JURNAL REVIEW

Analysis of α-cryptoxanthin, β-cryptoxanthin, α -carotene, and β-carotene

of Pandanus conoideus oil by high-performance liquid chromatography
(HPLC)

Disusun Oleh

Nufaisa Azizah 3325141801

Tania Farida 3325140699

Disusun untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Kimia Analisis Instrumen

Dosen Pengampu: Dra. Tritiyatma Hadinugrahaningsih, M. Si.

Program Studi Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Negeri Jakarta
 Analisis Kandungan α-kriptosantin, β-kriptosantin, α-karoten, dan β-
karoten Dalam Minyak Pandanus conoideus Dengan Metode Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi
Zita L. Sarungallo, Purwiyatno Hariyadia, Nuri Andarwulana, Eko H. Purnomo, Mitsuhiro Wada

Pandanus conoideus atau sering disebut buah merah merupakan tanaman endemik yang
berasal dari Papua. Minyak buah merah merupakan hasil ekstraksi buah merah. Berbagai
penelitian mengenai kendungan dan khasiat buah merah telah dilaporkan. Ekstrak buah
merah terbukti aman untuk dikonsumsi dengan aktivitas antioksidan yang tinggi, serta
menguntungkan kesehatan secara in vivo seperti menghambat tumor, membunuh sel kanker,
antiinflamasi, meningkatkan sel imun, dan menurunkan gula darah tikus (Rattus norvegicus)
diabetik. Komponen aktif dari minyak buah merah ini adalah α-kriptosantin, β-kriptosantin,
α-karoten, dan β-karoten.

Metode yang digunakan yakni kromatografi cair kinerja tingi atau high performance liquid
chromatography (HPLC-UV/Vis). Prinsip kerjanya ialah pemisahan absorpsi dan desorpsi
yang berulang kali dari komponen yang dipisahkan saat komponen tersebut dibawa oleh fasa
gerak mengalir sepanjang kolom.

Metode ini bertujuan untuk memisahkan dan membedakan komponen aktif minyak buah
merah. Metode ini didasari oleh percobaan yang dilakukan Wardayani dan terus
dikembangkan untuk menganalisis kandungan karotenoid buah merah. Untuk optimasi, maka
pada percobaan ini digunakan 9 klon buah merah yang diambil dari Papua, Indonesia.

Bahan baku utama dalam percobaan ini adalah 9 klon buah merah, dengan nama lokal Menjib
Rumbai, Edewewits, Memeri, Monsrus, Monsor, Mbarugum, Hityom, Himbiak, dan Hibcau.
Buah merah yang digunakan adalah buah segar yang dipanen pada tingkat kematangan
optimal, dengan kriteria panen yaitu bulir buah telah berisi penuh (bernas), berwarna merah
tua, posisi kemiringan buah pada pohon yakni 180˚, daun seludang terbuka, dan telah
mengering 50%. Bahan lain yang digunakan antara lain larutan standar α-karoten, α-
kriptosantin, β-kriptosantin, β-karoten, Kalium Hidroksida (KOH), Natrium Klorida (NaCl),
asetonitril, etil asetat, dan trietil amin, etanol 99.5%, heksana, dan metanol, asam askorbat,
dan beberapa senyawa kimia lainnya.

Untuk mendapatkan ekstrak minyak buah merah dilakukan dengan cara sebagai berikut.
Sekitar 12 gram daging buah merah dimaserasi yaitu direndam dalam 80 mL pelarut
campuran kloroform dan metanol (2:1) selama 1 jam dan diaduk dengan pengaduk magnet.
Hasil maserasi kemudian disaring menggunakan kertas saring dengan bantuan pompa vakum.
Kemudian, sebanyak 16 mL NaCl 0.88% ditambahkan kedalam larutan hasil penyaringan,
dan selanjutnya dilakukan pemisahan dengan labu pisah untuk mendapatkan fase minyak.
Sisa-sisa pelarut pada fase minyak diuapkan menggunakan rotary evaporator pada suhu 40˚C,
dikemas dalam botol gelap, dikeringkan dengan gas Nitrogen, dan disimpan pada suhu beku
sampai dianalisa.

Page 2
Preparasi sampel untuk analisis kandungan karotenoid dilakukan dengan cara sebagai berikut.
Karotenoid minyak buah merah diekstrak menggunakan metode yang dilaporkan oleh Wada
et al. Sebanyak 20 mg minyak ditimbang pada botol gelap, ditambahkan 10 mg asam
askorbat kemudian dihomogenisasi dengan 750 ml etanol. Selanjutnya 200 μl 76% KOH
ditambahkan, divorteks, dan dihembus dengan gas nitrogen. Sampel kemudian didiamkan
pada suhu kamar selama 30 menit untuk memungkinkan proses saponifikasi. Saponifikasi
dihentikan dengan menambahkan 250 μl NaCl (25 mg/mL). Karotenoid diekstrak dengan 750
ml heksana:etil asetat (9:1, v/v) selama 4 kali, kemudian lapisan organik yang terkumpul
diuapkan sampai kering pada suhu 40˚C. Untuk analisis dengan HPLC, sampel dilarutkan
dalam 400 mL metanol, disonikasi, dan disaring menggunakan filter membran 0.45 μm.

Preparasi larutan stok dan kalibrasi standar dilakukan dengan cara sebagai berikut. Larutan
stok standar α-kriptosantin, β-kriptosantin, α-karoten, dan β-karoten, (10 μl/mL) dilarutkan
dalam etanol. Kurva standar dibuat dengan memipet setiap standar 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80
dan 160 ng/mg dan di-spiking dalam minyak buah merah. Kurva kalibrasi dihitung
berdasarkan hasil analisis regresi linier daerah puncak dengan konsentrasi standar nominal
untuk masing-masing senyawa menggunakan Excel 2007 (Microsoft Corp, Redmon, Cuci,
USA). Kurva kalibrasi yang digunakan memiliki koefisien korelasi minimal 0.992.

Adapun prosedur validasinya meliputi satu set sampel kalibrasi yang dilakukan triplicate.
Validasi dilakukan sesuai metode yang dilakukan oleh Wada et al. Pengujian intra-day
precision dan accuracy dilakukan dengan menggunakan minyak yang di-spike dengan 5 dan
40 ng/mg dari setiap ke-4 standar karotenoid yang diuji. Analisis pengukuran dilakukan
dalam lima ulangan untuk masing-masing konsentrasi. Akurasi metode yang telah
diverifikasi dibandingkan dengan konsentrasi terukur dari α-kriptosantin, β-kriptosantin, α-
karoten, dan β-karoten dalam minyak dengan konsentrasi ditambahkan.

Analisis kromatografi menggunakan sistem HPLC yang terdiri dari 2 pompa kromatografi
Shimadzu LC-10ATvp (Kyoto), kolom Develosil Combi RP-5 (50 x 4.6 mm, i.d., 5 μm,
Nomura Chemical, Tokyo), dan detektor Shimadzu SPD-10 AV UV-VIS (Shimadzu), serta
7125 injektor dengan syringe 20 μl (Rheodyne, CA, USA). Sistem gradien fase gerak terdiri
dari (A) campuran asetonitril dan air dengan rasio 80:20 (v/v) mengandung 0.05% TEA dan
(B) campuran asetonitril, metanol dan etil asetat dengan rasio 68:5:27 (v/v) mengandung
0,05% triethylamine (TEA), pada 1 ml/menit. Program gradien sebagai berikut: 0-4 menit, 1-
10% B; 4-25 menit, 50-80% B; 25-35 menit, 100% B; and 35-45 menit, 1% B. Pemisahan
karotenoid dideteksi dan diukur pada 450 nm, dengan total waktu proses 45 menit.

Pengukuran total karotenoid menggunakan metode Porim dan Knockaert et al dengan sedikit
modifikasi. Sebanyak 2 mg minyak buah merah, ditambahkan 0.1% butylated hydroxytoluene
(BHT) dan heksan dalam labu ukur 10 ml sampai tanda tera dan divortek. Selanjutnya
absorbansi diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 446 nm and 470 nm
dengan menggunakan heksan yang ditambahkan 0.1% BHT sebagai blanko. Total karotenoid
dihitung menggunakan rumus berikut.

Page 3
A adalah absorbansi pada λ maksimal, volume adalah total volume larutan sampel,
adalah extinction coefficient yaitu 2560 untuk β-karoten dalam heksan.

Metode ini sangat cocok untuk menentukan kandungan komponen aktif buah merah secara
simultan. Peak yang dihasilkan adalah sebagai berikut.

Sedangkan peak yang dihasilkan oleh sampel yang di-spike dengan larutan standar karotenoid
adalah sebagai berikut.

Gambar tersebut menunjukkan bahwa waktu retensi yang dihasilkan oleh α-kriptosantin, β-
kriptosantin, α-karoten, dan β-karoten berturut-turut adalah 21, 22, 32, dan 33 menit. Waktu
retensi yang diperoleh lebih kecil daripada waktu retensi yang diperoleh oleh Wada et al
yakni waktu retensi yang dihasilkan oleh α-kriptosantin, β-kriptosantin, α-karoten, dan β-
karoten berturut-turut adalah 18, 20, 53, dan 60 menit.

Parameter kurva kalibrasi untuk metode HPLC-UV/Vis dirangkum dalam table berikut.

Compound of Concentration ra Equationb

standard (ng/mg oil)
α-cryptoxanthin 0.25-160 0.992 y = 1.82×105x + 2.45×106
β-cryptoxanthin 1.25-80 0.999 y = 1.69×105x + 1.88×106
α-carotene 1.25-80 0.995 y = 1.85×105x + 2.21×106
β-carotene 1.25-160 0.999 y = 1.14×05x + 6.93×06

Page 4
a koefisien korelasi
b y= peak karotenoid, x = konsentrasi sampel, ng/mg

Intra-day precision mengindikasikan nilai kesalahan relative standar yang nilainya berkisar
antara 6.3-10.9% untuk α-kriptosantin, 4.9-9.4% untuk β-kriptosantin, 6.1-10.1% for α-
karoten, dan 6.7-10.0% untuk β-karoten. Sedangkan akurasinya berkisar antara 101%, 99-
103%, 103-107%, dan 101-103% yang secara berturut-turut untuk α-kriptosantin, β-
kriptosantin, α-karoten, and β-karoten. Data lengkapnya disajikan dalam tabel berikut.
Tabel 2. Intra-day assay precision and accuracy for carotenoids spikes in Pandanus conoideus oil.
Precision,
Added concentration Measured concentration, Mean Accuracy, Mean ± a
Compound (ng/mg oil) ± S.D. (ng/mg oil) S.D. (%)b RSDs (%)
Intra-day
α-cryptoxanthin 0 (10.6 ± 1.1)
5 15.5 ± 0.4 101 ± 11.0 10.9
40 50.8 ± 2.5 101 ± 6.3 6.3
β-cryptoxanthin 0 (10.4 ± 0.8)
5 15.4 ± 0.4 103 ± 9.6 9.4
40 50.1 ± 1.6 99 ± 4.8 4.9
α-carotene 0 (11.6 ± 0.6)
5 16.9 ± 0.5 107 ± 10.8 10.1
40 52.9 ± 2.5 103 ± 6.3 6.1
β-carotene 0 (54.6 ± 2.5)
5 59.5 ± 0.4 101 ± 10.2 10.0
40 95.6 ± 2.8 103 ± 6.9 6.7
a
Relative standard deviation (n=5)
bAccuracy % = {(measured conc.- Original conc.)/Added conc.} x 100 (n=5)

Tabel 3. The results of the analysis carotenoid content of 9 clones Pandanus conoideus oil.
Clone of Pandanus Content of carotenoid, Mean ± S.D. (ng/mg oil)a
conoideus oil α-cryptoxanthin β-cryptoxanthin α-carotene β-carotene
Edewewits 11.4 ± 0.8 4.3 ± 0.8 13.1 ± 1.7 24.6 ± 2.6
Memeri 10.38 ± 1.2 9.8 ± 0.9 10.5 ± 1.6 55.8 ± 2.7
Monsrus 16.3 ± 0.4 16.4 ± 0.9 10.2 ± 1.0 50.3 ± 1.3
Monsor 36.0 ± 0.6 29.4 ± 0.1 19.8 ± 2.9 112.9 ± 0.6
Hibcau 1.6 ± 0.04 3.9 ± 0.4 1.9 ± 0.2 10.8 ± 0.9
Himbiak 7.3 ± 0.6 19.8 ± 1.2 5.1 ± 0.6 50.7 ± 3.1
Hityom 5.4 ± 0.2 10.7 ± 0.3 3.5 ± 0.1 24.2 ± 0.4
Mbarugum 6.1 ± 0.4 15.1 ± 0.5 9.2 ± 1.0 118.0 ± 4.0
Menjib Rumbai 138.5 ± 2.5 15.7 ± 1.4 80.0 ± 1.3 66.9 ± 0.9
a(n=3)

Metode ini diaplikasikan pada 9 klon buah merah untuk mengetahui kandungan karotenoid
dalam ke-9 klon buah merah tersebut. Hasilnya adalah kandungan karotenoid untuk α-
kriptosantin, β-kriptosantin, α-karoten, dan β-karoten secara berturut-turut adalah 5.4-138.5
ng/mg, 3.9-29.4 ng/mg, 3.5-80.0 ng/mg dan 10.8-118.0 ng/mg yang tersaji pada tabel 3.

Setiap klon buah merah memiliki kandungan komposisi 4 karotenoid yang berbeda-beda
seperti yang tersaji dalam tabel berikut.
Tabel 4. Total carotenoids content (TCC) of 9 clones Pandanus conoideus oil.
Total carotenoids content, Mean ± S.D.
Clones of Pandanus conoideus oil Color of fruit (ng/mg oil)c

Edewewitsa Red 9409 ± 83

Memeria Red 17179 ± 937
Monsrusa Red 15485 ± 607
Monsora Red 19959 ± 1206
Hibcaua Red 10338 ± 85

Page 5
 Himbiaka Red 15518 ± 649
Hityoma Red 11494 ± 292
Mbaruguma Red 14666 ± 16
Menjib Rumbaib Yellow 3027 ± 136
a
Wave Length 446 nm
bWave Length 470 nm
c(n=3)

Gambar diatas menjelaskan mengenai distribusi dari 9 klon buah merah. Dari gambar
tersebut klon buah merah dapat dikelompokkan ke dalam 3 kelompok berdasarkan perkiraan
kandungan karotenoid. Tiga kelompok tersebut adalah:

Grup A, terdiri dari Monsor, Mbarugum, Himbiak, Monsrus, dan Memeri, yang memiliki
kandungan β-karoten dan β-kriptosantin yang terletak pada kuadran III dan IV pada gambar
diatas.

Grup B, yaitu Menjib Rumbai yang memiliki kandungan α-karoten dan α-kriptosantin yang
terletak pada kuadran I pada gambar diatas.

Grup C, terdiri dari Edewewits, Hibcau, dan Hityom yang memiliki kandungan total
karotenoid terendah yang terletak pada kuadran III pada gambar diatas.

Kesimpulannya metode HPLC-UV/Vis sangat presisi yang ditunjukkan dengan nilai RSD
yang kurang dari 11% dan akurasi yang lebih dari 90%. Metode ini sukses diaplikasikan pada
ke-9 klon buah merah. Kandungan total karotenoid dari minyak buah merah berkisar antara
3027-19959 ng/mg dan β-karoten bukan merupakan komponen utama dalam minyak buah
merah. Sembilan klon buah merah dapat dikelompokkan ke dalam 3 kelompok berdasarkan
perkiraan kandungan karotenoid dimana grup A memiliki kandungan senyawa komponen
aktif β yang lebih tinggi, grup B memiliki kandungan senyawa komponen aktif α yang lebih
tinggi, dan grup C memiliki kandungan total karotenoid α dan β yang rendah.

Page 6