UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

FACULTAD DE QUÍMICA Y BIOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

"ENZIMOLOGÍA II. DETERMINACIÓN DE

LOS PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA
ENZIMA FOSFATASA ÁCIDA DE GERMEN DE
TRIGO"

INTEGRANTES : Francis González

Lawrence Lackey
PROFESORA : Alejandra Saavedra
AYUDANTE : Catalina Rodríguez
FECHA EXPERIENCIA : 20 de Noviembre del 2017
FECHA DE ENTREGA : 27 de Noviembre del 2017
 1.- INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS

En los organismos vivos, gran parte de los procesos bioquímicos ocurren espontáneamente,
pero a velocidades muy lentas, pudiendo ser incluso en un margen de años, por lo cual
requieren ser biocatalizadas por enzimas, que son agentes proteicos que reducen la energía
de activación de estas reacciones, permitiendo que ocurran en un margen de segundos.
Estas enzimas poseen un sitio activo en el que ocurre la reacción y que también puede ser
utilizado por los organismos como regulatorio, mediante inhibidores que pueden unirse a
este sitio activo o a otra parte de la enzima de forma reversible o irreversibles, este último
por formación de enlaces covalentes, impidiendo la correcta interacción entre el sitio activo
de la enzima y el sustrato como indica Lodish et al. (1).

En el estudio de la cinética enzimática, producto de la dificultad de medirla en el avance de

la reacción se prefiere aproximarla mediante la velocidad inicial según Nelson y Cox (2).

𝑉𝑚𝑎𝑥 ∙ [𝑆]
𝑉0 = (𝐸𝑐. 1)
𝐾𝑚 + [𝑆]

Dónde 𝑉𝑜 correponde a la velocidad inicial, 𝑉𝑚𝑎𝑥 la velocidad máxima, [𝑆] la concentración

de sustrato y 𝐾𝑚 es la constate de Michaelis la cual corresponde a la concentración de
sustrato con la que se alcanza la mitad de la velocidad máxima. Aquellas enzimas que
cumplen con este comportamiento se les conocen como de Michaelis-Menten (2).

La siguiente experiencia tiene por objetivos conocer procedimientos básicos para

cuantificar la actividad enzimática, comprobando el efecto de los inhibidores sobre los
parámetros cinéticos de una enzima, también aplicar los conceptos de sustrato y tipos de
inhibidor en la interpretación de resultados para finalmente determinar los parámetros
cinéticos 𝐾𝑚 y 𝑉𝑚𝑎𝑥 tanto en presencia como en ausencia de inhibidor.

2.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Se comenzó la experiencia por rotular el material de vidrio, en total 11 tubos de hemólisis y

5 tubos de ensayo, los cuales se marcaron del 1 al 6 para la elaboración de la curva de
calibración y del 7 al 11 para la determinación de los parámetros cinéticos. Por otro lado,
los tubos de ensayo utilizados en la sección 2.2 fueron marcados del 1 al 5.

2.1 Elaboración de una curva de calibración de p-nitrofenol

Se comenzó con el material de vidrio dispuesto en una gradilla plástica añadiendo con
ayuda de una micropipeta de 1000[µL] los reactivos en los tubos de hemólisis según lo
indicado en la tabla 2.1 presente a continuación.

1
 Tabla 2.1: Volúmenes de reactivos añadidos a los tubos de hemólisis para calibración.
Reactivo / Tubo 1 2 3 4 5 6
pNP1 60 µM en [mL] 0,0 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0
NaOH 0,05 M en [mL] 4,0 3,5 3,0 2,0 1,0 0,0

Posteriormente se colocó parafilm en el extremo superior a los tubos 2, 3, 4 y 5 para

homogenizarlos mediante inversión.

2.2 Determinación de los parámetros cinéticos de la fosfatasa ácida de germen de trigo

y el efecto del fosfato en la reacción

El mismo procedimiento descrito anteriormente se utilizó para preparar las muestras en esta
parte de la experiencia, con diferencia en que los volúmenes de reactivos corresponden a
los presentados en la tabla 2.2.

Tabla 2.2: Volúmenes de reactivos añadidos a los tubos de hemólisis para determinar los
parámetros cinéticos.

Reactivo / Tubos 7 8 9 10 11
pNPP2 2,5 mM [mL] 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Buffer citrato [mL] 1,50 1,25 1,00 0,75 0,50
KH2PO4 mM [mL] 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50
Enzima 0,5 mg/mL [mL] 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50

3.- RESULTADOS

Los puntos medidos por espectrofotometría para la curva de calibración son los siguientes:

Tabla 3.1: Concentración de pNP y absorbancia medida a 405[nm].

pNP [µM] 0,0 7,5 15,0 30,0 45,0 60,0

Absorbancia 0,000 0,138 0,349 0,578 0,869 0,544

Para elaborar la curva de calibración estos son graficados en las figuras 3.1 y 3.2, donde en
esta última se eliminan los datos fuera de la tendencia.

1
Para-Nitrofenol.
2
Para-Nitrofenil fosfato.

2
 70
60
50

pNP [µM]
40
30
20
10
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Absorbancia

Figura 3.1: Curva de calibración para el pNP.

Tabla 3.2: Datos de la regresión lineal.

Regresión [𝑝𝑁𝑃] = 60,3 ∙ 𝐴 + 1,3461

Coeficiente de correlación 0,684
Rango de validez [0 – 0,869]

Eliminando la concentración de 60[µM] y su respectiva absorbancia de la representación

gráfica y correlación, se obtiene:

50
45
40
35
pNP [µM]

30
25
20
15
10
5
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Absorbancia

Figura 3.2: Curva de calibración para el pNP ajustada.

Tabla 3.2: Datos de la regresión lineal de la curva de calibración ajustada.

Regresión [𝑝𝑁𝑃] = 51,869 ∙ 𝐴 + 0,5631

Coeficiente de correlación 0,9937
Rango de validez [0 – 0,869]

3
 Tabla 3.3: Concentración de sustrato, producto y velocidad inicial.

Con inhibidor Sin inhibidor

pNPP Absorbancia pNP µ𝒎𝒐𝒍 Absorbancia pNP µ𝒎𝒐𝒍

Tubo 𝑽𝟎 [ ] 𝑽𝟎 [ ]
[mM] 405[nm] [µM] 𝑳∙𝒎𝒊𝒏 405[nm] [µM] 𝑳 ∙ 𝒎𝒊𝒏
7 0 0 0 0 0 0 0
8 0,25 -0,058 -3,5715 -0,0045 0,224 11,0556 0,0138
9 0,5 0,046 1,8229 0,0023 0,34 17,0724 0,0213
10 0,75 0,049 1,9785 0,0025 0,37 18,6284 0,0233
11 1 0,395 19,9252 0,0249 0,475 24,0747 0,0301

0.035
0.03
0.025
Vo[µmol/L*min]

0.02
0.015
Con inhibidor
0.01
Sin inhibidor
0.005
0
-0.005 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
-0.01
pNPP[mM]

Figura 3.3: Curva de velocidad en función de la concentración de sustrato para cinéticas

con y sin inhibición.

Tabla 3.4: Concentración de sustrato, producto y velocidad inicial.

𝟏 𝟏 𝟏 𝑳∙𝒎𝒊𝒏 𝟏 𝑳∙𝒎𝒊𝒏
[ ] 𝑽 [ µ𝒎𝒐𝒍 ] [
𝑽𝟎 µ𝒎𝒐𝒍
]
𝒑𝑵𝑷𝑷 𝒎𝑴 𝟎

4,0000 -223,9954 72,3618

2,0000 438,8674 46,8594
1,3333 404,3506 42,9451113
1,0000 40,1503 33,2299

4
 450
350

1/V0 [L∙min/µmol]
250
150 Con inhibidor
50 Sin inhibidor

-4.2 -2.2 -50-0.2 1.8 3.8

-150
-250
1/pNPP[1/mM]

Figura 3.4: Curvas de dobles recíprocos para cinéticas con y sin inhibición.

Tabla 3.5: Datos de la regresión lineal del gráfico de dobles recíprocos.

Con inhibición Sin inhibición

1 1 1 1
Regresión = 349,15 ∙ − 209,88 = 12,292 ∙ + 23,241
𝑉0 [𝑝𝑁𝑃𝑃] 𝑉0 [𝑝𝑁𝑃𝑃]
Coeficiente de
0,6476 0,9794
correlación
Rango de validez [1 – 4] [1 – 4]

Tabla 3.6: Velocidad máxima y constante de Michaelis para cinéticas con y sin inhibición.

Con Sin
inhibición inhibición
Vmax -0,0048 0,0430
Km -1,6636 0,5289

4.- DISCUSIÓN

Los datos medidos para la curva de calibración presentes en la tabla 2.1 indican que el pNP
cumple la ley de Lambert-Beer para el rango de concentraciones hasta 45[µM], puesto que
a 60[µM] la tendencia lineal no es adecuada para modelar el comportamiento de la
absorbancia del sistema en ese punto. La mayor parte de las desviaciones de la ley de
Lamber-Beer ocurren con el aumento de la concentración, producto de que la radiación
emitida por el espectrofotómetro no es completamente monocromática y por ende el
incremento de la concentración hace más evidente la desviación de la tendencia. Si bien la
posibilidad de que en la preparación del tubo 6 tuviese errores es considerable, estas se
descartan puesto que se realizó un duplicado de este tubo para corroborar la tendencia. Es
por esto que la curva de calibración utilizada es la correspondiente a la tabla 3.2 y figura
3.2, donde la absorbancia a 60[µM] es eliminada.

5
Como indica Nelson & Cox (2) las velocidades iniciales de la catálisis enzimática
aumentan con el incremento de la concentración de sustrato en el sistema esto producto de
que se facilita la formación del complejo enzima-sustrato. Aquellas enzimas Michaelianas
describen un comportamiento hiperbólico de velocidad inicial en función del sustrato.
Cualitativamente los datos presentes en la tabla 3.3 en ausencia de fosfato y graficados en
la figura 3.3 describen el comportamiento presente en la literatura (3), es decir, de tipo
Michaelis-Menten, no obstante, la cinética descrita para la reacción con presencia de
fosfato no se observa el mismo fenómeno. El fosfato inorgánico es un inhibidor de tipo
competitivo como indica Guija et al. (3), esto quiere decir que junto con el sustrato buscan
unirse al sitio activo. Como consecuencia de esto la velocidad de catálisis disminuye, dado
que menos sustrato alcanza a conformar el complejo enzima-sustrato requerido para la
formación de productos, esto puede observarse en que todos los puntos en la curva de
inhibición de la figura 3.3 se encuentran a una velocidad menor que la cinética en ausencia
de fosfato. Los datos determinados para la cinética en presencia de inhibidor describen un
comportamiento menos hiperbólico y más sigmoideo, producto de la formación de un
complejo enzima-fosfato ligado covalentemente según Guija et al. (3). Las desviaciones del
comportamiento Michaeliano pueden deberse a errores en la preparación de los tubos o en
la medición de la absorbancia, como en el caso del tubo 8 que presentó valores de
absorbancia negativos lo que indica que no hubo formación de pNP.

Por otra parte, para determinar los parámetros cinéticos se requiere linealizar los datos
medidos en las corridas cinéticas anteriores mediante el método de dobles recíprocos,
donde para inhibiciones de tipo competitivas debería observarse que la velocidad máxima
de la reacción es la misma, mientras que la constante Michaeliana debería ser mayor.
Producto de las desviaciones mencionadas anteriormente para la cinética con inhibición no
es posible determinar los parámetros cinéticos en estas condiciones.

5.- CONCLUSIONES

Se aplicaron y conocieron los procedimientos relacionados a la determinación de la

actividad enzimática, pero no fue posible determinar los parámetros cinéticos que
permitieran comprobar el efecto del inhibidor sobre la catálisis de la fosfatasa ácida. No
obstante, en base a las diferencias presentes en la figura 3.1, la acción del fosfato sobre la
reacción es de inhibición mediante la formación de un complejo enzima-fosfato de manera
covalente, puesto que las velocidades determinadas para una misma concentración de
sustrato son menores a las determinadas en ausencia de fosfato.

6
 6.- REFERENCIAS

[1] Lodish H., Kaiser C., Berk A., Krieger M., Matsudaira P. & Scott M. (2005).
Biología Celular y Molecular. Fundamentos químicos, Equilibrio Químico. (5aed,
pp. 73-77). Buenos Aires, Argentina: Editorial médica panamericana S.A.

[2] Nelson D. L. & Cox M. M. (2009). Lehninger Principios de Bioquímica. Cuchillo

C. M. (ed), Funcionamiento de las enzimas (5a ed., pp. 186-200). España,
Barcelona: Ediciones Omega.

[3] Guija E., Soberón M. & Haak-Mares H. (2007). Mecanismo de acción de fosfatasas
ácidas de bajo peso molecular. (pp. 356 – 362). Anales de la facultad de Medicina,
Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú.