8
PENDAHULUAN yang dikembangkan oleh Cinquina et al.
Daging ayam merupakan salah satu
komoditas peternakan yang memiliki nilai gizi
sejajar dengan nilai gizi daging lainnya.
Konsumsi daging ayam masyarakat Indonesia
meningkat 10% per tahun (Rumiati 2003).
Oleh karena itu, pengawasan untuk
menghasilkan daging ayam bermutu tinggi,
bebas dari cemaran maupun residu bahan
kimia terutama obat-obatan serta aman
dikonsumsi perlu dilakukan.
Antibiotik selama ini digunakan untuk
pengobatan dan sebagai imbuhan pakan agar
hewan ternak tersebut bebas dari penyakit
sehingga pertumbuhan badannya tidak
terhambat. Pemakaian antibiotik yang tidak
beraturan dapat menyebabkan residu dalam
jaringan organ yang dapat menyebabkan
reaksi alergi, resistensi dan mungkin
keracunan sehingga cukup berbahaya bagi
kesehatan manusia (Yuningsih 2004). Salah
satu antibiotik yang digunakan ialah
tetrasiklin yang berfungsi sebagai antibakteri
(Castellari & Regueiro 2003). Tetrasiklin
merupakan antibiotik yang dihasilkan oleh
Streptomyces sp. dan umum digunakan untuk
melawan beberapa jenis bakteri (Berrensen &
Rhijn 2006). Tetrasiklin bekerja secara
bakteriostatik dan dapat mencegah penyakit
yang ditimbulkan baik oleh bakteri gram
positif maupun negatif seperti Sphirocete,
Actynomycetes, Ricketsia, dan Mycoplasma
(Cherlet et al. 2003).
Antibiotik tetrasiklin yang ditambahkan ke
dalam pakan ayam pedaging dapat
menimbulkan residu dalam daging ayam
tersebut. Adanya residu antibiotik ini pada
daging ayam dapat mengganggu kesehatan
manusia antara lain timbulnya resistensi
terhadap antibiotik tersebut (Oktateria 2008).
Untuk memastikan produk pangan aman
untuk dikonsumsi, Badan Standarisasi
Nasional (BSN 2000) menetapkan batas
maksimal residu (BMR) yang tercantum
dalam SNI 01-6366-2000 yang menetapkan
bahwa batas cemaran residu tetrasiklin pada
produk hewan ternak ialah 100 ppb pada
daging, 50 ppb pada telur, dan 50 ppb pada
susu.
Residu antibiotik tetrasiklin dalam bahan
pangan jumlahnya sangat kecil sehingga
diperlukan suatu metode analisis yang baik
dan teliti. Berbagai metode telah
dikembangkan dalam penentuan residu
antibiotik ini. Pengembangan metode
dilakukan untuk mendapatkan metode deteksi
yang lebih cepat dan teliti. Salah satunya ialah
(2003) serta Castellari dan Regueiro (2003)
yang melaporkan bahwa metode KCKT
dengan detektor berkas fotodioda dapat
digunakan untuk penentuan residu antibiotik
tetrasiklin dalam daging ternak.
Hipotesis yang diajukan dalam penelitian
ini ialah bahwa metode KCKT dengan
detektor berkas fotodioda (PDA) UV dapat
digunakan untuk menganalisis residu
antibiotik tetrasiklin pada daging ayam
pedaging.
Penelitian ini bertujuan memvalidasi
metode analisis dan menentukan tingkat
residu antibiotik golongan tetrasiklin pada
sampel lapang daging ayam pedaging asal
Jakarta, Bekasi, dan Depok secara KCKT.
TINJAUAN PUSTAKA
Tetrasiklin
Tetrasiklin ialah antibiotik yang umum
digunakan sebagai obat-obatan veteriner dan
diisolasi dari bakteri Streptomyces sp..
Penggunaan tetrasiklin sebagai obat-obatan
veteriner umumnya dicampurkan ke dalam
pakan. Tetrasiklin merupakan antibiotik yang
bersifat bakteriostatik dan bekerja dengan
jalan menghambat sintesis protein kuman.
Tetrasiklin memiliki spektrum yang luas,
artinya antibiotik ini memiliki kemampuan
melawan sejumlah bakteri patogen (Yuningsih
2004).
Tetrasiklin merupakan senyawa kristal
berwarna kuning dan sedikit larut dalam air.
Pada suhu 28°C kelarutan tetrasiklin dalam air
sebesar 1,7 mg/ml sedangkan dalam metanol
lebih dari 20 mg/ml (Schunack et al. 1990).
Tetrasiklin memiliki rumus molekul
C22H24N2O8 dan memiliki nama IUPAC [4s-
(4α,4aα,5aα,6β,12aα)] -4- (dimetilamino)
1,4,4a,5,5a, 6-11,12a-oktahidro-3,6,10,12,12a-
pentahidroksi- 6- metil -1,11-diokso- 2-
naftasenkarboksamida dengan bobot molekul
444,44 g/mol (Gambar 1).
Gambar 1 Struktur kimia tetrasiklin
Oksitetrasiklin merupakan tetrasiklin
dengan tambahan satu gugus OH pada

struktur cincinnya. Oksitetrasiklin dengan
rumus molekul C22H24N2O9 memiliki nama
IUPAC [ 4s - (4α,4aα,5α,5aα,6β,12aα)] – 4 -
(dimetilamino) -1 ,4 ,4 a,5 ,5a ,6- 11,12a -
oktahidro-3, 5, 6, 10, 12, 12a- heksahidroksi-
6-metil-1,11-diokso- 2- naftasenkarboksamida
dan bobot molekul 460,44 g/mol (Gambar 2).
Oksitetrasiklin berbentuk serbuk halus
berwarna kuning muda dan tidak berbau.
Oksitetrasiklin memiliki kelarutan yang lebih
besar dibandingkan tetrasiklin, yaitu 1g/ml
pada suhu 28°C dan sangat mudah larut dalam
etanol.
Gambar 2 Struktur kimia oksitetrasiklin
Klortetrasiklin merupakan tetrasiklin
dengan tambahan satu atom klor pada struktur
cincinnya. Klortetrasiklin berbentuk serbuk
halus berwarna kuning keemasan dan sedikit
larut dalam air (8,6 mg/ml). Klortetrasiklin
dapat larut dalam alkali hidroksida, dioksan,
karbitol, etanol, butanol, aseton, etil asetat,
benzena, dan sedikit larut dalam metanol.
Klortetrasiklin memiliki nama IUPAC [4s -
(4α, 4aα, 5aα, 6β, 12aα) ] - 7 - kloro – 4 -
(dimetilamino)- 1, 4, 4a, 5, 5a, 6 - 11, 12a –
oktahidro - 3, 6, 10, 12, 12a – pentahidroksi -
6-metil-1,11-diokso-2- naftasenkarboksamida
dengan bobot molekul 478,89 g/mol (Gambar
3).
Gambar 3 Struktur kimia klortetrasiklin
Selain keempat jenis antibiotik yang telah
disebutkan masih ada turunan lain dari
antibiotik tetrasiklin antara lain doksisiklin,
demeklosiklin, metasiklin, minosiklin, dan
rolitetrasiklin.
Daging Ayam Pedaging
Daging didefinisikan sebagai semua
jaringan hewan dan semua hasil pengolahan
jaringan-jaringan tersebut yang sesuai untuk
2
dimakan serta tidak menimbulkan gangguan
kesehatan bagi yang memakannya (Soeparno
1994). Daging ayam merupakan jenis bahan
pangan yang bernilai gizi tinggi dan
berperanan penting dalam memperbaiki
kualitas sumberdaya manusia. Daging ayam
yang beredar di Indonesia sebagian besar
berasal dari ayam pedaging. Ayam pedaging
ialah ayam ras yang mampu tumbuh cepat
sehingga dapat menghasilkan daging dalam
waktu relatif singkat, yaitu 5-7 minggu. Ayam
pedaging memiliki peranan yang penting
sebagai sumber protein hewani asal ternak
(Resnawati 2005).
Daging ayam yang sehat memiliki ciri
bersih/terang dan lapisan luarnya kering,
daging yang sudah ditiriskan tidak berdarah,
aroma baunya tidak amis, tidak kaku, dan
tidak bau asam. Daging ayam pedaging
memiliki kadar kolesterol yang rendah dan
kaya vitamin B dan mineral sehingga sangat
diperlukan untuk kesehatan sistem syaraf dan
pertumbuhan.
Residu Antibiotik Golongan Tetrasiklin
Residu antibiotik dalam makanan asal
hewan erat kaitannya dengan penggunaan
antibiotik untuk pencegahan dan pengobatan
penyakit serta penggunaannya sebagai
imbuhan pakan (Riti et al. 2002). Penambahan
obat hewan antibakteri (antibiotik) ke dalam
ransum pakan ternak bertujuan meningkatkan
laju pertumbuhan berat badan atau
meningkatkan laju efisiensi pakan.
Penggunaan obat-obatan tersebut
meningkat tajam khususnya bagi ternak sapi
pedaging dan ayam pedaging agar laju
pertumbuhan badannya semakin cepat.
Antibiotik pada ternak juga diberikan dalam
bentuk suntikan. Apabila hewan ternak yang
baru saja mendapatkan suntikan antibiotik
atau ransum tersebut segera dipotong, dapat
meninggalkan residu obat-obatan di dalam
daging ternak, telur, susu atau produk ternak
lainnya. Menurut Rico (1986), keberadaan
residu antibiotik dalam pangan asal hewan
dapat mengakibatkan efek yang buruk bagi
manusia, diantaranya alergi, keracunan,
karsinogen, dan resistensi terhadap antibiotik
tertentu.
Konsumsi pangan asal hewan yang
diberikan antibiotik tidak dilarang asalkan
berada di bawah batas maksimum residu
(BMR). BMR antibiotik golongan tetrasiklin
dalam daging dan susu tidak boleh melebihi
100 ppb menurut SNI 01-6366-2000.
Berbagai metode telah dikembangkan utuk
menganalisis residu antibiotik dalam pangan

hasil ternak diantaranya metode KCKT untuk
analisis tetrasiklin dan oksitetrasiklin dalam
susu (Fletouris et al. 1990) dan daging (Moats
& Khan (1995). Analisis residu tetrasiklin
dalam madu (Martel et al. (2006) dan ikan
salmon (Rupp & Anderson (2005).
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT),
merupakan suatu teknik kromatografi dengan
fase gerak cairan dan fase diam cairan atau
padat. Parameter KCKT yang digunakan
untuk analisis kuantitatif ialah waktu retensi
atau volume retensi. Perhitungan kuantitatif
didasarkan pada pengukuran tinggi puncak
atau luas puncak suatu komponen zat.
Populernya penggunaan KCKT
disebabkan teknik ini memiliki beberapa
keunggulan, yaitu mampu memisahkan
molekul-molekul dari suatu campuran,
kecepatan analisis, kepekaan yang tinggi dan
resolusi yang baik. Selain itu, kolom dapat
digunakan kembali, dapat menggunakan
bermacam-macam detektor, dan dapat
menghindari terjadinya dekomposisi atau
kerusakan bahan yang dianalisis (Adnan
1997).
Berdasarkan perbedaan fase, KCKT
terbagi menjadi dua, yaitu fase normal dan
fase terbalik. Fase normal ialah fase diam
yang berupa senyawa polar dan fase gerak
senyawa nonpolar. Sementara fase terbalik
ialah fase diam yang berupa senyawa
nonpolar dan fase gerak senyawa polar
(Adnan 1997). Menurut Gritter et al. (1991),
kromatografi menggunakan fase terbalik
sehingga senyawa polar akan lebih baik
pemisahannya, senyawa ionik dapat
dipisahkan, dan air dapat digunakan sebagai
salah satu komponen pada fase gerak.
Susunan peralatan KCKT tidak banyak
berbeda dengan kromatografi gas-cair.
Komponen utama pada KCKT antara lain
reservoir pelarut untuk fase gerak, pompa,
pencampur gradien, injektor, kolom, detektor,
rekorder, dan integrator.
Detektor dibutuhkan untuk mendeteksi
adanya komponen sampel di dalam kolom
(analisis kualitatif) dan menghitung kadarnya
(analisis kuantitatif). Detektor yang baik
memiliki sensitivitas yang tinggi, derau
(noise) yang rendah, kisaran respon linear
yang luas, dan memberi respons untuk semua
tipe senyawa. Detektor KCKT yang umum
digunakan ialah detektor UV 254 nm.
Variabel panjang gelombang dapat digunakan
untuk mendeteksi banyak senyawa dengan
kisaran yang lebih luas. Detektor indeks
83
refraksi juga digunakan secara luas, terutama
pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya
kurang sensitif jika dibandingkan dengan
detektor UV. Detektor-detektor lain yang
digunakan antara lain detektor fluororesensi,
spektroskopi massa, dan berkas fotodioda
(Putra 2004). Detektor berkas fotodioda
(PDA) UV telah banyak digunakan untuk
menganalisis residu antibiotik berdasarkan
serapan pada daerah spektrum ultraviolet
sampai sinar tampak.
Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis ialah suatu
tindakan penilaian terhadap parameter
tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium,
untuk membuktikan bahwa parameter tersebut
memenuhi persyaratan untuk digunakannya.
Validasi metode analisis merupakan suatu
proses pembuktian melalui pengujian analisis
di laboratorium untuk memberikan data
tentang keandalan suatu metode dari suatu
prosedur yang digunakan.
Beberapa parameter analisis yang harus
dipertimbangkan dalam validasi metode
analisis diuraikan dan didefinisikan sesuai
dengan cara penentuannya (Harmita 2004).
Parameter yang digunakan ialah batas deteksi
dan kuantitasi, presisi, akurasi, dan linearitas.
Selain itu digunakan pula parameter
keterulangan (repeatability) dan ketangguhan
(rudgedness) (CDER 1994).
Batas deteksi ialah jumlah terkecil analit
dalam sampel yang dapat dideteksi yang
masih memberikan respon signifikan
dibandingkan dengan blangko. Batas deteksi
merupakan parameter uji batas. Batas
kuantitasi merupakan parameter pada analisis
renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil
analit dalam sampel yang masih dapat
memenuhi kriteria cermat dan saksama.
Presisi ialah ukuran yang menunjukkan
derajat kesesuaian antarhasil uji individual,
diukur melalui penyebaran hasil individual
dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara
berulang pada sampel-sampel yang diambil
dari campuran yang homogen. Menurut
CDER (1994), presisi dibagi menjadi tiga,
yaitu keterulangan (repeatability), ketertiruan
(reproducibility), dan presisi antara
(intermediate precision). Keterulangan ialah
presisi metode jika dilakukan berulang kali
oleh analis yang sama pada kondisi sama dan
dalam interval waktu yang pendek.
Ketertiruan ialah presisi metode jika
dilakukan berulang kali oleh analis yang
berbeda pada kondisi berbeda. Presisi antara
merupakan ukuran ketertiruan pada kondisi
operasi normal antara laboratorium dan
antaranalis.
Akurasi ialah ukuran yang menunjukkan
kedekatan nilai hasil analisis dengan kadar
analit yang sebenarnya (CDER 1994).
Kecermatan dinyatakan sebagai persen
perolehan kembali (recovery) analit yang
ditambahkan. Kecermatan ditentukan dengan
dua cara yaitu, metode simulasi (spiked-
placebo recovery) dan metode penambahan
standar (standard addition method).
Linearitas ialah kemampuan metode
analisis yang memberikan respons secara
langsung atau dengan bantuan transformasi
matematika yang baik dan proporsional
terhadap konsentrasi analit dalam sampel.
Linearitas biasanya dinyatakan dalam variansi
sekitar arah garis regresi yang dihitung
berdasarkan persamaan matematika
menggunakan data yang diperoleh dari hasil
uji analit dalam sampel dengan berbagai
konsentrasi analit. Persamaan dinyatakan
dengan rumus y = a + bx, dengan a ialah
intersep, b ialah kemiringan garis dengan
koefisien korelasi 0,9995 (Harmita 2004).
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat–alat yang digunakan dalam penelitian
ini ialah KCKT Shimadzu LC 20AD, kolom
C18 Bondapak Waters Polaris 5, SPE
Cartdrige Bond Elut C18 Varian, mikropipet
Socorex 10-100 µl dan 100-1000 µl,
mikropipet syringe 50 µl, kertas saring 0.45
µm Waters, dan sentrifus Beckman model Tj-
6.
Bahan-bahan yang digunakan dalam
penelitian ini ialah daging ayam pedaging,
standar tetrasiklin, oksitetrasiklin, dan
klortetrasiklin (Vetranal®), SIGMA), dan
metanol HPLC Grade. Sampel daging ayam
pedaging berasal dari wilayah Jakarta, Bekasi,
dan Depok baik dari pasar tradisional maupun
swalayan yang diambil secara acak dan tidak
mengikuti kaidah statistik.
Metode
Ekstraksi dan Pemurnian Sampel
Metode ekstraksi yang digunakan diadopsi
dari metode yang dikembangkan oleh
Cinquina et al. (2003). Sementara metode
pemurnian sampel yang digunakan
dikembangkan dari Castellari dan Reguiro
(2003) berdasarkan referensi dari AOAC
Official Method 995.09 tentang residu
klortetrasiklin, oksitetrasiklin, dan tetrasiklin
dalam jaringan hewan.
Sebanyak 5,0 gr daging ayam yang telah
diseragamkan ukurannya ditempatkan dalam
tabung sentrifus. Setelah itu ditambahkan 2 ml
larutan asam trikloroasetat 20% kemudian
dikocok menggunakan vorteks. Setelah itu
sampel ditambahkan 18 ml larutan bufer
McIlvaine-EDTA kemudian diputar pada
kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Larutan
supernatan hasil sentrifus dipisahkan dari
residunya kemudian dimasukkan ke dalam
kolom. Ekstraksi diulangi kembali dengan
menambahkan 10 ml larutan bufer McIlvaine-
EDTA, lalu dikocok menggunakan vorteks.
Setelah itu sampel yang telah diekstrak
tersebut diputar pada kecepatan 3000 rpm
selama 10 menit. Larutan supernatan hasil
sentrifus dipisahkan dari residunya kemudian
dimasukkan ke dalam kolom. Proses ekstraksi
selesai, selanjutnya dilanjutkan dengan
pemurnian sampel menggunakan SPE
Cartridge (kolom) C18.
Kolom sebelumnya diaktifkan terlebih
dahulu dengan 20 ml metanol dan 20 ml air.
Setelah itu dimasukkan sebanyak 10 ml
sampel, kolom dicuci dengan 20 ml metanol
5% dan didiamkan selama 5 menit. Kemudian
kolom tersebut dielusi dengan 6 ml metanol
oksalat. Setelah itu, filtrat dipindahkan dalam
aliran gas nitrogen kemudian dilarutkan
dengan 200 µl metanol oksalat. Sebanyak 40
µl sampel dianalisis dengan KCKT.
Larutan Standar Tetrasiklin,
Oksitetrasiklin, dan Klortetrasiklin
Sebanyak 10 mg standar tetrasiklin,
oksitetrasiklin, dan klortetrasiklin dilarutkan
masing-masing dengan metanol lalu
dimasukkan ke dalam labu takar dan
ditepatkan hingga 5 ml untuk mendapatkan
konsentrasi larutan standar 2000 ppm.
Sebanyak 250 µl larutan standar standar
tetrasiklin, 250 µl larutan standar
oksitetrasiklin, dan 500 µl larutan standar
klortetrasiklin konsentrasi 2000 ppm
dimasukkan ke dalam labu takar 5 ml
kemudian ditepatkan dengan metanol
sehingga didapat konsentrasi larutan standar
campuran antibiotik tetrasiklin, oksitetrasiklin,
dan klortetrasiklin (1:1:2) 100:100:200 ppm.
Larutan tersebut dapat diencerkan kembali
untuk pengujian parameter-parameter analisis.
Analisis menggunakan KCKT
Sebanyak 40 µl alikuot diinjeksikan ke
dalam KCKT Shimadzu seri LC 20AD.
Kondisi KCKT sebagai berikut: