GENETICA GTGACGATCGATGCG

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Tom Strachan
Andrew P. Read
 GENETICA
HUMANA T E R C E R A E D IC IÓ N

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Tom Strachan
BSc PhD, FMedSci
Professor o f Human M olecular Genetics and Scientific Director, Institute o f Human Genetics
University o f Newcastle, Newcastle-upon-Tyne, UK
y

Andrew P. Read
MA PhD FRCPath FMedSci
Professor o f Human Genetics
University o f Manchester, Manchester, UK

Traducción
Dr. Jorge Orizaga Samperio
Revisión técnica:
Dr. Ismael Vázquez Moctezuma
Biólogo molecular, Instituto Politécnico Nacional,
México, D. F.

Me
Graw
Hill
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 Contenido

Abreviaturas xxiii
Prefacio xxvii
Auxiliares didácticos suplementarios xxviii
Antes de empezar: uso inteligente de internet xxix

PARTE UNO: Bases 1

Capítulo 1 Estructura del DNA y expresión gènica 3

1.1 Formación de bloques y enlaces químicos en DNA, RNA y polipéptidos 4

1.1.1 El DNA, RNA y polipéptidos son grandes polímeros definidos por una secuencia lineal de unidades
simples rápidas 4
1.1.2 Los enlaces covalentes confieren estabilidad; los enlaces no covalentes, más débiles, facilitan relaciones
intermoleculares y estabilizan la estructura 6
1.2 Estructura y replicación del DNA 8
1.2.1 La estructura del DNA es una hélice doble antiparalela 8
Recuadro 1-1. Ejemplos de la importancia del enlace de hidrógeno en ácidos nucleicos
y proteínas 10
1.2.2 La replicación del DNA es semiconservadora y la síntesis de cadenas de DNA semidiscontinua 10
1.2.3 La maquinaria de replicación del DNA en células de mamíferos es compleja 10
Recuadro 1-2. Principales clases de proteínas que se utilizan en la maquinaria
de replicación de DNA 12
1.2.4 Los genomas virales se conservan con frecuencia por replicación de RNA en lugar de DNA 13
1.3 Transcripción del RNA y expresión genica 13
1.3.1 El flujo de información genética en las células tiene un sentido casi exclusivo: DNA ! RNA ! proteína 13
1.3.2 En organismos complejos, sólo se expresa una fracción pequeña del DNA para formar una proteína
o producto de RNA 15
1.3.3 Durante la transcripción, la información genética en algunos segmentos de DNA (genes)
especifica RNA 16
1.3.4 Se requieren elementos reguladores de acción c is y factores de transcripción de acción transen la
expresión gènica eucariótica 17
1.3.5 La expresión gènica específica de tejido incluye la activación selectiva de genes específicos 19
1.4 Procesamiento del RNA 19
1.4.1 El corte y unión (splicing) del RNA elimina secuencias de RNA no esenciales del transcrito primario 19
1.4.2 Se añaden nucleótidos especializados a los extremos 5' y 3' de la mayor parte de los transcritos de
polimerasa II de RNA 22
1.5 Traducción, procesamiento postraduccional y estructura de las proteínas 23
1.5.1 Durante la traducción se descodifica mRNA en los ribosomas para especificar la síntesis de polipéptidos 23
1.5.2 El código genético se degenera, no es un código universal 25
1.5.3 Las modificaciones postraduccionales incluyen modificaciones químicas de ciertos aminoácidos y
segmentación polipeptídica 26
1.5.4 La secreción de proteínas y el traslado intracelular se controlan mediante señales de localización
específicas o modificaciones químicas 28
1.5.5 La estructura proteínica es muy variada y no es fácil predecirla por la secuencia de aminoácidos 29

Capítulo 2 Estructura y función de los cromosomas 33

2.1 Ploidía y ciclo celular 34

2.2 Estructura y función de los cromosomas 34
2.2.1 El empaque del DNA en los cromosomas sugiere múltiples jerarquías de doblamiento del DNA 35
2.2.2 Cromosomas individuales ocupan territorios no superpuestos en un núcleo en interfase 35
vi i CONTENIDO

2.2.3 Cromosomas como organelos funcionales: sitio central del centromero 36

Recuadro 2-1. Huso mitótico y componentes 37
2.2.4 Cromosomas como organelos funcionales: orígenes de la replicación 37
2.2.5 Cromosomas como organelos funcionales: los telómeros 39
2.2.6 Heterocromatina y eucromatina 40
2.3 Tipos de división celular: mitosis y nieiosis 40
2.3.1 La mitosis es la forma normal de división celular 40
2.3.2 La meiosis es una forma especializada de división celular que origina las células espermatozoo
y óvulo 40
2.3.3 Pareamiento X-Y y regiones seudoautosómicas 44
2.4 Estudio de los cromosomas humanos 44
2.4.1 Es posible observar cromosomas mitóticos en cualquier célula en división, pero en seres humanos es
difícil estudiar los cromosomas meióticos 44
Recuadro 2-2. Bandeo cromosomico 48
2.4.2 Citogenètica molecular: hibridación fluorescente in situ (HFIS) cromosomica 48
Recuadro 2-3. Nomenclatura del cromosoma humano 49
2.4.3 Pintado cromosomico, cariotipificación molecular e hibridación comparativa del genoma 49
2.5 Anormalidades de los cromosomas 49
2.5.1 Tipos de anormalidad cromosomica 51
2.5.2 Las anormalidades cromosómicas numéricas incluyen ganancia o pérdida de cromosomas completos 51
Recuadro 2-4. Nomenclatura de anormalidades cromosómicas 53
2.5.3 Las anormalidades cromosómicas estructurales resultan de la reparación errónea de roturas
de cromosomas o del mal funcionamiento del sistema de recombinación 54
2.5.4 Los complementos cromosómicos al parecer normales pueden ser patogénicos si tienen el origen
parental erróneo 56

Capítulo 3 Células y desarrollo 59

3.1 Estructura y diversidad de células 60

3.1.1 Las procariotas y eucariotas representan la división fundamental de las formas de vida celular 60
3.1.2 El tamaño y la forma de las células puede variar enormemente, pero los índices de
difusión fijan algunos límites superiores 61
3.1.3 En organismos multicelulares, se observa una diferenciación fundamental entre las células somáticas
y la línea germinal 61
Recuadro 3-1. Organización intracelular de las células animales 62
Recuadro 3-2. Citoesqueleto: elemento fundamental para el movimiento y la forma celulares,
y un armazón estructural mayor para el transporte intracelular 63
3.1.4 Los organismos multicelulares no poseen dos células que porten la misma secuencia exacta de DNA 64
3.1.5 Las células de organismos multicelulares pueden estudiarse in situ o en cultivo 65
3.2 Interacciones celulares 67
3.2.1 La comunicación entre células incluye la percepción de moléculas de señalamiento por
receptores específicos 67
3.2.2 Receptores activados inician vías de transducción de señal que pueden incluir cascadas enzimáticas
o segundos mensajeros y da por resultado activación o inhibición de factores de transcripción 68
3.2.3 La organización de las células para formar tejidos requiere adherencia celular 68
3.2.4 La matriz extracelular proporciona una estructura central para todos los tejidos del cuerpo y también
es una fuente importante de señales que controlan la conducta celular 70
3.3 Generalidades del desarrollo 70
3.4 Especialización de las células durante el desarrollo 72
3.4.1 La especialización celular incluye una serie irreversible de decisiones jerárquicas 72
Recuadro 3-3. Modelos animales del desarrollo 72
3.4.2 La elección entre destinos alternativos puede depender del linaje o la posición 73
Recuadro 3-4. Gemelación en embriones humanos 73
Recuadro 3-5. De dónde provienen los tejidos: jerarquía del desarrollo en mamíferos 74
 CONTENIDO vii

Recuadro 3-6. Diversidad de células humanas 75

3.4.3 Las células madre son células progenitoras que se renuevan por sí mismas 76
3.4.4 Se sabe que existe una variedad de células madre tisulares pero aún queda mucho por aprender
acerca de ellas 77
3.4.5 Las células madre embrionarias (ME) tienen el potencial para formar cualquier tejido 78
3.4.6 El potencial de diferenciación de las células madre titulares es motivo de controversias 79
3.5 Formación del patrón en el desarrollo 79
3.5.1 El surgimiento del plan del cuerpo depende de la especificación y polarización del eje 79
3.5.2 Las mutaciones homeóticas revelan la base molecular de la identidad posicional 79
3.5.3 La formación de patrones suele depender de los gradientes de señal 80
3.6 Morfogénesis 80
3.6.1 Cambios en la forma y el tamaño de las células pueden impulsar la morfogénesis 83
3.6.2 Los principales cambios morfogenéticos en el embrión son resultado de la afinidad diferencial
de las células 83
Recuadro 3-7. Polarización del embrión de mamíferos: señales y productos génicos 83
3.6.3 La proliferación celular y la muerte programada de las células (apoptosis) son mecanismos
morfogenéticos importantes 85
3.7 Desarrollo humano inicial: fecundación a gastrulación 85
3.7.1 La fecundación activa el óvulo y une entre sí los núcleos del espermatozoo y el óvulo para formar
un individuo único 85
3.7.2 La segmentación divide al cigoto en muchas células más pequeñas 86
3.7.3 Sólo un porcentaje pequeño de las células del embrión temprano de mamíferos origina el
organismo maduro 87
3.7.4 Implantación 87
3.7.5 La gastrulación es un proceso dinámico por el que las células del epiblasto originan las tres
capas germinales 88
3.8 Desarrollo neural 88
Recuadro 3-8. Membranas extraembrionarias y placenta 89
3.8.1 El sistema nervioso se desarrolla después que el mesodermo subyacente induce al ectodermo a
diferenciarse 89
Recuadro 3-9. Determinación del sexo: genes y ambiente en el desarrollo 93
3.8.2 La formación del patrón en el tubo neural incluye la expresión coordinada de genes a lo largo de
dos ejes 93
3.8.3 La diferenciación neuronal incluye la actividad combinatoria de factores de transcripción 94
3.9 Conservación de las vías del desarrollo 94
3.9.1 Muchas enfermedades humanas se deben a falla de procesos del desarrollo normales 94
3.9.2 Los procesos del desarrollo están muy bien conservados tanto a nivel de genes únicos
como a nivel de vías completas 94

Capítulo 4 Genes en genealogías y poblaciones 101

4.1 Herencia monogénica comparada con multifactorial 102

4.2 Patrones de genealogía mendelianos 102
4.2.1 Dominancia y recesividad son propiedades de caracteres, no de genes 102
4.2.2 Los cinco patrones básicos de genealogía mendeliana 102
Recuadro 4-1. Características de los patrones de herencia mendelianos 104
4.2.3 Rara vez es posible definir sin ambigüedad la modalidad de herencia en una genealogía aislada 104
4.2.4 Un gen-una enzima no implica un gen-un síndrome 105
4.2.5 La herencia mitocondrial origina un patrón de genealogía matrilineal identificable 106
Recuadro 4-2. Prueba de complementación para descubrir si dos caracteres recesivos están
determinados por genes alélicos 106
4.3 Complicaciones de los patrones de genealogía mendelianos básicos 106
4.3.1 Padecimientos recesivos comunes pueden originar a un patrón de genealogía seudodominante 106
4.3.2 La falta de manifestación de un padecimiento dominante se denomina no penetrancia 106
4.3.3 Muchos padecimientos muestran expresión variable 107
4.3.4 En genes improntos, la expresión depende del origen parental 108
viii CONTENIDO

4.3.5 La letalidad masculina puede complicar genealogías ligadas a X 109

4.3.6 Con frecuencia nuevas mutaciones complican la interpretación genealógica y pueden conducir
a mosaicismo 109
4.4 Genética de caracteres multifactoriales: teoría del umbral poligénico 111
4.4.1 Algo de historia 111
4.4.2 Teoría poligénica de los caracteres cuantitativos 112
Recuadro 4-3. Dos conceptos erróneos frecuentes respecto a la regresión a la media 114
Recuadro 4-4. Partición de varianza 115
4.4.3 Teoría poligénica de caracteres discontinuos 115
4.4.4 La asesoría en padecimientos no mendelianos utiliza los riesgos empíricos 115
4.5 Factores que afectan las frecuencias génicas 116
4.5.1 Es posible que las frecuencias génicas y las frecuencias de genotipo establezcan una relación simple 116
4.5.2 Las frecuencias de genotipo pueden utilizarse (con cautela) a fin de calcular índices de mutación 117
Recuadro 4-5- Frecuencias de genotipo de equilibrio de Hardy-Weinberg para frecuencias
de alelos p(Aj) y q(A2) 117
Recuadro 4-6. La distribución de Hardy-Weinberg puede utilizarse (con cautela) para calcular
frecuencias de portador y riesgos simples con fines de asesoramiento 118
Recuadro 4-7. Equilibrio entre mutación y selección 118
4.5.3 La ventaja del heterocigoto puede ser mucho más importante que la mutación recurrente para
determinar la frecuencia de una enfermedad recesiva 118
Recuadro 4-8. Selección en favor de heterocigotos para fibrosis quística (FQ) 119

Capítulo 5 Amplificación del DNA: clonación de DNA por PCR y basada en células 121
5.1 Importancia de la clonación del DNA 122
5.2 PCR: características y aplicaciones básicas 123
5.2.1 Principios de la PCR básica y la PCR de transcriptasa inversa (TI) 123
Recuadro 5-1. Glosario de métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 124
5.2.2 La PCR tiene dos limitaciones importantes: tamaños cortos y elaboración baja de productos 125
5.2.3 Aplicaciones generales de la PCR 127
5.2.4 Algunas PCR se diseñaron para permitir múltiples productos de amplificación y amplificar
secuencias no caracterizadas con anterioridad 128
5.3 Principios de la clonación del DNA basada en células 129
5.3.1 Generalidades de la clonación del DNA basada en células 129
Recuadro 5-2. Endonucleasas de restricción y sistemas de modificación y restricción 129
5.3.2 Las endonucleasas de restricción permitieron cortar DNA blanco en piezas manejables que pueden
unirse a moléculas vectoras cortadas de manera similar 130
5.3.3 La introducción de DNA recombinante en células receptoras proporcionan un método para fraccionar
una población de DNA de inicio compleja 133
5.3.4 Las genotecas de DNA son un amplio grupo de clonas de DNA que representan una población
de DNA de inicio compleja 135
5.3.5 Con frecuencia se logra la selección recombinante mediante inactivación insercional de un gen marcador 136
Recuadro 5-3. Mutaciones supresoras sin sentido 138
Recuadro 5-4. Importancia de los sitios de secuencia marcados (SSM) 138
5.4 Sistemas de clonación para amplificar fragmentos de diferentes tamaños 140
5.4.1 Los vectores plásmidos estándar proporcionan un medio simple para clonar fragmentos de DNA
pequeños en células bacterianas (y eucariotas simples) 140
5.4.2 Los vectores lambda y cósmidos proporcionan medios eficientes para clonar fragmentos de DNA
moderadamente grandes en células bacterianas 141
5.4.3 Es posible clonar grandes segmentos de DNA en células bacterianas con vectores basados en
bacteriófagos P1 y plásmidos de factor F 143
5.4.4 Los cromosomas artificiales de levadura (YAC) permiten clonar fragmentos de megabase 144
5.5 Sistemas de clonación para producir DNA de cadena única y mutagenizado 146
5.5.1 El DNA de cadena única para utilizarse en la secuenciación de DNA se obtiene con vectores
M I3 o fagómidos o amplificación lineal por PCR 146
5.5.2 La mutagénesis de oligonucleótido incompatibible puede crear un cambio predeterminado de
un nucleótido único en cualquier gen clonado 146
 CONTENIDO I ix

5.5.3 La mutagenesis basada en PCR incluye el acoplamiento de secuencias o grupos químicos deseados a una
secuencia blanco y mutagénesis específica de sitio 147
5.6 Sistemas de clonación diseñados para expresar genes 148
5.6.1 Es posible producir grandes cantidades de proteínas mediante la clonación de expresión en células
bacterianas 149
5.6.2 La exhibición de fago es una forma de clonación de expresión en la que se expresan las proteínas
en superficies de células bacterianas 151
5.6.3 La expresión gènica eucariota se lleva a cabo con mayor fidelidad en líneas de células eucariotas 151
Recuadro 5-5. Transferencia de genes a células animales cultivadas 153

Capítulo 6 Hibridación de ácido nucleico: principios y aplicaciones 157

6.1 Preparación de sondas de ácido nucleico 158

6.1.1 Los ácidos nucleicos pueden marcarse de manera conveniente in vitro si se incorporan nucleótidos
modificados 158
6.1.2 Pueden marcarse ácidos nucleicos mediante métodos isotópicos y no isotópicos 159
Recuadro 6-1. Principios de la autorradiografía 161
6.2 Principios de la hibridación de ácido nucleico 163
6.2.1 La hibridación de ácido nucleico es un método para identificar moléculas relacionadas en forma
cercana dentro de dos poblaciones de ácido nucleico 163
Recuadro 6-2. Sistemas de marcado y detección con fluorescencia 166
6.2.2 Las cinéticas de reasociación de DNA se definen mediante el producto de la concentración de DNA
y el tiempo (C0t) 166
Recuadro 6-3. Glosario de hibridación de ácido nucleico 168
6.2.3 Es posible utilizar una gran variedad de valoraciones de hibridación de ácido nucleico 169
6.3 Valoraciones de hibridación de ácido nucleico mediante sondas de DNA clonado para
seleccionar poblaciones de ácido nucleico no clonado 170
6.3.1 En la hibridación dot-blot, un método rápido de detección, suelen emplearse sondas de
oligonucleótidos específicas de alelo 170
Recuadro 6-4. Valoraciones de hibridación de ácido nucleico estándar e inversa 171
6.3.2 Las hibridaciones Southern b lo ty Northern blot detectan ácidos nucleicos cuyo tamaño se fraccionó
mediante electroforesis en gel 171
6.3.3 La electroforesis en gel de campo pulsado extiende la hibridación Southern al incluir la detección
de moléculas de DNA muy grandes 173
6.3.4 Sondas de hibridación in situ se hibridan para desnaturalizar DNA de una preparación de
cromosomas o RNA de un corte de tejido fijado en un portaobjetos de vidrio 174
6.4 Valoraciones de hibridación mediante el uso de DNA blanco clonado y microarreglos 176
6.4.1 La hibridación colony b lo ty la de levantado de placa son métodos para seleccionar colonias o placas
bacterianas separadas 176
6.4.2 Los arreglos de alta densidad en rejillas de clonas de células transformadas o clonas de DNA
incrementaron de modo considerable la eficiencia de la selección de genotecas de DNA 176
6.4.3 La tecnología de microarreglos de DNA extendió muchísimo la potencia de la hibridación de
ácido nucleico 177

Capítulo 7 Análisis del DNA y estructura, variación y expresión génicas 181

7.1 Secuenciación y genotipificación de DNA 182

7.1.1 La secuenciación estándar de DNA incluye la síntesis enzimàtica de DNA mediante terminadores de
cadena didesoxinucleótidos específicos de bases 182
Recuadro 7-1. Producción de plantillas de secuenciación de DNA de cadena única 182
7.1.2 Secuenciación automatizada de DNA y resecuenciación basada en microarreglos 183
7.1.3 Genotipificación básica de polimorfismos de sitio de restricción y número variable de polimorfismos
de repetición tándem 183
7.2 Identificación de genes en DNA clonado y establecimiento de su estructura 186
Recuadro 7-2. Clases comunes de polimorfismo de DNA susceptibles a métodos simples
de genotipificación 187
X 1 CONTENIDO

7.2.1 El atrapamiento de exón identifica secuencias expresadas mediante una valoración artificial de empalme
(splicing) de RNA 187
7.2.2 La selección de cDNA identifica secuencias expresadas en clonas genómicas mediante la formación de
heterodúplex 188
7.2.3 Obtención de secuencias de cDNA de longitud completa: grupos de clonas superpuestas y
amplificación PCR-RACE 188
7.2.4 Mapeo de sitios de inicio de transcripción y definición de límites exón-intrón 189
7.3 Estudio de la expresión génica 190
7.3.1 Principios de la selección de expresión 190
Recuadro 7-3. Investigación de homología en bases de datos 192
7.3.2 Análisis de expresión génica basado en hibridación: del análisis de un gen aislado a la selección de
la expresión del genoma completo 193
7.3.3 Análisis de expresión génica basados en PCR: PCR-RT y exhibición diferencial de mRNA 197
7.3.4 En las selecciones de expresión de proteínas suelen utilizarse anticuerpos muy
específicos 198
Recuadro 7-4. Obtención de anticuerpos 200
7.3.5 Los marcados autofluorescentes de proteína constituyen un medio potente para rastrear la
localización subcelular de proteínas 202

PARTE DOS: El genoma humano y su relación con otros genomas 205

Capítulo 8 Proyectos del genoma y organismos modelos 207

8.1 Importancia pionera de los proyectos del genoma 208

8.1.1 Los proyectos del genoma prepararon el camino para los estudios sistemáticos del universo interno 208
8.1.2 Se espera que los beneficios médicos y científicos de los proyectos del genoma sean enormes 208
Recuadro 8-1. Glosario de genómica 209
8.2 Fundamento y organización del Proyecto del Genoma Humano 210
8.2.1 Los polimorfismos de DNA y las nuevas tecnologías de clonación de DNA allanaron el camino
para la secuenciación del genoma humano 210
8.2.2 El Proyecto del Genoma Humano se llevó a cabo en grandes centros de genoma con capacidades
de secuenciación de alto rendimiento 210
8.3 Cómo se mapeó y secuenció el genoma humano 212
8.3.1 Los primeros mapas genéticos humanos útiles se basaron en marcadores microsatélites 212
Recuadro 8-2. Genes humanos y nomenclatura del segmento de DNA 212
Recuadro 8-3. Principales acontecimientos importantes en el mapeo y secuenciación del
genoma humano 213
8.3.2 Los primeros mapas físicos de alta resolución del genoma humano se basaron en contiguos de
clonas y referencias de sitios de secuenciación marcados (STS) 213
Recuadro 8-4. Mapeo de células híbridas 215
8.3.3 La etapa final del Proyecto del Genoma Humano dependió en vital medida de los contiguos
de clonas BAC/PAC 217
Recuadro 8-5. Mapeo físico mediante formación de contiguos de clonas 218
8.3.4 Los primeros mapas de genes humanos de alta densidad se basaron en marcadores de
secuencias expresados (EST) 219
Recuadro 8-6. Cooperación, competencia y controversia en los proyectos de genoma 220
8.3.5 El esquema de la secuencia del genoma humano sugirió 30 000 a 35 000 genes humanos,
pero es difícil estimar un total preciso 221
8.3.6 Etapas finales del Proyecto del Genoma Humano: anotación de genes y ontología génica 222
8.3.7 Son importantes los análisis de la variación de secuencias del genoma humano para la
investigación antropológica y médica 224
8.3.8 Sin las salvaguardas apropiadas, el Proyecto del Genoma Humano podría conducir a la
discriminación contra portadores de genes de enfermedades y también al resurgimiento de la eugénica 225
8.4 Proyectos de genomas para organismos modelos 225
8.4.1 Existe una enorme diversidad de proyectos genómicos procariotas 225
 CONTENIDO xi

8.4.2 El proyecto del genoma de S. cerevisiae fue el primero de muchos proyectos de genomas protistas exitosos 226
8.4.3 El proyecto del genoma de Caenorhabditis elegans fue el primer proyecto de un genoma animal
terminado 226
Recuadro 8-7. Modelos de organismos unicelulares 227
8.4.4 Los proyectos del genoma de metazoarios se enfocan sobre todo en modelos del desarrollo y
enfermedades 228
Recuadro 8-8. Animales multicelulares modelos para comprender el desarrollo, las enfermedades
y la función genica 230

Capítulo 9 Organización del genoma humano 239

9.1 Organización general del genoma humano 240
9.1.1 Generalidades del genoma humano 240
9.1.2 El genoma mitocondrial consiste en un dúplex de DNA circular pequeño empacado a densidad
con información genética 241
Recuadro 9-1. Variación del número de copias del genoma en células humanas 242
Recuadro 9-2. Autonomía limitada del genoma mitocondrial 243
9.1.3 El genoma nuclear consiste en 24 moléculas de DNA diferentes que corresponden a los 24 cromosomas
humanos distintos 244
9.1.4 El genoma humano contiene alrededor de 30 000 a 35 000 genes distribuidos de forma irregular pero
las cifras son inexactas 245
Recuadro 9-3. Mediación del DNA e islotes CpG 246
9.2 Organización, distribución y función de genes RNA humanos 247
9.2.1 Un total de casi 1 200 genes humanos codifican rRNA o tRNA y están organizados sobre todo en
grupos génicos grandes 247
9.2.2 Los RNA nuclear y nucleolar pequeños están codificados por familias génicas grandes esparcidas en
una gran proporción 249
Recuadro 9-4. Especificidad de anticodón de tRNA citoplásmico eucariota 249
9.2.3 Los micro-RNA y otros RNA reguladores nuevos son desafiantes preconcepciones sobre la extensión
de la función del RNA 250
9.3 Organización, distribución y (unción de genes humanos que codifican polipéptidos 253
9.3.1 Los genes humanos muestran una enorme variación de tamaño y organización interna 253
9.3.2 Algunas veces están agrupados genes similares desde el punto de vista funcional en el genoma humano,
pero con mayor frecuencia están esparcidos en diferentes cromosomas 254
Recuadro 9-5. Genoma humano y estadísticas de genes humanos 255
9.3.3 En ocasiones se encuentran en el genoma humano genes superpuestos, genes dentro de genes y
unidades de transcripción policistrónicas 256
9.3.4 Las familias génicas que codifican polipéptidos pueden clasificarse de acuerdo con el grado y extensión
de la relación de la secuencia en miembros de la familia 257
9.3.5 Los genes en familias génicas humanas pueden estar organizados en grupos pequeños o esparcidos con
amplitud, o ambas cosas 259
9.3.6 En familias multigénicas se encuentran casi siempre seudogenes, copias de genes truncadas y
fragmentos génicos 262
9.3.7 Se ha iniciado la clasificación del proteoma humano, pero aún son inciertas las funciones precisas de
muchas proteínas humanas 265
9.4 DNA no codificante de repetición tándem 265
9.4.1 El DNA satélite consiste en disposiciones muy largas de repeticiones tándem que pueden separarse
del volumen del DNA mediante centrifugación de gradiente de densidad 265
9.4.2 El DNA minisatélite está compuesto de configuraciones de tamaño moderado de repeticiones tándem
y con frecuencia se localiza en telómeros o cerca de ellos 267
9.4.3 El DNA microsatélite consiste en configuraciones cortas de repeticiones tándem simples y está disperso
en la totalidad del genoma humano 268
9.5 DNA no codificante repetido disperso 268
9.5.1 Las repeticiones derivadas de transposón constituyen hasta > 40% del genoma humano y surgieron
sobre todo por intermediarios de RNA 268
9.5.2 Algunos elementos LINE-1 humanos se transponen de modo activo y permiten la transposición de
SINES, seudogenes y retrogenes procesados 270
xii I CONTENIDO

9.5.3 Las repeticiones Alu ocurren más de una vez cada 3 kb en el genoma humano y pueden someterse a
selección positiva 271

Capítulo 10 Expresión génica humana 275

10.1 Generalidades de la expresión génica en células humanas 276

Recuadro 10-1. Restricción espacial y temporal de la expresión génica en células de mamíferos 276
10.2 Control de la expresión génica por enlace de factores proteínicos de acción tra ns a secuencias
reguladoras de acción cis en DNA y RNA 277
10.2.1 La modificación de la histona y la remodelación de la cromatina facilitan el acceso a la cromatina
mediante factores de enlace de DNA 278
10.2.2 La transcripción mediante polimerasas de RNA I y III requiere factores de transcripción ubicuos 279
10.2.3 La transcripción mediante polimerasa de RNA II requiere juegos completos de secuencias reguladoras
con acción cis y factores de transcripción específicos de tejido 280
10.2.4 Los factores de transcripción contienen elementos estructurales conservados que permiten el enlace
de DNA 282
Recuadro 10-2. Clases de elementos de secuencia de acción cis que participan en la regulación
de la transcripción de genes codificadores de polipéptidos 283
10.2.5 Una diversidad de mecanismos permite la regulación transcripcional de la expresión génica en
respuesta a estímulos externos 285
10.2.6 El control traduccional de la expresión génica puede incluir el reconocimiento de secuencias
reguladoras UTR por proteínas de enlace de RNA 288
10.3 Transcripción y procesamiento alternativos de genes individuales 291
10.3.1 El uso de promotores alternativos puede generar isoformas específicas de tejido 291
10.3.2 Los genes humanos son propensos a empalme (corte y unión, splicing) y poliadenilación alternativos 291
10.3.3 La edición de RNA es una forma rara de procesamiento por la que se introducen
cambios específicos de bases en el RNA 293
Recuadro 10-3. El empalme (corte y unión, splicitig) alternativo puede alterar las
propiedades funcionales de una proteína 293
10.4 Expresión génica diferencial: orígenes a través de asimetría y perpetuación hasta mecanismos
epigenéticos como metilación de DNA 294
10.4.1 Es muy probable que la expresión génica selectiva en las células de embriones de mamíferos
se desarrollara en respuesta a fenómenos de señalamiento intercelulares de corto alcance 295
10.4.2 La metilación del DNA es un factor epigenético importante en la perpetuación de la represión génica
en células de vertebrados 295
10.4.3 La metilación del DNA animal puede constituir una defensa contra transposones lo mismo que
la expresión génica reguladora 297
10.5 Control de largo alcance de la expresión y la impronta génicas 298
10.5.1 La estructura de la cromatina puede ejercer un control de la expresión génica de largo alcance 298
10.5.2 Una región de control de locus común puede coordinar la expresión de genes individuales en
grupos génicos 299
10.5.3 Algunos genes humanos muestran expresión selectiva de sólo uno de los dos alelos parentales 300
10.5.4 La impronta genómica incluye diferencias en la expresión de alelos según el padre de origen 301
Recuadro 10-4. Mecanismos que dan por resultado expresión monoalélica a partir de genes
bialélicos en células humanas 302
Recuadro 10-5. Falta de equivalencia de los genomas materno y paterno 302
10.5.5 El mecanismo de la impronta genómica no está claro pero la metilación del DNA parece ser un
componente fundamental 303
10.5.6 La inactivación del cromosoma X en mamíferos comprende la represión de la expresión génica
de acción cis de muy largo alcance 305
10.6 Organización y expresión únicas de genes de Ig y RCT 306
10.6.1 Reordenamientos del DNA en células B y T generan exones específicos de células que codifican
regiones variables de Ig y RCT 308
10.6.2 El cambio de clase de cadena pesada comprende la unión de un exón VDJ aislado a unidades de
transcripción de región constante alternativas 309
10.6.3 La monoespecificidad de las Ig y los RCT se debe a la exclusión alélica y de cadena ligera 310
 CONTENIDO | xiii

Capítulo 11 Inestabilidad del genoma humano: mutación y reparación del DNA 315

11.1 Generalidades de mutación, polimorfismo y reparación del DNA 316

11.2 Mutaciones simples 316
11.2.1 Las mutaciones que se deben a errores en la replicación y la reparación del DNA son frecuentes 316
Recuadro 11-1. Clases de polimorfismo genético y variación de secuencias 317
11.2.2 La frecuencia de sustituciones de bases individuales es no aleatoria de acuerdo con
la clase de sustitución 318
11.2.3 La frecuencia y la gama de mutaciones en el DNA codificante difieren de las del DNA no codificante 318
Recuadro 11-2. Mecanismos que afectan la frecuencia de alelos en la población 319
11.2.4 La localización de sustituciones de bases en el DNA de codificación es no aleatoria 320
11.2.5 Las tasas de sustitución varían de manera considerable entre diferentes genes y entre distintos
componentes génicos 320
Recuadro 11-3. Clases de sustitución de una base en el DNA que codifica polipéptidos 321
11.2.6 La tasa de sustitución puede variar en las diferentes regiones cromosómicas y en distintos linajes 323
Recuadro 11-4. Diferencias de sexo en la tasa de mutación y el problema de la evolución
impulsada por varones 326
11.3 Mecanismos genéticos que producen intercambios de secuencias entre repeticiones 326
11.3.1 El deslizamiento de la replicación puede causar polimorfismo de número variable de repetición
tándem (NVRT) en repeticiones tándem cortas (microsatélites) 329
11.3.2 Las unidades grandes de DNA de repetición tándem son propensas a inserción/deleción como
resultado de cruzamiento desigual o de intercambios desiguales de cromátides hermanas 329
11.3.3 Los acontecimientos de conversión gènica pueden ser más o menos frecuentes en DNA
de repetición tándem 329
11.4 Mutaciones patógenas 331
11.4.1 La tasa de mutación perjudicial es alta en homínidos 332
11.4.2 El genoma mitocondrial es un punto crítico para mutaciones patógenas 332
11.4.3 Casi todas las mutaciones por empalme (splicing) alteran una secuencia conservadora necesaria
para el empalme normal, pero algunas ocurren en secuencias que no suelen requerirse para empalme 333
11.4.4 Las mutaciones que introducen un codón de terminación prematuro a menudo dan por resultado
un mRNA inestable, pero otros resultados finales son posibles 336
11.5 Potencial patógeno de secuencias repetidas 337
11.5.1 El pareamiento erróneo de cadena deslizada de repeticiones tándem cortas predispone a
deleciones patógenas e inserciones de cambio de marco 337
11.5.2 La expansión inestable de repeticiones tándem cortas puede causar una diversidad de enfermedades,
pero el mecanismo mutacional no se comprende bien 337
11.5.3 Las familias de repetición tándem y de genes agrupados pueden ser propensas a cruzamiento
desigual patógeno y a acontecimientos semejantes a la conversión gènica 339
11.5.4 A menudo las repeticiones dispersas predisponen a deleciones y duplicaciones grandes 341
11.5.5 Las inversiones patógenas pueden producirse mediante recombinación intracromátide entre
repeticiones invertidas 342
11.5.6 La transposición de secuencias del DNA no es rara y puede causar enfermedad 343
11.6 Reparación del DNA 344
11.6 .1 La reparación del DNA suele incluir cortar y eliminar, y sintetizar de nuevo un área completa
de DNA que rodea el daño 345
11.6.2 Los sistemas de reparación del DNA comparten componentes y procesos con la maquinaria
de transcripción y recombinación 347
11.6.3 A menudo la hipersensibilidad a agentes que dañan el DNA produce un deterioro de la respuesta
celular al daño del DNA en lugar de una reparación defectuosa del DNA 347

Capítulo 12 Lugar del hombre en el árbol de la vida 351

12.1 Evolución de la estructura gènica y genes duplicados 352

12.1.1 Es probable que los intrones espliceosómicos se originaran de intrones del grupo II y aparecieran
por primera vez en las células eucariotas iniciales 352
Recuadro 12-1. Grupos de intrones 353
12.1.2 Los genes complejos pueden evolucionar mediante duplicación intragénica, muchas veces como
resultado de duplicación exónica 353
 12.1.3 La mezcla de exones puede traer consigo nuevas combinaciones de dominios proteínicos 354
12.1.4 La duplicación génica tuvo un papel crucial en la evolución de organismos multicelulares 354
Recuadro 12-2. Fases simétricas de exones e intrones 355
Recuadro 12-3. Mecanismos y paralogía de la duplicación génica 357
12.1.5 La superfamilia de la globina evolucionó por un proceso de duplicaciones génicas, conversiones
de genes y pérdida/inactivación génica 358
12.1.6 La retrotransposición puede permitir la mezcla de exones y contribuye de manera considerable
a la evolución génica 360
12.2 Evolución de cromosomas y genomas 362
12.2.1 Es posible que el genoma mitocondrial se originara después de la endocitosis de una célula
procariota por un precursor de la célula eucariota 362
Recuadro 12-4. Arbol universal de la vida y transferencia génica horizontal 363
12.2.2 La presión de selección reducida causó la divergencia del código genético mitocondrial 364
12.2.3 Es posible que la evolución de los genomas de vertebrados incluyera duplicación del genoma completo 364
12.2.4 Durante la evolución de los genomas de mamíferos hubo numerosos reordenamientos cromosómicos
mayores 365
12.2.5 Duplicación segmentaria en linajes de primates e inestabilidad evolucionista de secuencias
pericentroméricas y subteloméricas 367
12.2.6 Los cromosomas X y Y humanos muestran regiones importantes de homología secuencial,
incluidas las regiones seudoautosómicas comunes 368
12.2.7 Los cromosomas del sexo humanos evolucionaron de autosomas y divergieron debido a la
supresión regional periódica de recombinación 369
12.2.8 La diferenciación del cromosoma del sexo dio por resultado degeneración progresiva del
cromosoma Y e inactivación del cromosoma X 372
12.3 Filogenética molecular y genómica comparativa 374
12.3.1 La filogenética molecular utiliza alineamientos de secuencias para elaborar árboles evolucionistas 374
12.3.2 Los nuevos programas de computadora alinean secuencias a gran escala y del genoma completo
para asistir el análisis y la identificación evolucionistas de secuencias conservadas 376
12.3.3 El número de genes suele ser proporcional a la complejidad biológica 377
12.3.4 Las comparaciones de proteomas revelan la extensión de la especialización progresiva de proteínas 377
12.4 ¿Qué convierte al hombre en ser humano? 379
12.4.1 ¿Qué diferencia a los seres humanos de los ratones? 380
12.4.2 ¿Qué diferencia al ser humano de sus relacionados más cercanos, los grandes monos? 384
Recuadro 12-5. Glosario de grupos y conceptos filogenéticos metazoáricos comunes 386
12.5 Evolución de las poblaciones humanas 387
12.5.1 Las pruebas genéticas sugieren un origen reciente de los seres humanos modernos en
poblaciones africanas 389
12.5.2 La diversidad genética humana es baja y se debe sobre todo a variación dentro de las
poblaciones más que entre ellas 391
Recuadro 12-6. Análisis de coalescencia 391

PARTE TRES: Mapeo e identificación de genes patológicos y mutaciones 39 7

Capítulo 13 Mapeo genético de caracteres mendelianos 399

13.1 Recombinantes y no recombinantes 400

13.1.1 La fracción de recombinación es una medición de la distancia genética 400
13.1.2 Sin embargo, las fracciones de recombinación no exceden de 0.5 por muy considerable que sea
la distancia física 400
13.1.3 Las funciones de mapeo definen la relación entre la fracción de recombinación y la distancia genética 401
13.1.4 Cuentas de quiasmas y longitud total del mapa 401
13.1.5 Mapas físicos y genéticos: distribución de recombinantes 402
13.2 Marcadores genéticos 404
13.2.1 El mapeo de genes de enfermedades humanas requiere marcadores genéticos 404
13.2.2 El contenido de información de heterocigosidad o polimorfismo mide el grado de información
de un marcador 405
Recuadro 13-1. Desarrollo de marcadores genéticos humanos 405
 CONTENIDO | xv

13.2.3 Los polimorfismos de DNA son la base de todos los marcadores genéticos actuales 405
Recuadro 13-2. Meiosis informativa y no informativa 406
13.3 Mapeo de dos puntos 407
13.3.1 No siempre es fácil calificar recombinantes en genealogías humanas 407
13.3.2 El análisis computadorizado de la calificación lod es el mejor medio para analizar genealogías
complejas para enlace entre caracteres mendelianos 407
Recuadro 13-3. Cálculo de calificaciones lod para las familias de la figura 13-6 408
13.3.3 Calificaciones lod de +3 y -22 son los criterios para enlace y exclusión (para una prueba única) 408
13.3.4 Para investigaciones en el genoma completo debe utilizarse un umbral de significancia de toda
la extensión del genoma 409
13.4 El mapeo de múltiples puntos es más eficiente que el mapeo de dos puntos 409
13.4.1 El enlace de múltiples puntos puede localizar un locus de enfermedad en un marco estructural
de marcadores 409
Recuadro 13-4. Cálculo bayesiano del umbral de enlace 409
13.4.2 Mapas de marco estructural marcador: familias CEPH 410
13.4.3 Mapeo de marcador de enfermedad de múltiples puntos 410
13.5 Mapeo fino mediante genealogías extendidas y haplotipos ancestrales 411
13.5.1 El mapeo de autocigosidad puede mapear con eficiencia padecimientos recesivos en familias
endogámicas extendidas 411
13.5.2 La identificación de segmentos ancestrales compartidos permitió el mapeo de alta resolución
de los locus para la fibrosis quística y el síndrome de rotura de Nijmegen 412
13.6 El análisis de calificación lod estándar no está exento de problemas 414
13.6.1 Los errores en la genotipificación y los diagnósticos erróneos pueden generar recombinantes falsas 414
13.6.2 Las dificultades computacionales limitan las genealogías posibles 415
13.6.3 La heterogeneidad de locus siempre es un posible error en el mapeo de genes humanos 415
13.6.4 El mapeo meiótico tiene una resolución limitada 415
13.6.5 Con los métodos descritos en este capítulo no es posible mapear caracteres cuya herencia no
es mendeliana 415

Capítulo 14 Identificación de genes patológicos humanos 417

14.1 Principios y formas de identificar genes patológicos 418

14.2 Conductas independientes de la posición para identificar genes de enfermedad 418
14.2.1 Identificación de un gen de enfermedad por el conocimiento del producto proteínico 418
14.2.2 Identificación del gen patológico a través de un modelo animal 420
14.2.3 Identificación de un gen de enfermedad mediante el conocimiento de la secuencia de DNA
independiente de la posición 420
14.3 Clonación posicional 420
14.3.1 El primer paso consiste en definir la región candidata tanto como sea posible 421
14.3.2 Es necesario establecer un contiguo de clonas a través de la región candidata 421
14.3.3 Un mapa de transcritos define todos los genes dentro de la región candidata 422
14.3.4 Son prioritarios los genes de la región candidata para pruebas de mutación 423
Recuadro 14-1. Mapeo de transcritos: métodos de laboratorio que complementan los análisis de
bases de datos para identificar secuencias expresadas dentro de clonas genómicas 423
14.3.5 Importancia especial de los mutantes de ratón 424
14.4 Uso de anormalidades cromosómicas 425
14.4.1 Son interesantes los pacientes con una anormalidad cromosómica equilibrada y un fenotipo inexplicable 425
Recuadro 14-2. Mapeo de genes del ratón 425
14.4.2 Los pacientes con dos trastornos mendelianos, o uno mendeliano junto con retraso mental, pueden
tener una deleción cromosómica 427
Recuadro 14-3. Indicadores de la presencia de anormalidades cromosómicas 428
14.5 Confirmación de un gen candidato 429
Recuadro 14-4. Efectos de la posición: un peligro latente en la identificación de genes patológicos 429
14.5.1 Selección de mutación para confirmar un gen candidato 430
14.5.2 Una vez que se confirma un gen candidato, el paso siguiente es comprender su función 430
xvi I CONTENIDO

Recuadro 14-5. Hibridación genómica comparativa (HGC) para la detección de desequilibrios

cromosómicos submicroscópicos 430
14.6 Ocho ejemplos ilustran diversas formas de identificar genes de enfermedades 431
14.6.1 Identificación directa de un gen a través de una anormalidad cromosómica: síndrome de Sotos 431
14.6.2 Mapeo de transcritos puros: síndrome de Treacher-Collins 431
14.6.3 Secuenciación y búsqueda de homólogos a gran escala: síndrome branquiootorrenal 432
14.6.4 Candidatos posicionales definidos mediante función: rodopsina y fibrilina 432
14.6.5 Un candidato posicional identificado a través de la comparación de mapas humanos y de ratón:
PAX3 y síndrome de Waardenburg 433
14.6.6 Inferencia de la función in vitro: anemia de Fanconi 433
14.6.7 Inferencia de función in vivo: miosina 15 y sordera DFNB3 433
14.6.8 Inferencia del patrón de expresión: otoferlina 433

Capítulo 15 Mapeo e identificación de genes que confieren susceptibilidad a enfermedades complejas 437

15.1 Decidir si un carácter no mendeliano es genético: función de los estudios de familia, gemelos
y adopción 438
15.1.1 El valor X es una medida de agrupamiento familiar 438
15.1.2 Importancia del ambiente familiar compartido 438
15.1.3 Los estudios de gemelos adolecen de muchas limitaciones 439
15.1.4 Estudios de adopción: el estándar ideal para desenmarañar factores genéticos y ambientales 439
15.2 El análisis de segregación permite analizar los caracteres que se encuentran en cualquier parte
del espectro entre puramente mendeliano y sólo poligénico 440
15.2.1 El sesgo de indagación suele ser un problema con datos familiares: el ejemplo de padecimientos
autosómicos recesivos 440
15.2.2 El análisis de segregación compleja es un método general para estimar la mezcla más probable
de factores genéticos en datos mancomunados de familias 440
Recuadro 15-1. Corrección de la relación de segregación 441
15.3 Análisis de enlace de caracteres complejos 442
15.3.1 El análisis de calificación lod estándar no suele ser apropiado para caracteres no mendelianos 442
15.3.2 El análisis de enlace no paramétrico no requiere un modelo genético 443
15.3.3 Análisis de segmento compartido en familias: análisis de par de hermanos afectados y miembro
de la genealogía afectada 443
15.3.4 Los umbrales de significancia son una consideración importante en el análisis de enfermedades
complejas 444
15.4 Estudios de asociación y desequilibrio de enlace 445
15.4.1 ¿Por qué suceden asociaciones? 445
15.4.2 Asociación es un principio muy distinto de enlace, pero donde la familia y la población se fusionan,
el enlace y la asociación se fúnden 446
Recuadro 15-2. Medidas de desequilibrio de enlace 446
15.4.3 Muchos estudios muestran islotes de desequilibrio de enlace separados por puntos críticos
de recombinación 447
15.4.4 Diseño de estudios de asociación 448
Recuadro 15-3. Prueba de desequilibrio de transmisión (PDT) para determinar si el alelo
marcador M, se relaciona con una enfermedad 449
15.4.5 Enlace y asociación: técnicas complementarias 450
Recuadro 15-4. Tamaños de muestras necesarios para encontrar un locus de susceptibilidad
a una enfermedad por el estudio del genoma completo mediante el uso de pares de hermanos
afectados (PHA) o la prueba de desequilibrio de transmisión (PDT) 450
15.5 Identificación de alelos de susceptibilidad 451
15.6 Ocho ejemplos que ilustran el éxito variable de la disección genética de enfermedades complejas 451
15.6.1 Cáncer de mama: la identificación de un subgrupo mendeliano condujo a adelantos médicos
importantes, pero no explica las causas de la enfermedad esporádica frecuente 452
15.6.2 Enfermedad de Hirschsprung: una enfermedad oligogénica 453
15.6.3 Enfermedad de Alzheimer: los factores genéticos son importantes tanto en la forma frecuente
de inicio tardío como en las formas mendelianas raras de inicio temprano, pero son genes
diferentes que actúan de manera distinta 454
 CONTENIDO | xvii

15.6.4 Diabetes mellitus tipo 1: ¿aún es la pesadilla de los genetistas? 455

Recuadro 1 de ética. Enfermedad de Alzheimer, prueba de ApoE y discriminación 455
15.6.5 Diabetes tipo 2: dos factores de susceptibilidad, uno muy frecuente para ser indetectable mediante
enlace; el otro muy complejo y sólo en ciertas poblaciones 457
15.6.6 Enfermedades inflamatorias del intestino: un gen de susceptibilidad preciso identificado 458
15.6.7 Esquizofrenia: los problemas especiales de los trastornos psiquiátricos o conductuales 459
15.6.8 Obesidad: análisis genético de un carácter cuantitativo 460
15.7 Generalidades y resumen 461
15.7.1 ¿Por qué es tan difícil? 461
15.7.2 Si todo funciona y se identifican alelos de susceptibilidad, ¿entonces qué? 461

Capítulo 16 Patología molecular 465

16.1 Introducción 466

16.2 La nomenclatura conveniente de alelos A y a oculta una inmensa diversidad de secuencias de DNA 466
16.3 Una primera clasificación de mutaciones con pérdida de función comparadas con mutaciones
con ganancia de función 466
16.3.1 El aspecto importante para la patología molecular no es la secuencia de una alelo mutante sino su efecto 466
Recuadro 16-1. Principales clases de mutación 466
Recuadro 16-2. Nomenclatura para describir cambios de secuencia 467
Recuadro 16-3. Nomenclatura para describir el efecto de un alelo 467
16.3.2 Una pérdida de función es probable cuando las mutaciones de punto en un gen producen el
mismo cambio patológico que las deleciones 467
16.3.3 Una ganancia de función es probable cuando sólo una mutación específica en un gen produce
una patología determinada 468
16.3.4 Puede ser difícil decidir si el cambio en una secuencia de DNA es patógeno 468
16.4 Mutaciones con pérdida de función 469
16.4.1 Muchos cambios distintos en un gen pueden causar pérdida de función 469
Recuadro 16-4. Hemoglobinopatías 469
Recuadro 16-5. Lincamientos para estimar la significancia de un cambio de secuencia de DNA 470
16.4.2 En la haploinsuficiencia una reducción de 50% del nivel de la función génica causa un
fenotipo anormal 471
16.4.3 Las mutaciones en proteínas que actúan como dímeros y multímeros a veces producen efectos
dominantes negativos 473
16.4.4 La modificación epigenética puede abolir la función génica aun sin un cambio de secuencia
de DNA 473
16.5 Mutaciones con ganancia de función 473
16.5.1 La adquisición de una función nueva es rara en enfermedades hereditarias pero frecuente en el cáncer 473
16.5.2 La expresión excesiva puede ser patógena 473
16.5.3 Los cambios cualitativos en el producto de un gen pueden causar ganancia de función 474
16.6 Patología molecular: del gen a la enfermedad 475
16.6.1 En mutaciones con pérdida de función el efecto fenotípico depende del nivel residual de
función génica 475
Recuadro 16-6. Patología molecular de los síndromes de Prader-Wílli y de Angelman 476
16.6.2 Las mutaciones con pérdida de función y ganancia de función en el mismo gen causarán
diferentes enfermedades 478
16.6.3 La variabilidad entre familias es evidencia de genes modificadores o efectos al azar 478
16.6.4 Repeticiones en expansión inestables: una nueva causa de enfermedad 479
16.6.5 La agregación de proteínas es un mecanismo patógeno frecuente en enfermedades por ganancia
de función 481
16.6.6 La heteroplasmia y la inestabilidad complican la relación entre genotipo y fenotipo en las mutaciones
mitocondriales 482
16.7 Patología molecular: de la enfermedad al gen 482
16.7.1 Es posible que el gen subyacente a una enfermedad no sea el obvio 482
16.7.2 La heterogeneidad de locus es la regla en lugar de la excepción 483
xviii I CONTENIDO

16.7.3 Mutaciones en diferentes miembros de una familia génica pueden producir una serie de síndromes
relacionados o superpuestos 483
16.7.4 Las clasificaciones clínica y molecular son herramientas alternativas para pensar acerca de las
enfermedades y cada una es válida en su esfera 483
16.8 Patología molecular de trastornos cromosómicos 484
16.8.1 Los síndromes de microdeleción unen la brecha entre síndromes de gen único y cromosómicos484
16.8.2 Los principales efectos de las aneuploidías cromosómicas pueden deberse a desequilibrios de dosis
en unos cuantos genes identificables 486

Capítulo 17 Genética del cáncer 48 9

17.1 Introducción 490

17.2 Evolución del cáncer 490
Recuadro 17-1. Dos formas de establecer una serie de mutaciones sucesivas más probables 491
17.3 Oncogenes 491
17.3.1 Historia de los oncogenes 491
17.3.2 Funciones de los oncogenes 492
17.3.3 Activación de protooncogenes 492
17.4 Genes supresores de tumor 494
17.4.1 El paradigma del retinoblastoma 494
17.4.2 La selección de pérdida de heterocigosidad (LoH) se utiliza con amplitud para intentar
identificar las localizaciones de genes supresores de tumor (ST) 499
17.4.3 Con frecuencia los genes supresores de tumor son silenciados epigenéticamente por metilación499
17.5 Estabilidad del genoma 499
17.5.1 Inestabilidad cromosómica 499
17.5.2 Reparación de defectos del DNA e inestabilidad a nivel del DNA 501
17.5.3 Cáncer de colon no polipósico hereditario e inestabilidad microsatélite 501
17.5.4 p53 y apoptosis 502
17.6 Control del ciclo celular 503
17.6.1 Punto de control Gl-S 503
17.7 Integración de los datos: vías y capacidades 504
17.7.1 Vías en el cáncer colorrectal 505
17.7.2 Un tumor con éxito debe adquirir seis capacidades específicas 506
17.8 ¡Para qué sirve todo este conocimiento? 506

Capítulo 18 Pruebas genéticas en individuos y poblaciones 511

18.1 Introducción 512

18.2 Elección del material para pruebas: DNA, RNA o proteínas 512
18.3 Estudio de un gen para mutaciones 513
18.3.1 Métodos basados en secuenciación 513
18.3.2 Métodos basados en la detección de compatibilidades erróneas o heterodúplex 513
18.3.3 Métodos basados en análisis de conformación de cadena única 514
18.3.4 Métodos basados en traducción: prueba de truncamiento de proteína (PTT) 515
18.3.5 Métodos para detectar deleciones 515
18.3.6 Métodos para detectar patrones de metilación del DNA 516
18.4 Pruebas para un cambio de secuencia especificado 517
18.4.1 Se dispone de muchos métodos simples para genotipificar una variante especificada 518
Recuadro 18-1. Hibridación multiplex con sonda amplificable (MAPH) 520
18.4.2 Métodos para genotipificación de alto rendimiento 521
18.4.3 Pruebas genéticas para enfermedades por repetición de tripletos 521
18.4.4 El origen geográfico es una consideración importante para algunas pruebas 523
18.5 Rastreo génico 523
18.5.1 El rastreo génico incluye tres pasos lógicos 525
18.5.2 La recombinación establece un límite fundamental en la precisión del rastreo génico 526
18.5.3 Cálculo de los riesgos en el rastreo génico 526
 CONTENIDO ¡ xix

Recuadro 18-2. Dos métodos para la genotipificación de alto rendimiento 526

18.5.4 Problemas especiales de la distrofia muscular de Duchenne 529
Recuadro 18-3. Lógica del rastreo génico 529
18.6 Selección de población 530
18.6.1 Los programas de selección aceptables deben ajustarse a ciertos criterios 531
Recuadro 18-4. Uso del teorema de Bayes para combinar probabilidades 531
18.6.2 La especificidad y la sensibilidad miden el desempeño técnico de una prueba de selección 531
18.6.3 Organización de un programa de selección genética 532
18.7 El perfil de DNA puede utilizarse para identificar individuos y determinar relaciones 533
18.7.1 Para el perfil suele emplearse una diversidad de polimorfismos de DNA diferentes 534
18.7.2 El perfil de DNA puede usarse para determinar la cigosidad de gemelos 534
18.7.3 El perfil de DNA puede emplearse para descartar o establecer la paternidad 536
18.7.4 El perfil del DNA es un medio potente para las investigaciones forenses 536
Recuadro 18-5. La falacia del fiscal 537

PARTE CUATRO: Nuevos horizontes: en el siglo xxi 539

Capítulo 19 Más allá del proyecto del genoma: genómica funcional, proteómica y bioinformática 539

19.1 Generalidades de genómica funcional 542

19.1.1 La información obtenida de la fase estructural del Proyecto del Genoma Humano es de uso
limitado sin una anotación funcional 542
19.1.2 Las funciones de genes individuales pueden describirse a niveles bioquímico, celular y del
organismo completo 542
19.1.3 Las relaciones funcionales entre los genes deben estudiarse a niveles del transcriptoma y el proteoma 542
Recuadro 19-1. Función de la glucocinasa 543
19.1.4 Las técnicas de análisis de alto rendimiento y la bioinformática son tecnologías que hacen capaz
la genómica funcional 543
19.2 Anotación funcional mediante comparación de secuencias 543
19.2.1 La comparación de secuencias permite asignar funciones tentativas a los genes 543
19.2.2 Métodos de búsqueda consenso pueden extender el número de relaciones homologas identificadas 545
19.2.3 Las similitudes y diferencias entre genomas indican secuencias conservadas e importantes desde el
punto de vista funcional 545
19.2.4 La genómica comparativa puede aprovecharse para identificar y caracterizar genes de enfermedades
en humanos 546
19.2.5 Una minoría inflexible de genes resiste la anotación funcional mediante búsqueda de homología 547
19.3 Perfil global del mRNA (transcriptómica) 548
19.3.1 El análisis del transcriptoma revela cómo los cambios en los patrones de expresión génica coordinan
las actividades bioquímicas de la célula en la salud y la enfermedad 548
19.3.2 El muestreo secuencial directo es un método estadístico para determinar la abundancia relativa
de diferentes transcritos 548
Recuadro 19-2. Técnicas de muestreo de secuencias para el análisis global de la expresión génica 549
19.3.3 Los microarreglos de DNA recurren a valoraciones de hibridación multiplex para medir la
abundancia de miles de transcritos en forma simultánea 550
19.3.4 El análisis de datos de arreglos de DNA incluye la creación de una matriz de distancia y el
agrupamiento de puntos de datos relacionados utilizando algoritmos reiterativos 554
19.3.5 Los arreglos de DNA se utilizan para estudiar la expresión génica global en líneas de células humanas,
biopsias de tejidos y modelos animales de enfermedad 555
19.4 Proteómica ' 556
19.4.1 La proteómica comprende el análisis de la expresión de proteínas y de la estructura y las interacciones
proteínicas 556
19.4.2 La proteómica de expresión floreció a través de la combinación de dos plataformas de tecnología
mayores: la electroforesis en gel bidimensional (EG2D) y la espectrometría de masa 556
Recuadro 19-3. Chips de proteínas 557
Recuadro 19-4. Espectrometría de masa en proteómica 561
19.4.3 La proteómica de expresión se usa para estudiar cambios en el proteoma relacionados con
enfermedad y toxicidad 562
XX I CONTENIDO

19.4.4 Las estructuras de las proteínas proveen información funcional importante 562
19.4.5 Existen muchas maneras distintas para estudiar interacciones de proteínas individuales 565
Recuadro 19-5. Determinación de estructuras de proteínas 566
19.4.6 Selección de interacción de alto rendimiento con métodos basados en genotecas 567
Recuadro 19-6. Clasificación estructural de proteínas 570
19.4.7 El desafío de la proteómica de interacción es ensamblar un mapa de interacción funcional de la célula 573
19.4.8 La información de interacciones proteínicas con ligandos pequeños puede mejorar el conocimiento
de los procesos biomoleculares y proveer una base racional para el diseño de fármacos 574
19.5 Resumen 575

Capítulo 20 Manipulación genética de células y animales 577

20.1 Generalidades de la tecnología de transferencia gènica 578

20.2 Principios de la transferencia gènica 578
20.2.1 La transferencia gènica puede utilizarse para nuevas secuencias de DNA funcionales en células
animales cultivadas, en forma pasajera o estable 578
20.2.2 La producción de animales transgénicos requiere la transferencia gènica estable a la línea germinal 579
Recuadro 20-1. Métodos de transferencia gènica a células animales en cultivo 580
Recuadro 20-2. Marcadores seleccionables para células animales 581
Recuadro 20-3. Aislamiento y manipulación de células madre embrionarias de mamíferos 584
20.2.3 El control de la expresión transgénica es una consideración importante en cualquier experimento
de transferencia gènica 586
20.2.4 La transferencia gènica también es útil para producir mutaciones definidas y alterar la expresión
de genes endógenos 588
20.2.5 El envío dirigido de genes permite producir animales que portan mutaciones definidas en
todas las células 588
20.2.6 La recombinación específica de sitio posibilita la inactivación gènica condicional y la
ingeniería cromosómica 591
20.2.7 Las estrategias transgénicas pueden usarse para inhibir la función de genes endógenos 592
20.3 Uso de la transferencia genica para estudiar la expresión y la función génicas 595
20.3.1 La expresión y la regulación génicas pueden investigarse por medio de genes rastreadores 595
20.3.2 La función gènica puede investigarse generando mutaciones con pérdida de función y ganancia
de función, y fenocopias 596
Recuadro 20-4. Genes rastreadores para células animales 597
20.3.3 Los análisis de la función gènica a gran escala por mutagénesis insercional e interferencia sistemática
del RNA son partes fundamentales de la genómica funcional 598
Recuadro 20-5. Vectores complicados utilizados para mutagénesis insercional 600
20.4 Creación de modelos de enfermedad mediante transferencia gènica y tecnología de envío
dirigido de genes 601
20.4.1 Modelado de la patogénesis de enfermedades y tratamiento farmacológico en cultivos de células 602
20.4.2 Puede ser difícil identificar modelos de enfermedad en animales generados de manera espontánea
o inducidos por mutagénesis aleatoria 602
20.4.3 Los ratones tienen una gran utilidad como modelos animales de enfermedades humanas en gran
parte porque pueden crearse mutaciones específicas en un locus predeterminado 603
20.4.4 Es posible modelar mutaciones con pérdida de función mediante envío dirigido de genes y
mutaciones con ganancia de función por expresión de genes mutantes dominantes 603
Recuadro 20-6. Potencial de animales para el modelado de enfermedades en humanos 605
20.4.5 La atención se dirige cada vez más al uso de animales transgénicos para modelar trastornos complejos 606
20.4.6 Una variedad de diferencias entre el humano y el ratón puede dificultar la construcción de modelos
de enfermedades humanas en ratones 606

Capítulo 21 Nuevas conductas para el tratamiento de enfermedades 611

21.1 El tratamiento de una enfermedad genética y la terapéutica genética de una afección no son
lo mismo 612
21.2 Tratamiento de anormalidades genéticas 612
 CONTENIDO sci

21.3 Uso del conocimiento genético para mejorar los tratamientos existentes y desarrollar nuevas
terapéuticas convencionales 612
21.3.1 La farmacogenética promete incrementar la efectividad de los medicamentos y reducir los efectos
secundarios peligrosos 612
21.3.2 Las compañías farmacéuticas realizan grandes inversiones en genómica para identificar nuevos blancos
farmacológicos 613
21.3.3 Los tratamientos basados en células prometen transformar el potencial de los transplantes 614
21.3.4 Proteínas recombinantes y vacunas 615
Recuadro 1 de ética. Etica de la clonación humana 616
21.4 Principios de la terapéutica gènica 618
21.5 Métodos para insertar y expresar un gen en una célula o tejido blanco 619
21.5.1 Es posible transferir genes a células receptoras en el laboratorio (ex vivo) o dentro del cuerpo
del paciente (in vivo) 619
Recuadro 2 de ética. Terapéutica con línea germinal y tratamiento gènico somático 619
2 1 .5.2 Pueden diseñarse vectores para integrarse en los cromosomas de la célula huésped o permanecer
como episomas 621
21.5.3 Los virus son los vectores utilizados con más frecuencia para la terapéutica gènica 621
Recuadro 21-1. Informe del Panel de los NIH de 1995 sobre terapéutica gènica (informe
Orkin-Motulsky) 621
Recuadro 3 de ética. Diseño de niños 622
21.5.4 Los sistemas vectores no virales evitan muchos de los problemas de inseguridad de los virus
recombinantes, pero las tasas de transferencia gènica son casi siempre bajas 625
21.6 Métodos para reparar o inactivar un gen patógeno en una célula o tejido 627
2 1 .6.1 Reparación de un alelo mutante mediante recombinación homologa 627
2 1 .6.2 Inhibición de la traducción mediante oligonucleótidos antisentido 627
21.6.3 Destrucción o reparación selectiva de mRNA por una ribozima 627
21.6.4 Inhibición selectiva del alelo mutante mediante interferencia por RNA (iRNA) 628
21.7 Algunos ejemplos de intentos de terapéutica gènica humana 628
21.7.1 El primer éxito definitivo: curación de la inmunodeficiencia combinada grave ligada a X 628
21.7.2 Intentos de terapéutica gènica para la fibrosis quística 629
21.7.3 Intentos de terapéutica gènica para la distrofia muscular de Duchenne 630
21.7.4 Terapéutica gènica para el cáncer 631
21.7.5 Terapéutica gènica para las enfermedades infecciosas: HIV 631

Glosario 635
índice de enfermedades 647
índice 649
 Abreviaturas

2D Bidimensional ddNTP Trifosfato de didesoxinucleósido

5-MeC 5-Metilcitosina DE Desequilibrio de enlace
A Adenina DE Donador de empalme
Acm Anticuerpo monoclonal DEEP Clasificación de doblez basada en la alineación
AcMNPV Virus de la polihedrosis nuclear califórnica estructura-estructura de proteínas
autógrafa df Doble filamento
ADAR Desaminasa de adenosina que actúa en el RNA DFP Displasia fibrosa poliostótica
AE Aceptor de empalme DIMJ Diabetes con inicio en la madurez del joven
AEC Ataxia espinocerebeiosa DIQ Dimerización inducida químicamente
AEC1 Ataxia espinocerebeiosa tipo 1 DMD Distrofia muscular de Duchenne
AID Desaminasa inducida por activación DNA Ácido desoxirribonucleico
ALH Antígeno de leucocitos humanos DN-asa I Desoxirribonucleasa I
AMH Hormona antimülleriana DO Densidad óptica
ANCP Antígeno nuclear de célula proliferante DRMC Desviación de raíz media cuadrada
APT Activador del plasminógeno tisular DUP Disomía uniparental
AREC Amplificación rápida de extremos de cDNA E2DG Electroforesis bidimensional en gel
ASEG Análisis seriado de expresión génica EARS Empalme alterado relacionado sin .sentido
AT Ataxia telangiectásica EASV Estenosis aórtica supravalvular
ATCC American Type Culture Collection EBV Virus de Epstein-Barr
BDG Base de datos del genoma EC Enfermedad de Crohn
BDP Banco de Datos de Proteínas ECACC European Collection o f Cell Cultures
BLAST-IPE BLAST iterado de posición específica ECM Elemento centrómero
BOR Síndrome branquiootorrenal EDG Electroforesis de diferenciación en gel
BrdU Bromodesoxiuridina EG Equivalentes de genomas
BrEt Bromuro de etidio EGCP Electroforesis en gel de campo pulsado
C Citosina EGF Factor de crecimiento epidérmico
CAP Cromosoma artificial P1 EGGD Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante
CATH Class Architecture Topology Homologous, EH Enfermedad de Huntington
superfamilia EHi Enfermedad de Hirschsprung
CBA Cromosoma bacteriano artificial Eli Enfermedad inflamatoria del intestino
CCC Circular covalentemente cerrado EM Espectrometría de masa
CCNPH Cáncer de colon no polipósico hereditario ENEC Elementos nucleares entremezclados cortos
CCRE Complementación cruzada de reparación de ENEL Elementos nucleares entremezclados largos
escisión ENO Efecto nuclear de Overhauser
CD Cruzamiento desigual EPRA Enfermedad poliquística renal del adulto
CDLAE Cromatografía desnaturalizante en líquido de ERH Elemento que responde al hierro
alta ejecución ES/EM Espectroscopia de masa tándem
cDNA DNA complementario ESRN Elemento silenciador restrictivo neural
CE Carcinoma embrionario EVA Endodermo visceral anterior
CGP Célula germinal primordial FIE Factor 1 esteroidogénico
CIP Contenido de información de polimorfismo FCU Fenilcetonuria
CLAP Cromatografía en líquido de alta presión FISH Hibridación fluorescente in situ
cM CentiMorgan FIV Fecundación in vitro
CMH Célula madre hemopoyética FQ Fibrosis quística
COMT Centro de organización de microtúbulos FR Forma replicativa
CQt Producto de la concentración de DNA y tiempo FSRN Factor silenciador restrictivo neural
CP Compatibilidad perfecta FT Factores de transcripción
CPV Células productoras de vector FU Filamento único
CSIR Complejo silenciador inducido por RNA Fvcu Fragmento variable de cadena única
CU Colitis ulcerosa G Guanina
D Desplazamiento o diversidad Gcv Ganciclovir
DAM Dispersión anómala de multilongitud de onda GE Germen embrionario
DC Dicigótico GPI Gradiente de pH inmovilizado
xxiv ABREVIATURAS

GSS Gerstmann-Straussler-Scheinker MFT Monofosfato de timidina

GST Transferasa de glutatión S MGSC Mouse Genome Sequencing Consortium (Consorcio
HAH Hélice-asa-hélice de Secuenciación del Genoma del Ratón)
HAT Acetiltransferasa de histona MI Mesodermo intermedio
HDAC Desacetilasa de histona miRNA Micro-RNA
HDMP Impresión digital de masa de péptidos MLA Marco de lectura alternativo
HDV Virus delta humano MP Mesodermo paraaxil
HFIS Hibridación fluorescente in situ MPE Mesodermo de placa externa
HFISM HFIS múltiple mRNA RNA mensajero
HGC Hibridación genómica comparativa MSE Marcados de secuencia expresada; metilsulfonato
HGH Hélice-giro-hélice de etilo
HMSA Hibridación multiplex de sonda amplificable mtDNA DNA mitocondrial
HPRT Fosforribosiltransferasa de hipoxantina y guanina NF1 Neurofibromatosis tipo I
HSV-TK Cinasa de timidina del virus del herpes simple NUE Nitrosourea de etilo
HUGO Human Genome Organization (Organización del OEA Oligonucleótido específico de alelo
Genoma Humano) OG Ontologia gènica
ICLC Interlab Cell Line Collection (Colección Interlab OI Osteogénesis imperfecta
de Líneas Celulares) P Pesada
IDCG Inmunodeficiencia combinada grave PAF Poliposis adenomatosa familiar
IDCG-X Enfermedad de inmunodeficiencia combinada pb Pares de bases
grave ligada a X PCR Reacción en cadena de la polimerasa
IDCH Intercambio desigual de cromátide hermana PCR-COD Reacción en cadena de la polimerasa cebada con
IE Identidad por estado oligonucleótido degenerado
IEE Intensificador de empalme exónico PCR-TI Reacción en cadena de la polimerasa de
IELS Implicaciones éticas, legales y sociales transcriptasa inversa
PDGH Proyecto de la Diversidad del Genoma Humano
IEP Ionización por electropulverización
PDT Prueba de desequilibrio de transmisión
Ig Inmunoglobulina
PDTE PDT extendida
IICE Inyección intracitoplásmica de espermatozoides
PEG Polietilenglicol
IM Inestabilidad microsatélite
PeH Pérdida de heterocigosidad
IMC Indice de masa corporal
PFV Proteína fluorescente verde
IMER Integración mediada por enzima de restricción
PGH Proyecto del Genoma Humano
INC Inestabilidad cromosómica
Ph Filadelfia
INCP Incompatibilidad
PHA Par de hermanos afectados
IP3 1,4,5-trifosfato de inositol
Pi Pirimidina
IPD Identidad por descendencia
PIPj 4,5-Difosfato de fosfatidilinositol
IPTG IsopropiI-tio-(3-D-galactopiranósido
PNU Polimorfismo de nucleótido único
ISCN International System fo r Human Cytogenetic
PP. Residuo pirofosfato
Nomenclature (Sistema Internacional para la PRLF Polimorfismo de longitud de fragmento de
Nomenclatura Citogenética Humana) restricción
ITCF Isotiocianato de fluoresceína PRS Partícula de reconocimiento de señal
kb Kilobases PRSS Polimorfismo de repetición de secuencia simple
KEGG Kyoto Encyclopedia o f Genes and Genomes PRTC Polimorfismo de repetición tándem corta
(Enciclopedia Kioto de Genes y Genomas) PSR Polimorfismo de sitio de restricción
L Luz PTP Prueba de truncación de proteína
LCC Locus de carácter cuantitativo Pu Purina
LLA Leucemia linfoblastoide aguda RAP Región de agrupamiento de punto de rotura
LMA Leucemia mieloide aguda RCL Región de control de locus
LNP Lod no paramétrico RCT Receptor de célula T
LPM Leucemia promielocítica RDC Región determinante de la complementariedad
m7G 7-Metilguanosina RE Retículo endoplásmico
Ma Millón de años REB Reparación de escisión de base
MACI Marcadores de afinidad codificados por isótopo REM Repetición entremezclada de amplitud de
MACN Molécula de adherencia de célula neural mamíferos
MADL Monómero Alu derecho libre REN Reparación de escisión de nucleótido
MAIL Monómero Alu izquierdo libre RER Retículo endoplásmico rugoso
Mb Megabase REST Factor de transcripción silenciador RE-1
Me Monocigótico RFA Regiones de fijación de andamiaje
MCI Masa celular interna RFM Región de fijación de matriz
ME Madre embrionaria RIUDA Restitución isomorfa única con dispersión
MEC Matriz extracelular anómala
 Prefacio

Genética m olecular humana se revisó y actualizó a la luz de los descubrimientos consecutivos del Proyecto del Genoma Humano
l Human Genome Proyect). A medida que entramos en la era posgenoma, aún pensamos que este libro proporciona un enlace entre libros
de texto elementales y la bibliografía sobre investigación, de tal manera que las personas sin demasiadas bases sobre el tema puedan
apreciar y leer las últimas investigaciones.
La genética molecular humana es un tema enorme. Hemos intentado hacerla más comprensible al organizar el texto en secciones
codificadas a color demarcadas con claridad, con oraciones sinópticas en forma de encabezados y nuevos términos importantes destacados
en cursivas.
La primera sección (capítulos 1 a 7) incluye material básico sobre la estructura y función del DNA, cromosomas, células y desarrollo,
análisis de genealogía y técnicas básicas utilizadas en un laboratorio. La segunda (capítulos 8 a 12) comenta los diversos proyectos de
secuenciación del genoma y las informaciones que proporcionan sobre la organización, expresión, variación y evolución del genoma
humano. La tercera (capítulos 13 a 18) se enfoca en el mapeo, identificación y diagnóstico de causas genéticas de enfermedades
mendelianas, complejas y oncológicas. Por último, en la cuarta parte (capítulos 19 a 21) se analizan los horizontes más amplios de la
genómica funcional, proteómica, bioinformática, modelos animales y terapéutica.
Asimismo, se incluye un glosario extenso y tres glosarios especiales adicionales en los capítulos 5, 6 y 12. También hay dos índices:
uno principal (marcado con una cinta verde en el borde de la página) y un índice de enfermedades (indicado con una cinta roja).
Durante los cuatro años transcurridos desde que se publicó la segunda edición de Genética m olecular humana se han observado
muchos acontecimientos. El borrador de la secuencia del genoma humano apareció en 2001 y la versión “terminada” se publicó en 2003.
Los lectores familiarizados con la edición previa advertirán muchos cambios. Hay nuevos capítulos sobre células y desarrollo y genómica
funcional. Se reescribieron y organizaron por completo las secciones sobre enfermedades complejas y el capítulo de proyectos del
genoma. Entre los múltiples cambios más pequeños hay que mencionar una nueva sección sobre filogenética molecular (capítulo 12) y la
introducción de recuadros de ética para comentar algunas de las implicaciones del nuevo conocimiento. Además, se revisó y actualizó
virtualmente cada página para considerar los desarrollos sorprendentes de los últimos cuatro años. La producción a todo color fue un
cambio agradable y significó una revisión total de todas las figuras, con muchas del todo nuevas. Tal y como en la edición anterior, las
figuras están disponibles (excepto algunas tomadas de otras publicaciones) para descargarlas de sitios de la red del editor.
Algunas cosas no han cambiado. Nuestro propósito es aún explicar los principios y no proporcionar gran número de hechos. Es fácil
consultar los acontecimientos relevantes, sobre todo a través de internet, y proporcionamos las referencias necesarias. El carácter científico
exige que en las revisiones de investigación se utilice la referencia a fin de dar crédito a las personas que llevaron a cabo los
descubrimientos originales. Sin embargo, en esta obra, las bibliografías al final de cada capítulo tienen un propósito más didáctico; con
frecuencia citamos revisiones en lugar del primer artículo sobre un tema y hemos intentado elegir referencias de revistas de fácil acceso.
Esperamos la comprensión de las personas que no encuentren una referencia a un artículo básico. Antes que todo, como en ediciones
previas, intentamos reflejar la sensación de una investigación de rápido movimiento y esperamos que los lectores compartirán al final
nuestra motivación y entusiasmo para continuar la travesía del descubrimiento hacia nuestro genoma.
Como siempre, agradecemos a las múltiples personas que comentaron la edición antecesora, incluso si no fue posible siempre
incorporar sus sugerencias. En la edición actual, apreciamos el consejo y los comentarios sobre capítulos de muchos colegas, en especial
Gavin Cuthbert, Ian Hampson, Mike Jackson, Ralf Kist, Chris Mathew, Heiko Peters, Nalin Thakker, Andy Wallace y John
Wolstenholme. Richard Twyman amerita un agradecimiento especial por su importante ayuda en los capítulos 3, 19 y 20. Ha sido un
placer trabajar con Jonathan Ray, Fran Kingston, el grupo de Garland Science/BIOS Scientific Publishers y Touchmedia, quienes
desarrollaron las ilustraciones a todo color. Por último, agradecemos a nuestras familias, en especial Meryl, Alex, James y Gilly, y a las
secretarias Anne, Kate, Leanne y Margaret su apoyo y tolerancia, lo que ha representado en ocasiones tiempo de estrés para todos ellos.

Tom Strachan y Andrew Read

 Auxiliares didácticos suplementarios

El m aterial suplementario para estudiantes incluye:

Genética molecular humana 3: problemas y soluciones
Es un texto adjunto de Genética m olecular humana 3 y en él se halla una autovaloración que contiene muchas preguntas de elección
múltiple, preguntas y respuestas de revisión y problemas de respuesta abierta.

Los materiales suplementarios disponibles para profesores incluyen:

The Art of Human Molecular Genetics 3
Es un CD-ROM que contiene todas las figuras del libro para fines de presentación. Las figuras se encuentran disponibles en formato
JPEG y PowerPoint y están disponibles para los conferencistas que adopten el texto. También pueden adquirirse.

Garland Science Classwire™

Tenemos el agrado de ofrecer Garland Science Classwire™ a quienes adquieran Genética m olecular humana 3, un sitio de la red que
permite:
► Acceso a recursos para enseñanza proporcionados por Garland Science.
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Para G e n é tica m o l e c u la r h u m a n a 3 los recursos d e enseñanza en línea incluyen:

► Todas las imágenes del libro en una forma descargable, lista para la red, y en fácil formato en PowerPoint.
► El acceso a todos los demás recursos de Garland Science se encuentra en Classwire.
Quienes adquieran Genética m olecular humana 3 están autorizados para utilizar en forma ilimitada el servicio de Garland Science
Classwire. Puede observarse la demostración en línea de Classwire™ en www.classwire.com/garlandscience/demol.html.

Para detalles más amplios, p o r favor, póngase en contacto con su representante d e ventas local.

Classwire es una marca registrada de Chalkfree Inc.

 Antes de empezar:
uso inteligente de internet
A los estudiantes e investigadores de la actualidad no es necesario indicarles que utilicen internet. Sin embargo, hay algunos puntos en
particular importantes para los lectores de este libro que desearíamos señalar desde el inicio.
En este libro intentamos incluir los principios de la genética molecular humana, pero no hemos indicado demasiados hechos. Cuando
los proporcionamos, son sobre todo para ilustrar principios. Pero los principios sin hechos son bastante estériles y esperamos que el lector
vea los hechos, según sea necesario, en internet. Los proyectos del genoma, y todos los investigadores relacionados con la genética humana,
han producido una enorme cantidad de datos. El uso inteligente y selectivo de internet es una habilidad clave para cualquier científico, pero
tal vez en especial para genetistas y estudiantes de genética.
Hemos llevado a cabo una búsqueda en Google para “genética” y aquélla produjo 3 630 000 referencias. Algunos de esos sitios son
recursos claves, muchos son secundarios y algunos son erróneos e imprecisos. Durante el curso del libro recomendamos varios sitios para
temas particulares. A continuación sugerimos algunos sitios específicos; los elegimos porque son confiables, estables (no es probable que
cambien durante la vida de este libro) y proporcionan enlaces de gran ayuda a muchos otros portales. Con base en estos puntos
preliminares, el lector debe ser capaz de elaborar su lista personal de sitios útiles y aprovechar de modo sensible las asombrosas riquezas
que se encuentran en internet.

► Puntos de inicio generales para datos genéticos: http://www.ncbi.nlm.nih.gov; http://www.ebi.ac.uk/services/

► Para información sobre el genoma: www.ensembl.org;http://genome.cse.ucsc.edu
► Para información sobre proteínas: http://ca.expasy.org/;
► Para información sobre cualquier fenotipo mendeliano: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/
► Acceso a publicaciones biomédicas: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/
PARTE UNO

Bases

j
CAPÍTULO UNO

Estructura del DNA

y expresión genica

Contenido del capítulo

4 [ CAPÍTULO UNO [ ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIÓN GÈNICA

1.1 Form ación de bloques y enlaces
quím icos en DNA, RNA y
polípéptidos
La genética molecular se relaciona sobre todo con la interrelación
entre las macromoléculas de información de DNA (á cid o desoxi-
rrib o n u cleico ) y RNA (á cid o rib o n u cleico ) y la forma en que se
utilizan esas moléculas para sintetizar p o lip ép tid o s, el componente
básico de todas las proteínas. En algunos virus, el RNA es el mate­
rial hereditario, pero en todas las células la información genética se
aloja en moléculas de DNA. Regiones seleccionadas de las molécu­
las celulares de DNA sirven como plantillas para sintetizar molécu­
las de RNA. La gran mayoría de las moléculas de RNA se emplea,
a su vez, para especificar la síntesis de polipéptidos, sea de manera
directa o mediante la ayuda de la expresión génica en diferentes eta­
pas. Si se toma en cuenta que la expresión génica está enfocada ca­
si en su totalidad en la síntesis de polipéptidos, las proteínas
representan el principal punto final funcional del DNA y constitu­
yen la mayor parte del peso seco de una célula. El término p r o te í­
na deriva del griego proteios, que significa “de la primera jerarquía”,
y alude a las actividades importantes de las proteínas en diversas
funciones celulares al actuar como enzimas, receptores, proteínas
de almacenamiento, proteínas de transporte, factores de transcrip­
ción, moléculas de señalamiento, hormonas, etcétera.
1.1.1 El DNA, RNA y polipéptidos son grandes
polímeros definidos por una secuencia lineal
de unidades simples rápidas
En eucariotas se encuentran moléculas individuales de DNA en los
cromosomas de los núcleos, las mitocondrias y asimismo los cloro-
plastos de células de plantas. Son polímeros grandes, con una es­
tructura básica lineal de residuos de azúcar y fosfato alternados. El
azúcar en las moléculas de DNA es desox irribosa, un azúcar de
cinco carbonos, y están unidos residuos sucesivos de azúcar por en­
laces fosfodiéster covalentes. Fijada de manera covalente al átomo
de carbono número 1 ' (uno p rim a ) de cada residuo de azúcar figu­
ra una base de nitrógeno. Se encuentran cuatro tipos de bases: a d e-
n in a (A), cito sin a ( C), gu a n in a (G) y tim in a (T) y consisten en
anillos heterocíclicos de átomos de carbono y nitrógeno. Pueden
dividirse en dos clases:
► Purinas (A y G) que tienen dos anillos heterocíclicos engrana­
dos.
► Pirimidinas (C y T) que poseen uno de estos anillos.
Un azúcar con una base unida se denomina nucleósido. Un nu-
cleósido con un grupo fosfato unido al átomo de carbono 5' o 3'
constituye un nucleótido, que es la unidad de repetición básica de
una cadena de DNA (figs. 1-1 y 1-2). La composición de las molécu­
las de RNA es similar a la de las moléculas de DNA, pero difiere en
que contiene residuos de azúcar ribosa en lugar de desoxirribosa y
u ra cilo (U) en lugar de timina (figs. 1-1 y 1-2).
Para su composición, las proteínas incluyen una o más molécu­
las polipeptídicas que pueden modificarse por la adición de varias
cadenas laterales de carbohidratos u otros grupos químicos. Al igual
que el DNA y el RNA, las moléculas polipeptídicas son polímeros
que consisten en una secuencia lineal de unidades repetidas, en es­
te caso aminoácidos. Estos últimos se conforman con los grupos
amino, de carga positiva, y ácido carboxílico (carboxilo), de carga
negativa, conectados por un átomo de carbón central al cual está
unida una cadena lateral de identificación. Los 20 aminoácidos di­
ferentes pueden agruparse en distintas clases según sea la naturale-

BASE NUCLEÓSIDO N U C LEÓ TID O

(= base + azúcar) (= nucleósido + fosfato)

R IB O S A I
M O N O FO SFA TO DIFO SFATO TR IFO SFA TO
D E SO XIR R IB O SA

I PU R IN A S I

A deno sina A M P (adenilato) ADP ATP

A denina [
Desoxiadenosina dA M P dADP dATP
G uanosina q M P (guanilato) GDP GTP
G uanina [
Desoxiguanosina dG M P dGDP dGTP

P IR IM ID IN A S

C itidina C M P (citidilato) CDP CTP

C itosina I
Desoxicitidina dCM P dCDP dCTP
Tim idlna [T M P ] (timidilato) [TDP] FTP]
Tim ina [ Desoxitim idina dTM P dTDP dTTP
U ridina [U M P ] (uridilato) UDP UTP
Uracilo
Desoxiuridina dUM P dUDP dUTP

Fig. 1-1. Bases comunes que se encuentran en ácidos nucleicos con nucleósidos y nucleótidos correspondientes.

Nota: 1) los nucleótidos con un monofosfato suelen describirse con nombres en los que se reemplaza el sufijo -in a de la base por el sufijo -ila to , como
en adenilato, guanilato, etc.; 2) los paréntesis en TMR TDP y TTP indican que en condiciones normales no se encuentran.
 1.1 | FORMACIÓN DE BLOQUES Y ENLACES QUÍMICOS EN DNA, RNA Y POLIPfiPTIDOS | 5

N C \ 8 HN C \
I II CH I II CH8
HC C / ,C C /
N 4 NH H 2N N N NH
3 93

A d e n in a (A) G u a n in a (G)

0I
XC
z-

O
M

II
3^ \5 3/ c4
\ S/c h 33 P4
3/ \5
N CH HN C HN CH
I II I II I II
C CH

c
I

C
I
_ ^ 2 \ / 6
0 NH 0 2 X NH 6 o ^ 2 X nh 6
1 1 i

C ito s in a (C) T im in a (T) U ra c ilo (U)

NH,
NH2 NH2
> C\ 5
n^ C6x c5/C \ N CH
N 9 \ .CH 1 II Xe
CH XC CH
CH C CH C S 2\
2^ n/ 4 X n7 2^ N X 4 X N
3

O
II y II K II o í

OH " o -p - 0 " O -P -O -P -O -P -
I I I
I I 1 o
CH2 o O- CH2 n o ch2
5l
"C I H/ H C1
, 51 / ° N
C H H C 1’
C H H C
4'l \ l l / l 1'
41 \ I l/í 4I \ ! I/S H C— C H
H C— C H H C — C H 3 '| r 2JL_
3 '| 2LL _ 3 | r -'i'- H
OH
OH OH OH OH

A d e n o s in a 5 ’-m o n o fo s fa to d e a d e n o s in a 5 ’-trifo s fa to d e 2 '-d e s o x lc ¡tid ¡n a

(A M P ) (d C T P )

Fig. 1-2. Estructuras de bases, nucleósidos y nucleótidos.

Las líneas negras en la parte inferior de los anillos de azúcar indican que el plano del anillo se estableció a un ángulo de 90° respecto del plano de la base
correspondiente (es decir, si el plano de una base se representa com o si reposara sobre la superficie de la página, los átomos de carbono 2' y 3 ' [tres
p rim a ] del azúcar pueden imaginarse en 'proyección hacia arriba, fuera de la página, y el átomo de oxígeno hacia abajo de la superficie de la página).
Nota: la numeración en los azúcares desoxírribosa y ribosa se limita a los cinco átomos de carbono, que se numeran 1' a 5', pero la numeración de las
bases incluye átomos de carbono y nitrógeno que ocurren dentro de los anillos heterocícllcos. Los átomos de hidroxilo e hidrógeno destacados unidos
al carbono 2 ' indican la diferencia esencial entre los residuos de azúcares ribosa y desoxírribosa. Los grupos fosfato se señalan de modo secuencial
como a , (3, y , etc., según sea la proximidad al anillo de azúcar (véase estructura dCTP).
6 CAPÍTULO UNO j ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIÓN GÈNICA

za de sus cadenas laterales (fig. 1-3). La clasificación se basa en lo
siguiente:
► Aminoácidos básicos, que llevan una cadena lateral con una car­
ga positiva neta: un grupo amino (NH2) o anillo de histidina en
la cadena lateral adquiere un ion H a un pH fisiológico.
► Aminoácidos ácidos, que incluyen una cadena lateral con una
carga neta negativa: un grupo carboxilo en la cadena lateral
pierde un ion H^ a un pH fisiológico para formar COO .
► Aminoácidos polares sin carga, que son neutros en sentido eléc­
trico pero portan cadenas laterales con grupos eléctricos polares,
que se distinguen por tener cargas eléctricas fracciónales (que se
indican como 8 + o 8 —). Por ejemplo, el átomo de hidrógeno
en el gru p o hidrox ilo (—OH) y su lfh id rilo (—SH) posee una
carga fraccional positiva, en tanto que los átomos de oxígeno/
azufre tienen una carga fraccional negativa, lo que conduce a las
designaciones siguientes: (—O8 —H8+) y (—S& —H8+).
► Aminoácidos neutros no polares, que son hidrófobos (rechazan
agua). Por lo general, interactúan entre sí y con otros grupos hi­
drófobos.
Los polipéptidos se forman con una reacción de condensación en­
tre los grupos amino de un aminoácido y el carboxilo del siguiente
para crear u na estru ctu ra básica rep etid a (-N H —CHR—C O -),
en la que las cadenas laterales R difieren de un aminoácido a otro
(véase fig. 1-21 ).
1.1.2 Los en laces covalentes confieren estabilidad;
los en laces no covalentes, m ás débiles,
facilitan relaciones interm oleculares y
estabilizan la estru ctu ra
La estabilidad del ácido nucleico y los polímeros proteínicos depen­
de en particular de los enlaces covalentes potentes que unen los
átomos constituyentes de sus estructuras básicas lineales. En las in­
teracciones entre estas moléculas y grupos dentro de un ácido nu­
cleico o una molécula de proteína aislados, son importantes,
además de los enlaces covalentes, varios enlaces no covalentes dé­
biles (véase cuadro 1-1). Es típico que estos enlaces no covalentes
sean más débiles que los covalentes por un factor mayor de 10. A
diferencia de los enlaces covalentes, cuya fuerza depende sólo de los
átomos particulares que participan, la fuerza de los enlaces no co­
valentes también depende en notable proporción de su ambiente
acuoso. La estructura del agua es en particular compleja, con una
red de enlaces no covalentes de rápida transformación que tiene lu­
gar entre las moléculas individuales de H20 . La fuerza predomi­
nante en esta estructura es el enlace de hidrógeno, un enlace
electrostático débil formado entre un átomo de hidrógeno parcial­
mente positivo y un átomo parcialmente negativo que, en el caso
de las moléculas de agua, es un átomo de oxígeno.
Las moléculas cargadas son muy solubles en agua. Debido a las
cargas de fosfato que se encuentran en sus nucleótidos componen­
tes, el DNA y el RNA poseen carga negativa (polianiones). De acuer­
do con su composición de aminoácidos, las proteínas pueden llevar
una carga positiva neta (proteínas básicas) o una carga negativa
neta (proteínas ácidas). El potencial de enlace del hidrógeno de las
moléculas de agua significa que las moléculas con grupos polares
(incluidos DNA, RNA y proteínas) pueden formar múltiples inte­
racciones con las moléculas de agua, que conducen a su solubiliza-
ción. Por consiguiente, incluso las proteínas neutras muchas veces
son solubles con facilidad si contienen un número considerable de
aminoácidos polares cargados o neutros. En contraste, las proteínas
enlazadas a la membrana suelen caracterizarse por un contenido al­
to de aminoácidos hidrófobos, que son más estables desde el pun­
to de vista termodinámico en el ambiente hidrófobo de una
membrana lípida.
A diferencia de los enlaces covalentes que requieren un ingreso
considerable de energía para romperse, los no covalentes se forman
y rompen de manera constante a temperaturas fisiológicas. Como
resultado, permiten con facilidad interacciones moleculares reversi­
bles (transitorias), que son esenciales para la función biológica. En
el caso de los ácidos nucleicos y las proteínas, poseen una variedad
completa de acciones fundamentales que aseguran la replicación
fiel del DNA, la transcripción del RNA y el reconocimiento codón-

Cuadro 1-1. Enlace no covalente débil

Tipo de enlace Naturaleza del enlace

Hidrógeno Se forman enlaces de hidrógeno cuando queda intermedio un átomo de hidrógeno entre dos átomos que atraen electrones,
por lo general átomos de oxígeno o nitrógeno. Véase el recuadro 1-1 para ver ejemplos de su importancia en la estructura y
función del ácido nucleico y las proteínas.

Iónico Ocurren interacciones iónicas entre grupos cargados. Pueden ser muy potentes en cristales, pero en un ambiente acuoso los
grupos cargados son protegidos por moléculas de H20 y otros iones en solución y en consecuencia son muy débiles. No
obstante, pueden ser muy importantes en la función biológica, como es el caso del reconocimiento enzima-sustrato.

Van der Waals’ Cualesquiera dos átomos que estén muy cerca entre sí muestran una interacción de enlace atractiva débil debido a sus cargas
eléctricas fluctuantes (atracción de Van der Waals) hasta que quedan en extremo cerca, cuando se repelen entre sí de forma
muy intensa (repulsión de Van der Waals). Aunque las atracciones de Van der Waals son muy débiles en el plano individual,
pueden tornarse importantes cuando hay un buen ajuste entre las superficies de dos macromoléculas.

Fuerzas hidrófobas El agua es una molécula polar. Cuando se colocan moléculas hidrófobas o grupos químicos en un ambiente acuoso se fuerzan
juntas a fin de reducir al mínimo sus efectos destructores en la red compleja de enlaces de hidrógeno entre las moléculas de
agua. Se dice que los grupos hidrófobos que se fuerzan juntos en esta forma se conservan unidos entre sí por enlaces
hidrófobos, aunque la base de su atracción se debe a repulsión común por moléculas de agua.
 1,1 1 FORMACIÓN DE-BLOQUES Y ENLACES QUÍMICOS EN DNA, RNA Y POL1PÉPT1DOS ■ 7

ESTRUCTURA
GENERAL H O
I II
h 2n — c —c- OH

R
POLARES CARGADOS

I I
R — CH, CH, pch 2 ch2
I I I I
C CH, y ch2 CH. CH,
O * \
0- I
C
8ch2
I I
ch2
I
Ácido
aspártioo = aspartato O £ch2 O- NH N CH
I I ib ,
(Asp) Ácido
glutámico = glutamato nh3 C
'gtm? X
HC = NH
(Glu) h 2n nh2
Lisina Arginina Histidina
(Lis) (Arg) (His)
ÁCIDO BÁSICO

I
POLARES SIN CARGA CH2

i I I * C\
= ch2 ch2 ch2 C H - CH, HC CH
I I
c ch, OH OH
I HC CH
o nh2 c Serina Treonina CH,
C
3
NNH, (Ser) (Tre)
I I
»
A s p a ra g in a G lu ta m in a
OH
Cisteína (Cis)
Tirosina (Tir)
j
(A sp) (Glu)

G R U P O S A M ID A GRUPOS GRUPOS S
HIDROXILO SULFHIDRILO

NO POLARES H O
I II
ch2 CH HN- C — C — OH
I I I / \ I I
CH, CH CH CH3 CH2 CH, CH ,
/ \ / S 3 i 2 /
VCH2
-o

ch3 CH3 ch3 ch3

i"

Glicina Alanina Valina Leucina Isoleucina Prolina

(Gli) (Ala) (Val) (Leu) (lie) (Pro)
I I
CH2 ch2
I I CH2
CH
ch2
HC CH HC
* \ C-
I
-c
s
Metionina I I II I
CH, HC CH HC
(Met)
CH
^ CH/ ° \ NH/ C
Fenilalanina Triptófano
(Fen) (Trp)

Fig. 1-3. Estructuras de los 20 aminoácidos principales.

Los aminoácidos en una subclase (p. ej., los aminoácidos ácidos) son muy similares desde el punto de vista químico. Los grupos que se destacan son
grupos químicos polares. La convención de la numeración de átomos de carbono se emplea para designar el átomo de carbono central como a y los
carbonos subsecuentes de las cadenas laterales lineales como (3, y , 8, etc. (véase el ejemplo de la cadena lateral de la Usina en la parte superior).
Aunque, en general, los aminoácidos polares son aminoácidos hidrófilos y los no polares hidrófobos, la glicina (que tiene una cadena lateral muy
pequeña) y la cisteína (cuyo grupo sulfhidrilo no es tan polar como un grupo hidroxilo) ocupan posiciones intermedias en la escala hldrófila-hidrófoba.
Nota: la prolina es rara porque la cadena lateral une el átomo de nitrógeno del grupo NH2 y también el átomo central de carbono.
8 CAPÍTULO UNO | ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIÓN GÈNICA

1.2 Estructura y replicación del DNA

1.2.1 La estructura del DNA es una hélice doble

CH,
2O B as e
4-1
C' H H C
^.1 antiparalela
IV
H C — C H
l/l Como se mencionó, la estructura básica lineal de una molécula de
DNA y una molécula de RNA consiste en residuos de azúcar y gru­
I I2' pos de fosfato alternados. En cada caso, el enlace que une un resi­
O H
duo de azúcar individual con los residuos de azúcar vecinos es un
o = p -o enlace 3\5’-fosfodiéster. Ello significa que un grupo fosfato une el
I átomo de carbono 3 ’ d e un azúcar con el átomo d e carbono 5' d el azú­
o car contiguo (fig. 1-4).
CH. B as e
En condiciones normales, las moléculas de RNA dentro de una
.O célula existen como moléculas únicas; en cambio, la estructura del
C H H C DNA es una doble hélice en la cual están sostenidas entre sí dos
\\\ l/l moléculas de DNA (ca d en a s d e DNA) por enlaces de hidrógeno
H C — C H
débiles para formar un DNA dúplex. El enlace de hidrógeno ocurre
1 I2' entre bases opuestas lateralmente y los pares de bases (pb) de las dos
O H
cadenas de DNA dúplex siguen las reglas de Watson-Crick: A se
enlaza d e modo específico con T y C con G (fig. 1-5). Como resulta­
do, la composición de bases del DNA de diferentes fuentes celula­
res no es aleatoria: la cantidad d e adenina es igual a la d e timina y la
Fig. 1-4. Enlace 3 '-5 ' fosfodiéster. de citosina equivale a la de guanina. Por consiguiente, la composición
de bases del DNA puede especificarse con precisión al indicar su
composición de %GC (= %G + %C). Por ejemplo, si se señala
que una fuente de DNA celular es 42% GC, puede deducirse que
la composición de bases es: G, 21%; C, 21%; A, 29%; T, 29%).
El DNA puede adoptar diferentes tipos de estructuras helicoi­
anticodón. Aunque débiles de modo individual, la acción combi­ dales. El A - D N A y el B - D N A son hélices derechas (aquellas en las
nada de numerosas uniones no covalentes puede contribuir en bue­ cuales la hélice forma una espiral en dirección dextrógira a medida
na medida a la estabilidad de la estructura (conformación) de estas que se aleja del observador). Son, de manera respectiva, 11 y 10 pb
moléculas y por consiguiente puede ser crucial para especificar la por giro. El Z - D N A es una hélice a la izquierda que tiene 12 pb por
forma de una macromolécula (véase fig. 1-7B para el ejemplo de giro. En condiciones fisiológicas, casi todo el DNA en un genoma
la forma en que el enlace intramolecular de hidrógeno proporciona bacteriano o eucariótico es de la forma B-DNA, en la que cada ca­
gran parte de la forma de una molécula de RNA de transferencia). dena helicoidal tiene una vu elta co m p leta (la distancia ocupada

H H
8 M I 5+ 5- s ¿ 8- 8+ I
h c ^ \ N— h .......... ok ch, h c ^ \ xmmmh — n
I \S 6/ \ * 5/ I '5 6y \ 4 5
C— C C— C I C— C C — CH
N \ / \ 8- S+ / \ 6 N ^ / \ S+ 8 - / v* 6
/ 9 C ..........HH—-------N
N ........... N CH
CH / /- 9 C N -------H ........... N CH
4\ / ’ 3\ / / 4\ / 1 3\ /

/ 2 1\ AZUÜAH 3 2\ 8+ 8- / 2 1\
O \ N H .......O \
A ZÚ CA R | AZÚ CA R

T G H C
Clave:
........... E nlace de
hidrógeno

Fig. 1-5. Los pares de bases A-T tienen dos enlaces de hidrógeno de conexión; los pares de bases G-C tienen tres.

Las cargas positivas fracciónales en los átomos de hidrógeno y las cargas negativas fracciónales en los átomos de oxígeno y nitrógeno se Indican por
8 + y S_ , respectivamente.
 1.2 ! ESTRUCTURA Y REPLICACIÓN DEL DNA 9

por un giro aislado de la hélice) de 3.4 nm. A medida que los en­
laces fosfodiéster unen los átomos de carbono números 3' y 5' de
residuos de azúcar sucesivos, un extremo de cada cadena del DNA,
el llamado extremo 5', posee un residuo de azúcar terminal en el
cual el átomo de carbono número 5' no está unido a un residuo de
azúcar vecino (fig. 1-6). El otro se define como el extremo 3' de­
bido a una ausencia similar del enlace fosfodiéster en el átomo de
carbono número 3’ del residuo de azúcar terminal. Se dice que las
dos cadenas de un DNA dúplex son antiparalelas porque siempre
se relacionan (anneal) en forma tal que la dirección 5’—>3' de una
cadena de DNA es la opuesta a la de su compañera (fig. 1-6).
La información genética está codificada por la secuencia lineal
de bases en la cadena de DNA (la estructura primaria). En conse­
cuencia, se dice que las dos cadenas de DNA de un DNA dúplex
tienen secuencias complementarias (o que muestran complemen-
tariedad de bases) y es posible deducir con facilidad la secuencia de
bases de una cadena de DNA si se conoce la secuencia de DNA de
su cadena complementaria. Por estas razones, es usual describir una
secuencia de DNA al escribir la secuencia de bases sólo de una ca­
dena y en la dirección Esta es la dirección de la síntesis de
nuevas moléculas de DNA durante la replicación del DNA y asi­
mismo de la transcripción cuando se sintetizan moléculas de RNA
y se utiliza el DNA como una plantilla (véase más adelante). Sin
embargo, cuando se describe la secuencia de una región de DNA
que incluye dos bases vecinas (en realidad, un dinucleótido) en una
cadena del DNA, es usual insertar una “p” para indicar un enlace
fosfodiéster de conexión; por ejemplo, CpG significa que una citi-
dina está unida de manera covalente a una guanosina vecina en la
misma cadena de DNA, mientras que un par de bases CG represen­
ta que una citosina en una cadena de DNA está enlazada por hi­
drógeno a una guanina en la cadena complementaria (véase fig. 1-6 ).
El enlace intermolecular de hidrógeno también permite la for­
mación de RNA-DNA dúplex y RNA de doble cadena, que son re­
querimientos importantes para la expresión génica (véase recuadro
1-1). Además, el enlace de hidrógeno puede ocurrir entre bases
dentro de una molécula aislada de DNA o RNA. Las secuencias
que tienen repeticiones invertidas complementarias colocadas muy
próximas son propensas a formar estructuras en horquilla o asas
que estabilizan los enlaces de hidrógeno entre las bases en el cuello
de la asa (fig. 1-7A; véase asimismo fig. 9-6 para el ejemplo de los

A) B)
Extrem o 5' O HOH
\Z
I 3'h
Extrem o 3'
0 = P -C T H C— C i
I V¡C /lH IV 4'
0 H C
1
ch2 H ° 5c h 2
5VC H H C
..... 0
4'l\l l/l
1
o -p = o
H C— C H
31 I* I Surco
0 H H O
1 I 2' I 3' m enor
o=p-o H C— C H

oI r Cl / !H
I~
IM 4-
H C

u 5c h ,
Í C H>H ° H\ 0
C
1 Surco
4' l \ l l/ l "o- p=o
m ayor
H C— C H
3| I2' I
0 H H O
1 I 2' 13'
H C— C H
o = p —O
1-1/1
oI CH
a j CH2

0I
5'?H / 0 '
C H Ht C
4'l\ l l/l o -p = o
H C— C H
3'| 12' 1
Extrem o 3 ’ OH H "O Extrem o 5'

Fig. 1-6. La estructura del DNA es una hélice antiparalela, de doble cadena.
A) Naturaleza antiparalela de las dos cadenas de DNA. Las dos cadenas son antiparalelas porque tienen direcciones opuestas para la unión del
átomo de carbono 3 ' con el átomo de carbono 5 '. La estructura que se muestra es un trinucleótido de doble cadena cuya secuencia puede representarse
como: 5 ' pCpGpT-OH 3 ’ (cadena de DNA a la izquierda)/5' pApCpG-OH 3'(cadena de DNA a la derecha) (en la que p es un enlace fosfodiéster y -O H un
grupo OH terminal en el extremo 3 '). En condiciones normales, esto se abrevia al eliminar los símbolos “ p” y “ OH” y proporcionar la secuencia sólo en
una cadena (p. ej., la secuencia podría representarse también como 5'CGT 3 ' o 5 ' ACG 3'). B) Estructura helicoidal doble del DNA. Las dos cadenas
están arrolladas una con la otra para form ar un serpentín plectonémico. La vuelta completa de cada hélice representa la distancia ocupada por un giro
y en la estructura del B-DNA (véase texto) incluye 10 nucleótidos.
10 CAPÍTULO UNO i ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIÓN GÉNICA
Recuadro 1-1. Ejemplos de la importancia del enlace de hidrógeno en ácidos nucleicos y proteínas
Enlace de hidrógeno intermolecular en ácidos nucleicos
Es importante para permitir la formación de ácidos nucleicos de doble ca­
dena, según se indica a continuación:
► DNA de doble cadena. La estabilidad en la doble hélice se conserva
por enlaces de hidrógeno entre pares de bases A -T y C-G (sección
1.2.1 y fig. 1-5).
► Dúplex DNA-RNA. Se forman de manera natural durante la transcrip­
ción del RNA y el enlace de hidrógeno apoya los tipos siguientes de
pares de bases: A-U ; C-G y A -T (enlace de A en la cadena de RNA
con T en la cadena de DNA). Véase sección 1.3.3 y figura 1-12.
► RNA de doble cadena. Los genomas de ciertos virus consisten en
dúplex RNA-RNA pero, además, durante el procesamiento del RNA y
la expresión génica se forman dúplex transitorios RNA-RNA en todas
las células. El corte y unión (splicing) de RNA requiere el reconoci­
m iento de los límites exón-intrón después del enlace de hidrógeno
entre los transcritos de RNA sin cortar y unir (unspliced) y varias
micro-RNA originados por segmentación de precursores RNA en
horquillo). Estas constricciones estructurales, que son adicionales a
las impuestas por la estructura primaria, contribuyen a la estructu­
ra secundaria de la molécula. Ciertas moléculas de RNA, como el
RNA de transferencia (tRNA), muestran cantidades en particular
altas de estructura secundaria (fig. 1-7B).
N ota: en los enlaces de hidrógeno en RNA-RNA dúplex y también
en el enlace intramolecular de hidrógeno dentro de una molécula
de RNA, se encuentran de modo ocasional pares de bases G~ U además
de los pares de bases A—U y C—G (fig. 1-7B). Esta forma de pares de
bases no es en especial estable, pero no altera en grado significativo
la hélice de RNA-RNA.
1.2.2 La replicación del DNA es semiconservadora y ia
síntesis de cadenas de DNA semidiscontinua
Durante el proceso de síntesis del DNA (replicación del DNA) se
desenrollan las dos cadenas de DNA de cada cromosoma por ac­
ción de una helicasa y cada cadena de DNA dirige la síntesis de una
cadena de DNA complementaria. Se forman dos dúplex hijas de
DNA, cada una de ellas idéntica a la molécula original (parental)
(fig. 1-8). Debido a que cada dúplex de DNA hija contiene una ca­
dena de la molécula original y una cadena de DNA recién sintetizada,
el proceso de replicación se describe como semiconservador. La
enzima polimerasa de DNA cataliza la síntesis de nuevas cadenas de
DNA mediante los cuatro trifosfatos de desoxinucleósidos (dATP,
dCTP, dGTP, dTTP) como precursores nucleótidos.
La replicación del DNA se inicia en puntos específicos, que se
denominan orígenes de replicación. Si se comienza desde uno de
estos orígenes, el inicio de la replicación del DNA tiene como re­
sultado una horquilla de replicación en forma de Y, en la cual se
bifurca el DNA dúplex original en dos dúplex hijas de DNA. Las
dos cadenas del DNA dúplex original son antiparalelas, pero ac­
túan de forma individual como plantillas para la síntesis de una ca­
dena hija antiparalela complementaria. Se deduce que las dos
cadenas hijas deben seguir en direcciones opuestas (es decir, la di­
rección del crecimiento de la cadena debe ser 5'—>3' en una cadena
moléculas de RNA nuclear pequeño (sección 1.4.1). De igual modo,
el reconocimiento codón-anticodón incluye el enlace de hidrógeno
entre dos moléculas de RNA: mRNA y tRNA (sección 1.5.1 y figura
1-20). El enlace de hidrógeno entre moléculas de RNA incluye pares
de bases G -U y asim ism o la formación de pares de bases A -U y C-G
(véase cuadro 1 -6).
Enlace de hidrógeno intramolecular en ácidos nucleicos. Es im por­
tante para proporcionar la estructura secundaria en moléculas de DNA y
RNA, com o sucede en la formación de horquillas en el DNA y los brazos
complejos del tRNA (véase sección 1.2.1 y figura 1-7). En el últim o ca­
so, cabe señalar que las formaciones de pares de bases incluyen pares
de bases G -U y asim ismo pares de bases A -U y G-C.
Enlace de hidrógeno intramolecular en proteínas. Algunas unidades
fundamentales de la estructura secundaría de las proteínas, como la hé­
lice a , la hoja plegada j8 y el giro se definen en gran parte mediante
enlaces de hidrógeno intracatenarios (sección 1.5.5 y fig. 1-24).
hija, la cadena rápida [leading, 3'->5' en la otra cadena hija, la ca­
dena lenta [la ggin g; fig. 1-9).
Las reacciones catalizadas por polimerasas de DNA incluyen la
adición de un residuo de dNMP del grupo hidroxilo 3' libre de
la cadena de DNA en crecimiento (el residuo de dNMP lo propor­
ciona un precursor de dNTP —se cortan los dos residuos fosfato
distales ß y 7 y se descarta el grupo pirofosfato resultante). Este re­
querimiento introduce una asimetría en el proceso de replicación
del DNA: sólo la cadena rápida posee un grupo hidroxilo 3’ libre
en el punto de bifurcación. Esto posibilita la adición secuencial de
nucleótidos y el alargamiento continuo en la misma dirección en la
que se mueve la horquilla de replicación.
La 5'->3' de la síntesis de la cadena lenta es la dirección opuesta
respecto de la que sigue la horquilla de replicación. Como resulta­
do, la síntesis tiene que llevarse a cabo en pasos que generan una se­
rie progresiva de fragmentos pequeños, de manera característica de
100a 1 000 nucleótidos de largo (fragmentos de Okazaki). Debi­
do a que sólo la cadena rápida se sintetiza de modo continuo, se di­
ce que la síntesis de cadenas de DNA es semidiscontinua. Cada
fragmento de la cadena lenta se sintetiza en la dirección 5’-*3’, la
opuesta a la que sigue la horquilla de replicación. Los fragmentos
sintetizados de forma sucesiva se unen de manera covalente en sus
extremos mediante la enzima ligasa de DNA. Por consiguiente, la
cadena lenta crece en la dirección en la que se mueve la horquilla
de replicación.
1.2.3 La maquinaria de replicación del DNA en células
de mamíferos es compleja
Tal y como ocurre en los ribosomas, la maquinaria de replicación
del DNA está muy conservada y es en esencia similar, desde la Es­
cherichia coli hasta las células de mamíferos, con una variedad de di­
ferentes tipos fundamentales de proteínas (recuadro 1-2). Sin
embargo, la complejidad es mayor en las células de mamíferos, en
términos de la cifra de diferentes polimerasas de DNA y el núme­
ro de proteínas constituyentes y subunidades de proteínas. Casi to­
das las polimerasas de DNA en las células de los mamíferos usan
 1.2 ESTRUCTURA Y REPL1CACIÓN DEL DNA 11

A) 5' AGACCACCAGTACAAGACGTTTCTTGTACTGGAACAAG 3' B) OH E xtrem o 3 '

I
i C
Extrem o 5 '( P ) C
A

i - i B razo a c e p to r
A— T
G— C
1-8
Om—|it
A- T
1 -1
A- T G C
C G B razo D U U
, r CG G C C i1A
A- T
T- A Clave:
u G _____
a c u u„ g ' mC
, , 1
mC G G
G
l i l i m5C G
G- C - E n la ce d e hidrógeno gI aG a a u Ua ffAG B razo Tyj/ C
A- T C-.G
C— G
U-G
B razo an ticodó n C -G
C— G
A G AC C A A A C AA G
CC - GmsC

W
Anticodón

Fig. 1-7. Enlace de hidrógeno intramolecular en DNA y RNA.

A) Formación de un asa en horquilla de doble cadena dentro de una cadena de DNA única. Las secuencias que se destacan en la cadena de DNA
arriba representan secuencias de repetición invertidas que pueden enlazar hidrógeno para form ar una estructura en horquilla (abajo). B) El RNA de
transferencia (tRNA) tiene una estructura secundaria extensa. El ejemplo que se muestra es un gen tRNAGIU humano. Los nucleósidos menores son:
D,5,6-d¡hidrouridina; psi (\P), seudouridina (5 ribosiiuracilo); m5C, 5-metiicitidina; m 1A, 1-metiladenosina. La estructura en hoja de trébol está estabilizada
por un enlace de hidrógeno intramolecular extenso, sobre todo por los pares de bases Watson-Crick G-C y A-U , pero asim ismo con el par de bases
ocasional G-U. Se reconocen cuatro brazos: en el brazo aceptor puede fijarse un aminoácido (en el extremo 3 '); el brazo T'PC se define por este
trinucleótido; el brazo D se denomina así porque contiene residuos de dihidrouridina; y el brazo anticodón contiene el trinucleótido anticodón en el
centro del asa. La estructura secundaria del tRNA virtualmente no varía; siempre hay siete pares de bases en el tallo del brazo aceptor, cinco en el brazo
T 'l'C , cinco en el brazo anticodón y tres o cuatro en el brazo D.

una cadena de DNA individual como plantilla para sintetizar una
cadena de DNA complementario y en consecuencia son p o lim er a ­
sas d e DNA d irigid a s p o r DNA. A diferencia de las polimerasas de
RNA, las polimerasas de DNA requieren absolutamente el extremo
hidroxilo 3 ’ de una cadena oligonucleótida iniciadora (cebador) de
bases pareadas como sustrato para la extensión de la cadena. Por
consiguiente, se necesita un o ligo n u cleótid a in icia d o r d e RNA
(cebador) sintetizado con anterioridad (que sintetiza una p rim a sa )
para proporcionar el grupo 3-OH libre que requieren las polimera­
sas de DNA para iniciar la síntesis de DNA.
En las células de los mamíferos existen más de 20 tipos diferen­
tes de polimerasa de DNA (Friedberg y cois., 2000; 2002), que pue­
den agruparse de manera conveniente en tres clases principales
(véase cuadro 1-2 ):
► P olim erasas d e DNA d irigid a s p o r DNA típ ica s (alta fi d e l i ­
dad). De ellas, dos participan en la replicación estándar de
DNA cromosómico, son específicas para sintetizar DNA a par­
tir de la cadena rápida o la lenta (polimerasas de DNA 8 y a,

Fig. 1-8. La replicación del DNA es semiconservadora.

El dúplex de DNA original consiste en dos cadenas de DNA antiparalelas y complementarias, que
se desenrollan y a continuación actúan de manera individual como plantillas para la síntesis de
nuevas cadenas de DNA antiparalelas y complementarias. Cada uno de los dúplex de DNA hijas
contiene una cadena de DNA parental original y una nueva cadena de DNA que forman dúplex de
Nuevo Original Original Nuevo DNA, que es en términos estructurales idéntico al dúplex del DNA parental. Nota: esta figura
muestra el resultado de la duplicación de DNA, pero no la forma en que actúa el proceso (para
C adena C adena
ello véase fig. 1-9).
hija hija
12 i CAPITULO UNO ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIÓN GÈNICA

5' 5' 3' 5' 3'

c
•o
'5

E
o

H e lic a s a

3' 5' 3' 5' 3 '5 ' 3'5' 3 '5 ' 3'5'
C adena C adena
rá p id a le n ta

Fig. 1-9. Asimetría de la síntesis de la cadena durante la replicación del DNA.

La helicasa desenrolla el dúplex de DNA para permitir que se repliquen las cadenas individuales. A medida que tiene lugar la replicación, la dirección
5'-*3’ de la síntesis del filamento rápido es la mism a en la que se mueve la horquilla de replicación y en consecuencia la síntesis puede ser continua.
Sin embargo, la síntesis de la cadena lenta tiene la dirección opuesta a la del movimiento de la horquilla de replicación. Necesita sintetizarse en piezas
(fragmentos de Okazaki), primero A, después B y a continuación C, que sella de manera subsecuente la enzima ligasa de DNA para form ar una cadena
continua de DNA. Nota: la síntesis de estos fragmentos comienza mediante un nucleótido iniciador RNA. En células eucariotas, las polimerasas de DNA
8 y « sintetizan las cadenas rápida y lenta, respectivamente (véase cuadro 1 -2).

respectivamente), dos están encargadas de reparar DNA ((3 y e) y
una de la replicación y reparación del DNA mitocondrial (7 ).
► P olim erasas d e DNA d irigid a s p o r DNA p ro p en sa s a error.
Se identificó una amplia variedad de diferentes polimerasas de
DNA con fidelidad muy baja de replicación de DNA (p. ej., la
tasa de error para la polimerasa de DNA iota ( 1) es 20 000 ve­
ces mayor que la de la polimerasa del DNA e. Se sabe que
algunas poseen gran expresividad en células del sistema inmuni-
tario y esta observación, aunada a su baja fidelidad de replica­
ción de DNA, sugiere su participación en la hipermutación en
linfocitos B y T (véase sección 10.6).
► P olim erasas d e DNA d irigid a s p o r RNA. Algunas polimerasas
de DNA sintetizan DNA mediante una plantilla del RNA y por
esta razón se describen como tra n scrip ta sa s in versa s (véase
secciones 1.2.4 y 1.3.1). Incluyen una actividad que se encuen-

Recuadro 1-2. Principales clases de proteínas que se utilizan en la maquinaria de replicación de DNA

Las topoisomerasas inician el proceso de desdoblamiento del DNA al
crear una muesca (romper) en una cadena de DNA. Como resultado, se
libera la tensión que sostiene la hélice en sus formas arrollada y supera-
rrollada.
Las helicasas llevan a cabo el desenrollamiento de la cadena doble origi­
nal, una vez que se eliminó el superarrollamiento por acción de una topoi-
somerasa.
Las polimerasas de DNA sintetizan nuevas cadenas de DNA. Las polime­
rasas de DNA son agregados complejos de varias subunidades de proteí­
nas diferentes, que incluyen con frecuencia actividades de lectura de
pruebas y nucleasa de DNA, de tal manera que es posible identificar
cualquier base incorporada de forma errónea y cortarse y eliminarse una
tira local del DNA que contiene el error y a continuación repararse. En las
células, el DNA se replica por la síntesis de nuevo DNA a partir de una
plantilla de la cadena de DNA existente, para lo cual emplea polimerasas
de DNA dirigidas por DNA y en las células de mamíferos existe una ex­
tensa variedad de estas polimerasas de DNA. En situaciones más espe­
cializadas, puede sintetizarse DNA en las células a partir de plantillas de
RNA mediante polimerasas de DNA dirigidas por RNA (llamadas asimis­
mo transcriptasas inversas), como en el caso de la síntesis de los ex­
tremos de un cromosoma lineal con la transcriptasa inversa de la enzima
te lomera sa
Primasas. Las polimerasas de DNA tienen dificultad para iniciar la sínte­
sis nueva de una plantilla desnuda de cadena única. En lugar de ello, se
requiere un oligonucleótido iniciador (cebador) con un grupo OH 3 ' al cual
puede fijar un dNTP la polimerasa. Las primasas fijan un oligonucleótido
iniciador de RNA pequeño al DNA de cadena única para actuar como un
sustituto de OH 3 ' a fin de que comience a sintetizarse la polimerasa de
DNA a partir de él. Este oligonucleótido iniciador de RNA lo elimina al fi­
nal una ribonucleasa, se llena la hendidura mediante una polimerasa de
DNA y a continuación se sella con una ligasa de DNA.
Las ligasas catalizan la formación de un enlace fosfodiéster para obtener
un OH 3 ' y un fosfato 5 ' no fijados pero adyacentes.
Las proteínas de enlace de cadena única son importantes para conser­
var la estabilidad de la horquilla de replicación. El DNA de cadena única
es muy lábil, o inestable, de tal manera que estas proteínas se unen a él
en tanto permanece como cadena única y evitan que se degrade.
 1.3 TRANSCRIPCIÓN DEL RNA Y EXPRESIÓN GÈNICA 13

Cuadro 1-2, Principales clases de polimerasas de DNA de mamíferos

A) Polimerasas de DNA de alta fidelidad (típicas) dirigidas por DNA

Clase de polimerasa de DNA

a P 7 8 e

Localización Nuclear Nuclear Replicación de Nuclear Nuclear

Replicación general de DNA Síntesis y mtDNA Síntesis de
oligonucleótido mitocondrial cadena rápida
iniciado de cadena
lenta
Exonucleasa3 3 ' -*■ 5' No No Sí Sí Sí
Función de reparación de DNA - Por escisión Reparación Por escisión de Por escisión de
de bases de mtDNA nucleótido y base nucleótido y base

aTiene actividad de lectura de pruebas.

B) Polimerasas de DNA de baja fidelidad (propensas a error) dirigidas por DNA

Polimerasa de DNA £ (zeta) Se expresa en células B y T mutantes; ¿participa en hipermutación?

Polimerasa de DNA t] (eta) ¿Muta nucleótidos A y T durante la hipermutación?

Polimerasa de DNA i (iota) Fidelidad de replicación muy baja; se piensa que participa en la hipermutación

Polimerasa de DNA n, (mu) Muy expresada en células B y T; se piensa que participa en la hipermutación

C) Polimerasas de DNA dirigidas por RNA (transcriptasas inversas)

Telomerasa de transcriptasa inversa (Tert) Replica DNA en los extremos de cromosomas lineales

Transcriptasa Inversa LINE-1/retrovlrus endógenos En ocasiones convierte mRNA y otro RNA en cDNA que puede integrarse en cualquiera otra
parte dentro del genoma

tra en la enzima telom era sa que tiene a su cargo la replicación
de los extremos de cromosomas lineales (sección 2.2.5) junto
con transcriptasas inversas codificadas por algunos DNA muy
repetitivos y clases de retrovirus endógenos.
1.2.4 Los genomas virales se conservan con frecuencia
por replicación de RNA en lugar de DNA
El DNA es el material hereditario en todas las células en la actuali­
dad y se acostumbra pensar en genomas como término colectivo pa­
ra las moléculas de DNA hereditarias de un organismo o una célula.
A pesar de la ubicuidad del DNA como material hereditario celular,
hoy día muchas clases diferentes de virus tienen un gen o m a RNA.
Las moléculas de RNA pueden autorreplicarse, pero el grupo OH 2'
en los residuos de ribosa d el RNA hace que sean bastante inestables, des­
de el punto d e vista químico, los enlaces azúcar-fosfato. En el DNA, los
residuos de desoxirribosa sólo llevan átomos de hidrógeno en la po­
sición 2' y por consiguiente el DNA es mucho más adecuado que el
RNA para ser un portador estable de información genética. La repli­
cación de RNA también es propensa a errores y las tasas normales de
error de replicación de RNA son alrededor de 10 000 veces más al­
tas que las registradas durante la replicación de DNA.
Los virus desarrollaron muchas formas diferentes para infectar y
trastornar células y sus genomas muestran una diversidad extraor­
dinaria (véase cuadro 1-3; fig. 1-10). Como resultado de su eleva­
da carga mutacional, los genomas de RNA virales suelen ser muy
pequeños pero tienen como ventaja índices de mutación rápidos. A
diferencia de los virus DNA, que por lo general se replican en el
núcleo, los virus RNA se replican casi siempre en el citoplasma. En­
tre algunas excepciones de importancia a esta regla general se en­
cuentra un grupo de virus RNA conocido como retrovirus. Los
retrovirus son virus RNA raros porque se replican en el núcleo y el
RNA se replica a través de un intermedio de DNA, mediante una
tra nscripta sa inversa, una polimerasa de DNA dirigida por RNA
que, al igual que las polimerasas de RNA, tiene tasas de error de
replicación relativamente altas. Después de la conversión de RNA
en DNA complementario (cDNA), se integra el cDNA retroviral en el
DNA cromosómico del huésped (véase sección 21.5.3).
1.3 Transcripción dei RNA y expresión
génica
1.3.1 El flujo de información genética en las células
tiene un sentido casi exclusivo:
ONA - » RNA - » proteína
La expresión de la información genética en todas las células es en
gran parte un sistema de un sentido: el DNA especifica la síntesis
de RNA y a continuación el RNA especifica la síntesis de polipép-
tidos (que de modo subsecuente forman proteínas). Debido a su
universalidad, el flujo DNA -* RNA -» polipéptido (proteína) de
información genética se describe como el dogma central de la bio­
logía molecular. En todos los organismos celulares son esenciales
dos pasos sucesivos:
14 CAPÍTULO UNO ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIÓN GÉNICA

A) RNA
DNA

L IN E A L C IR C U L A R L IN E A L C IR C U L A R

CADENA
Ú N IC A
P arv o viru s p e ro sin D N A
in te rm ed io , p. ej., viru s d e
p. ej., M 1 3 , fd , f1 p. ej., h e p a titis A h e p a titis d e lta

p. ej., ra b d o v iru s

R é p lic a p o r D N A in te rm e d io ,
p. ej., retrovirus

DOBLE iiiiiiiiiiiiiiiiiniiiiiiiiiiiii
CADENA
H e rp e s virus, X P a p o v a v iru s R eo v iru s
b à cu lo v iru s

.......................
A d en o viru s
(tie n e u n a p ro te in a te rm in a l
u n id a d e fo rm a covalente • )

P iiriìrn iiiirn m m m n n n rQ

P o x viru s (tien e
e x tre m o s c e rra d o s )

B)

V irus d e la in flu en za V irus G em in i

(R N A d e c a d e n a n e g a tiv a (b ip a rtito ; d o s m o lé c u la s
s e g m e n ta d a ) d e D N A circulares)

Fig. 1-10. La extraordinaria variedad de genomas virales.

A) Estructuración y topología de los genomas virales. En genomas virales de cadena única, el RNA que se utiliza para elaborar productos proteínicos
puede tener el mism o sentido que el genoma; éste, en consecuencia, es un genoma de cadena positiva ( + ) o de sentido opuesto (antisentido) al genoma
que se describe como genoma de cadena negativa ( - ) . Algunos virus RNA de cadena única ( + ) pasan a través de un DNA Intermedio (retrovirus) y
algunos virus DNA de cadena doble, como el de la hepatitis B, pasan a través de una forma repllcativa de RNA. B) Genomas virales segmentados y
multipartitos. Los genomas segmentados tienen una variedad de diferentes moléculas de ácido nucleico que especifican mRNA monocistrónicos, como
en los virus de la influenza que tienen ocho moléculas de RNA de cadena única negativas diferentes. Los genomas multipartitos son un subgrupo de
genomas segmentados en los que cada una de las diferentes moléculas está empacada en una partícula viral separada.
 1.3 I TRANSCRIPCIÓN DEL RNA Y EXPRESIÓN GENICA 15

M ITO C O N D R IA

D N A crom osóm ico - núc leo ]

Proteínas
Transcripción nucleares Transcripción

í /Transcrito

snRNA O tras
T prim ario

proteínas MitorRNA mRNA tRNA

m itocondriales

Ribosomas
citoplásmicos
A
mRNA RNA
tRNA citoplásm ico
pequeño
Traducción

Procesam iento
postraduccional

Proteínas en otros organelos + citosol

Proteínas secretadas

Fig. 1-11. Expresión gènica en una célula animal.

Nota: a) Sólo de manera muy ocasional, una proporción pequeña de moléculas de RNA nucleares puede convertirse en forma natural en cDNA por
transcriptasas inversas codificadas viralmente y celulares y más adelante integrarse en el DNA cromosómico en diversas localizaciones; b) la
mitocondria sintetiza su rRNA y tRNA propios y unas cuantas proteínas que participan en el sistema de fosforilación oxidativa (Ox. fos.). Sin embargo,
genes nucleares codifican a las proteínas de los ribosomas mitocondriales y la mayor parte de las proteínas del sistema de fosforilación oxidativa
mitocondrial, además de otras proteínas mitocondriales, y se traducen en ribosomas citoplásmicos, antes de llevarse al interior de la mitocondria.

1 . Transcripción. Ésta emplea una p o lim era sa d e RNA d irigid a
p o r DNA y tiene lugar en el núcleo de células eucarióticas y, en
grado limitado, en mitocondrias y cloroplastos, los únicos otros
organelos que tienen capacidad genética además del núcleo
(véase fig. 1- 11 ).
miembros de la familia de DNA repetido de mamíferos LINE-1
(véase sección 9.5.2). Debido a que se sabe que ciertas secuencias
de RNA no viral actúan como plantillas para la síntesis de DNA ce­
lular, ya no es estrictamente válido el principio del flujo unidirec­
cional de información genética en las células.

2. Traducción. Ocurre en los ribosomas, complejos grandes de

RNA y proteínas que se encuentran en el citoplasma y asimis­
mo en las mitocondrias y los cloroplastos. Las moléculas de
RNA que especifican polipéptidos se conocen como RNA
mensajeros (mRNA).
La expresión de la información genética sigue un principio de coli-
nearidad: la secuencia lineal de nucleótidos en el DNA se descodifi­
ca en grupos de tres nucleótidos a la vez (trip leto s d e bases) para
obtener una secuencia lineal de nucleótidos en el RNA que puede
descodificarse a su vez en grupos de tres nucleótidos (codon es) para
crear una secuencia lineal de aminoácidos en el producto polipéptido.
En fecha reciente se aclaró que las células eucarióticas, incluidas
las de los mamíferos, contienen secuencias de DNA cromosómico
no virales que codifican transcriptasas inversas celulares, como los
1.3.2 En organismos complejos, sólo se expresa
una fracción pequeña del DNA para formar una
proteína o producto de RNA
Sólo una pequeña proporción de todo el DNA en las células se
transcribe alguna vez. De acuerdo con sus necesidades, las diferen­
tes células transcriben distintos segmentos de DNA (unidades de
transcripción) que son unidades discretas, espaciadas de forma
irregular a lo largo de la secuencia de DNA. Las polimerasas de
RNA utilizan unidades de transcripción como plantillas para sinte­
tizar de manera inicial moléculas de RNA de tamaño equivalente
(tra n scrito sp rim a rio s) que a continuación se modifican para ge­
nerar productos de expresión maduros. Sin embargo, la gran mayo­
ría del DNA celular nunca se transcribe en ninguna célula. Más
16 CAPÍTULO UNO ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIÓN GÈNICA

Cuadro 1 -3 . Diferentes clases de genomas (véase fig. 1-10 para revisar ejemplos de organización del genoma viral)
DNA RNA

Doble cadena Cadena única Doble cadena Cadena única

(de) (cu) (de) (cu)

Molécula circular Muchas bacterias y arc/iaea; Ciertos virus - Muy pocos virus
única mitocondria, cloroplastos;
algunos virus

Molécula lineal única Unas cuantas bacterias; por Ciertos virus Unos cuantos virus Ciertos virus
ejemplo, Borrella; algunos virus

Moléculas lineales Núcleos eucarióticos; algunos Ciertos virus DNA cu Ciertos virus RNA de Ciertos virus RNA cu
múltiples virus de DNA de segmentados segmentados segmentados segmentados

Moléculas circulares Algunas bacterias; algunos - - -

múltiples virus bipartitos y tripartitos

Lineales y circulares Muy pocas bacterias; por

mixtas ejemplo, Agrobacterium
tumefaciens

aún, sólo una porción del RNA elaborado mediante transcripción
se traduce en un polipéptido. Ello se debe a que:
► Algunas unidades d e transcripción especifican RNA no codificante:
el producto de RNA no codifica polipéptidos como mRNA, si­
no que tiene una función diferente. Además del RNA ribosómi-
co (rRNA) y el RNA de transferencia (tRNA), bien establecidos
hoy en día, se conoce una amplia variedad de RNA no codifi­
cantes de diversas funciones (sección 9.2).
► El transcrito prim ario d e unidades de transcripción que especifican
mRNA se som ete a l procesam iento de RNA. Como resultado, gran
parte de la secuencia de RNA inicial se descarta para formar un
mRNA mucho más pequeño (sección 1.4.1).
► Sólo se traduce una parte central d el mRNA maduro; secciones de
longitud variable en cada extremo del mRNA permanecen sin
traducirse (sección 1 .5 . 1).
En células animales se encuentra DNA en el núcleo y las mitocon-
drias. Sin embargo, las mitocondrias sólo tienen una fracción muy
pequeña del DNA celular total y un número muy limitado de ge­
nes (véase sección 9.1.2); la inmensa mayoría del DNA de una cé­
lula se localiza en los cromosomas del núcleo.
La fracción de DNA codificante en los genomas de eucariotas
complejas es bastante pequeña. Ello resulta en considerable medi­
da de la naturaleza no codificante de gran parte de la secuencia den­
tro de los genes. Otra razón es que una fracción grande del genoma
de eucariotas complejas contiene secuencias repetidas que no son
funcionales o que no se transcriben en RNA. La primera incluye
copias defectuosas de genes funcionales (seu d ogen es y fr a g m en to s
gén ico s) y DNA no codificante muy repetido.
1.3.3 Durante la transcripción, ia información genética
en algunos segm entos de DNA (genes) especifica
RNA
La síntesis de RNA se lleva a cabo mediante una polimerasa de
RNA, con DNA como plantilla y ATP, CTP, GTP y UTP como
precursores de RNA. Este último se sintetiza como una cadena ais­
lada y la dirección de la síntesis es 5' 3'. El alargamiento de la
cadena ocurre por la adición del residuo monofosfato del ribonu-
cleósido apropiado (AMP, CMP, GMP o UMP) al grupo hidroxilo
libre 3' en el extremo 3' de la cadena de RNA en crecimiento. Es­
tos nucleótidos se derivan al cortar un residuo pirofosfato (PP¡) de
los precursores de trifosfato de ribonucleósido (rNTP) apropiados.
Ello significa que el nucleótido en el extremo terminal 5' (el nu-
cleó tid o in icia d or) difiere de todos los otros porque su cadena lleva
un grupo trifosfato 5' ■
En condiciones normales, sólo una de las dos cadenas de DNA
actúa como plantilla para la síntesis de RNA. Durante la transcrip­
ción se desenreda el DNA de doble cadena y la cadena de DNA que
actúa como plantilla para la síntesis de RNA forma un h íb rid o
R N A - D N A de doble cadena transitorio con la cadena de RNA en
crecimiento. A medida que el transcrito del RNA es complementa­
rio de esta cadena plantilla, el transcrito tiene la misma dirección
5' 3' y secuencia de bases (excepto porque U reemplaza a T) res­
pecto de la cadena no plantilla opuesta de la doble hélice. Por esta
razón, la cadena no plantilla se conoce con frecuencia como cadena
de sentido y la cadena plantilla suele denominarse cadena de anti­
sentido (fig. 1-12). Cuando se documentan las secuencias génicas es
usual mostrar sólo la secuencia de DNA de la cadena de sentido. La
orientación de secuencias en relación con una secuencia génica se
llama las más de las veces cadena de sentido. Por ejemplo, el extre­
mo 5' de un gen se refiere a secuencias en el extremo 5' de la cade­
na de sentido y las secuencias corriente arriba o corriente abajo
aluden a las secuencias que flanquean al gen en los extremos 5' o 3',
respectivamente, con referencia a la cadena de sentido.
En células eucarióticas se requieren tres moléculas de polimera­
sa de RNA diferentes para sintetizar las distintas clases de RNA
(cuadro 1-4). La inmensa mayoría de los genes celulares codifica
polipéptidos y los transcribe la polimerasa II de RNA. Sin embar­
go, cada vez se concede mayor importancia a los genes que codifi­
can RNA como su producto maduro: hoy en día se sabe que
moléculas funcionales de RNA tienen una amplia variedad de ac­
ciones y se han atribuido a algunas de ellas funciones catalíticas
(véase sección 9.2.3).
 i . 3 | TRANSCRIPCIÓN DEL RNA Y EXPRESIÓN GENICA 17

P ro m o to r

\J0 % é ^é W ^
f j j r * ' fá T ’''
-ni- é r á ^ %*. J ^ L w '^ -ü »
< 5'

/© t \

l
TF TF
-

RNA
©
p ol.

C a d e n a d e s e n tid o
5'
3'
f* S \á 5'
111111111111111111111111
5 ' P P P > ....... .........i....:............-> O H 3 '
C la v e :
RNA ' — C a d e n a p la n tilla l i l l l l l l l l i l Enlaces de
(= cadena de antisentido) hidrógeno

Fig. 1-12. El RNA se transcribe como una cadena única que es complementaria en la secuencia de bases a una cadena (cadena en plantilla)
de un gen.
Se requieren varios factores de transcripción (TF) para unirse a una secuencia promotora en la cercanía inmediata de un gen (1), a fin de colocar y
guiar de form a subsecuente la polimerasa de RNA que transcribe el gen (2). La síntesis de la cadena se inicia con un trifosfato de nucleósido y el
alargamiento de la cadena ocurre por la adición sucesiva de residuos de monofosfato de nucleósido proporcionados por rNTP al OH 3 ’ . Esto significa
que el extremo 5 ' tiene un grupo trifosfato, que puede modificarse más adelante (p. ej., mediante bloqueo [capping]; véase sección 1.4.2) y el extremo
3 ' posee un grupo hidroxilo libre. Nota: en condiciones normales, la secuencia de RNA es idéntica a la cadena de sentido del gen (excepto que U
reemplaza a T ) y complementaria en secuencia a la cadena plantilla.

1.3.4 Se requieren elementos reguladores de acción cis
y factores de transcripción de acción trans en la
expresión génica eucariótica
Las polimerasas de RNA eucarióticas no pueden iniciar la transcrip­
ción por sí mismas. Por el contrario, las combinaciones de elemen­
tos de secuencia corta en la cercanía inmediata de un gen actúan
como señales de reconocimiento para que se unan factores de
transcripción al DNA a fin de guiar y activar la polimerasa. Mu­
chas veces se reúne un grupo mayor de estos elementos de secuen­
cia corta corriente arriba de la secuencia de codificación de un gen,
en donde constituyen en conjunto el p rom otor. Después de unirse
varios factores generales de transcripción a la región promotora, se
une una polimerasa de RNA al complejo de factor de transcripción y
se activa para iniciar la síntesis de RNA desde una localización única.
Se dice que los factores de transcripción tienen acción tra ns porque
los sintetizan genes localizados en posición remota y se requieren
para migrar a sus sitios de acción. En contraste, los elementos pro­
motores tienen acción cis porque su función está limitada al DNA
dúplex en el que residen (cuadro 1-5). Los principales agrupamien-
tos funcionales de elementos de acción cis incluyen:
► Promotores. Los elementos comunes de acción cis incluyen:
• TATA box, con frecuencia TATAAA o una variante, y por lo
general se encuentran en una posición alrededor de 25 pb

Cuadro 1 Las tres clases de polimerasa de R N A eucariótica

Clase Genes transcritos Comentarios

28S rRNA; 18S rRNA; 5.8S rRNA Localizado en el nucléolo. Se segmenta un transcrito primario único (45S rRNA) para
form ar las tres clases de rRNA indicadas

Todos los genes que codifican polipéptidos; Los transcritos de polimerasa II son únicos porque están sujetos a bloqueo (capping)
casi todos los genes snRNA y poliadenilación

5S rRNA; tRNA genes; U6 snRNA; 7SL RNA; El promotor de algunos genes transcritos por polimerasa III de RNA (p. ej., 5S rRNA,
7SK RNA; 7SM RNA; SiRNA tRNA, 7SL RNA) se halla dentro del gen (véase fig. 1-13) y en otros (p. ej., 7SK RNA)
corriente arriba
 18 CAPÍTULO UNO ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIÓN GENICA

Ejemplos de elementos de acción cis reconocidos por factores de transcripción ubicuos

Elemento cis La secuencia de DNA es idéntica a Factores de acción trans Comentarios
(o es una variante de) relacionados

GC box GGGCGG Spi El factor Spi es ubicuo

TATA box TATAAA TFIID TFIIA se une al complejo

TFIID-box TATA para
estabilizarlo

CAAT box CCAAT Muchos, p. e j„ C/EBR CTF/NF1 Familia grande de factores

de acción trans

TRE (elemento de respuesta de TPA) GTGAGT(A/C)A AP-1 familia, p. ej., JUN/FOS Familia grande de factores
de acción trans

CRE (elemento de respuesta de cAMP) GTGACGT(A/C)A(A/G) CREB/ATF familia, p. ej., ATF-1 Genes activados en
respuesta a cAMP

corriente arriba (—25) del sitio de inicio transcripcional (fig.
1-13). De manera característica se encuentran en genes que
son transcritos de forma activa por la polimerasa II de RNA,
pero en un sentido restringido, esto es, en una etapa especí­
fica del ciclo celular (p. ej., histonas) o en tipos específicos
de células (como la globina (3). La mutación en el elemento
TATA no previene el inicio de la transcripción, pero causa el
desplazamiento del punto de inicio de la transcripción de la
posición normal.
GC box, una variante de la secuencia consenso GGGCGG,
que se halla en una diversidad de genes, muchos de ellos ca­
recen del TATA box como en el caso de los genes que cuidan

-100 -9 0 -8 0 -7 0 -6 0 -5 0 -4 0 -3 0 -20 -10 +1

G lo b in a -p __I_ I_ __I __|_ -L

-1 0 0 0 -9 0 0 -8 0 0 -7 0 0 -6 0 0 -5 0 0 -4 0 0 -3 0 0 -2 0 0 -1 0 0 +1
R e c e p to r 1---------.---------'------- *--------- J-------------- ---------------.------- U -------------- 1----------------O — --------- 1------------- 1------------- L
g lu c o c o rtic o id e
> <' »' < ^>>

-1 5 0 -1 4 0 -1 3 0 -1 2 0 -1 1 0 -1 0 0 -9 0 -8 0 -7 0 -6 0 -5 0 -4 0 -3 0 -2 0 -1 0 +1
H is to n a H 2 B _ _ | _______I_______I I_______I_______|_______I_______|_______|_______|_______|_______|_______I I I_______I
O ct O ct

+30 +40 +50 +60 +70 +80

__ I

C la v e :
TATA b o x y CAAT box O ct O ctám ero

y y <G Cbox +1 S itio d e in ic io tra n s c rip c io n a l

Fig. 1-13. Los promotores eucarióticos consisten en un conjunto de elementos de secuencia corta conservados, localizados a distancias
relativamente constantes desde el sitio de inicio de la transcripción.

Las orientaciones alternativas para los elementos GC y box CAAT están indicadas por la orientación de la sardineta: > significa orientación normal;
< indica orientación inversa. El gen del receptor de glucocorticoides es poco común porque posee 13 boxes GC corriente arriba (10 en la orientación
normal; tres en la orientación inversa). La polimerasa III de RNA transcribe los genes de tRNA y éstos tienen un promotor bipartito interno que comprende
el elemento A (por lo general dentro de los nucleótidos numerados + 8 a + 1 9 , según el sistema de numeración de nucleótidos del tRNA estándar) y un
elemento B (casi siempre entre los nucleótidos + 5 2 y + 6 2 ). A estos elementos se enlazan factores de transcripción específicos y a continuación guían
a la polimerasa III de RNA para iniciar la transcripción en + 1 .

la casa (sección 1.3.5). Aunque la secuencia GC box es asi­
métrica, al parecer funciona en cualquier orientación (véase
fig. 1-13).
• CAAT box se localiza con frecuencia en la posición -80. Por
lo regular es el determinante más potente de la eficiencia del
promotor. Al igual que GC box, es capaz al parecer de fun­
cionar en cualquier orientación (fig. 1-13).
Además de los anteriores se sabe que los factores de transcripción
restringidos a tejido identifican más elementos de reconocimiento
específicos (véase cuadro 10-3).
► Los intensificadores incluyen a grupos de elementos de secuen­
cia corta de acción cis, que pueden intensificar la actividad
transcripcional de genes eucarióticos específicos. Sin embargo,
a diferencia de los elementos promotores cuyas posiciones res­
pecto del sitio de inicio transcripcional son relativamente cons­
tantes (fig. 1-13), los intensificadores se localizan a una distancia
variable, y a menudo considerable, del sitio de inicio transcripcio­
nal y su función es independiente de su orientación. Al parecer,
enlazan proteínas reguladoras de gen y, de manera subsecuente, el
DNA entre el promotor y el intensificador forma un asa, que
permite que se unan proteínas al intensificador para interactuar
con los factores de transcripción enlazados al promotor, o con
la polimerasa de RNA.
► Los silenciadores son elementos reguladores con propiedades
similares a las de los intensificadores, pero inhiben la actividad
transcripcional de genes específicos.
1.3.5 La expresión génica específica de tejido incluye la
activación selectiva de genes específicos
El contenido de DNA de un tipo específico de célula eucariota, por
ejemplo un miocito, es virtualmente idéntico al de un linfocito,
una célula hepática o cualquier otro tipo de células nucleadas del
mismo microorganismo. El hecho que distingue a los diferentes ti­
pos de células es que en una célula determinada sólo se expresa en
grado significativo una proporción de los genes y el catálogo de genes
expresados varía entre diferentes tipos d e células. En algunas células,
en particular las cerebrales, se expresa un gran número de genes di­
ferentes; en muchos otros tipos de células, una fracción grande del
gen es inactiva en sentido transcripcional.
Desde luego, los genes que se expresan son los que definen las
funciones de la célula. Algunas de ellas son funciones celulares gene­
rales y se especifican por los llamados genes que “cuidan la casa” (p.
ej., genes que codifican histonas, proteínas ribosómicas, etc.). Otras
funciones pueden restringirse en gran parte a tipos particulares de te­
jidos o células (expresión génica específica de tejido). Sin embar­
go, cabe señalar que incluso en el caso de genes que muestran una
gran especificidad de expresión tisular, algunos transcritos génicos
pueden estar representados a niveles muy bajos en todos los tipos de
células.
La distinción entre regiones de DNA activas en sentido trans­
cripcional e inactivas en una célula se refleja en la estructura de la
cromatina vinculada:
► La cro m a tin a in a ctiv a d esd e e l p u n to d e vista tra n scrip cio ­
n a l suele adoptar una conformación muy condensada y con fre­
cuencia se relaciona con regiones del genoma que se someten a
una replicación tardía durante la fase S del ciclo celular. Esto se
vincula con el enlace estrecho por la molécula H 1 de histona.
1.4 j PROCESAMIENTO DEL RNA_ 19
► La cro m a tin a a ctiv a en sen tid o tra n scrip cio n a l adopta una
conformación más abierta y muchas veces se replica temprano
en la fase S. Se caracteriza por el enlace relativamente débil por
moléculas H1 de histona y acetilación extensa de los cuatro ti­
pos de histonas nucleosómicas (es decir, histonas H2A, H2B,
H3 y H4; véase sección 10.2.1).
De modo adicional, las regiones promotoras de los genes de verte­
brados suelen caracterizarse por la ausencia de citosinas metiladas
(véase más adelante). Los factores de transcripción pueden mostrar
nucleosomas y por consiguiente es posible distinguir por medios
experimentales la conformación abierta de la cromatina activa en
sentido transcripcional, porque ello también permite el acceso a
nucleasas: a concentraciones muy bajas, la enzima desoxirribonu-
cleasa I (DN-asa I) digiere regiones largas de DNA sin nucleosoma.
Aunque las regiones reguladoras pueden contener varias proteínas
de unión específicas de secuencia, la estructura de la cromatina
abierta se caracteriza por la presencia de sitio s h ip ersen sib les a
DN-asa /(véase sección 10.5.2).
1.4 Procesam iento del RNA
El transcrito de RNA de la mayor parte de los genes eucarióticos se
somete a una serie de reacciones de procesamiento. Con frecuencia
incluyen la eliminación de segmentos internos indeseables y la nue­
va unión de los segmentos restantes (RNA sp licin g, corte y unión).
Además, en los transcritos de polimerasa II de RNA se añade una
unión nucleótida especializada (7-trifo sfa to d e m etilgu an osin d) al
extremo 5' del transcrito primario (capping, recubrimiento de blo­
queo) y se añaden de modo secuencial residuos de adenilato (AMP)
al extremo 3' de mRNA para formar una cola poli-(A) (p o lia d en i-
lacióri).
1.4.1 El corte y unión (splicing) del RNA elimina
secuencias de RNA no esenciales del transcrito
primario
La secuencia lineal de una unidad de transcripción rige la síntesis
de un producto de expresión correspondientemente lineal, sea un
polipéptido o un RNA no codificante maduro. Sin embargo, en la
mayor parte de los genes de vertebrados se ha interpretado que só­
lo una porción pequeña de la secuencia del gen proporciona el pro­
ducto final. Por el contrario, en la gran mayoría de los genes que
codifican polipéptidos, y muchos de los genes que especifican RNA
no codificante, la información genética se halla en segmentos (exo-
nes) separados por secuencias intermedias que no contribuyen con
información genética que se utiliza para sintetizar el producto final
(intrones).
El fenómeno de transcripción inicial incluye la producción de
una secuencia de RNA complementaria a la longitud total del gen,
el llamado tra n scrito p rim a rio . En genes que contienen múltiples
exones, el transcrito primario posee secuencias complementarias
para los exones y los intrones que incluye el gen. Sin embargo, más
adelante, el transcrito de RNA se somete a splicing de RNA, una
serie de reacciones de procesamiento mediante las cuales se cortan
y descartan segmentos de RNA intrónicos y se unen los tramos de
RNA exónicos extremo con extremo (spliced) para obtener un pro­
ducto de RNA más corto (fig. 1-14). El splicing (corte y unión) de
RNA requiere que se reconozcan las secuencias de nucleótidos en
20 1 CAPÍTULO UNO j ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIÓN GENICA
los límites del exón/intrón (uniones de splice). En la inmensa ma­
yoría de los casos, los intrones comienzan con GT (o GU a nivel
del RNA) y el extremo con AG (regla GT-AG; véase fig. 1-15).
Aunque los dinucleótidos GT (GU) y AG conservados tienen una
importancia crucial para el splicing, no son suficientes por sí mismos
para señalar la presencia de un intrón. Comparaciones de secuen­
cias comprobadas revelaron que las secuencias inmediatamente ad­
yacentes a los dinucleótidos GT y AG también muestran un grado
considerable de conservación (fig. 1-15). Una tercera secuencia in-
trónica conservada que es esencial desde el punto de vista funcio­
nal en el splicing es el llamado sitio de ramificación, que suele estar
localizado muy cerca d el extremo del intrón, cuando mucho 40 nu-
cleótidos antes del dinucleótido AG terminal (fig. 1-15). Además,
algunas otras secuencias exónicas e intrónicas tienen efectos positi­
vos (secuencias in ten sifica d o ra s d e splice) o efectos negativos (se­
cuencias silen cia d o ra s d e sp lice) en el sp licin gy las mutaciones en
esas secuencias pueden ser patogénicas (sección 1 1.4.3).
El mecanismo de splicing (corte y unión) comprende las secuen­
cias siguientes:
► Corte en la unión de splice 5'■
► Ataque nucleofílico por el nucleótido G terminal del sitio do­
nador del splice en la invariante A del sitio de ramificación para
crear una estructura en forma de lazo.
► Corte en el sitio de splice 3', que da lugar a la liberación del
RNA intrónico como un lazo y splicing de segmentos exónicos
de RNA (fig. 1-16A).
P ro m o to r Exón 1
G en
E1
T ra n s c rito d e
R N A p rim a rio
R N A m a d u ro
Fig. 1-14. El splicing de RNA incluye el corte endonucleolítico y la eliminación de segmentos de RNA intrónicos y splicing (unión) de segmentos
de RNA exónicos.
Las reacciones anteriores las media un complejo RNA-proteína
grande, el spliceosoma, que consiste en cinco tipos de snRNA (del
inglés sm all nuclear RNA, RNA nuclear pequeño) y más de 50 pro­
teínas (véase Staley y Guthrie, 1998; Hastings y Krainer, 2001).
Cada una de las moléculas de snRNA está unida a las proteínas es­
pecíficas para formar partículas snRNP y la especificidad de la
reacción de splicing se establece por el pareamiento (formación de
pares) de bases RNA-RNA entre el transcrito de RNA y las mo­
léculas de snRNA. Hay dos tipos de spliceosoma:
► El spliceosoma mayor (GU-AG) procesa intrones GT-AG típi­
cos. En la inmensa mayoría de intrones en genes que codifican
polipéptidos, las cinco especies de snRNA son snRNA U l, U2,
U4, U5 y U 6 . La terminal 5' del snRNA U l tiene una secuen­
cia UACUUAC cuya base forma pares con el consenso donador
de splice (GUAAGUA). Después de enlazarse la snRNP U l, el
snRNA U2 reconoce el sitio de ramificación por una reacción
similar de pareamiento de bases y, de manera subsecuente, la in­
teracción entre snRNP U l y snRNP U2 acerca entre sí las dos
uniones de splice. Más adelante, una partícula multi-snRNP
que contiene snRNA U4, U5 y U 6 se vincula con el complejo
snRNP U1-U2 (fig. 1-16B).
► Spliceosoma menor (AU-AC). Éste procesa una clase rara de
intrones, que se conocen como intrones AT-AC porque los di­
nucleótidos 5' GT y 3' AG conservados son reemplazados por
AT y AC, respectivamente. En este caso, snRNA U ll y U12
sustituyen a U l y U2 (véase Tarn y Steitz, 1997).
Unidad de transcripción
Intrón 1 Exón 2 Intrón 2 Exón 3
E2 ¡>E3
¡Segmentación en :
GU— AG - D e s c a r ta r
E2 E3
C o r te y u n ió n / /
// // //
// / ' / '
E2 E3 /
 1.4 | PROCESAMIENTO DEL RNA 21

S itio d o n a d o r d e S itio d e Sitio

c o rte y unión ra m ific a c ió n splice a c e p to r

£ag
A
_ t A . „ x \ \ T..CTA .C
G T G A G T .......................... ............................................... C T C G
C C CC C CCCCCCMC Ar
T ................................... T T T T T T T T T T T N T A G

Exó n -— 1 0 s a > 1 0 0 0 0 n u c le ó tid o s — * — < 20 n u c leó tid o s—1- Exón

Fig. 1-15. Secuencias de consenso a nivel del DNA para el splice (corte) donador y el splice (unión) del aceptor y sitios de ramificación en
los Intrones de eucariotas complejos.
Los nucleótidos que se destacan son casi Invariables (nota: existen asimismo intrones AT-AC raros, en los que el dinucleótido GT splice donador
conservado se reemplaza por AT y en los que el dinucleótido AG splice aceptor conservado se sustituye con AC; véase texto). Otros nucleótidos
representan la mayor parte de los nucleótidos que se encuentran en esta posición particular, o el equivalente entre dos nucleótidos, por ejemplo entre C
y T en la via de poiipirimidina adyacente al extremo 3 ' del intrón. Los elementos típicos preferidos para el splice donador, el sitio de ramificación y el
splice aceptor en especies Individuales (Incluidos los humanos, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans y Saccharomyces cerevisiae) se
encuentran en una lista de Lim y Burge (2001). Se sabe que algunas otras secuencias exónicas e ¡ntrónicas regulan el corte y la unión (splicing)
Incluidas las secuencias splice intensificadoras y silenciadoras (véase Berget y cois., 1995). Véase asimismo Fairbrother y cois. (2002) para las
secuencias consenso y la secuencias splicing Intensificadoras exónicas.

A) B)

S plice _ ... . S plice Splice S itio d e Splice

j S itio d e . donador
donador ... . . a c e p to r c<3 ra m ific a c ió n E2
_________ra m ific a c ió n i—c —i
A AG ____ A A G M M
.©OH
1. SnRNP U1 se enlaza al sitio splice donador
2. SnRNP U2 se enlaza al sitio de ramificación
1. Corte en el extremo 5' (s)
2. El ataque nucleofílico ( v _ . ) tiene como E2
resultado la formación de un lazo
is m
L a zo X íW la r

Enlace de U 4/U 5/U 6

E1 E2 Complejo SnRNP; SnRNP U5
AG— se enlaza al splice donador + aceptor

1. Corte en el extremo 3'

2. Ligadura de exones

E1 E2

Fig. 1-16. Mecanismo de splicing (corte y unión) de RNA (intrones GU-AG).

A) Mecanismos. Véase la figura 1-15 para hallar una descripción de las secuencias de consenso de splice donador, splice aceptor y sitio de ramifica­
ción. El ataque nucleofílico incluye el grupo de hidroxilo 2 ' fijado al A conservado en el sitio de ramificación y el G del GU conservado al inicio del intrón
y que tiene por resultado un enlace covalente nuevo que une estos dos nucleótidos para form ar una estructura ramificada (lazo).
B) Sitio de las snRNP. Las partículas de ribonucleoproteína nucleares pequeñas (snRNP) son parte del spllceosoma. snRNA U1 tiene una secuencia C
terminal complementaria al consenso del splice donador y se unen a él mediante el pareamiento de bases RNA-RNA. Después del enlace de snRNP U1,
snRNA U2 reconoce el sitio de ramificación por una reacción de pareamiento de bases similar. Se estabilizan la interacción entre las uniones splice do­
rador y splice aceptor mediante el enlace subsecuente de una partícula multi-snRNP preformada, que contiene snRNA U4, U5 y U6, y el snRNP U5 es
capaz de unirse de manera simultánea al splice donador y el splice aceptor.
22 | CAPÍTULO UNO | ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIÓN GÈNICA

El spliceosoma, si se lo representa de forma mental, actúa en una
forma procesal: una vez que se reconoce un sitio de splice 5 ', busca
la secuencia de RNA hasta que encuentra el siguiente sitio de spli­
ce 3 ' (que se señalaría como un blanco por la secuencia de consen­
so del sitio de ramificación localizado justo antes de él). Sin
embargo, el orden en que se eliminan las secuencias intrónicas y se
unen (sp liced) sus secuencias exónicas de flanqueo no está regido
por su patrón lineal en el transcrito de RNA; por el contrario, se
piensa que la conformación del RNA influye en la accesibilidad de
los sitios de splice 5'.
1.4.2 Se añaden nucleótidos especializados a los
extremos 5' y 3' de la mayor parte de los
transcritos de polimerasa II de RNA
Además del corte y unión (splicing) de RNA, los transcritos de po­
limerasa II de RNA se someten a dos fenómenos de procesamien­
to del RNA adicionales:
Bloqueo (capping)
Ocurre poco después de la transcripción. En el caso de transcritos
primarios que se procesan para obtener mRNA, se une un nucleó­
sido metilado, 7-metilguanosina (m7G), al primer nucleótido 5'
del transcrito de RNA por un enlace fosfodiéster 5'-5' especial. A
medida que este enlace establece un puente efectivo del carbono 5'
del residuo m7G al carbono 5' del primer nucleótido, se dice que el
extremo 5' está bloqueado o capped (fig. 1-17). Los transcritos de
los genes snRNA también están capped, pero sus bloqueos (caps)
pueden sufrir una modificación adicional. Por lo general se consi­
dera que el bloqueo (cap) tiene varias posibles funciones:
► Proteger al transcrito del ataque de exonucleasa S'-*3' (las mo­
léculas de mRNA que no se bloquean [decapped\ se degradan
con rapidez).
► Facilitar el transporte del núcleo al citoplasma.
► Promover el splicing de RNA.
► Tener una función esencial en la fijación de la subunidad 40S de
los ribosomas citoplásmicos al mRNA (véase más adelante).
Poliadenilación
Se sabe que la transcripción por la polimerasa I de RNA y la III se
detiene una vez que la enzima reconoce un sitio de terminación de
transcripción específico. Sin embargo, es difícil identificar los posi­
bles sitios de terminación de la transcripción mediante polimerasa

OH OH
2'|___ 3'
A 4'
mG 0 s'ch 2:
l S
o I

O U nión trifo s fa to
5-5'

O
¡ 5
5'CH2 [PÜ1 5'CH2 [Pu]

4w r
/ 0\ © P é rd id a d e y -fo s fa to

3i r
O OH
‘
© A d ic ió n d e G M P
w 0 o
ch3
© M e tila c ió n del á to m o d e n itró g e n o 7 d e
0 G a g re g a d o y d e l c a rb o n o 2 ' d e la o
1 rib o s a d e l n u c le ó tid o a d y a c e n te
5'CH.
¡ O , ED (y d e su a d ju n to en v e rte b ra d o s )
5'CH,
0„ S]

OH
W’
CHa

Fig. 1-17. El extremo 5 ' de las moléculas de mRNA eucaríóticas está protegido (bloqueado) por un nucleótido especializado (capping).

Después de eliminarse el fosfato gamma original del nucleótido terminal 5 ', un precursor GTP proporciona un nuevo residuo GMP que forma una
unión especializada 5 ’- 5 ' trifosfato con lo que era el nucleótido terminal 5 '. Reacciones posteriores conducen a la metilación del átomo de nitrógeno
7 de la terminal G y, en vertebrados, del átomo de carbono 2 ' de la ribosa de cada uno de los dos nucleótidos adyacentes. N, cualquier nucleótido;
Pu, purina.
 1.5 | TRADUCCIÓN, PROCESAMIENTO POSTRADUCCIONAL Y ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS [ 23

S itio d e inicio S itio d e ad ic ió n ¿ S e ñ ale s

d e tra n s c rip c ió n p o li-(A ) c o rrie n te ab ajo ?

=t AATAAA
TTA TTT t
5 ' m 7G p p p
i T ran scrip ció n

AAUAAA 3'

5 ' m 7G p p p
i
AAUAAA
C o rte

3'

i
A d ic ió n
d e poli-(A )

5 ' m 7G p p p AAUAAA ■A A A A A A A - -A A A -O H 3 '

N u c le ó tid o s
1 5 -3 0

Fig. 1-18. El extremo 3' de la mayor parte de las moléculas de mRNA eucarióticas se poliadenila.
El extremo de la transcripción de transcritos de polimerasa II de RNA está indicado por un corte 3 ' en el RNA transcrito. En casi todas las especies de
mRNA, esto se logra por una señal corriente arriba AAUAAA en conjunto con señales corriente abajo no identificadas, hasta la fecha. En condiciones
normales, la segmentación ocurre alrededor de 15 a 30 nucleótidos corriente abajo del elemento AAUAAA y después se añaden residuos a AMP por la
polimerasa poli-(A) para form ar una cola poli-(A). El mRNa de histona sufre una reacción de corte 3 ' diferente (véase texto).

II de RNA porque los extremos 3' de las moléculas de mRNA están
determinados por una reacción de segmentación postranscripcional.
La secuencia AAUAAA (o en ocasiones la variante AUUAAA,) es una
secuencia de señal de poliadenilación mayor que señala el corte de
3' para la inmensa mayoría de los transcritos de polimerasa I I (los
transcritos de genes de histona y genes snRNA son excepciones notables).
El corte sucede en un sitio específico localizado 15 a 30 nucleótidos
corriente abajo del elemento AAUAAA (fig. 1-18).
El transcrito primario puede continuar cientos o miles de nu­
cleótidos más allá del punto de corte hasta que tiene lugar la termi­
nación en uno de varios sitios posteriores. Una vez que se observó
el corte corriente abajo del elemento AAUAAA, en células de ma­
míferos, la enzima polimerasa poli-(A) añade de modo secuencial
alrededor de 200 residuos de adenilato (es decir, AMP) para formar
una cola poli-(A). A menudo se piensa que la cola poli-(A) tiene
varias funciones posibles:
► Facilitar el transporte de las moléculas de mRNA al citoplasma.
► Estabilizar cuando menos algunas de las moléculas de mRNA
en el citoplasma [el acortamiento de las vías poli-(A) se acom­
paña de degradación del mRNA, pero algunas especies de mR-
NA (p. ej., mRNA de actina), continúan estables sin poli-(A) o
muy poca].
► Promover la traducción y mejorar el reconocimiento del mRNA
por la maquinaria ribosómica.
En los genes de histona, los cuales son únicos en la producción de
mRNA que no se poliadenila, la terminación de la transcripción in­
cluye asimismo el corte 3' del transcrito primario. Esta reacción de­
pende de la estructura secundaria en el transcrito de RNA, incluida
una secuencia en horquilla corriente arriba conservada y una se­
cuencia corriente abajo corta con pares de bases en el extremo 5 ’
del snRNA U7.
1.5 Traducción, procesamiento
poslraduccional y estructura
de ias proteínas
1.5.1 Durante la traducción se descodifica el mRNA
en los ribosomas para especificar la síntesis de
polipéptidos
Después del procesamiento postranscripcional, el mRNA transcri­
to de los genes en el DNA nuclear migra al citoplasma. En este si­
tio, se une con ribosomas y otros componentes para dirigir la
síntesis de polipéptidos específicos. Las mitocondrias también tie­
nen ribosomas y una capacidad limitada para sintetizar proteínas
(véase sección 9.1.2).
Sólo el segmento central de una molécula de mRNA eucarióti-
ca típica se traduce para especificar la síntesis de un polipéptido.
Las secuencias de flanqueo, regiones 5' y 3' no traducidas (RNT
24 CAPÍTULO UNO ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIÓN GÈNICA

Exón 1 Intrón 1 Exon 2 Intrón 2 Exón 3

Fig. 1-19. Expresión del gen de globina p humana.

Los exones 1 y 3 contienen cada uno secuencias no codificantes (barras sombreadas) en sus extremidades, que se transcriben y se encuentran en los
extremos 5 ' y 3 ' del mRNA de la globina p, pero no se traducen para especificar síntesis polipeptídica. Sin embargo, se piensa que estas regiones 5 ' y
3 ' no traducidas (RNT 5' y RNT 3 ') son importantes para asegurar la gran eficiencia de la traducción (véase texto). El codón de detención UAA
representa los tres primeros nucleótidos de la región no traducida 3 '. Obsérvese que el producto inicial de la traducción tiene 147 aminoácidos, pero
que se elimina la metionina N terminal por el procesamiento postraduccional para producir el polipéptido maduro globina p. El exón 1 codifica las dos
primeras bases del codón que especifican Arg30 y el exón 2 la tercera base (es decir, el intrón 1 separa las bases segunda y tercera del codón, un
ejemplo de un intrón de lase 2; véase recuadro 12-2). El segundo intrón separa los codones 104 y 105 y es un ejemplo de un intrón de fase 0; véase
el recuadro 12-2 y asimismo la figura 1-23 para hallar un ejemplo de intrón de fase 1.

5'; RNT 3') se transcriben a partir de los exones terminales 5' y 3'
y, al igual que el cap 5' y la poli-(A) cola 3’, contribuyen al enlaza-
miento y la estabilización del mRNA en los ribosomas en donde
ocurre la traducción del segmento central (fig. 1-19).
Los ribosomas son complejos de RNA y proteínas grandes que
poseen dos subunidades. En eucariotas, los ribosomas citoplásmi-
cos tienen una subunidad 60S grande y una subunidad 40S pequeña
(los valores S son una medida de la rapidez con que se sedimentan
las estructuras moleculares grandes en la ultracentrifugación y de­
penden de la masa y la forma molecular). La subunidad 60S con­
tiene tres tipos de moléculas de rRNA: 28S rRNA, 5.8S rRNA y 5S
rRNA y alrededor de 50 proteínas ribosómicas. La subunidad
40S incluye un 18S rRNA aislado y más de 30 proteínas ribosómi­
cas. Los ribosomas proporcionan un marco estructural para la sín­
tesis de polipéptidos en la que los componentes de RNA se encargan, de
modo predominante, de la función catalítica del ribosoma; se piensa que
los componentes proteínicos aumentan la función de las moléculas
de rRNA y en apariencia un número sorprendente de ellos no pa­
rece esencial para la función del ribosoma.
El ensamble de un nuevo polipéptido a partir de sus aminoáci­
dos constituyentes está regido por un código genético de triple­
tos. Se descodifican de manera secuencial grupos sucesivos de tres
nucleótidos (codones) en la secuencia lineal del mRNA a fin de es­
pecificar aminoácidos individuales. El proceso de descodificación
recibe la mediación de un conjunto de moléculas del tRNA, a ca­
da una de las cuales se enlaza de modo covalente un aminoácido es­
pecífico (en el grupo hidroxilo 3' libre del tRNA, véase fig. 1-20),
por acción de una sintetasa de aminoacilo de tRNA.
Distintas moléculas de tRNA enlazan diferentes aminoácidos.
Cada tRNA tiene una secuencia trinucleótida específica, llamada
anticodón, en un sitio crucial localizado en el centro de un brazo
del tRNA (fig. 1-7B). Este sitio proporciona la especificidad nece­
saria para interpretar el código genético: a fin de que se inserte un
aminoácido en la cadena polipeptídica en crecimiento, debe reco­
nocerse el codón importante de la molécula de mRNA mediante el
pareamiento de bases con un anticodón complementario adecuado
de la molécula de tRNA apropiada (fig. 1-20).
Un modelo de traducción supone que la subunidad ribosómica
40S reconoce al principio el cap 5' a través de la participación de
proteínas que se unen de modo específico a este último. A conti­
nuación explora a lo largo del mRNA hasta que encuentra el codón
de inicio, que casi siempre es metionina de especificación AUG (se
 1.5 TRADUCCIÓN, PROCESAMIENTO POSTRADUCCIONAL Y ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS 25

5' AUG A
V ■A G G ----------C U C ■ ■A U G ---------- A U G ------------------U G G ---------^ ---------3'

t
t
ACC

Term inal N M e t- AT ■A r g ------------ Leu

i Trp

o= P - 0
C H ,?

CH¡
CH,
n2 O OH
I I
NH, c c o
I
H

Fig. 1-20. El código genético se descifra por el reconocimiento codón-anticodón.

La secuencia de nucleótidos en la secuencia del mRNA se interpreta a partir de un punto de inicio traduccional (casi siempre indicado por la secuencia
AUG) y continúa en la dirección 5 ' - » 3 ' hasta llegar a un codón de detención en ese marco de lectura. La secuencia anticodón complementaria de una
molécula de tRNA reconoce cada codón en el mRNA; a ella se enlaza de modo covalente un aminoácido específico de la adenosina en el extremo 3'
(véase inserto).

conocen unos cuantos casos en los que se utilizan, en lugar de él, noácido en promedio; empero, en algunos aminoácidos, por ejem­
ACG, CUG o GUG). Por lo general, el primer AUG que se halla plo leucina y serina, hasta seis codones intervienen en la especifica­
es el codón de inicio. Sin embargo, el AUG se reconoce con eficien­ ción, en tanto que otros están representados de manera mucho más
cia como un codón de inicio sólo cuando está incluido en una se­ escasa (fig. 1-22 ).
cu en cia d e recon o cim ien to d e l co d ón d e in icio adecuada y la
óptima es la secuencia: GCCPuCCAUGG. Los determinantes más
importantes en esta secuencia son los G después del codón AUG y H 0
la purina (Pu), de preferencia A, a la que precede por tres nucleóti­ I II
H„N- c - - C — OH
A
dos (Kozak, 1996). Con posterioridad, se incorporan aminoácidos
sucesivos en la cadena polipeptídica en crecimiento mediante una R, H 0
L© i II
reacción de condensación: el grupo amino del aminoácido que in­ h 2n — c —c OH
gresa reacciona con el grupo carboxilo del último aminoácido por
incorporar y el resultado es un enlace peptídico entre residuos su­
cesivos (fig. 1-21). Esto sufre catálisis de la actividad de la transfe-
rasa de peptidil que reside en el componente RNA de la subunidad i
ribosómica grande.

1.5.2 El código genético se degenera, no es un código

universal
E n la ce p e p tíd ic o
El genético es un código de tres letras. Hay cuatro posibles bases a
elegir de cada una de las tres posiciones de bases en un codón. Por
consiguiente, hay (4)3 = 64 posibles codones, pero sólo 20 tipos Fig. 1-21. Los polipéptidos se sintetizan por la formación de enlaces
mayores de aminoácidos. Como resultado, el código genético es péptidos entre aminoácidos sucesivos.
d egen era tivo: unos tres codones diferentes especifican a cada ami­
26 | CAPÍTULO UNO ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIÓN GÉNICA

AAA]
AAGJ
AAC1
Lis

Asn
CAA
CAG
CAC
} G|n q Í g }
His
GAC1 .
G
IüÜÍS}D
ETEN
C
IÓ
N
U A C } _.
Cuadro 1 -6 . El par codón-anticodón admite pares de bases
relajadas (bamboleantes) en la posición tercera base de
AAUJ CAU G A U J A sp UAUJ codones

ACA CCA GCA1 UCA] Base en el extremo 5' Base reconocida en el

ACG CCG GCG u c g L del anticodón tRNA extremo 3' del codón mRNA
Tre Pro A la
ACC CCC GCC UCC |
ACU CCU GCUJ UCUJ A U sólo
(■DETENCIÓN (N)
A G A lf A r g ( N ) CGA GGA] U G A IT r p (M ) B G sólo
A G G J [DETENCIÓN (M )C G G GGG U G G T rp
A rg Gli G (o 1)* CoU
AGC1 CGC GGC
AGUJ
S er
CGU GGUJ
UGC1<
UGU J
>Cis
file (N) U AoG
A U A iM e t ( M ) CUA] GUA UUA] *1, inosina, una forma de adenina modificada de forma postraduccional. Véase el
Leu
AUG M et CUG GUG UUGJ recuadro 9-4 para mayores detalles del reconocimiento de inosina y codón-anti-
Leu Val
AUCl CUC GUC UUC1 codón dei tRNA citoplásmico.
lie Fen
AUUJ CUUJ GUU UUUJ

Fig. 1-22. Los códigos genéticos nuclear y mitocondrial son

similares pero no idénticos.
Los cuatro codones (se muestran en rojo) se interpretan de manera
diferente en el núcleo y las mitocondrias de las células de mamíferos;
la interpretación mitocondrial se indica en verde. Por consiguiente, el
código mitocondrial tiene cuatro codones de detención en lugar de tres
(UAA, UAG, AGA, AGG), dos codones Trp en vez de uno (UGA, UGG),
cuatro codones Arg en lugar de seis (CGA, CGC, CGG, CGU), dos
codones Met en vez de uno (AUA, AUG) y dos codones lie en lugar de
tres (AUC, AUU). Notas: a) la degeneración del código genético incluye
con mayor frecuencia la tercera base del codón. En ocasiones puede
sustituirse cualquier base (GGN = glicina, CCN = prolina, etc.; N es
cualquier base). En otros casos lo hace cualquier purina (Pu) o
pirimidina (Pi) (AAPu = lisina, AAPi = asparagina, etc.); b ) las señales
en algunos mRNA pueden conducir a interpretaciones alternativas de
codones de detención, de tal manera que UGA puede especificar un
21° aminoácido, selenocisteina, y UAG glutamina o un 22° aminoácido,
p irro lisin a (Atklns y Gesteland, 2002).
Aunque hay 64 codones, es menor el número correspondiente
de moléculas de tRNA con diferentes anticodones: 30 tipos de tR­
NA citoplásmico y sólo 22 tipos de tRNA mitocondrial. Es posible
interpretar todos los 64 codones en ribosomas citoplásmicos y mi-
tocondriales, dado que las reglas normales de pareamiento de bases
se relajan cuando llegan al reconocimiento del codón-anticodón.
La hipótesis de bamboleo indica que el pareamiento de codón y
anticodón sigue las reglas normales A-U y G-C para las dos prime­
ras posiciones de bases en un codón, pero que tiene lugar un “bam­
boleo” excepcional en la tercera posición y que también pueden
utilizarse pares de bases G—U (véase cuadro 1-6).
Es usual describir el código genético como un có d ig o un iversal,
lo que significa que se utiliza el mismo código en todas las formas
de vida. Esto no es cierto en sentido estricto por la interpretación
alternativa de codones debido a:
^ La d iv erg en cia ev o lu tiva d e có d igo s g e n é tico s d e organ elos.
Las mitocondrias y los cloroplastos también tienen capacidad
para sintetizar proteínas, aunque limitada. Durante la evolu­
ción, estos organelos adoptaron códigos genéticos algo diferen­
tes respecto de los que se usan en los genes nucleares. Por
consiguiente, por ejemplo, continúa la traducción de mRNA de
codificación nuclear hasta que se encuentra un codón de ter­
minación, que es una de tres posibilidades -UAA, UAG, UGA,
en tanto que en las mitocondrias de mamíferos hay cuatro po­
sibilidades: UAA, UAG, AGA y AGG; véase figura 1-22.
► N ueva d efin ició n d e cod on es d ep en d ien te d e l contexto. Las se­
ñales en algunos mRNA, incluidos unos cuantos tipos de mRNA
de codificación nuclear, conducen a la nueva definición (redefini­
ción) de algunos codones. Por ejemplo, en una gran variedad de
células (incluidas las humanas), algunos mRNA de codificación
nuclear pueden interpretar de forma alternativa el mRNA como
un 21° aminoácido, la selen ocisteina, e interpretarse de forma al­
ternativa UAG o glutamina (véase Atkins y Gesteland, 2002).
Por consiguiente, la estructura básica del producto primario de la
traducción tiene en un extremo una metionina con un grupo ami-
no libre (el extremo N terminal) y en el otro un aminoácido con
un grupo carboxilo libre (el extremo C terminal). Cabe señalar que
aunque los codones se traducen en un marco de lectura traduc-
cional específico, en ocasiones se encuentran en eucariotas genes
superpuestos, en los que se utilizan marcos de lectura traduccional
diferentes (véase para un ejemplo la fig. 9 -3 ).
El paso predominante en el control de la traducción es el enla­
ce ribosómico. Además del cap 5’, la RNT 5' (con frecuencia <
200 pb) y la RNT 3 ' (por lo general mucho más larga que la RNT
5') tienen acciones críticas en la incorporación del mRNA para tra­
ducción. Se han caracterizado varios elementos de acción cis que
participan en este proceso y, además, identificado unos cuantos fac­
tores de acción trans que se enlazan a estos elementos. Es posible
que interactúen las secuencias de RNT 5' y 3' para mejorar la tra­
ducción. La RNT 3 ’ tiene un sitio fundamental en la regulación de
la traducción y en esta región se encontraron señales para controlar
la traducción, la estabilidad y la localización del mRNA (véase
Wickens y cois., 1997; véase asimismo sección 10 .2 .6 ).
1.5.3 Las modificaciones postraduccionales incluyen
modificaciones químicas de ciertos aminoácidos y
segmentación polipeptídica
Con frecuencia, los productos primarios de la traducción sufren
una diversidad de reacciones de modificación que incluyen la adi­
ción de grupos químicos que se fijan de manera covalente a la ca­
dena polipeptídica en los niveles de traducción y postraduccional.
 1.5 | TRADUCCIÓN, PROCESAMIENTO POSTRADUCCIONAL Y ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS | 27

Ello puede incluir una modificación química simple (hidroxila-
ción, fosforilación, etc.) de las cadenas laterales de aminoácidos
únicos o la adición de diferentes tipos de grupos de carbohidratos
o de lípidos (véase cuadro 1-7).
Modificación de proteínas por la adición de grupos
carbohidrato
Las glucoproteínas contienen oligosacáridos que están fijados de
manera covalente a las cadenas laterales de ciertos aminoácidos. Po­
cas proteínas en el citosol están glucosiladas, es decir, que tienen un
carbohidrato unido y estas últimas llevan un residuo de azúcar úni­
co, iV-acetilglucosamina, unido de forma covalente a un residuo de
serina o treonina. En contraste, las proteínas que se secretan de las
células o se llevan a lisosomas, el aparato de Golgi o la membrana
plasmática son glucosiladas. Los componentes oligosacáridos de las
glucoproteínas son preformados en gran parte y se añaden en blo­
que a polipéptidos. Se reconocen dos tipos principales de glucosila-
ción:
► Glucosilación N: incluye, en casi todos los casos, la transferen­
cia de una secuencia oligosacárida común al grupo NH2 de la
cadena lateral de un residuo de asparagina dentro del retículo
endoplásmico (RE; véase cuadro 1-7). En el aparato de Golgi
sucede el recorte subsecuente de residuos y su restitución con
diferentes monosacáridos.
► Glucosilación O: véase cuadro 1-7.
Los proteoglucanos son proteínas con glucosam inoglucanos unidos
que suelen contener unidades disacáridas repetidas que incluyen
glucosamina o galactosamina. Los proteoglucanos mejor caracteri­
zados son componentes de la matriz extracelular.
Modificación de proteínas por la adición de grupos lípidos
Algunas proteínas, en especial las de la membrana, se modifican
por la adición de grupos grasos acilo o prenilo, que típicamente sir­
ven como fijadores de membrana. Los ejemplos de grupos grasos
acilo incluyen el grupo miristoilo, un lípido C 14 fijado a un resi­
duo de glicina en el extremo N terminal que permite que la proteí­
na modificada interactúe con un receptor de membrana o la bicapa
lipídica de la membrana. Otro grupo graso acilo que sirve como un
fijador de membrana es el grupo palmitoilo C ^, que se fija al áto­
mo S de residuos de cisterna.
Es típico que los gru p o s p r en ilo se fijen a residuos de cisterna
cerca del C terminal e incluyen los grupos farnesilo (C 15) y geranil-
geranilo (C 2o). Muchas proteínas que participan en la transducción
de señal y el blanco de proteínas contienen una unidad farnesilo o
una unidad geranilgeranilo en su C terminal.
En la fijación de una proteína a la capa externa de la membra­
na plasmática se utiliza un mecanismo diferente: la fijación de un
grupo inositol del glucosilfosfatidilo (GPI). Este grupo glucolípido

Cuadro 1 Principales tipos de modificación de polipéptidos

Tipo de modificación Aminoácidos blanco Comentarios
(grupo añadido)

Fosforilación (P04~) Tirosina, serina, treonina Lograda por cinasas específicas. Pueden
revertirse por fosfatasas

Metilación (CH3) Usina Lograda por metilasas y desechas por

desmetilasas

Hidroxilación (OH) Prolina, lisina, ácido aspártico Hidroxiprolina e hidroxilisina son en particular
comunes en colágenas

Acetilación (CH3C0) Usina Lograda por una acetilasa y desecha por

desacetilasa

Carboxllación (COOH) Glutamato Lograda por carboxilasa 7

Acetilación (CH3C0) Lisina Lograda por una acetilasa y desecha por

desacetilasa

Glucosilación N (carbohidrato complejo) Asparagina, por lo general en la secuencia: Se lleva a cabo al principio en el retículo
Asn-X-(SerlThr) endoplásmico; X es un aminoácido distinto de la
prolina

Glucosilación 0 (carbohidrato complejo) Serina, treonina, hidroxilisina Se lleva a cabo en el aparato de Golgi; menos
común que la glucosilación N

GPI (glucolípido) Aspartato en el C terminal Sirve para fijar proteínas a la capa externa de la
membrana plasmática

Miristoilación (grupo graso acilo C14) Glicina en el N terminal (véase texto) Sirve como fijador de membrana

Palmitoilación (grupo graso acilo C16) Cisteína para form ar unión S-palmitoílo Sirve como fijador de membrana

Farnesilaclón (grupo prenilo C15) Cisteína en el C terminal (véase texto) Sirve como fijador de membrana

Geranilgeranilación (grupo prenilo C20) Cisteína en el C terminal (véase texto) Sirve como fijador de membrana
28 ¡ CAPÍTULO UNO j ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIÓN GÈNICA

complejo contiene un grupo graso acilo que sirve como el anclaje
de membrana, que está unido de manera sucesiva a una unidad de
glicerofosfato, una unidad oligosacárida y al final, a través de una
unidad fosfoetanolamina, al C terminal de la proteína. Con excep­
ción de la fijación GPI, la totalidad de la proteína se localiza en el
espacio extracelular.
Corte postraduccional
El principal producto de la traducción también puede sufrir un
corte (segmentación) interno a fin de generar un producto madu­
ro más pequeño. En ocasiones se corta la metionina iniciadora del
producto primario de la traducción como sucede durante la sínte­
sis de la globina beta (fig. 1-19). Se observa una segmentación (cor­
te) polipeptídica más importante en la maduración de muchas
proteínas, incluidas las plasmáticas, hormonas polipeptídicas, neu-
ropéptidos, factores de crecimiento, etc. Como se describe en la
sección siguiente, muchas veces se usan secuencias de señal que
pueden cortarse para marcar proteínas que están destinadas a en­
viarse a un sitio específico. Además, en algunos casos, una molécula
de mRNA aislada puede especificar más de una cadena polipeptí­
dica funcional como resultado de la segmentación (corte) proteolí-
tica de un polipéptido precursor grande (fig. 1-23).
1.5.4 La secreción de proteínas y el traslado
intracelular se controlan mediante señales de
localización específicas o modificaciones químicas
Para la función dentro de las mitocondrias se requieren proteínas
sintetizadas en los ribosomas mitocondriales. Sin embargo, las nu-

E xó n 1 Intrón 1 E xó n 2 Intrón 2 E xó n 3
110 *
[
63

G en ]G T AG
i1ATG G GT AG TG A A C IT A G
y ....— ------------------ ----------- —T'

\5 ' \ .
!! i Jl 6gX 110 ^3'UTR//
'“ I
mRNA m 7G p p p ” l UG AA C UAG i A A A A A A --A „ >
i
i
i

i
i
i J l
©
1 24 ^ 25 11 0
P rep ro in su lin a ( n ) [ M et A la | Fen A sn |

1 24
i
S e c . g u ía I M e t A la i

3 0 i 31 65 2 66 86
F en Leu I G lu A rg | G li A sn | P roinsulina

i 35 C la v e :
IG I u Argl ] R e g ió n sin
P é p tid o d e c o n ex ió n tr a d u c ir
1 30 1 21
I Fen Leu I I Gli A sn l
S itio d e c o rte
C a d e n a B d e in s u lin a C a d e n a A d e in s u lin a

Fig. 1-23. La síntesis de insulina incluye múltiples cortes postraduccionales de precursores polipeptídicos.

El primer intrón interrumpe la región no traducida 5 '; el segundo intrón las posiciones base 1 y 2 del codón 63 y se clasifica como un intrón de fase I
(véase recuadro 12-2 y figura 1-19 para otras fases de intrón). El producto primario de la traducción, preproinsulina, posee una secuencia guía de 24
aminoácidos que se requiere para que la proteína cruce la membrana celular y luego se descarte. El precursor proinsulina contiene un segmento central,
el péptido de conexión, que al parecer es importante para conservar la conformación de los segmentos de las cadenas A y B de tal manera que puedan
crear puentes disulfuro (véase fig. 1-25).
 1.5 ! TRADUCCIÓN, PROCESAMIENTO POSTRADUCCIONAL Y ESTRUCTURA DE LAS PROTEINAS ¡ 29
merosas proteínas que se sintetizan en ribosomas citoplásmicos tie­
nen diversas funciones que quizá requieran que se secreten las mis­
mas proteínas de la célula en donde se sintetizaron (p. ej., las
hormonas y otras moléculas de señalamiento intercelular) o que se
trasladen a compartimientos intracelulares específicos, como el nú­
cleo (histonas, DNA y polimerasas de RNA, factores de transcrip­
ción, proteínas de procesamiento de RNA, etc.), la mitocondria
(proteínas ribosómicas mitocondriales, muchos componentes de la
cadena respiratoria, etc.), peroxisomas, etc. Con el fin de llevarlo a
cabo, es necesario que esté alojada en la estructura del polipéptido
una señal de localización específica, de tal manera que pueda en­
viarse a la dirección correcta. Por lo general, la señal de localización
tiene la forma de una secuencia peptídica corta. A menudo esto re­
presenta una llamada secuencia de señal (o secuencia guía), que
se elimina de la proteína por una peptidasa de señal especializada
una vez que se lleva a cabo el proceso de selección.
Señales para el traslado al retículo endoplásmico (RE) y el
espacio extracelular
En las proteínas secretadas, el péptido de señal comprende casi los
20 primeros aminoácidos en el extremo N terminal y siempre in­
cluye un número considerable de aminoácidos hidrófobos (véase
cuadro 1-8). La secuencia de señal se guía hacia el RE por una par­
tícula de reconocimiento de señal (PRS), un complejo de RNA y
proteína que consiste en una especie de RNA citoplásmico pequeña,
7SL RNA, y seis proteínas específicas. El complejo de PRS se une
a la cadena polipeptídica en crecimiento y al ribosoma y los dirige
a una proteína receptora de PRS en el lado citosólico de la superfi­
cie de la membrana del retículo endoplásmico rugoso (RER). Con
posterioridad, puede pasar un polipéptido a la luz del RE, destina­
do para eliminarse de la célula, a menos que haya segmentos hidró­
fobos adicionales que detengan el proceso de transferencia, como
en el caso de las proteínas transmembranosas.
Otras señales
Al igual que la señal del RE, se requiere una secuencia de señal de
la N terminal para atravesar la membrana mitocondrial y se seg­
menta de modo subsecuente. De manera característica, un péptido
de señal mitocondrial tiene, además de muchos aminoácidos hidró­
fobos, varios aminoácidos de carga positiva, las más de las veces es­
paciados a intervalos de unos cuatro aminoácidos. Se piensa que
Cuadro 1 -8 . Ejemplos de secuencias proteínicas de localización
Destino de la proteína Localización y forma de señal
Retículo endoplásmico y Péptido N terminal de unos
secreción de la célula 20 aminoácidos; muy hidrófobo
Mitocondrias Péptido N terminal; hélice a con
residuos de carga positiva en
una cara e hidrófobos en la otra
Núcleo Secuencia interna de aminoácidos; con
frecuencia un cordón de aminoácidos
básicos más prolinas; puede ser bipartita
Lisosoma Adición de residuos de manosa 6-fosfato
esta estructura forma una hélice a anfipática, una estructura heli­
coidal con aminoácidos cargados en una superficie y aminoácidos
hidrófobos en la otra (véase más adelante y fig. 1-24A).
Las señales de localización nucleares pueden localizarse casi
en cualquier parte de la secuencia polipeptídica y consisten de ma­
nera habitual en una tira de cuatro a ocho aminoácidos de carga
positiva, junto con residuos prolina contiguos. No obstante, mu­
chas veces la señal es bipartita y los aminoácidos de carga positiva
se encuentran en dos bloques de dos a cuatro residuos, separados
por unos 10 aminoácidos (véase cuadro 1-8). Cabe señalar que al­
gunas proteínas nucleares carecen de cualquier secuencia de locali­
zación nuclear en sí mismas, pero se transportan al interior del
núcleo con ayuda de otras proteínas nucleares que tienen las seña­
les apropiadas.
Las proteínas lisosómicas se dirigen al lisosoma por la adición
de un residuo de 6 -fosfato de manosa que se añade en el comparti­
miento cis del aparato de Golgi y que reconoce una proteína recep­
tora en el compartimiento trans de Golgi.
1.5.5 La estructura proteínica es muy variada y no es
fácil predecirla por la secuencia de aminoácidos
Las proteínas están compuestas de uno o más polipéptidos, cada
uno de los cuales puede someterse a modificación postraduccional.
Pueden interactuar con cofactores específicos (p. ej., que requieren
cationes divalentes como Ca2+, Fe2+, Cu2+, Zn2+ o moléculas pe­
queñas para la actividad enzimàtica funcional, como NAD+) o li-
gandos (cualquier molécula que enlaza una proteína específica),
cada uno de los cuales puede tener influencias poderosas en la con­
formación de la proteína. Por lo regular se distinguen para las pro­
teínas cuando menos cuatro niveles diferentes de organización
estructural (véase cuadro 1-9).
Dentro de una cadena polipeptídica aislada hay una esfera de
acción amplia para enlaces de hidrógeno entre diferentes residuos;
al margen de las cadenas laterales, el oxígeno de un enlace peptídi-
co del grupo carbonilo (CO) puede enlazar hidrógeno al hidróge­
no del grupo NH de otro enlace peptídico. Las unidades
estructurales fundamentales definidas por enlazamiento de hidró­
geno entre residuos aminoácidos muy cercanos de un polipéptido
aislado incluyen:
► La hélice a . Ésta incluye la formación de un cilindro rígido.
La estructura sufre el dominio del enlace de hidrógeno entre el
Ejemplos
Insulina humana: 24 aminoácidos, péptido de señal muy hidrófobo;
N-Met-Ala-Leu-Trp-Met-Arg-Leu-Leu-Pro-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Leu-Trp-
Gli-Pro-Asp-Pro-Ala-Ala-Ala
Deshidrogenasa de aldehido mitocondrial humana
17 aminoácidos N terminal:
N-Met-Leu-Arg-Ala-Ala-Ala-Arg-Fen-Gli-Pro-Arg-Leu-Gli-Arg-Arg-Leu-Leu
Antigeno SV40 T continuo: Pro-Pra-Lis-Lis-Lis-Arg-Lis-Val
p53 bipartito: Lis-Arg-Ala-Leu-Pro-Asn-Asn-Tre-Ser-Ser-Ser
Pro-GIn-Pro-Lis-Lis-Lis
30 CAPITULO UNO ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIÓN GÉNICA

Cuadro 1-9. Niveles de estructura de proteínas

Nivel Definición Comentario

Primario Secuencia lineal de aminoácidos Puede variar de longitud de modo notorio, desde un péptido pequeño hasta miles
en un poiipéptido de aminoácidos de largo

Secundario Vía que sigue la estructura básica polipeptídica Puede variar en sentido local, por ejemplo como hélice a u hoja plegada p

Terciario Estructura tridimensional total de Puede variar en grado notable; por ejemplo, globular, en bastón, tubo, serpentín,
un poiipéptido hoja, etcétera.

Cuaternario Estructura total de una estructura multimérica Con frecuencia estabilizada por puentes disulfuro y enlace a ligandos, etcétera.
( = una combinación de subunidades de proteínas)

Fig. 1-24. Con frecuencia, los enlaces de hidrógeno intracatenarios dominan las regiones de estructura secundaria en polipéptidos.

A) Estructura de una hélice a . Izquierda: sólo se muestra la estructura básica del poiipéptido para efectos de claridad. El oxígeno carbonilo (CO) de
cada enlace péptido está enlazado al hidrógeno en el enlace péptido del grupo amida (NH) del cuarto aminoácido distante, de tal form a que la hélice
tiene 3.6 aminoácidos por giro. Nota: para mayor claridad se omitieron algunos enlaces. Las cadenas laterales de cada aminoácido se hallan en la parte
exterior de la hélice y casi no hay un espacio libre dentro de la hélice. Derecha: se localizan aminoácidos cargados y aminoácidos hidrófobos en
superficies diferentes en una hélice a antipática. La secuencia que se muestra es la secuencia peptídica de señal de 17 aminoácidos de largo para la
deshidrogenasa de aldehido mitocondrial (véase cuadro 1-8). B) Estructura de una hoja plegada p . Obsérvese que el enlace de hidrógeno ocurre
entre los átomos de oxígeno de CO e hidrógeno de NH de los enlaces peptídicos en segmentos paralelos adyacentes de la estructura básica pollpeptídica.
El ejemplo muestra un enlace entre segmentos antiparalelos de la estructura básica polipeptídica (hoja p antiparalela), y el cambio súbito forzado de
dirección entre segmentos antiparalelos suele llevarse a cabo mediante giros p (véase texto). Las flechas indican la dirección de la N terminal al C
terminal. Nota: también es común encontrar hojas plegadas p paralelas con los segmentos adyacentes en la misma dirección.
 ! LECTURAS ADICIONALES j 31

© .............0
H j N - G I V E Q C C T S I C S L Y Q L E N Y C N -C O O C adena A
SH ISH I

SH SH
© 0
H j N - F V N Q H L C G S H L V E A L Y L V C G E R G F F Y T P K T -C O O C adena B

© [s]— — [s]
i ©
H3N — G I V E Q c rc S L Y Q L E N Y C N COO
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f v n q h l c g s h l v e a l y l v c g e r g f f y t p k t
©
-C O O

Fig. 1-25. Puentes disulfuro intracatenarios e inlercatenarios en la insulina humana.

Los puentes disulfuro ( -S -S -) se forman por una reacción de condensación entre grupos sulfhidrilo (-SH ) opuestos de los residuos de cisteina 6 y 11 de
la cadena A o entre los residuos indicados de las diferentes cadenas.

oxígeno carbonilo de un enlace peptídico con el átomo de hi­
drógeno del nitrógeno amino de un enlace peptídico localizado
cuatro aminoácidos más lejos (véase fig. 1-24). Cabe señalar
que los dominios de enlace de DNA de los factores de transcrip­
ción suelen ser helicoidales a (véase sección 10.2.4). Una hé­
lice a anfipática tiene residuos cargados en una superficie e
hidrófobos en otra (fig. 1-24). Las hélices a idénticas con una
ordenación repetida de cadenas laterales no polares pueden
arrollarse entre sí para formar una estructura estable particular
llamada superarrollamiento. Los superarrollamientos largos
parecidos a bastones se encuentran en muchas proteínas fibro­
sas, como las fibras de queratina a de la piel, el pelo y las uñas
o el fibrinógeno del coágulo sanguíneo.
► La hoja plegada (3. Es característica de la formación de enlaces
de hidrógeno entre enlaces peptídicos opuestos en segmentos
paralelos (muchas veces en realidad antiparalelos) de la misma
cadena polipeptídica (véase fig. 1-24). Las hojas plegadas (3 for­
man el núcleo de la mayor parte de las proteínas globulares.
► El giro p. El enlace de hidrógeno entre el enlace peptídico del
grupo CO del residuo aminoácido n de un polipéptido con el
enlace peptídico del grupo NH del residuo n + 3 tiene como
resultado un giro en horquilla. Al permitir que el polipéptido
invierta de forma súbita la dirección, pueden lograrse formas
globulares compactas. Los giros beta se llaman así porque tam­
bién conectan con frecuencia cadenas antiparalelas en hojas ple­
gadas (3 (véase fig. 1-24B).
Elementos estructurales más complejos que consisten en combina­
ciones de los módulos estructurales anteriores constituyen los domi­
nios proteínicos; son regiones compactas de una proteína formadas
por el doblamiento nuevo de la estructura primaria, de tal manera
que los elementos de la estructura secundaria pueden aproximarse
cerca entre sí. Estos dominios suelen representar unidades funciona­
les que participan en el enlace de otras moléculas. Además, a menu­
do se forman puentes disulfuro covalentes entre los grupos
sulfhidrilo (—SH) de pares de residuos de cisteina que ocurren den­
tro de la misma cadena polipeptídica o en cadenas polipeptídicas di­
ferentes (véase fig. 1-25).
Desde luego, la estructura terciaria o cuaternaria de las proteí­
nas depende de la secuencia primaria de aminoácidos. Sin embar­
go, aunque al analizar la secuencia primaria es posible predecir
secuencias típicas de estructuras secundarias, como hélices a , hojas
plegadas (i y giros (3, en la actualidad no es posible predecir con
precisión la estructura tridimensional total. Además de la comple­
jidad estructural de los polipéptidos simples, muchas proteínas están
organizadas como agregados complejos de múltiples subunidades
polipeptídicas.

Lecturas adicionales

A lb e rts B, J o h n s o n A , L e w is J, R a ff M , R o b e rts K , W a lte r P B ro w n D A (2002) Allosteric cascade of spliceosome activation.

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New York.
B ell SP, D u tta A (2002) DNA replication In eukaryotic cell. Annu.
Rev. Biochem. 71 , 307-331.
B ig P ic tu re B o o k o f V iru s e s at: h ttD ://w w w .viro loQ v.ne t/B ia
V iro lo g y /B V H o m e P a a e .h tm l
B ra d e n C , T o o s e J (1999) Introduction to Protein Structure, 2nd
Edn. Garland Science, New York.
Annu. Rev. Genet. 36, 333-360.
C a rra d in e C R , D re w H R (1997) Undemanding DNA. The molecule
and how it works. Academic Press, London.
L o d is h H , B a ltim o re D, B e rk A . Z ip u rs k y L, M a ts u d a ira P,
D a rn e ll J (1995) Molecular Cell Biology, 3rd Edn. Scientific
American Books, New York.
32 CAPÍTULO UNO ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIÓN GÈNICA
Bibliografía
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Chem. 24, 2411-2414.
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DNA polymerases: strategies for mutagenesis and for mutational
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some: motors clocks, springs and things. Cell 92, 315-326.
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new spllceosome doubles the challenge. Trends Biochem Sei. 22,
132-137.
Wickens M, Anderson P, Jackson RJ (1997) Life and death In the
cytoplasm: messages from the 3' end. Curr. Biol. 7, 220-232.
CAPÍTULO DOS

Estructura y función
de los cromosomas

Contenido del capítulo

34 CAPÍTULO DOS ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS CROMOSOMAS
El DNA funciona en un contexto. El DNA humano está estructu­
rado en crom osom a s y los cromosomas funcionan dentro de las cé­
lulas que se derivan de otras células por división celular. El proceso
de la división celular es, por supuesto, un pequeño componente del
ciclo celu la r, el proceso por el cual los cromosomas y sus molécu­
las de DNA constituyentes necesitan elaborar copias perfectas de sí
mismas y a continuación segregarse en la forma de células hijas. Es­
to necesita dirigirse con sumo cuidado, de tal manera que las célu­
las hijas reciban el juego correcto de cromosomas. En la forma
usual de división celular, la m itosis, cada célula hija tiene el mismo
número y tipo de cromosomas que la célula parental. Además, en
ciertas células del testículo y el ovario ocurre una forma de división
celular especializada, m eiosis, que da lugar respectivamente a las cé­
lulas espermatozoo y óvulo.
2.1 Ploidía y ciclo celu lar
El número de diferentes cromosomas en cualquier célula nucleada,
el juego de cromosomas, y el contenido de DNA relacionado se
designan n y C, de forma respectiva. En los seres humanos n es igual
a 23 y C se aproxima a 3.5 pg (3.5 X 10 12 g). Las células pueden
variar en el número de copias que tienen del juego de cromosomas
(ploidía). Los espermatozoos y óvulos llevan un juego de cromo­
somas y se dice que son haploides (n cromosomas; contenido de
DNA, C). Sin embargo, casi todas las células humanas poseen dos co­
pias del juego de cromosomas y son diploides (2 n cromosomas;
contenido de DNA, 2C). Casi todos los mamíferos son diploides
(la rata vizcacha roja es una rara excepción; véase Gallardo y cois.,
1999), pero en otros organismos hay muchos ejemplos de especies
que en condiciones normales son haploides, tetraploides (4n) o po-
liploides (> 4n). Es menos común la triploidía (3n) porque los tri­
plo ides tienen problemas con la meiosis (véase más adelante).
Las células diploides del cuerpo del hombre proceden al final
de una célula diploide única, el cigoto, a través de rondas repetidas de
división celular mitótica. Cada ronda puede resumirse como una
vuelta del ciclo celular (fig. 2-1). Esto comprende una etapa corta
de la división celular, la fase M (mitosis: véase fig. 2-7) y una in-
terfase intermedia larga. La interfase puede dividirse en fase S (sín­
tesis de DNA), fase G1 (espacio entre la fase M y la fase S) y fase
G2 (espacio entre la fase S y la fase M). Desde la anafase de la mi­
tosis, de manera directa, hasta la duplicación del DNA en la fase S,
un cromosoma de una célula diploide contiene una doble hélice de
DNA y el contenido total de DNA es 2C. La fase G1 es el estado
normal de una célula y el estado final a largo plazo de las células
que no se dividen. Las células sólo entran en la fase S si están dis­
puestas para la mitosis; las células que no se dividen permanecen en
una etapa G1 modificada, llamada en ocasiones fase G0. El diagra­
ma del ciclo celular puede dar la impresión de que toda la acción
interesante sucede en las fases S y M, pero esto es una ilusión. Una
célula pasa la mayor parte de su vida en la fase GO o G1 y es allí
donde el genoma lleva a cabo la mayor parte de su trabajo.
Un subgrupo de las células diploides del cuerpo constituye la lí­
nea germinal (véase fig. 2-9). Dichas células originan las células di­
ploides especializadas en el ovario y los testículos, que pueden
dividirse por meiosis para producir gametos haploides (espermato­
zoo y óvulo). En seres humanos (n = 23), cada gameto contiene 22
autosomas (cromosomas que no son sexuales) más un cromosoma
del sexo. En los óvulos, el cromosoma del sexo siempre es una X;
en el espermatozoo puede ser una X o una Y. Después de la fecun-
: Total d e 92
46
c ro m o s o m a s + « crom osom as
(c o n d e n s a d o s ) j ¡ divididos en dos
células hijas
4C
46 crom osom as (extendidos),
dos dobles hélices d e DNA
por crom osom a
Síntesis
DNA
46 crom osom as (extendidos),
una doble hélice de DNA
por crom osom a
2C
Fig. 2-1. Contenido cromosomico del DNA humano durante el ciclo
celular.
La interfase comprende G1 + S + G2. Los cromosomas contienen
una hélice doble de DNA desde la anafase de la mitosis hasta que se
duplicó el DNA en la fase S. Desde esta etapa hasta el final de la
metafase de la mitosis, el cromosoma consiste en dos cromátides que
contienen cada uno un dúplex de DNA, para form ar dos dobles hélices
por cromosoma. El contenido de DNA de una célula diploide antes de
la fase S es 2C (el doble del contenido de DNA de una célula haploide),
en tanto que entre la fase S y la mitosis es 4C.
dación, el cigoto es diploide (2 n) con la constitución cromosómica
46,XX o 46,XY (fig. 2-2). Las otras células del cuerpo, aparte de la
línea germinal, se conocen como células somáticas. Las células so­
máticas humanas suelen ser diploides, pero algunas células carecen
de núcleo y cualquier cromosoma y se dice que son n u lip loides, y
otras son p o r naturaleza poliploides como resultado de múltiples
rondas de replicación del DNA sin división celular (véase sección
3.1.4).
2.2 Estructura y función de los
crom osom as
Los cromosomas, como se observan bajo el microscopio y se ilus­
tran en libros de texto, son bastante engañosos porque representan
un estado poco com ún que ocurre brevem ente en el ciclo celular, du­
rante una parte de la fase M, a medida que se preparan las células
para llevar a cabo la división celular (metafase). Los cromosomas de
metafase y los cromosomas de prometafase se hallan en un estado
muy condensado y tienen una estructura poco común de dos cromátides
 2.2
E s p e rm a to z o o
Fig. 2-2. La vida humana desde un punto de vista cromosómico.
Las células haploïdes espermatozoo y óvulo se originan por meiosls a partir de precursores dlploides (véase fig. 2-9). En el óvulo fecundado los crom o­
somas del espermatozoo y el óvulo forman al principio los pronúcleos femenino y masculino separados. Éstos se combinan durante la primera mitosis.
porque en esta etapa el DNA se replicó en preparación para la divi­
sión celular. Tan sólo por estar empacados apretadamente en haces
puros, los cromosomas en metafase son lo bastante grandes para ob­
servarse con un microscopio de luz, pero no son representativos por­
que el empaque extremo asegura que los genes están desconectados.
Los procesos de la división celular son fascinantes por sí mismos
y los errores en el empaquetamiento o la división del genoma tienen
consecuencias médicas de importancia (sección 2.5). Sin embargo,
es esencial recordar que la inmensa mayoría de los cromosomas en
el ciclo celular tiene un aspecto muy diferente. Durante toda la pro­
longada etapa de la interfase, los cromosomas están extendidos en
gran proporción y por consiguiente son mucho más difusos que los
cromosomas en metafase que se observan en la figura 2-14. Como
hecho importante, un cromosoma de interfase sólo comprende una
cromátide aislada y una doble hélice de DNA y la estructura extendi­
da permite que se expresen los genes.
Como organelos funcionales, al parecer, los cromosomas euca-
rióticos sólo requieren tres clases de elementos de secuencia de
DNA: centrómeros, telómeros y orígenes de replicación. Se verifi­
có este requerimiento simple por el éxito en la construcción de cro­
mosomas artificiales en levaduras: los fragmentos grandes extraños
de DNA se comportan como cromosomas autónomos cuando se
unen a secuencias cortas que especifican un centròmero funcional,
dos telómeros y un origen de replicación (fig. 5-17). En fecha re­
ciente se crearon cromosomas artificiales de mamíferos con base
en principios similares (Huxley, 1997; Schindelhauer, 1999).
2.2.1 El empaque del DNA en los cromosomas sugiere
múltiples jerarquías de doblamiento del DNA
En la célula está muy ordenada la estructura de cada cromosoma
(Manuelidis, 1990). Incluso en el núcleo de interfase la doble héli­
ce de DNA de 2 nm está sujeta cuando menos a dos niveles de arro­
llamiento (fig. 2-3):
► El nucleosoma es la unidad fundamental del empaquetamiento.
Consiste en un núcleo central de ocho proteínas histona, proteí­
nas básicas (= carga positiva) y pequeñas, muy conservadas, de
102 a 135 aminoácidos. Cada núcleo comprende dos molécu­
las de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4, alrededor
de las cuales se arrolla un tramo de 146 pb de DNA de doble
cadena en 1.75 vueltas. Los nucleosomas adyacentes están co­
1 ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS CROMOSOMAS 35
C ig o to
nectados por un tramo corto de DNA espaciador. Las fotomi­
crografías electrónicas de preparaciones adecuadas muestran un
aspecto en hilo de cuentas. Nota: las células del espermatozoo
son diferentes. Se logra un empaquetamiento muy apretado de
DNA en las cabezas de los espermatozoos en reemplazo de his­
tonas con una clase alternativa de proteínas básicas pequeñas
conocidas como protam in as.
► El hilo de cuentas, de unos 10 nm de diámetro, se arrolla a su
vez en una fibra de cromatina de 30 nm de diámetro. Al pa­
recer, el cromosoma de interfase consiste en estas fibras de cro­
matina, organizadas tal vez en asas largas como se describe más
adelante.
Durante la división celular, los cromosomas están mucho más con-
densados. El DNA en un cromosoma en metafase está compactado
alrededor de 1/10 000 de su longitud en extensión. Se encuentran
asas de la fibra de cromatina de 30 nm, que contienen 20 a 100 ki-
lobases (kb) de DNA por asa, unidas a una estructura central, que
se integra con proteínas ácidas diferentes de las histonas, en espe­
cial topoisomerasa I I , una enzima que tiene la interesante capaci­
dad de pasar una hélice doble de DNA a través de otra y abrir una
hendidura y repararla. Se sabe que la topoisomerasa II y algunas
otras proteínas de la cromatina se unen a una secuencia abundante
en AT y las asas de cromatina pueden ser unidas por tiras de varios
cientos de pares de bases de DNA muy abundante en AT (> 65%)
(regiones de fijación a la estructura central). En las cromátides
de un cromosoma en metafase está más compactado aún el com­
plejo de asa-estructura central por arrollamiento (véase fig. 2-3).
2.2.2 Cromosomas individuales ocupan territorios
no superpuestos en un núcleo en interfase
Hace mucho tiempo se conoce el alto grado de organización en el
citoplasma, pero el núcleo, asimismo, tiene una subestructura con­
siderable. Además del n u cleo lo familiar, en el que se transcribe el
rRNA y se ensamblan subunidades ribosómicas, en fecha reciente
se identificaron muchos otros compartimientos subnucleares (cuer­
pos d e CajaL, cuerpos de PML, paramanchas, etc.; véase recuadro
3-1). La colocación de los cromosomas dentro del núcleo también
está muy organizada y se desarrollaron técnicas especializadas para
seguir los movimientos de cromosomas individuales dentro de cé­
lulas vivas en el transcurso de la interfase.
36 CAPÍTULO DOS ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS CROMOSOMAS
C ro m á tid e s
h e rm a n a s
A sa s d e fib ra d e
c ro m a tin a (~ 7 5 kb)
E s tru c tu ra
ce n tra l
Fig. 2-3. Del DNA dúplex hasta el cromosoma en metalase.
La figura muestra el cromosoma 17 humano, como se observa en una preparación de 400 bandas con bandeo G. Las relaciones estimadas de
empacamiento (el grado de compactación del DNA dúplex lineal) para los cromosomas humanos son 1:6 para nucteosomas, 1:36 en la fibra de 30 nm
y > 1:10 000 para el cromosoma en metafase. En la actualidad no se sabe con certeza si el DNA en el centròmero del cromosoma en metafase se
retrasó en su replicación a diferencia del resto de la cromátide o si la replicación completa del DNA ocurrió en la fase S y la contracción en el cen­
tròmero se debe a alguna otra causa.
En cierto grado, la mitosis origina una restricción en la orienta­
ción cromosómica durante la interfase. Justo antes que se divida la
célula, los microtúbulos unidos al centrómero tiran cada cromoso­
ma hacia uno de los dos polos del hu so m itó tico (la red de micro­
túbulos que colocan los cromosomas durante la mitosis; véase
recuadro 2-1). Durante el movimiento de los cromosomas, los cen-
trómeros guían el camino y tira detrás de sí los brazos de los cro­
mosomas para crear formas en V. Al inicio de la interfase, los
cromosomas tienden a conservar esta llamada o rien ta ción Rabí, con
los centrómeros alineados en dirección de un polo del núcleo y los
telómeros en la dirección opuesta (en algunas células en las que la
interfase es corta, los cromosomas tienden a adoptar esta orienta­
ción durante toda la interfase).
En los mamíferos, los cromosomas de las células en interfase no
suelen encontrarse en la orientación Rabí y no están tan bien ali­
neados los diferentes centrómeros (aunque tienden a agruparse
entre sí en la periferia del núcleo durante la fase G 1 antes de dis­
persarse mucho más en el transcurso de la fase S). No obstante,
aunque cada cromosoma se encuentra en una forma muy extendi­
da, los cromosomas no están entrelazados de manera extensa. Por
el contrario, ocupan al parecer territorios cromosómicos no super­
puestos relativamente pequeños (fig. 2-4 y Cremer y Cremer, 2001;
Parada y Misteli, 2002).
Aunque en apariencia los cromosomas en interfase no tienen si­
tios nucleares favoritos, la colocación cromosómica no es aleatoria.
80 M b 80 M b
de DNA de DNA
I I
D o b le
h é lice
F ib ra d e
c ro m a tin a 1 0 nm
d e 3 0 nm
Por ejemplo, se sabe que los cromosomas humanos con mayor abun­
dancia de genes se concentran en el centro del núcleo, en tanto que
los cromosomas con menos genes se localizan hacia la envoltura nu­
clear (fig. 2-4; véase Boyle y cois., 2001; y Parada y Mistelli, 2002).
Es probable que los movimientos de los cromosomas se restrinjan
por interacción con la envoltura nuclear y asimismo por las estructu­
ras internas del núcleo, incluido el nucleolo (en el caso de cromoso­
mas que contienen genes de RNA ribosómicos).
2.2.3 Cromosomas como organeios funcionales: sitio
centrai del centróm ero
Los cromosomas normales sólo tienen un centrómero que se obser­
va al microscopio como la constricción primaria, la región en la
que se unen las cromátides hermanas. El centrómero es esencial pa­
ra la segregación durante la división celular. Los fragmentos cromo­
sómicos que carecen de un centrómero (fragmentos acéntricos)
no se unen al hu so m itó tico (véase recuadro 2-1 y fig. 2 -7 ) y tam­
poco se incluyen en los núcleos de cualquiera de las células hijas.
Durante la profase tardía de la mitosis se forman en cada cen­
trómero un par de complejos multiproteínicos grandes que se co­
nocen como cin eto co ro s, unido cada uno a una de las cromátides
hermanas. Los microtúbulos se fijan a cada cinetocoro, con unión
del centrómero de un cromosoma y los dos polos del huso (véase
recuadro 2-1 y fig. 2-7). En la anafase, los microbútulos del cineto-
 2.2 | ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS CROMOSOMAS
El huso mitótico (véase figura abajo) está formado por microtúbulos
(polímeros hechos de un heterodímero repetido de tubulina a y p) y pro­
teínas relacionadas con microtúbulos. Cada uno de los dos polos del
huso está definido por un centrosoma, el principal centro organizador del
microtùbulo. El centrosoma origina el crecimiento hacia afuera de fibras
microtubulares polares, con un extremo ( - ) en el exterior del centrosoma
y el extremo distal en crecimiento definido como el extremo ( + ) .
Cada centrosoma está compuesto de una matriz fibrosa (que consiste en
unas 50 copias de un complejo anular de tubulina y) en la cual está inclu­
ido un par de centriolos (véase dibujo A en la figura de abajo). Los cen­
tró lo s son estructuras cilindricas cortas compuestas de microtúbulos y
proteínas relacionadas y los dos centriolos del par siempre están dis­
puestos en ángulos rectos entre si, para form ar una figura en L (véase
dibujo A de la figura). En cierto punto de la etapa G1 se separan los dos
centriolos en un par y durante la fase S comienza a crecer un centriolo
hijo en la base de cada centriolo madre y en ángulos rectos con éste has­
ta que se forma por completo alrededor de G2. Los dos pares de centrio­
los permanecen juntos entre sí en un complejo centrosómico único hasta
el inicio de la fase IVI en la que se divide el complejo en dos y comienzan
M atriz del
+ centro so m a
C en triolos
M ic rotúbulos
o = co m p lejo s d e anillo d e tu b u lin a y
A ) Estructura del centrosoma; B) relación cinetocoro-centrómero; C ) estructura del huso mitótico.
coro tiran las dos cromátides hermanas hacia polos opuestos del
huso (fig. 2-7). Los cinetocoros tienen un sitio central en este pro­
ceso y controlan el ensamble y desensamble de los microtúbulos fi­
jados y, a través de la presencia de moléculas motoras, impulsan al
final el movimiento del cromosoma.
Tal vez secuencias específicas de DNA dictaminan la estructura y
función de los centrómeros. En eucariotas simples, las secuencias que
especifican la función del centròmero son muy cortas. Por ejemplo,
en la levadura Saccharomyces cerevisiae el elemento centròmero tiene
alrededor de 110 pb de largo y consiste en dos elementos de flanqueo
muy conservados de 9 pb y 11 pb y un segmento central rico en AT
de unos 80 a 90 pares de bases (pb) (véase fig. 2-5). Los centrómeros
de estas células son intercambiables; un fragmento del elemento cen­
tròmero derivado de un cromosoma de la levadura puede reemplazar
al centròmero de otra sin consecuencias aparentes.
En mamíferos, el DNA de centrómeros individuales consiste en
cientos de kilobases de DNA repetido, algunos específicos de cro­
mosomas y otros inespecíficos. Un componente mayor del DNA
¡ 37
a separarse las dos mitades. Cada centrosoma desarrolla ahora su dis­
posición radial propia de los microtúbulos (áster) y comienza a migrar a
los extremos opuestos de la célula en donde se forman los polos del huso
(véase dibujo C en la figura).
En el huso se encuentran tres formas diferentes de fibras de microtúbu­
los (véase dibujo C en la figura abajo):
► Fibras polares que se extienden desde los dos polos del huso hacia
el ecuador. Se desarrollan en la profase en tanto está intacta aún la
membrana nuclear. Nota: para mayor claridad sólo se muestra un par
de estas fibras superpuestas.
► Las fibras del cinetocoro no se desarrollan hasta la prometafase.
Estas fibras se fijan al cinetocoro, una estructura multiproteínica uni­
da al centròmero en cada cromátide (dibujo B) y se extienden en
dirección de los polos del huso.
► Se forman fibras astrales alrededor de cada centrosoma y se extien­
den hacia la periferia.
1 P laca de
J m etafa se
M ic rotúbulos
del cin etocoro
M ic rotúbulos
M icrotúbu los
astrales
polares
centromérico humano es un DNA sa télite a , una familia comple­
ja de DNA repetidos en tándem basada en un monómero de 171
pb (véase sección 9.4.1 para una descripción más completa de las
secuencias centroméricas humanas). Se sabe que varias proteínas
diferentes se relacionan con centrómeros humanos, incluido el
CENP-B, que se enlaza de forma directa a un DNA satélite a (véa­
se cuadro 2-1). Como hecho sorprendente, al tomar en cuenta que
la maquinaria de segregación cromosómica está muy conservada a
través de eucariotas, han evolucionado con rapidez el DNA centro­
mérico y las proteínas vinculadas e incluso se considera que tienen
a su cargo el aislamiento reproductor de especies en surgimiento
(Henikoff y cois., 2001).
2.2.4 Cromosomas como organeios funcionales:
orígenes de la replicación
En condiciones normales, en la mayor parte de las células diploides el
DNA sólo se replica una vez por ciclo celular. El inicio de la replica-
38 CAPÍTULO DOS ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS CROMOSOMAS

C e n trò m e ro

TCACATGAT 80-90 pb TGATTTCCGAA

AGTGTACTA > 90% (A+T) ACTAAAGGCTT
III
USA
18 T e lóm ero
R e p e tic io n e s tá n d e m b a s a d a s en la fó rm u la g en eral
H S Á 19
(TG)i_3 TG2. 3/C2- 3A(CA)1.3

e.g.

5'... .T G T G T G G G T G T G G T G T G T G T G G ... .3'

3 '....A C A C A C C C A C A C C A C A C A C A C C ....5 '
H S A 19
S ecuen cia d e replicación autónom a
H SA
C o n tie n e un co n s e n s o d e n ú c leo d e 11 p b q u e es a b u n d a n te
18 en AT, a u n a d o a a lg u n as co p ia s im p e rfe c ta s d e e s ta s e c u e n c ia
q u e a b a rc a una región del D N A d e unos 5 0 pb

Fig. 2-4. Cromosomas individuales ocupan territorios precisos en el
cromosoma en el núcleo en interfase.
La fotografía muestra un ejemplo de pintado crom osóm ico (véase
sección 2.4.3) con dos pinturas cromosómicas, una específica para
HSA18 ( = cromosoma humano 18: señal verde, localización periféri­
ca) y otra para HSA19 ( = cromosoma humano 19: señal roja, locali­
zación nuclear interna) con un núcleo en interfase. El núcleo aparece
azul como resultado de la contratinción con DAPI, un colorante fluores­
cente que enlaza DNA. Imagen proporcionada gentilmente por Wendy
Bickmore, MRC Human Genetics Unit, Edinburgh.
ción está controlado por secuencias de acción cis que se encuentran
cerca de los puntos en que comienza la síntesis de DNA. Es probable
que éstos sean sitios en los que se enlazan proteínas de acción trans.
Los orígenes eucarióticos de la replicación se estudiaron de modo más
exhaustivo en la levadura, en la que es posible estudiar mediante una
valoración genética la presencia del posible origen de una replicación.
A fin de analizar la capacidad de un fragmento aleatorio de DNA de
levadura para promover la replicación autónoma, se incorpora en un
plásmido bacteriano junto con un gen de levadura que es esencial pa-
IQI SE □
C o p ia s C o n se n so d e n ú c leo =
im p e rfe c ta s
ATTTAT(A/G)TTTA
TAAATA(T/C)AAAT
Fig. 2-5. Elementos funcionales del cromosoma de una levadura.
ra el crecimiento de células de levadura. Esta estructura formada se
utiliza para transformar una levadura mutante que carece del gen
esencial. Las células transformadas sólo pueden formar colonias si es
posible que el plásmido se replique en las células de levadura. Sin em­
bargo, la replicación bacteriana originada en el plásmido no funciona
en la levadura. Por consiguiente, los pocos plásmidos que se transfor­
man con una gran eficiencia deben poseer una secuencia dentro del
fragmento de levadura insertado que confiere la capacidad para repli­
carse de forma extracromosómica con gran eficacia, un elemento lla­
mado de secuencia autónomamente replicante (SAR).
Se piensa que los elementos SAR derivan de orígenes de repli­
cación auténticos y, en algunos casos, se ha confirmado al mapear

Principales proteínas del centròmero humano

Nombre Localización Características

CENP-A Placa externa del cinetocoro Una variante H3 de histona específica de centròmero; esencial para la vida y necesaria para
dirigir CENP-C al cinetocoro

CENP-B Heterocromatina centromérica Enlaza una secuencia de 17 pb que se encuentra en monómeros satélite alfa (box CENP-B);
¿necesaria para la estructura de la heterocromatina centromérica?

CENP-C Placa interna del cinetocoro Esencial para la función apropiada centrómero/cinetocoro

CENP-G Placa interna del cinetocoro Se enlaza a un subgrupo de secuencias en la familia satélite a

N ota: Las proteínas CENP-E (en la corona fibrosa), CENP-F (placa externa del cinetocoro) y las proteínas INCENP (heterocromatina céntrica) se vinculan
de modo transitorio con el centròmero. Véase Craig y cois. (1999) para detalles adicionales.
 2.2 | ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS CROMOSOMAS 39

un elemento SAR específico en una localización cromosomica pre­
cisa y demostrar que la replicación del DNA se inicia en realidad
en ese punto. Los elementos SAR de la levadura sólo se extienden
alrededor de 50 pb y consisten en una región abundante en AT que
contiene un consenso de centro conservado y algunas copias imper­
fectas de esta secuencia (fig. 2-5). Además, los elementos de SAR
contienen un sitio de enlace para un factor de transcripción y se sa­
be que se une al origen un complejo multiproteínico.
Se han definido de manera más imprecisa los orígenes de la re­
plicación del DNA de mamíferos por la ausencia de una valoración
genética. Se estudiaron algunos sitios de inicio pero esos estudios
no fueron capaces de identificar un origen único de la replicación.
Esto condujo a pensar que la replicación puede comenzar en múl­
tiples sitios sobre regiones de decenas de kilobases de largo (véase
Gilbert, 2001). Al parecer, los cromosomas artificiales de mamífe­
ros actúan sin que se proporcionen secuencias de SAR específicas.
Telomerasa y el problema de la replicación del extremo
Durante la replicación del DNA se sintetiza la cadena lenta en pie­
zas porque debe crecer en una dirección opuesta a la del sentido
5'—>3' de la síntesis de DNA. Se requiere una sucesión de síntesis
de “puntos reversos” para formar una serie de fragmentos de DNA
cuyos extremos sella a continuación la ligasa de DNA (véase fig.
1-9 y secciones 1.2.2 y 1.2.3). A diferencia de las polimerasas de
RNA, las de DNA requieren absolutamente un grupo -OH 3' libre
de un ácido nucleico de doble cadena a partir del cual pueden ex­
tender la síntesis. Ello se logra mediante una polimerasa de RNA
para sintetizar un oligonucleótido iniciador (cebador) RNA com­
plementario a fin de cebar la síntesis de cada uno de los fragmen­
tos de DNA utilizado para elaborar la cadena lenta. En estos casos,
los oligonucleótidos iniciadores RNA (cebadores) requieren la pre-

2.2.5 Cromosomas como organelos funcionales:

los teióm eros
Estructura, función y evolución del telómero
Los teiómeros son estructuras especializadas que contienen DNA y S ín te sis 1 T e lo m e ra s a
proteínas y que cubren los extremos de cromosomas eucarióticos. de DNA ▼
Es posible que tengan varias funciones:
► C onservación d e la in tegración estructural. Cuando se pierde
un telómero, el extremo resultante del cromosoma es inestable.
Tiene la tendencia a fusionarse con los extremos de otros cromo­
somas rotos, participar en fenómenos de recombinación o ser
degradado. Las proteínas de unión del telómero reconocen el ex­
tremo 3' sobresaliente de un telómero (véase más adelante) y pue­ Translocación
en zim àtica
de proteger el DNA terminal in vitro y tal vez in vivo.
► A segurar la rep lica ció n co m p leta d e l DNA (véase sección so­
bre telomerasa más adelante). AATCCC 5'
► C oloca ció n d e l crom osom a . Los teiómeros ayudan al esta­
blecimiento de la configuración tridimensional del núcleo, al
pareamiento de cromosomas, o ambas cosas. En algunas célu­ S ín te sis
de DNA
las, los extremos del cromosoma parecen atados a la envoltura
nuclear, lo que sugiere que los teiómeros pueden ayudar a la
posición de los cromosomas.
Los teiómeros eucarióticos consisten en disposiciones moderadamen­
te largas de repeticiones tándem de una secuencia simple abundante
en TG en una de las cadenas de DNA y abundante en CA en la ca­
dena complementaria. En el hombre (y en otros animales), la secuen­
cia de repetición es el hexanucleótido TTAGGG. La estructura
(TTAGGG)n del telómero humano abarca de manera característica Fig. 2-6. La telomerasa extiende la cadena abundante en TG de
alrededor de 3 a 20 kb, punto más allá del cual (en dirección del cen­ teiómeros mediante la síntesis de DNA con una plantilla interna de
tròmero) se encuentran alrededor de 100 a 300 kb de rep eticio n es RNA.
rela cion a d a s co n e l teló m ero antes de encontrar alguna secuencia Nota: se muestran hexanucleótidos recién sintetizados sombreados y
única. el mecanismo de alargamiento depende de la plantilla de RNA que con­
A diferencia de los centrómeros, la secuencia de los teiómeros se tiene una repetición tándem casi perfecta com o se muestra subrayada
conservó en la evolución -la secuencia simple repetida es muy similar en la secuencia siguiente: 5 ' CUAACCCUAAC 3 '.
en teiómeros de diferentes especies, por ejemplo TTGGGG en Para-
mecium, TAGGG en Trypanosoma, TTTAGGG en Arabidopsis y
TTAGGG en Homo sapiens-. (Nota: sin embargo, en algunas especies sencia de cierto DNA adelante d e la secuencia que se copia con la
existe cierta flexibilidad en la repetición precisa de la unidad como se finalidad de que sirva como plantilla. Sin embargo, nunca puede
observa en la levadura S. cerevisiae\ véase fig. 2-5.) Además, hay una encontrarse dicha plantilla en el extremo final de una molécula li­
gran conservación en los tipos de proteínas de enlace de telómero (véa­ neal de DNA y es necesario un mecanismo diferente para solucio­
se Blackburn, 2001). No obstante, las repeticiones relacionadas con el nar el problema de la replicación de los extremos de una molécula
telómero no están conservadas en eucariotas y se desconoce su función. lineal de DNA.
40 CAPÍTULO DOS ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS CROMOSOMAS
El problema de la replicación del extremo se soluciona al ex­
tender la síntesis de la cadena rápida con una forma especializada de
transcriptasa inversa (polimerasa de DNA dependiente de RNA) pro­
porcionada por una enzima de RNA y proteína especializada cono­
cida como telomerasa. Esta última lleva en su componente de RNA
una secuencia corta dentro de su extremo 5’, CUAA CCCUAAC.
con una secuencia hexanucleótida interna (cursivas subrayadas) que
es la secuencia antisentido de la secuencia de repetición del telómero
humano (TTAGGG). Esta secuencia actúa como una plantilla para
cebar la síntesis extendida de DNA de secuencias de DNA teloméri-
cas en la cadena rápida. La extensión adicional de la cadena rápida
proporciona la plantilla necesaria para que la polimerasa alfa de DNA
complete la síntesis de la cadena lenta (fig. 2-6). Este mecanismo de­
ja al telómero en sí mismo con un extremo 3’ saliente que suminis­
tra un blanco de DNA de filamento único para ser unido por
proteínas específicas de telómero, como TRF2 humano. Pese a ello,
es posible que no sea importante la naturaleza real de la secuencia del
telómero. Se sabe que la longitud del telómero es muy variable y es­
tá sujeta a control genético (véase sección 17.5.1).
2.2.6 Heterocromatina y eucromatina
En el núcleo de interfase, la mayor parte de la cromatina está ex­
tendida, dispersada en la totalidad del núcleo, y se riñe de forma di­
fusa (eucromatina). No obstante, durante el ciclo celular parte de
la cromatina permanece muy condensada y forma la región de tin­
ción oscura (heterocromatina). Los genes que se hallan en la eu­
cromatina pueden expresarse o no, según sean el tipo de célula y sus
requerimientos metabólicos, pero es muy poco probable que se ex­
presen los genes localizados dentro de la heterocromatina, sea de
manera natural o como resultado de un reordenamiento cromoso­
mico. Existen dos clases de heterocromatina:
► Heterocromatina constitutiva: casi siempre es inactiva y con­
densada. Consiste en gran parte en repeticiones de DNA y se
encuentra en los centrómeros de los cromosomas, alrededor de
ellos y en ciertas otras regiones (véase fig. 2-15 para la localiza­
ción de heterocromatina constitutiva en cromosomas humanos
y el cuadro 9-2 para las cantidades estimadas de DNA relacio­
nado) .
► Heterocromatina facultativa: puede existir en una forma ge­
néticamente activa (descondensada) o inactiva (condensada).
Los ejemplos incluyen la inactivación del cromosoma X en ma­
míferos (sección 10.5.6) o el silenciamiento del cromosoma del
sexo durante la meiosis masculina. En el último caso, durante
la meiosis masculina están inactivados el cromosoma X y el Y
(por un periodo aproximado de 15 días en seres humanos). Se
condensan para formar el corpúsculo XY y son segregados ha­
cia un compartimiento nuclear especial.
En la eucromatina, las ba n d a s G muestran algunas de las propieda­
des de la heterocromatina, pero en menor grado (las bandas G son
las bandas oscuras del cromosoma que resultan de la tinción positi­
va con el colorante de Giemsa; las bandas pálidas, negativas al
Giemsa, se denominan bandas R; véase la sección 2.4.1). La croma­
tina de la banda G en cromosomas en metafase está más condensa­
da que la de la banda R y las bandas G contienen relativamente
pocos genes. El subgrupo de bandas R que se revela mediante el
bandeo T tiene una densidad en particular alta de genes. En la sec­
ción 1.3.5 se discuten las diferentes estructuras de la cromatina en
regiones cromosómicas activas e inactivas en sentido transcripcional.
2.3 Tipos de división celular: m itosis
y m eiosis
2.3.1 La mitosis es la forma normal de división celular
A medida que se forma una persona a partir de un embrión, en el
tránsito de feto a lactante y adulto, se requieren divisiones celulares
a fin de generar el gran número de células necesarias. Además, mu­
chas células tienen un periodo de vida limitado, de tal manera que
en el adulto hay una necesidad continua de generar nuevas células.
Todas estas divisiones celulares ocurren por mitosis. Esta última es
el proceso normal de división celular, desde la segmentación del ci­
goto hasta la muerte de la persona. En el tiempo de vida de un ser
humano puede haber alrededor de 10 divisiones mitóticas (sec­
ción 11 .2 . 1).
La fase M del ciclo celular (fig. 2-1) consiste en las diversas eta­
pas de la división nuclear (profase, prometafase, metafase, anafase y
telofase de la mitosis) y la división celular (citocinesis), que super­
pone las etapas finales de la mitosis (fig. 2-7). En preparación para
la división celular se contraen y condensan los cromosomas, antes
muy extendidos, de tal modo que alrededor de la metafase de la
mitosis se observan con facilidad bajo el microscopio. Aunque el
DNA se replicó antes en algún momento, sólo en la prometafase es
posible observar que los cromosomas individuales comprenden dos
cromátides hermanas, unidas en el centròmero.
La interacción entre las diferentes fibras del huso (véase recua­
dro 2 - 1) tracciona los cromosomas hacia el centro y alrededor de la
metafase está alineado cada cromosoma en el plano ecuatorial (pla­
ca de metafase). Nota: durante la mitosis, cada cromosoma en el
juego diploide se comporta de manera independiente y no se rela­
cionan en lo absoluto los homólogos maternos y paternos. En la anafa­
se se dividen los centrómeros y dan lugar a la separación física de lo
que fueron antes cromátides hermanas; la tracción por los fibras del
huso asegura que las cromátides hermanas separadas se desplacen a
polos opuestos (figs. 2-7 y 2-8). El DNA de las dos cromátides her­
manas es idéntico y se elimina cualquier error en la replicación del
DNA. Por consiguiente, el efecto de la mitosis es generar células hi­
jas que contienen precisamente el mismo juego de secuencias de
DNA.
2.3.2 La meiosis es una forma especializada de división
celular que origina las células espermatozoo y
óvulo
Las células germinales primordiales migran dentro de la gónada
embrionaria y llevan a cabo rondas repetidas de mitosis para formar
la oogonia en mujeres y la espermatogonia en varones (n ota : esto
incluye mucho más mitosis en varones que en mujeres -véase re­
cuadro 11-4—y ello puede ser un factor importante que explica las
diferencias de sexo en el índice de mutación). El crecimiento y la
diferenciación adicionales producen oocitos primarios en el ova­
rio y espermatocitos primarios en el testículo. Estas células diploi-
des especializadas pueden sufrir meiosis (fig. 2-9).
La meiosis incluye dos divisiones celulares sucesivas pero sólo
una ronda de replicación del DNA, de tal manera que los produc­
tos son haploides. En varones, el resultado son cuatro espermato­
zoos; empero, en mujeres hay una d ivisió n celu la r a sim étrica
porque el citoplasma se divide de manera desigual en cada etapa:
los productos de la meiosis I (la primera división meiótica) son un
 2.3 1 T IPOS DE DIVISIÓN CELULAR: MITOSIS Y MEIOSIS | 41

INTERFASE Nucleolo
• Envoltura nuclear intacta
• No hay crom osom as visibles

Profase
• Se condensan los crom osom as y
se tornan visibles
• Se desarrolla el huso bipolar

P laca de
Prometafase m etafase
• Se disuelve la envoltura nuclear
• Los crom osom as com ienzan a migrar
al plano ecuatorial (placa d e m etafase)
y se observa que contienen
dos crom átides Mitosis
Metafase
• C rom osom as plenam ente condensados
Plano ecuatorial =
y localizados en la placa de m etafase
placa d e m etafase

Anafase
• Se divide ca d a centròm ero
• Las dos crom átides d e cada
crom osom a sufren tracción a
polos opuestos

Telofase
• Los crom osom as llegan a los
polos y com ienzan a descondensarse
• S e form a nuevam ente
la m em brana nuclear
• C om ienza a dividirse el citoplasm a

Citocinesis
• División del citoplasm a term inada
para crear dos células hijas

Fig. 2-7. Representación de la división celular por mitosis.

oocito secundario grande y una célula pequeña (cuerpo polar).
Durante la meiosis II (la segunda división meiótica), el oocito se­
cundario origina a continuación la célula óvulo madura grande y
un segundo cuerpo polar.
Existen dos diferencias cruciales entre mitosis y meiosis (cuadro
2 - 2 ):
► Los productos de la mitosis son diploides; los de la meiosis son
haploides.
► Los productos de la mitosis son idénticos en sentido genético;
los de la meiosis son diferentes en ese mismo aspecto.
La mitosis incluye una vuelta del ciclo celular (fig. 2-1). En la fase
S se replica el DNA y en la fase M se dividen las dos copias exacta­
mente iguales entre las células hijas. La meiosis también va prece­
dida por una ronda de síntesis de DNA, pero a continuación hay
dos divisiones celulares sin síntesis intermedia de DNA, de tal for­
ma que los productos terminan haploides. La segunda división de
la meiosis es idéntica a la mitosis, pero la primera división tiene di­
ferencias importantes cuyo propósito es generar diversidad genéti­
ca entre las células hijas. Esto se lleva a cabo por dos mecanismos:
segregación independiente de homólogos paternos y maternos y re­
combinación.
Segregación independiente de homólogos
paternos y maternos
Durante la meiosis I, los homólogos materno y paterno de cada par
de cromosomas forman un bivalente al parearse entre sí (sinapsis;
véase fig. 2-11). Después de la replicación del DNA cada cromoso­
ma consiste en dos cromátides hermanas, de tal manera que el bi­
valente es una estructura de cuatro cadenas en la placa de metafase.
A continuación, las fibras del huso tiran un cromosoma completo
42 j CAPÍTULO DOS i ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS CROMOSOMAS

Fig. 2-8. Vísta de la figura 2-7 realizada por un biólogo celular.

Las imágenes son de células HeLa y se obtuvieron mediante microscopía de desconvolución. El DNA está teñido con OAPI (color rojo falso) y los
microtúbulos con un anticuerpo a tubulina p (color verde falso). Imagen proporcionada por Willlam Eamshaw, University of Edinburgh. Reimpreso a par­
tir de Pollard y Earnshaw (2002), Cell Biology, con autorización de Elsevier.

Cuadro 2-2. Comparación de mitosis y meiosis

Mitosis Meiosis

Localización Todos los tejidos Sólo en testículos y ovario

Productos Células somáticas diploides Células haploides espermatozoo y óvulo

Replicación de DNA y división celular En condiciones normales una ronda de Sólo una ronda de replicación pero dos divisiones celulares
replicación por división celular

Extensión de la profase Corta (-30 minutos en células La meiosis 1 es larga y compleja; puede requerir varios años
humanas) para terminarse

Pareamiento de homólogos Ninguna Sí (en la meiosis 1)

Recombinación Rara y anormal En condiciones normales cuando menos una vez en cada
brazo del cromosoma

Relación entre células hijas Genéticamente Idéntica Diferente (recombinación y separación independientes de
homólogos)
 2.3 | TIPOS DE DIVISIÓN CELULAR: MITOSIS Y MEIOSIS | 43

Ovario La célula germinal Testículo

- primordial penetra - --jp—
la gónada

® x Esperm atogonia

Divisiones m itóticas
d e oogonia diploide
repetidas + esperm atogonia

C recim iento y
diferenciación

m Esperm atocito
prim ario (2rí)

M eiosis I
Esperm atocitos
secundarios
(n )

Meiosis II
(m) Esperm átides
m <§> m
(n)
1 l I I
Un Segundo
óvulo cuerpo
m aduro polar
w w
(n) (n) C uatro esperm atozoos m aduros (n)

Fig. 2-9. Desarrollo de la línea germinal.

La línea germinal se desarrolla por división mitótica repetida de las células diploides y culmina con la producción de oocitos y espermatocitos primarios.
Estas células diploides pueden someterse a meiosis. Esta última comprende dos divisiones celulares pero sólo una ronda de replicación de DNA, de tal
manera que los productos son haploides. En los seres humanos, los oocitos primarios entran en meiosis I durante la vida fetal pero a continuación se
detienen en la etapa profase hasta la pubertad o después. Durante este tiempo, los oocitos primarios completan su fase de crecimiento y adquieren una
cubierta gelatinosa externa, granulos corticales, ribosomas, mRNA, vitelo, etc. Después de la pubertad, cada mes completa la meiosis un oocito. Los
espermatozoos se producen de manera continua desde la pubertad en adelante.

(dos cromátides) hacia cada polo. Sin embargo, para cada uno de
los 23 pares de homólogos es independiente la elección del homó­
logo que ingresa con la célula hija. Esto permite que se produzcan
en una persona 22ii o alrededor de 8.4 X 106 posibles combinacio­
nes de cromosomas parentales (fig. 2 - 10 ).
Recombinación
Durante la profase de la meiosis I los homólogos en sinapsis dentro
de cada bivalente intercambian segmentos en una forma aleatoria.
En la etapa cigotena, cada par de homólogos comienza a formar un
complejo sinaptonemal que consiste en dos cromosomas en apo­
sición estrecha, separados por una proteína de centro lineal larga. La
terminación de este complejo marca el inicio de la etapa paquitena,
justo cuando ocurre la recombinación (cruzamiento o cruce). El
cruce incluye la rotura física de la doble hélice en una cromátide
materna y otra paterna y la unión de los extremos paterno y ma­
terno. En conjunto, la combinación de recombinación entre ho­
mólogos en la profase I aunada a la segregación independiente de
homólogos en la anafase I asegura que una célula individual pueda
producir un número casi ilimitado de gametos diferentes desde el
punto de vista genético.
No se comprende el mecanismo que posibilita la alineación de
los homólogos. Sin embargo, se piensa que para la recombinación
se requiere esta aposición cercana. Se cree que los nodulos de recom­
binación, ensambles muy grandes de múltiples proteínas localizadas
a intervalos en el complejo sinaptonemal, median los fenómenos de
recombinación. Es posible observar que los dos homólogos están
unidos físicamente en puntos específicos. Cada una de estas cone­
xiones se describe como un quiasma e indica un punto de cruza­
miento. En la meiosis masculina humana hay en promedio 55
quiasmas por célula y tal vez 50% más en la meiosis femenina. En
el capítulo 13 se consideran las consecuencias genéticas del cruza­
miento.
Además de su función en la recombinación, se piensa que los
quiasmas son esenciales para la segregación correcta de cromosomas
en la meiosis I. Al conservar los homólogos materno y paterno de
cada par de cromosomas unidos en el huso hasta la anafase I (figs.
44 CAPÍTULO DOS ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS CROMOSOMAS

© O
1 2 3 ¡4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122 X M a te rn o C é lu la
1 2 3 4 5 |6 7 8 |9 (1011 i1 2 f1 3 !14 (l5(l6 {l7¡18 |1 9¡2 0|2 1 ;22 Y P a te rn o s o m á tic a
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D) |l 2 j3 |4 [5 |6 7|8|9[l0|nMNIl4|l5|l6h7|Í8|Í9|20|2l|22|x|

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E) [1 2 3 4 5 |6 |7 8 9 10 11 |l2|l3|l4 1516 17|l8|l9j20Í21 2 2 |X

Fig. 2-10. Meiosis: la segregación independiente de homólogos maternos y paternos en la meiosis I produce el primer nivel de diversidad genética.

Hay 223 u 8.4 millones de formas diferentes de tom ar un cromosoma de cada uno de los 23 pares en una célula diploide. Los gametos A-E muestran
tan sólo cinco de las posibles combinaciones de cromosomas maternos y paternos. En este diagrama se Ignora la recombinación, que introduce un
segundo nivel de diversidad genética, lo que asegura que cada cromosoma individual que pasa es una mezcla de secuencias maternas y paternas.

2-11 y 2 - 12 ) tienen una función que es análoga a la de los centró-
meros en la mitosis y la meiosis II. Pruebas genéticas indican que
los niños con números incorrectos de cromosomas suelen ser el
producto de gametos en los que un bivalente careció de cruces.
Al parecer, la meiosis I I es idéntica a la mitosis, excepto que
sólo existen 23 cromosomas en lugar de 46. Cada cromosoma
consiste en dos cromátides y éstas se separan en la anafase II; em­
pero, hay una diferencia. Las cromátides hermanas de un cromo­
soma mitótico son idénticas, son copias una de la otra, pero las
dos cromátides de un cromosoma en la meiosis II pueden ser di­
ferentes en sentido genético como resultado de cruces en la meio­
sis I (fig. 2 - 12 ).
2.3.3 Paramiento X-Y y regiones seudoautosómicas
En la meiosis femenina, cada cromosoma tiene un compañero por
completo homólogo y los dos cromosomas X hacen sinapsis y se
cruzan justo igual que cualquier otro par de homólogos. En la
meiosis masculina hay un problema. Los cromosomas humanos del
sexo X y Y son muy diferentes entre sí. No obstante, en varones se
parean en la profese I, lo que asegura así que en la anafase I cada
célula reciba un cromosoma del sexo, sea X o Y. El pareamiento de
los cromosomas X y Y es terminoterminal y no a lo largo de toda
su longitud, y es posible por una región base de 2.6 mega (Mb) de
homología entre los cromosomas X y Y en las puntas de sus brazos
cortos. El pareamiento se sostiene por un cruce obligatorio en esta
región. Los genes en el segmento de pareamiento tienen ciertas pro­
piedades interesantes:
► Se encuentran como copias homologas en los cromosomas X
y Y.
► No están sujetos a inactivación X (como se esperaría ya que ca­
da sexo tiene dos copias).
► Debido al cruzamiento, los alelos de estos locus no muestran
los patrones normales de herencia ligados a X o Y, sino que se
segregan como alelos autosómicos.
Debido a esta conducta, esta región se conoce como región mayor
seudoautosómica. En las puntas de los brazos largos de ambos cro­
mosomas se halla una segunda región seudoautosómica más peque­
ña de 320 kb, pero el pareamiento y cruzamiento en esta región
seudoautosómica menor no es una característica obligatoria de la
meiosis masculina.
2.4 Estudio de los crom osom as
hum anos
2 A 1 Es posible observar cromosomas mitóticos en
cualquier célula en división, pero en seres
humanos es difícil estudiar ios cromosomas
meióticos
Obtención y preparación de céiuias humanas
para análisis cromosómico
En condiciones normales se observan los cromosomas en las célu­
las en división y es difícil obtener células en división directamente
del cuerpo humano. La médula ósea es una posible fuente —pero
siempre es mucho más fácil obtener una fuente accesible de células
que no están en división y cultivarlas en el laboratorio. Las fuentes
de células humanas que se utilizan más a menudo para análisis ci-
togenético son las sanguíneas y los fibroblastos de la piel. Casi nin­
guna persona tiene inconveniente en proporcionar unos cuantos
mililitros de sangre y mediante tratamiento con lectinas, como la
fitohemaglutinina, es posible inducir con facilidad a los linfocitos
T sanguíneos para que se dividan. Los fibroblastos de la piel se cul­
tivan de biopsias de piel. Además, el diagnóstico prenatal incluye
de rutina análisis cromosómicos en células fetales que se despren­
den hacia el líquido amniótico o en vellosidades coriónicas.
Aunque en algunos organismos se han descrito con precisión los
cromosomas tan temprano como en la década de 1880, durante
 2.4 ESTUDIO DE LOS CROMOSOMAS HUMANOS ¡ 45

17 17 ' Leptoteno
1 ------------------------------------- -
Los crom osom as son cadenas
finas no pareadas que consisten en
dos crom átides herm anas enlazadas
d e m odo estrecho

Gigoteno
17 Los hom ólogos m aterno y paterno se
parean entre sí para form ar bivalentes

Paquiteno
Engrasam iento de los crom osom as
O curre el cruzam iento

Diploteno
Se separan los hom ólogos
pero se conservan juntos por
quiasm as
Pueden contarse los cruces
y registrarse las posiciones

Diacinesia
Bivalentes más
contraídos

Fig. 2-11. Meiosis: las cinco etapas de la profase en la meiosis I.

Se muestran dos pares representativos de homólogos. Hay dos cruzamientos en el cromosoma 1 bivalente y uno en el cromosoma 17 bivalente. Para
mayor claridad, los dos cruzamientos en el cromosoma 1 incluyen las dos mismas cromátides. En realidad, es probable que el número de cruzamientos
sea alto y múltiples cruzamientos pueden incluir tres o Incluso todas las cuatro cromátides en un bivalente, como se muestra en la figura 13-2.

muchos decenios todos los intentos por preparar dispersiones de
cromosomas humanos proporcionaron una maraña que impidió
analizarlos. La clave para obtener preparaciones diseminadas anali­
zables fue una nueva técnica, el desarrollo de células en suspensión
líquida y su tratamiento con solución hipotónica para tornarlas tu­
mefactas. Esto permitió obtener las primeras preparaciones de bue­
na calidad en 19 5 6 . Se colocan los glóbulos blancos de la sangre en
un medio de cultivo rico entrelazado con fitohemaglutinina y se
permite que crezcan durante 48 a 72 horas, cuando deben estar ya
en división libre. No obstante, debido a que la fase M sólo ocupa
una parte pequeña del ciclo celular, en realidad están en división
pocas células en cualquier momento determinado.
El índice mitótico (proporción de células en mitosis) se incre­
menta al tratar el cultivo con un agente que altera el huso, como la
co lcem id a . Las células llegan a la fase M del ciclo, pero no son ca­
paces de superarla y de esa forma se acumulan células en la metafa-
se de la mitosis. Muchas veces es preferible estudiar crom osom a s en
la p rom eta fa se, que están menos contraídos y por consiguiente
muestran más detalles. Los cultivos celulares pueden sincronizarse y
evitar de modo temporal que lleven a cabo el ciclo. Con frecuencia
eso se logra al añadir timidina en exceso (a fin de provocar una re­
ducción de dCTP y originar un retraso de la síntesis de DNA, de tal
manera que las células permanezcan en la fase S). Cuando se supri­
men los efectos de la timidina, las células progresan a través del ciclo
de manera sincrónica. Mediante ensayo y error, un tiempo después
de la supresión es posible determinar cuando se encuentra una bue­
na proporción de células en la etapa de prometafase deseada.
La meiosis sólo puede estudiarse en muestras testiculares u ováricas.
La meiosis femenina es en especial difícil, ya que sólo es activa en ova­
rios fetales, en tanto que la meiosis masculina puede estudiarse en una
biopsia testicular de cualquier varón pospúber que desee proporcionar
un espécimen. Los resultados de la meiosis pueden estudiarse al ana­
lizar los cromosomas de espermatozoos, aunque la metodología para
ello es molesta. En algunos modelos de investigación de infecundidad
masculina se recurre al análisis meiótico.
Cariotipificación y bandeo cromosómico
Hasta la década de 1970 se identificaron los cromosomas a partir
de su tamaño y la posición de los centrómeros. Esto hizo posible
clasificarlos en grupos (cuadro 2-3), pero no identificarlos sin am­
bigüedad. La introducción de las técnicas de bandeo (recuadro 2-2)
posibilitó al final identificar cada cromosoma y asimismo definir
con mayor precisión puntos de rotura de translocación, deleciones
subcromosómicas, etc. La resolución del bandeo puede incremen­
tarse mediante cromosomas más alargados, por ejemplo cromoso­
mas de la prometafase o más temprano, en lugar de la metafase. Los
procedimientos típicos de bandeo de alta resolución para cromoso­
mas humanos pueden proporcionar un total de 400, 550 u 850
bandas (figs. 2-13 y 2-14).
 46 CAPITULO DOS ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS CROMOSOMAS
Fig. 2-12. Meiosis: de la metafase I a los gametos.
La figura es una continuación de la tigura 2-11. A) De la m etalase a la d ivisió n ce lu la r en la m eiosis I. La figura muestra un posible patrón de segre­
gación de los dos bivalentes. B) M eiosis II. Aunque las dos cromátides hermanas de cada cromosoma se segregan a diferentes células hijas, los distin­
tos cromosomas se comportan de manera independiente y, en consecuencia, como se muestra, son posibles muchas combinaciones.
La constitución cromosomica se describe por un cariotipo que
señala el número total de cromosomas y la constitución de cromo­
somas del sexo. Los cariotipos normales de mujeres y varones hu­
manos son 46,XX y 46,XY, respectivamente. Cuando hay una
anormalidad cromosomica, el cariotipo también describe el tipo
de anormalidad y las bandas o subbandas cromosómicas afectadas.
Véase el recuadro 2-3 para detalles de la nomenclatura de los cro­
mosomas.
Los cromosomas se muestran en un cariograma (véase fig. 2-14;
con frecuencia denominado tan sólo cariotipo). Los cariogramas se
preparaban al cortar una fotografía de los cromosomas homólogos
diseminados y compatibles; en la actualidad se utiliza una compu­
tadora con un programa de análisis de imágenes.
Como se comenta con detalle en el recuadro 2-2, el bandeo cro­
mosomico consiste en someter los cromosomas a desnaturación, di­
gestión enzimàtica, o ambos, seguido de la incorporación de un
colorante específico de DNA, que origina que los cromosomas hu­
manos y otros mitóticos se tiñan como una serie de bandas claras y
\ oscuras (figs. 2-13, 2-14; véase Craig y Bickmore, 1993). Son inte­
resantes los patrones de bandeo (y asimismo útiles para citogenetis-
tas) porque proporcionan pruebas de cierta clase de estructura en
regiones de 1 a 10 Mb. Los patrones de bandeo se correlacionan
con otras propiedades. Las regiones que se tiñen como bandas G
oscuras se replican tarde en la fase S del ciclo celular y contienen
cromatina más condensada, en tanto que las bandas R (= bandas G
claras) suelen replicarse temprano en la fase S y tienen menos cro-
matina condensada. Los genes se concentran sobre todo en las ban­
das R, mientras que el DNA de la banda G más condensada, de
replicación más tardía, es menos activo en sentido transcripcional.
Existen asimismo diferencias en los tipos de elementos de repeti­
ción dispersados que se hallan en las bandas G y R (secciones 9.5.2
y 9.5.3).
Es posible producir bandas similares a las G mediante tinción
con q u in a crin a , que enlaza de preferencia DNA abundante en AT,
en tanto que el patrón de bandeo R puede obtenerse con cro m o -
m icin a, que enlaza de modo preferencial DNA con abundancia de
GC. Aunque el porcentaje del contenido de AT del DNA de la
banda G humana sólo es un poco mayor que el del DNA de la ban­
da R, las bandas G son localm ente pobres en G-C (es decir, las ban­
das G individuales siempre tienen un %GC más bajo que sus
secuencias de flanqueo inmediatas; Niimura y Gojobori, 2002).
Saitoh y Laemmli (1994) sugirieron que la diferencia depende de
las variaciones de la formación estructura central-asa. Se piensa que
las asas de cromatina se fijan a la estructura central de los cromoso­
mas en regiones de fijación de estructuras centrales (RFEC) es­
peciales. Según el modelo de Saitoh y Laemmli, las bandas G tienen
asas más pequeñas y una disposición más apretada de RFEC a lo lar­
go de la estructura central. Ello significa más RFEC por unidad de
longitud de DNA en las bandas G que en las R, que da lugar a una
tinción potente con colorantes selectivos de AT como Giemsa.
 2.4 I ESTUDIO DE LOS CROMOSOMAS HUMANOS 47

A) B) C)

Fig. 2-13. Las diferentes resoluciones de bandeo cromosómico pueden determinar bandas, subbandas y sub-subbandas.
Se muestra el cromosoma 4 (acompañado de un idiograma) a niveles crecientes de resolución que se aproximan a A) 400, B) 550 y C) 850 bandas por
juego haploide. Nótese la subdivisión de bandas en subbandas a medida que aumenta la resolución. Adaptado a partir de Cross y Wolstenhoime
(2001). En: Human Cytogenetics: Constitutional Analysis, 3rd Edn (ed. D. E. Rooney). Reproducido con autorización de Oxford University Press.

Fig. 2-14. Cariograma de prometafase con bandeo G de cromosomas mitóticos de linfocitos de un varón normal entre 550 y 850 bandas por juego
haploide.
Compárese con los ideogramas idealizados en la figura 2-15. Las longitudes totales de los cromosomas en metafase varían entre 2 y 10 /L/m; el DNA de
cada célula tendría alrededor de 2 m de largo, si se estirara. Reproducido a partir de Cross y Wolstenhoime (2001). En: Human Cytogenetics:
Constitutional Analysis, 3rd Edn (ed. 0. E. Rooney). Reproducido con autorización de Oxford University Press.
48 CAPÍTULO DOS ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS CROMOSOMAS

Cuadro 2-3. Grupos de cromosomas humanos

Grupo Cromosomas Descripción

A 1-3 El más grande; 1 y 3 son metacéntricos pero 2 es submetacéntrico

B 4,5 Grande; submetacéntrico, con dos brazos de tamaño muy diferente

C 6-1 2 ,X Tamaño mediano; submetacéntrico

D 13-15 Tamaño mediano; acrocéntrico con satélites

E 16-18 Pequeño; 16 es metacèntrico pero 17 y 18 son submetacéntricos

F 19,20 Pequeño; metacèntrico

G 2 1 ,22,Y Pequeño; acrocéntrico, con satélites en 21 y 22 pero no en la Y

Los autosomas se numeran del más grande al más pequeño, excepto que el cromosoma 21 es más pequeño que el 22.

Recuadro 2-2. Bandeo crom osom ico ÍÜ!

Bandeo G: se someten los cromosomas a digestión controlada con trip­
sina antes de teñirse con filernsa, un colorante químico que enlaza DNA.
Las bandas oscuras de tinción positiva se conocen como bandas G. Las
bandas pálidas son G negativas.
Bandeo Q: se tiñen los cromosomas con un colorante fluorescente que
se enlaza de modo preferencial a DNA abundante en AT. com o la Quina-
crina, DAPI (4 ',6 díamidino-2-fenilindol) u Hoechst 33258 y se observan
mediante fluorescencia ÜV. Las bandas fluorescentes se denominan ban­
das Q e indican los mismos segmentos cromosómicos que las bandas G.
Bandeo R: es en esencia el patrón inverso (del inglés reverse) del patrón
de bandeo G. Los cromosomas se desnaturalizan mediante calor en so­
lución salina antes de teñirse con Giemsa. El tratamiento con calor des-
vm
I n mi
naturaliza DNA abundante en AT y las bandas R son Q negativas. Puede
producirse el mism o patrón al enlazar colorantes específicos de GC como
cromomicina A3, olivomicina o mitramicina.
Bandeo T: identifica un subgrupo de bandas R que están concentradas
sobre todo en los telómeros. Las bandas T son las bandas R que se tiñen
de modo más intenso y se observan mediante un tratamiento por calor en
especial Intenso del cromosoma antes de teñirlo con Giemsa, o con una
combinación de colorante y fluorocromos.
Bandeo C: se piensa que demuestra heterocromatina constitutiva, sobre
todo en los centrómeros. De manera típica, los cromosomas se exponen
a desnaturalización con una solución saturada de hidróxido de bario, an­
tes de teñirse con Giemsa.

2.4.2 Citogenètica molecular: hibridación fluorescente
in situ (HFIS) cromosomica
La h ib rid a ció n cro m o som ica in situ estándar consiste en hibridar
una sonda de DNA marcada con DNA cromosómico desnaturali­
zado que se encuentra en una preparación de cromosomas en me­
talase en un portaobjetos para microscopio secado al aire. Con
anterioridad se marcaban sondas con radioisótopos que a menudo
proporcionaban relaciones de ruido: señal altas, pero el desarrollo
de HFIS cromosomica (hibridación de fluorescencia in sitii) (véase
Trask, 1991; Van Ommen y cois., 1995) ofreció una sensibilidad y
resolución mejores en grado notorio (véase en la figura 2-16 el mé­
todo básico). En este caso, se marca la sonda de DNA de forma di­
recta mediante la incorporación de un precursor de nucleótidos
marcado con fluorescencia, o de manera indirecta con la incorpo­
ración de un nucleótido que contiene una molécula rastreadora (o
reportera) (como biotina o digoxigenina), que después de incorpo­
rarse en el DNA es enlazada a continuación por una molécula de
afinidad marcada con fluorescencia (véase sección 6.1.2). Con el
fin de incrementar la intensidad de la señal de hibridación, casi
siempre se prefieren sondas de DNA grandes, si se dispone de ellas.
La HFIS tiene la ventaja de proporcionar resultados rápidos que
pueden calificarse de manera conveniente con la vista mediante un
m icroscop io d e flu o rescen cia (para los principios básicos subyacen­
tes de la microscopia fluorescente, véase fig. 6-5). En la HFIS cromo­
somica convencional se emplean dispersiones en metafase (HFIS d e
m etafasé) y las señales de hibridación positiva con frecuencia se
muestran como puntos dobles, que corresponden a la sonda hibri-
dada a ambas cromátides hermanas (fig. 2-17A). Con un tipo de
procesamiento de imágenes complicado y moléculas de enlace ras­
treadoras que llevan diferentes fluoróforos es posible mapear y or­
denar varias clonas de DNA de manera simultánea.
La resolución máxima de la HFIS en la metafase es de varias
megabases. El uso de los cromosomas de la prometafase más exten­
didos puede permitir una resolución de 1 Mb, pero debido a pro­
blemas con el doblamiento de la cromatina pueden aparecer dos
señales de sonda marcadas de modo preferencial de lado a lado, a
menos que estén separadas por distancias mayores de 2 Mb. Sin
embargo, en fecha reciente se desarrollaron nuevas variaciones, co­
mo la HFIS de fibra, que incluye el estiramiento artificial de fibras
de DNA o cromatina, que permite una resolución más alta (véase
Heiskanen y cois., 1996). La HFIS en los cromosomas de núcleos
de interfase (HFIS de interfase; véase fig. 2-17B) también puede
suministrar un análisis de alta resolución porque los cromosomas es­
tán muy extendidos en forma natural comparados con los cromoso­
mas de la metafase o prometafase.

Recuadro 2-3. N o m e n c la t u r a d e l c r o m o s o m a h u m a n o
El International System for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN) está
fijado por el Standing Committee on Human Cytogenetic Nomenclature
(véase lecturas adicionales). La terminología básica para el bandeo de
cromosomas se decidió en una reunión en París en 1971 y con frecuen­
cia se conoce com o nomenclatura de París.
Las localizaciones en el brazo corto se marcan p ip e tit) y en los brazos
largos q (queue). Cada brazo del crom osom a está dividido en regiones
marcadas p1, p2, p3, etc., y q1, q2, q3, etc., con conteo hacia fuera
desde el centròmero. Las regiones están delimitadas por referencias
específicas, que son características m orfológicas consistentes y pre­
cisas, com o los extremos de los brazos del cromosoma, el centròmero
y ciertas bandas. Las regiones se dividen en bandas marcadas p11
(uno-uno, ¡no once!), p1 2 , p13, etc., subbandas marcadas p1 1 .1 , p1 1 .2 ,
2.4.3 Pintado cromosomico, cariotipificación molecular
e hibridación com parativa del genoma
Pintado cromosomico estándar
Una aplicación especial de la HFIS ha sido el uso de sondas de
DNA en las que el DNA de inicio está compuesto de un conjunto
grande de diferentes fragmentos de DNA sólo de un tipo de cro­
mosoma. Estas sondas pueden prepararse al combinar todos los in­
sertos de DNA humano en una biblioteca de DNA específica de
cromosomas (véase sección 8.3.2). De forma alternativa, es posible
amplificar fragmentos específicos de seres humanos a partir de cé­
lulas híbridas monocromosómicas humanas (un tipo de célula híbri­
da de ser humano y roedor en la que hay un juego completo de
cromosomas de roedor aunado sólo a un tipo de cromosoma hu­
mano (véase recuadro 8-4 para los detalles en la forma en que se
preparan células híbridas; las secuencias humanas pueden amplifi­
carse de forma selectiva mediante Alu-PCR, un método de PCR en
el que se usan oligonucleótidos iniciadores (cebadores) derivados de
la secuencia repetida AIu que no se encuentra en el genoma de roe­
dores; véase recuadro 5-1).
La señal de hibridación resultante representa las contribuciones
combinadas de múltiples clonas de DNA marcadas, derivadas de
muchos diferentes locus que abarcan un cromosoma completo, una
p in tu ra d e l crom osom a, y en consecuencia causa fluorescencia de
todos los cromosomas (pintado cromosomico; véase Ried y cois.,
1998 y fig. 2-16 para la base del método). La figura 2-4 muestra un
ejemplo de pintado cromosomico en núcleos en interfase, pero ca­
si todo el pintado cromosomico se lleva a cabo en cromosomas en
metafase. Una aplicación importante es la definición de reordena­
mientos nuevos y marcado de cromosomas en citogenètica clínica y
del cáncer (véase fig. 2-18 para un ejemplo). Es en particular útil
en citogenètica del cáncer en la que las preparaciones de cromoso­
mas tumorales suelen ser de mala calidad.
Cariotipificación molecular e hibridación fluorescente
in situ multiplex (HFIS-M)
El pintado cromosomico se limitó al inicio por el número relativa­
mente pequeño de colorantes fluorescentes de distintos colores
(fluoróforos) que podían emplearse para distinguir distintos cromo-
2.5 ! ANORMALIDADES DE LOS CROMOSOMAS 49
etc. y sub-subbandas, por ejemplo p1 1 .2 1 , p1 1 .22, con conteo en cada
caso hacia fuera del centròmero (figs. 2-13 y 2-15).
La distancia relativa del centròmero se indica con las palabras proxi-
mal y distai. Por consiguiente, Xq proximal significa el segmento del bra­
zo largo de X que está más cerca del centròmero, en tanto que 2p distal
indica la porción del brazo corto del cromosoma 2 que está más distante
del centròmero, y en consecuencia más cerca del telómero. Otros térm i­
nos comunes son los que se indican más adelante.
Cuando se comparan cromosomas humanos con los de otras especies,
el acuerdo es utilizar la primera letra del nombre de género y las dos prime­
ras letras del nombre de especie (p. ej., HSA18 significa humano: Homo sa-
piens, cromosoma 18).
somas. A fin de incrementar el número de diferentes blancos que
pueden detectarse, suelen utilizarse un marcado combinatorio
(sondas de marcado individuales con más de un tipo de fluorófo-
ro) y la proporción de marcado (diferentes proporciones de los dis­
tintos fluoróforos) (véase Lichter, 1997). Los colores mixtos no se
detectan mediante microscopía de fluorescencia estándar con fil­
tros apropiados. Por el contrario, es preferible el análisis digital au­
tomatizado de imágenes mediante el cual se asignan a diversas
combinaciones de fluoróforos seudocolores artificiales.
Los métodos anteriores permitieron en fecha reciente observar
de modo simultáneo los 24 cromosomas humanos, una forma de
cariotipificación molecular. El método general se conoce como
HFIS multiplex (HFIS-M) y emplea imágenes digitales adquiridas
por separado de cada uno de estos cinco fluoróforos diferentes me­
diante una cámara CCD (dispositivo de carga acoplado). Las imáge­
nes se analizan con un grupo de programas de computadora que
generan una imagen compuesta en la cual a cada cromosoma se le
proporciona un seudocolor diferente según sea la composición del
fluoróforo. Estos métodos son aplicables en especial para analizar
muestras tumorales en las que son en especial frecuentes reordena­
mientos cromosómicos complejos (véase fig. 17-10 para un ejemplo).
Hibridación comparativa del genoma (HCG)
Una extensión adicional del pintado cromosómico es la hibridación
comparativa del genoma (HCG) que incluye el pintado simultáneo
de cromosomas en dos colores diferentes y que utiliza como sondas
DNA total de dos fuentes relacionadas, que se espera que muestren
diferencias que incluyen la ganancia o pérdida de regiones subcro-
mosómicas o incluso de cromosomas completos. Una aplicación
común es el análisis de muestras tumorales para prueba de regiones
del genoma que se amplificaron, o en las que hubo pérdidas cro-
mosómicas. Estas se identifican al comparar las proporciones de las
dos señales de color cromosoma por cromosoma (véase fig. 17-3
para un ejemplo).
2.5 Anormalidades de ios cromosomas
Las anormalidades de los cromosomas podrían definirse como
cambios que dan por resultado una alteración visible de los cromo-
50 j CAPÍTULO DOS j ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS CROMOSOMAS

1 1 2 11
11.2 11
11.21
11.22
11.23

21.1
21.2 I
21.3 ¡

31.2

31.2 31.3
31.3

37.1
37.2
37.3

12

13 O

21.2 13:1 14.1

14.2
21.3 14.3
22.1 21.1
22.2
22.3
24.1
24.2
24.3

12 13 14 15

11.32
11.31
11.2

Itt
13.2
13.1
Q C lave:
21.2
21.3
11.2
12.1
12.2
12.3
15
n
13.1
11:1 9 iQ □
-
C en tró m ero
rD N A
13.2 □ H etero cro m atin a
no cen tro m érica

18 19 20 22

Fig. 2-15. Patrón de bandeo de cromosomas humanos.

Se muestra una recopilación de los mejores patrones de bandeo que podrían observarse en cada cromosoma y no una fotografía de la forma en que apare­
cen al microscopio los cromosomas en cualquier célula. Los cromosomas están numerados en orden de tamaño, excepto que el 21 es en realidad más
pequeño que el 22. Las disposiciones de genes de DNA ribosómico repetidos en los brazos cortos de los cromosomas acrocéntricos 1 3 ,1 4 ,1 5 , 21 y 22
aparece con frecuencia como tallos delgados que llevan perillas de cromatina (satélites). La heterocromatina constitucional ocurre en los centrómeros, en
gran parte del brazo largo del cromosoma Y en las constricciones secundarias en 1q, 9q y 16q y en los brazos cortos de los cromosomas acrocéntricos.

B U SQ U ED A ESTÁNDAR
C LO N A P U R IFIC A D A DE DNA
Preparación d e crom osom a en
portaobjeto para m icroscopio
Desnaturalización d e DNA
i in situ
Sonda única de marcado
D ejar fijar (annea/),
exponer a UV y observar
i la fluorescencia in situ
Enlace de Enlace d e pintado
sonda única crom osom ico
Fig. 2-16. Bases de la HFIS de cromosomas y métodos de pintado cromosomico.
Nota: para efectos de simplificación, sólo se muestra el resultado final en cromosomas en metafase. Véase las figuras 2-17A y 2-17B para ejemplos de
HFIS en metafase y HFIS en interfase, respectivamente, y las figuras 2-18 y 2-4 para ejemplos de pintado cromosomico en cromosomas en metafase e
interfase, de modo respectivo.
somas. La cuantía de lo que puede observarse depende de la técni­
ca utilizada. La pérdida o ganancia más pequeña de material visible
mediante los métodos tradicionales en preparaciones citogenéticas
estándar es alrededor de 4 Mb de DNA. Sin embargo, la HFIS per­
mite observar cambios mucho más pequeños; el desarrollo de la ci-
togenética molecular eliminó cualquier línea divisoria clara entre
los cambios descritos como anormalidades cromosómicas y los que
se piensa que son defectos moleculares o del DNA. Una definición
alternativa de anormalidad cromosómica es una anormalidad pro­
ducida por mecanismos específicamente cromosómicos. Casi todas
las aberraciones cromosómicas se originan por pares erróneos de
cromosomas rotos, recombinación inapropiada o mala segregación
de cromosomas durante la mitosis o la meiosis.
2.5.1 Tipos de anormalidad cromosómica
Las anomalías cromosómicas pueden clasificarse en dos tipos según
sea la extensión con que ocurren en las células del cuerpo. En todas
las células corporales existe una anormalidad constitucional. Cuando
sucede, la anomalía debe presentarse muy temprano en el desarrollo,
con mayor probabilidad como resultado de un espermatozoo u óvu­
lo defectuosos, o tal vez fecundación anormal o un fenómeno anó­
malo en el embrión muy temprano. Sólo en ciertas células o tejidos
de un individuo existe una anormalidad somática (o adquirida).
Como resultado, un individuo con una anomalía somática es un mo­
saico (fig. 4-10), contiene células con dos constituciones cromosómi­
cas diferentes y ambos tipos de células derivan del mismo cigoto.
2.5 j ANORMALIDADES DE LOS CROMOSOMAS 51
o PINTADO
C R O M O S O M IC O
C onjunto heterogéneo de
m uchas clonas d e D N A con
insertos derivados de
m uchas diferentes regiones
d e un m ism o crom osom a
M arcado que incorpora
nucleótidos con fluoróforo
unido; desnaturalizar
o Pintado cromosomico
Las anormalidades cromosómicas, sean constitucionales o so­
máticas, corresponden sobre todo a dos categorías: anomalías nu­
méricas y estructurales (véase recuadro 2-4). En ocasiones se
identifican anormalidades en las que los cromosomas tienen el nú­
mero y estructura correctos, pero representan contribuciones desi­
guales de los dos padres (sección 2.5.4). Tal vez de forma
inesperada corrigen problemas de origen parental.
2.5.2 Las anormalidades cromosómicas numéricas
incluyen ganancia o pérdida de cromosomas
completos
Es posible distinguir tres clases de anormalidades cromosómicas
numéricas: poliploidía, aneuploidía y mixoploidía.
Polipioidía
Uno a 3% de los embarazos humanos reconocidos son triploides. La
causa más usual es la de dos espermatozoos que fecundan un óvulo
(dispermia); algunas veces se debe a un gameto diploide (fig. 2-19).
Los triploides muy rara vez sobreviven hasta el término y el trastorno
no es compatible con la vida. La tetraploidía es mucho más rara y
siempre mortal. Por lo regular se debe a falta de terminación de la pri­
mera división cigótica: se replicó el DNA para dar un contenido 4C,
pero a continuación no se efectúa la división celular en forma normal.
Aunque la poliploidía constitucional es rara y mortal, todas las perso­
nas normales tienen algunas células poliploides (sección 3.1.4).
52 CAPÍTULO DOS ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS CROMOSOMAS

Fig. 2-17. HFIS de dos colores en metafase e interlase para detectar el reordenamiento BCR-ABL en la leucemia mieloide crónica.

Casi todos los casos de leucemia mieloide crónica resultan de una translocación recíproca en t(9 ;22 ) que genera la fusión de genes entre el
oncogén ABL en 9q34 y el gen BCR en 22q11 (véase fig. 17-4 para detalles). Se muestra la hibridación con sondas marcadas para ABL (señal roja)
y BCR (señal verde) para cromosomas en metafase de un paciente con LMC (a la izquierda y con las áreas dentro de los círculos con rayas
aumentadas en los dibujos de la parte media) y para cromosomas de interfase del mismo paciente (fotografía de la derecha). Los genes ABL y
BCR normales emiten señales estándar roja y verde, respectivamente (nota: son visibles las señales en la metafase de las dos cromátides hermanas
cuando menos en el caso del gen ABL). Las flechas blancas muestran señales características para el gen de fusión BCR-ABL en los dos crom oso­
mas de translocación (der[9] y der[22]). Éstas pueden identificarse por la colocación muy cercana de las señales roja y verde y la superposición de
las señales roja y verde aparece en naranja-amarillo. Imagen proporcionada por Fiona Hardíng, Institute of Human Genetics, Newcastle Upon Tyne.

Aneuploidía
Euploidía significa la presencia de un juego completo de cromoso­
mas (n, 2n, 3n, etc.). La aneuploidía es lo opuesto: se encuentran
uno o más cromosomas individuales en una copia adicional o fal­
tan en un juego euploide. Trisomía significa tres copias de un cro­
mosoma particular en una célula por otra parte diploide, por
ejemplo trisomía 21 (47,XX+21 o 47,XY+21) en el síndrome de

J
| Down. Monosomía es la falta correspondiente de un cromosoma,
Fig. 2-18. Puede utilizarse el pintado cromosómico para definir
reordenamientos de cromosomas.
En este caso se investigó un cromosoma X anormal, con presencia de
material cromosómico adicional en el brazo corto, identificado median­
te cariotipificación de una muestra de sangre periférica, con pintado
completo del cromosoma X (rojo) y pintado completo del cromosoma 4
(verde). Esta imagen confirma que el material adicional que se en­
cuentra en el brazo corto del crom osom a X anormal se originó del
crom osom a 4. La tinción de fondo de los cromosomas emplea el co­
lorante DAPI azul. Imagen proporcionada por Gareth Breese, Institute
of Human Genetics, Newcastle Upon Tyne.
por ejemplo monosomía X (45,X) en el síndrome de Turner. Con
frecuencia, las células cancerosas muestran aneuploidía extrema,
con múltiples anormalidades cromosómicas (véase fig. 17-10). Las
células aneuploides surgen por dos mecanismos principales:
► No disyunción: falta de separación (desunión) de cromosomas
pareados en la anafase de la meiosis I o falta de desunión de
cromátides hermanas en la meiosis I I o la mitosis. La no dis­
yunción en la meiosis produce gametos con 22 o 24 cromoso­
mas, que después de la fecundación por un gameto normal
producen un cigoto trisómico o monosómico. La no disyun­
ción en la mitosis crea un mosaico.
► Retraso de la anafase: falla de un cromosoma o una cromáti-
de para incorporarse en uno de los núcleos hijos después de la
división celular, como resultado del movimiento tardío (retra­
so) durante la anafase. Los cromosomas que no penetran en el
núcleo de la célula hija se pierden.
Mixoploidía (mosaicismo y quimerismo)
Mixoploidía significa la presencia de dos o más linajes de células di­
ferentes en sentido genético en un mismo individuo. Las poblacio-
 2.5 [ ANORMALIDADES DE LOS CROMOSOMAS 53

nes celulares distintas desde el punto de vista genético pueden ori­

ginarse del mismo cigoto (mosaicismo) o más rara vez surgir de di­
ferentes cigotos (quimerismo). Véase la sección 4.3.6 y la figura
4-10 para una explicación más completa. Las anomalías que serían
mortales en forma constitucional pueden ser compatibles con la vi­
da en mosaicos.
Son comunes m osaicos d e aneuploidia. Por ejemplo, el mosaicis­
mo que da por resultado una proporción de células normales y otra
de células aneuploides (p. ej., trisómicas) puede atribuirse a no dis­
yunción o retraso del cromosoma que ocurre en una de las divisio­ D u p lic a c ió n d e D N A
pe ro sin d ivisió n c e lu la r
nes mitóticas del embrión temprano (cualquier célula monosómica
(en d o m ito s is)
que se forma suele morir).
En ocasiones se encuentran m o sa ico sp o lip lo id es (p. ej., mosai­ T e tra p lo id ía
cos humanos diploide/triploide). Como es muy poco probable la ga­
nancia o pérdida de un juego haploide de cromosomas por no
disyunción mitótica, los mosaicos humanos diploides/triploides se
originan con gran probabilidad por la fusión del segundo cuerpo po­
Fig. 2-19. Orígenes de triploidía y tetraploidía.
lar con uno de los núcleos segmentados del cigoto diploide normal.

Consecuencias clínicas de las anormalidades numéricas

La presencia de un número erróneo de cromosomas tiene conse­
cuencias importantes, por lo general mortales (cuadro 2-4). Aun­
que el cromosoma 21 adicional en un varón con síndrome de
Down es un cromosoma del todo normal, heredado de un padre
normal, su presencia causa múltiples anomalías congénitas. Las
monosomías autosómicas tienen consecuencias incluso más catas­
tróficas que las trisomías. Estas anormalidades deben ser conse­
cuencia de un desequilibrio en los niveles de productos génicos
codificados en distintos cromosomas. El desarrollo y la función
normales dependen de innumerables interacciones entre productos
génicos, incluidos muchos que se codifican en diferentes cromoso­
mas. La alteración de las cifras relativas de cromosomas afecta estas
interacciones.
La presencia de un número erróneo de cromosomas del sexo tie­
ne, con mucho, menos efectos perjudiciales que la existencia de un
número erróneo de cualquier autosoma. Muchas veces, las personas
47,XXX y 47,XYY funcionan dentro de los límites normales; los
varones 47,XXY tienen problemas relativamente menores compa­
rados con personas que presentan cualquier trisomía autosómica, e
incluso la monosomía, en mujeres 45,X, tiene pocas consecuencias
mayores. De hecho, ya que las personas normales pueden tener uno
o dos cromosomas X, y uno o ninguno Y, deben existir mecanismos
especiales que permitan el funcionamiento normal con números
variables de cromosomas del sexo. En el caso del cromosoma Y, se
debe a que lleva muy pocos genes, cuya función importante sólo es
determinar el sexo masculino. En el cromosoma X humano, el me­
canismo especial en mamíferos de in a ctiv a ció n d e l crom osom a X

1
R e c u a d r o 1 i . N o m e n c la t u r a d e a n o r m a li d a d e s c r o m o s ó m ic a s

Anorm alidades num éricas: Notas:

Triploidía 69,XXX, 69.XXY, 69.XYY aLa ganancia de un cromosoma está indicada por + ; la pérdida de un cro­
Trisomía p. ej. 47,X X ,+21a mosoma por
Monosomía p. ej. 45,X bDeleción terminal (punto de rotura en 4p16.3) y deleción intersticial
Mosaicismo p. ej. 47.XXX/46.XX (5q13-q33).
cUn reordenamiento de una copia del cromosoma 2 por inserción del seg­
Anorm alidades estructurales: mento 2q21-q31 dentro de un punto de rotura en 2p13.
Deleción p. ej. 46,XYdel(4) (p16.30b; 46,XX,del (5)(q13q33)b ‘’Cariotipo de una célula que contiene un cromosoma marcador (un cro­
Inversión p. ej. 46,XY¡nv(11)(p11p15) mosoma adicional no identificado).
Duplicación p. ej. 46,XX,dup(1)(q22q25) eUna translocación reciproca equilibrada con puntos de rotura en 2q35 y
Inserción p. ej. 46,XX,ins(2)(p13q21q31)c 6p21.3.
Anillo p. ej. 46,XY,r(7)(p22q36) fUn portador equilibrado de una translocación robertsoniana 14:21. q10
(del inglés ring) no es en realidad una banda cromosomica sino que indica el centròmero;
Marcador p. ej. 47,XX,+m ar‘i der significa derivado del cromosoma (y se utiliza cuando está presente
Translocación p. ej. 46,XX,t(2;6)(q35;p21.3)e un cromosoma de una translocación).
recíproca 8Translocación de síndrome de Down; un paciente con un cromosoma
Translocación normal 14, una translocación robertsoniana cromosomica 14;21 y dos
robertsoniana p. ej.45,XYder(14;21)(q10;q10)' copias normales del cromosoma 2 1 .
(da lugar a un p. ej. 46,XX,der(14;21 )(q10;q10),+ 2 1 9 Ésta es una nomenclatura corta; una nomenclatura más complicada está
cromosoma definida por el ISCN que permite la descripción completa de cualquier
derivado) anormalidad cromosomica; véase Lecturas adicionales.
54 { CAPITULO DOS ¡ ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS CROMOSOMAS

(sección 10.5.6) controla el nivel de los productos génicos que co­
difica X al margen del número de cromosomas X que se encuen­
tren en la célula.
La monosomía autosómica es, de manera invariable, mortal en
la etapa más temprana de la vida embrionaria. En cada cromosoma
hay tal vez unos cuantos genes en los que la reducción del nivel del
producto génico al 50% es incompatible con el desarrollo. Asimis­
mo, si bien esta reducción no es desde luego patogénica para la ma­
yor parte de los genes (sección 16.4.2), puede tener efectos menores
y la combinación de cientos o miles de estos efectos menores pue­
de ser suficiente para alterar el desarrollo normal del embrión. Las
trisomías dan lugar a un cambio más pequeño que las monosomías
en los niveles relativos de productos génicos y sus efectos son un
poco menores. Los embriones trisómicos sobreviven más tiempo
que los monosómicos y las trisomías 13, 18 y 21 son compatibles
con la supervivencia hasta el nacimiento. Como hecho interesante,
al parecer estos tres cromosomas contienen relativamente pocos ge­
nes (sección 9.1.4).
No es tan obvia la razón por la que la triploidía es mortal en se­
res humanos y otros animales. Con tres copias de cada autosoma,
la dosis de genes autosómicos está equilibrada y no debe causar pro­
blemas. Los triploides siempre son estériles porque los tripletos de
cromosomas no pueden formar pares y segregarse de modo correc­
to en la meiosis, pero muchas plantas triploides son sanas y vigoro­
sas en todos los otros aspectos. La letalidad en animales se explica
quizá por un desequilibrio entre los productos codificados en el
cromosoma X y los autosomas, que es incapaz de compensar la
inactivación del cromosoma X.
2.5.3 Las anormalidades cromosómicas estructurales
resultan de la reparación errónea de roturas de
cromosomas o del mal funcionamiento del sistema
de recombinación
Las roturas cromosómicas ocurren como resultado de daño del
DNA (p. ej., por radiación o sustancias químicas) o como parte del
mecanismo de recombinación. En la fase G2 del ciclo celular (fig.
2-1) los cromosomas consisten en dos cromátides. Las roturas que
suceden en esta etapa se manifiestan como roturas de cromátides
y sólo afectan a una de las dos cromátides hermanas. Si las roturas
que ocurren en la fase G1 no se reparan antes de la fase S, se pre­
sentan más tarde como roturas cromosómicas, que afectan a ambas
cromátides. Las células tienen sistemas enzimáticos que reconocen,
y tal vez reparan, extremos cromosómicos rotos. Las reparaciones
pueden incluir la unión entre sí de dos extremos rotos o la adición
de un telómero a uno de ellos. En condiciones normales, los meca­
nismos de punto de control del ciclo celular (sección 18.7.3) impi­
den que las células con roturas cromosómicas no reparadas inicien
la mitosis; si no es posible reparar el daño, la célula se suicida
(apoptosis).

Consecuencias de anormalidades cromosómicas numéricas

Poliploidía

Triploidía (69,XXX, XXY o XYY) 1-3% de todas las concepciones; casi nunca nace vivo; no sobrevive

Aneuploidía (autosomas)

Nulísomía (falta de un par de homólogos) Mortal antes de la implantación

Monosomía (falta de un cromosoma) Mortal embrionaria

Trísomía (un cromosoma adicional) Por lo general mortal en las etapas embrionaria o fetal; pero en las trisomías 13 (síndrome de Patau) y
18 (síndrome de Edwards) pueden sobrevivir hasta el término y la trísomía 21 (síndrome de Down)
suele sobrevivir hasta los 40 años de edad o más

Aneuploidía (cromosomas del sexo)

Cromosomas del sexo adicionales (47,XXX; 47,XXY; 47,XYY) presenta problemas relativamente menores, con tiempo de vida normal

Ausencia de un cromosoma del sexo 45,X = síndrome de Turner. Alrededor de 99% de los casos se aborta de form a espontánea; los
sobrevivientes tienen inteligencia normal pero son infecundos y muestran signos físicos menores. 45,Y
= no viable.

Cuadro 2 - ~ Anormalidades estructurales que resultan de la reparación errónea de roturas cromosómicas o recombinación
entre cromosomas no homólogos
Un cromosoma afectado Dos cromosomas afectados

Una rotura Deleción terminal (cicatrizado por adición de telómero)

Dos roturas Deleción intersticial; inversión
Cromosoma anular (fig. 2-20)
Duplicación o deleción por intercambio desigual
de cromátides hermanas (fig. 11-7)
Tres roturas Varios reordenamíentos, por ejemplo inversión
con deleción, inserción intracromosómica
Translocación recíproca (fig. 2-21)
Translocación robertsoniana (fig. 2-21)
Duplicación o deleción por recombinación desigual (fig. 11-7)
Inserción intercromosómica (directa o invertida)
 2.5 ¡ ANORMALIDADES DE LOS CROMOSOMAS 55

Dos roturas en el mismo brazo

Las anormalidades estructurales se presentan cuando las roturas
Dos roturas en diferentes brazos
no se reparan de forma correcta. A condición de que no haya extre­
mos rotos libres, es posible pasar a través de los puntos de control
del ciclo celular. Por consiguiente, algunas veces se unen entre sí los
extremos rotos erróneos. Cualquier cromosoma acentrico (falta de
un centromero) o cromosoma dicéntrico (que posee dos centró-
meros) resultante no se segrega de manera estable en la mitosis y al
final se pierde. Sin embargo, los cromosomas con un centromero
pueden propagarse de modo estable a través de rondas sucesivas de
mitosis, incluso si son anormales desde el punto de vista estructu­
ral. La recombinación meiótica entre cromosomas pareados de for­
ma errónea es una causa común de translocaciones, en especial en
la espermatogénesis. En el cuadro 2-5 se resumen las principales
anormalidades estructurales estables.
Una clase adicional rara de anormalidad estructural que no se
muestra en el cuadro 2-5 es la de los isocromosomas. Son cromoso­
mas simétricos que poseen dos brazos largos o dos brazos cortos de un
cromosoma particular. Se piensa que surgen de un intercambio anor­
mal tipo U entre cromátides hermanas justo cerca del centròmero de
un cromosoma. Los isocromosomas humanos son raros excepto i(Xq)
e i(21q), que es una causa ocasional de síndrome de Down.
Las anomalías cromosómicas estructurales se equilibran si no hay
ganancia o pérdida neta de material cromosómico y desequilibran si
hay ganancias o pérdidas netas. En general, las anormalidades equili­
bradas (inversiones, translocaciones equilibradas) no tienen efecto en
el fenotipo, aunque hay excepciones importantes a ello:
Inversión Deleción Inversión Crom osom a
paracéntrica intersticial pericéntrica anular ► Una rotura cromosomica puede alterar un gen esencial.
► La rotura puede afectar la expresión de un gen, aunque eso no
altere la secuencia de codificación. Puede separar un gen de un
Fig. 2-20. Posibles resultados estables de dos roturas en un mismo elemento de control o colocar el gen en un ambiente de cro­
cromosoma. matina inapropiado, por ejemplo la translocación de un gen
normalmente activo dentro de la heterocromatina.

S atélites

Intercam bio en
T R A N S L O C A C IÓ N brazos cortos
R O B E R TS O N IA N A proxim ales

P érdida

C ro m osom as Translocación Translocación ro bertsonian a

dicéntrico + acéntrico recíproca es tab le estable
In estables en la m itosis

Fig. 2-21. Orígenes de translocaciones.

Los cromosomas dicéntricos y acéntrícos son inestables durante toda la mitosis. Se producen translocaciones robertsonianas por intercambios entre
los brazos cortos proximales de los cromosomas acrocéntricos 1 3 ,1 4 ,1 5 , 21 y 22 (las disposiciones de genes de DNA ríbosómico repetidos en los
brazos cortos de los cromosomas acrocéntricos 1 3 ,1 4 ,1 5 ,2 1 y 22 aparecen con frecuencia como tallos delgados que llevan perillas de cromatína,
satélites). En una translocación robertsoniana se encuentran los dos centrómeros pero funcionan com o uno y el cromosoma es estable. Se pierde el
fragmento acéntrico pequeño, pero ello no tiene consecuencias patológicas porque sólo contiene secuencias repetidas de rDNA, que también se
encuentran en los otros cromosomas acrocéntricos.
56 | CAPÍTULO DOS | ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS CROMOSOMAS

G a m e to s

F e c u n d a c ió n n

A p o r g a m e to
n o rm a l J jL

C ig o to s

N o rm a l Portador
balanceado
Monosom ía parcial Trísomía parcial

Fig. 2-22. Resultados de la meiosis en un portador de una translocación recíproca equilibrada.

También son posibles otros modos de segregación, por ejemplo segregación 3:1. No es fácil predecir la frecuencia relativa de cada posible gameto. El
riesgo de que un portador tenga un niño con cada uno de los posibles resultados finales depende de su frecuencia en los gametos y asimismo de la
posibilidad de que un concepto con dicha anormalidad se desarrolle hasta el término. Véase el libro de Gardner y Sutherland (Lecturas adicionales) para
la discusión.

► Translocaciones equilibradas del autosoma X que causan pro­
blemas con la inactivación de X (fig. 14-10).
Las translocaciones robertsonianas se denominan en ocasiones fu­
siones céntricas, pero es erróneo porque de hecho las roturas se en­
cuentran proximales en los brazos cortos. La translocación del
cromosoma es en verdad dicéntrica, pero debido a que dos centró-
meros están muy cerca entre sí funcionan como uno y el cromoso­
ma se segrega de manera regular. Las partes distales de los brazos
cortos se pierden como un fragmento acéntrico. Los brazos cortos
de cromosomas acrocéntricos sólo contienen disposiciones de genes
RNA ribosómicos repetidos y la pérdida de dos brazos cortos no
tiene efecto fenotípico. Debido a que no existe este último, las
translocaciones robertsonianas se consideran equilibradas, aunque
de hecho se perdió cierto material.
Las anormalidades desequilibradas pueden surgir de modo di­
recto, por deleción o, rara vez, duplicación, o de manera indirecta
por segregación errónea de cromosomas durante la meiosis en un
portador de una anomalía equilibrada. Los portadores de anorma­
lidades estructurales equilibradas pueden tener problemas durante
la meiosis, si no corresponden las estructuras a los pares homólogos
de cromosomas:
► Un portador de una translocación recíproca equilibrada puede
producir gametos que, después de la fecundación, originan un
niño por entero normal, un portador equilibrado desde el pun­
to de vista fenotípico normal o varios cariotipos desequilibra­
dos que siempre combinan monosomía por parte de uno de los
cromosomas con trisomía de parte del otro (véase fig. 2 -22 ).
No es posible hacer afirmaciones generales sobre las frecuencias
relativas de estos resultados finales. El tamaño de cualquier seg­
mento desequilibrado depende de la posición de los puntos de
rotura. Si los segmentos desequilibrados son grandes, es proba­
ble que el feto se aborte de manera espontánea; un desequili­
brio de segmentos más pequeños puede tener como resultado
niños anormales que nacen vivos.
► Un portador de una translocación robertsoniana equilibrada
puede producir gametos que después de la fecundación dan lu­
gar a un niño del todo normal, un portador equilibrado en sen­
tido fenotípico normal o un concepto con trisomía o
monosomía completas para uno de los cromosomas relaciona­
dos (fig. 2-23).
► Un portador de una inversión pericéntrica puede tener una
descendencia desequilibrada porque los homólogos invertidos
y no invertidos forman un asa cuando se parean de tal manera
que se parean segmentos compatibles a lo largo de todo el cro­
mosoma. Si ocurre un cruce dentro del asa, el resultado es un
cromosoma que lleva una deleción y duplicación desequilibra­
das. Las inversiones cromosómicas paracéntricas forman asas
similares, pero cualquier cruce dentro del asa genera un cromo-

N o rm a l P o rta d o r (Trisom ía 14)
eq u ilib ra d o
v.
Fig. 2-23. Resultados de la meiosis en un portador de una translocación robertsoniana.
Los portadores son asintomáticos pero con frecuencia producen gametos desequilibrados que pueden dar por resultado un cigoto monosómico o
trisóm ico. Los cigotos monosómico y trisóm ico en este ejemplo no se desarrollarían hasta el término.
soma acéntrico o dicéntrico que no es probable que sobreviva.
En el libro de Gardner y Sutherland (lectura adicional) o cual­
quier otro texto de citogenética se menciona con más detalles
la meiosis en portadores de inversiones.
2.S.4 Los com plem entos eromosómícos al parecer
norm ales pueden ser patogénicos si tienen
el origen parental erróneo
Las raras anomalías que se describen más adelante demuestran que
no es suficiente tener el número y estructura correctos de cromoso­
mas; también deben tener el origen parental apropiado. Los con­
ceptos 46,XX en los que ambos genomas se originan del mismo
padre (diploidía uniparental) nunca se desarrollan de forma co­
rrecta. En algunos cromosomas individuales, la presencia de ambos
homólogos derivados del mismo padre (disomía uniparental) tam­
bién causa anormalidades. Un número pequeño de genes lleva la im­
pronta de su origen parental (sección 10.5.4) y se expresa de manera
diferente según sea el origen. Se presupone que las anomalías de di­
somía y diploidía uniparentales se deben a la expresión anormal de
estos genes improntados.
La diploidía uniparental se observa en molas hidatidiformes,
conceptos anormales con un cariotipo 46,XX de origen exclusiva­
mente paterno. Los embarazos molares muestran hiperplasia dise­
minada del trofoblasto, pero sin partes fetales y tienen un riesgo
2.5 j ANORMALIDADES DELOS CROMOSOMAS _57
(M o n o so m ía 14) (M o nosom ía 21 ) Tris o m ía 21
considerable de transformarse en cariocarcinomas. Estudios de
marcadores genéticos muestran que casi todas las molas son homoci-
gotas en todos los locus, lo que indica que surgieron por duplicación
cromosómica de un espermatozoo. Los teratomas ováricos resultan
de diploidía uniparental materna. Son tumores benignos raros del
ovario que consisten en tejidos embrionarios desorganizados, sin
membranas extraembrionarias. Se originan por activación de un
oocito no ovulado.
La disomía uniparental (DUP), que afecta sólo a un par de ho­
mólogos, no se diagnostica si el resultado no es anormal, pero se de­
tecta por cromosomas en los que producen síndromes característicos
(véase recuadro 16-6). La DUP puede incluir isodisomía, en la que
los dos homólogos son idénticos, o heterodisomla, cuando derivan de
ambos homólogos en un padre. Se piensa que la causa usual es res­
cate de trisomía: un concepto que es trisómico y que de otra mane­
ra moriría en ocasiones pierde un cromosoma por no disyunción
mitótica o retraso de anafase de una célula totipotente. La progenie
euploide de esta célula forma el embrión, en tanto que todas las cé­
lulas aneuploides mueren. Si cada una de las tres copias tiene una
posibilidad igual de perderse, habrá dos de tres probabilidades de
que se pierda un cromosoma aislado, lo que conduce a la constitu­
ción cromosómica normal y una en tres posibilidades de disomía
uniparental (sea paterna o materna). La isodisomía uniparental pue­
de surgir tal vez por presión de selección en un embrión monosómi­
co para lograr la euploidía mediante la duplicación selectiva del
cromosoma monosómico.
58 CAPITULO DOS i ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LOS CROMOSOMAS
Lecturas adicionales
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CAPÍTULO TRES

Células y desarrollo

Contenido del capítulo

60 I CAPÍTULO TRES | CÉLULAS Y DESARROLLO
Con excepción de los virus, toda la vida consiste en células —com­
partimientos acuosos limitados por membranas que interactúan en­
tre sí y con el ambiente-. Cada célula se origina por división o
fusión de células preexistentes. Finalmente debe haber una cadena
íntegra de células que conduce de nuevo a la primera célula primor­
dial satisfactoria que vivió tal vez hace 3.5 miles de millones de años.
¿Cómo se formó esa célula? Es una pregunta interesante.
Algunas células son organismos unicelulares independientes,
que pueden llevar a cabo todas las actividades necesarias para con­
servar la vida y deben ser capaces de reproducirse. Por tanto son en
extremo sensibles a cambios en su ambiente, por lo general tienen
ciclos de vida muy cortos y en consecuencia son adecuadas para
proliferar con rapidez. Como resultado pueden adaptarse rápido a
cambios en su alrededor —las mutantes que son más capaces de so­
brevivir en un ambiente particular pueden florecer muy rápido—.
Ello dio lugar a una enorme gama de microorganismos unicelula­
res que evolucionaron para ajustarse a diferentes nichos ambienta­
les, en ocasiones extremos. Sin embargo, la complejidad de estos
microorganismos siempre es limitada.
En comparación, los organismos multicelulares tienen una mayor
longevidad y los cambios en el fenotipo son lentos de manera corres­
pondiente. Su éxito se basa en la repartición de diferentes funciones
a distintos tipos celulares, y la disponibilidad resultante de numero­
sas formas de interacción de célula con célula proporciona un poten­
cial enorme de complejidad funcional. El ciclo de vida de algunos
microorganismos unicelulares, como el moho del limo Diclyostelium
discoideum, tiene una etapa multicelular, pero existen de modo pre­
dominante como células únicas. En contraste los animales y las plan­
tas son multicelulares durante toda su existencia vegetativa, con
células germinales especializadas que facilitan la reproducción. Los
organismos multicelulares pueden variar mucho de tamaño, forma y
número de células, pero en todos los casos la vida se inicia con una
célula. El proceso de desarrollo, desde la célula única hasta el orga­
nismo maduro, incluye muchas rondas de división celular durante las
que las células deben tornarse cada vez más especializadas y organi­
zarse en patrones precisos. Su conducta e interacciones durante el de­
sarrollo moldea la morfología total del organismo.
3.1 Estructura y diversidad de células
3.1.1 eucariotas representan la
dm siófi fundamenta* de las term as de « d a I
Las células pueden clasificarse en grupos taxonómicos amplios de
acuerdo con diferencias en su organización interna y distinciones
funcionales mayores que surgen de la divergencia evolutiva tempra­
na (véase fig. 3-1). La principal división de los organismos en pro­
cariotas y eucariotas se basa en diferencias fundamentales en la
arquitectura celular (fig. 3 -2 ).
Las células procariotas tienen una organización interna simple,
notablemente carente de organelos y compartimientos intracelula-
res. No poseen un núcleo definido. El DNA cromosómico, que no
parece estar muy organizado, existe como un complejo de núcleo-
proteínas conocido como nucleoide. Las células procariotas se ob­
servan hasta cierto punto sin rasgos característicos bajo el
microscopio electrónico. Sin embargo, las procariotas están muy le­
jos de ser primitivas, puesto que han existido a través de muchas
Protistas
ID P ro to p h y ta Pía ita s M e ta p h y ta
o
LU
Hongos
Aninr
P ro to zo a ,ales M e ta z o a
Unicelular Multicelular
Fig. 3-1. Clasificación de organismos unicelulares y multicelulares.
Nota: los protistas incluyen organismos unicelulares que se clasificaron
como animales (protozoarios), plantas (protofitos) y hongos (p. ej., leva­
dura), pero muchos protistas no se clasifican en ninguno de estos grupos.
más generaciones de evolución que los humanos. Comprenden dos
reinos de vida: bacterias (llamadas con anterioridad eubacterias pa­
ra diferenciarlas de las archaebacterias) y archaea (un grupo de or­
ganismos muy mal comprendido que semeja en forma superficial a
las bacterias y por esa razón antes se denominaban archaebacte­
rias). Todos los organismos procariotas son unicelulares. Las bacte­
rias se encuentran en muchos ambientes y algunas son patógenas
para el hombre. Con frecuencia las archaea se hallan en ambientes
extremos, como primaveras ácidas calientes, pero algunas especies
se encuentran en localizaciones más aptas para la convivencia jun­
to con eubacterias (p. ej., en el intestino de las vacas). El genoma
procariota típico se considera de manera convencional como un
cromosoma circular único que contiene menos de 10 Mb de DNA.
Sin embargo, este concepto se desafió en fecha reciente conforme
más especies procariotas se caracterizaron a detalle y se descubrie­
ron estructuras genómicas diversas. Por ejemplo, se identificaron
procariotas que poseen múltiples cromosomas circulares o lineales,
mezclas de cromosomas circulares y lineales, y genomas hasta de 30
Mb de tamaño (p. ej., Bacillus megateriurn).
Se piensa que las células eucariotas aparecieron por primera vez
hace alrededor de 1.5 miles de millones de años. Tienen una orga­
nización mucho más compleja que sus contrapartes procariotas,
con membranas internas y organelos limitados por membranas, in­
clusive un núcleo (véase recuadro 3-1). Sólo se conoce un reino de
organismos eucariotas -el eukarya—pero abarca tanto especies uni­
celulares (p. ej., levaduras, protistas, algas) como multicelulares (en
especial animales y plantas). En todos los organismos eucariotas co­
nocidos el genoma comprende dos o más cromosomas lineales con­
tenidos dentro del núcleo. Cada cromosoma es una molécula
aislada de DNA muy larga empacada en una forma elaborada y

E u c a río ta
Q P ro c a rio ta
1 0 (OTTI
N u c le o lo
N ú c le o
R ib o s o m a s
M íto c o n d ria
Fig. 3-2. Anatomía de las células procariota y eucaríota.
La célula eucaríota que se muestra en esta figura es una célula animal genérica. Los ejemplos de tipos individuales de células se describen en el recuadro 3-6.
muy organizada con histonas y otras proteínas. El número y el con­
tenido de DNA de los cromosomas varían mucho entre las especies
v, aunque la tendencia se dirige a que el tamaño del genoma sea pa­
ralelo a la complejidad del organismo, se observan excepciones no­
tables (véase sección 3.1.4). Además de los organelos mayores, las
porciones solubles tanto del citoplasma como del nucleoplasma es­
tán altamente organizadas. En el núcleo se identificó una diversi­
dad de estructuras subnucleares dispuestas en el contexto de la
matriz nuclear (véase recuadro 3-1). El citoplasma alberga una red
compleja de diferentes clases de filamentos proteínicos llamados en
conjunto citoesqueleto, que determina la forma y el movimiento
de la célula, y proporciona un esqueleto para el transporte intrace-
lular (véase recuadro 3-2).
3.1.2 El tam año y la form a de las células puede variar
enorm em ente, pera los índices de difusión fijan
algunos límites superiores
Muchos factores afectan el tamaño de las células (Su y OTarrel,
1998; Saucedo y Edgar, 2002). Las células dependen de la difusión
para coordinar sus actividades metabólicas y sus interacciones con el
ambiente y con otras células. Conforme su tamaño aumenta, la rela­
ción entre superficie y volumen disminuye. Se piensa que la estruc­
tura interna simple de las células procariotas limita su tamaño
máximo —por lo general las células bacterianas tienen 1 mcm de diá­
metro-. Las membranas internas complejas y la compartamentaliza-
3.1 I ESTRUCTURA Y DIVERSIDAD DE CÉLULAS 61
C á p s u la
P a re d c e lu la r
ción de las células eucariotas pueden ser importantes para permitir­
les crecer más. No obstante, las regiones internas con actividad me-
tabólica rara vez se encuentran a más de 15 a 25 |i.m de la superficie
celular y ello limita el tamaño de la célula a cerca de 50 |j,m. En rea­
lidad el diámetro promedio de las células en un organismo multice­
lular se encuentra dentro de los límites de 10 a 30 mcm. Algunas
células especializadas pueden crecer mucho más de este tamaño. Por
ejemplo, las neuronas suelen alcanzar hasta 1 m de largo, aunque eso
refleja la proyección de axones largos y muy delgados, en tanto que
el cuerpo celular permanece bastante dentro de los parámetros co­
mentados. Los óvulos también son células muy grandes. Los óvulos
de los mamíferos tienen alrededor de 100 mcm de diámetro, pero los
de otros animales que almacenan nutrimentos necesarios para el de­
sarrollo pueden ser mucho mis grandes. La célula más grande que se
conoce es el huevo de avestruz, que puede alcanzar hasta 20 cm de
largo y tiene un volumen aproximado al de 24 huevos de pollo.
3.1.3 Es organism os m ulticelulares, se observa
una diferenciación fundam ental entre células
som áticas y ia linea germinal
Las funciones vegetativas y de la reproducción están separadas en los
organismos multicelulares. Una población de células germinales es­
pecializadas para realizar las funciones de la reproducción se encuen­
tra aparte, en tanto que la función de las células somáticas restantes
consiste en proporcionar un recipiente en el que estas células repro-
62 } CAPÍTULO TRES CÉLULAS Y DESARROLLO
Recuadro 3-1. Organización intracelular de las células animales
La diversidad de organelos demuestra la complejidad de las células eucario-
tas, pero a causa de la especialización funcional no siempre se encuentran
los mismos organelos en todos los tipos de células. Algunas células huma­
nas muestran variaciones extremas (p. ej„ los glóbulos rojos maduros care­
cen de núcleo y los queratinocitos diferenciados terminalmente no poseen
organelos en lo absoluto). En otros casos se hallan organelos particulares en
muy pocos tipos de células y se requieren para funciones especificas. Por
ejemplo, las células epiteliales que recubren el aparato respiratorio contienen
cilios para eliminar las partículas contaminantes de los pulmones, en tanto
que los espermatozoos maduros son las únicas células humanas que po­
seen flagelos. Sin embargo, casi todas las células contienen un “ paquete es­
tándar" de organelos cuyas funciones se comentan a continuación.
NÚCLEO: el depósito del material genético
El núcleo contiene la inmensa mayoría (por lo general 99.55%) del DNA
de una célula animal, en la forma de cromosomas lineales. Está rodeado
por una envoltura nuclear, compuesta de dos membranas separadas por
un espacio estrecho que se continúa con el retículo endoplásmico (véase
más adelante). El resto de la célula se conoce como citoplasma y está
constituido por diversos organelos, membranas y un compartimiento
acuoso denominado citosoL La comunicación entre el núcleo y el cito­
plasma se efectúa a través de poros nucleares, aberturas en la envoltu­
ra nuclear que están rodeadas por complejos de poro nuclear. Estos
últimos son complejos proteínicos que actúan como transportadores es­
pecíficos de macromoléculas entre el núcleo y el citoplasma.
Dentro del núcleo, los cromosomas están dispuestos en una forma muy
ordenada, que indica la existencia de una subestructura compleja conoci­
da como matriz nuclear, una red de proteínas y RNA a la que se fijan los
cromosomas mediante secuencias de DNA que se denominan regiones
de fijación de matriz (RFM). El núcleo presenta otras estructuras discer-
nibles que sugieren una organización compleja de diferentes procesos bio­
químicos. El nucléolo es una región discreta en la que el RNA ribosómico
(rRNA) se sintetiza y procesa En este organelo se localizan los genes del
rRNA, que se encuentran de manera predominante como grupos en los
brazos cortos de los cromosomas 1 3 ,1 4 ,1 5 , 21 y 22 en células huma­
nas. El alto contenido de RNA confiere al núcleo su aspecto denso en las
fotomicrografías electrónicas. Se identifican otros corpúsculos nucleares
pero están menos bien caracterizados. Por ejemplo, se piensa que los cor­
púsculos de Cajal (que también se conocen como corpúsculos arrollados
o gems) son los sitios de síntesis de partículas de ribonucleoproteina nu­
clear pequeña (snRNP) y también pueden participar en la regulación gé-
nica. Está demostrado que el núcleo contiene varios factores de
transcripción y proteínas reguladoras del ciclo celular, localizados en fo­
cos, que a menudo se relacionan con locus genéticos particulares. Esto
sugiere que la cromatina se incorpora en regiones de transcripción acti­
va en sitios nucleares particulares, en contraste con el concepto tradicio­
nal de que los factores de transcripción se difunden con libertad alrededor
del núcleo. Un ejemplo en particular interesante es el corpúsculo LPM, que
aparece como un anillo y está compuesto sobre todo por la proteína de
leucemia premíelocítíca (LPM). En pacientes con leucemia premielocítíca
aguda, una translocación que incluye el gen de LPM y otro gen que codi­
fica un receptor de ácido retinoico genera una proteína de fusión que no
puede formar corpúsculos de LPM en forma normal. El tratamiento con
ácido retinoico restablece la capacidad de la célula para formar corpúscu­
los de LPM quizás al permitir que la proteína se localice correctamente y
asimismo conduce a remisión del cáncer. Al parecer otros corpúsculos nu­
cleares participan en procesos de transcripción corriente abajo. Incluyen
fibrillas de pericromatina (sitios de acumulación de RNA naciente), cor­
púsculos de segmentación (sitios de poliadenilación y segmentación) y
manchitas o grupos de gránulos de intercromatina (que participan en el
corte y la unión del RNA).
MITOCONDRIAS: las centrales de energía de células eucariotas aerobias
Las mitocondrias, una característica notable en el citoplasma de la ma­
yor parte de las células eucariotas, son los organelos que se encargan de
generar energía. La cadena respiratoria mitocondrial es una serie de cin­
co complejos proteínicos unidos a la membrana, que incluye varias qui-
nonas, citocrom os y proteínas de hierro y azufre. El conjunto de estos
complejos tiene a su cargo la fosforilación oxidativa, una reacción en la
que el oxígeno molecular oxida los nutrimentos orgánicos y la energía quí­
mica resultante se utiliza para generar ATR Medíante la difusión subse­
cuente a todas las otras partes de la célula, el ATP puede donar su energía
almacenada (por hidrólisis de ATP o ADP) y la energía liberada se emplea
para impulsar numerosas funciones celulares.
Aunque su tamaño es variable, el diámetro de las mitocondrias suele ser
de alrededor de 1 mcm, similar al de las células bacterianas. Las m itocon­
drias tienen dos membranas: una externa, hasta cierto punto lisa, y una
membrana mitocondrial interna compleja que posee un área de superfi­
cie muy grande por numerosos dobleces (crestas). El compartimiento in­
terno, la matriz mitocondrial, es una solución acuosa muy concentrada de
muchas enzimas e intermediarios químícos relacionados con el metabolis­
mo energético.
Las mitocondrias (y los cloroplastos de las células vegetales) son los úni­
cos otros organelos eucariotas que contienen DNA. Asimismo albergan ri-
bosomas propios que son distintos de los que se encuentran en el citosol.
Los ríbosomas mitocondriales se usan para traducir el mRNA transcrito
del DNA mitocondrial. Esta prueba y otras sugieren que las mitocondrias
son descendientes de bacterias aerobias que vivieron en simbiosis con
los precursores de células eucariotas (sección 12.2.1). Sin embargo, el
DNA mitocondrial sólo puede especificar unas cuantas de las funciones
mitocondriales y casi todas las proteínas mitocondriales son codificadas
por genes del núcleo. En el último c a s tv líl mRNA se traduce en riboso-
mas en el citosol y a continuación las proteínas resultantes se llevan al in­
terior de las mitocondrias.
RETÍCULO ENDOPLÁSMICO: un sitio mayor de síntesis de proteínas
y lípidos
El retículo endoplásmico consiste en vesículas aplanadas, de membrana
única, cuyos compartimientos internos, las cisternas, se conectan entre
sí para form ar conductos a través del citoplasma. Desde los puntos de
vista físico y funcional se divide en dos componentes. El retículo endoplás­
mico rugoso, llamado así porque la superficie está cubierta de ríbosomas
que son más grandes que los que se encuentran en las mitocondrias, en
tanto que el retículo endoplásmico liso carece de cualquier ribosoma ad­
herido. Las proteínas sintetizadas por los ríbosomas que se adhieren al
retículo endoplásmico rugoso cruzan la membrana del retículo endoplás­
m ico y aparecen en el espacio intracisternal. Desde este sitio se trans­
portan a la periferia de la célula, donde se incorporarán a la membrana
plasmática, restaurarán el retículo endoplásmico o se secretarán por
completo de la célula. Muchas proteínas humanas son glucosiladas (tie­
nen residuos de azúcar añadidos a ellas) y este proceso se inicia en el re­
tículo endoplásmico.
APARATO DE GOLGI: la maquinaria para secreción
El complejo de Golgi consiste en vesículas aplanadas, de membrana úni­
ca, con frecuencia apiladas. Las principales funciones del aparato de Gol­
gi comprenden la secreción de productos celulares, como proteínas,
hacia el exterior y la formación de las membranas plasmática y lisosómi-
ca. Vesículas pequeñas surgen en la periferia mediante un proceso de
desprendimiento por pellizcado y algunas de estas vesículas concentran
productos secretorios (vacuolas secretorias). Las glucoproteínas que
llegan del retículo endoplásmico se modifican en forma adicional en el
complejo de Golgi.

Recuadro 3-1. (con tinuació n)
PEROXISOMAS (MICROCUERPOS): especialistas en química peligrosa
Los peroxisomas (microcuerpos) son vesículas pequeñas de membrana
única que contienen una diversidad de enzimas que emplean oxígeno m o­
lecular para oxidar sus sustratos y generar peróxido de hidrógeno. Este úl­
tim o lo utiliza una enzima peroxisómica mayor, catalasa, para oxidar una
gran variedad de compuestos. Las especies de oxígeno reactivo, como
peróxido, y los radicales superóxido son muy tóxicos para las células y
deben guardarse con cuidado extremo.
LISOSOMAS: órganos digestivos intracelulares
Los lisosomas son vesículas pequeñas, delineadas por una membrana,
que contienen enzimas hidrolítícas, como ribonucleasa y fosfatasa. Los li­
sosomas participan en la digestión de materiales que llegan al interior de
la célula por fagocitosis o pinocitosis y ayudan a degradar los componen­
tes celulares después de la muerte de la célula.
MEMBRANA PLASMÁTICA (MEMBRANA CELULAR): confín protector de
la célula
La membrana plasmática está compuesta por una bicapa fosfolípida en
cuyo interior se localizan grupos lípidos hidrofóbicos. Se encuentran en­
tre grupos fosfato hidrofílicos que están en contacto con un ambiente
acuoso polar en ambos lados, el exterior de la célula y el citoplasma. Ade­
más de proporcionar una barrera casi siempre protectora, la membrana
plasmática tiene una diversidad de funciones importantes:
► es selectivamente permeable, regula el transporte de diversos iones
y moléculas pequeñas al interior y el exterior de las células. Contiene
sistemas de transporte activo para diversos iones, com o Na+ , K+ y
Ca2+ , y varios nutrimentos, por ejemplo, glucosa y aminoácidos, así
como diversas enzimas importantes:
► contiene una variedad de proteínas integrales de membrana o proteí­
nas unidas a una cara de la membrana que desempeñan funciones
importantes en el señalamiento intercelular.
CITOSOL: una solución acuosa muy concentrada y estructurada
El cltosol, el componente acuoso del citoplasma, constituye alrededor de
la mitad del volumen de la célula y es el sitio de mayor actividad metabò­
lica, que incluye casi toda la síntesis de proteínas y el metabolismo inter­
Recuadro 3-2. Citoesqueleto; elemento fundamental para el movimiento y la forma celulares, y un armazón
estructural mayor para el transporte intracelular
El citoesqueleto de las células eucariotas es una estructura interna de fila­
mentos proteinicos que proporciona estabilidad, genera la fuerza necesa­
ria para el movimiento y los cambios en la forma de la célula, facilita el
transporte intracelular de organelos y permite la comunicación entre ia
célula y su ambiente. Hay tres tipos de filamentos citoesqueléticos: mi-
crofilamentos de actina, microtúbulos (hechos de tubulina) y filamentos in­
termedios (elaborados con una diversidad de diferentes proteínas, algunas
específicas de tipo celular). Las actinas y las tubulinas se conservaron
bastante durante la evolución. Los microfllamentos y los microtúbulos son
estructuras muy dinámicas y también están polarizados debido a la asime­
tría durante la polimerización de las subunldades de actina y tubulina a par­
tir de las cuales se forman. Por tanto los polímeros crecen por la fijación
de nuevas subunidades en ambos extremos pero a ritmos distintos, lo que re­
sulta en un crecimiento más rápido de la punta denominada extremo plus
( + ) y uno más lento de la terminación que se conoce com o extremo
minus ( - ) . A los filam entos polarizados suelen enlazarse clases espe­
cíficas de proteínas motoras que se mueven de manera constante a lo
largo de ellos en una dirección, impulsados por hidrólisis de ATR
Vi
3.1 ¡ ESTRUCTURA Y DIVERSIDAD DE CÉLULAS 63
mediario. El citosol, que también contiene componentes solubles, está
muy organizado por una serie de filamentos proteínicos que se denomi­
nan en conjunto citoesqueleto y desempeñan una función importante
tanto en el movimiento y la forma de las células como en el transporte in­
tercelular (véase recuadro 3-2).
CILIOS y FLAGELOS: trasladadores y agitadores
Los cilios y los flagelos son estructuras que se extienden desde la mem­
brana plasmática y se emplean para facilitar el movimiento. Los cilios son
estructuras pequeñas que se baten hacia atrás y adelante o giran. Con fre­
cuencia los microorganismos unicelulares se desplazan por el movimiento
coordinado de miles de cilios, pero en animales estas estructuras también
se encuentran en células fijas en las que se usan para desplazar comentes
de líquido. En humanos, los cilios se hallan en células epiteliales que recu­
bren las vías respiratorias (donde impulsan el moco y cualquier partícula de
material contenido en él hacia fuera de los pulmones) y el oviducto (en el que
proporcionan una corriente para desplazar el óvulo hacia el útero). Los cilios
también se hallan en una estructura embrionaria muy pequeña llamada nu­
do (véase sección 3.7.5), donde su rotación produce el movimiento del lí­
quido perinodal a un lado del embrión. Se piensa que este proceso es
Importante en la especificación del eje de izquierda a derecha del embrión
(recuadro 3-7). Los flagelos son estructuras más grandes que se mueven
en forma similar a un látigo. Aunque muchos microorganismos unicelulares
se desplazan por flagelos, a diferencia de los cilios, sólo suele haber uno o
dos por célula. Las únicas células humanas que poseen flagelos son los es­
permatozoos, que los utilizan como un medio de propulsión. Tanto los cilios
como los flagelos están compuestos por haces de filamentos microtubula-
res, con una estructura característica '9 + 2 ' (nueve microtúbulos dobles
externos rodeados por dos microtúbulos únicos en el centro) o una '9 + 0'.
Estas estructuras se unen a corpúsculos basales bajo la membrana plas­
mática, que se originan por la duplicación repetida de centriolos durante la
diferenciación celular (véase recuadro 2.1). El movimiento se produce por el
deslizamiento entre sí de la pareja externa de microtúbulos, que está contro­
lado por la proteína motora dineína. Las deficiencias de dineína en humanos
ocasionan el síndrome de cilios inmóviles, que se caracteriza por infec­
ciones respiratorias recurrentes y defectos de lateralidad, y también cau­
san infertilidad por la Imposibilidad de los óvulos para llegar al útero y la
incapacidad de los espermatozoides para mover sus colas.
Los filamentos de actina (también llamados microfilamentos) pueden dis­
ponerse en haces paralelos o enlazados semejantes a redes. Proporcionan
apoyo mecánico en la forma de fibras para esfuerzo, posibilitan cambios con­
trolados de la forma de la célula (p. e j„ constricciones apicales, constriccio­
nes durante la división celular) y facilitan el movimiento de la célula por
estructuras como filopodios y lamelipodios (extensiones de la célula que le
permiten desplazarse a lo largo de superficies). Los filamentos de actina son
la base de estructuras especiales, como las microvellosidades, las placas de
adherencia y el proceso acrosómico de la cabeza del espermatozoo. Consis­
ten en polímeros helicoidales de dos cadenas de la proteína actina y tienen
un diámetro aproximado de 7 a 8 nm. Interactúan con miembros de la super-
familia miosina de proteínas motoras. Las interacciones entre actina y mio-
sina en las células musculares forman unidades contráctiles que confieren a
las células musculares su potencia de contracción. Las actinas también tie­
nen una función celular más general en las células no musculares, por ejem­
plo, permitir que las membranas se invaginen, como en la endocitosis.
Los microtúbulos son cilindros huecos largos, de unos 25 a 30 nm de diá­
metro, y mucho más rigidos que los filamentos de actina. Están formados
64 CAPÍTULO TRES CÉLULAS Y DESARROLLO
3 - 2 . (C
por el ensamble de una serie de polímeros basados en residuos alternados
de tubulina « y tubulina p. Con los microtübulos se vinculan miembros de
dos superfamilias de proteínas motoras, dineínas y cinesinas, cuya función
consiste en mover elementos particulares a lo largo de los trayectos de los
microtübulos en la célula. Ésta es el modo en que las mitocondrias, los api-
lamientos de Golgi y las vesículas secretorias, por ejemplo, llegan a sus si­
tios apropiados dentro de la célula. Las dineínas y las cinesinas se mueven
a lo largo de los microtübulos en direcciones opuestas.
Por lo general los extremos minus de microtübulos individuales en célu­
las animales convergen en un centro de organización de m icrotübulos
(COMT), que se localiza en una porción del citoplasma adyacente al nú­
cleo. En casi todas las células animales se encuentra un centro único y
ductoras puedan transportarse y un medio para lograr la reproduc­
ción (Wylie, 2000). En términos evolutivos, los animales pueden
considerarse incubadores y facilitadores para el espermatozoo y los
óvulos que permiten que la especie se reproduzca. Aunque en plan­
tas y animales primitivos, las células somáticas ordinarias pueden
dar lugar a células germinales durante toda la vida del organismo, en
casi todos los animales que se conocen a detalle —insectos, nemato-
dos y vertebrados- las células germinales se sitúan aparte muy tem­
prano en el desarrollo, como una línea germinal especializada, y
representan la única fuente de gametos. Las células germinales son
las únicas células del cuerpo capaces de efectuar la meiosis y por
consiguiente son las únicas células que dan lugar a descendientes ha-
ploides que pueden tomar parte en la fecundación. Las células de la
línea germinal en mamíferos se originan a partir de células germi­
nales primordiales (CGP) que en el caso de los humanos surgen du­
rante la segunda semana del desarrollo.
3.1.4 Los organism os m ulticelulares no poseen dos
células que porten la misma secuencia exacta
de DNA
Como se describió en la sección 2 . 1 , el contenido de referencia del
DNA de las células, el valor C, lo proporciona el juego de cromo­
somas haploides (n), como en las células espermatozoo y óvulo. Es­
te valor varía de manera muy amplia para los diferentes organismos
V aso sa n g u ín eo (s e n o s sa n g u ín eo s )
Las plaq uetas
b ro tan del p ro ce so
del m e ga ca riocito
Fig. 3-3. Algunas células se forman por fragmentación o fusión de otras células.
Las plaquetas se forman por gemación de un megacariocito gigante. Carecen de núcleo. Las células musculares se forman por fusión de un gran núme­
ro de células mioblastos.
bien definido de este tipo, que se conoce com o centrosoma. Durante la
división celular, los microtübulos forman el huso m itó tico y los filamen­
tos de los microtübulos se fijan a un ensamble proteínico (el cinetocoro)
localizado en los centrómeros de los cromosomas en duplicación y ase­
guran el movimiento ordenado de los cromosomas hacia las dos células
hijas (recuadro 2-1). Asimismo los microtübulos forman el núcleo de ci­
lios y flagelos que se estudió en el recuadro 3-1.
Los filamentos intermedios tienen 7 a 11 nm de diámetro y una función
principalmente estructural. No están polarizados y no se vinculan con pro­
teínas motoras. Los neurofilamentos (específicos de las células neurales)
y las queratinas (especiales de células epiteliales) son proteínas filam en­
tosas intermedias.
y la falta de una relación directa entre el valor C y la complejidad
biológica se conoce como paradoja del valor C. Por ejemplo, en
tanto que la mayor parte de los mamíferos tiene un tamaño de ge-
noma haploide en los límites de unos 2 500 a 3 500 Mb de DNA,
sorprende un poco encontrar que el contenido de DNA haploide
de una célula humana es sólo 19% del de una cebolla, 4% del de
algunos lirios y apenas 0.5% del de un eucariota unicelular, Amoe-
ba dubia (véase cuadro 3-1 y la base de datos de tamaños del geno-
ma en (http://www.cbs.dtu.dk/databases/DOGS).
En un mismo individuo también se observa una variación consi­
derable en el contenido de DNA como resultado de diferencias en el
número de copias del juego de cromosomas (ploidía). Aunque casi
todas las células somáticas humanas son diploides, existen excepcio­
nes. Como se comenta en el recuadro 3-1, algunas células diferencia­
das terminalmente, como los glóbulos rojos, los queratinocitos y las
plaquetas, carecen de núcleo y se describen como nuliploides. Otras
células son poliploides como resultado de la replicación de DNA sin
división celular (endomitosis) o de la fusión celular. Por ejemplo, la
ploidía de los hepatocitos varía de 2 n a 8 n, la de los cardiomioci-
tos (células de músculo cardiaco) de 4 n a 8 n y la de los megacario-
citos gigantes de la médula ósea de 16 n a 64 n. Las últimas células
originan de modo individual miles de células plaquetarias nuliploides
(fig. 3-3). La poliploidía que se debe a fusión celular ocasiona que al­
gunas células que ocurren de manera natural (p. ej., fibras muscula­
res) tengan múltiples núcleos diploides y formen un sincitio (fig. 3 -3 ).

Cuadro 3-1 Paradoja del valor C : el tamaño del genoma no
se relaciona simplemente con la complejidad del organismo
O rg a n is m o Ta m añ o de l N ú m e ro de
genom a ge n e s
Unicelular
Escherichia coli 4.2 Mb 4 300
Saccharomyces cerevisiae 13 Mb 6 300
Amoeba dubia 670 000 Mb ? 3.1.5 Las células de organismos multicelulares pueden
M ulticelular
Caenorhabditis elegans 95 Mb ca. 20 000
Drosophila melanogaster 165 Mb ca. 13 000
?
Allium cepa (cebolla) 15 000 Mb
Mus musculus 3 000 Mb ca. 30 000
Homo sapiens 3 300 Mb ca. 30 000
El DNA de las células de distintos organismos puede variar mu­
chísimo como resultado de diferencias hereditarias en la secuencia
de DNA (mutaciones). La extensión de las diferencias de secuencia
es en gran parte proporcional a la distancia evolutiva que separa los
dos organismos. Por consiguiente el DNA de una célula humana se
relaciona de modo muy cercano en secuencia con el de una célula
de chimpancé (98 a 99%), pero las divergencias se incrementan en
comparación con las células del ratón, la rana y la mosca de la fruta
respectivamente. El DNA de las células de diferentes individuos de
la misma especie también muestra diferencias mutacionales. Se ob­
serva aproximadamente un cambio en cada 1 000 nucleótidos cuan­
do se compara el DNA de dos humanos no relacionados. Asimismo
existen diferencias en la secuencia de DNA de las células de un in­
dividuo aislado. Tales diferencias pueden originarse en tres formas:
► D iferencias program a das en células especializadas. Los ejem­
plos incluyen las células espermatozoos que tienen un cromo­
soma X o uno Y, y por tanto llevan diferentes juegos de DNA
del cromosoma del sexo así como linfocitos B y T maduros que
experimentan reordenamientos del DNA específicos de célula que
conducen a diferencias de una célula con otra en los tipos de
anticuerpo o receptor de célula T producidos.
► M utación aleatoria e inestabilidad d e l DNA. El DNA de to­
das las células está sujeto de manera constante a daño ambien­
tal, degradación y reparación química, y ello influye en la
precisión de la replicación del DNA. La tasa de error pequeña,
pero importante, significa que en cada ronda de división celu­
lar surgen nuevas mutaciones en la secuencia del DNA. En
consecuencia durante el desarrollo cada célula forma un perfil
único de mutaciones y ningún p a r de células del mismo indivi­
duo tendrá la misma secuencia de DNA precisa. La mayor parte
de estas mutaciones no tiene ningún efecto fenotípico e inclu­
sive las mutaciones que se presentan en genes esenciales tienen
poco efecto en el organismo como conjunto cuando se presen­
tan en células aisladas (a menos que causen proliferación de la
célula, véase cap. 17). Sólo cuando una mutación perjudicial
en la línea germinal, en las células madre o en las células somá­
ticas ocurre temprano en el desarrollo es probable que los efec­
tos se observen a nivel fenotípico.
3.1 I ESTRUCTURA Y DIVERSIDAD DE CÉLULAS 65
► Q uim erism o y colonización. En muy pocas ocasiones un indi­
viduo puede estar representado por dos o más clonas de célu­
las con secuencias de DNA muy diferentes, que reflejan la
fusión temprana de embriones gemelos fraternos en el desarro­
llo o la formación de un embrión de colonias de células deri­
vadas de otro (fig. 4-10). A nivel superficial, tales diferencias se
identifican también cuando un individuo recibió un injerto,
un trasplante o una transfusión.
estudiarse in situ o en cultivo
Con frecuencia los organismos unicelulares pueden estudiarse cul­
tivándolos en un medio que representa su ambiente normal. Como
tal vez sea difícil reproducir el ambiente de una célula individual en
el caso de los organismos multicelulares, las células de estos orga­
nismos pueden estudiarse en su contexto natural entero o en un
ambiente artificial fuera del mismo. Es factible utilizar varios mé­
todos distintos.
► Análisis in situ (como parte del animal original). En los anima­
les más simples, como Caenorhabditis elegans, pueden estudiar­
se con el microscopio células individuales en especímenes vivos
completos. El uso de la proteína fluorescente verde como un
marcador vital (recuadro 20-4) permite realizar estudios in situ
en especímenes vivos de animales más grandes en tanto el teji­
do que se investiga sea ópticamente transparente. Los embrio­
nes de muchos animales (p. ej., Drosophila, pez cebra, ratón)
son transparentes en las etapas tempranas: En especímenes
opacos, quizá sea necesario preparar cortes de tejido después de
tratarlos.
► Como un explante d e tejido. La investigación de la conducta de
explantes de tejidos particulares aislados o en combinación facili­
ta muchos estudios de biología del desarrollo. Tal investigación se
usa para probar el efecto de moléculas del desarrollo particulares
o los efectos inductores ele una población celular en otra (véase sec­
ción 3.4.2).
► Como células prim arias. Un explante tisular puede disociarse,
lo que permite separar células individuales y desarrollarlas de
ese mismo modo en cultivo. Éste no siempre es un método di­
recto ya que quizá sea muy difícil que algunos tipos de células
crezcan y el esfuerzo necesario para conservar las células prima­
rias puede ser considerable.
► Como una línea celu lar estable. A menudo es fácil que una lí­
nea de células estables crezca en cultivo y por tanto puede ex­
pandirse con facilidad y enviarse a investigadores de todo el
mundo. Puesto que las células se distinguen por diversas carac­
terísticas diagnósticas, los investigadores pueden estar seguros
de que los resultados que obtienen de una línea celular son
comparables con los de otras personas que trabajan en alguna
otra parte en la misma línea celular o integrarse a ellos.
Aunque el estudio de explantes tisulares o de células primarias cul­
tivadas tiene muchas ventajas, éstos son difíciles de manejar y re­
presentan un recurso temporal. Ello se debe a que casi todas las
células animales en cultivo pasan por cierto número de divisiones
y a continuación envejecen, dejan de dividirse y se eliminan del ci­
clo celular al entrar al estado latente conocido como Gq (Campi-
si, 1996). El número de rondas de división depende del tipo de
célula, la especie y la edad del organismo de origen. Por ejemplo,
los fibroblastos fetales humanos se dividirán cerca de 60 veces en
66 ¡ CAPÍTULO TRES CÉLULAS Y DESARROLLO

cultivo, en tanto que los fibroblastos obtenidos de un adulto expe­
rimentarán casi la mitad de este número de divisiones. Al parecer
el potencial de división y la longevidad de la especie guardan cier­
ta relación. Por ejemplo, el número de divisiones que los fibroblas­
tos fetales humanos efectúan (alrededor de 60 divisiones, periodo
máximo de vida 120 años) se encuentra entre la cifra lograda por
los fibroblastos fetales de ratones (alrededor de 15 divisiones, perio­
do de vida máximo tres años) y los fibroblastos fetales de la tortu­
ga gigante Galapagos (alrededor de 125 divisiones, periodo de vida
máximo 175 años).
Las limitaciones de las células primarias pueden superarse me­
diante el establecimiento de una línea celular permanente que se di­
vidirá en forma indefinida en cultivo. Se establecieron muchas líneas
celulares de explantes de tumores que ya habían perdido ciertas res­
tricciones del crecimiento. Por ejemplo, la línea celular HeLa que se
utiliza con amplitud se derivó de un tumor cervical extirpado a una
paciente llamada Henrietta Lacks en 1995. El problema con las lí­
neas celulares de tejidos tumorales es que a menudo tienen carioti-
pos muy distintos en comparación con los del tejido original del que
se obtuvieron, lo que da por resultado diferencias fenotípicas que se
tornan más pronunciadas con el número creciente de pasos. Tam­
bién es posible obtener líneas celulares de células primarias hacien­
do que sufran transformación del crecimiento (inmortalización) en
cultivos. Este proceso, que es análogo a la pérdida de restricciones
del crecimiento que se observa en tumores, puede ocurrir de modo
espontáneo por mutaciones adquiridas o inducirse mediante radia­
ción, mutágenos químicos o virus de transformación. En fecha más
reciente se establecieron líneas celulares mediante la transfección de
células primarias con secuencias particulares de DNA que son on-
cógenas. Se conservan miles de líneas celulares, que representan di­
ferentes tejidos humanos y de animales, en bancos de células como
la American Type Culture Collection (ATCC), la European Collec-
tion of Cell Cultures (ECACC) y la Interlab Cell Line Collection
(ICLC) (véase cuadro 3-2; Stacey y Doyle, 2000).
Una aplicación importante de las líneas celulares es la conserva­
ción de recursos genéticos renovables de pacientes humanos par­
ticulares. Esto se requiere para diversos procedimientos: desde el
control de calidad en laboratorios que tipifican tejido hasta el aná­
lisis de enlace y el mapeo basado en marcadores. En este caso el fe­
notipo de la célula no es importante pero el genotipo debe
conservarse con precisión. Uno de los medios más directos para lo­
grarlo es hacer líneas de células linfoblastoides mediante transfor­
mación con virus Epstein-Barr (EBV), que permanece episóm ico
(no integrado) y en consecuencia no altera el genoma endógeno.
Los linfocitos B humanos tienen un receptor para EBY y una vez
que se infectan pueden inmortalizarse con una tasa alta de éxito pa­
ra producir una línea celular que es posible propagar en forma in­
definida en el cultivo (o criopreservarse para necesidades futuras).

Cuadro 3-2. Ejemplos de líneas celulares humanas y sus usos

Código ATCC Línea celular Orígenes y aplicaciones

Líneas celulares linfoides

CCL123 DAU0I Línea de células B, derivadas del linfoma de Burkitt, se utiliza en estudios de cáncer

CRL1432 NAMALWA Línea de células B, derivadas del linfoma de Burkitt, se usa para elaborar interferones

TIB152 JURKAT E61 Línea de células T, derivadas de la leucemia linfoblástica aguda, produce grandes cantidades
de interleucina-2

CRL1942 SUP-T1 Línea de células T, derivadas de la leucemia linfoblástica T, apoya la replicación del VIH

Líneas celulares mieloides

CCL240 HL-60 Derivada de células de leucemia promielocíticas, se emplea para estudiar la diferenciación
del linaje mieloide

TIB202 THP Derivada de leucemia monocítica aguda, se utiliza para estudiar la activación y la maduración
de macrófagos

Líneas celulares renales

CRL1573 293 Células de riñón fetal transformadas por adenovirus, se usan para estudiar los adenovirus

CRL2190 HK-2 Línea de células tubulares proximales transformadas con genes E6/E7 de virus del papiloma
humano, se emplea como sistema modelo para estudios del túbulo proximal

Líneas celulares hepáticas

HB8064 Hep3B Produce muchas proteínas del plasma

HTB52 SK-HEP-1 Se deriva del adenocarcinoma hepático, induce tumores en el ratón desnudo

Líneas celulares ováricas

HTB75 Caov-3 De adenocarcinoma del ovario, produce el mutante p53, se utiliza en estudios de citocinas y cáncer

CRL1572 PA/1 De teratoma del ovario, se usa en estudios del desarrollo y pruebas de fármacos
 3.2 I INTERACCIONES CELULARES 67

3.2 In teracciones celulares
3.2.1 La comunicación entre células incluye la
percepción de moléculas de señalamiento
por receptores específicos
La supervivencia y la reproducción de células individuales en un or­
ganismo multicelular está subordinada a la supervivencia y la re­
producción del organismo como un todo. Las células somáticas
deben cooperar entre sí en beneficio del organismo. Por esta razón
las células de un organismo multicelular necesitan comunicarse a
fin de coordinar y regular funciones fisiológicas y bioquímicas. La
comunicación celular se basa en la producción de moléculas de se­
ñalamiento por una población de células y su reconocimiento por
los receptores que suelen encontrarse en la superficie de las células
correspondientes (cuadro 3-3). Las células animales se cubren po­
sitivamente en abundancia con receptores para moléculas de señala­
miento y estos receptores están conectados con vías de transducción
de señal internas que permiten regular la actividad del factor de
transcripción y por último alterar patrones de expresión génica
(véase Twyman 2001 para una revisión general).
El señalamiento entre las células puede realizarse en diferentes
extensiones. Casi todas las personas están familiarizadas con el con­
cepto de señalamiento endocrino, en el que una hormona liberada
de una glándula endocrina en una parte del cuerpo llega a una po­
blación distante de células blanco a través del torrente sanguíneo.
El señalamiento endocrino es importante para conservar la ho­
meostasis y también tiene una función destacada en el desarrollo
ulterior, una vez que el sistema vascular se establece. Sin embargo,
en el desarrollo temprano las señales más importantes viajan distan­
cias cortas. El señalamiento paracrino comprende la liberación de
una molécula de señalamiento de una población de células y la di­
fusión de dicha molécula por una distancia corta a las células que
responden. El señalamiento yuxtracrino se basa en la interacción
de células vecinas y suele reflejar el hecho de que la señal produci­
da por una célula permanece fijada a la membrana plasmática. Las
células también responden a moléculas que se encuentran en su
ambiente inmediato, la matriz extracelular (sección 3.2.4).

Cuadro 3-3 Clases importantes de moléculas de señalamiento y sus receptores

Receptor Ejemplos

SEÑALES SECRETADAS

Diversas (péptidos, proteínas, moléculas
orgánicas pequeñas, estímulos físicos)
Receptor acoplado a proteína G
Polipéptldo único. La región hidrofóbica central
form a un dominio transmembrana de siete pasos,
el dominio terminal N enlaza el ligando, el dominio
terminal C interno se vincula con una proteína
de enlace de nucleótido de guanidina
Receptores de adrenalina, serotonina,
glucagon, hormona estimulante del folículo,
histamina, opioides y neurocininas. También
receptores olfatorios, del gusto y del receptor
visual rodopsina

Factores de crecimiento, efrinas Receptor de cinasa de tirosina Receptores de Insulina, factores de

Dimérico; dominio de enlace de ligando de crecimiento de fibroblastos y de crecimiento
la terminal N, dominio de cinasa interno, epidérmico, efrinas
atraviesa la membrana una vez

Citocinas Receptores con actividad relacionada de cinasa
de tirosina
Oligoméricos; dominio de enlace de ligando
de la terminal N, dominio interno vinculado con
cinasa Janus (JAK)
Receptores de hormona del crecimiento,
prolactina, eritropoyetina, factores estimulantes
de colonias, interleucinas, interferones

Familia del factor de transformación
del crecimiento p
Receptores con actividad relacionada de cinasa de Receptores de proteínas TGF-p y morfogenéticas
serina/treonina óseas, Nodal, factor neurotrófico derivado glial
Oligoméricos; dominio de enlace de ligando
de la terminal N, dominio Interno vinculado
con proteínas SMAD

Familia hedgehog En placas Receptores para Sonic e Indlan hedgehog

en el desarrollo de mamíferos

Familia Wnt Rizado Receptores para proteínas de la familia Wnt

en el desarrollo de mamíferos

Hormonas esteroides, retinoides Receptores nucleares Receptores para hormonas esteroides

Diméricos; residen en el citoplasma o el núcleo, y tiroideas, vitamina D, ácido retinoico
se convierten en factores de transcripción
en relación con ligando

SEÑALES FIJAS

Familia delta/Serrate Escotadura Delta y Serrate en el desarrollo neural

68 CAPÍTULO TRES CÉLULAS Y DESARROLLO
3.2.2 Receptores activados inician vías de transducción
de señal que pueden incluir cascadas enzimáticas o
segundos mensajeros y dar por resultado activación
o inhibición de factores de transcripción
Una vez que el receptor de una proteína de señalamiento particu­
lar se activa, se desata una cadena de acontecimientos cuyo último
resultado es un cambio del patrón de actividad gènica en la célula
que responde. El número y la naturaleza de uniones en la cadena
depende de la molécula de señalamiento particular relacionada.
Tanto las hormonas esteroides y tiroideas como el ácido retinoico
que regula el desarrollo son capaces de difundirse a través de la
membrana plasmática, de tal manera que sus receptores se localizan
en el interior de la célula. Tras unirse a sus ligandos, estos recepto­
res actúan de manera directa como factores de transcripción a fin
de modular la expresión de genes corriente abajo. Por tanto las mo­
léculas similares a esteroides utilizan una vía de transducción de se­
ñal de un paso (Tsai y O’Malley, 1994).
Casi todas las otras moléculas de señalamiento permanecen fue­
ra de la célula y se enlazan a receptores transmembrana. El enlace
del ligando al dominio extracelular del receptor ocasiona un cam­
bio de conformación en el dominio interno que suele estimular una
actividad enzimàtica latente. En el caso de las cinasas de receptor,
este cambio de conformación estimula una actividad de cinasa que
Ligando
Ì pendiente de cAMP y la cinasa de proteína C dependiente de
/\/> 'V v/V/
Fig. 3-4. Los receptores de citocina son diméricos u oiigoméricos,
con cada polipéptido atravesando la membrana una vez.
Los receptores no poseen actividad de cinasa de tirosina intrínseca,
pero se relacionan de manera constitutiva con cinasas de tirosina
citoplásmicas de la familia Janus (cinasas Janus, JAK). El enlace de
ligando causa la dimerización de los receptores. Esto resulta en
autotransfosforilación recíproca de las JAK vinculadas, que se tornan
activas y fosforilan el receptor en sí mismo. A continuación el receptor
es capaz de incorporar factores de transcripción inactivos llamados
STAT (transductores de señal y activadores de transcripción) que se
unen a residuos de fosfotirosina mediante sus dominios SH2. Después
los STAT son fosforilados por las JAK, lo que les permite dimerizarse y
translocarse hacia el núcleo, donde activan genes corriente abajo.
Redibujado de Twyman (2001) Instant Notes in Developmental Biology,
publicado por BIOS Scientific Publishers.
es integral para el receptor o para una proteína que se relaciona con
el mismo. Ello causa que el receptor se fosforile en sí mismo prime­
ro y a continuación permite que fosforile otras proteínas dentro de
la célula y en consecuencia las active. Estas proteínas blanco suelen
ser cinasas en sí mismas, que en seguida fosforilan proteínas co­
rriente más abajo. Al final esta cascada de actividad de cinasa llega
a un factor de transcripción, que se activa o inhibe según sea apro­
piado y que produce un cambio en la expresión génica. En algunos
casos esta cascada de señalamiento es corta (p. ej., la vía JAK-STAT
regulada por citocina; Pellegrini y Dusanter-Fourt, 1997; Hou y
cois., 2002; fig. 3-4), en tanto que en otros puede contener muchos
pasos (como la vía de cinasa MAP regulada por factor de creci­
miento; Robinson y Cobb, 1997; fig. 3-5).
La transducción de señal en receptores acoplados a la proteína
G se efectúa por la activación de segundos mensajeros (moléculas
pequeñas, como cAMP, calcio y lípidos). El enlace del ligando oca­
siona que la proteína de enlace de nucleótido de guanidina (proteí­
na G) relacionada con el receptor intercambie GDP por GTP, que
da lugar a que se disocie en unidades a y fS-7 . A continuación ca­
da una de estas unidades puede interactuar con proteínas corriente
abajo con objeto de regular los niveles de segundo mensajero
(Bourne, 1997). Según el tipo particular de proteína G presente, el
enlace del ligando puede estimular o inhibir la enzima ciclasa de
adenilato, lo que resulta en un cambio en los niveles de cAMP in-
tracelular (Houslay y Milligan, 1997). Otras proteínas G estimulan
la producción de lípidos, como 1,4,5 trifosfato de inositol y diacil-
glicerol (Speigel y cois., 1996), o la liberación de iones de calcio
(Clapham, 1995). Los segundos mensajeros activan a su vez cina­
sas de proteína corriente abajo, como la cinasa de proteína A de­
calcio, que se fosforilan y en consecuencia modifican la actividad
de factores de transcripción particulares.
Las vías de señalamiento comentadas sostienen una plática cru­
zada extensa. Por ejemplo, tanto la cinasa de proteína A como la ci­
nasa de proteína C interactúan con la vía de cinasa MAP, las cinasas
del receptor de tirosina pueden estimular la vía JAK-STAT e influir
los niveles de segundos mensajeros, y los receptores de citocina sue­
len influir la actividad Ras. La respuesta que una célula particular
produce depende de la suma de todos los señalamientos que llegan
a su superficie y de los receptores y componentes de señalamiento
específicos que se presentan.
3.2.3 La organización de las células para formar tejidos
requiere adherencia celular
Las células se organizan en tejidos mediante la expresión de mo­
léculas de adherencia (Cunningham, 1995; Gumbiner, 1996). En
esencia las moléculas de adherencia actúan en la misma forma que
cualquiera otra interacción receptor-ligando, aunque en este caso el
receptor y el ligando están fijos a las superficies de células adyacen­
tes y puede haber cientos de miles de estas moléculas por célula pa­
ra asegurar que el enlace sea muy potente. Las células pueden
adherirse entre sí de modo directo, por la expresión de moléculas
de adherencia complementarias en sus superficies, mediante la for­
mación de vínculos con la matriz extracelular, o por ambos proce­
sos. Durante el desarrollo, los cambios en la expresión de moléculas
de adherencia permiten que las células formen y rompan conexio­
nes entre sí, lo que facilita que la migración sea individual o en ho­
jas y produce reordenamientos a gran escala (McNeil, 2000; Irvine
y Rauskolb, 2001). En el organismo maduro las interacciones de
 3.2 I INTERACCIONES CELULARES [ 69

Fig. 3-5. Los factores de crecimiento actúan como ligandos para cinasas de tirosina receptoras.
El enlace de ligando estimula la dimerización del receptor e inicia la actividad de cinasa de tirosina citoplásmica intrínseca para el receptor. Luego el
receptor puede fosforilar no sólo otras proteínas sino también a sí mism o (autotransfosforilación) y ocasionar la incorporación de proteínas que se
enlazan en forma específica a residuos de fosfotirosina, inclusive enzimas que modulan la actividad de Ras. Los Ras activados incorporan Raf a la
membrana donde se estimula su actividad de cinasa. En seguida Raf activa MEK, que a su vez activa la cinasa MAR Tanto MEK como la cinasa MAP
activan factores de transcripción latentes y por tanto cambian los patrones de expresión en el núcleo. Redibujado de Twyman (2001), Instant Notes
Developmental Biology, publicado por BIOS Scientific Publishers.

i. Uniones celulares
Uniones adherentes Uniones de anclaje en las que los filamentos de actina del citoesqueleto se conectan con caderinas en la superficie celular
y por tanto unen células vecinas en un cinturón continuo de adherencia

Desmosomas Uniones de anclaje en las que los filamentos intermedios del citoesqueleto se conectan con caderinas en la superficie celular

Contactos focales Uniones de anclaje en las que los filamentos de actina del citoesqueleto se conectan con integrinas en la superficie celular
y proporcionan sitios de fijación punteados a la matriz extracelular

Hemidesmosomas Uniones de anclaje en las que los filamentos intermedios del citoesqueleto se conectan con integrinas en la superficie
celular, se utilizan para conectar células epiteliales con la lámina basal

Uniones comunicantes Son poros que conectan el cltosol de células adyacentes. Están formados por seis proteínas conexina idénticas que forman
un canal en cada membrana. La fijación de complejos de conexina en células adyacentes crea la unión comunicante

Uniones estrechas Proteínas transmembrana interconectadas que sellan células epiteliales en una hoja continua. Según la densidad de las
proteínas en la unión, la barrera puede ser por completo impermeable o selectivamente permeable a moléculas de un
tamaño particular
70 | CAPÍTULO TRES CÉLULAS Y DESARROLLO
adherencia entre las células suelen reforzarse por la formación de
regiones de contacto especializadas que se conocen como uniones
celulares (Steinberg y McNutt, 1999; Pérez-Moreno y cois., 2003;
cuadro 3-4).
Las principales clases de moléculas de adherencia celular son
cuatro (Humphries y Newham, 1998; Hynes, 2002):
► Caderinas. Son proteínas de adherencia transmembrana depen­
dientes de calcio que reconocen caderinas idénticas en la super­
ficie de otras células y se enlazan con ellas. El proceso de enlace
con moléculas idénticas se conoce como enlace homofílico. En
los mamíferos se encuentran alrededor de 30 caderinas distin­
tas, las más importantes de las cuales son la caderina E (que se
restringe sobre todo a células epiteliales) y la caderina (que se
expresa de manera predominante en el sistema nervioso).
► CAM-lg. Son moléculas de adherencia transmembrana inde­
pendientes del calcio que tiene una similitud estructural con la
familia de las inmunoglobulinas (Ig). Por ejemplo, la molécula
de adherencia d e células neurales (NCAM) se expresa en el siste­
ma nervioso y en las somitas en desarrollo.
► Integrinas. Son moléculas de adherencia dependientes de cal­
cio que suelen mediar interacciones entre la célula y la matriz
(véase más adelante), pero ciertas integrinas de leucocitos tam­
bién participan en la adherencia intercelular.
► Selectinas. Estas moléculas las expresan células endoteliales du­
rante una respuesta inflamatoria. Reconocen residuos de car­
bohidratos en la superficie de los neutrófilos y guían estas
células a los sitios de inflamación.
3.2.4 La matriz extracelular proporciona una estructura
central para todos los tejidos del cuerpo y también
es una fuente importante de señales que controlan
la conducta celular
Los espacios entre las células del cuerpo están vacíos. El espacio extra-
celular está lleno de una estructura tridimensional de fibras proteí-
nicas embebidas en un gel de carbohidratos complejos llamados
glucosaminoglucanos. Este material, el material extracelular (MEC),
tiene una composición variable según los materiales que las células
locales secreten hacia su ambiente inmediato. Las células también
influyen en la estructura del MEC mediante la secreción de enzi­
mas modificadoras, como proteasas, y esto puede influir en la con­
ducta celular (Streuli, 1999). A su vez el MEC proporciona una
estructura central que desempeña una función esencial en la con­
servación de la integridad tisular y guía la conducta de la célula du­
rante el desarrollo al interactuar con receptores que abarcan la
membrana (Giancotti y Ruoslahti, 1999; Bokel y Brown, 2002).
Los componentes del MEC pueden dividirse en varios grupos
(véase cuadro 3-5):
► proteínas estructurales, como colágenas y elastinas;
► proteínas de adherencia, por ejemplo, lamininas y fibronectinas;
► proteoglucanos, que comprenden una proteína central relaciona­
da con varios glucosaminoglucanos. Los proteoglucanos difie­
ren de las glucoproteínas porque los residuos de azúcar en los
primeros representan hasta 95% del peso total de la molécula;
► el glucosaminoglucano libre, ácido hialurónico.
Las proteínas estructurales y de adherencia de la MEC tienen una
participación importante en la determinación de su función. Por
ejemplo, los tejidos ricos en colágena son muy fuertes (como los
tendones), en tanto que los tejidos ricos en elastina son muy elásti­
cos (p. ej., los vasos sanguíneos). Las proteínas de la MEC interac-
túan con las células por medio de receptores transmembrana
llamados integrinas. Éstas se unen a proteínas de la MEC en el ex­
terior de la célula y a microfilamentos de actina en el interior me­
diante proteínas en puente, como la talina y la actinina alfa. Tales
interacciones permiten que las células se muevan al contraer los fi­
lamentos de actina contra la estructura fija en el material extracelu­
lar (MEC). Asimismo está demostrado que las integrinas activan las
vías internas de señalamiento, lo que sugiere que la MEC puede in­
fluir en la expresión génica dentro de la célula y por tanto modifi­
car la conducta celular en respuesta a componentes específicos del
material extracelular (MEC). Un ejemplo importante de la función
del MEC en la conducta de las células es la conservación de la po­
laridad celular por medio de la lámina basal (para más ejemplos,
véase Dustin, 2002). En el epitelio intestinal, la presencia de la lá­
mina basal en Un lado de la monocapa celular tiene a su cargo el es­
tablecimiento y la conservación de una superficie basal plana
adyacente al tejido conjuntivo y una superficie apical caracterizada
por un borde en cepillo.
Los componentes proteoglucano y glucosaminoglucano de la
MEC realizan varias funciones. Primero, las moléculas son muy so­
lubles y forman geles hidratados que actúan como amortiguadores
para proteger los tejidos contra compresiones. El tejido es muy re­
sistente a la compresión (p. ej., cartílago) en los sitios en que el con­
tenido de proteoglucano de la MEC es en particular alto. Los
proteoglucanos pueden formar superestructuras complejas en las
que moléculas de proteoglucano individuales están dispuestas alre­
dedor de estructuras básicas de ácido hialurónico. Estos complejos
actúan como reservorios biológicos al almacenar moléculas activas,
por ejemplo, factores de crecimiento. De hecho es posible que los
proteoglucanos sean esenciales para la difusión de ciertas moléculas
de señalamiento. Por ejemplo, las vías de señalamiento Hedgehog
y Wingless se inhiben en el mutante Drosophila sugarless, que es in­
capaz de sintetizar de modo correcto proteoglucanos (véase Selleck,
2000). Por último los proteoglucanos también ayudan a mediar la
adherencia entre la célula y la matriz. Ello se logra mediante el en­
lace con enzimas en la superficie celular conocidas como glucosil-
transferasas, cuya función consiste en añadir residuos de azúcar a
los grupos de carbohidratos. Cuando no hay azúcar libre, la enzi­
ma mantiene la cadena de carbohidratos. Cuando se dispone de
azúcar, la reacción se completa y la cadena de carbohidratos se libe­
ra. Estos ciclos de adherencia y liberación pueden tener importan­
cia particular en el control de la migración celular.
3.3 G eneralidades del desarrollo
El término desarrollo, como se aplica a los animales, se refiere a un
proceso por el que una célula aislada origina un organismo maduro.
A menudo es conveniente dividir el desarrollo animal en una etapa
embrionaria, durante la cual se establecen todos los principales siste­
mas orgánicos, y una posembrionaria que (en el caso de los mamífe­
ros) consiste sobre todo en crecimiento y refinamiento. Los biólogos
del desarrollo tienden a concentrarse en la etapa embrionaria porque
es ésta en la que ocurren los acontecimientos más excitantes y dramá­
ticos, pero esto no disminuye la importancia del desarrollo posem-
brionario. Aún no se aclara cuándo se detiene el desarrollo una vez
que el plan básico del cuerpo se establece. Los humanos experimen­
tan un continuo de crecimiento y consolidación posembrionarios
 3.3 GENERALIDADES DEL DESARROLLO 71

Cuadro 3 ' Componentes moleculares de la matriz extracelular

Componente Distribución Estructura/función

Colágenas Muchos tejidos Las colágenas son glucoprotreínas triméricas grandes. Existen varias formas de
colágena químicamente distintas cuya abundancia varía en diferentes tejidos. Las
formas más abundantes son las colágenas I, II y III, que tienden a form ar fibrillas
estabilizadas mediante enlaces cruzados entre residuos de lisina. Brindan apoyo
estructural e influyen en la diferenciación y la migración celulares por medio de
interacciones con integrinas. En contraste, la colágena IV forma enrejados más que
fibrillas y es un componente importante de la lámina basal. Interactúa de manera
indirecta con células, mediante el vínculo con laminina

Fibronectina Muchos tejidos La fibronectina es una glucoproteína dimérica cuya principal función es facilitar la
adherencia entre célula y matriz. Las fibronectinas tienen dominios de enlace
de colágena y heparina que ayudan a organizar el MEC. Las fibronectinas interactúan
con células por medio de integrinas e influyen en la forma, el movimiento y la
diferenciación celulares

Lamininas Tejidos epiteliales Las lamininas son proteínas triméricas que comprenden las subunldades A, B1 y
B2. Interactúan con la colágena IV para form ar la lámina basal y su principal función
es facilitar la adherencia de las células a la lámina basal al interactuar con integrinas
y otras moléculas de la superficie celular. Hay muchas formas específicas de tejidos
de cada subunidad de laminina

Entactina Tejidos epiteliales Se relaciona estoiquiométricamente con laminina y contiene secuencias que pueden
permitir interacciones con Integrinas de la superficie celular

Elastina Muchos tejidos, pero
abundantes en vasos
sanguíneos, piel y otras
estructuras que se estiran
y deforman
La elastina es una proteína no glucosilada que forma redes y hojas por enlace
cruzado. La proteína tiene un retroceso elástico natural y confiere a los tejidos
la capacidad de recuperar su form a después de deformarse

Tenasclna Embrión, sistema nervioso La tenascina es una glucoproteína hexamérica que desempeña una función importante
adulto en el control de la migración celular. Posee efecto adhesivo en algunas células y
repelente en otras según los receptores que se encuentran en la superficie celular

Vitronectina Sangre y otros tejidos Esta proteína suele vincularse con la fibronectina, aunque no se distribuye de manera
tan amplia, e Interactúa con clases particulares de integrinas para facilitar la adherencia
entre célula y matriz

Proteoglucanos Muchos tejidos Familia muy diversa de moléculas que comprende una proteína de centro, como
decorina o sindecán, relacionada con uno o más glucosaminoglucanos (p. ej.,
sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, heparina, sulfato de heparán). A
menudo adopta una estructura de mayor orden en el material extracelular (MEC).
Estas moléculas median la adherencia celular y también pueden enlazar factores de
crecimiento y otras moléculas bloactivas

Acido hialurónico Muchos tejidos El único glucosaminoglucano no sulfatado y no unido de modo covalente a una
proteína para form ar un proteoglucano. Facilita la migración celular en particular
durante el desarrollo y la reparación de tejidos

que inicia en el nacimiento y transcurre hasta por dos decenios pos­
teriores, con algunos órganos que llegan a la madurez antes que
otros. Podría argumentarse que el desarrollo humano cesa cuando el
individuo se torna maduro sexualmente, pero muchos tejidos nece­
sitan restituirse durante toda la vida (p. ej., piel, sangre, epitelio in­
testinal) y en estos casos el desarrollo nunca se detiene del todo, sólo
llega a un equilibrio. Algunos científicos consideran inclusive el en­
vejecimiento como una parte del desarrollo puesto que representa
una parte natural del ciclo de vida.
El desarrollo es un proceso gradual. El óvulo fecundado origina
primero un embrión simple con características relativamente grue­
sas. Conforme el desarrollo prosigue, el número de tipos de células
aumenta y la organización de estas últimas se toma más compleja.
La complejidad se adquiere de manera progresiva. A nivel molecu­
lar, el desarrollo incorpora varios procesos distintos que afectan la
conducta de las células. Estos procesos están interrelacionados y
pueden ocurrir por separado o en combinación en diferentes par­
tes del embrión (Twyman, 2 0 0 1 ):
► proliferación celular, por la división repetida de las células, que
conduce a un incremento de su número. En el organismo ma­
duro, ésta se equilibra por la pérdida celular;
► crecimiento, por la síntesis de macromoléculas, que conduce a
un aumento del tamaño y la biomasa totales;
► diferenciación, el proceso por el que las células se toman espe­
cializadas desde los puntos de vista estructural y funcional;
72 j CAPÍTULO TRES j CÉLULAS Y DESARROLLO
► formación de patrón, el proceso mediante el cual se organizan
las células, primero para formar el plan del cuerpo fundamen­
tal del organismo y luego las estructuras detalladas de diferen­
tes órganos y tejidos;
► morfogénesis, o cambios en la forma total. En la morfogénesis
pueden participar varios mecanismos subyacentes, que incluyen
proliferación celular diferencial, adherencia selectiva intercelu­
lar o adherencia entre célula y matriz, cambios en la forma y el
tamaño de las células, uso selectivo de la muerte celular progra­
mada y control de la simetría y el plano de la división celular.
Todos los procesos anteriores están controlados por genes, que espe­
cifican dónde y cuándo se sintetizan proteínas particulares en el em­
brión y por tanto la forma en que las distintas células se comportan.
Si bien un organismo multicelular presenta diferencias menores en
la secuencia de DNA entre las células, la mayor parte de ellas con­
tiene cuando menos los mismos genes. Por consiguiente, para que
las células en el embrión en desarrollo se diversifiquen debe haber
una expresión génica diferencial. Puesto que la expresión génica está
controlada por factores de transcripción, el desarrollo depende final­
mente de los factores de transcripción que se activan en cada célula
(véase, p. ej., Kuo y cois., 1992). Como se señaló en la sección 3.2.2,
la actividad de los factores de transcripción puede regularse por se­
ñalamiento entre las células. Un objetivo mayor de la investigación
biomédica es descubrir las vías de señalamiento y los programas re­
guladores que controlan el desarrollo. Este capítulo se dirigirá al de­
sarrollo de vertebrados y en especial de mamíferos. El conocimiento
del desarrollo inicial del humano es fragmentario porque el acceso a
La investigación de! desarrollo se dirigió a un número hasta cierto punto
pequeño de organismos modelo, que se consideran representativos de
las principales divisiones taxonómicas de la vida multicelular. Algunos de
estos organismos se eligieron al principio por la facilidad con que podrían
obtenerse y reproducirse en cautividad, en tanto que otros se selecciona­
ron por las ventajas experimentales específicas que ofrecían. El estudio de
estos organismos demostró que los genes del desarrollo, y de hecho to­
das las vias reguladoras, están muy conservados. Han sido instrumenta­
les en la identificación y la caracterización de los genes humanos que
participan en el desarrollo. La importancia de estas especies com o m o­
delos experimentales la indica su precedencia entre los proyectos del ge-
noma que se planean o se encuentran en curso (recuadro 8.8).
INVERTEBRADOS
Los principales modelos invertebrados son la mosca de la fruta (Drosop­
hila melanogaster) y el nematodo (Caenorhabditis elegans). Estos dos
organismos son genéticamente accesibles y por consiguiente adecuados
para la selección de mutaciones a gran escala y el análisis y la manipula­
ción genéticas. Los embriones de ambas especies (y también los gusa­
nos adultos) son transparentes y factibles de manipulaciones quirúrgicas.
Drosophila fue el primer modelo animal que se estudió con detalle a nivel
molecular y muchos de los mecanismos moleculares que sustentan el
desarrollo embrionario temprano se establecieron en esta especie. Dro­
sophila también proporciona modelos con utilidad particular de neurogé-
nesis y desarrollo del ojo. Caenorhabditis es notable por su programa
estereotipado de desarrollo que se caracteriza por un linaje celular casi in­
variable y la disponibilidad de un diagrama completo de conexiones del
sistema nervioso. Los mutantes de linaje constituyen un medio útil para
estudiar ia memoria celular en el desarrollo. La vulva del nematodo es un
modelo bien establecido de organogénesis. Otros modelos de Invertebra­
dos Incluyen moluscos, ascidianos (tunicados) y anélidos.
muestras para estudio suele restringirse por razones éticas o prácti­
cas. Como resultado gran parte de la información disponible se de­
riva de modelos animales del desarrollo (véase recuadro 3-3).
3 .4 Especialización de las células
durante el desarrollo
3.4.1 La especialización celular incluye una serie
irreversible de decisiones jerárquicas
El desarrollo es comparable con una corriente que desciende por un
lado de una montaña, con las células individuales representadas por
hojas que fluyen con el agua (fig. 3-6). El curso del agua puede ra­
mificarse muchas veces antes de llegar al fondo, pero una hoja sólo
puede seguir una vía. Conforme se aproxima a un punto de rami­
ficación, la hoja debe comprometerse con una vía u otra. Una vez
que la decisión se toma, la hoja ya no puede retroceder y elegir una
vía diferente. La decisión es irreversible.
Después de la fecundación, las primeras divisiones celulares que
el cigoto de mamíferos experimenta son simétricas y originan células
hijas con el mismo potencial (o potencia) de desarrollo. El cigoto y
sus descendientes inmediatos no son especializados; se dice que son
totipotentes porque cada célula retiene la capacidad para diferenciar­
se en todas las posibles células del organismo, inclusive las membra­
nas extraembrionarias. Esto es análogo a una hoja al inicio de su
trayecto en la montaña. A medida que el desarrollo procede, las cé­
lulas se tornan más especializadas y a la vez más restringidas en su ca-
VERTEBRADOS
Los organismos modelo vertebrados sirven como modelos representati­
vos del desarrollo humano a los niveles tanto anatómico como molecular.
Se prefieren el pollo doméstico (Gallus gallus) y la rana africana con ga­
rras (Xenopus iaevis) porque ambas especies producen embriones robus­
tos que se desarrollan fuera del cuerpo y pueden manipularse con facilidad.
Sin embargo, estas especies se utilizan poco para análisis genético; en el
caso de X. iaevis, a causa sobre todo del intervalo de generación prolon­
gado y el genoma tetraploide, que dificultan el análisis genético. En fecha
más reciente despertó interés una especie relacionada, X. tropicalis, que
produce embriones más pequeños pero tiene un intervalo de generación
más corto y es diploide. El ratón [Mus musculus) tiene ventajas en térm i­
nos de su accesibilidad genética, su adecuación a manipulaciones genéti­
cas (en particular dirigirse a blancos génicos, lo que permite inactivar
genes específicos; véase cap. 20), y su cercanía con humanos. No obs­
tante, como el embrión debe desarrollarse internamente, resulta difícil
efectuar manipulaciones quirúrgicas. El pez cebra (Danio reiro) combina ia
docilidad con la accesibilidad genéticas y por tanto tal vez sea el más ver­
sátil de los organismos modelo de vertebrados.
Todos los embriones vertebrados pasan por etapas similares del desarro­
llo, inclusive segmentación de un óvulo grande, gastrulación, neurulación,
somitogénesis y formación de yemas de los miembros. Llegan a una eta­
pa filotípica en la que el plan corporal de todos los vertebrados es muy
parecido. A pesar de estas similitudes, las cinco clases de vertebrados
también presentan diferencias mayores entre si, en especial en las etapas
de segmentación y gastrulación, que indican estrategias nutricionales al­
ternativas. Este hecho se explica con mayor amplitud en la sección 3.7.2.
Asim ism o existen diferencias en los métodos que se utilizan para especi­
ficar los ejes embrionarios primarios (sección 3.5.1) y en otros procesos
del desarrollo, com o la determinación del sexo (recuadro 3-9).
 3.4 1 ESPECIALIZACIÓN DE LAS CÉLULAS DURANTE EL DESARROLLO
Fig. 3-6. Las vías de desarrollo pueden imaginarse como corrientes
ramificantes que corren cuesta abajo por el lado de una montaña.
racidad para generar diferentes tipos de descendientes celulares. Las
células son forzadas a tomar decisiones y elegir vías alternativas.
La primera decisión en el embrión de los mamíferos es la elec­
ción entre masa celular interna y trofoblasto. La primera se constitu­
ye en el embrión propiamente dicho y el amnios, en tanto que la
segunda se torna en el corion de la porción embrionaria de la pla­
centa. Las células de la masa celular interna son pluripotentes, es
decir, pueden dar lugar a todas las células del embrión y en conse­
cuencia a un animal completo, pero ya no son capaces de originar
-¿s estructuras extraembrionarias derivadas de un trofoblasto. En
cualquier momento hasta este punto, la potencia de las células em­
brionarias se demuestra por la capacidad del embrión para formar
gemelos (recuadro 3-4).
Las células que se ramificaron hacia el linaje de la masa celular
..-.terna afrontan luego tres elecciones. Pueden escoger uno de los
tres tipos celulares fundamentales del embrión: ectodermo, meso-
dermo o endodermo. A continuación cada una de estas capas ger-
minativas puede dar lugar a una gama específica y limitada de tipos
celulares pero ninguna de ellas es capaz de producir un embrión
completo. Se dice que son multipotentes. Además, una vez que las
;elulas se comprometen a una capa germinativa, por lo general no
c-ieden producir los tipos de células característicos de las otras,
=_nque una prueba reciente sugiere que las células madre podrían
—: ;trar más plasticidad en el desarrollo de lo que se supuso con an­
terioridad (véase sección 3.4.6). Por ejemplo, las células del linaje
ecrodérmico suelen originar epidermis, células de tejido neural o de
k cresta neural, pero por lo regular no pueden dar lugar a células
renales (que se derivan del linaje mesodérmico) ni a células hepáti-
que provienen del linaje endodérmico) (recuadro 3-5). Por úl­
Recuadro .3-4. Gemelación en embriones humanos
- rededor de 1 de cada 200 embarazos humanos origina gemelos. Éstos
son de dos tipos distintos: fraternos (dicigóticos) e idénticos (monocigó-
tícosi Los gemelos fraternos resultan de la fecundación independiente de
dos óvulos y no se relacionan en forma más cercana que cualquiera otro
nermano. Aunque se desarrollan en la misma matriz, los embriones tienen
ru p o s separados e independientes de membranas extraembrionarias. Los
:í~ e lo s idénticos surgen del mism o fenómeno de fecundación y se pro-
:. : e n por la división del embrión en tanto las células son aún totipotentes
: plunpotentes. Las divisiones tempranas, que ocurren durante la etapa de
-o ru la o antes, producen blastocistos separados que originan embriones
r * je ito s por grupos independientes de membranas extraembrionarias.
73
timo, en el fondo de la montaña, surgen las células progenitoras
que sólo dan origen a un tipo aislado de células diferenciadas. És­
tas se describen como unipotentes.
Los libros de texto de histología reconocen más de 200 tipos di­
ferentes de células en el cuerpo humano, que comprenden una va­
riedad amplia de funciones (véase recuadro 3-6). Algunas tienen
una función limitada a un órgano (p. ej., hepatocitos, cardiomioci-
tos), mientras que otras pueden tener funciones más generales, co­
mo los fibroblastos. Algunas células especializadas maduras no se
dividen y se dice que son diferenciadas terminalmente. Otras cé­
lulas se dividen en forma activa y actúan como precursoras de cé­
lulas diferenciadas terminalmente. Estos tipos de células suelen
distinguirse por el sufijo - blasto, como en osteoblastos, condroblas-
tos, mioblastos, etc. En algunos casos las células precursoras tam­
bién son capaces de renovarse por sí mismas y éstas se conocen
como células madre (sección 3.4.3).
3.4.2 La elección entre destinos alternativos puede
depender del linaje o la posición
Una pregunta que los biólogos del desarrollo suelen hacerse es si el
destino de una célula (la gama de tipos de células que puede pro­
ducir) depende de su linaje (es decir, las células de las que se deri­
va) o de su posición (esto es, las células con que se encuentra en
contacto). La posición de una célula parece ser el determinante de
mayor importancia del destino celular en el desarrollo temprano de
los embriones de vertebrados. Con frecuencia los destinos de las cé­
lulas están especificados por señales de células cercanas, un proceso
denominado inducción. La formación de la placa neural en el em­
brión de Xenopus constituye un ejemplo bien caracterizado (Har-
land, 2000; Bainter y cois., 2001; fig. 3-7).
La placa neural proviene del ectodermo de superficie a lo largo de
la línea media dorsal del embrión en tanto que el ectodermo a cada
lado de la línea media da lugar a la epidermis. Sin embargo, al inicio
todo el ectodermo de superficie no está comprometido o es virgen; es
decir, es competente para dar lugar a la epidermis o la placa neural.
La señal para la inducción neural proviene del notocordio, una estruc­
tura mesodérmica que corre a lo largo del eje craneocaudal del em­
brión. Las células ectodérmicas arriba del notocordio reciben señales
que promueven el desarrollo neural, no así el ectodermo circundante.
Sin embargo, si el notocordio se extirpa, entonces todo el ectodermo
forma epidermis. De igual forma, si se injerta una pieza extra de no­
tocordio bajo el ectodermo ventral o lateral (que en condiciones nor­
males formaría epidermis), en lugar de ello forma tejido de la placa
neural. El ectodermo removido de la supuesta región de la placa neu-
Éstos constituyen alrededor de un tercio de los gemelos idénticos. En los
dos tercios restantes, la gemelación ocurre en la etapa de blastoclsto y
comprende la división de la masa celular interna. La naturaleza de la ge­
melación indica la etapa exacta en que la división ocurre y qué tan com ­
pleta es. En casi todos los casos la división se realiza antes del noveno día
de la gestación, que es cuando se forma el amnios. Estos gemelos com ­
parten una misma cavidad coriónica pero están rodeados por amnios in­
dividuales. En una proporción muy pequeña de los embarazos la división
ocurre después del noveno día y los embriones en desarrollo están ence­
rrados dentro de un amnios común. En ocasiones estos gemelos son sia­
meses sea por separación Incompleta o por fusión subsecuente.
74 | CAPÍTULO TRES CÉLULAS Y DESARROLLO

Recuadro 3-S. De dónde provienen los tejidos: jerarquía del desarrollo en mamíferos

Cada tipo de célula humana puede seguirse a través de la jerarquía del de­ según la analogía en la sección 3.4.1. Casi todas las células se derivan
sarrollo hasta el óvulo fecundado. El esquema de la parte inferior mues­ de una de las tres capas germinales primarias y la mayor excepción son
tra las decisiones del desarrollo necesarias para que el óvulo dé lugar a las células germinales primordiales, que se separan del linaje somático
cada uno de estos tipos de células, el viaje de descenso por la montaña antes de la gastrulación.

C igoto
Células
G am etos germ inales I
prim ordiales S eg m entació n E ctoderm o G lándulas
extraem brionario de sudoríparas*
Vejiga urinaria* 4 am nios y corion
U ñas
Gastrulación
Glándulas mamarias*
ENDODERMO Pelo
A lantoides*
H ígado Tráquea,* EPITELIO EXTER N O
bronquios,* E C TO D E R M O ' DEL C U E R P O
Páncreas* pulm ones
T
Tubo digestivo* Cristalino del ojo G lándulas
NOTOCORDtO sebáceas*
Vesícula
Tiroides FARINGE t j auditiva* Epitelio
MESODERMO estom odeal
Fosas
faríngeas* Mecanismo del oído interno
Epitelio bucal
Oído medio,* trompa R eceso Epitelio nasal y
am igdalino* MESODERMO olfatorio y Esmalte de los dientes
de Eustaquio PARAXIL nervio olfatorio
Tim o prim itivo,* Lóbulo anterior
paratiroides* d e la hipófisis
Epitelio
C uerpos proctodeal
V_____ posbranquiales P arte neural
Esqueleto I Raíces de los nervios d e la hipófisis
axil "* Esclerotomas raquídeos motores
Conducto anal* A Médula espinal
Esqueleto Yemas para
ap endicular apéndices M iotom as J )
^ TUBO NEURAL --------------
Músculos de Músculos esqueléticos ^ \
apéndices del tronco R etina* y
nervio óptico Vesículas ópticas i C erebro
C ap a s de tejido < D erm atom as
conjuntivo d e la piel Nervios motores craneales

r
Epididim o, C RESTA N EU R A L
conductos Raíces de los nervios
deferentes Ganglios y nervios raquídeos sensoriales
Divertículo metanéfrico, *■ sensoriales craneales
uréteres, pelvis renal,
túbulos colectores Ganglios en las M é d u la
- raíces raquíde; suprarrenal
Mesonefros,

r~
i ___ MESODERMO dorsales
conductos eferentes IN TE R M E D IO
I D entina
Pronefros G anglios
M etanefros, C ráneo y sim páticos
túbulos renales* -------------------------------- f cartílagos
a h . . i i. . S ^ RM0 M E S É N Q U IM A DE LA | branquiales C ap a s externas

J
Vagina* Oviductos* U tero* LATERAL .. C A B E ZA i
^ Tejido del ojo
Mesodermo extraembrionario Mesodermo conjuntivo
C0JV
de amnios y corion extraembrionario cefálico
del saco vitelino
M e so d erm o som atopleural y la alantoides M úsculos
I
Pleura, pericardio, Mesodermo Corteza de las M esenterios Peritoneo visceral
esplacnopleural

Estrom a o
g ónadas * -
peritoneo

M e sé n q u
f
ím a
V___
suprarrenales

----------------------------
«

%
4 Epim iocardio,
epicardio,
m iocardio
C orazón

Pleura visceral
Tejido hemangioblástico

Tejido conjuntivo y
T
C orpúsculos Endotelio de Endocardio
músculo liso de visceras sanguíneos vasos sanguíneos
’ Indica el origen sólo de partes epiteliales y vasos sanguíneos
 3.4 [ ESPECIALIZACfÓN DE LAS CÉLULAS DURANTE EL DESARROLLO 75

V --------► D

D ¡t*
\k

Epidermis Placa neural Placa neural

Fig. 3-7. Los experimentos de injertos en Xenopus muestran cuándo las células del ectodermo se comprometen con destinos de células epidérmi­
cas y neurales.
En el lado izquierdo, el ectodermo ventral (V) (verde) da lugar a epidermis en tanto que el ectodermo dorsal (D) (rojo) origina la placa neural. A la dere­
cha, si se Injerta ectodermo ventral en el lado dorsal del embrión, éste se reespecifica y es capaz de formar la placa neural. Lo anterior demuestra que
el destino del ectodermo depende de las señales que emanan de otras células en la cercanía de la placa neural, es decir, las células del mesodermo axil.

Recuadro 3-6. Diversidad de células humanas

.... ...................... *................... .
Los libros de texto de histología describen más de 200 tipos de células.
A continuación se ilustra la variedad de tamaño y forma entre algunos ti­
pos de células comunes.
Óvulo y espermatozoo (véase fig. 3-12 para las características y recua­
dro 11.4 para la form a en que se generan a partir de células germinales
primordiales).
Linfocito (fig. 3-9): célula redonda pequeña, de 6 a 8 y,m de diámetro.
Muy poco citoplasma. Por lo general 5 000 por (xm de sangre.
Eritrocito (fig. 3-9): disco bicóncavo plano de 7.2 de diámetro. Los
eritrocitos carecen de núcleo, mitocondrias o ribosomas. El metabolismo
ocurre mediante giucólisis por completo. El periodo de vida es de 120
días. Casi siempre 5 millones por mcl de sangre.
Megacariocito (figs. 3-3 y 3-9): célula grande de la médula ósea de 35 a
150 |xm de diámetro. Núcleo lobulado Irregular que contiene 8 a 32 ge-
nomas, formados por endomitosis. Los megacarlocítos se fragmentan
para form ar miles de plaquetas.
Plaquetas (figs. 3-3 y 3-9): fragmento de 3 a 5 ^ m de citoplasma muy es­
tructurado sin núcleo. Periodo de vida de ocho días. Por lo general 200 000
por p.l de sangre.
Macrófago (fig. 3-9): célula de form a variable que se desplaza por medio
de seudópodos. Especializada para englobar partículas por fagocitosis,
contiene muchos lisosomas para digerirlas. Muchos macrófagos se fu­
sionan alrededor de grandes cuerpos extraños y forman células tisulares
gigantes.
....................
Célula epitelial: células muy adherentes que se unen entre sí para formar
los epitelios con uniones estrechas (desmosomas) entre las células. Al­
gunas células epiteliales están especializadas en transporte de Iones, ab­
sorción o secreción.
Fibroblasto: célula de tejido conjuntivo no especializada capaz de diferen­
ciarse en cartílago, hueso, grasa y células de músculo liso.
Hepatocito: célula polihédrica de 20 a 30 (¿m de diámetro, en ocasiones
muitinucleada. Abundante en mitocondrias y retículo endoplásmico; con­
tiene lisosomas; puede incluir gotitas de lípidos.
Célula de fibra muscular (fig. 3-3): célula muitinucleada formada por la
fusión de mioblastos. Tiene 10 a 100 p.m de diámetro y puede alcanzar
varios centímetros de largo. Los núcleos se sitúan alrededor de la perife­
ria; casi todo el interior está ocupado por miofibrillas de 1 a 2 ^ m , con
muchas mitocondrias entre ellas.
Neurona: tamaño y forma muy variables. Cuerpo celular de 4 a 150 ^ m ;
por lo general muchas dendritas y un axón. Una célula puede tener más
de 100 000 conexiones con otras neuronas. Los axones de células espi­
nales que inervan los pies miden 1 m de largo.
Melanocito (fig. 3-9): célula epitelial con procesos ramificados largos si­
tuada entre queratinocitos y que pasa paquetes de pigmento (melanoso-
mas) al interior de ellos. Por lo general 1 500 por mm 2 de piel (con
independencia del color de la misma).
Queratinocito: los queratinocitos maduros son estructuras similares a es­
camas llenas de queratina y desprovistas de núcleo o cualquier organelo.
76 I CAPITULO TRES [ CÉLULAS Y DESARROLLO

ral del embrión e injertado en alguna otra parte formará epidermis, en
tanto que el ectodermo que se extirpa del lado ventral del embrión y
se injerta arriba del notocordio formará placa neural. Por consiguien­
te, es claro que el destino del ectodermo —epidérmico o neural—de­
pende de la posición de las células y no de su linaje, y al principio es
reversible. En esta etapa se dice que el destino de las células es especi­
ficado, lo que significa que aún puede alterarse si se cambia el ambien­
te de las células. Una vez que transcurre cierto periodo, el destino del
ectodermo se torna fijo y ya no puede alterarse mediante injertos. En
esta etapa se dice que las células son determinadas, o sea, comprome­
tidas de manera irreversible con su destino. Por lo general determina­
ción significa que la célula inició un proceso molecular que conduce
de modo inevitable a diferenciación. En algunos casos esto se debe a
la síntesis de nuevo factor de transcripción y el factor de transcripción
no puede inactivarse. En otros casos puede haber modificaciones de
la cromatina que fijan el patrón de expresión génica en el sitio. Tam­
bién es posible que ocurra pérdida de competencia por inducción. Por
ejemplo, las células ectodérmicas que están comprometidas a transfor­
marse en epidermis pueden dejar de sintetizar el receptor que respon­
de a la señal que proviene del notocordio.
Aunque se cuenta con menos ejemplos del destino de las células es­
pecificado por el linaje en embriones de vertebrados, un caso explícito
es la conducta de las células madre, que se comenta más adelante.
3,4.3 Las células madre son células progenitores
que se renuevan por sí mismas
Inclusive cuando un organismo está desarrollado a plenitud, algu­
nas células —en especial las sanguíneas, las epiteliales en la piel y el
intestino, y las espermáticas—necesitan producirse de manera con­
tinua. Éstas son producto de células precursoras que se renuevan
por sí mismas, o células madre. Las células madre pueden prolife-
rar por división celular simétrica y generar dos células hijas simila­
res. Según se requiera, también pueden someterse a división celular
asimétrica-, una célula hija tiene el mismo tipo de propiedades que
la célula madre original, pero la otra célula hija posee propiedades
alteradas y queda comprometida a producir un linaje de células di­
ferenciadas. El destino de la célula hija comprometida no está in­
fluido por su posición o por las señales de otras células. La decisión
es intrínseca al linaje de la célula madre. Este tipo de especificación
no condicional (autónomo) de los destinos de las células es resulta­
do de la distribución asimétrica de moléculas reguladoras en la di­
visión celular. Por ejemplo, en las células madre neurales se observa
una distribución asimétrica de las proteínas Notch-1 (concentradas
en el polo apical) y las Numb (que se concentran en el polo basal).
La división en el plano de la superficie epitelial ocasiona que estos
determinantes se distribuyan por igual, pero una división en ángu-

Fig. 3-8. El destino de la célula en los descendientes de células madre neurales depende del plano de división celular, que refleja la distribución asi­
métrica de proteínas que abarcan la membrana como Notch y determinantes intracelulares, por ejemplo Numb.

Ocurre división simétrica en el plano del neuroepitelio y da por resultado la distribución uniforme de Notch (círculos verdes) y Numb (triángulos rojos)
entre células hijas. Las divisiones asimétricas perpendiculares al neuroepitelio conducen a la formación de un progenitor neuronal apical y una célula
madre de reemplazo basal.
 3.4 | ESPECIALIZACIÓN DE LAS CÉLULAS DURANTE EL DESARROLLO | 77
CÉLULA MADRE HEMOPOYÉTICA PLURIPOTENTE
A u to rre n o v a c ió n
1
R e p lic a d o r)
e n d o m itó tic a
Y 1r ____ i i t
OOO o o
C é lu la B C é lu la T Plaquetas ■ Basófilo
(trombocitos) Macrofago
L in fo cito s
Fig. 3-9. Compromiso y diferenciación en el linaje de células sanguíneas.
los rectos a la superficie epitelial causa que éstos se segreguen en las
células hijas, que en consecuencia se desarrollan de manera distin­
ta (Kim y Schagat, 1996; fig. 3-8).
Las células sanguíneas son un ejemplo útil de linajes de células
madre. Un tipo de célula único, la célula madre hemopoyética
(CMH), puede dar lugar a todas las células sanguíneas (Morrison y
cois., 1995). Esto se comprobó con claridad mediante la irradiación
de ratones para asegurar la destrucción de la médula ósea y a conti­
nuación injertando CMH purificadas de una cepa distinta de rato­
nes, tras lo cual las células que se produjeron fueron capaces de
diferenciarse y repoblar la sangre. Las CMH son multipotentes pero
los linajes celulares a que dan lugar se tornan cada vez más especiali­
zados y por último producen todas las células hematológicas diferen­
ciadas terminalmente (fig. 3-9).
3.4.4 Se sabe que existe una variedad de células madre
tisulares, pero aún queda mucho por aprender
acerca de ellas
Una célula madre tisular (en ocasiones también descrita como una
célula madre somática) es una célula indiferenciada que se encuen­
1i ir ' f v
<8 > < S > < g > O
Reticulocito
I
Neutrófilo Eosinófilo Eritrocito
Granulocitos
tra entre las células diferenciadas en un tejido u órgano (Verfaile,
2002). Puesto que es una célula madre, puede renovarse por sí mis­
ma y diferenciarse para reproducir los principales tipos de células
especializadas del tejido o el órgano. Por lo general cada tejido po­
see un número muy pequeño de estas células y aunque su origen
preciso se desconoce en gran parte, se piensa que residen en áreas
específicas de cada tejido. En algunos casos pueden permanecer la­
tentes (sin dividirse) durante muchos años hasta que una enferme­
dad o lesión las activa, pero en otras circunstancias en las que es
necesario restituir células con frecuencia (p. ej., para reemplazar cé­
lulas epiteliales de la piel y el intestino) son regularmente activas.
Las primeras células madre de adultos se encontraron en el de­
cenio de 1960 cuando se observó que la médula ósea contenía
cuando menos dos tipos de células madre; células madre bemopoyé-
ticas, que forman todos los tipos sanguíneos, y células d el estroma de
la médula ósea, una población mixta que genera hueso, cartílago,
grasa y tejido conjuntivo fibroso. A partir de entonces se realizaron
algunos descubrimientos sorprendentes y se hizo público que las
células madre cerebrales generan los tres tipos principales de célu­
las del cerebro: las neuronas (células nerviosas) y los astrocitos y oli-
godendrocitos no neuronales.
78 i CAPÍTULO TRES CÉLULAS Y DESARROLLO
Cuadro 3 Ejemplos de células madre adultas
Tipo de célula madre Localización
Células madre hemopoyéticas Médula ósea
Células madre mesenquimatosas Médula ósea
de médula ósea (células estrómicas)
Células madre neurales Cerebro
Células madre de epitelio intestinal Criptas profundas en
el recubrimiento del tubo
digestivo
Células madre epidérmicas Capa basal de la epidermis
Células madre foliculares Base de los folículos pilosos
En la actualidad las publicaciones indican que diversos tejidos
adultos contienen células madre (véase cuadro 3 -6 ) y se ha progre­
sado un poco en la identificación de localizaciones especificas de al­
gunas células madre tisulares. Una de las principales dificultades
para el uso experimental de células madre tisulares estriba en que la
mayor parte sólo puede permanecer en cultivo sin diferenciarse du­
rante periodos cortos (a diferencia de las células madre embriona­
rias; véase la sección siguiente) y su potencial de diferenciación es
mucho más limitado que el de las células madre embrionarias. No
obstante, pruebas recientes sugieren que el potencial de desarrollo
de algunas células madre adultas puede ser más plástico de lo que se
pensaba. Este tema se expone en la sección siguiente.
3.4.5 Las células madre embrionarias (ME) tienen
el potencial para formar cualquier tejido
Desde etapas muy tempranas del desarrollo, las células son indife-
renciadas comparativamente. Como su nombre lo sugiere, las célu­
las madre embrionarias (ME) se derivan de embriones. Al inicio
del decenio de 1980 se efectuó un adelanto científico importante
cuando se logró cultivar células de la masa celu lar in tern a de blas-
tocistos de ratón (Evans y Kaufman, 1981; Martin, 1981). Las cé­
lulas ME son plu rip oten tes y poco tiempo más tarde se demostró
que son capaces de desarrollar ratones adultos sanos después de in­
yectarse en blastocistos de una cepa de ratón diferente que luego se
transfirieron al oviducto de una madre adoptiva (las aplicaciones de
este proceso se comentan en el cap. 20 ).
Las células ME de ratón se cultivaron mediante la transferencia de
células de la masa celular interna a un plato que contenía un medio de
cultivo y cuya superficie interna estaba recubierta con una capa de cé­
lulas alimentadoras. Las células de la masa celular interna (MCI) pue­
den crecer y dividirse en tanto están unidas a la superficie adherente de
las células alimentadoras que, como su nombre lo indica, también li­
beran nutrimentos hacia el medio. Una vez que las células de la MCI
proliferan, se extraen con suavidad y se subcultivan sembrándolas de
nuevo en varios platos para cultivo fresco. Tras unos seis meses de sub-
cultivos repetidos, las cerca de 30 células originales de la MCI pueden
proporcionar millones de células madre embrionarias (ME). Las célu­
las ME que proliferaron en cultivo celular durante seis meses o más sin
diferenciarse y que son pluripotentes y parecen genéticamente norma­
les se denominan línea de células madre embrionarias (ME).
Diferenciación en
Todas las células sanguíneas (véase fig. 3-9)
Osteocitos (células óseas), condrocitos (células de cartílago), adipocitos
(células adiposas) más otros tipos de células de tejido conjuntivo como
las de tendones
Neuronas (células nerviosas), astrocitos, oligodendrocitos
Células de absorción, caliciformes, de Paneth y enteroendocrinas
Queratinocitos
Folículos pilosos y células epidérmicas
Para valorar si es probable que las células ME sean pluripoten­
tes pueden seguirse varios métodos experimentales, algunos de los
cuales conducen a la producción de los tipos deseados del produc­
to de la diferenciación.
► D iferenciación espontánea. En circunstancias normales las cé­
lulas ME se desarrollan bajo ciertas condiciones que las man­
tienen en un estado indiferenciado. Las alteraciones de las
condiciones del cultivo suelen permitir que las células se adhie­
ran entre sí para formar grupos celulares que se conocen como
cuerpos embrioides, tras lo cual las células comienzan a dife­
renciarse de modo espontáneo para formar células de diferen­
tes tipos, aunque en una forma bastante impredecible.
► D iferenciación dirigida. Las células se manipulan (por medio
del cambio de la composición química del medio de cultivo,
etc.) de tal manera que se diferenciarán para formar los tipos
de célula especifica deseados.
► Form ación d e teratomas. Las células se inyectan en un ratón
inmunosuprimido a fin de estudiar la formación de un tipo
particular de tumor benigno que se conoce como teratoma. Los
teratomas que ocurren en forma natural y los inducidos por
medios experimentales contienen de manera característica una
mezcla de muchos tipos de células diferenciadas o parcialmen­
te diferenciadas -una indicación de que las células ME son ca­
paces de diferenciarse en múltiples tipos celulares.
Cabe señalar que aunque las células ME se denominan células madre,
son diferentes a las células madre tisulares porque no se dividen de
modo asimétrico para producir una célula madre de reemplazo y una
célula hija preparada para la diferenciación. Las células ME se dividen
simétricamente y todas las células hijas tienen el mismo potencial de
diferenciación, acorde con las circunstancias experimentales.
En fecha más reciente se notificó éxito en el cultivo de células
ME humanas (Thomson y col-, 1998), derivadas de embriones de­
sarrollados de óvulos fecundados in vitro en una clínica de fecu n d a­
ción in vitro (FIV). El objetivo del procedimiento de FIV es ayudar
a las parejas con dificultades para tener hijos y por lo general se ob­
tiene un exceso de óvulos fecundados que pueden donarse después
para fines de investigación. Los embriones de los que se derivan las
células ME casi siempre son de cinco días de edad o blastocistos,
pelotas microscópicas huecas que contienen alrededor de 100 célu­
las, de las que casi 30 constituyen las células de la masa celular in­
 3.5 j FORMACIÓN DEL PATRÓN EN EL DESARROLLO
terna (MCI). El éxito en el cultivo de células ME humanas fue un
¿delanto científico importante y excitante porque originó la posi­
bilidad de nuevas conductas terapéuticas y nuevos caminos de in­
vestigación hacia la diferenciación celular. Los trastornos y las
-csiones graves en los que la patogénesis es resultado de la pérdida
ce células del cuerpo podrían tratarse mediante estrategias de res­
titución celular y puesto que, en principio, es posible programar las
.elulas ME para que se diferencien en células de un tipo específico,
hay grandes expectativas (cap. 2 1 ).
Una estrategia alternativa es el aislamiento de células germinales
primordiales, las células del reborde gónadal que en condiciones nor­
males se desarrollarán en gametos maduros (véase figura en el recua­
dro 11.4). Estas células pueden cultivarse in vitro y dar lugar a células
germinales embrionarias (GE) pluripotentes que se mantienen en
torma muy similar a las células ME. Shamblott y colaboradores
998) cultivaron por primera vez las células GE humanas derivadas
de células germinales primordiales o de embriones y fetos de 5 a 10
¿emanas de edad. Véase también Donovan y Gearhart, 2001.
3.4.6 Ei potencia! de diferenciación de ias células
madre tisulares es motivo de controversias
El potencial de diferenciación de las células madre tisulares se reva-
oró en los últimos años con base en varios informes de finales del
decenio de 1990 que indicaron que al parecer ciertas células madre
tisulares adultas son pluripotentes. La capacidad aparente de las cé-
. Jas madre adultas para diferenciarse en múltiples tipos de células
muy distintas se denomina transdiferenciación o plasticidad. Los
templos informados incluyen:
► células madre hemopoyéticas que se diferencian en los tres tipos
principales de células cerebrales (neuronas, oligodendrocitos y
astrocitos), en células de músculo esquelético y de músculo car­
diaco, y en hepatocitos (p. ej., Petersen y cois., 1999);
► células cerebrales que se diferencian en células sanguíneas y de
músculo esquelético o viceversa (p. ej., Shih y cois., 2002; Clar-
ke y cois., 2000; Bjornson y cois., 1999).
► células del estroma de la médula ósea que se diferencian en cé­
lulas de músculo cardiaco y esquelético (Orlic y cois., 2001).
La excitación que estos informes originaron reflejó en gran parte
el potencial de la terapéutica con células madre. En principio cual­
quier tejido u órgano dañado podría renovarse y aun reemplazarse
utilizando las células madre más accesibles y éstas podrían inclusive
manipularse de manera previa (véase Weissman, 2000; Daley, 2002).
Por ejemplo, las células madre hemopoyéticas de un paciente, que
son de fácil acceso, podrían reprogramarse para producir células ce­
rebrales que reemplacen las que se perdieron en una enfermedad
neurodegenerativa o en lesiones de la médula espinal. Sin embargo,
surgieron dudas respecto a la posibilidad de aprovechar con fines te­
rapéuticos la transdiferenciación (véase Medvinsky y Smith, 2003).
Véase también el capítulo 21 para problemas prácticos y éticos gene­
rales relacionados con el uso de células madre humanas.
5.5 Formación del patrón en el desarrollo
Si bien la diferenciación da lugar a células con estructuras y funcio­
nes especializadas, eso no constituye un organismo a menos que las
células se organicen en una forma útil. Sin organización, el huma­
no podría terminar como una burbuja amorfa de tejido heterogé­
79
neo, con células hepáticas, neuronas y de la piel distribuidas de ma­
nera aleatoria incapaces de formar tejidos y órganos identificables.
Aunque los individuos presentan muchas diferencias menores, to­
dos los miembros de la misma especie tienden a ajustarse al mismo
plan básico del cuerpo (Wolpert, 1996). En los humanos, y en los
vertebrados en general, el plan del cuerpo muestra simetría bilate­
ral superficial con respecto al eje craneocaudal, en tanto que el otro
eje mayor (el dorsoventral) sigue de la espalda al vientre. Al interior
del cuerpo ciertos órganos están colocados asimétricamente y defi­
nen un eje de izquierda a derecha. Los órganos y tejidos del cuerpo
se distribuyen en esencia de la misma manera en relación con estos
ejes en cada individuo y este patrón surge muy temprano en el de­
sarrollo. Después emergen patrones definidos dentro de órganos
particulares. Un buen ejemplo es la formación de los cinco dedos
de cada mano y de cada pie. El ordenamiento de células dentro de
los tejidos genera patrones más detallados. Tales patrones surgen de
manera gradual durante el desarrollo, con un embrión al principio
tosco que poco a poco se refina como una fotografía que se enfoca
con precisión. En esta sección se estudian la manera en que la for­
mación del patrón en el embrión en desarrollo se inicia y los meca­
nismos moleculares relacionados.
3.5.1 El surgimiento del plan del cuerpo depende de la
especificación y la polarización del eje
El desarrollo comienza con una célula aislada, que debe polarizarse
de alguna manera para producir un embrión con una cabeza y una
cola, un dorso y un frente, y lados izquierdo y derecho. En muchos
animales la diferenciación del huevo durante la gametogénesis com­
prende el depósito de moléculas particulares en diferentes sitios in-
tracelulares y éstas dan lugar a la polaridad del óvulo. Cuando el
huevo fecundado se divide, estos determinantes se segregan hacia
diferentes células hijas y de este modo se polariza el embrión. La si­
metría del huevo de otros animales se rompe por un indicio exter­
no del ambiente. Por ejemplo, en pollos el eje craneocaudal del
embrión se define por la gravedad conforme el huevo gira en su ca­
mino hacia el oviducto. Las ranas utilizan ambos mecanismos: una
asimetría preexistente en el huevo definida por la distribución de los
productos génicos matemos, en tanto que el sitio de entrada del es­
permatozoo proporciona otra coordenada de posición. Aunque aún
no se aclara el mecanismo de simetría-rotura en mamíferos, es pro­
bable que también incluya el sitio de entrada del espermatozoo (re­
cuadro 3-7).
3.5.2 Las mutaciones homeóticas revelan la base
molecular de la identidad posicional
Investigaciones a gran escala de mutagénesis en Drosophila que se
realizaron en el decenio de 1980 produjeron un número pequeño
de moscas en las que una parte del cuerpo se desarrolló con el as­
pecto de otra (una transformación homeótica). Un ejemplo es la
Antennapedia mutante, en la que las patas crecen de la cabeza en lu­
gar de las antenas. Lo que este hecho muestra respecto a la forma­
ción del patrón es que la identidad posicional de una célula, es
decir, la información que indica a cada célula dónde se encuentra
en el embrión y por consiguiente cómo debe comportarse para ge­
nerar una estructura apropiada para la región está controlada por
genes. Estos genes se conocen como genes homeóticos.
Análisis moleculares subsecuentes de las mutantes homeóticas de
Drosophila revelaron dos grupos de genes muy similares (fig. 3-10),
8° | CAPÍTULO TRES 1 C ÉLULAS Y DESARROLLO
cada uno de los cuales codifica un factor de transcripción que con­
tiene un dominio de unión de DNA conservado llamado homeodo-
minio. Los genes se expresaron de manera notable en patrones
superpuestos a lo largo del eje de la cabeza a la cola de la mosca para
dividir el cuerpo en zonas discretas. Al parecer la combinación parti­
cular de genes expresados en cada zona estableció un código que con­
firió a cada célula una identidad posicional específica a lo largo del
eje (véase Morata, 1993; Lawrence y Morata, 1994). La manipula­
ción de los códigos, sea mediante la mutación de uno o más de los
genes o por su expresión deliberada en exceso, permitió generar mos­
cas con transformaciones específicas de partes del cuerpo.
En mamíferos se encuentran grupos muy similares de genes ho-
meobox (genes Hox). Tanto los humanos como los ratones tienen
cuatro grupos no unidos de genes Hox que se expresan en patrones
superpuestos a lo largo del eje craneocaudal de una manera muy si­
milar a la de las moscas (Krumlauf, 1994; Lumsden y Krumlauf,
1996; Burke, 2000; fig. 3-10). Más aún, al parecer el mecanismo
general de actividad del gen Hox se conserva ya que los estudios de
mutaciones knockout y la expresión excesiva deliberada lograron
transformaciones de partes del cuerpo que incluyen las vértebras
del ratón. Por ejemplo, la alteración dirigida del gen Hoxc8 produ­
jo ratones con un par extra de costillas a causa de la transformación
de la primera vértebra lumbar en la 13a. vértebra torácica (Le
Mouellic y cois., 1992).
Dos de los grupos de genes Hox, HoxA y HoxD, también se ex­
presan en patrones superpuestos a lo largo de los miembros. El ra­
tón knockout y los mutantes de expresión excesiva de estos genes
muestran reordenamientos específicos de los segmentos de los
miembros. Por ejemplo, los ratones con alteraciones dirigidas de los
genes H ox all y H ox dll carecen de radio y cúbito (Davis y cois.,
1995). Las mutaciones que ocurren de manera natural en el gen
HOXD13 humano se acompañan de una gama de defectos de las
manos, inclusive polisindactilia (Manouvrier-Hanu y cois., 1999).
3.5.3 La formación de patrones suele depender
de los gradientes de señal
La especificación del eje y la polarización son acontecimientos tem­
pranos importantes en el desarrollo porque las células de las distin­
tas partes del embrión deben comportarse de manera diferente, en
última instancia en términos de los productos del gen que sinteti­
zan, a fin de generar el plan corporal apropiado. Una célula sólo se
comporta de modo apropiado si puede indicar dónde se encuentra
en relación con otras células. Ello requiere a su vez un armazón de
referencia. Los principales ejes del embrión brindan una referencia
que permite definir en forma absoluta y sin ambigüedad la posición
de cualquier célula.
¿Cómo reconocen las células su posición a lo largo de un eje y
en consecuencia se comportan como corresponde? Esta pregunta
resulta pertinente porque a menudo es necesario que células con
funciones equivalentes en diferentes posiciones produzcan estruc­
turas distintas. Los ejemplos abarcan la formación de los distintos
dedos a partir de los mismos tipos de células en la mano en desa­
rrollo y la de diferentes vértebras (algunas con costillas y otras sin
ellas) de variedades idénticas de células en las somitas.
Está demostrado que en muchos sistemas en desarrollo la con­
ducta específica de región de las células depende de un gradiente de
señal, que tiene diferentes efectos en células blanco equivalentes a
distintas concentraciones. Las moléculas de señalamiento que ac­
túan en esta forma se conocen como morfógenas. Tanto el princi­
pal eje craneocaudal del cuerpo como los ejes anteroposterior y
proximodistal de los miembros de embriones vertebrados se mode­
lan mediante este mecanismo (Wolpert, 1996; Ng y cois., 1999).
En los miembros en desarrollo (véase Schwabe y cois., 1998;
Niswander, 2003), se encuentra un subgrupo particular de células
en el margen posterior de cada brote de los miembros llamado zo­
na de actividad polarizante (ZAP) que es el origen de un gradien­
te morfógeno (fig. 3-11). Las áreas más cercanas a la ZAP forman
los dedos más pequeños y posteriores de la mano o el pie, en tanto
que las que están más alejadas originan el pulgar o el dedo gordo.
La capacidad de organización de la ZAP puede demostrarse con fa­
cilidad si se injerta una ZAP donadora en el margen anterior del
brote de un miembro que ya tiene su propia zona de actividad po­
larizante (ZAP). En este experimento el miembro se torna simétri­
co, con dedos posteriores en ambas extremidades. Al parecer el
morfógeno en el miembro en desarrollo es la proteína de señala­
miento Sonic hedgehog (Shh), aunque se piensa que la proteína ac­
túa de manera indirecta puesto que no es capaz de difundirse más
allá de unas cuantas células de ancho desde su origen. Una cuenta
sumergida en la proteína Shh sustituirá en funciones a la ZAP, lo
mismo que una cuenta humedecida en ácido retinoico, que se sabe
induce la expresión del gen Shh. Los cinco genes distales HoxD
(Hoxd9 a Hoxdl3) se expresan en el centro de la ZAP. Sin embar­
go, conforme la fuerza de la señal disminuye, los genes HoxD se
apagan uno por uno hasta el margen anterior de la yema del miem­
bro que forma el pulgar y sólo Hoxd9 permanece activo. Los gra­
dientes de señal que especifican los principales ejes embrionarios
están unidos a los genes homeóticos que controlan la conducta re­
gional de la célula en esta forma.
Como ya se comentó, los genes Hox no sólo se expresan en los
miembros sino también a lo largo de los ejes craneocaudales mayo­
res del embrión. En este caso se piensa que el origen del gradiente
morfógeno que guía la expresión del gen Hox es el mido em briona­
rio y que el morfógeno en sí mismo es ácido retinoico. Puesto que
el nudo secreta cantidades cada vez más abundantes de ácido reti­
noico a medida que involuciona, las células posteriores se exponen
a mayores cantidades de la sustancia química que las células ante­
riores, lo que produce la activación progresiva de más genes Hox en
las regiones posteriores del embrión.
3.6 Morfogénesis
La división celular, con la formación progresiva de patrones y dife­
renciación celular, proporcionaría por último un embrión con tipos
de células organizadas, pero ese embrión sería una pelota estática de
células. Los embriones reales son estructuras dinámicas, con célu­
las y tejidos que se someten a interacciones y reordenamientos
constantes para generar estructuras y formas. Las células forman
hojas, tubos, masas reticulares laxas y aglomerados densos. Las cé­
lulas migran de manera individual o en masa. En algunos casos es­
ta conducta es una respuesta al programa de desarrollo, pero en
otros tales procesos impulsan el desarrollo al llevar entre sí grupos
de células que de otra manera nunca entrarían en contacto. Varios
mecanismos sustentan la morfogénesis; se resumen en el cuadro
3-7 y se comentan con mayor detalle más adelante (Hogan, 1999;
Mathis y Nicolás, 2002; Peifer y McEwan, 2002; Lubarsky y Kras-
now, 2003).
 3.6 i MORFOGÉNESIS ¡ 81

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 P a ra s e g m e n to s
Pro Mia
iva M x Lb T1 T 2 T 3 A1 A 2 A 3 A 4 A 5 A 6 A 7 A 8 Tel S e g m e n to s

A N T -C Labial m
proboscipedia
d eform ada
peines de sexo reducidos
antennapedia

B X -C U ltrabitórax
abdom inal-a l i l i l í
abdom inal-B
! I

lab Pb Dfd Ser Antp Ubx abdA AbdB

H O M -C

O c c ip ita l C ervical T o rá cic o Lum bar S a c ro Caudal

1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 1 2 3 4

Fig. 3-10. Comparación de los complejos génicos HOM-C/Wox de Drosophila y el ratón y sus dominios de expresión a lo largo del eje anteroposterior
del embrión.

Redibujado de Twyman (2001 ) Instant Notes in Developmental Biology, publicado por BIOS Scientific Publishers.
82 CAPÍTULO TRES CÉLULAS Y DESARROLLO

G e n e s H oxD

IV

11 1 0 9
IV
G e n e s H oxD

Flg. 3-11. El Injerto de una segunda zona de actividad polarizante en el margen anterior de la yema del miembro del pollo ocasiona duplicación de
los dedos en una imagen en espeio.
A) Un gradiente de señal establecido por la expresión de Sonic hedgehog en la zona de actividad polarizante (ZAP) genera un patrón anidado de
superposición de patrones de expresión del gen HoxD en la yema de la extremidad en desarrollo, que conduce a la especificación de cinco dedos.
B) Los injertos de ZAP establecen un gradiente opuesto y producen una reversión en imagen en espejo de los destinos de los dedos. El efecto puede
simularse mediante perlas recubiertas con ácido retinoico (AR) o proteína sónica hedgehog (Shh). Redibujado de Twyman (2001) Instant Notes in
Developmental Biology, publicado por BIOS Scientific Publishers.

Procesos morfogenéticos en el desarrollo y ejemplos de sistemas modelo del desarrollo

P ro c e s o E je m p lo s

Ritmos diferenciales de proliferación celular Brote selectivo de yemas de los miembros de vertebrados mediante proliferación de células en la zona
de progreso

Colocación alternativa, orientación Patrones de segmentación embrionaria diferentes en animales. Divisiones celulares estereotipadas
del huso mitótico, o ambos en nematodos

Cambio del tamaño celular Expansión celular conforme los adipocitos acumulan gotitas de lípidos

Cambio de la form a celular Cambio de forma de las células de cilindrica a cuña durante el cierre del tubo neural en aves y mamíferos

Fusión celular Formación de trofoblasto y miotubos en mamíferos

Muerte celular Separación de los dedos en la yema de los miembros de vertebrados. Selección de slnapsis funcionales
en el sistema nervioso de mamíferos

Ganancia de adherencia célula-célula Condensación del mesénquima de cartílago en la yema de los miembros de vertebrados

Pérdida de adherencia de célula-célula Deslaminación de células del epiblasto durante la gastrulación en mamíferos

Interacción célula-matriz Migración de células de la cresta neural y células germinales. Migración del axón

Pérdida de adherencia célula-matriz Deslamlnación de las células de la capa basal de la epidermis

Reproducido de Twyman (2001 ), Instant Notes in Developmental Biology. © 2001 BIOS Scientific Publishers.

3.6.1 Cambios en la forma y el tamaño de las células
pueden impulsar la morfogénesis
La reorganización del citoesqueleto puede originar cambios instrumen­
tados en la forma de la célula y es posible que esto tenga un efecto ma­
yor en la estructura de todos los tejidos. Uno de los acontecimientos
destacados en el desarrollo de los vertebrados, la formación del tubo
neural, es impulsado en parte por cambios en la forma de la célula. Las
constricciones apicales originadas por la contracción local de microfila-
mentos determinan que algunas de las células cilindricas de la placa
neural tomen forma de cufia, lo que les permite actuar como bisagras.
En combinación con el incremento de la proliferación en los márgenes
de la placa neural, ello proporciona la fuerza suficiente para que toda la
placa neural se enrolle hacia un tubo (Schoenwolf y Smith, 1990). Una
conducta similar dentro de cualquier hoja plana de células tenderá a
ocasionar la invaginación de esa hoja.
Recuadro 3-7. Polarización del embrión de mamíferos: señ ales y productos génicos
EJE D0RS0VENTRAL
El primer signo franco de asimetría en el embrión de mamíferos es la se­
gregación de la masa celular interna (MCI) a un lado del blastocisto (Lu y
col., 2001; Zernicka-Goetz, 2002). Ello define el e/e embrionario-abem-
brionario y la MCI representa el polo embrionario. La cara embrionaria de
la MCI está expuesta al trofoblasto y en contacto con él, en tanto que la
cara abembrionarla está abierta hacia el blastocele. Esta diferencia en el
ambiente es suficiente para especificar las dos primeras capas precisas
de células en la MCI: ectodermo primitivo en el polo embrionario y endo-
dermo primitivo en el polo abembrionario. Esto a su vez define el eje dor-
soventral del embrión. Aunque aún no se aclara cómo se posiciona
asimétricamente la MCI en el blastocisto en primer lugar, es Interesante
señalar que cuando el sitio de entrada del espermatozoo se sigue median­
te cuentas fluorescentes, siempre se localiza en las células del trofoblas­
to en el borde embrionario-abembrionario.
EJE CRANEOCAUDAL
La posición de la entrada del espermatozoo también tiene una función im ­
portante en la definición del eje craneocaudal del embrión de mamíferos,
pero aún no se aclara cómo se polariza este eje (Beddington y Robertson,
1999; Lu y cois., 2001). La fecundación induce la segunda división meió-
tica y por lo general se expulsa el segundo cuerpo polar opuesto al sitio
de entrada del espermatozoo. Lo anterior define el eje animal-vegetal del
cigoto, con el cuerpo polar en el polo animal. Las divisiones por segmen­
tación subsecuentes que ocurren en el contexto del eje animal-vegetal
producen un blastocisto que muestra simetría bilateral alineada con el eje
animal-vegetal inicial del cigoto. El eje de simetría bilateral en el blastocls-
to predice la alineación de la estria primitiva, pero no su orientación. La
decisión en cuanto al extremo que debe form ar la cabeza y el que form a­
rá la cola descansa en una región de tejido extraembrionario llamada en-
dodermo visceral anterior (EVA). En ratones, al principio se localiza en la
punta del cilindro del huevo. Éste gira hacia el futuro polo craneal del eje
craneocaudal justo antes de la gastrulación y el nudo embrionario se es­
tablece en el extremo opuesto del epiblasto.
EJE IZQUIERDA A DERECHA
El primer signo evidente de asimetría izquierda-derecha en el embrión de
mamíferos es la formación del asa del tubo cardiaco. Sin embargo, m u­
3.6 | MORFOGÉNESIS ] 83
3.6.2 Los principales cambios morfogenéticos en el
embrión son resultado de la afinidad
diferencial de las células
La adherencia selectiva célula-célula y la de la célula con la matriz se
describieron en las secciones 3.2.3 y 3.2.4 como mecanismos que se
utilizan para organizar las células en tejidos y conservar los límites del
tejido. En el desarrollo, la regulación de la síntesis de moléculas de
adherencia celular particulares permite que las células formen y rom­
pan contactos entre sí, y experimentan una reorganización muy di­
námica. La gastrulación, que se describe en la sección 3.7.5, es quizás
el ejemplo más notable de un proceso morfogenético. La hoja única
de epiblasto gira sobre sí misma y se convierte en las tres capas ger­
minales fundamentales del embrión, un proceso impulsado por una
combinación de cambios en la forma de la célula, proliferación celu­
lar selectiva y diferencias en la afinidad de las células. La alteración de
cho antes de este hecho se observa asimetría molecular (Capdevila y col.,
2000). En el embrión de mamíferos ocurre un paso de determinación im ­
portante durante la gastrulación cuando la rotación de cilios en el nudo
embrionario ocasiona un flujo unidireccional del líquido perinodal que se
requiere para especificar el eje izquierda-derecha. Aunque aún no se
aclara el mecanismo (Tabin y Vogan, 2003), el resultado es la activación
de genes que codifican las moléculas de señalamiento Nodal y Lefty-2,
de manera específica en el lado izquierdo del embrión. Éstas inician vías
de señalamiento que activan factores de transcripción específicos del la­
do izquierdo (p. ej., Pitx2) e inhiben factores de transcripción específicos
dei lado derecho. En el lado derecho del embrión, que carece de Lefty-2
y Nodal, Pitx2 no se activa. Otras proteínas, com o Lefty-1, se expresan
en la línea media del embrión y establecen una barrera que Impide el es­
cape de señales de un lado del embrión al otro. Las mutaciones en los ge­
nes humanos LEFTA, LEFTB y NODAL se acompañan de una gama de
malformaciones del eje que incluyen reversión izquierda-derecha (situs
inversus, situs ambiguous) y simetría de imagen en espejo (isomerismo).
En ocasiones estas malformaciones afectan la totalidad del cuerpo y a ve­
ces sólo órganos individuales (heterotaxia). Las mutaciones que afectan
subunidades de la proteína motora dineína, necesaria para la rotación uni­
direccional de cilios, también se acompañan de defectos de lateralidad.
Como hecho interesante, con frecuencia éstas ocurren aunadas a infec­
ciones respiratorias recurrentes e infertilidad, que refleja la falta de moti-
lidad de los cilios en otras partes del cuerpo (recuadro 3-1).
Generalidades de la formación temprana del eje en el embrión de ratón
desde la fecundación hasta la etapa de estría media (véase pág. sig.).
El polo animal del eje animal-vegetal en el embrión de ratón se define co­
mo el punto en el que el segundo cuerpo polar se expulsa justo después
de la fecundación. El eje embrionario-abembrionario en el blastocisto es
ortogonal al eje animal-vegetal y se define por la localización de la MCI
con el polo embrionario en el lado del blastocisto que contiene la MCI y el
polo abembrionario en el lado con la cavidad del blastocele. El eje P-D en
la etapa de cilindro del huevo del embrión se forma con el polo proximal
localizado en el cono ectoplacentario y el polo distal en el fondo del em­
brión en forma de copa. Antes de la gastrulación, el eje P-D gira 90° y se
convierte en un eje A-R Tomado de Lu y col. (2001) Curr. Opin. Genet.
Dev. 11, 384-392. Con autorización de Elsevier.
84 CAPÍTULO TRES CÉLULAS Y DESARROLLO

Recuadro 3-7. (co n tin u a ció n )

A n im al A nim al ¡ A nim al j

] V eg etal ¡ [V eg etal [ V eg etal :

Segundo Segundo
c u e rp o p o la r c u e rp o p o la r

Posición de la Posición de la
entrada del entrada del
espermatozoo espermatozoo
Ó vu lo sin
C ig o to Embrión de dos células Embrión de tres células
fe c u n d a r

! E m b rio n ario i
Cono
V eg etal A nim al ectoplacentario
Ectodermo
Abembrionario extraembrionario'
Trofoectodermo EV
MCI polar extraembrionario
Epiblasto
Endodermo Cuerpo polar proximal
primitivo — EV
Posición de la
entrada del espermatozoo EV/A
Trofoectodermo
mural Cavidad del EV distal
4.5 dpc blastocelo
Trofoblasto

5.5 dpc 5.75 dpc

EV
extraembrionario
A n terio r ]<— >-| P o s te rio r]

EV
desplazado Mesodermo
extraembrionario

Estría
------ primitiva
Neuroectodermo
anterior
Mesodermo
anterior

6.0 dpc

6.5 dpc
Nudo

. 7.5 dpc
 3.7 [ DESARROLLO HUMANO INICIAL: FECUNDACIÓN A GASTRULACIÓN
las propiedades adherentes de las células puede dar lugar a varios pro­
cesos diferentes (McNeil, 2000; Irvine y Rauskolb, 2001):
► Migración. Movimiento de una célula individual con respecto
a otras células del embrión. Algunas células, en especial las de
la cresta neural y las germinales, sufren migración extensa du­
rante el desarrollo y pueblan partes del embrión que están muy
distantes de sus sitios originales.
► Ingresión. Movimiento de una célula de la superficie de un
embrión hacia su interior.
► Egresión. Movimiento de una célula del interior de un em­
brión a la superficie externa.
► Deslaminación. Movimiento de células fuera de una hoja epi­
telial, con frecuencia para convertir una hoja aislada de células
en múltiples capas. Éste es uno de los principales procesos que
sustentan la gastrulación en embriones de mamíferos. Las cé­
lulas también pueden deslaminarse a partir de una membrana
basal, como ocurre en el desarrollo de la piel.
► Intercalación. Fusión de células a partir de múltiples capas ce­
lulares hacia una capa epitelial única.
► Condensación. Conversión de células mesenquimatosas empa­
cadas de manera laxa en una estructura epitelial. En ocasiones
se denomina transición mesenquimatosa a epitelial.
► Dispersión. Conversión de una estructura epitelial en células me­
senquimatosas laxas. Una transición epitelial a mesenquimatosa.
► Epibolia. Diseminación de una hoja de células.
► Involución. Giro hacia el interior de una hoja de células en ex­
pansión de tal manera que las células se diseminan sobre la su­
perficie interior de la hoja y crean una segunda capa.
3.6.3 La proliferación celular y la muerte programada
de las células (apoptosis} son mecanismos
morfogenéticos importantes
Después de un periodo inicial de segmentación en el que todas las
-elulas se dividen casi al mismo ritmo, células en distintas partes
dd embrión comienzan a dividirse a ritmos diferentes. Esto puede
;mplearse para generar nuevas estructuras. Por ejemplo, la división
;¿u lar rápida en regiones seleccionadas de la placa lateral mesodér-
—_ca da origen a las yemas de los miembros, en tanto que las regio­
nes adyacentes, que se dividen más lentamente, no forman estas
estructuras. El plano de la división celular también es importante.
Por ejemplo, las divisiones perpendiculares al plano de una hoja
;c:telial ocasionarán que la hoja se expanda por la incorporación de
cuevas células. Sin embargo, las divisiones en el mismo plano de la
generarán capas adicionales. Si las células son asimétricas, co-
- ; es el caso de las células madre neurales que se comentan en la
sección 3.4.3, entonces el plano de la división celular puede influir
en .os tipos de células hijas que se producen. Más aún, si el plano
as segmentación no es medial, es posible que se generen células de
"trentes tamaños. Eso ocurre en la gametogénesis femenina,
- jn dn la división meiótica produce un óvulo masivo que contie-
.i. mayor parte del citoplasma y cuerpos polares vestigiales que
esencia son vasijas de desecho del juego de cromosomas haploi-
I no deseado. Lo anterior contrasta con la gametogénesis mascu-
en la que la meiosis produce cuatro espermátides equivalentes
- iü e figura del recuadro 11-4).
85
La muerte celular programada (apoptosis) es otro mecanismo
morfogenético importante, ya que permite que se introduzcan hen­
diduras dentro del plan corporal (Vaux y Korsmeyer, 1999). Las
hendiduras entre los dedos de las manos y los pies se originan por la
muerte de células interdigitales en las placas de la mano y del pie que
comienza alrededor de los 45 días de la gestación. En el sistema ner­
vioso de mamíferos, la apoptosis se utiliza para eliminar las neuro­
nas con conexiones no productivas, lo que permite que el circuito
neuronal se refine progresivamente. De esta manera se descarta has­
ta 50% de las neuronas y en la retina puede aproximarse a 80%.
3.7 Desarrollo hum ano inicial:
fecundación a gastrulación
3.7.1 La fecundación activa el óvulo y une entre sí
los núcleos del espermatozoo y el óvulo
para formar un individuo único
Fecundación es el proceso por el que dos células sexuales (gam etos)
se fusionan entre sí para crear un nuevo individuo con potenciales
genéticos derivados de ambos padres, pero diferentes a ellos (Was-
sarman, 1999). El gameto masculino, la célula espermatozoo, es
una célula pequeña con citoplasma muy reducido y un núcleo ha-
ploide. El núcleo está condensado de manera intensa y no posee ac­
tividad transcripcional porque las histonas normales están
reemplazadas por una clase especial de proteínas de empaque cono­
cidas como protaminas. En el extremo posterior se encuentra un
fla gelo largo que se ondula para dar impulso y en el extremo ante­
rior se halla la vesícula acrosómica, que contiene enzimas digesti­
vas (véase fig. 3-12).
El gameto femenino, la célula óvulo (o huevo), es una célula
grande que contiene el material necesario para iniciar el crecimien­
to y el desarrollo (véase fig. 3-12). El citoplasma está en extremo
bien dotado de muy grandes cantidades de mitocondrias y riboso-
mas, y de DNA y polimerasa de RNA. También alberga cantidades
enormes de proteínas, RNA, sustancias químicas protectoras y fac­
tores morfogenéticos. En muchas especies, inclusive aves, reptiles,
peces, anfibios e insectos, el huevo contiene una cantidad grande o
moderada de vitelo, un conjunto de nutrimentos necesarios para
nutrir el embrión en desarrollo antes que pueda alimentarse en for­
ma independiente. Aunque los embriones de mamíferos tienen un
saco vitelino, los óvulos de mamíferos no requieren vitelo porque
el embrión se nutre gracias al aporte sanguíneo de la placenta.
Fuera de la membrana plasmática se encuentra la envoltura vi-
telina, que en los mamíferos es una matriz extracelular separada y
gruesa conocida como zona pelúcida. También en los mamíferos,
el óvulo está rodeado por una capa de células que se conocen como
células cúmulo y sirven para nutrir el óvulo antes y justo después
de la ovulación.
Las células espermatozoo humanas tienen que migrar distancias
muy considerables y sólo alrededor de 200 de los cerca de 280 mi­
llones que se eyaculan en el interior de la vagina llegan a la parte ne­
cesaria del oviducto donde la fecundación se efectúa. Esta última
inicia con la fijación de un espermatozoo a la zona pelúcida seguida
de la liberación de enzimas de la vesícula acrosómica, que causan la
digestión local de la zona. A continuación la cabeza del espermato­
zoo se fusiona con la membrana plasmática del oocito y el núcleo
del espermatozoo pasa al interior del citoplasma. Dentro del oocito,
86 j CAPÍTULO TRES | CÉLULAS V DESARROLLO

A)
V es ícu la a c ro s ó m ic a
N ú c le o
M e m b ra n a
p la s m á tic a P ie z a m e d ia
5 |j,m

G ràn u lo M ito c o n d ria

co rtical
M e m b ra n a p la s m á tic a

F la g elo

Fig. 3-12. Células sexuales especializadas.

A) Óvulo (huevo). El óvulo de mamíferos es una célula grande, de 120 ixm de diámetro, rodeada por una envoltura extracelular, la zona pelúcida, a la
que debe unirse primero el espermatozoo, que contiene tres glucoproteínas, ZP-1, ZP-2 y ZP-3, que se polimerizan para form ar un gel. El primer cuerpo
polar (no se muestra), el producto de la meiosis I, se sitúa abajo de la zona dentro del espacio perívitelino. En la ovulación los oocitos se encuentran en
metafase II. La meiosis II no termina hasta después de la fecundación. Esta última desencadena la secreción de gránulos corticales que inhiben con
efectividad el paso de espermatozoos adicionales a través de la zona pelúcida. B) Espermatozoo. Esta célula es mucho más pequeña que el óvulo con
una cabeza de 5 (im que contiene DNA muy compactado, un cuerpo cilindrico de 5 (xm, la pieza media, con múltiples mitocondrias, y una cola de
50 |xm. En el frente, el acrosoma contiene enzimas que ayudan al espermatozoo a hacer un orificio en la zona pelúcida, los que le permite acceder al
óvulo y fecundarlo. Por lo general el semen contiene 100 millones de espermatozoos por mililitro. Tomado de Alberts y cois. (2002), M olecular Biology
o fth e Cell, 4a. ed., p. 1147. Copyright © 2002, Garland Science.

al principio se separan entre sí los juegos haploides de cromosomas
del espermatozoo y el óvulo, y constituyen los pronúcleos masculino
y femenino respectivamente. Más adelante se fusionan para formar
un núcleo diploide. El oocito fecundado se conoce como cigoto.
3,7.2 La segmentación divide ei cigoto en muchas
células más pequeñas
Segmentación es la etapa del desarrollo en la que el cigoto se divide
para formar varias células más pequeñas llamadas blastómeros. La
naturaleza de las divisiones de segmentación tempranas varía con
amplitud entre las distintas especies animales y en muchos insectos
(inclusive Drosophild) el proceso no incluye siquiera división celular
(por el contrario, el núcleo del cigoto sufre una serie de divisiones en
un citoplasma común para generar una gran célula multinucleada
aplanada, el blastodermo sincitial). Con algunas excepciones, el re­
sultado de la segmentación suele ser una pelota de células, que a me­
nudo rodea una cavidad llena de líquido llamada blastocele.
La pelota de células que resulta de la segmentación se denomina
blástula en casi todos los invertebrados, pero la terminología varía
en los vertebrados. En anfibios y mamíferos se utiliza el término
mórula para describir la pelota inicial, empacada con laxitud, de cé­
lulas que resultan de la segmentación inicial y más adelante, cuando
el blastocele lleno de líquido se forma, la pelota de células se cono­
ce como blástula en anfibios, pero como blastocisto en mamíferos
(véase fig. 3-13). La situación es distinta en aves, peces y reptiles, en
los que el huevo contiene mucho vitelo que inhibe la división celu­
lar. En este caso la segmentación se restringe a un blastodisco apla­
nado en la periferia de la célula.
En muchas especies (pero no en mamíferos, véase más adelan­
te), las divisiones por segmentación son rápidas porque no intervie­
nen las fases de latencia intermedias G1 y G2 del ciclo celular entre
la replicación del DNA y la mitosis. En estos casos no hay creci­
miento neto del embrión y de esa manera conforme el número de
células aumenta, el tamaño de las mismas disminuye. Cuando lo
anterior sucede, el genoma heredado del cigoto (el genom a cigóticó)
es transcripcionalmente inactivo durante la segmentación y en conse­
cuencia esta última depende mucho de los productos génicos de la
herencia materna distribuidos en el citoplasma del óvulo. Los pro­
ductos génicos maternos regulan el ciclo celular y determinan el
ritmo de segmentación, y las divisiones de segmentación son sin­
crónicas. Con frecuencia este tipo de regulación se denomina re­
gulación por el gen om a m aterno y los productos génicos maternos
suelen conocerse como determ in an tes m aternos.
La segmentación de los mamíferos es excepcional en varios aspectos:
► activación temprana del genoma cigótico: en algunas especies
tan pronto como en la etapa de dos células. Como resultado, el
genoma cigótico, en lugar de los productos génicos heredados
de la madre, controla las divisiones de segmentación y éstas son
divisiones lentas (porque los ciclos celulares incluyen las fases
de latencia G1 y G2) y asincrónicas;
► segmentación rotacional: el primer plano de segmentación es
vertical, pero en la segunda ronda de división celular una de
 3.7 | DESARROLLO HUMANO INICIAL: FECUNDACIÓN A GASTRULACIÓN
Ó vulo S e g m e n ta c ió n
ro tac io n a l
U nión
e s tre c h a
M ó ru la
c o m p a c ta d a
M ó ru la
Fig. 3-13. Desarrollo temprano del embrión de mamífero, desde la fecundación hasta la formación del blastocisto.
^ecibujado de Twyman (2001) Instant Notes Developmental Biology, publicado por BIOS Scientific Publishers.
las células se segmenta en sentido vertical y la otra en direc­
ción horizontal (véase fig. 3-13);
► compactación: los blastómeros del embrión de ocho células,
vinculados de manera laxa, se aplanan unos contra otros para
maximizar su contacto y formar una mórula empacada apreta­
damente (nota: la compactación no ocurre en muchos embrio­
nes no mamíferos, inclusive Xenopus, pero en mamíferos es
manifiesta). La compactación tiene el efecto de introducir un
erado de p o la rid a d celular. Antes de la compactación, los blas­
tómeros son células redondas con microvellosidades distribui­
das de modo uniforme y la molécula de adherencia celular
caderina E se encuentra siempre que las células están en con­
tacto entre sí. La situación es muy diferente después de la com­
pactación: las microvellosidades se restringen a la superficie
apicaL en tanto que la caderina E se distribuye sobre las super­
ficies basolaterales. Ahora las células forman uniones estrechas
con sus vecinas y los elementos citoesqueléticos se reorganizan
para formar una banda apical (véase cuadro 3-4).
Alrededor de la etapa de mórula de 16 células en mamíferos es po-
m tie diferenciar dos tipos de células: polarizadas externas y apolares
jzrimas. Conforme la población de células apolares aumenta, las cé-
Uas comienzan a comunicarse entre sí a través de uniones comuni-
La distinción entre los dos tipos de células es fundamental y
se txplica en la sección siguiente.
1 7 2 Sólo un porcentaje pequeño de las células
del embrión temprano de mamíferos origina
el organismo maduro
muchos modelos animales del desarrollo el organismo está for-
—.i- o por células que son descendientes de todas las células del em­
87
E ta p a d e c u a tro c é lu la s
T ro fo e c to d e rm o
MCI
I \
B la s to c e le
♦
\
B la s to c is to
brión original. Sin embargo, los mamíferos son muy diferentes y
sólo una pequeña minoría de las células del embrión inicial da lu­
gar al organismo propiamente dicho. Ello se debe a que gran parte
del desarrollo inicial de los mamíferos se relaciona con el estableci­
miento de tejidos que actúan como apoyo para la vida pero que en
su mayor parte no contribuyen al organismo final, éstos son las
membranas extraembrionarias y la placenta (véase recuadro 3-8).
Los dos tipos de células que pueden distinguirse alrededor de la
etapa de 16 células en mamíferos tienen diferentes destinos. Las cé­
lulas polarizadas externas comprenden el trofoblasto (o trofecto-
dermo) que evolucionará para formar una de las cuatro membranas
extraembrionarias, el corion, que proporciona la porción embrio­
naria de la placenta. Las células apolares internas comprenden el
embrioblasto. A medida que el blastocele se forma (alrededor de la
etapa de 32 células en humanos), las células apolares internas se
congregan en un extremo del blastocele para formar una masa de
células internas (MCI) descentrada. Las células de la MCI origina­
rán todas las células del organismo aunadas a las otras tres membra­
nas extraembrionarias (recuadro 3-8).
3.7.4 Implantación
Después de algún tiempo (día cinco del desarrollo humano), el blas­
tocisto m adura: se libera una enzima que perfora un orificio a tra­
vés de la zona pelúcida y el blastocisto se exprime hacia el exterior.
Ahora el blastocisto está libre para interactuar en forma directa con
el endometrio uterino. Muy poco después de llegar al útero (día seis
del desarrollo humano), el blastocisto se fija estrechamente al epite­
lio uterino (implantación). Las células del trofoblasto proliferan con
rapidez y se diferencian en una capa interna de citotrofoblasto y una
capa externa de células multinucleadas, el sincitiotrofoblasto, que
comienza a invadir el tejido conjuntivo del útero.
88 CAPÍTULO TRES CÉLULAS Y DESARROLLO
Incluso antes que la implantación ocurra, las células de la MCI co­
mienzan a diferenciarse en capas externa e interna precisas. La capa ce­
lular externa es el epiblasto (o ectodermo primitivo). Las células del
epiblasto originan el ectodermo, el endodermo y el mesodermo (y en
consecuencia todos los tejidos del embrión), así como el amnios, el sa­
co vitelino y la alantoides. La capa de células internas, el hipoblasto
(o endodermo primitivo) origina el m esoderm o extraem brionario
que recubre el saco vitelino primario y el blastocele.
Al interior de la masa de células internas se forma una cavidad
llena de líquido, la cavidad amniótica, encerrada por el amnios. El
embrión, que se deriva de una parte de la masa celular interna, con­
siste ahora en las capas distintas epiblasto e hipoblasto (y se cono­
ce como disco germinal bilaminar). Se localiza entre dos cavidades
llenas de líquido: la cavidad amniótica en un lado y el saco vitelino
en el otro (fig. 3-14).
3.7.5 La gastrulación es un proceso dinámico por el
que las células del epiblasto originan las tres
capas germinales
Como Lewis Wolpert lo remarcó “el acontecimiento realmente im­
portante en la vida no es el nacimiento, el matrimonio o la muerte,
sino la gastrulación”. La gastrulación se efectúa durante la tercera se­
mana del desarrollo humano y es el primer proceso morfogenético
importante del desarrollo. Durante la gastrulación se establece la
orientación del cuerpo y el embrión se convierte en una estructura de
tres capas germinales: ectodermo, endodermo y mesodermo, todas
las cuales se derivan d el epiblasto. Las tres capas germinales son las pro-
genitoras de la totalidad de los tejidos del organismo (recuadro 3-5).
La principal estructura que caracteriza la gastrulación en mamí­
feros, aves y reptiles es lineal, la estría primitiva. Aparece alrededor
del día 15 del desarrollo humano, como un surco débil a lo largo de
la línea media longitudinal del disco germinal bilaminar ahora
de forma oval. En el transcurso del día siguiente, el surco prim itivo
se profundiza y alarga para ocupar alrededor de la mitad de la lon­
gitud del embrión. Alrededor del día 16 es evidente una depresión
profunda (el fo so p rim itivo) rodeada por un montículo ligero de
epiblasto (el nudo p rim itivo) al final del surco, cerca del centro del
disco germinal (véase fig. 3-14).
El proceso de gastrulación es en extremo dinámico e incluye mo­
vimientos celulares muy rápidos (Narasimha y Leptin, 2000; Myers
y cois., 2002). El día 16 del desarrollo humano comienzan a prolife-
rar y aplanarse las células del epiblasto, cerca de la estría primitiva, y
pierden sus interconexiones. Estas células aplanadas desarrollan seu-
dópodos que les permiten migrar a través de la estría primitiva hacia
el espacio entre el epiblasto y el hipoblasto (fig. 3-14). Algunas de las
células del epiblasto que están ingresando invaden el hipoblasto, des­
plazan sus células y por último reemplazan por completo el hipoblas­
to con una nueva capa de células, el endodermo definitivo. A partir
del día 16 algunas de las células del epiblasto que migraron a través
de la estría primitiva se desvían hacia el espacio entre el epiblasto y el
endodermo definitivo naciente para formar una tercera capa, el me­
sodermo intraembrionario. Una vez que el mesodermo intraembrio-
nario y el endodermo definitivo se forman, el epiblasto residual se
describe como ectodermo y la nueva estructura de tres capas se de­
nomina disco germinal trilaminar (fig. 3-14).
Las células mesodérmicas que ingresan migran en diferentes di­
recciones, algunas hacia afuera y cranealmente, en tanto que otras
se depositan en la línea media. Las células que migran a través del
foso primitivo y llegan a reposar en la línea media forman dos es­
tructuras:
► la placa precordial, una masa compacta de mesodermo craneal
al foso primitivo. La placa precordial inducirá estructuras cra­
neales importantes en la línea media, como el cerebro;
► el proceso notocordial, un tubo que brota del foso primitivo y
aumenta de longitud conforme las células que proliferan en la
región del nudo primitivo se añaden a su extremo proximal y
conforme la estría primitiva involuciona. El proceso notocor­
dial está formado por completo alrededor del día 20 del desa­
rrollo humano, pero a continuación se transforma de un tubo
en un bastón sólido, el notocordio, que después induce la for­
mación de componentes del sistema nervioso (véase la sección
siguiente).
Las células mesodérmicas que ingresan y migran hacia las partes la­
terales se condensan hacia estructuras similares a bastones y hojas
en ambos lados del notocordio. Hay tres estructuras principales
(véase fig. 3-15):
► El mesodermo paraxil (MP), un par de condensaciones cilin­
dricas que se sitúan justo adyacentes al notocordio y lo flan­
quean. El MP se desarrolla primero en una serie de estructuras
semejantes a verticilos que se conocen como somitómeros y se
forman en una secuencia craneal a caudal durante la tercera y
cuarta semanas del desarrollo humano. Los primeros siete son
los somitómeros craneales que al final formarán los músculos es­
triados de la cara, la mandíbula y la garganta, pero los otros so­
mitómeros se desarrollan adicionalmente en bloques discretos
del mesodermo segmentario conocidos como somitas (véase
fig. 3-15). Las somitas cervicales, torácicas, lumbares y sacras es­
tablecerán la organización segmentaria del cuerpo al dar lugar a
la mayor parte del esqueleto axil (inclusive la columna verte­
bral), los músculos voluntarios y parte de la dermis de la piel.
► El mesodermo intermedio (MI), un par de condensaciones ci­
lindricas menos pronunciadas, justo laterales al mesodermo pa­
raxil. El MI formará el sistema urinario y partes del sistema
genital.
► El mesodermo de la placa lateral (MPL), el resto del mesoder­
mo lateral que forma una hoja aplanada. El MPL se divide en
dos capas a partir del día 17 del desarrollo humano:
• el m esoderm o esplacnopleural, la capa adyacente al endo­
dermo, que origina el recubrimiento mesotelial de los ór­
ganos viscerales;
• el m esoderm o som atopleural, la capa adyacente al ectoder­
mo, que da lugar al recubrimiento interno de la pared del
cuerpo, parte de los miembros y la mayor parte de la der­
mis de la piel.
3.8 Desarrollo neural
Como ya se describió, el resultado de la gastrulación es un grupo
notable de cambios en el embrión que lo transforman de una es­
tructura en dos capas en una de tres capas. Ahora el desarrollo del
embrión está programado para organizar los tejidos en los precur­
sores de muchos órganos y sistemas contenidos en el adulto. A con­
tinuación se describe el desarrollo inicial del sistema nervioso como
un ejemplo de organogénesis porque muestra la forma en que los
procesos de diferenciación, formación de patrones y morfogénesis
se coordinan de manera exquisita.

Recuadro 3-8. Membranas extraem brionarias y placenta
El desarrollo temprano de los mamíferos se relaciona sobre todo con la
formación de tejidos que en general* no contribuyen al organismo final.
Hay cuatro membranas extraembrionarias (saco vitelino, amnios, corion
y alantoides) y la placenta, que se deriva de una combinación de tejido
embrionario (el corion) y tejido materno. Además de proteger el embrión
(y después el feto), estos sistemas de apoyo de la vida son necesarios
:ara proveer su nutrición, respiración y excreción.
'L a s excepciones son: la parte dorsal del saco vitelino, que se incorpo­
ra en el embrión como el precursor del intestino primitivo, y la alantoi­
des, que en el adulto está representada por un cordón fibroso, un residuo
del cordón umbilical.)
SACO VITELINO. La más primitiva de las cuatro membranas extraembrio-
larias, el saco vitelino, se encuentra en todos los amniotas y asimismo
en tiburones, peces vertebrados y algunos anfibios. En embriones de
aves, el saco vitelino rodea una masa vitelina nutritiva (la parte amarilla
del huevo, que consiste principalmente en fosfolípidos). En muchos ma­
míferos (inclusive humanos y ratones) el saco vitelino no contiene ningún
vitelo. El saco vitelino suele ser importante porque:
► las células germinales primordiales, que se originan del epiblasto,
migran al saco vitelino antes que invadan el reborde gónadal;
► es la fuente de las primeras células sanguíneas del conceptus y de
casi todos los primeros vasos sanguíneos (algunos de los cuales se
extienden por sí mismos dentro del embrión en desarrollo).
El saco vitelino se origina de la placa lateral esplácnica (visceral) meso-
dermo y endodermo.
AMNIOS. El amnios no sólo se encuentra en amniotas (mamíferos, aves,
reptiles) sino también en forma primitiva en algunos peces vertebrados y
ciertos anfibios. Es la más interna de las membranas extraembrionarias y
oermanece unida al embrión rodeándolo inmediatamente. Contiene liqui­
do amniótico que baña el embrión y en consecuencia evita que este últi­
mo se seque durante el desarrollo: lo ayuda a que flote (lo que reduce los
efectos de la gravedad en el cuerpo) y actúa como un cojín hidráulico pa-
■a protegerlo de sacudidas mecánicas, etc. El amnios se deriva del ecto-
dermo y el mesodermo somático de la placa lateral.
CORION. Como el amnios, el corion se encuentra en amniotas y también
en forma primitiva en algunos peces vertebrados y anfibios. Asimism o se
3.8.1 El sistema nervioso se desarrolla después que
el mesodermo subyacente induce al ectodermo
a diferenciarse
El desarrollo del sistema nervioso marca el principio de la organogé­
nesis y comienza al final de la tercera semana del desarrollo humano.
El acontecimiento inicial es la inducción del ectodermo suprayacen-
rc por el mesodermo axil (Wilson y Edlund, 2001). Al interior de es­
te ultimo, células de la placa precordial y de la porción craneal de la
r aca notocordial transmiten señales a las células suprayacentes del
ectodermo y ocasionan su diferenciación en una placa gruesa de cé-
_las neuroepiteliales (neuroectodermo). La placa neural resultante
¡carece el día 18 del desarrollo humano pero crece con rapidez y
cambia de proporciones durante los siguientes dos días (fig. 3-16).
Al inicio de la cuarta semana, un proceso que se conoce como
neurulación conduce a la conversión de la placa neural en el tubo
oeural, el precursor del cerebro y la médula espinal. La placa neu­
ral comienza a plegarse en sentido ventral a lo largo de su línea me­
3.8 | DESARROLLO NEURAL 89
deriva del ectodermo y el mesodermo somático de la placa lateral. En em­
briones de aves, como los pollos, el corion está presionado contra la
membrana de recubrimiento pero en embriones de mamíferos está com ­
puesto por células trofoblásticas, que producen las enzimas que erosio­
nan el recubrimiento del útero y ayudan al embrión a implantarse en la
pared uterina. El corion también es una fuente de hormonas (gonadotro-
pina coriónica) que Influyen tanto en el útero como en otros sistemas. En
todos estos casos el corion sirve como una superficie para el intercam­
bio respiratorio. El corion proporciona el componente fetal de la placenta
en mamíferos placentados (véase más adelante).
ALANTOIDES. La más reciente en términos evolutivos de las membranas
extraembrionarias, la alantoides, sólo se encuentra en amniotas (cuyo
nombre quizá deba cambiarse por alantoisotas). Actúa como un sistema
de depósito de desechos (orina) en aves, reptiles y de hecho en la mayor
parte de los amniotas, pero no en mamíferos placentados. La alantoides
se deriva de un abultamiento hacia el exterior del piso del intestino caudal
y en consecuencia se compone de endodermo y mesodermo esplácnlco
de la placa lateral. Aunque es notable en algunos mamíferos, en otros (in­
clusive los humanos) es un vestiglo (no tiene ninguna función) excepto
que sus vasos sanguíneos dan origen al cordón umbilical.
PLACENTA. La placenta es una característica que sólo presentan los ma­
míferos placentados y se deriva en parte del conceptus y en parte de la
pared uterina. Se desarrolla después de la implantación, cuando el em­
brión induce una respuesta en el endometrio materno vecino y lo cambia
para que se constituya en un tejido muy vascular que contiene nutrimen­
tos llamado decidua. Durante la segunda y la tercera semanas del desa­
rrollo, el tejido del trofoblasto se torna vacuolado, las vacuolas unen los
capilares maternos cercanos y se llena rápidamente con sangre. Confor­
me el corion se forma, se proyectan evaginaciones al interior de las va­
cuolas, conocidas como vellosidades coriónícas, que ponen en íntimo
contacto los aportes sanguíneos materno y embrionario. Al final de las
tres semanas el corion está diferenciado a plenitud y contiene un sistema
vascular conectado al embrión. El intercambio de nutrimentos y produc­
tos de desecho ocurre sobre las vellosidades coriónicas. Al inicio el em­
brión está rodeado del todo por la decidua, pero a medida que crece y se
expande hacia el útero, el tejido decidual suprayacente (decidua capsular)
se adelgaza y luego se desintegra. La placenta madura se deriva por com ­
pleto de la decidua basal subyacente.
dia para formar una depresión llamada surco neural. Se piensa que
éste se desarrolla en respuesta a señales inductoras del notocordio
apuesto en la cercanía. Los pliegues neurales gruesos giran alrede­
dor del surco neural y se encuentran dorsalmente, al principio en
un punto medio a lo largo del eje craneocaudal (fig. 3-16A). El cie­
rre del tubo neural prosigue en forma semejante a una cremallera y
en ambas direcciones. Los sitios en que el cierre es incompleto
muestran un neuroporo anterior y un neuroporo posterior. En oca­
siones parte del tubo neural no se cierra y esto ocasiona trastornos
como la espina bífida.
Durante la neurulación, una población específica de células que
surge a lo largo de los márgenes laterales de los pliegues neurales se
desprende de la placa neural y migra a muchos sitios específicos
dentro del cuerpo. Este grupo de células muy versátiles, denomina­
do cresta neural, origina parte del sistema nervioso periférico, los
melanocitos, parte de hueso y músculo, la retina y otras estructuras
(García-Castro y Bonner-Fraser, 1999; Knecht y Bonner-Fraser,
2 0 02 ; recuadro 3-5).
 GASTRULACIÓN HUMANA GASTRULACIÓN DEL RATÓN

C ono ectoplacen tario

Ectoderm o
M e m b ra n a am niotica extraem brionario
C avidad am niotica
Epiblasto (em brión) Endoderm o visceral
Endoderm o parietal
H ipoblasto
S aco vitelino
S aco vitelino
Epiblasto
(curvado)
Pared uterina
Trofoblasto
M esod erm o

B) N udo prim itivo Estría

prim itiva
Am nios
Epiblasto
Endoderm o

H ipoblasto \ x Epiblasto N otocordio

S aco vitelino

C)

M ovim iento de células a través

del surco prim itivo. Invaginación
para form ar m esoderm o y en doderm o

D isco germ inal bilam inar

Estría prim itiva

Epiblasto

Hipoblasto

14 a 15 días Endoderm o 16 días M esod erm o E ndoderm o definitivo

Fig. 3-14. La gastrulación en humanos y otros primates incluye la reorganización de un disco germinal bilaminar plano para formar un embrión tri­
laminar mediante la deslaminación programada de células del epiblasto.

(A a C) Aunque el resultado final de la gastrulación es similar en todos los mamíferos, puede haber diferencias mayores en los detalles de la morfogénesis, en
particular en el modo en que se forman y utilizan las estructuras extraembrionarias. A la derecha se muestra la gastrulación en el ratón para comparación. En
esta especie el disco germinal plano es reemplazado por un huevo cilindrico en forma de copa y las células “ salen” de la estria primitiva hacia la superficie del
embrión y no al interior del mismo. El futuro eje anteroposterior se envuelve alrededor de la base de la copa. D) Después de 14 a 15 días del desarrollo huma­
no, las células mesodérmicas que están ingresando invaden el hipoblasto y desplazan sus células, lo que conduce a la formación del endodermo embrionario.
El día 16 alguna de las células del epiblasto que está ingresando se desvían hacia el espacio entre el epiblasto y el endodermo naciente para formar el meso­
dermo embrionario. Obsérvese que si bien el epiblasto da lugar a las tres capas germinales (ectodermo, endodermo y mesodermo), el hipoblasto origina el
endodermo extraembrionario que recubre el saco vitelino. Embriones humanos redibujados de Larsen (2002) Human Embryology 3a. ed, con autorización de
Elsevier. Embriones de ratón redibujados de Twyman (2001), Instant Notes Developmental Biology. Publicado por BIOS Scientific Publishers.
 3.8 DESARROLLO NEURAL 91

A)

S u rc o
p r im it iv o

N udo
E p ib la s t o -
p r im it iv o
E n d o d e rm o

B) M e s o d e rm o
p a r a x il
M e s o d e rm o
in te r m e d io
M esod erm o de
la p laca lateral
P ro c e s o
n o to c o r d ia i

D) S o m ita
M e s o d e r m o in te r m e d io

S o m itó m e r o s 1 a 7

S o m ita s

N o to c o r d io M e s o d e r m o in te r m e d io

E m in e n c ia —
caudal

Fig. 3-15. Vías de migración y destinos de las células mesodérmicas que ingresan durante la gastrulación.
A) Migración temprana del mesodermo. Las células del epiblasto que ingresan a través del nudo primitivo migran cranealmente para formar la placa
precordial, una masa compacta de mesodermo justo craneal al nudo primitivo, y el proceso notocordiai un tubo denso en la línea media que después
formará un bastón sólido, el notocordio. Las células del epiblasto que ingresan a través del surco primitivo migran para form ar el mesodermo lateral que
flanquea la línea media. B) Diferenciación temprana del mesodermo lateral. El mesodermo que flanquea inmediatamente el proceso notocordiai forma
condensaciones cilindricas, el mesodermo paraxil. Las condensaciones cilindricas vecinas, menos pronunciadas, son el mesodermo intermedio. El res­
to del mesodermo lateral form a una hoja aplanada, el m esodermo de la placa lateral. C) Diferenciación del mesodermo de la placa lateral (MPL). Se
forman vacuolas en el MPL y se dividen en dos capas, una ventral, el mesodermo esplacnopieural. que da lugar al recubrimiento mesotelial de los órga­
nos viscerales, y el mesodermo somatopleural dorsal, que origina el recubrimiento interno de las paredes del cuerpo y la mayor parte de la dermis.
D) Formación de somitómeros. El mesodermo paraxil forma una serie de estructuras redondas semejantes a verticilos, los somitómeros. Con excep­
ción de los somitómeros 1 a 7 (véase texto), los somitómeros darán lugar a las somitas, bloques de mesodermo segmentario que establecen la organi­
zación segmentaria del cuerpo. En este diagrama de un embrión humano de 21 días ya se diferenciaron en somitas seis somitómeros centrales.
Adaptado de Larsen (2002) con autorización de Churchill Livingstone Publishers.
 92 CAPÍTULO TRES ! CÉLULAS Y DESARROLLO

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Recuadro 3-‘>. Determinación del sexo: genes y ambiente en el desarrollo
Como los mamíferos, los humanos son sexualmente dimorfos, es decir
hay sexos masculino y femenino separados. La decisión entre desarrollo
masculino y femenino ocurre en la concepción, durante la que el esper­
matozoo lleva un cromosoma X o uno Y al óvulo, que siempre contiene
un cromosoma X (Schafer y Goodfellow, 1996). Las únicas excepciones
a esta regla general se observan cuando errores en la meiosis producen
gametos con menos o más cromosomas del sexo, cuyo resultado son in­
dividuos con aneuploidias de cromosoma del sexo (sección 2.5.2). Aun­
que el sexo del embrión humano se establece en la concepción, la
diferenciación sexual comienza hasta que el embrión tiene alrededor de
cinco semanas de edad. Las formas de diferenciación sexual son dos;
una incluye las características sexuales primarias (el desarrollo de la
gónada y la elección entre el desarrollo de espermatozoo y óvulo) y otra
comprende las características sexuales secundarias (las estructuras
específicas del sexo del sistema urogenital y los genitales externos). Las
características sexuales primarias dependen del genotipo del embrión, en
tanto que las características sexuales secundarias, de señales del am­
biente, mediadas por señalamiento hormonal.
El desarrollo masculino depende de la presencia o ausencia del crom oso­
ma Y, que contiene un gen determinante masculino critico llamado SRY
(región determinante del sexo del cromosoma Y). El SRY codifica un fac­
tor de transcripción que activa genes corriente abajo necesarios para el
desarrollo de los testículos. A continuación estos últimos producen hor­
monas sexuales que se requieren para el desarrollo de las características
sexuales secundarias masculinas. Durante mucho tiempo se pensó que el
desarrollo de la gónada femenina era un “estado de descuido” y que el
gen SRY era suficiente para cambiar la gónada embrionaria indiferente de
la diferenciación femenina a la masculina. Este hecho se apoyó en varias
I líneas de pruebas: los raros varones XX suelen tener un fragmento peque­
ño del cromosoma Y, inclusive SRY, translocado hacia la punta de uno de
sus cromosomas X y los ratones genéticamente hembras transgénicos
del gen Sry del ratón se desarrollan como machos. Sin embargo, estudios
más recientes sugieren que los genes en el cromosoma X y los autoso-
mas participan en la regulación positiva del desarrollo del ovario. La ex­
presión excesiva de estos genes, que comprenden DAX y WNT4A, puede
feminizar individuos XY aun si poseen un gen SRY funcional.
Al parecer el desarrollo temprano del gameto está controlado más por el
ambiente que por el genotipo de las células germinales. Las células ger­
minales primordiales (CGP) femeninas introducidas en los testículos co­
3.8.2 La formación del patrón en el tubo neural incluye
la expresión coordinada de genes a lo largo
de dos ejes
Tan pronto se forma la placa neural, se tornan visibles tres vesículas
craneales grandes (el futuro cerebro) y una sección caudal más estre­
cha que formará la médula espinal. Esta polaridad craneocaudal re­
fleja la especificidad regional de la inducción neural, es decir, que las
señales que provienen del mesodermo axil contiene información po-
sidonal que conduce a que el ectodermo suprayacente forme tejido
neural específico para diferentes partes del eje. La naturaleza precisa
de la señal en amniotas no se comprende (Stern, 2002). En Xenopus
hay un modelo bien establecido en el que miembros de la familia de
la proteína morfogenética ósea (PMO) de proteínas de señalamien­
to previenen el desarrollo neural y antagonistas de la proteína mor­
fogenética ósea (PMO) inician la inducción neural. Sin embargo, al
parecer el mecanismo en aves y mamíferos es mucho más complejo
3.8 DESARROLLO NEURAL 93
menzarán a diferenciarse en espermatozoos y las CGP masculinas que se
introducen en el ovario comenzarán a diferenciarse en oocitos. Esto pue­
de indicar la regulación del ciclo celular, ya que las CGP que entran en el
testículo se detienen antes de la meiosis en tanto que las que ingresan al
ovario comienzan la meiosis de inmediato. Por tanto las CGP de cualquie­
ra de los sexos que invaden tejido somático fuera de la gónada empiezan
a diferenciarse en oocitos porque no hay una señal para detener el ciclo
celular. Sin embargo, no se producen gametos funcionales en todas estas
situaciones poco frecuentes. La diferenciación aborta en una etapa hasta
cierto punto tardia, tal vez porque el genotipo de las células germinales en
sí mismas también tiene una función crítica en el desarrollo del gameto.
A diferencia de lo que ocurre con las características sexuales primarias,
al parecer las caracteristicas sexuales secundarias femeninas son el es­
tado de falta de cumplimiento. Uno de los genes regulados por SRY es
NR5A1, que codifica otro factor de transcripción llamado factor 1 esteroidó-
geno (SF1). Éste activa genes necesarios para la producción de hormonas
sexuales masculinas, Inclusive HSD17B3 (que codifica la deshidrogena-
sa 3 de hidroxiesteroides beta-17, necesaria para la síntesis de testoste-
rona) y AMH (el gen que codifica la hormona antimulleriana). Ambas
hormonas tienen acciones importantes en la diferenciación del sistema
urogenital masculino. Por ejemplo, AMH origina la desaparición de los
conductos mullerianos (que se constituyen en las trompas de Falopio y el
útero en mujeres). Las mutaciones que inhiben la producción, distribu­
ción, eliminación o percepción de estas hormonas producen individuos
XY feminizados. Por ejemplo, el síndrome de insensibilidad al andrógeno
es resultado de defectos en el receptor de testosterona que impiden que
el cuerpo responda a la hormona aun si se produce a concentraciones
normales. El aspecto exterior de los individuos XY con esta enfermedad
es de mujeres normales, pero debido a los efectos de SRY y AMH poseen
testículos no descendidos en lugar de ovarios y carecen de útero y trom ­
pas de Falopio. Las mutaciones que conducen a la producción excesiva
de hormonas sexuales masculinas en mujeres tienen el efecto opuesto,
es decir, la virilización de individuos XX. En ocasiones esto ocurre en ge­
melos fraternos masculino/femenino en desarrollo cuando el gemelo
hembra se expone a las hormonas masculinas de su hermano. La enzima
CYP19 convierte los andrógenos en estrógenos de tal manera que las
mutaciones que incrementan su actividad pueden producir feminización
de varones, en tanto que las que la disminuyen o suprimen suelen condu­
cir a virilización en mujeres.
y constituye un área de investigación activa. Parece probable que
una señal general neurulizante se libere del mesodermo que induce
la formación de la placa neural que es de carácter anterior. Esto de­
be “posteriorizarse” por otra señal que se origina en la región caudal
del embrión. Se requieren moléculas adicionales, secretadas de mo­
do específico por el mesodermo anterior, para formar la cabeza.
Cualquiera que sea el mecanismo subyacente, las señales activan
diferentes grupos de factores de transcripción a lo largo del eje y és­
tos confieren identidades de posición a las células y regulan su con­
ducta. En el cerebro anterior y el cerebro medio se expresan factores
de transcripción de las familias Emx y Otx. Las identidades de po­
sición están controladas por los genes H oxen el cerebro caudal y la
médula espinal. Al parecer en el cerebro caudal los valores posicio-
nales de las células se fijan en la etapa de la placa neural y las célu­
las de la cresta neural que migran con esta información posicional
imponen identidades de posición en los tejidos circundantes. Por el
contrario, la identidad posicional en la médula espinal está impues­
94 CAPÍTULO TRES CÉLULAS Y DESARROLLO
ta por señales del mesodermo paraxil circundante. Esto puede de­
mostrarse mediante el trasplante de células a diferentes partes del
eje. Las células de la cresta neural craneal se comportan según su li­
naje cuando se mueven a una nueva posición, es decir, hacen las
mismas cosas que harían en su posición original. Las células de la
cresta del tronco se comportan de acuerdo con su nueva posición
-hacen las mismas cosas que sus vecinas.
El sistema nervioso central en desarrollo es un buen modelo de
formación y diferenciación del patrón, ya que a lo largo del eje dor-
soventral surgen varios tipos de células (diferentes clases de neuro­
nas y glía). Una jerarquía de reguladores genéticos controla este
proceso (Lumsden y Krumlauf, 1996; Tanabe y Jessel, 1996;EisIen
1999; fig. 3-16B, C).
La polaridad dorsoventral es generada por grupos oponentes de
señales que se originan en el notocordio y el ectodermo adyacente.
El notocordio secreta la molécula de señalamiento Sonic hedgehog,
que tiene actividad ventralizante, en tanto que el ectodermo secre­
ta varios miembros de la superfamilia del factor transformador del
crecimiento ¡3 (TGF), inclusive BMP4, BMP7 y una proteína de­
nominada dorsalina. Conforme la placa neural comienza a doblar­
se, estas mismas señales empiezan a expresarse en las regiones
extremas ventral y dorsal del tubo neural en sí mismo -la placa del
piso y la placa del techo respectivamente—. Las señales oponentes
tienen efectos contrarios en la activación de varios factores de trans­
cripción de clase homeodominio. Como se muestra en la figura 3-
16B, esto divide el tubo neural en zonas dorsoventrales discretas, o
dominios de factor de transcripción, que después se convierten en
los centros regionales de diferentes clases de neuronas. Por ejemplo,
la zona definida por la expresión de Nkx6.1 sólo se convierte en la
región poblada por neuronas motoras, que residen en el tercio ven­
tral del tubo neural.
3.8.3 La diferenciación neurona! incluye ta actividad
com binatoria de facto res de transcripción
Las neuronas no surgen de manera uniforme en el ectodermo neural
sino que se restringen a regiones específicas delimitadas por la expre­
sión de genes proneurales, como neurogenina, MASH1 y MATH1
(fig. 3-16C), que codifican factores de transcripción de la familia
bHLH. La expresión génica proneural confiere a las células capacidad
para formar neuroblastos, pero no todas las células proneurales pue­
den adoptar este destino. Por el contrario, hay competencia entre las
células que incluyen la expresión de genes neurógenos como Notch y
Delta. Las células que tienen éxito forman neuroblastos e inhiben las
células circundantes para que realicen lo mismo. En consecuencia los
neuroblastos surgen en un patrón de espaciamiento preciso. Este pa­
trón que forma procesos se denomina inhibición lateral. A continua­
ción las neuronas comienzan a diferenciarse según su posición con
respecto a los ejes dorsoventral y craneocaudal del sistema nervioso,
que se define por la combinación de los factores de transcripción que
se comentaron en la sección previa (Panchision y McKay, 2002).
Refinamientos en los patrones de expresión de estos factores de
transcripción controlan la diversificación adicional. Por ejemplo, al
principio todas las neuronas motoras expresan dos factores de trans­
cripción de la familia homeodominio LIM: Islet-1 e Islet-2. Luego só­
lo las neuronas motoras que proyectan sus axones a los músculos de
la extremidad ventral expresan estos factores de transcripción LIM y
no otros. Las neuronas que expresan Isl-1, Isl-2 y un tercer factor de
transcripción, Lim-3, proyectan sus axones hacia los músculos axiles
de la pared del cuerpo. Las neuronas que expresan Isl-2 y Lim-1 pro­
yectan sus axones a los músculos de la extremidad dorsal, en tanto que
las que expresan Isl-1 sólo proyectan sus axones a ganglios linfáticos
(fig. 3-16C). Los factores de transcripción determinan las combina­
ciones particulares de receptores que se expresan en los conos de cre­
cimiento del axón y por tanto determinan también la respuesta de los
axones en crecimiento a diferentes indicios físicos y químicos (qui-
mioatrayentes, etc.) (Tessier-Lavigne y Goodmans, 1996). Una vez
que los primeros axones llegan a sus blancos, los axones adicionales
pueden encontrar su camino al crecer a lo largo de las vías de axón
existentes -un proceso que se denomina fasciculación—,
3.9 Conservación de las vías
dei desarrollo
3.9.1 M uchas enferm edades hum anas % deben a falla
de procesos del desarrollo norm ales
Las enfermedades humanas más espectaculares incluyen anormalida­
des morfológicas notables que se deben a alteraciones de los procesos
generales de diferenciación, formación de patrón y morfogénesis. Un
ejemplo es la holoprosencefalia, una falla del proceso normal de de­
sarrollo del cerebro anterior que en su forma más grave da lugar a
individuos con un solo ojo (ciclopía) y sin nariz. Como en otras en­
fermedades humanas, el fenotipo puede influirse tanto por factores
genéticos como ambientales. En algunos casos es claro que este de­
fecto lo causaron mutaciones específicas, por ejemplo, mutaciones
en el gen SHHque codifican la proteína de señalamiento Sonic hed­
gehog. Por otra parte la anormalidad puede seguirse hasta una cau­
sa ambiental, como el consumo limitado de colesterol en la dieta
materna. La determ inación del sexo, que se describe en el recuadro 3-
9, ilustra con claridad las funciones relativas de los genes y el am­
biente en un proceso de desarrollo.
Aunque ciertas anormalidades del desarrollo pueden seguirse
hasta el uso de fármacos (las sustancias químicas que se sabe tienen
efectos teratógenos incluyen alcohol, ciertos antibióticos, talidomi-
da, ácido retinoico y drogas ilegales como cocaína y heroína), mu­
chas resultan de mutaciones en genes específicos. Como se indicó
al inicio de este capítulo, algunos de los genes del desarrollo más
importantes son de naturaleza reguladora y codifican factores de
transcripción o componentes de vías de señalamiento. Los genes
que codifican componentes estructurales de la célula o de la matriz
extracelular, e inclusive enzimas metabólicas, también tienen una
función destacada en el desarrollo y revelan fenotipos de enferme­
dades importantes. El cuadro 3-8 presenta algunos ejemplos.
3.9J2 Los procesas del desarrollo están muy bien
conservados tanto a nivel de genes únicos
co n » a nivel de vías com pletas
En los casos en que se demuestra que los genes causan enfermeda­
des del desarrollo, a menudo se observa un grado notable de con­
servación evolutiva entre animales. Esta conservación no sólo se
aplica a los genes sino también a las vías completas en las que par­
ticipan (Pires-daSilva y Sommer, 2003; fig. 3-17).
Con frecuencia se utilizan vías moleculares conservadas para
procesos similares en especies relacionadas de manera muy distan­
te. Por ejemplo, como se comentó antes brevemente, la inducción
 3.9 ^ CONSERVACIÓN’ DE LAS VIAS DEL DESARROLLO 95

Cuadro 3-8 Selección de genes del desarrollo humano relacionados con fenotipos de enfermedad específicos. Se consideran varias cla­
ses mayores de productos génicos: proteínas de señalamiento, receptores, factores de transcripción, proteínas estructurales y enzimas
Gen Producto y función normal Trastorno relacionado

Proteínas de señalamiento secretadas

SHH Sonic hedgehog Holoprosencefalia, un trastorno en el que el cerebro anterior en desarrollo no se

Proteína de señalamiento a cargo de la form a­ separa en hemisferios izquierdo y derecho. En casos graves, hay un ventrículo
ción del patrón de tubo neural, somltas, intesti­ cerebral único y ciclopía. En casos muy leves, la enfermedad puede manifestar­
no y yemas de los miembros se por un incisivo central único

EDN3 Endotelína 3, hormona péptída que regula la va­ Enfermedad de Hirschsprung, un trastorno de la diferenciación de la cresta neu­
soconstricción, necesaria durante el desarrollo ral en el que no se forman ganglios entéricos; causa megacolon (estreñimiento
para la diferenciación de derivados de la cresta y obstrucción intestinal crónicos) que se debe a la ausencia de movimientos pe­
neural ristálticos

GH1 Hormona del crecimiento 1, hormona polipépti- Enanismo hipofisario, una form a de enanismo que puede tratarse con la admi­
da que se expresa en la glándula hipófisis y tie­ nistración de hormona del crecimiento purificada o recombinante durante la ni­
ne a su cargo la regulación del crecimiento ñez

LEFTB Lefty 2, proteína de señalamiento relacionada con Defectos de lateralidad — situs inversus, isomerlsmo o heterotaxia— , ocasiona­
el nudo que se expresa de manera especifica en dos por falta de especificación del eje izquierda-derecha
el lado izquierdo del embrión temprano y ayuda a
establecer la asimetría izquierda-derecha

Receptores

FGFR3 Receptor para factores de crecimiento de fibro­ Acondroplasla, la forma más frecuente de enanismo de miembros cortos
blastos, que se expresa con fuerza particular en Síndrome de Crouzon y craneosinostosis, anormalidades craneofaciales graves
cartílago y sistema nervioso. Desempeña una
función mayor en el desarrollo óseo

EDNRB Receptor de endotelína B, se encuentra en célu­ Enfermedad de Hirschsprung (véase EDN3, antes)
las de la cresta neural y se requiere para su dife­
renciación en melanocltos y ganglios entéricos

KIT KIT es un receptor de cinasa de tirosina, llama­ Piebaldismo, caracterizado por placas congénitas de piel y pelo blancos por fal­
da así porque originalmente se encontró como ta de proliferación de melanocitos
oncogén en un virus de sarcoma felino. El re­
ceptor se expresa en form a amplia pero tiene
acciones particularmente Importantes en el de­
sarrollo del linaje de células sanguíneas, mela-
nocitos y células germinales

GHR Receptor de hormona del crecimiento, transduce Enanismo de Laron, una forma de enanismo en la que los valores séricos de hor­
señales para la hormona del crecimiento (véase mona del crecimiento son normales y que no responde al tratamiento con hor­
antes) mona del crecimiento. También se conoce como síndrome de insensibilidad a
hormona del crecimiento
Factores de transcripción

H0XD13 Factor de transcripción que participa en la for­ Polisindactllia (dedos extrafusionados) causada por la especificación errónea de
mación del patrón. Confiere información posi- tipos celulares y la consiguiente formación de estructuras óseas anormales en
cional a lo largo del eje craneocaudal y en el las regiones distales de los miembros
desarrollo de los miembros

PAX6 Factor de transcripción con múltiples acciones Defectos oculares que varían de pupilas con ectopia leve (pupilas fuera del cen­
en el desarrollo del ojo tro) a aniridia (ausencia parcial o total del iris, en combinación con malformacio­
nes del cristalino y la cámara anterior, y degeneración corneal)

TBX5 Factor de transcripción que se expresa de modo es­ Síndrome de Holt-Oram, un trastorno de los miembros superiores que también
pecífico en la región del miembro delantero del em­ afecta el desarrollo del corazón
brión en desarrollo, tiene una función importante en
el establecimiento de la Identidad del miembro (de­
sarrollo del brazo comparado con el de la pierna)

SRY Factor de transcripción expresado en el reborde Reversión del sexo masculino (aspecto externo femenino en individuos XY) que
gonadal de embriones masculinos y necesario suele acompañarse de disgenesia gonadal completa
para iniciar la diferenciación sexual masculina.
Se encuentra en el cromosoma Y
96 1 CAPÍTULO TRES CÉLULAS Y DESARROLLO
Cuadro 3-8. continuación
Gen Producto y función norm al
Proteínas estructurales
C0L6A1 Subunidad alfa de la colágena VI, principal com ­
ponente de microflbrillas en la matriz extracelu-
lar que proporciona rigidez estructural a los
tejidos
ELN Elastina, una proteína de la matriz extracelular
que permite que los tejidos recuperen su forma
original después de deformarse
LAMA3 Subunidad alfa 3 de laminina 5, un componente
de la membrana basai de la piel que desempeña
una función Importante en la diferenciación de
queratinocitos
USH2A Proteina de matriz extracelular necesaria para el
desarrollo del ojo y el oído interno
Enzimas
WRN Una helicasa que tal vez se relaciona con la re­
paración de roturas del DNA de doble cadena
CYP11B1 Hidroxilasa de esteroides 11 -beta, necesaria pa­
ra la síntesis de aldosterona (una hormona que
actúa en los riñones y regula el equilibrio mine­
ral y del agua)
HSD17B3 Deshidrogenasa de hidroxíesteroides beta-17,
necesaria para la síntesis de testosterona
EXT1 Glucosiltransferasa necesaria para la síntesis de
un sulfato de heparán, un constituyente impor­
tante de la matriz extracelular
neural en embriones de Xenopus incluye una batalla entre los efec­
tos opuestos de BMP4, que favorece destinos ventral y lateral, y
factores de dorsalización (neurulizantes) como Chordin, Noggin y
Follistatin. Los ortólogos de Drosophila de BMP4 y Chordin son
proteínas llamadas decapentapléjicas (Dpp) y de gastrulación corta
(Sog) respectivamente. Resulta notable que estas proteínas tengan
funciones equivalentes en la formación del sistema nervioso de
Drosophila. De hecho la relación va más allá. La actividad de Dpp
en Drosophila se incrementa con la proteína Tolloid (Tol) que de­
grada Sog. En Xenopus la función de Tol la realiza su ortólogo Xo-
lloid (Xol) y en el pez cebra la molécula equivalente es BMP1.
Tanto Xolloid como BMP1 degradan Chordin. Hay asimismo un
pareamiento de phylum cruzado de Xenopus BMP7 y la proteína
Drosophila Screw, proteínas accesorias necesarias para la actividad
de BMP4/Dpp.
En otros casos la misma vía del desarrollo se emplea para pro­
pósitos muy diferentes en distintas especies. En mamíferos el factor
de crecimiento epidérmico (EGF) se utiliza para promover la pro­
liferación de células epidérmicas. Este factor de crecimiento se en­
laza con el receptor de EGF, un receptor de cinasa de tirosina, e
inicia la cascada de cinasa Ras-Raf-MAP (sección 3.2.1). Drosophi­
la usa la misma vía para promover la diferenciación de uno de los
ocho tipos de células fotorreceptoras durante el desarrollo del ojo.
Trastorno relacio nado
Míopatía de Bethlem, que incluye la contracción de articulaciones (en particular
los codos y los tobillos), a causa de ausencia de microfibrlllas de colágena VI.
La expresión excesiva puede contribuir a defectos cardiacos en el síndrome de
Down
Cutis laxa, piel suelta y holgada que resulta de una deformación permanente;
puede deberse a elastina anormal y disfuncional
Estenosis aórtica, ocasionada por deformación de la aorta
Epidermólisis ampollar de la unión grave, un trastorno vesicante de la piel en el
que se desprenden células basales de la membrana basai
Síndrome de Usher tipo II, caracterizado por sordera grave desde el nacimiento
e inicio de retinitis pigmentosa en los últimos años de la adolescencia
Síndrome de Werner, una enfermedad de envejecimiento prematuro
Hiperplasia suprarrenal congènita, que incluye crecimiento rápido en la niñez pe­
ro terminación prematura del alargamiento óseo cuyo resultado es estatura cor­
ta de adulto
Seudohermafroditismo masculino, en el que los niños nacen con aspecto feme­
nino externo no ambiguo, pero se virilizan durante la pubertad
Exostosis múltiple hereditaria, un trastorno en el que se forman tumoraciones
cartilaginosas cerca de los extremos de los huesos, en particular en los miem­
bros, pero a veces también en las costillas y los hombros
Los nematodos emplean la misma vía para estimular la división y
la diferenciación de células vulvares.
El mejor ejemplo de conservación evolutiva incluye los genes
que contienen homeobox, que al parecer se encuentran en todos los
animales y desempeñan funciones muy similares. La capacidad de
genes ortólogos de muy diferentes especies para sustituirse entre sí
demuestra la función fundamental de estos genes en la formación
del patrón. Por ejemplo, se introdujeron genes humanos HOX y
OTXen líneas de Drosophila en las que se mutaron genes ortólogos
y ello condujo a un rescate completo del fenotipo mutante.
Sin embargo, también se observan diferencias importantes en­
tre especies, aun entre las que están relacionadas muy de cerca. Con
base en la similitud extensa entre humanos y ratones, tal vez sor­
prenda que el proceso de gastrulación deba ser tan distinto (fig.
3-14). De hecho se observa una gran diferencia entre los embrio­
nes vertebrados antes de la gastrulación, que refleja diferentes estra­
tegias para la adquisición de nutrimentos. Los mecanismos que
determinan el sexo también son muy diversos (Morrish y Sinclair,
2002). No todos los mamíferos emplean el modelo humano de de­
terminación del sexo XY (Graves, 2002) y muchos reptiles prescin­
den por completo del uso de cromosomas del sexo heteromorfos y
confían en la temperatura del ambiente para especificar el sexo del
embrión.
 BIBLIOGRAFÍA ! 97

»
V e r te b r a d o s D ro s o p h ila
In h ib id o r X o llo ¡d /B M P 1 T o llo id

E lim in a d o r C h o rd in SOG

A c tiv a d o r BMP7 S c re w

L ig a n d o BMP4 DPP

H um anos D ro s o p h ila C a e n o r h a b d itis

L ig a n d o EGF BOSS L IN -3

R e c e p to r EGFR S e v e n le s s L E T -2 3

- A d a p t a d o r S H 2 /S H 3 GRB2 D rk S E M -5

— P r o te ín a G R as R asi L E T -6 0

A ctivador de G T P -as a e G A P /G N R P G a p 1 /S O S G a p -1
intercam blador d e nucleótido

Fig. 3-17. Conservación evolutiva de las vías del desarrollo.

A) Vía BMP4/Chordin que sustenta la inducción neural en Drosophila y vertebrados. B) Vía de señalamiento del factor de crecimiento, que tiene diversas
acciones en vertebrados, moscas y gusanos.

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CAPÍTULO CUATRO

Genes en genealogías y poblaciones

Contenido del capítulo

102 CAPÍTULO CUATRO GENES EN GENEALOGÍAS Y POBLACIONES
4.1 Herencia monogènica comparada
con muitifactorial
Los caracteres genéticos más simples son aquellos cuya presencia o
ausencia dependen del genotipo en un locus aislado. Esto no signi­
fica que el carácter en sí mismo sea programado sólo por un par de
genes: es probable que la expresión de cualquier carácter humano re­
quiera un gran número de genes y factores ambientales. Sin embar­
go, en ocasiones es tanto necesario como suficiente un genotipo
particular en un locus para que el carácter se exprese, si se conside­
ra el fondo genético y ambiental humano normal. Estos caracteres
se denominan mendelianos. Los caracteres mendelianos pueden re­
conocerse por los patrones genealógicos característicos que propor­
cionan (sección 4.2). En el hombre se conocen más de 6 000
caracteres mendelianos. Como se describe en “Antes de comenzar:
uso inteligente de la Internet”, el punto de inicio esencial para ad­
quirir información de cualquiera de estos caracteres, sea patológico
o no, es la base de datos OMIM (www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/).
Casi todos los caracteres humanos están regidos por genes en
más de un locus. Cuanto más alejado esté un carácter de la acción
gènica primaria, menos probable es que muestre un patrón de ge­
nealogía mendeliana simple. Las variantes de secuencias del DNA
casi siempre son puramente mendelianas -lo que constituye su
principal atracción como marcadores genéticos (sección 13.2)-.
Aunque las variantes de proteínas (movilidad electroforética o acti­
vidad de la enzima) suelen ser mendelianas, pueden depender de
más de un locus por la modificación postraduccional (sección
1.5.3). Es probable que la falla o el mal funcionamiento de una vía
del desarrollo que origina un defecto de nacimiento incluya un
equilibrio complejo de factores. Por tanto, los defectos comunes del
nacimiento (paladar hendido, espina bifida, cardiopatia congènita,
etc.) rara vez son mendelianos. Aunque es menos probable aún que
los caracteres conductuales, como el desempeño en la prueba de IQ
(CI) o la esquizofrenia sean mendelianos, pueden estar determina­
dos genéticamente en mayor o menor grado.
Los caracteres no mendelianos dependen de dos, tres o muchos
locus genéticos, con contribuciones mayores o menores de factores
ambientales. En este capítulo se utiliza muitifactorial como un tér­
mino incluyente que abarca todas estas posibilidades. De manera
más específica, la determinación genética puede comprender un nú­
mero pequeño de locus (oligogénica) o muchos de ellos, cada uno
con un efecto individual pequeño (poligénico); o es posible que ha­
ya un locus mayor único con un fondo poligénico. Para los caracte­
res dicótomos (caracteres que pueden tenerse o no, como dedos
extra) los locus subyacentes se asumen como genes de susceptibili­
dad en tanto que para los caracteres cuantitativos o continuos
(estatura, peso, etc.) se ven como locus de carácter cuantitativo
d Varón □ O
0 M u je r
0 1 S e x o d e s c o n o c id o 0 (D
Fig. 4-1. Principales símbolos utilizados en genealogías.
Las generaciones suelen indicarse en números romanos y los individuos dentro de cada generación en números arábigos; III-7 o ili7 es la séptima per­
sona de la izquierda (a menos que se numere en forma explícita de otra manera) en la generación II!. Puede emplearse una /* para indicar los hijos de
pacientes o propósitos (mujer: proposita) a través de los que se descubrió la familia.
(LCC). Cualquiera de estos caracteres puede tender a presentarse en
familias, pero los patrones genealógicos no son mendelianos y no ad­
miten un análisis simple.
4.2 Patrones de genealogía mendelianos
4.2.1 Dominancia y recesividad son propiedad
de caracteres, no de genes
Un carácter es dominante si se manifiesta en heterocigotos y re­
cesivo si no se presenta. Cabe señalar que dominancia y recesividad
son propiedades de caracteres, no de genes. Por consiguiente la ane­
mia de células falciformes es recesiva porque sólo los homocigotos
manifiestan HbS, pero el carácter falciforme, que es el fenotipo de
los heterocigotos de HbS, es dominante. Casi todos los síndromes
dominantes en humanos se conocen sólo en heterocigotos. A veces
se describen homocigotos que nacen de matrimonios de dos perso­
nas heterocigotas afectadas y a menudo los homocigotos se afectan
mucho más. Los ejemplos son la acondroplasia (enanismo con
miembros cortos, MIM 100800) y el síndrome de Waardenburg ti­
po 1 (sordera con anormalidades pigmentarias, MIM 193500). No
obstante, por lo general estos dos trastornos se describen como do­
minantes porque estos términos indican fenotipos que se observan
en heterocigotos. En organismos experimentales, en los que la in-
certidumbre no cabe, los genetistas tienden a utilizar el término se­
midominante cuando el heterocigoto tiene un fenotipo
intermedio y reservan “dominante” para los padecimientos en que
no es posible distinguir entre homocigoto y heterocigoto -p. ej., la
enfermedad de Huntington (deterioro neurològico progresivo de
inicio en el adulto, MIM 143100)-. Wilkie (1994) revisó bien el
problema de la dominancia. Los varones son hemicigotos para lo­
cus en los cromosomas X y Y, donde sólo tienen una copia de cada
gen, de manera que no presentan el problema de dominancia o re­
cesividad para caracteres ligados a X o a Y.
4.2.2 Los cinco patrones básicos de genealogía
m endeliana
La figura 4-1 muestra los símbolos que se utilizan para dibujar ge­
nealogías y el recuadro 4-1 resume los principales factores de cada
patrón. Los caracteres mendelianos pueden ser determinados por
locus en un autosoma o en los cromosomas del sexo X y Y. Los
caracteres autosómicos en ambos sexos y los caracteres ligados a X
en mujeres pueden ser dominantes o recesivos. Nadie tiene dos cro­
mosomas Y genéticamente distintos (en los raros varones XYY, los
dos cromosomas Y son duplicados). Por tanto existen cinco patro-
In d e m n e M a trim o n io
c o n s a n g u ín e o (o p cio n al)
A fe c ta d o
G e m e lo s
P o rta d o r (op cio n al) JZÍ 0 M u e rte
 4.2 PATRONES DE GENEALOGÍA MENDELIANOS | 103

A) O

C br¿ ¿ t O Sh E é r O ÓrO ¿ tO
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

III D ¿ □ □ 4 o d o £ o ¿ b
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

B) & -0 c) i O- -<5
1 2

© tO Q “r ¿ ¿ h rO (l H - Q
2 3 1 | 2 3 | 4 5 | 6

0 = =0
III 4 t O ¿ O
1 1 2 3 4 5 6 7 8

IV
1 2
á ó ■ é>
iv ¿ T o ~ S ~ k >
3 4 5 6
1 2 3 4

D) -o 2

á 3
•4 55 56 i7- ~D

III é. ¿1 2
ír O3 4
6 á
5 6
i 7
Ó
8
E ^ ¿10
9

IV
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
□ "i
13 14

Fig. 4-2. Patrones de genealogía mendeliana básicos.

A) Autosómico dominante; B) autosómíco recesivo; C) recesivo ligado a X; D) dominante ligado a X; E) ligado a Y. El riesgo para los individuos que se
¡ndican con una interrogación son: A) 1 en 2; B) 1 en 4; C) 1 en 2 varones o 1 en 4 de toda la descendencia; D) insignificantemente bajo para varones,
100% para mujeres. Véase la sección 4.3 y la figura 4-5 para las complicaciones de estos patrones básicos.

nes de genealogía mendeliana arquetípicos (fig. 4-2). Como se des­
cribe más adelante, se aplican consideraciones especiales a padeci­
mientos ligados a X y ligados a Y, de modo que en la práctica los
natrones de genealogía mendeliana importantes son autosómico
dominante, autosómico recesivo y ligado a X (dominante o recesi­
vo). Estos patrones básicos están sujetos a varias complicaciones
que se comentan en la sección 4.3 (más adelante) y se ilustran en la
figura 4-5.
La inactivación de X (iionización) confunde la distinción
entre padecimientos ligados a X dominantes y recesivos
Los portadores de afecciones ligadas a X “recesivas” suelen manifes­
tar algunos signos del padecimiento, en tanto que comparados con
los varones afectados, los heterocigotos para afecciones ligadas a X
“dominantes” suelen afectarse en menor grado y de manera variable.
Esto es una consecuencia de la inactivación de X. Como se describe
104 CAPÍTULO CUATRO GENES EN GENEALOGÍAS Y POBLACIONES
R ecuadro 4-1. C aracterísticas de los patrones de herencia m endelianos
Herencia autosómica dominante (fig. 4-2A):
una persona afectada suele tener cuando menos un padre afectado (para
excepciones véase fig. 4-4);
afecta cualquier sexo;
la transmite cualquier sexo;
un niño de un apareamiento afectado x no afectado tiene 50% de posibi­
lidad de afectarse (ello supone que la persona afectada es heterocigota,
lo que suele ser cierto en padecimientos raros).
Herencia autosómica recesiva (fig. 4-2B):
las personas afectadas suelen nacer de padres no afectados;
los padres de personas afectadas suelen ser portadores asintomáticos;
la incidencia de consanguinidad parental es mayor;
afecta cualquier sexo;
después del nacimiento de un niño afectado, cada niño subsecuente tie­
ne 25% de posibilidad de afectarse (si se asume que ambos padres son
portadores fenotipicamente normales).
Herencia recesiva ligada a X (fig. 4-2C):
afecta sobre todo a varones;
los varones afectados suelen nacer de padres no afectados; por lo gene­
ral la madre es un portador asintomático y puede tener familiares varones
afectados;
en la sección 10 .5 .6 , los mamíferos compensan números desiguales
de cromosomas X en varones y mujeres mediante la inactivación
permanente de todos los cromosomas X, excepto uno en cada célu­
la somática. Los varones XY conservan su X única activa, en tanto
que las mujeres XX inactivan una X (que se elige de modo aleato­
rio) en cada célula. La inactivación ocurre temprano en la vida em­
brionaria y una vez que una célula elige la X que activa, esa elección
se transmite en forma clonal a todas sus células hijas.
Un heterocigoto femenino para un padecimiento ligado a X
(dominante o recesivo) es un mosaico (véase sección 4.3.6). Cada
célula expresa el alelo normal o el anormal, pero no ambos. Cuan­
do el fenotipo depende de un producto circulante, como la hemo­
filia (falta de coagulación de la sangre, MIM 306700, 306900), hay
un efecto promediado entre las células normales y anormales. Las
mujeres portadoras tienen un fenotipo intermedio y no suelen ma­
nifestar afección clínica pero son anormales desde el punto de vis­
ta bioquímico. Cuando el fenotipo es una propiedad localizada de
células individuales, como en la displasia ectodérmica hipohidróti-
ca (falta de glándulas sudoríparas, dientes y pelo anormales; MIM
305100), las mujeres portadoras muestran placas de tejido normal
y anormal. En ocasiones se observan heterocigotos con manifes­
taciones de padecimientos recesivos ligados a X. Estas mujeres pue­
den afectarse de modo muy grave porque, por mala suerte, casi
todas las células de algunos tejidos críticos inactivaron la X normal.
El cromosoma Y porta hasta cierto punto pocos genes
Además de la masculinidad en sí misma, la genealogía estereotípi­
ca ligada a X de la figura 4-2E no confiere ningún carácter huma­
no conocido (las afirmaciones de “varón puerco espín” y “oídos
pilosos” son dudosas, véase MIM 146600 y 425500 respectivamen­
las mujeres pueden afectarse si el padre lo está y la madre es un porta­
dor o en ocasiones como resultado de inactivación de X no aleatoria (sec­
ción 4.2.2);
no se transmite de varón a varón en la genealogía (pero los matrimonios
de un varón afectado y una mujer portadora pueden dar el aspecto de
transmisión de varón a varón, véase fig. 4-5G).
Herencia dominante ligada a X (fig. 4-2D):
afecta cualquier sexo, pero más a las mujeres;
por lo general las mujeres se afectan de manera más leve y variable que
los varones;
el niño de una mujer afectada, con independencia de su sexo, tiene una
posibilidad de 50% de afectarse;
todas las hijas de un varón afectado están afectadas, pero ninguno de los
hijos.
Herencia ligada a Y (fig. 4-2E):
sólo afecta a varones;
los varones afectados siempre tienen un padre afectado (a menos que
haya una mutación nueva);
todos los hijos de un varón afectado están afectados.
te). Puesto que las mujeres normales carecen de todos los genes li­
gados a Y, cualquiera de dichos genes debe codificar los caracteres
no esenciales o las funciones específicas masculinas. Algunos genes
existen como copias funcionales, tanto en Y como en X; quizá re­
sulten una excepción a este argumento, pero no proporcionarían
un patrón de genealogía ligado a Y clásico. Las deleciones intersti­
ciales de Yq son una causa importante de infertilidad masculina pe­
ro, desde luego, los varones infértiles no producirán genealogías
como la de la figura 4-2E. Jobling y Tyler-Smith (2000) y Skaletsky
y cois. (2003) resumieron el contenido génico del cromosoma Y y su
posible participación en enfermedades.
Genes localizados en la región de pareamiento Xp-Yp
muestran herencia seudoautosómica
Como se menciona en la sección 2.3.3, las 2.6 Mb distales de Xp e
Yp son homologas y están sujetas a cruzamiento en la meiosis. Por
consiguiente los pocos genes en estas regiones se segregan en un pa­
trón “seudoautosómico” y no alguno ligado al sexo.
4.2.3 Rara vez es posible definir sin ambigüedad la
modalidad de herencia en una genealogía aislada
Con base en el tamaño limitado de las familias humanas, rara vez
es posible estar del todo seguro de la forma de herencia de un ca­
rácter mediante la simple inspección de una genealogía aislada. En
animales de experimentación podría establecerse una prueba cruza­
da y revisarse para una relación 1:2 o 1:4. En genealogías humanas
la proporción de niños afectados no es un indicador muy seguro.
Ello se debe sobre todo a que los números son muy pequeños pe­
ro, además, la forma en que se descubre a la familia puede predis­

poner la relación de niños afectados con los que no lo están. En pa­
decimientos recesivos a menudo la proporción de niños afectados
parece mayor de 1 en 4. Esto se debe a que las familias suelen des­
cubrirse cuando tienen un niño afectado; las familias en que ambos
padres son portadores pero, por fortuna, ninguno está afectado se
pasan por alto de manera sistemática. Estos sesgos de indagación
y las formas de corregirlos se comentan en la sección 15.2.1.
La modalidad de herencia establecida para muchos de los pade­
cimientos más raros no es más que una suposición informada. La
asignación de las modalidades de herencia tiene importancia por­
que constituye la base de las estimaciones del riesgo que se utilizan
en asesoría genética. Sin embargo, es esencial reconocer que con
frecuencia las formas de herencia son hipótesis de trabajo más que
hechos establecidos. La OMIM utiliza un asterisco para indicar las
entradas con modalidades de herencia hasta cierto punto bien esta­
blecidas. La herencia sólo puede definirse con certeza cuando se
dispone de una copia clonada del gen.
4.2.4 Un gen-una enzima no implica un gen-un síndrome
Los patrones de genealogía proporcionan el punto de entrada esen­
cial a la genética humana, pero sólo son un punto de inicio para de­
rruir genes. Sería un error muy serio imaginar que los cerca de
6 000 caracteres mendelianos definen 6 000 secuencias de codifi­
cación de DNA. Constituiría una extensión injustificada de la hi­
pótesis un gen-tina enzima de Beadle y Tatum. Desde el decenio
ce 1940 esta hipótesis permitió un adelanto importante en la com-
prensión de la forma en que los genes determinan fenotipos. A par­
i r de entonces se extendió: algunos genes codifican RNA no
Traducidos, ciertas proteínas no son enzimas y muchas proteínas
contienen varias cadenas polipéptidas que se codifican por separa­
do. Pero, incluso con estas extensiones, no es posible utilizar la hi-
r-ótesis de Beadle y Tatum para implicar una correspondencia uno
i uno entre entradas en el catálogo de OMIM y unidades de trans­
cripción de DNA.
Los genes de la genética clásica son entidades abstractas. Nin­
gún carácter determinado en una localización cromosómica única
^ segregará en un patrón mendeliano -pero es posible que el de­
terminante no sea un gen en el sentido de la palabra molecular de
ios genetistas-. Aunque la distrofia muscular fascio-escápulo-hu-
—eral (debilidad intensa pero no mortal de ciertos grupos muscu-
.¿res; MIM 158900) se debe a deleciones pequeñas de secuencias
O O
AaB B AaB B
è è
III
A aB b
- ; 4-3. Complementación: los padres con pérdida profunda de la audición autosómica recesiva suelen tener niños con audición normal.
« , ll7 son descendientes de padres no afectados pero consanguíneos y cada uno tiene hermanos afectados, lo que determina que sea probable que cada
. X tenga pérdida de la audición autosómica recesiva. Todos sus niños no están afectados, lo que demuestra que ll6 y ll7 tienen mutaciones no alélicas.
4.2 i PATRONES DE GENEALOGÍA MENDELIANOS i 105
4q35, hasta el momento de escribir este libro nadie ha intentado
encontrar una secuencia de codificación de proteínas importante
en esa localización a pesar de la investigación y la secuenciación in­
tensivas. El “gen” de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth tipo
1A (neuropatía motora y sensorial; MIM 118220) resultó ser una
duplicación tándem de 1.5 Mb sobre el cromosoma 17pl 1.2 (sec­
ción 16.5.2). Estos ejemplos son muy poco frecuentes; la mayor
parte de las entradas de OMIM probablemente describen las con­
secuencias de mutaciones que afectan una unidad de transcripción
aislada. Sin embargo, aún no se establece una correspondencia uno
a uno entre fenotipos y unidades de transcripción a causa de tres ti­
pos de heterogeneidad:
► heterogeneidad de locus, cuando el mismo fenotipo clínico pue­
de resultar de mutaciones en cualquiera de varios locus distintos;
► heterogeneidad alélica, cuando pueden observarse muchas
mutaciones diferentes dentro de un gen determinado en distin­
tos pacientes con cierto padecimiento genético (se analiza en
forma más completa en el cap. 16). Muchas enfermedades
muestran heterogeneidad tanto de locus como alélica;
► heterogeneidad clínica, que se utiliza aquí para describir la si­
tuación en que las mutaciones en el mismo gen producen dos
o más enfermedades diferentes. La sección 16.6 proporciona
ejemplos.
La heterogeneidad de locus es común en síndromes
que se deben a la falla de una vía compleja
La pérdida de la audición brinda buenos ejemplos de heterogenei­
dad de locus. Cuando dos personas con pérdida de la audición con­
gènita profunda, autosómica recesiva, contraen matrimonio, como
suele suceder, por lo general los niños tienen una audición normal
(fig. 4-3). Es fácil observar que se necesitarían muchos genes distin­
tos para construir una máquina tan exquisita como las células pili-
formes cocleares y un defecto en cualquiera de estos genes podría
ocasionar sordera. Los niños tienen una audición normal siempre
que los padres llevan mutaciones en diferentes genes. Éste es un
ejemplo de complementación (recuadro 4-2). Esta heterogeneidad
de locus sólo cabe esperarla en padecimientos como sordera, cegue­
ra o retraso mental, en los que fracasó una vía bastante general; pe­
ro incluso con patologías más específicas, múltiples locus son muy
frecuentes. Un ejemplo notable es el síndrome de Usher, una com-
AABb AABb
Ó É -r-é Ó É ó
aa B B AAbb
Ó Ó
A aB b A aB b A aB b A aB b A aB b
106 CAPÍTULO CUATRO ¡ GENES EN GENEALOGÍAS Y POBLACIONES
binación autosómica recesiva de pérdida de la audición y ceguera
progresiva (retinitis pigmentosa) que puede deberse a mutaciones
en 10 locus o más no relacionados (Hereditary H earing Loss Home­
page, www.uia.ac.be/dnalab/hhh/). La OMIM separó entradas pa­
ra ejemplos conocidos de heterogeneidad de locus (definidos por
análisis de enlace o mutación), pero deben existir muchos ejemplos
no detectados que aún se incluyen dentro de entradas únicas.
Las series aiélicas son una causa de heterogeneidad clínica
En ocasiones varios fenotipos humanos en apariencia distintos tienen
como causa diferentes mutaciones aiélicas en el mismo locus. La di­
ferencia puede ser de grado: mutaciones que inactivan en forma par­
cial el gen de distrofina producen la distrofia muscular de Becker, en
tanto que mutaciones que inactivan por completo dicho gen causan
la distrofia muscular de Duchenne, similar pero más grave (desgaste
muscular mortal: MIM 310200). Otras veces la diferencia es cualita­
tiva: la inactivación del gen del receptor de andrógeno ocasiona in­
sensibilidad al andrógeno (los embriones 46,XY se desarrollan como
mujeres; MIM 313700), pero la expansión de un tramo de codones
de glutamina dentro del mismo gen causa una enfermedad muy di­
ferente, la atrofia muscular espinobulbar o enfermedad de Kennedy
(MIM 313200). Tanto estas correlaciones entre genotipo y fenotipo
como otras más se comentan con mayor amplitud en el capítulo 16.
4.2.5 La herencia mitocondrial origina un patrón de
genealogía matrilineal identificable
Además de las mutaciones en genes que se portan en los cromoso­
mas nucleares, las mutaciones mitocondriales son una causa impor­
tante de enfermedad genética humana (véase la base de datos
MITOMAP para detalles; www-mitomap.org). El genoma mito­
condrial (sección 9.1.2) es pequeño pero muy mutable en compa­
ración con el DNA nuclear, tal vez porque la replicación del DNA
mitocondrial es más propensa a errores y el número de replicaciones
es mucho mayor. Las enfermedades codificadas de manera mitocon­
drial tienen dos características poco usuales: herencia matrilineal y
heteroplasmia frecuente.
La herencia es matrilineal porque el espermatozoo no contribu­
ye con mitocondrias al cigoto (la afirmación se apoya en pruebas li­
mitadas; sin embargo, en niños casi nunca se detectan variantes
mitocondriales derivadas del padre). Por tanto un padecimiento
heredado en forma mitocondrial puede afectar ambos sexos, pero
sólo las madres afectadas lo transmiten (fig. 4-4), lo que origina un
patrón de genealogía identificable.
Las células contienen muchos genomas mitocondriales. En al­
gunos pacientes con una enfermedad mitocondrial cada genoma
mitocondrial lleva la mutación causal (homoplasmia), pero en otros
Recuadro 4-2. Prueba de complementación para descubrir si dos caracteres recesivos están determinados por
genes alélicos
un locus dos locus
Cruzamiento parental a ^ x a2a2 aaBB x AAbb
Descendencia a ^ AaBb
Fenotipo mutante tipo silvestre
Anímales homocigotos para los dos caracteres se cruzan y se observa el
fenotipo de la descendencia. Cuando ambos animales llevan mutaciones
casos se observa una población mixta de genomas normales y mu-
tantes (heteroplasmia) dentro de cada célula. A diferencia del mo-
saicismo genético nuclear, que debe surgir después de la etapa de
cigoto (sección 4.3.6), la heteroplasmia mitocondrial puede trans­
mitirse de la madre heteroplásmica al niño heteroplásmico. En es­
tos casos la proporción de genomas mitocondriales anormales
puede variar de modo notable entre la madre y el niño, lo que su­
giere que un número en extremo pequeño de moléculas de DNA
maternas origina todo el DNA mitocondrial del niño (véase sec­
ción 11.4.2). La patología molecular complicada de las enfermeda­
des mitocondriales se estudia en la sección 16.6.6.
4 C om plicaciones de ios patrones de
genealogía m endeiianos básicos
En la vida real varias complicaciones suelen ocultar un patrón men-
deliano básico. La figura 4-5 muestra diversas complicaciones fre­
cuentes.
4.3.1 Padecimientos recesivos comunes pueden originar
un patrón de genealogía seudodominante
Si un carácter es común en la población, es muy posible que dos o
más personas lo introduzcan en la genealogía de manera indepen­
diente. Un carácter recesivo común, como el grupo sanguíneo O,
puede observarse en generaciones sucesivas por matrimonios repeti­
dos de personas grupo O con heterocigotos. Esto produce un patrón
que semeja la herencia dominante (fig. 4-5A). Por consiguiente los
patrones genealógicos clásicos se observan mejor con caracteres raros.
4.3.2 La falta de manifestación de un padecimiento
dominante se denomina no penetrancia
La no penetrancia es una complicación frecuente en padecimientos
dominantes. Para un genotipo determinado, la penetrancia de un ca­
rácter se define como la probabilidad de que una persona con el geno­
tipo manifieste el carácter. Por definición un carácter dominante se
manifiesta en una persona heterocigota y por tanto debe mostrar
100% de penetrancia. No obstante, aunque muchos caracteres en hu­
manos suelen mostrar herencia dominante, a veces brincan una gene­
ración. En la figura 4-5B, II2 tiene un padre y un niño afectados, y casi
con certeza porta el gen mutante, pero es normal desde el punto de vis­
ta fenotípico. Éste se describiría como un caso de no penetrancia.
La no penetrancia no entraña ningún misterio -de hecho,
100% de penetrancia es el fenómeno más sorprendente—. Muy a
menudo la presencia o ausencia de un carácter depende, tanto en las
en el m ism o locus, la progenie no tendrá un alelo tipo silvestre y en con-
secuencia será fenotípicamente anormal. Si hay dos locus diferentes, la
progenie es heterocigota para cada uno de los dos caracteres recesivos
y pQ(. cons¡gU¡ente fenotípicamente normal. En muy pocas ocasiones
alelos en el m ism o locus pueden complementarse entre sí (comple-
mentación interalélica).
 4.3 | COMPLICACIONES DE LOS PATRONES DE GENEALOGÍA MENDELIANOS BÁSICOS ; 107
Fig. 4-4. Genealogía de una enfermedad mitocondrial.
Patrón de genealogía típico que muestra pérdida de la audición deter-
—nnada de modo mitocondrial (familia informada por Prezant y cois.,
1993). Obsérvese la penetrancia incompleta.
circunstancias principales como en las normales, del genotipo en
n locus, pero un fondo genético poco frecuente, un estilo de vida
particular o tan sólo el azar significan que es posible que una per­
sona ocasional no manifieste el carácter. La no penetrancia es un
rtligro latente mayor en asesoría genética. Sería imprudente que un
üesor que sabe que el padecimiento de la figura 4-5B es dominan-
:e y observa que III7 no tiene signos diga a la mujer que no corre
riesgo de procrear niños afectados. Una de las labores de los aseso­
res genéticos es conocer el grado usual de penetrancia de cada sín­
drome dominante.
Con frecuencia, por supuesto, un carácter depende de mu­
chos factores y no muestra un patrón de genealogía mendeliano
inclusive si es del todo genético. Existe un continuo de caracte­
res, desde el mendeliano por completo penetrante hasta el mul-
tifactorial (fig. 4-6), con influencia creciente de otros locus
genéticos, el ambiente, o ambos. Ninguna división lógica sepa­
ra los caracteres mendelianos imperfectamente penetrantes de
'os multifactoriales; éste es un aspecto de la descripción más útil
que se aplicaría.
Penetrancia relacionada con la edad en enfermedades
de inicio tardío
En enfermedades de inicio tardío se observa un caso en particular
importante de penetrancia reducida. Los padecimientos genéticos
no siempre son congénitos (presentes al nacer). Aunque el genoti­
po se fija en la concepción, es posible que el fenotipo no se mani­
fieste hasta la vida adulta. En estos casos la penetrancia se relaciona
con la edad. Un ejemplo bien conocido (fig. 4-7) es la enfermedad
de Huntington (neurodegeneración progresiva; MIM 143100). El
retraso del inicio podría deberse a la acumulación lenta de una sus­
tancia nociva, la muerte paulatina del tejido o la incapacidad para
reparar cierta forma de daño ambiental. Los cánceres hereditarios
son causados por una segunda mutación que afecta una célula de
una persona que ya porta una mutación en un gen supresor de tu­
mor (cap. 17). Según la enfermedad, la penetrancia puede ser de
100 % si la persona vive el tiempo suficiente o es posible que un in­
dividuo que lleva el gen nunca presente síntomas sin considerar el
tiempo que viva. Las curvas de edad de inicio, como las de la figu­
ra 4-7, son medios importantes en asesoría genética porque permi­
ten que el genetista estime la posibilidad de que una persona con
riesgo pero asintomática desarrolle después la enfermedad.
4.3.3 Muchos padecimientos muestran expresión
variable
Relacionada con la no penetrancia, la expresión variable se obser­
va a menudo en padecimientos dominantes. La figura 4-5C mues­
tra un ejemplo de una familia con síndrome de Waardenburg.
Diferentes miembros de la familia presentan distintas características
del síndrome. La causa es la misma que la de la no penetrancia: otros
genes, factores ambientales o el azar puro tiene cierta influencia en
el desarrollo de los síntomas. Por lo general la no penetrancia y la ex­
presión variable son problemas con caracteres dominantes, más que
recesivos. Ello indica en parte la dificultad para señalar casos no pe­
netrantes en una genealogía recesiva típica. Sin embargo, como re­
gla general, los padecimientos recesivos son menos variables que los
dominantes, tal vez porque el fenotipo de un heterocigoto incluye
un equilibrio entre los efectos de los dos alelos, de manera que el
resultado final puede ser más sensible a la influencia externa que
el fenotipo de un homocigoto. Sin embargo, tanto la no pene­
trancia como la expresión variable se observan a veces en padeci­
mientos recesivos.
Estas complicaciones son mucho más notables en humanos que
en plantas u otros animales. Los animales de laboratorio y las plan­
tas de siembras presentan mayor uniformidad genética que los hu­
manos. Lo que se observa en genética humana es típico de una
población silvestre. No obstante, los genetistas de ratones están fa­
miliarizados con la forma en que la expresión de un mutante pue­
de cambiar cuando se introduce en un fondo genético distinto
-una consideración importante cuando se estudian modelos de en­
fermedades humanas en el ratón—.
La anticipación es un tipo especial de expresión variable
Anticipación se refiere a la tendencia de algunos padecimientos
dominantes variables a tornarse más graves (o iniciar antes) en ge­
neraciones sucesivas. Hasta hace poco tiempo la mayoría de los ge­
netistas se mostraba escéptica respecto a que este hecho sucediera
alguna vez. El problema es que variaciones aleatorias en la grave­
dad simulan con mucha facilidad la anticipación verdadera. Una
familia recibe atención clínica cuando nace un niño con una afec­
ción grave. En la investigación de los antecedentes el genetista ob­
serva que uno de los padres está afectado, pero de manera muy
leve. Aunque esto parece anticipación, en realidad puede ser sólo
un sesgo de indagación. Si el padre hubiera estado muy afectado
es muy posible que nunca hubiera tenido un hijo; si la afección del
niño es muy leve, es probable que la familia no se hubiera detec­
tado. Con base en la falta de cualquier mecanismo plausible para
la anticipación, y en los problemas estadísticos de demostrarla an­
te estos sesgos, la mayoría de los genetistas no deseaba considerar
con seriedad la anticipación hasta que los adelantos moleculares
los obligaron a hacerlo.
La anticipación se tornó respetable de pronto, e inclusive se
puso de moda, con el descubrimiento de repeticiones extensibles
de trinucleótidos inestables en el síndrome de X frágil (retraso
mental con varios signos físicos; MIM 309550) y después en la
distrofia miotónica (una enfermedad multisistémica muy varia­
ble con disfunción muscular característica; MIM 160900) y la
enfermedad de Huntington. La gravedad o la edad de inicio de
estos trastornos se correlaciona con la longitud de la repetición y
esta última tiende a crecer conforme el gen se transmite a través
de las generaciones (véase sección 16.6.4). Estos padecimientos
108 | CAPÍTULO CUATRO GENES EN GENEALOGÍAS Y POBLACIONES

A) I ■ -1 B)
00 AO

AO | AA 0 0 | AO AO 00 AO

6 ■ 4
AO AA 00 AO AO OO 00

C) i

IV

E) I 0 - -Q - -O F) i # yO

D r¿ Ó □ 2> ¿ " " S < 5 tE í

II 4 -rD 1 á -rO Ó -rD

r 5 é í ¿i ó ¿ ¿

IV

H) I D yO

II á - r O Ó - r D á -T -O Ó - r D

6 ó l ¿ o 6cj £ ■
/

Fig. 4-5. Complicaciones de los patrones mendelianos básicos.

A) Un recesivo común, por ejemplo, un grupo sanguíneo O, puede dar el aspecto de un patrón dominante. B) Herencia autosómica dominante con no
penetrancia en ll2. C) Herencia autosómica dominante con expresión variable: en esta familia con síndrome de Waardenburg, primer cuadro lleno = pér­
dida de la audición; segundo cuadro = ojos de diferentes colores; tercer cuadro = copete blanco; cuarto cuadro = encanecimiento prematuro.
D) Impronta genética: en esta familia los tumores glomosos autosómicos dominantes se manifiestan sólo cuando el gen se hereda del padre (familia
descrita por Heutink y cois., 1992). E) Impronta genética: en esta familia el síndrome de Beckwith-Wledemann autosómico dominante se manifiesta sólo
cuando el gen se hereda de la madre (familia Informada por Viljoen y Ramesar, 1992). F) Incontinencia pigmentaria dominante ligada a X. Los varones
afectados se abortan de manera espontánea (cuadros pequeños). G) Genealogía recesiva ligada a X en la que la endogamia produce una mujer afectada
y transmisión aparente de varón a varón. H) Mutación autosómica dominante nueva que simula un patrón autosómico o ligado a X recesivo.

muestran anticipación verdadera. Ahora de nuevo se reclama
considerar la anticipación para muchas enfermedades y es impor­
tante recordar que la objeción antigua respecto el sesgo de inda­
gación aún es válida. A fin de que sea creíble, una afirmación de
anticipación requiere un respaldo estadístico cuidadoso, no sólo
la impresión clínica.
4.3.4 En genes improntos, la expresión depende
del origen parental
Ciertos caracteres humanos son autosómicos dominantes, afectan a
ambos sexos y los transmiten los padres de cualquier sexo, pero sólo
se manifiestan cuando se heredan de un padre de un sexo particular.
 4.3 I COMPLICACIONES DE LOS PATRONES DE GENEALOGIA MENDELIANOS BÁSICOS j 109
Gen único
A
M endeüano
Fig. 4-6. Espectro de caracteres humanos.
Pocos caracteres son puramente mendelianos, poligénicos o ambien­
tales. Casi todos dependen de la misma mezcla de determinantes genéti­
cos mayores y menores aunados a influencias ambientales. La mezcla
de factores que determina cualquier carácter determinado podría repre­
sentarse por un punto localizado en alguna parte dentro del triángulo.
Por ejemplo, se describen familias con tumores glomosos autosómi-
cos dominantes que sólo se expresan en varones o mujeres que here­
dan el gen de su padre (fig. 4-5D), en tanto que el síndrome de
Beckwith-Wiedemann (exónfalos, macroglosia, crecimiento excesi­
vo; MIM 130650) en ocasiones es dominante pero sólo se expresa en
niños que lo heredan de su madre (fig. 4-5E). Estos efectos del sexo
parental son prueba de improntación, un fenómeno mal compren­
dido por el que ciertos genes son marcados (“improntos”) de alguna
manera con su origen parental. Los múltiples problemas que rodean
el mecanismo y el propósito evolutivo de la improntación se estudian
en la sección 10.5.4 y el recuadro 16.6 describe un ejemplo clínico
de particular notabilidad.
4.3.5 La letalidad m asculina puede com plicar
genealogías ligadas a X
En algunos padecimientos dominantes ligados a X, la ausencia del
alelo normal es letal antes del nacimiento. Por consiguiente los varo­
nes afectados no nacen y se observa un padecimiento que sólo afecta
a mujeres, que lo transmiten a la mitad de sus hijas pero a ninguno
de sus hijos (fig. 4-5F). Es posible que haya un antecedente de abor­
tos espontáneos, pero las familias rara vez son lo bastante grandes pa­
ra demostrar que el número de hijos sólo es la mitad que el de hijas.
Un ejemplo es la incontinencia pigmentaria (defectos lineales de la
piel que siguen patrones definidos conocidos como líneas de Blasch-
ko, que a menudo se acompañan de problemas neurológicos o esque­
léticos; MIM 308310).
4.3.6 Con frecuencia nuevas m utaciones complican
ia interpretación genealógica y pueden
conducir a mosaicismo
Muchos casos de enfermedad genética dominante o ligada a X gra­
ve resultan de mutaciones nuevas, sin advertencia notable en una
E d a d (años)
Fig. 4-7. Curva de edad de inicio en la enfermedad de Huntington.
Curva A: probabilidad de que un individuo que porta el gen de enfer­
medad desarrolle síntomas a una edad determinada. Curva B: riesgo
de que un niño sano de un padre afectado lleve el gen de enfermedad a
una edad determinada. Tomado de Harper (2001). Practical Genetíc
Counselling, 5a. ed„ Hodder Arnold. Reproducido con autorización de
Hodder Arnold.
familia que carece de antecedentes de la enfermedad. Un dominan­
te mortal por completo penetrante ocurriría de manera necesaria
por una mutación nueva y los padres nunca estarían afectados; un
ejemplo, es la displasia tanatofórica (acortamiento grave de los hue­
sos largos y fusión anormal de suturas craneales; MIM 187600).
Para un padecimiento dominante no mortal, pero grave, se aplica
un argumento similar, aunque en menor grado. Si la enfermedad
impide que la mayoría de las personas se reproduzca, pero de cual­
quier modo se presentan casos nuevos de la enfermedad, muchos o
la mayor parte de ellos se deben a nuevas mutaciones. Los recesivos
ligados a X importantes también muestran una proporción signifi­
cativa de mutaciones nuevas, porque el gen está expuesto a selec­
ción natural siempre que se encuentra en un varón. Por otra parte,
las genealogías autosómicas recesivas no se afectan de modo impor­
tante -un alelo mutante puede propagarse durante muchas genera­
ciones en portadores asintomáticos y cabe asumir con seguridad
que ambos padres de un niño afectado son portadores—.
Si se considera que, promediadas con el tiempo, las mutaciones
nuevas reemplazan a los genes de enfermedad que se perdieron a
través de la selección natural, su frecuencia en la población depen­
de de una relación simple (que se describe en la sección 4.5.2) en­
tre el ritmo al que la selección natural elimina genes desventajosos
y el ritmo al que se crean nuevas mutaciones. Los mecanismos ge­
nerales que afectan la frecuencia de alelos en la población se comen­
tan en el capítulo 11 , recuadro 11 .2 .
Puede ser muy difícil decidir la modalidad de herencia y el ries­
go de recurrencia cuando una pareja normal sin un antecedente
110 CAPÍTULO CUATRO GENES EN GENEALOGÍAS Y POBLACIONES

familiar importante tiene un niño con anormalidades graves (fig.

4-5H); el problema podría ser autosómico recesivo, autosómico
dominante con una mutación nueva, recesivo ligado a X (si el ni­
ño es varón) o no genético. El mosaicismo germinal introduce una
complicación adicional (véase a continuación).

Los mosaicos tienen dos (o más) líneas celulares

genéticamente distintas
Suele observarse que en enfermedades autosómicas dominantes y li­
gadas a X importantes, en las que las personas afectadas no tienen
niños o muy pocos, los genes de la enfermedad se conservan en la
población mediante mutación recurrente. Una suposición usual es
que una persona por completo normal produce un gameto mutan-
te único. Sin embargo, no siempre sucede así. A menos que exista
algo especial en el proceso mutacional, como sólo puede suceder du­
rante la gametogénesis, las mutaciones pueden surgir en cualquier
momento durante la vida poscigótica. Las mutaciones poscigóticas
producen mosaicos con dos (o más) líneas celulares genéticamente
distintas.
El mosaicismo puede afectar tejidos con líneas somáticas, germi­
nales, o ambas. Las mutaciones poscigóticas no sólo son frecuentes, si­
no inevitables. Por lo general las tasas de mutación en humanos son
de 10 7 por gen por generación celular y el cuerpo contiene tal vez
1013 células. Cabe pensar que todas las personas deben ser un mosai­
co para innumerables enfermedades genéticas. De hecho, como lo re­
marcó en forma memorable el profesor John Edwards, un varón
normal bien podría producir la totalidad del catálogo de la OMIM en
cada eyaculado. Esto no debe originar ansiedad. Si una célula en el de­
do meñique de una persona muta para el genotipo de enfermedad de
Huntington, o una célula en el oído capta una mutación de fibrosis
quística, la persona o su familia no sufren ninguna consecuencia. Só­
lo cuando una mutación somática conduce al surgimiento de una clo­
na sustancial de células mutantes existe un riesgo para todo el
organismo. Lo anterior puede suceder en dos formas:
► la mutación causa proliferación anormal de una célula que en
condiciones normales se replicaría con lentitud o no del todo,
lo que genera una clona de células mutantes. Ésta es la forma
en que se presenta el cáncer; el tema se estudia en su totalidad
con más detalle en el capítulo 17.
► la mutación ocurre en un embrión temprano, afecta una célu­
la que es la progenitora de una fracción importante del orga­
nismo completo. En este caso el individuo mosaico puede
mostrar signos clínicos de la enfermedad.
Las mutaciones que ocurren en la línea germinal de un padre pue­
den causar una enfermedad hereditaria nueva en un niño. Una mu­
tación temprana en la línea germinal puede producir una persona
que aloja una clona de células de la línea germinal mutantes (mo­
saicismo germinal o gonadal). Como resultado, una pareja nor­
mal sin un antecedente familiar puede tener más de un niño con la
misma enfermedad dominante grave. La genealogía simula heren­
cia recesiva. Inclusive si la modalidad de herencia correcta se cono­
ce, es muy difícil calcular el riesgo de recurrencia para utilizarlo en
la asesoría a los padres (Van der Meulen y cois., 1995). Por lo ge­
neral se cita un riesgo empírico (sección 4.4.4). La figura 4-8 mues­
tra un ejemplo de la incertidumbre que el mosaicismo introduce en
la asesoría, en este caso en una enfermedad ligada a X.
Los estudios moleculares pueden ser muy útiles en estas circuns­
tancias. A veces es posible demostrar de manera directa que un pa­
dre normal está produciendo una proporción de espermatozoos
Fig. 4-8. Mutación nueva en la distrofia muscular de Duchenne
recesiva ligada a X.
Los tres cromosomas X de la abuela se distinguieron por medio de
marcadores genéticos y se muestran en azul, rosa y pardo (Ignorando
la recombinación). 111, tiene X de la abuela, que adquirió una mutación
en algún punto en la genealogía. Hay cuatro posibles puntos en los que
pudo ocurrir:
si Ilh porta una mutación nueva, el riesgo de recurrencia para todos
los miembros de la familia es muy bajo;
si II, es un mosaico germinal, hay un riesgo importante (pero difícil de
cuantificar) para su niño futuro, pero no para sus hermanas;
sí Ih fue el resultado de un espermatozoo mutante único, ella tiene el
riesgo de recurrencia estándar para recesivas ligadas a X, pero sus
hermanas no lo tienen;
sí h fue un mosaico germinal, todas las hermanas tienen un riesgo sig­
nificativo, que es difícil cuantificar.
mutantes. Aunque las mujeres no pueden someterse a estudios di­
rectos de la línea germinal, otros tejidos accesibles, como los fibro­
blastos o las raíces del pelo, pueden someterse a pruebas de
mosaicismo. Un resultado negativo en tejidos somáticos no descar­
ta mosaicismo de la línea germinal, pero un resultado positivo, au­
nado a un niño afectado, lo comprueba (fig. 4-9).
Las quimeras contienen células de dos cigotos separados
en un mismo organismo
Los mosaicos inician la vida como un óvulo fecundado único. Las
quimeras resultan de la fusión de dos cigotos para formar un em­
brión (el inverso de la gemelación) o de la colonización limitada
de un gemelo por células de un cogemelo no idéntico (fig. 4-10).
El quimerismo se demuestra por la presencia en muestras de teji­
dos mancomunados de demasiados alelos parentales en varios lo-
cus (si sólo participara un locus, cabría sospechar mosaicismo por
una mutación aislada). En ocasiones los centros de grupos sanguí­
neos descubren quimeras entre donadores normales y algunos pa­
cientes intersexuales resultan ser quimeras XX/XY. Strain y
colaboradores (1998) describieron, por ejemplo, a un niño
46,XY/46,XX que fue el resultado del amalgamiento de dos em­
briones después de una fecundación in vitro en la que se transfirie­
ron tres embriones a la madre.
 í.4 i GENÉTICA DE CARACTERES MULTIFACTORIALES: TEORIA DEL UMBRAL POLIGENICO 111

In d iv id u o III-4 :
h a p lo tip o : a lto rie s g o
c o lo n o s c o p ia : n o rm a l
DGGE: n o rm a l

i l D I I 0 1

Exón 14 > W 593X

de APC
T ip o s ilv e s tre

Fig. 4-9. Mosaicismo de línea germinal y somático en una enfermedad dominante.

Los individuos II-2 y III-2 sufren poliposis adenomatosa familiar, una form a de cáncer colorrectal que se hereda de manera dominante y se mapea en el
cromosoma 5 (MIM 175100, véase sección 17.5.3). Los padres de II-2 no están afectados. La electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (véase
sección 18.3.2) demuestra una mutación, W593X, en el exón 14 del gen/lPC en III-2 (se observa en las bandas superiores en la pista 1 del gel). Para
II-2 el gel muestra las bandas mutantes, pero sólo de manera muy débil, lo que indica que la sangre de esta persona es mosaico para la mutación. La
mutación está ausente en III-4, aunque los estudios con marcadores ligados (cromosomas codificados con color, véase sección 18.5) mostraron que
heredó el cromosoma de riesgo alto (azul) de su madre. El examen clínico (colonoscopia) confirmó que III-4 no tenía la enfermedad. II-2 debe ser tanto
una línea germinal como un mosaico somático para la mutación. Ejemplo y gel cortesía del profesor Bert Bakker, Leiden.

4.4 G enética de c a ra c te re s Cuando el trabajo de Mendel se redescubrió, surgió una con­

m u ltifactoriales: te o ría del um bral
poligénico
4.4.1 Algo de historia
Cuando el trabajo de Mendel se redescubrió en 1900 ya estaba bien
establecida una escuela rival de genetistas en el Reino Unido y algu­
na otra parte. Francis Galton, el primo notable y excéntrico de Char­
les Darwin, dedicó gran parte de su inmenso talento a sistematizar el
estudio de la variación humana. A partir del artículo “Hereditary Ta-
lent an d Character"publicado el mismo año, 1865, como trabajo de
Mendel (y aumentado en 1869 a un libro, Hereditary Genius), invir-
~ó muchos años en la investigación de semejanzas familiares. Galton
sí dedicó a cuantificar observaciones y aplicar análisis estadísticos. Su
.-jithropometric Laboratory, establecido en Londres en 1884, registró
r« o , estatura en posición sedente y de pie, brazada, capacidad respi­
ratoria, fuerza de tiramiento y opresión, fuerza de soplido, tiempo de
reacción, agudeza visual y auditiva, diferenciación de colores y juicios
ie longitud de sus sujetos (quienes le pagaron tres peniques por el
rrivilegio). En una de las primeras aplicaciones estadísticas comparó
ios atributos físicos de padres y niños, y estableció el grado de corre­
cción entre familiares. Alrededor de 1900 contaba ya con un gran
-òmero de conocimientos respecto a la herencia de dichos atributos
v una tradición (biomètrica) de su investigación.
troversia. Los biometras aceptaron que los genes mendelianos po­
drían explicar unas cuantas anormalidades raras o desviaciones
curiosas, pero señalaron que la mayor parte de los caracteres que
podían ser importantes en la evolución (talla corporal, estructura,
fuerza, habilidad para atrapar presas o encontrar alimento) la
constituían caracteres continuos o cuantitativos y no factibles de
análisis mendeliano. Puesto que todas las personas tienen estos
caracteres, pero en grados distintos, no es posible definir su he­
rencia mediante el dibujo de genealogías y el mareaje de las per­
sonas que las tienen. El análisis mendeliano requiere caracteres
dicótomos que se tienen o no. La controversia siguió, en ocasio­
nes acalorada, entre mendelianos y biometras hasta 1918. En ese
año R. A. Fisher publicó un artículo de gran influencia que de­
mostró que los caracteres regidos por un gran número de factores
mendelianos independientes (caracteres poligénicos) mostrarían
con precisión la naturaleza continua, la variación cuantitativa y
las correlaciones familiares descritas por los biometras. Más ade­
lante Falconer amplió este modelo para incluir los caracteres di­
cótomos. Los análisis de Fisher y de Falconer crearon la base
teórica unificada para la genética humana. Las secciones siguien­
tes exponen sus ideas, en una forma no matemática. Puede en­
contrarse una descripción más rigurosa en cualquier libro de texto
de genética cuantitativa, por ejemplo Falconer y Mackay, 1996
(véase lecturas adicionales).
112 CAPÍTULO CUATRO GENES EN GENEALOGÍAS Y POBLACIONES

r
U n cig o to

C a m b io
g e n é tic o

Fusión o

m ►. - intercam bio
d e células
D o s c ig o to s
/

Fig. 4-10. Mosaicos y quimeras.

Los mosaicos tienen dos o más líneas celulares genéticamente distintas de un cigoto único. El cambio genético indicado puede ser una mutación
gènica, un cambio crom osom ico numérico o estructural o, en el caso especial de lionización, inactivación de X. Una quimera deriva de dos cigotos,
que suelen ser normales pero genéticamente distintos.

4.4.2 Teoría poligénica de los caracteres cuantitativos
Cualquier carácter variable que depende de la acción aditiva de un
gran número de causas independientes individualmente pequeñas
mostrará una distribución normal (gausiana) en la población. La
figura 4-11 presenta una ilustración muy simplificada de este he­
cho. Se supone que el carácter depende de alelos en un solo locus,
después dos locus y a continuación tres. Conforme más locus se in­
cluyen, se observan dos consecuencias:
► la relación simple uno a uno entre genotipo y fenotipo desapa­
rece. Excepto por los fenotipos extremos, no es posible deducir
el genotipo a partir del fenotipo;
► a medida que el número de locus aumenta, la distribución se
ve cada vez más como una curva gausiana. La adición de una
variación ambiental pequeña aplanaría la distribución de tres
locus hacia una buena curva gausiana.
Un concepto más complicado, que comprende dominancia y fre­
cuencias de gen variables, conduce a las mismas conclusiones. Co­
mo los familiares comparten genes, sus fenotipos se correlacionan
y el artículo de Fisher de 1918 predijo el tamaño de la correlación
para diferentes relaciones.
Una característica muy mal entendida, tanto de los datos bio-
métricos como de la teoría poligénica, es la regresión a la media.
Sólo como ejemplo imagínese que la variación en el IQ estuviera
determinada de modo genético por completo. La figura 4-12 mues­
tra cómo en el modelo simplificado de dos locus, para cada clase de
madres, el IQ promedio de sus niños se encuentra a la mitad del va­
lor de la madre y la media de la población. Esta es la regresión a la
media -pero con frecuencia sus implicaciones se interpretan de
modo erróneo (véase recuadro 4-3)—. Sin embargo, en este modelo
simple cabe señalar una suposición oculta: que hay un apareamien­
to aleatorio. Para cada clase de madres se asume que el IQ prome­
dio de sus esposos es de 100. Por tanto el IQ promedio del niño es
la mitad del IQ parental, como lo sugeriría el sentido común. En
el mundo real mujeres muy inteligentes tienden a casarse con varo­
nes de inteligencia mayor que el promedio (apareamiento concor­
dante) y no cabría esperar la regresión a la mitad de la media de la
población, inclusive si el IQ fuera un carácter genético puro.
Una segunda suposición del modelo simplificado es que no hay
dominancia: cada fenotipo de la persona es la suma de la contribu­
ción de cada alelo a cada locus importante. Si se introduce la domi­
nancia, alelos dominantes e invisibles en su fenotipo ocultarían el
efecto de algunos de los genes de un padre, pero aún así pueden
transmitirse y afectar el fenotipo del niño. Si se toma en cuenta la
dominancia, la expectativa para el niño ya no es el valor medio pa­
rental. La mejor suposición respecto al efecto fenotípico probable de
alelos recesivos ocultos se obtiene buscando en el resto de la pobla­
ción. Por consiguiente el fenotipo esperado del niño se mostraría a
partir del valor medio parental hacia una media de la población. La
cuantía del desplazamiento depende de qué tan importante es la do­
minancia para determinar el fenotipo.
 4.4 ¡ GENÉTICA DE CARACTERES MÜLTIFACTORIALES: TEORÍA DEL UMBRAL. POLIGÉNICO 113

A) U n lo c u s Aa
B) D o s locus
A A bb
A aB b
aaB B

A abb AABb
aa B b A aB B

aabb AABB

i ___L....... i. ..i . ___ i__ .. i__

70 80 90 100 110 120 130

C) Tres lo c u s A A B bcc D) M u c h o s locus

A A bbC c
A aB bC c
A A bbcc A ab b C C A A B B cc
A aB b c c A aB B cc A A B bC c
A ab b C c aag B C c A A bbC C
aa B b C c aaBbCC A aB B C C
aa b b C C A aB bC C
aaB B cc aaB B C C
A abbcc AAB B C C
aa B b cc A A B bC C
aab b C c A aB B C C
a a b b cc AABBCC
i ... i __ __ ! ... - __ i ... .... i....
70 80 90 100 110 120 130

Fig. 4-11. Aproximación sucesiva a una distribución gausiana.

Las gráficas muestran la distribución poblacional de un carácter hipotético que tiene un valor medio de 100 unidades. El carácter está determinado por
los efectos aditivos (codominantes) del alelo. Cada alelo del caso superior contribuye con cinco unidades al valor y cada alelo del caso inferior resta
cinco unidades. Todas las frecuencias de alelo son 0.5. A) El carácter está determinado por un locus aislado; B) dos locus; C) tres locus: la adición de
una cantidad menor de variación “ aleatoria" (ambiental o poligénica) produce una curva Gaussiana D).

La herencia es la proporción de varianza debida a efectos
genéticos aditivos
Las curvas gaussianas sólo se especifican por dos parámetros, la
media y la varianza (o la desviación estándar, que es la raíz cua­
drada de la varianza). Las varianzas tienen la propiedad útil de
ser aditivas cuando se deben a causas independientes (recuadro
4-4). Por consiguiente la varianza total del fenotipo Vp es la su­
ma de las varianzas que se deben a las causas individuales de va­
riación: la varianza ambiental VEy la varianza VG genérica. Esta
última puede descomponerse a su vez en una varianza V\ debida
a efectos genéticos aditivos simples y un término VD extra debi­
do a efectos de dominancia. La heredabilidad (h2) de un carác­
ter es la proporción de la varianza total que es genética, es decir
Vg/Vp. Para los criadores de animales que se interesan en aparear
vacas con producciones altas de leche ésta es una medida impor­
tante de la forma en que un programa de apareamiento puede
crear un ganado en el que el animal promedio se asemeja al me­
jor del momento. En sentido estricto, Vg/Vp es la heredabilidad
amplia. Puesto que la varianza de dominancia no puede fijarse
por apareamiento, la respuesta de selección está determinada por
la heredabilidad estrecha, VAI Vp. A menudo las heredabilidades
de caracteres humanos se estiman como parte de los análisis de
segregación (véase sección 15.2 y cuadro 15.4). Sin embargo, de­
be recordarse que para muchos caracteres conductuales humanos
no es aplicable la división simple de la varianza en componentes
ambiental y genético. Los padres proporcionan a sus hijos tanto
sus genes como su ambiente. La desventaja genética y la desven­
taja social tienden a ir juntas, de modo que los factores genéticos
y ambientales se correlacionan con frecuencia. Si estos dos no
son independientes, V¡> no es igual a Vq + Vg; hay varianzas de
interacción adicionales. Una proliferación de varianzas puede re­
ducir con rapidez la potencia explicativa de los modelos y en ge­
neral es un área difícil de trabajar.
A menudo el término “heredabilidad” se comprende mal. La
heredabilidad es muy diferente de la modalidad de herencia (auto-
sómica dominante, poligénica, etc.). La modalidad de herencia es
una propiedad fija de un carácter, pero la herencia no. La “hereda­
bilidad del IQ” es la abreviatura para “heredabilidad de variaciones
en IQ”. Contrastan las dos preguntas:
► ¿hasta q u é grado es gen ético e l IQ? Ésta es una pregunta sin
sentido;
► ¿qué tanto de la diferencia en el IQ entre personas en un país y un
tiempo particulares se debe a sus diferencias genéticas y qué tanto
a sus distintos am bientes e historias de vida? Ésta es una pregun­
ta importante aunque difícil de responder.
La heredabilidad del IQ (CI) varía en diferentes circunstancias so­
ciales. Cuanto más igual es una sociedad, más alta debe ser la here-
114 O CUA! RO GENES EN GENEALOGÍAS Y POBLACIONES

80 90 100 110 120

D e s c e n d e n c ia d e s p u é s
d e a p a re a m ie n to a le a to rio

80 90 1 0 0 1 1 0 1 2 0 80 90 1 0 0 1 1 0 1 2 0 80 90 100 110 120 80 90 100 1 1 0 1 2 0 80 90 100 110 120

D istrib u ció n e n tre niños

H I I M
80 90 1 0 0 1 1 0 1 2 0

Fig. 4-12. Regresión a la media.

El mismo carácter de la figura 4 -1 1B: media 100, determinado por alelos codominantes A, a, B y b en dos locus, todas frecuencias génicas = 0.5.
Arriba: distribución en una serie de madres. En medio: distribución en niños de cada clase de madres, asumiendo apareamiento aleatorio. Abajo:
distribución sumada en los niños. N ótese que: a) la distribución en los niños es la misma que la distribución en las madres; b) para cada clase de
madre, la media para sus niños es la equidistante entre el valor de la madre y la media en la población (100), y c) para cada clase de niños (abajo),
la media para sus madres es equidistante entre el valor en los niños y la media poblacional.

Recuadro 4-3. Dos conceptos erróneos frecuentes respecto a la regresión a la media

1) Después de unas cuantas generaciones, todas las personas serán
exactamente ¡guales.
2) SI un carácter muestra regresión a la media, debe ser genético.
La figura 4-12 muestra que el primero de estos conceptos es erróneo.
En un modelo genético simple:
la distribución total es la misma en cada generación;
la regresión funciona en ambos caminos: para cada clase de niños, el
promedio para sus madres es equidistante entre el valor de los niños y
la media de la población. Aunque puede parecer paradójico, suele con­
firm arse mediante la inspección, por ejemplo, de la columna del lado
derecho en la parte inferior del histograma de la figura 4-12 (niños con
IQ de 120). Una cuarta parte de sus madres tiene un IQ de 120, la mitad
1 1 0 y una cuarta parte 100, lo que da un promedio de 1 1 0 .
Sin considerar la segunda de estas creencias, la regresión a la media no
es un mecanismo genético sino un fenómeno estadístico puro. Sea que
los determinantes de IQ sean genéticos, ambientales, o cualquier com ­
binación de ambos, si se toma un grupo excepcional de madres (p. ej.,
las que tienen un IQ de 120), entonces estas madres deben haber tenido
un juego excepcional de determinantes. Si se considera un segundo
grupo que comparte la mitad de esos determinantes (sus niños, her­
manos o incluso sus padres), el fenotipo promedio en este segundo
grupo se desviará de la media de la población pero cuando mucho la
mitad. La genética proporciona la cifra de una mitad, pero no el principio
de regresión.
 4.4 GENÈTICA DE CARACTERES MULTIFACTORIALES: TEORÌA DEL UMBRAL POLIGÉNICO
Recuadro 4-4. Partición de varianza
Varianza de fenotipo ( / P) = varianza genética (t/G) + varianza ambientai
(Và
yG = varianza por efectos genéticos aditivos (l/A) + varianza por efectos
dominantes (l/D)
dabilidad del IQ. Si todas las personas tienen iguales oportunida­
des se eliminan varias de las diferencias ambientales entre las perso­
nas. En consecuencia, más de las diferencias restantes en el IQ se
deberán a las diferencias genéticas entre las personas.
4.4.3 Teoría poligénica de caracteres discontinuos
La mayor parte de los caracteres “poligénicos” clásicos continua­
mente variables, como estatura y peso, tiene poco interés para los
genetistas médicos (aunque se discute la obesidad; sección 15.6.8).
Resultan mucho más interesantes las innumerables enfermedades y
malformaciones que tienden a presentarse en familias, pero que no
muestran patrones de genealogía mendeliana. Una elemento con­
ceptual importante en la genética no mendeliana la proporcionó la
extensión de Falconer de la teoría poligénica a caracteres dicótomos
o discontinuos (los que una persona tiene o no).
Falconer postuló una susceptibilidad subyacente continuamente
variable. Puede tenerse o no un paladar hendido, pero cada embrión
posee una cierta susceptibilidad a paladar hendido, que puede ser al­
ta o baja; es poligénica y sigue una distribución gausiana en la pobla­
ción. Aunada a la susceptibilidad poligénica, Falconer postuló la
existencia de un umbral. Los embriones cuya susceptibilidad excede
un valor umbral crítico desarrollan paladar hendido; aquellos cuya
susceptiblidad es menor del umbral no tienen paladar hendido, inclu-
Fig. 4-13. Determinación multifactorial de una enfermedad o malfor­
mación.
Los ángeles y los demonios pueden representar cualquier combinación
de factores genéticos y ambientales. La adición de un demonio o la
supresión de un ángel puede inclinar la balanza, sin que ese factor par­
ticular sea la causa de la enfermedad. Cortesía del profesor R. S. W.
Smithells.
115
V? ~ + Vi
Heredabilidad (amplia) = V ^V ?
Heredabilldad (reducida) = iy i/p
sive si sólo es un poco menor. Despojado de sutileza matemática el
modelo puede representarse como en la figura 4-13. El umbral puede
imaginarse como el punto neutro de la balanza. El cambio del equili­
brio de los factores inclina el fenotipo en un sentido o en el otro.
En el paladar hendido, parecer ser intuitivamente razonable un
modelo de umbral poligénico (Fraser, 1980). Todos los embriones
comienzan con un paladar hendido. Durante el desarrollo tempra­
no, los entrepaños palatinos deben tornarse horizontales y fusio­
narse entre sí. Es necesario que esto ocurra dentro de una ventana
de tiempo específica del desarrollo. Muchos factores genéticos y
ambientales diferentes influyen en el desarrollo embrionario, de
manera que parece razonable que la susceptibilidad deba ser poli­
génica. No es importante si los entrepaños palatinos se encuen­
tran y fusionan con un tiempo de ahorro suficiente o que sólo se
fusionen a tiempo: si se fusionan, se forma un paladar normal y
si no lo hacen, entonces resulta un paladar hendido. Por tanto hay
un umbral natural superpuesto en un proceso continuamente va­
riable.
La teoría del umbral de Falconer ayuda a explicar la forma en
que los riesgos de recurrencia varían en familias. Las personas afec­
tadas deben tener una combinación desafortunada de alelos con
susceptibilidad alta. Sus familiares que comparten genes con ellos
también tendrán, en promedio, mayor susceptibilidad según la di­
vergencia de la media de la población en la proporción de genes
compartidos. Por consiguiente los caracteres del umbral poligénico
tienden a presentarse en familias (fig. 4-14). Es posible que los pa­
dres con varios niños afectados hayan tenido mala suerte, pero en
promedio tendrán más alelos de riesgo alto que los padres que sólo
tienen un niño afectado. El umbral es fijo, pero la susceptibilidad
promedio, y en consecuencia el riesgo de recurrencia, aumenta con
un número cada vez mayor de niños afectados.
Muchos supuestos padecimientos de umbral tienen diferentes
incidencias en los dos sexos. Esto implica umbrales específicos de
sexo. Por ejemplo, la estenosis pilórica congènita es cinco veces más
frecuente en niños. El umbral debe ser más alto para niñas que pa­
ra los niños y, por tanto, los familiares de una niña afectada tienen
una susceptibilidad promedio más alta que los familiares de un ni­
ño afectado (fig. 4-15). El riesgo de recurrencia es de manera co­
rrespondiente más alto, aunque en cada caso el riesgo de que se
afecte un hijo es cinco veces más alto si es varón (cuadro. 4-1).
4.4.4 La asesoría en padecimientos no mendelianos
utiliza los riesgos empíricos
En la asesoría genética para padecimientos no mendelianos los ries­
gos no se derivan de la teoría poligénica; son riesgos empíricos que
se obtienen mediante encuestas en la población, como los que se
muestran en el cuadro 4-1. Esto es en esencia distinto de los pade­
cimientos mendelianos, en los que los riesgos uno en dos, uno en
cuatro, etc., provienen de la teoría. El efecto del antecedente fami-
116 j CAPÍTULO CUATRO i GENES EN GENEALOGÍAS Y POBLACIONES

D istrib u ció n d e l riesgo Distribución del riesgo en

en la p o b la c ió n g e n e ra l la población general

Distribución de! riesgo en hermanos U m b ra l Distribución del riesgo en los

de la persona afectada
hermanos de niños afectados
In d e m n e n ^ A fe c ta d o -
Um brales específicos de sexo
Distribución del riesgo en los
hermanos de niñas afectadas Niños Niños

R ies g o R ie s g o p ro m e d io R ie s g o p ro m e d io R ies g o
bajo en la p o b la c ió n en tre h e rm a n o s d e alto
g e n e ra l p e rs o n a s a fe c ta d a s

Riesgo m e d io para:
Fig. 4-14. Modelo de umbral poligénico de Falconer para caracteres p o b la ció n g e n e ra l-------
dicótomos no mendelianos. he rm a nos de
n iño s afectad os —
El riesgo para el padecimiento es poligénico y distribuido normalmente he rm a nos de
(curva verde). Las personas cuyo riesgo es mayor de un cierto valor niñas afectadas —
umbral (el punto de equilibrio en la figura 4-13) están afectadas. Sus
hermanos (curva de color lila) tienen un riesgo promedio más alto que Fig. 4-15. Carácter poligénico con umbrales específicos de sexo.
el promedio de la población y una proporción mayor de ellos posee un
Si un carácter dícótomo no mendeliano afecta a varones de manera
riesgo que excede el umbral. Por consiguiente el padecimiento tiende a
predominante, éste corresponde a la teoría del umbral multifactorial,
presentarse en familias.
que postula un umbral más bajo para varones que mujeres. Se deduce
que los riesgos de recurrencia son más altos para familiares de
liar también es muy distinto. Si los dos miembros de una pareja son mujeres afectadas, pero la mayoría de estos casos recurrentes la
portadores de fibrosis quística, el riesgo de que su próximo niño se constituirán varones. Véase cuadro 4-1 para un ejemplo de datos que
afecte es de uno en cuatro. Lo anterior es cierto sin considerar se ajustan a esta interpretación.
cuántos niños afectados o normales hayan tenido ya (“el azar no tie­
ne memoria”). Si tienen un niño con un defecto del tubo neural, el 4.5 Factores que afectan las frecuencias
riesgo de recurrencia es alrededor de 1 en 25 en el Reino Unido, génicas
pero si ya tienen dos niños afectados, el riesgo de recurrencia se
aproxima a uno en dos (que quizá pueda resumirse como “a él de­ 4.5.1 Es posible que las frecuencias génicas y las
be concedérsele”). La procreación de un segundo niño afectado no frecuencias de genotipo establezcan una relación
es la causa del incremento de su riesgo de recurrencia, sino que per­
simple
mitió reconocerlos como una pareja que siempre había tenido un
riesgo en particular alto. Aunque un cínico diría que esto implica
que el asesor es muy astuto después del acontecimiento, la práctica Un experimento meditado: escoger genes del fondo común
concuerda tanto con el conocimiento basado en la teoría del um­ génico
bral como con los datos epidemiológicos, y representa lo mejor que En una población completa debe haber muchos alelos diferentes en
puede ofrecerse en un estado de conocimientos imperfecto. un locus particular, aunque cada persona tiene sólo dos alelos, que

Riesgos de recurrencia de estenosis pilórica.

Familiares de Hijos Hijas Hermanos Hermanas

Hijos de pacientes masculinos 19/296 7/274 5/230 5/242

(6.42%) (2.55%) (2.17%) (2.07%)

Hijos de pacientes femeninos 14/61 7/62 11/01 9/101

(22.95%) (11.48%) (10.89%) (8.91%)

Aunque más niños que niñas están afectados, el riesgo de recurrencia es más alto para familiares de una niña afectada. Los datos se ajustan a un
modelo de umbral poligénico con umbrales específicos de sexo (fig. 4-15). Datos de Fuhrmann y Vogel (1976).
 4.5 1 FACTORES QUE AFECTAN LAS FRECUENCIAS GÉNICASJ
pueden ser idénticos o diferentes. Es posible imaginar un fondo
común gènico, que consiste en todos los alelos en el locus A en la
población. La frecuencia gènica del alelo Aj es la proporción de
todos los alelos A en el fondo común gènico que son A i. Considé­
rense dos alelos, Aj y A2 en el locus A. Asúmase que sus frecuencias
génicas sean p y q respectivamente (p y q están, cada una, entre 0
v i ) . Llévese a cabo un experimento meditado:
► elíjase al azar un alelo del fondo común gènico. Hay una posi­
bilidad de que p sea Aj y una de que q sea A2;
► selecciónese un segundo alelo al azar. Una vez más la posibili­
dad de seleccionar A, es p y la posibilidad de elegir A2 es q (se
supone que el fondo común gènico es suficientemente grande
para que la eliminación del primer alelo no cambie de manera
significativa las frecuencias génicas en el fondo común restan­
te). Se deduce que:
• la posibilidad de que ambos alelos fueran Aj es p2;
• la posibilidad de que ambos alelos fueran A2 es q ;
• la posibilidad de que el primer alelo fuera At y el segundo A2
es pq. La posibilidad de que el primero fuera A2 y el segun­
do A[ es qp. En total, la posibilidad de seleccionar un alelo
Aj y uno A2 es 2pq.
Distribución de Hardy-Weinberg
La elección al azar de una persona de la población equivale a selec­
cionar en forma aleatoria dos genes del fondo común gènico. La
posibilidad de que la personas sea AjA¡ es p2, la de que sea AjA2 es
2pq y la de que sea A2A2 es q2. Esta relación simple entre las fre­
cuencias génicas y las frecuencias de genotipo (la distribución de
Hardy-Weinberg, véase recuadro 4-5) es aplicable siempre que se
extraen del fondo común gènico dos genes de una persona de ma­
nera independiente y al azar. Es posible que Ai y A2 sean los úni­
cos alelos en el locus (en cuyo caso p + q = 1) o que haya otros
alelos y otros genotipos (p + q < 1). Para locus ligados a X, los va­
rones, siendo hemicigotos (sólo un alelo), son A! o A2 con frecuen­
cias p y q respectivamente, en tanto que las mujeres pueden ser
AjAj, AjA2 o A2A2 (véase recuadro 4-5).
Limitaciones de la distribución de Hardy-Weinberg
Estos cálculos simples se descomponen si no se sigue la suposición
subyacente de que los dos genes de una persona se captaron de ma­
nera independiente del fondo común gènico. En particular es un
problema si no ha habido apareamiento aleatorio. El apareamiento
concordante puede tomar varias formas, pero la más importante
suele ser la endogàmica. Si una persona se casa con un familiar, lo
hace con alguien cuyos genes se parecen a los de ella. Este hecho
aumenta la posibilidad de que los niños sean homocigotos y dismi­
nuye la de que sean heterocigotos. Los padecimientos recesivos ra­
Recuadro 4-5. Frecuencias de genotipo de equilibrio de Hardy-Weinberg para frecuencias de alelo p ^ ) y q(Az)
Locus autosómico
Genotipo A ,A 2 A2A2
Frecuencia P2 2pq q2
Nótese que estas frecuencias de genotipos se observarán sea o no que A, o A2 sean los únicos alelos en el locus.
117
ros se relacionan de manera firme con consanguinidad parental y
los cálculos de Hardy-Weinberg que lo ignoren estimarán en exce­
so la frecuencia de portador en la población en conjunto.
Uso de la distribución de Hardy-Weinberg en asesoría genética
Las frecuencias génicas o las de genotipo constituyen información
esencial en muchas formas de análisis genéticos, como el análisis de
enlace (sección 13.3) y el análisis de segregación (sección 15.2), y
tienen importancia particular en el cálculo de los riesgos genéticos.
El recuadro 4-6 presenta algunos ejemplos.
4,5.2 Las frecuencias de genotipo pueden utilizarse (con
cautela) a fin de calcular los índices de mutación
Los genes mutantes se crean por mutaciones nuevas y se eliminan
por selección natural (recuadro 11-2). Para un nivel determinado
de selección es posible calcular el índice de mutación que se reque­
riría para reemplazar dos genes que se perdieron por selección. Si se
supone que la población presenta un equilibrio entre las tasas de
pérdida y de restitución, el cálculo indica el índice de mutación que
existe. Es posible definir el coeficiente de selección (s) como la
posibilidad relativa de fracaso de la reproducción de un genotipo
debido a selección (el tipo más idóneo en la población tiene s = 0 ,
un letal genético tiene s = 1).
► Para un padecimiento autosómico recesivo una proporción q‘
de la población está afectada. La pérdida de los genes de enfer­
medad de cada generación es sq . Esto se equilibra por la muta­
ción al índice de p.(l —q ) en la que p. es el índice de mutación
por gen por generación. En equilibrio sq^ = (x(l —q“) o alrede­
dor de (si q es pequeña) p, = sq2.
► Para un padecimiento autosómico dominante raro los homo-
cigotos son en extremo raros. Los heterocigotos ocurren con
una frecuencia 2 pq (frecuencia del gen de enfermedad = p).
Sólo una mitad de los genes que se perdieron a través de su fra­
caso reproductivo es el alelo de la enfermedad, por lo que el ín­
dice de pérdida genética es muy cercano a sp. Una vez más esto
se equilibra mediante un índice de nuevas mutaciones de p.q",
que se aproxima a p, si q es casi 1. Por consiguiente, p, = sp.
► Para una enfermedad recesiva ligada a X el índice de pérdida
génica a través de varones afectados es sq, lo que se equilibra
por una tasa de mutación 3p. ya que todos los cromosomas X
en la población están disponibles para mutación, pero sólo un
tercio de los cromosomas X que se encuentran en varones está
expuesto a selección. Por consiguiente, p, = sq/3.
Estos resultados se resumen en el recuadro 4-7. Las estimaciones
derivadas de su empleo pueden compararse con la expectativa ge­
neral, de estudios en muchos organismos, de que los índices de mu­
tación suelen ser 10 5 a 10 ' por gen por generación.
Locus ligado a X
Varones Mujeres
Ai A2 A1A1 A,A 2 A2A2
p q p2 2pq i?
118 CAPÍTULO CUATRO GENES EN GENEALOGÍAS Y POBLACIONES

Recuadro 4-6. La distribución de Hardy-Weinberg puede utilizarse (con cautela) para calcular frecuencias
de portador y riesgos sim ples con fines de asesoram iento
Un padecimiento autosómico recesivo afecta a 1 recién nacido en 10 000. (el riesgo de portador del padre) x (el riesgo de portador de la nueva
¿Cuál es la frecuencia esperada de portadores? esposa) x 1/4 = 1 x 1/50 x 1/4

Fenotipos: No afectado Afectado = 1/200

Genotipos: AA Aa aa Esto asume que no hay un antecedente familiar de la misma enfermedad

en la familia de la nueva esposa.
Frecuencias: p2 2pq p2 = 1/10 000
La ceguera a los colores rojo y verde ligada a X afecta a 1 de 12
q2 es 1 0 " 4 y por tanto q = 10 "2 o 1/ 100.
varones británicos. ¿Qué proporción de mujeres serán portadoras y
1 en 100 genes en el locus A son a, 99/100 son A. qué proporción estarán afectadas?
La frecuencia de portador, 2pq, es 2 x 99/100 x 1/100, muy cerca de Varones Mujeres
1 en 50. Esto supone que la frecuencia del padecimiento no aumentó por Genotipos: Ai A2 A1A1 A1A2 A2A2
endogamia.
Frecuencias: p q = 1/12 p2 2pq q2
Si un padre de un niño afectado con los padecimientos anteriores se
casa de nuevo, ¿cuál es el riesgo de que procree un niño afectado en q = 1 / 1 2 , por tanto p = 11/12
el nuevo matrimonio? 2 pq = 2 x 1/12 x 11/12 = 22/144
Para tener un niño afectado, ambos padres deben ser portadores y el q2 = 1 en 144. En consecuencia este modelo de locus único predice que
riesgo entonces es de uno en cuatro. Por consiguiente el riesgo total es: 15% de las mujeres será portador y 0.7% estará afectado.

R ecuadro 4-7. Equilibrio entre mutación y selección

Padecimiento autosómico recesivo* ix = sq2 0 ijl = F(1 —f)

Padecimiento autosómico dominante = sp 0 p. = 1/2F(1 - f )
Padecimiento recesivo ligado a X |x = sq/3 0 ix = 1/3F(1 - f)
ix = índice de mutación por gen por generación
p,q = frecuencias génicas
s = coeficiente de selección
f = idoneidad biológica = 1 - s
F = frecuencia del padecimiento en la población
*Esta fórmula proporciona un estimado muy erróneo del índice de mutación si hay ventaja del heterocigoto, véase recuadro 4-8.

4.5.3 La ventaja del heterocigoto puede ser mucho
más importante que la mutación recurrente para
determinar la frecuencia de una enfermedad
recesiva
La fórmula p, = sq2 proporciona una tasa de mutación inesperada­
mente alta para algunos padecimientos autosómicos recesivos; por
ejemplo, la fibrosis quística (FQ). Hasta fecha muy reciente, casi
nadie con FQ vivía el tiempo suficiente para reproducirse y por
tanto s = 1. La FQ afecta a alrededor de 1 nacimiento en 2 000 en
el Reino Unido. En consecuencia, q2 = 1/2 000 y la fórmula da
p, = 5 X 10 4, que sería un índice de mutación muy alto para
cualquier gen -aunque las pruebas indican que las mutaciones nue­
vas de FQson muy raras—. Lo anterior se deduce de la distribución
étnica desigual de la FQ y la existencia de un desequilibrio de en­
lace potente (sección 13.5.2).
El factor perdido es la ventaja del heterocigoto. Los portado­
res de FQ tienen, o tuvieron, cierta ventaja en la reproducción so­
bre los homocigotos normales. Aún se discute cuál puede ser esta
ventaja. Puesto que el gen de FQ codifica un canal de cloruro en la
membrana que se requiere para que Salmonella typhi penetre a las
células epiteliales, es probable que los heterocigotos sean hasta cier­
to punto resistentes a la fiebre tifoidea (Pier y cois., 1998). Cual­
quiera que sea la causa de la ventaja del heterocigoto, si Sj y S2 son
los coeficientes de selección contra los genotipos AA y aa respecti­
vamente, entonces el equilibrio se establece (ignorando la mutación
recurrente) cuando la relación de las frecuencias génicas de A y a,
p/q, es s2/sj. El recuadro 4-8 ilustra el cálculo para la fibrosis quís­
tica y muestra que una ventaja del heterocigoto muy pequeña para
observarse en encuestas poblacionales puede tener un efecto mayor
en las frecuencias génicas.
Merece la pena recordar que las enfermedades mendelianas con
importancia en medicina son tanto frecuentes como graves. Todas
también deben tener algún truco especial para permanecer comu­
nes ante la selección. El truco puede ser un índice de mutación en
extremo alto (distrofia muscular de Duchenne), la propagación de
premutaciones no patológicas (X frágil) o el inicio de síntomas des­
pués de la edad de la reproducción (enfermedad de Huntington);
no obstante, para padecimientos recesivos importantes más a me­
nudo es la ventaja del heterocigoto.
 4.5 ! FACTORES QUE AFECTAN LAS FRECUENCIAS GÉNICAS 1 119

Recuadro 4-8. Selección en favor de heterocigotos para fibrosis quística (FQ)

Para FQ, la frecuencia de enfermedad en el Reino Unido se aproxima a 1 q2 es 5 x 10 4, por consiguiente q = 0.022 y p = 1 - q = 0.978
en 2 000 nacimientos
p/q = 0.978/0.022 = 43.73 = s2/s,
Fenotipos: No afectados Afectados
Si s2 = 1 (los homocigotos afectados nunca se reproducen), s, = 0.023
Genotipos: AA Aa aa
La frecuencia del gen de FQ presente se mantendrá, inclusive sin muta­
Frecuencias: p2 2pq q2 = 1/2 000 ciones nuevas, si los heterocigotos Aa tienen en promedio 2.3% más
niños sobrevivientes que los homocigotos AA.

Lecturas adicionales

Falconer DS, Mackay TFC (1996) Introduction to Quantitative Forrest DW (1974) Francis Galton: The Life and Work of a Victorian
Genetics. Longman, Harlow Genius. Elek, London.

Bibliografia

Fisher RA (1918) The correlation between relatives under the sup­
position of mendelian inheritance. Trans. Roy. Soc. 52, 399-433.
Fuhrmann W, Vogel F (1976) Genetic Counselling. Springer, New
York.
Fraser FC (1980) The William Allan Memorial Award Address:
Evolution of a palatable multifactorial threshold model. Am. J.
Hum. Genet. 32, 796-813.
Harper PS (2001) Practical Genetic Counselling, 5th Edn. Arnold,
London.
Heutink P, van der Mey AG, Sandkuijl LA ef al. (1992) A gene
subject to genomic imprinting and responsible for hereditary
paragangliomas maps to chromosome 11 q23-qter. Hum. Molec
Genet. 1, 7-10.
Jobling MA,Tyler-Smith C (2000) New uses for new haplotypes:
the human Y chromosome, disease and selection. Trends
Genet. 16, 356-362.
Pier GB, Grout M, Zaidi T ef al. (1998) Salmonella typhi uses
CFTR to enter intestinal epithelial cells. Nature 393, 79-82.
Prezant TR, Agapian JV, Bowman MO et al. (1993) Mitochon­
drial ribosomal RNA mutation associated with both antibiotic
induced and non syndromic deafness. Nature Genet. 4,
289-294.
Skaletsky H, Kuroda-Kawaguchi T, Minx PJ ef al. (2003) The
male-specific region of the human Y chromosome is a mosaic
of discrete sequence classes. Nature 423, 825-837.
Strain L, Dean JCS, Hamilton MPR, Bonthron DT (1998) A true
hermaphrodite chimera resulting from embryo amalgamation
after in vitro fertilization. N. Engl. J. Med. 338, 166-169.
Van der Meulen MA, van der Meulen MJP, te Meerman GJ
(1995) Recurrence risk for germinal mosaics'revisited. J. Med.
Genet. 32, 102-104.
Viljoen D, Ramesar R (1992) Evidence for paternal imprinting in
familial Beckwith-Wiedemann syndrome. J. Med. Genet. 29,
221-225.
Wilkie AOM (1994). The molecular basis of dominance. J. Med.
Genet. 31, 89-98.
CAPÍTULO CINCO

Amplificación del DNA: clonación de

DNA por PCR y basada en células

Contenido del capítulo

122 i CAPÍTULO CINCO AMPLIFICACIÓN DEL DNA: CLONACIÓN DE DNA POR PCR Y BASADA EN CÉLULAS

5.1 Im po rtancia de la clonación
del DNA
Los fundamentos de la tecnología actual del DNA se basan de mo­
do muy amplio en dos conductas bastante diferentes para estudiar
secuencias específicas de DNA dentro de una población de DNA
complejo (véase fig. 5-1):
► Clonación de DNA. Deben amplificarse d e form a selectiva la
secuencia o el fragmento elegido de DNA para producir un
gran número de copias idénticas y el resultado es la purifica­
ción del producto deseado. A continuación es posible estudiar
en extenso su estructura y función.
► Hibridación molecular. No se amplifica ni purifica en ningu­
na forma el fragmento de interés; por el contrario, se detecta de
modo específico dentro de una compleja mezcla de muchas se­
cuencias diferentes.
Antes de la clonación del DNA, el conocimiento sobre este último
era en extremo limitado. La tecnología de clonación del DNA
cambió todo lo anterior y revolucionó el estudio de la genética. Pa­
ra comprender por qué sucedió así, deben reconocerse el tamaño
y la complejidad enormes de las secuencias de DNA (comparadas,
por ejemplo, con las secuencias de proteínas). Las moléculas indi­
viduales de DNA nuclear contienen cientos de millones de nu-
cleótidos. Cuando se aísla DNA de las células mediante métodos
estándar, estas moléculas enormes se fragmentan por acción de
fuerzas de desgarro, lo cual crea mezclas complejas de fragmentos
de DNA aún muy grandes (50 a 100 kb de largo).
Si se toma en cuenta la complejidad del DNA aislado de célu­
las eucarióticas típicas o incluso una procariota, el desafío fue la for­
ma de analizarlo. Se requería cierto método de fraccionamiento del
DNA de tal manera que pudieran purificarse las diferentes subpo-
blaciones de secuencias del DNA. En muchas eucariotas, un méto­
do inicial consistió en separar distintas poblaciones de secuencias
de DNA mediante centrifugación. La ultracentrifligación en gra­
dientes de densidad de equilibrio (p. ej., gradientes de densidad
CsCl) fracciona de forma característica el DNA de una célula euca-
riota en una banda mayor (la m asa d e DNA) y varias bandas me­
nores. Las densidades boyantes de las bandas menores de DNA
difieren de la masa de DNA (y entre sí) porque están formadas por
secuencias de DNA sa télite de repetición tándem, cuya composi­
ción de bases es diferente en grado notorio de la masa de DNA. Se
encontró que las secuencias de DNA satélite participan en aspectos
específicos de la estructura y función de los cromosomas. Aunque
de valor e interés, los DNA satélite purificados fueron un compo­
nente menor del genoma y no contienen genes. ¿La clonación d el
DNA ofrecía un m étodo general para pu rificar y estudiar cualquier se­
cuencia de DNA?
La clonación de DNA exige la amplificación selectiva de un
componente específico de DNA (el DNA blanco) que ocurre den­
tro de una población de DNA inicial grande y compleja, que pue­
de ser el DNA genómico total dentro de un tejido particular (o el
tipo de célula) o DNA co m p lem en ta rio (cDNA) preparado a par­
tir del RNA total de un tejido particular. La amplificación se logra
mediante una polimerasa de DNA y puede llevarse a cabo in vitro
o dentro de las células.
Clonación del DNA in vitro
En este caso se selecciona el DNA blanco deseado mediante ceba­
dores (oligonucleótidos iniciadores) que se enlazan de modo espe­
cífico a esta secuencia. Una vez que se enlazan al blanco los

P oblación d e D N A com plejo,!

p. ej., D N A genóm ico total,
cD N A total d e tejido, etc.

M é to d o s g e n e ra le s p a ra
A m p lific a c ió n espe cífica e s tu d ia r s e c u e n c ia s d e D e te c c ió n
(clonación d e DNA) D N A e s p e c ífic a s e s p e c ífic a

C lo n a c ió n d e
DNA basada M é to d o s H ib rid a c ió n m o le c u la r
en cé lu la s

.....................................
1. C élu la h u é sp e d 1. P o lim e ra s a d e 1. S o n d a m a rc a d a
a p ro p ia d a D N A te rm o e s ta b le de DNA o RNA

2. R ep licó n 2. L a in fo rm ació n d e 2. M edios para d etectar

R eq u e rim ie n to s
s e c u e n c ia p e rm ite la fragm entos a los que
es e n c ia le s se en laza la sonda
3. M e d io s d e fijació n síntesis d e c e b a d o re s
d e D N A e x tra ñ o al o lig o n u c leó tid o s
rep licó n y tra n s fe re n c ia e s p ec ífic o s
a la c é lu la h u é sp e d

Fig. 5-1. Métodos generales para el estudio de secuencias específicas de DNA en poblaciones de DNA complejas.
 5-2
aradores específicos de secuencia, una polimerasa de DNA ter-
- -estable puede crear copias adicionales de la secuencia objetivo.
Las nuevas copias del DNA blanco sirven a su vez como plantillas
rara elaborar más copias aún en una rea cció n en ca d en a que se de-
- : —úna reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas
— inglés).
I : nación del DNA basada en células
Se rijan las moléculas blanco de DNA a un tipo aislado de molécu-
¡ de replicón (que es capaz de replicar DNA d e manera indepen-
lum te dentro de una célula huésped adecuada) y se transfieren a
células huésped apropiadas. De manera típica, las moléculas híbri-
1^5 de blanco y replicón llevan a cabo muchas rondas de replica-
_ de DNA (a m p lifica ció n d e DNA), después de las cuales
rueden separarse las moléculas de DNA blanco amplificadas de
o:ro contenido celular y asimismo de las moléculas del replicón. La
clave para la clonación del DNA basado en células es que, cuando se
transfieren las diferentes moléculas de blanco-replicón a las células
tra n sform a ción ), cada célula sólo capta un tipo de molécula de
DNA blanco-replicón y de esa manera todos los descendientes d e la cé­
lula contienen exactamente e l mismo tipo de moléculas blanco (clon a s
d e DNA). Al desarrollar un gran número de células a partir de una
colonia celular aislada es posible preparar poblaciones puras del
DNA blanco deseado.
PCR: c a ra c te rís tic a s y aplicaciones
básicas
La PCR revolucionó la genética molecular al permitir la clonación
y análisis rápidos de DNA. Desde los primeros informes que descri­
bieron esta nueva tecnología a mediados de la década de 1980 se
utilizó en múltiples aplicaciones en investigación básica y clínica.
5.2.1 Principios de la PCR básica y la PCR de
transcriptasa inversa (TI)
Selección del ácido nucleico de inicio
Por lo general, la PCR está diseñada para permitir la amplificación
selectiva de una(s) secuencia(s) específica(s) de DNA blanco dentro
de un conjunto heterogéneo de secuencias de DNA. Con frecuen­
cia, el DNA de inicio es DNA genómico total de un tejido particu­
lar o células cultivadas, en cuyo caso el DNA blanco es casi siempre
una fracción minúscula del DNA de inicio. Por ejemplo, si se tiene
la intención de amplificar el gen de globina (i de 1.6 kb del DNA
humano (el tamaño del genoma haploide es de 3 300 Mb), la rela­
ción blanco:DNA de inicio es 1.6 kb:3 300 Mb o 1:2 000 000.
Muchas PCR incluyen la amplificación de blancos incluso más pe­
queños, como exones aislados con 140 pb en promedio, y por con­
siguiente representan menos de 0.000005% de una población de
inicio del DNA genómico humano.
En el caso de secuencias blanco de DNA codificante, muchas
veces el DNA de inicio puede ser cDNA total preparado al aislar
RNA de un tejido o una línea celular adecuados y convertirlo a
continuación en DNA con la enzima transcriptasa inversa (PCR-
TI). Según sea la extensión a la cual se expresa la secuencia blanco
como transcritos en la población original de RNA, puede haber un
enriquecimiento considerable de la secuencia blanco (cuando se
compara con su representación en el DNA genómico). Sin embar­
1 PCR: CARACTERÍSTICAS Y APLICACIONES BÁSICAS j 123
go, bajo condiciones óptimas es posible utilizar en ocasiones la
PCR-TI para amplificar secuencias blanco de tejidos en los que só­
lo hay un nivel de transcripción basal.
Selección de cebadores (oligonucleótidos iniciadores)
Con el fin de permitir la amplificación selectiva es necesaria cier­
ta información previa de la secuencia de DNA de las secuencias
blanco. Estos datos se utilizan para diseñar dos cebadores oligonu­
cleótidos (amplímeros), en condiciones óptimas de unos 18 a 25
nucleótidos de largo, que son específicos para las secuencias que
flanquean a la secuencia blanco (es decir, sus secuencias de bases
están representadas perfectamente en las secuencias que flanquean
la secuencia blanco).
En la mayor parte de las PCR, el objetivo es amplificar^una se­
cuencia de DNA aislada y por lo tanto es importante reducir la po­
sibilidad de que se enlacen los cebadores en otros sitios del DNA
que no sean los deseados. Por consiguiente, es esencial evitar se­
cuencias repetidas de DNA y en el diseño del cebador es necesario
tomar en cuenta varias consideraciones:
► composición de bases. El contenido de GC debe ser de 40 a 60%
con una distribución uniforme de los cuatro nucleótidos.
► temperatura de fusión ( Tm; véase sección 6 .2.1 para su defini­
ción). Los valores de Tm calculados para los dos cebadores usa­
dos juntos no debe variar > 5°C y la Tm del producto de
amplificación no diferir de las de los cebadores > 10°C.
► secuencias terminales 3'. La secuencia 3' de un cebador no de­
be ser una secuencia complementaria de ninguna región del
otro cebador en la misma reacción. Nota: es crítica la compa­
tibilidad de bases correcta en el extremo 3' del cebador y pue­
de emplearse para asegurar que incluso es posible amplificar un
alelo específico pero no otros, lo que proporciona la base de la
PCR esp ecífica d e a lelo (véase recuadro 5-1).
► secuencias autocomplementarias. Deben evitarse repeticiones in­
vertidas o cualquier secuencia autocomplementaria > 3 pb de
largo.
El diseño del cebador se facilita mediante programas comercia­
les de computación y otros sin costo, como los disponibles en
http://www.hgmp.mrc.ac.uk/GenomeWeb/nucprimer.html
Naturaleza cíclica y amplificación exponencial
La PCR consiste en una serie de ciclos de tres reacciones sucesivas:
► desn atu ra liz ación , que se ajusta a una temperatura de 93 a
95°C para el DNA genómico humano.
► tem p la m ien to d e l ceb a d o r (annealing), a temperaturas casi
siempre de 50 a 70°C de acuerdo con la temperatura d e fusión
del dúplex esperado (por lo regular la temperatura de templa­
do se ajusta a unos 5°C menos respecto de la temperatura de
fusión calculada).
► sín tesis d e DNA, de manera característica alrededor de 70 a
75°C. La polimerasa de DNA empleada es termoestable (necesi­
ta alargarse con eficiencia a 70 a 75°C y no debe afectarse de
forma adversa por los pasos de la desnaturalización). Cuando
existen una polimerasa de DNA termoestable y precursores de
DNA adecuados (los cuatro trifosfatos de desoxinucleósido,
dATP, dCTP, dGTP y dTTP), los cebadores inician la síntesis de
nuevas cadenas de DNA que son complementarias a las cadenas
de DNA individuales del segmento de DNA blanco.
124 | CAPÍTULO CINCO AMPLIFICACIÓN DEL DNA: CLONACIÓN DE DNA POR PCR Y BASADA EN CÉLULAS
► PCR específica de alelo. Se designó para am plificar una secuencia
de DNA al tiempo que excluye la posibilidad de am plificar otros ale­
los. Se basa en la necesidad de una compatibilidad precisa de bases
entre el extremo 3 ' de un cebador de PCR y el DNA blanco. Véase la
figura 5-4.
► PCR-ftlu. Es un método de PCR en el que se usa un cebador especí­
fico para la repetición Alu, una secuencia que ocurre alrededor de una
vez cada 3 kb en el DNA humano. Cuando las repeticiones Alu conti­
guas están orientadas en direcciones opuestas, un tipo aislado de ce­
bador Alu puede amplificar la secuencia intermedia (p. e¡„ cebadores
A o B en la figura A de este recuadro).
► PCR anclada. Emplea un cebador específico de secuencia y un ceba­
dor universal para amplificar secuencias adyacentes a una secuencia
conocida. El cebador universal reconoce y se enlaza a una secuencia
común que se añade de modo artificial a todas las moléculas de DNA
diferentes en la población de inicio, por ejemplo con la fijación cova-
lente de un enlazador oligonucleótido de cadena doble.*
► PCR de exhibición diferencial. Una forma de PCR-TI para comparar
poblaciones de mRNA expresadas de dos fuentes relacionadas de cé­
lulas a fin de captar genes que se expresan de form a diferencial (véa­
se fig. 7-16).
► PCR-DOP (PCR con cebador oligonucleótido degenerado). Se em­
plean de forma parcial cebadores oligonucleótidos degenerados
(grupos de secuencias oligonucleótidas que se sintetizan en paralelo
para que tengan la mism a base en ciertas posiciones de nucleótidos,
en tanto que difieren en otras) para amplificar una variedad de DNA
blancos relacionados.
► PCR de inicio por calor. Es un medio para incrementar la especifici­
dad de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El mezclado
de todos los reactivos de la PCR antes de un paso Inicial de desnatu­
ralización por calor ofrece más oportunidades para el enlace inespe-
cífico de secuencias cebadoras. Con el fin de reducir esta posibilidad,
se separan de form a física uno o más componentes de la PCR hasta
el primer paso de desnaturalización.
► PCR inversa. Otra forma de acceso al DNA inmediatamente adyacen­
te a una secuencia conocida (véase PCR anclada). En este caso se
digiere la población de DNA de inicio con una nucleasa de restricción,
se diluye a una concentración baja de DNA y a continuación se trata
con ligasa de DNA para fomentar la formación de moléculas de DNA
circular mediante ligadura intramolecular. Los cebadores de la PCR se
colocan de tal manera que se unen a una secuencia de DNA conoci­
da y en seguida inician la síntesis del nuevo DNA en una dirección
que se aleja de la secuencia conocida y hacia la secuencia descono­
cida adyacente, lo que posibilita la amplificación de esta última. Véa­
se la figura B de este recuadro (X y Y son secuencias no
caracterizadas que flanquean una secuencia conocida).
► PCR de rescate de Islote. Es un método especializado para amplifi­
car secuencias en islotes CpG.
► PCR con cebador enlazador (PCR con adaptador de ligadura). Se
trata de una form a de am plificación indiscrim inada. Se digiere un
compiejo de DNA de inicio con una nucleasa de restricción para
producir múltiples tipos de fragmentos con el m ism o tipo de extre­
mo saliente. Se liga a los fragmentos un enlazador oligonucleótido
de doble cadena* de secuencia conocida y con extremos salientes
similares. A continuación se lleva a cabo la PCR con cebadores que
son específicos para las secuencias enlazadoras a fin de am plificar
todos los fragmentos del DNA fuente flanqueados por moléculas en­
lazadoras.
► PCR con cebador anidado. Es una forma de incrementar la especifi­
cidad de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se diluyen los
productos de una reacción de amplificación inicial y se emplean co­
mo fuente de DNA de inicio para una segunda reacción en la que se
usa un grupo de cebadores diferentes, que corresponde a secuencias
localizadas próximas, pero internas, a las empleadas en la primera
reacción.
► PCR cuantitativa. Véase PCR de tiempo real.
► PCR-RACE. Es una forma de PCR con cebador anclado (véase an­
tes) para la amplificación rápida de extremos de cDNA (del inglés ra- \
pid am plificaron of cDNA ends) (véase fig. 7-12).
► PCR de tiempo real. Es una variante de la PCR cuantitativa en la que
se usa un aparato termociclador de detección de fluorescencia para
amplificar secuencias específicas de ácido nucleico y medir de ma­
nera simultánea sus concentraciones. Tiene dos aplicaciones princi- j
pales en investigación: a) cuantificar la expresión génica (y confirmar
la expresión diferencial de genes detectados mediante análisis de hi­
bridación de microarreglo); y b) seleccionar mutaciones y polim orfis-
mos de nucleótido único. En laboratorios analíticos también se
practica para medir la abundancia de secuencias de DNA o RNA en ¡
muestras clínicas e industriales.
► PCR-TI (PCR de transcriptasa inversa, del inglés reverse trans-
criptase). PCR en la que la población de inicio es mRNA y en la
que se requiere un paso de transcriptasa inversa inicial para pro- j
ducir cDNA.
► PCR touch-down. Es un medio para incrementar la especificidad de
una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Puede programar-
se la mayor parte de los cicladores térm icos para que efectúen cur­
sos en los que se disminuye de manera gradual la temperatura de
templado (annealing) durante el ciclo de PCR, desde un valor inicial
mayor al Tm esperado hasta un valor menor de Tm. Al conservar muy
alta de form a inicial la rigidez de hibridación, se evita la form ación
de productos falsos y ello posibilita que predomine la secuencia es­
perada,
► PCR de genoma total. PCR indiscriminada en la que se emplean en
extenso cebadores degenerados o se fijan enlazadores de oligonu­
cleótido a una población de DNA complejo y a continuación se utili­
zan cebadores oligonucleótidos específicos de enlazador para
amplificar todas las secuencias.
*N ota: se prepara un enlazador (adaptador) oligonucleótido de doble
cadena al diseñar dos oligonucleótidos con secuencias complementa- f
rías. Los dos oligonucleótidos se sintetizan por medios químicos en
reacciones separadas y una vez que se purifican se permite que formen
pares de bases entre sí a fin de producir la secuencia de doble cadena
deseada. Los enlazadores oligonucleótidos se ligan (enlazan) a una se­
cuencia de DNA con objeto de permitir: a) la PCR mediante un oligonu­
cleótido específico para un enlazador; o b) la adición de características
convenientes, por ejemplo sitios de restricción para contribuir a la clona­
ción (véase fig. 5-10). Se insertan de rutina en vectores de clonación po-
lienlazadores complejos que contienen varios sitios de restricción (véase
sección 5.3.5).
 5.2 i PCR: CARACTERÍSTICAS Y APLICACIONES BÁSICAS
Recuadro 5-1. (c o n tin u a ció n )
A)
C eb a d o r B C ebador A
R epetición Alu
_______
/-v
3 J L ,
1
—
A) PCR-Alu
La orientación de los cebadores se elige de modo deliberado de tal
manera que la dirección de la síntesis de la nueva cadena ocurra a
partir de un cebador y se dirija hacia el sitio de unión del otro ce­
bador. Como resultado, las cadenas recién sintetizadas pueden ser­
vir a su vez como plantillas para la síntesis del nuevo DNA, lo que
da lugar a una reacción en cadena con un incremento exponencial
del producto (fig. 5-2).
La necesidad de contar con una enzima termoestable llevó a los
investigadores a aislar polimerasas de DNA de microorganismos cu-
vos hábitat naturales son las aguas termales. Un ejemplo inicial que
se utiliza con amplitud fue la polimerasa Taq que se obtiene de Ther-
mus aquaticus y es termoestable hasta 94°C, con una temperatura
óptima de trabajo de 80°C. Sin embargo, la polimerasa Taq carece
de una actividad de exonucleasa 3/_>5' adjunta para proporcionar
una fu n ció n d e lectu ra d e p r u eb a s y de esa manera comparar los
errores de copiado (incorporación de la base errónea) con los que
ocurren dentro de las células. Como resultado, en la actualidad se
usan con frecuencia enzimas alternativas con^ha actividad de exo­
nucleasa de lectura de pruebas 3,_>5', comó la polimerasa Pfu de
Pyrococcus furiosus (Cline y cois., 1996).
5.2.2 La PCR tiene dos limitaciones importantes:
tamaños cortos y elaboración baja
de productos
Una desventaja evidente de la PCR como método de clonación del
DNA es el tamaño limitado de los productos de la amplificación.
A diferencia de la clonación de DNA basada en células, en la que
el límite superior del tamaño de las secuencias de DNA clonadas
125
B)
DNA conocido
(i) Digerir con nucleasa de restricción en ( r )
(ii) Circularizar m ediante ligasa de DNA
I (iii) Desnaturalizar, tem plar (anneaí) cebadores —> PCR
X I
B) PCR inversa
puede aproximarse a 2 Mb, los productos de la PCR publicados
tienen entre 0 y 5 kb de tamaño, con frecuencia en el extremo in­
ferior de esta escala. Aunque suele ser posible amplificar los seg­
mentos pequeños de DNA mediante PCR, es cada vez más difícil
obtener una amplificación eficiente a medida que aumenta la lon­
gitud del producto deseado. Sin embargo, se han desarrollado pro­
tocolos de PCR de largo alcance, que proporcionan productos
que tienen decenas de kilobases de longitud, como un producto de
42 kb del bacteriófago \ (véase Cheng y cois., 1994). A menudo, las
condiciones modificadas incluyen una mezcla de dos tipos de polime­
rasas termoestables como esfuerzo para proporcionar niveles óptimos
de polimerasa de DNA y actividad de exonucleasa de 3'~*5' que sir­
ve como un mecanismo de lectura de pruebas.
También es una limitación la cantidad de material que puede
clonarse en una reacción de PCR aislada, además de que requiere
tiempo y es costoso repetir la misma reacción de PCR muchas ve­
ces con el fin de obtener grandes cantidades del DNA deseado. De
igual modo, es posible que el producto de la PCR no se encuentre
en una forma adecuada que permita ciertos estudios subsecuentes.
Como resultado, muchas veces es conveniente clonar el producto
de la PCR en un sistema de clonación basado en células para con­
seguir grandes cantidades de DNA y permitir una diversidad de
análisis.
Se usan varios sistemas de clonación en plásmidos para propagar
el DNA clonado mediante PCR en células bacterianas. Una vez que
se clona, puede cortarse y eliminarse el inserto mediante nucleasas de
restricción apropiadas y transferirse a otros plásmidos que pueden te­
ner usos especializados para posibilitar la expresión que se confiere a
un producto de RNA o proporcionar grandes cantidades de una pro­
teína. Varias polimerasas termoestables, incluida la polimerasa Taq,
126 CAPÍTULO CINCO AMPLIFICACIÓN DEL DNA: CLONACIÓN DE DNA POR PCR Y BASADA EN CÉLULAS

Sitio d e en lac e Sitio d e en la c e

del c e b a d o r del c e b a d o r
B lanco
5 ':
3 '-
S ec u en cia

i D es n atu ralizació n p o r ca lo r

J P erm ite te m p la r (anneal) ce b ad o res

Síntesis d e D N A

P ro d u cto p red o m in an te
p o r in crem en to ex p o n en c ia l
del núm ero d e co p ias

Fig. 5-2. La PCR es un método in vitro para amplificar secuencias de DNA mediante cebadores oligonucleótidos definidos.

Después de identificar una secuencia por amplificar (la secuencia blanco), se diseñan cebadores oligonucleótidos para que sean complementarios de las
secuencias de DNA localizadas en cadenas de DNA opuestas y a los lados de la secuencia blanco. La PCR consiste en ciclos de desnaturalización, tem ­
plado (annealing) de cebadores y luego síntesis de DNA en la que se Incorporan los cebadores en las cadenas de DNA recién sintetizadas. El primer ciclo
tiene como resultado dos cadenas de DNA nuevas (N) cuyos extremos 5 ' están fijos a la posición del cebador oligonucleótido, pero cuyos extremos 3 '
son variables (se indica con líneas punteadas). Después del segundo ciclo, las cuatro cadenas nuevas consisten en dos productos con extremos 3 ' varia­
bles, al igual que en el primer ciclo, aunque ahora dos cadenas de longitud fija (ambas con extremos 5 ' y 3 ') definidas por las secuencias del cebador.
Después del tercer ciclo, seis de las ocho cadenas nuevas tienen la longitud fija deseada y después de unos 30 ciclos hay un incremento masivo (amplifi­
cación) de este tipo de producto.
 5 . 2 I PCR: CARACTERISTICAS Y APLICACIONES BÁSICAS } 127

tienen actividad de transferasa de desoxinucleotidilo terminal que
modifica de modo selectivo fragmentos generados mediante PCR al
añadir un nucleótido aislado, por lo general adenina, a los extremos
3' de los fragmentos de DNA amplificados.
Los extremos salientes resultantes pueden dificultar la clonación
de los productos de la PCR y suelen utilizarse varios métodos para
facilitar la clonación, que incluyen el uso de vectores con residuos
T salientes en su sitio de clonación polienlazador (fig. 5-3) y el em­
pleo de enzimas de “pulimiento” como la polimerasa T4 o la poli-
merasa Pfu que pueden eliminar los nucleótidos aislados salientes.
De manera alternativa, pueden modificarse los cebadores de la
PCR si se diseña una extensión aproximada de 10 nucleótidos que
contiene un sitio de restricción apropiado en el extremo 5'. La ex­
tensión del nucleótido no forma pares de bases con el DNA blan­
co durante la amplificación, pero con posterioridad puede digerirse
el producto amplificado con la enzima de restricción adecuada a fin
de generar extremos salientes para clonación dentro de un vector
apropiado (véase sección 5.5.3).
5.2.3 Aplicaciones generales de la PCR
Debido a su sencillez, la PCR es una técnica difundida con una
gran variedad de aplicaciones que dependen en esencia de tres ven­
tajas principales del método:
► Muy rápido y fácil de practicar.
► Muy sensible y con la posibilidad de amplificar cantidades di­
minutas de DNA blanco -incluido el DNA de una célula ais­
lada (Li y cois., 1988)—. Se han hallado varias aplicaciones en
diagnósticos, análisis de enlace genético (incluida la tipifica­
ción de espermatozoos únicos) y ciencia forense (es posible ti­
pificar mediante PCR rastros de tejidos dejados por un
individuo -como un cabello aislado o células de piel descarta­
das- con marcadores de DNA muy polimórficos para identifi­
car al sujeto de origen).
► Es muy vigorosa y con frecuencia es posible amplificar DNA
de tejidos o células que están mal degradados o incluidos en
algún medio que dificulta aislar el DNA con los métodos es­
tándar. Asimismo, pueden amplificarse secuencias cortas de
cantidades pequeñas de DNA degradado extraídas de tejidos
descompuestos en sitios arqueológicos/históricos y es posible
tener éxito en la amplificación mediante PCR de muestras
de tejidos fijados en formalina (con ventajas notorias para la
patología molecular y, en algunos casos, estudios genéticos
de enlace).
Las múltiples aplicaciones de la PCR y la necesidad de optimizar su
eficiencia y especificidad llevaron a idear una gran variedad de mé­
todos de PCR (recuadro 5-1). Debido a la crucial importancia de
la especificidad del cebador, se utilizan por lo regular varias modi­
ficaciones a fin de reducir las posibilidades de enlace de un cebador
inespecífico (p. ej., PCR hot-start, cebadores anidados, PCR touch­
down 5 véase recuadro 5 - 1).
La dependencia esencial del pareamiento de bases correcto en el
extremo 3’ de cebadores enlazados permitió desarrollar métodos
que hacen posible distinguir entre alelos que difieren tan sólo en un

5 '-----------------------------------3'
3 '-----------------------------------5'

I
A c tiv id a d d e tra n s fe ra s a
d e d e s o x in u c le o tid ilo term in al
d e p o lim e ra s a te rm o e s ta b le

5' ----------------------------------- a 3'

3'A----------------------------------- 5'
P ro d u c to d e P C R
c o n s a lie n te A
^ — T ra ta m ie n to co n e n zim a
C lo n a c io n T -fi
p a ra “p u lim ie n to ”

Fig. 5-3. Clonación de productos de la PCR en células bacterianas

Con frecuencia, los productos de la PCR tienen una saliente de adenosina en sus extremos 3 ' (véase texto). El sistema de clonación T-A posee un siste­
ma polienlazador con salientes de timina complementarias para facilitar la clonación. Una alternativa es recortar de nueva cuenta la saliente de adenina
con una enzima “ pulidora" apropiada que deja el fragmento con un extremo romo.
128 CAPÍTULO CINCO AMPLIFICACIÓN DEL DNA: CLONACIÓN DE DNA POR PCR Y BASADA EN CÉLULAS

R e g ió n c o n s e rv a d a
1 5 10 15
. .7777777777.^/eio 1
..........................................A le lo 2

D is e ñ o d e c e b a d o re s e s p e c ífic o s
d e a le lo (n u c le ó tid o s 1 -1 7 )
I
1 5 10 15
5' £ > 3 - C e b a d o r e s p e c ífic o d e a le lo 1 (A S P 1)

1 5 10 15
5' fe > 3 ' C e b a d o r e s p e c ífic o d e a le lo 2 (A S P 2)

P C R con ASP1 o A S P 2 + ce b ad o r
l c o n s e rv a d o (C O N )

DNA del alelo 1

5 '. n n i. i 3'

CON 5
A SP1
f e
pero
ASP2 55 7
N o a m p lific a c ió n
3' =

DNA del alelo 2

CON
ASP2

f e
p e ro
_ASP1
N o a m p lific a c ió n
3 'c

Fig. 5-4. La PCR específica de alelo mediante el sistema ARMS depende del pareamiento de bases perfecto del extremo 3' nucleótido de los cebadores.

Los cebadores oligonucleótidos específicos de alelo ASP1 y ASP2 están diseñados para que sean idénticos a la secuencia de los dos alelos sobre una
región precedente a la posición del nucleótido variable, hasta este último y con término en él mismo. El ASP1 enlaza a la perfección la cadena comple­
mentaria de la secuencia del alelo 1 y ello hace posible la amplificación con el cebador conservado. Sin embargo, la terminal C 3 ' del cebador ASP2 es
incompatible con la T de la secuencia del alelo 1, lo que imposibilita la amplificación. De igual forma, ASP2 puede enlazarse de forma perfecta al alelo 2
e iniciar la amplificación, a diferencia de ASP1.

nucleótido (PCR específica de alelo). En el difundido ARMS (sis­
tem a d e m u ta ción refra cta rio a la a m p lifica ción ), los cebadores
se preparan con sus nucleótidos en el extremo 3 ' diseñados para
formar pares de bases con el nucleótido variable que distingue los
dos alelos y con la secuencia restante del cebador diseñada para
complementar a la secuencia inmediatamente adyacente al nucleó­
tido variable. Bajo condiciones experimentales adecuadas, no se lle­
va a cabo la amplificación en donde el nucleótido del extremo 3'
no forma perfectamente pares de bases y se distinguen en conse­
cuencia los dos alelos (fig. 5-4).
5.2.4 Algunas PCR se diseñaron para permitir múltiples
productos de amplificación y amplificar
secuencias no caracterizadas con anterioridad
Las reacciones estándar de PCR/PCR-TI se basan en la necesidad
del enlace del cebador muy específica a fin de permitir la amplifi­
cación selectiva de una secuencia blanco conocida deseada. Sin em­
bargo, en ocasiones es conveniente diseñar las PCR para amplificar
secuencias de DNA en las que no existe información previa sobre
la secuencia o es limitada.
 5.3 PRINCIPIOS
-----
------------------ LA CLONACIÓN
Amplificación de nuevos miembros de una familia de DNA
nediante PCR-DOP
Algunas veces es posible clonar secuencias de DNA no caracteriza­
das antes mediante la PCR si se trata de miembros de una familia
génica o de DNA repetido de los cuales se caracterizó ya cuando
menos uno de ellos. Por ejemplo, se aislaron por primera vez mu­
chos miembros nuevos de la familia del gen de mamíferos Wnt des­
pués de observar que los productos de los primeros genes Wnt
tenían secuencias de aminoácidos muy similares dentro de un do­
minio particular conservado. Esto hizo posible diseñar cebadores
para esta secuencia basada en oligo n u cleótid os d egen era d os, con
una mezcla en cada caso de diferentes oligonucleótidos que represen­
tan varios cambios de aminoácidos. La PCR ceb a d a co n oligon u -
cleótid o d egen era d o {PCR-DOP, por sus siglas en inglés) posibilita
amplificar al mismo tiempo una diversidad de distintos genes, pero
relacionados muy de cerca, incluidos genes nuevos, y a continuación
fraccionarlos y purificarlos mediante clonación de DNA basada en
células.
Amplificación indiscriminada
Si la fuente de DNA es de gran valor y tiene cantidades muy limi­
tadas, es posible emplear la PCR para amplificar todo el DNA me­
diante oligonucleótidos enlazadores de doble cadena unidos de
manera covalente a las extremidades de todas las secuencias de DNA
en la población de inicio. Para preparar los oligonucleótidos enlaza­
dores se sintetizan de manera individual dos oligodesoxirribonu-
cleótidos diseñados para complementarse en su secuencia y ser
capaces de realizar un pareamiento de bases para formar una secuen­
cia de DNA de doble cadena con un extremo saliente. Se digiere el
DNA por amplificar con una nucleasa de restricción que produce
extremos salientes similares, de tal forma que puedan unirse en sen­
tido covalente los enlazadores (ligarse). Los cebadores específicos de
enlazador posibilitan la amplificación de moléculas de DNA blanco
con enlazadores en ambos extremos. Como resultado, es posible am­
plificar de modo simultáneo todas las secuencias de DNA en una se­
cuencia iniciadora, lo que permite a m p lifica r tod o e l gen o m a en
el caso del DNA genómico. Un método alternativo consiste en usar
de forma extensa oligonucleótidos degenerados como cebadores de
tal suerte que puedan enlazarse los cebadores a muchísimos sitios
de enlace.
Recuadro 5-2. Endonucleasas de restricción y sistem as de modificación y restricción
Los bacteriófagos que se liberan de una bacteria de una cepa particular
pueden Infectar a otras bacterias de la misma cepa, pera no a las de una
cepa diferente. Eso se debe a que el DNA del fago tiene el mism o patrón
de modificación que el DNA de las cepas bacterianas que puede infectar;
el fago se “restringe” a esa cepa de bacterias. La restricción es absoluta:
algunos fagos pueden escapar a la restricción y adquirir el patrón de m o­
dificación del nuevo huésped.
En la actualidad se sabe que la base de los sistemas de modificación y
restricción incluyen dos tipos de actividad enzimática:
► Una actividad de metiiasa de DNA específica de secuencia proporcio­
na la base del patrón de modificación. / modificación y restricción y pueden conferir esta especificidad a una cé­
DE --------
DEL DNA
------- ---- ---------------- BASADA EN CÉLULAS I------
-- ----------------------------------i 129
Uso de una secuencia conocida para amplificar
una secuencia de DNA cercana no caracterizada
Se han ideado varias modificaciones ingeniosas con la finalidad de
progresar de una secuencia de DNA de inicio conocida a una se­
cuencia contigua no caracterizada, sea en DNA genómico o en cD-
NA. En los ejemplos se incluyen PCR an clada , PCR inversa,
RACE-PCR (recuadro 5-1).
5 .3 Principios de la clonación del DNA
basada en células
5.3.1 Generalidades de la clonación del DNA
basada en células
La clonación del DNA basada en células se desarrolló por prime­
ra vez al inicio de la década de 1970. Fue posible por el descu­
brimiento de endonucleasas de restricción tip o II, que son
enzimas bacterianas capaces de cortar DNA en todos los sitios
que contienen una secuencia de reconocimiento específica y pe­
queña, por lo general de 4 a 8 pb de largo. En condiciones nor­
males, estas enzimas sirven para proteger a las bacterias de
bacteriófagos invasores al seccionar de forma selectiva el DNA
extraño (véase recuadro 5-2 y la sección siguiente). La enorme
ventaja que ofrecieron a los genetistas moleculares fue la de dis­
poner de un medio para cortar DNA en fragmentos definidos
que pudieran unirse con facilidad a otros fragmentos de DNA
cortados de manera similar.
La esencia de la clonación del DNA basada en células es el uso
de nucleasas de restricción para cortar moléculas de DNA en una
población de DNA iniciador {DNA blanco) en piezas de tamaño
manejable y a continuación unirlas a un replicón (cualquier se­
cuencia capaz de replicar DNA de manera independiente) y trans­
ferir las moléculas híbridas resultantes {DNA recom b in a n te) en
una célula huésped apropiada que a continuación prolifera por di­
visión celular. Debido a que el replicón puede replicarse dentro de
las células (con frecuencia hasta grandes números de copias), al
igual que el DNA blanco unido, el resultado es una forma de am ­
plificación de DNA basada en células.
En la clonación de DNA basada en células hay cuatro pasos
esenciales (véase fig. 5-5):
► El fenómeno de restricción se basa en una actividad de endonuclea-
sa de restricción específica de secuencia: corta DNA del fago cuyo
patrón de metílación es diferente al DNA de la célula huésped.
La cepa bacteriana posee una actividad de metiiasa de DNA con la m is­
ma especificidad de secuencia que la actividad de la nucleasa de restric­
ción correspondiente. Como resultado, las endonucleasas de restricción
celulares no cortan el DNA de la célula huésped metilado de manera apro­
piada, pero pueden cortar el DNA del fago que ingresa sí no está metila­
do de modo adecuado.
Nota: algunos plásmidos y bacteriófagos poseen genes para sistemas de
lula huésped.
130 [ CAPÍTULO CINCO AMPLIFICACIÓN DEL DNA: CLONACIÓN DE DNA POR PCR Y BASADA EN CÉLULAS
► creación de moléculas de DNA recombinante. De forma tí­
pica, se producen fragmentos de DNA de tamaño apropiado al
cortar con una nucleasa de restricción seguida de la unión co-
valente (ligadura) de los fragmentos de DNA blanco a un tipo
único de molécula de replicón . La creación de DNA recombi­
nante se facilita si se asegura que el DNA blanco y las molécu­
las de replicón se corten mediante nucleasas de restricción, que
producen los mismos tipos de extremo antes de unir los frag­
mentos de DNA blanco a las moléculas de replicón mediante
la enzima ligasa de DNA;
► transformación. Las moléculas de DNA recombinante se
transfieren a células huésped (a menudo células bacterianas o
de levadura) en las que el replicón elegido puede replicar el
DNA sin importar cuál sea el(Ios) cromosoma(s) de la célu­
la huésped. Los replicones empleados en clonación celular
suelen denominarse moléculas vectoras porque ayudan a
transportar las moléculas blanco pasajeras hacia el interior de
las células y a continuación ayudan a que se repliquen den­
tro de ellas;
► propagación selectiva de clonas celulares que incluye dos
etapas. Al inicio, se siembran las células transformadas en
placas y se las disemina en una superficie de agar con el fin
de promover el crecimiento de colonias de células bien sepa­
radas. Todas las células en una colonia aislada son idénticas
(ya que descienden sólo de una célula) y se describen como
clonas celulares. De manera subsecuente, pueden tomarse de
una placa colonias individuales y dejar que las células lleven a
cabo una segunda etapa de crecimiento en cultivo líquido;
► aislamiento de clonas de DNA recombinante al reunir culti­
vos celulares expandidos y aislar de manera selectiva el DNA
recombinante.
Ejemplos de endonucleasas de restricción de uso común (véase asimismo cuadro 6-3 para los cortadores raros).
Enzima Fuente
Produce extrem os romos
Alul Arthrobacter luteus
Produce salientes 5’
EcoRI Factor R de Escherichia coli
Producen
Pstl Providencia stuartii
tG A CGT C
Reconoce ¡ecuencia no palindrómica
M nl 1 Moraxella nonliquefaciens
Reconoce secuencia de reconocimiento bipartita
BstXI
Nota: en condiciones normales, los nombres derivan de la primera letra del género y las dos primeras letras del nombre de la especie, por ejemplo Pstl
es la primera nucleasa de restricción que se aisló de Providencia stuartir, véase http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html para la base de datos REBA­
SE de nucleasas de restricción.
5,3.2 Las endonucleasas de restricción permitieron
cortar DNA blanco en piezas manejables que
pueden unirse a moléculas vectoras cortadas
de manera similar
Nucleasas de restricción tipo II
En condiciones normales, las secuencias de reconocimiento de la
inmensa mayoría de las endonucleasas de restricción tipo II son pa-
líndromes (la secuencia de bases es igual en ambas cadenas cuan­
do se lee en la dirección 5'~*3', como resultado de un eje de
simetría doble). Según sea la localización de los sitios de corte pro­
ducidos mediante una nucleasa de restricción, los fragmentos de
re str icció n resultantes pu ed en tener;
► extremos romos (los puntos de corte ocurren exactamente en
el eje de simetría).
► extremos salientes (los puntos de corte no se encuentran en el eje
de simetría, de tal manera que los fragmentos de restricción resul­
tantes poseen las llamados sa lien tes 5' o 3' (véase cuadro 5-1).
Nota: los dos extremos salientes de cada fragmento son comple­
mentarios en su secuencia de bases y muestran la tendencia a
vincularse entre sí (o con cualquier otra saliente similar comple­
mentaria) para formar pares de bases. Como resultado de su pro­
pensión a adherirse a otros extremos del mismo tipo, los extremos
salientes de este tipo se conocen como extremos pegajosos.
Las nucleasas de restricción tipo II ofrecieron dos grandes ventajas
para la clonación y el análisis de DNA:
► un gru p o d efin id o d e fr a g m en to s d e DNA d e in icio. Cuando
se aísla DNA de tejidos y células cultivados, el desempacamien­
to de moléculas de DNA voluminosas y el corte por desgarro fí­
sico inevitable dan por resultado poblaciones heterogéneas de
Corte de secuencia; Fragmentos de restricción
N = A, C, G o T con los extremos siguientes
a ag c t 5 ’ C T-----------------A G 3'
T tC G a 3' G A ---------- -TC 5'
A A T TC 5 ' A A T T C ----------- G 3'
CTTAtAG 3' G---------------- C T T A A 5 '
C T G C AA G 5 ' g ---------------- C 3'
3' C---------------- G 5 '
4n
c c t c n n n n n n 5' ~~------------ C C T C N N N N N N N 3 '
GGAGNNNNNtNN 3' N— ■.............. G G A G N N N N N N 5'
CCANNNN'VlNTGG 5' N T G G— C C A N N N N N 3 '
G G T tN N N N N N A C C 3 ' N N N N N A C C --G G T N
 5.3 PRINCIPIOS DE LA CLONACIÓN DEL DNA BASADA EN CÉLULAS 131

OR

e tc .
P o b la c ió n d e D N A
c o m p le jo (b la n c o )
R e p lic o n e s h o m o g é n e o s
(m o lé c u la s v e c to ra s ;
(C o lig a d u ra )
O R = o rig e n d e re p lic a c ió n )
D N A re c o m b in a n te

B)
< g j|> 1 - O R

(1 -O R ) < ^ 2 -° R

(2 -O R ) . = _

D N A c ro m o s o m ic o < g & 3 -O R
(3 -O R )

D N A r e c o m b in a n te C é lu la s h u é s p e d _£o 1 -° R
S ^ 3 -O R
(C o tra n s fo rm a c ió n )
T ra n s fo r m a d o r e s

C) A m p lific a c ió n
< g jjg 1 -O R
p rim a ria

< ^ j|> 1 -O R A m p lific a c ió n

O b te n e r c o lo n ia s y p e rm itir el s e c u n d a r ia
1 -O R
S*. ; ^ ^ 1 -OR
c r e c im ie n to a d ic io n a l en
c u ltiv o líq u id o
S e m b r a d o e n p la c a
's * .
d e a g a r n u trie n te *
< ^ 1 -OR

e tc .
C o lo n ia d e clo n as
c e lu la re s id é n tic a s

D)
P u rific a c ió n d e
> 1 -O R > 1 -O R
D N A re c o m b in a n te
> C lo n a s d e D N A
r e c o m b in a n te
> 1 -O R >1 -O R

Fig. 5-5. Los cuatro pasos esenciales para la clonación de DNA basada en células.
A) Formación de DNA recombinante. Obsérvese que, además de los productos simples vector-ligadura del blanco, pueden ocurrir fenómenos de coli­
gadura por los cuales pueden ligarse en un mism o producto dos secuencias de DNA blanco no relacionadas (p. ej., secuencias 1 más 2 en el ejemplo
de la parte inferior). OR, origen de la replicación. B) Transformación. Éste es un paso fundamental en la clonación de DNA porque en condiciones nor­
males las células sólo captan una molécula de DNA extraño. Sin embargo, obsérvese que algunas veces se presentan fenómenos de cotransformación,
como las células que se ilustran en la parte inferior, que transforman dos moléculas de DNA diferentes (una molécula recombinante que contiene la se­
cuencia 1 y una molécula recombinante que posee la secuencia 3). C) Amplificación para producir numerosas clonas celulares. Éste es otro paso
fundamental. Después de sembrar en la placa las células transformadas, pueden separarse colonias de clonas individuales en un plato y a continuación
tomarse de forma individual y llevarse a un paso secundario de amplificación a fin de asegurar la homogeneidad de la clona. D) Aislamiento de clonas
de DNA recombinante.
132 CAPÍTULO CINCO AMPLIFICACIÓN DEL DNA: CLONACIÓN DE DNA POR PCR Y BASADA EN CÉLULAS

fragmentos de DNA de longitudes aleatorias diferentes. Al usar
endonucleasas de restricción es posible convertir estas poblacio­
nes considerablemente heterogéneas de fragmentos de DNA rotos
en grupos á t fra gm en to s d e restricción de longitudes definidas.
► Un m edio p a ra o b ten er d e fo r m a a rtificia l m olécu las d e D N A .
Los fragmentos de restricción con los mismos tipos de extremo
pegajoso pueden unirse con facilidad entre sí mediante una li-
ga sa d e D N A . Por consiguiente, a fin de elaborar un DNA re-
combinante podría cortarse la molécula de replicón (v ecto r) y
DNA blanco con el mismo tipo de nucleasa de restricción, o
bien con nucleasas de restricción que producen los mismos ti­
pos de extremo pegajoso.
Las terminales de fragmentos de restricción que tienen el mismo
tipo de extremos salientes pueden relacionarse en una diversidad
de diferentes formas, sea de modo /«fmmolecular (ciclización) o
entre moléculas para formar concatámeros lineales o moléculas
circulares compuestas. Las reacciones intermoleculares ocurren
con mayor facilidad cuando las concentraciones de DNA son al­
tas. Sin embargo, a concentraciones de DNA muy bajas, las ter­
minales individuales en diferentes moléculas tienen menos opor­
tunidad de hacer contacto entre sí y se favorece la ciclización
intramolecular. Por lo general, las reacciones de ligadura están
diseñadas para promover la formación de DNA recombinante
(mediante la ligadura de DNA blanco a DNA vector), aunque
también son posibles la ciclización de vector, concatámeros vec­
tor-vector y la ligadura de DNA blanco con DNA blanco (véase
fig. 5-6). Con la finalidad de lograr lo anterior, se tratan las mo­
léculas vectores de tal modo que se impida o minimice su capa­
cidad para llevar a cabo la ciclización.
Vectores simples para clonación en células bacterianas
Durante la clonación del DNA basada en células, los fragmentos de
DNA blanco deben ser capaces de replicarse dentro de las células.
Puesto que carecen de un origen funcional de replicación, necesi­
tan unirse a un replicón (vector) que pueda replicarse dentro de la
célula huésped, al margen de sus cromosomas. El vector puede te-

C o rte d e D N A V e c to r d e D N A co n
b la n c o co n M b o l sitio ú n ic o B a /n H I
B am H I
M bo \ B am HI

>GATC >G ATC

< CTA G < CTA G <

p. ej., in te rm o le cu la r; p. ej., intram olecular,

c o n c a tá m e ro s cic liz a c ió n

1 2
> GATC 1 GATC >
< CTAG 1 CTAG <"

Fig. 5-6. Las terminales cohesivas pueden relacionarse de manera intramolecular e intermolecular.

Nota: sólo se muestran algunos de los posibles resultados finales. Por ejemplo, las moléculas vectoras también pueden form ar concatámeros intermole­
culares, los multímeros suelen llevar a cabo ciclización y los fenómenos de coligadura pueden incluir dos diferentes secuencias blanco Incluidas con
una molécula vectora en la misma molécula de DNA recombinante (véase fig. 5-5A). La tendencia a la ciclización de moléculas individuales es más pro­
nunciada cuando el DNA se encuentra a una concentración baja y son reducidas las posibilidades de colisión entre diferentes moléculas con extremos
pegajosos complementarios.
 5.3 PRINCIPIOS DE LA CLONACIÓN DEL DNA BASADA EN CÉLULAS
-.er un origen de replicación que procede de un replicón extracro-
—osómico natural o, en algunos casos, un replicón cromosómico
como sucede en los cromosomas artificiales de levadura; véase sec-
oón 5.4.4).
Las células huésped que se utilizan con mayor frecuencia son
ncterianas o micóticas modificadas. Las células huésped bacteria­
nas se usan en extenso, en particular por su capacidad de división
celular rápida. Tienen un cromosoma de doble cadena circular
lisiado con un origen único de replicación. La replicación del cro­
mosoma huésped desencadena con posterioridad la división ceta-
ir de tal manera que cada una de las dos células hijas resultantes
contiene un cromosoma aislado igual que su célula original (es
decir, se conserva el número de copias en una copia por célula).
Mn embargo, la replicación de replicones extracromosómicos no
se restringe en esta forma: muchos de estos replicones pueden lle­
var a cabo varios ciclos de replicación durante el ciclo celular y
rormar gran número de copias. Como resultado, es posible pro­
ducir grandes cantidades de DNA blanco mediante correplica-
ción con un replicón. Existen dos clases generales de replicón
extracromosómico:
► plásmidos, o moléculas de DNA de doble cadena circulares y
pequeñas, que contienen a nivel individual muy pocos genes.
Su existencia es intracelular, se distribuyen en sentido vertical a
células hijas después de la división de la célula huésped, aun­
que pueden transferirse de forma horizontal a células vecinas
durante los fenómenos de conjugación bacteriana. Los ejem­
plos naturales incluyen plásmidos que llevan los factores del se­
xo (F) y los que alojan genes de resistencia a fármacos;
► Bacteriófagos, o virus que infectan células bacterianas. Los
bacteriófagos que contienen DNA suelen tener genomas que
incluyen DNA de doble cadena que puede ser circular o lineal.
A diferencia de los plásmidos, pueden existir de modo extrace-
lular. La partícula viral madura (virión) tiene incluido su geno-
ma en una cubierta proteínica a fin de facilitar la adsorción y
entrada a una nueva célula huésped.
5.3.3 La introducción de DNA recombinante en células
receptoras proporciona un método para fraccionar
una población de DNA de inicio compleja
La membrana plasmática de la célula es permeable de manera selec­
tiva y en condiciones normales no admite moléculas grandes como
fragmentos de DNA largos. Sin embargo, es posible tratar las célu­
las en algunas formas (p. ej., mediante exposición a ciertas sales de
potencia iónica alta, choques eléctricos cortos, y otras), de tal for­
ma que se alteren las propiedades de permeabilidad de las mem­
branas plasmáticas. Como resultado, una fracción de las células se
torna competente, lo que significa que son capaces de captar DNA
extraño del ambiente extracelular.
Sólo un porcentaje pequeño de las células capta el DNA extra­
ño (transformación de DNA). Sin embargo, las que captan DNA
extraño recogen con frecu en cia sólo una molécula aislada (que, no obs­
tante, puede replicarse después muchas veces dentro de una célula).
Ésta es la base del paso crítico de fraccionamiento en la clonación
de DNA basado en células: la población de células transformadas
puede considerarse como una oficina de clasificación en la cual se
selecciona la mezcla compleja de fragmentos de DNA al depositar
moléculas de DNA individuales en células receptoras individuales
(fig. 5-7).
133
Debido a que el DNA circular (incluido el DNA circular corta­
do en muesca [nicked\) se transforma con mucho mayor eficiencia
que el DNA lineal, casi todos los transformadores celulares contie­
nen productos ciclizados en lugar de concatámeros de DNA re-
combinante lineales y, si es necesario suprimir la ciclización del
vector (p. ej., mediante desfosforilación), casi todos los transforma­
dores poseen DNA recombinante. Sin embargo, cabe señalar que
en algunos sistemas de clonación los fenómenos de cotransforma-
ción (la ocurrencia de más de un tipo de molécula de DNA intro­
ducida dentro de una clona celular; véase fig. 5-5B) pueden ser
comunes en términos comparativos.
Se permite que se multipliquen las células transformadas. En
las clonaciones en que se usan vectores plásmidos y una célula
huésped bacteriana, tan sólo se disemina sobre la superficie de agar
nutriente en una placa de Petri una solución que contiene las cé­
lulas transformadas (sembrado en placa). Esto tiene como resul­
tado la formación de colonias bacterianas que consisten en
clonas de células (progenie idéntica de una célula ancestral úni­
ca). La introducción de una colonia individual en un tubo para
crecimiento subsecuente en cultivo líquido permite una expansión
secundaria del número de células que pueden aumentarse para su­
ministrar muy grandes rendimientos de clonas celulares, todas
idénticas a una célula ancestral única (fig. 5-7). Si la célula origi­
nal contenía un tipo aislado de fragmento de DNA extraño unido
a un replicón, también lo tendrán las descendientes, lo que dará
por resultado una amplificación inmensa de la cantidad del frag­
mento extraño específico. Los cultivos expandidos que representan
clonas celulares derivadas de una célula pueden procesarse a con­
tinuación para recobrar el DNA recombinante.
Con objeto de recuperar de modo selectivo el DNA recombi­
nante de células lisadas, se aprovechan las diferencias físicas entre el
DNA de la célula huésped y el DNA recombinante. En células bac­
terianas, el cromosoma bacteriano de doble cadena es circular, al
igual que en cualquier plásmido que contiene DNA extraño intro­
ducido pero de un tamaño mucho mayor. Como resultado, es pro­
penso al corte en muesca y desgarro durante la lisis celular y
extracción subsecuente de DNA, lo que crea fragmentos lineales de
DNA con extremos libres. Después de someter el DNA aislado a
un paso de desnaturalización, por ejemplo mediante tratamiento
con alcalinos, se desnaturaliza con facilidad el DNA linealizado de
la célula huésped, pero las cadenas de DNA del plásmido circu la res
cerra d a s d e m anera co va len te (CCC) no son capaces de separarse y,
cuando se permite que se renaturalicen, se vinculan de nueva cuenta
las dos cadenas para formar moléculas nativas superhelicoidales o el
llamado DNA superenrollado (fig. 5-8). El DNA desnaturalizado
de la célula huésped se precipita de la solución y deja el DNA circu­
lar cerrado de forma covalente (CCC) del plásmido.
Si se requiere, es posible una purificación adicional mediante
cen trifu ga ció n d e g r a d ien te d e d en sid a d d e eq u ilib rio (cen trifu ­
g a ció n isop ícnica ): se centrifuga el DNA purificado de forma par­
cial hasta equilibrarse en una solución de cloruro de cesio que
contiene bromuro de etidio (EtBr). Este último une DNA median­
te in terca la ció n entre los pares de bases y propicia en consecuen­
cia el desenrollamiento de la hélice de DNA. A diferencia del DNA
cromosómico, un DNA CCC de plásmido no tiene extremos libres
y sólo puede desenrollarse hasta un grado limitado, lo que restrin­
ge la cantidad de EtBr que puede enlazar. Los complejos de EtBR-
DNA son más densos cuando contienen menos EtBr, de tal manera
que el DNA CCC del plásmido forma una banda en la posición
más inferior en el gradiente de cloruro de cesio que el DNA ero-
134 1 CAPÍTULO CINCO AMPLIFICACIÓN DEL DNA: CLONACIÓN DE DNA POR PCR Y BASADA EN CÉLULAS

C é lu la s q u e c o n tie n e n C é lu la s q u e c o n tie n e n D N A p o r c lo n a r
rep licó n e x tra c ro m o s ó m ic o (O )

4
(i) E x p a n d ir en cu ltivo (i) P u rific a r D N A
(ii) P u rific a r rep lico n e s (ii) C o rta r co n n u c le a s a
(iii) C o rta r co n n u c le a s a d e restricción
d e restricción

V e c to r B lan co
(Tipo único
d e m o léc u la)

(N u m e ro s o s fra g m e n to s
d ife re n te s ... 1, 2, 3, etc .)

O
...e tc .

M o lé c u la s d e D N A re c o m b in a n te

i (i) T ra n s fo rm a c ió n d e D N A
(¡i) R e p lic a c ió n d e n tro d e la c é lu la

...e tc .

C a d a cé lu la só lo c o n tie n e un tip o d e D N A re c o m b in a n te
S e m b ra r en
p la c a co n a g a r
n u trie n te (i) E x p a n d ir en cu ltivo d e
co lo n ia s in d ivid u ale s

Cada co lo n ia es una p o b la ció n de células 1

0
A
¿ A
r - i
(ii) P u rific a r D N A
re c o m b in a n te

bacteria nas id én ticas (clo n a s c elu lare s) que 1 l

contien e una m olécula d e DNA re com bin an te espe cífica O I 02 03
C lo n a s d e D N A

Fig. 5-7. Clonación de DNA en células bacterianas.

El ejemplo ilustra la clonación de DNA genómico pero podría aplicarse asimismo a la clonación de cDNA.
 5.3 | PRINCIPIOS DE LA CLONACIÓN DEL DNA BASADA EN CÉLULAS ¡ 135
O
DNA CCC
re la ja d o DNA
s u p eren ro llad o
Fig. 5-8. DNA circular cerrado de forma covalente (CCC) y superen-
rollamlento de DNA.
A la izquierda se muestra en manera esquemática DNA CCC (no se in­
tentó mostrar la estructura helicoidal doble). A menos que se haga un
corte con muesca en una de las dos cadenas de DNA, no puede re d ­
arse el retorcimiento de la doble hélice y la tensión inducida da lugar a
la formación espontánea de una estructura superenrollada que se
muestra a la derecha. Sin embargo, la muesca en cualquiera de las ca­
denas de DNA alivia la tensión y permite la rotación del extremo libre.
mosómico o los círculos de plásmido que están abiertos, lo cual po­
sibilita separar el DNA recombinante del DNA de la célula hués­
ped. Las moléculas de DNA recombinante resultantes son idénticas
entre sí (representan un fragmento de DNA blanco único) y se de­
nominan clonas de DNA.
5.3.4 Las genotecas de DNA son un amplio grupo de
clonas de DNA que representan una población
de DNA de inicio compleja
Los primeros intentos de clonación de fragmentos de DNA huma­
nos en células bacterianas se concentraron en secuencias blanco que
eran muy abundantes en una población de DNA de inicio particu­
lar. Por ejemplo, las células humanas nucleadas contienen gran par­
te del mismo grupo de secuencias de DNA, pero las poblaciones de
mRNA pueden ser muy diferentes. Aunque la población de mRNA
en cada célula es compleja, algunas células están dedicadas en par­
ticular a sintetizar un tipo específico de proteína y por consiguien­
te tienen pocas especies de mRNA predominantes (p. ej., gran
parte del mRNA que se forma en los eritrocitos consiste en mRNA
de globina a y (3). Puede utilizarse la enzima transcriptasa inver­
sa (TI; polimerasa de DNA dependiente de RNA) a fin de elabo­
rar una copia de cDNA cuya secuencia de bases es complementaria
al mRNA. En consecuencia, el cDNA de eritrocitos se enriquece
en grado considerable en cDNA de globina y ello facilita su aisla­
miento.
Los métodos modernos de clonación de DNA ofrecen la posi­
bilidad de producir conjuntos amplios de clonas de DNA (genote­
cas de DNA) a partir de poblaciones de DNA de inicio en extremo
complejas (como el DNA genómico humano total). Este método
permite que las secuencias de DNA que son muy raras en la pobla­
ción de inicio estén representadas en una biblioteca de clonas de
DNA, en donde pueden aislarse de manera individual al seleccio­
nar una colonia adecuada de células huésped y amplificarla. Por lo
general se practican dos variedades básicas de este método, según
sea la naturaleza del DNA de inicio: genotecas de DNA genómico
y genotecas de cDNA.
Se dice que las genotecas recién formadas no están a m p lifica ­
das, aunque es un término erróneo porque las células transformadas
de manera inicial se amplificaron para formar colonias de células se­
paradas. Con frecuencia se permite que prosiga la formación de co­
lonias celulares en la parte superior de membranas que se colocan
sobre la superficie de agar nutriente en platos para cultivo estériles.
A continuación es posible hacer copias de la biblioteca mediante re-
p lica ció n p o r sem b ra d o en p la ca en una membrana de tamaño si­
milar antes de extenderse sobre la superficie de un agar nutriente y
del crecimiento de colonias. En fechas más recientes se diseminaron
colonias de células obtenidas de modo individual en configuracio­
nes en parrilla sobre membranas adecuadas o dentro de fosos de pla­
cas para microtítulo en los que pueden guardarse por periodos
prolongados a -70°C en presencia de un medio estabilizador de cé­
lulas, como el glicerol.
Para una distribución múltiple se precisan g e n o te ca s a m p lifi­
cadas. Se lavan en un medio de cultivo celular las células de fil­
tros primarios representativos, se diluyen y estabilizan mediante
la presencia de glicerol o algún agente estabilizador alternativo. A
continuación, en una etapa posterior, pueden sembrarse en placas
alícuotas individuales para regenerar la biblioteca. Sin embargo,
este paso de amplificación adicional puede deformar la represen­
tación original de clonas celulares porque es posible que durante
la etapa de amplificación haya ritmos diferenciales de crecimien­
to de distintas colonias.
Genotecas de DNA genómico
En eucariotas complejas, como las de mamíferos, todas las células
nucleadas tienen en esencia el mismo contenido de DNA y muchas
veces es conveniente preparar una biblioteca genómica de células
fácilmente accesibles, como los leucocitos. El material de inicio es
DNA genómico que se fragmentó en cierta forma, las más de las
veces mediante digestión con una endonucleasa de restricción.
Es típico que se digiera el DNA genómico con un cortador de
4 pb, como M bol, que reconoce la secuencia GATC. Esta secuen­
cia ocurre casi cada 280 pb en promedio en el DNA genómico hu­
mano y, por consiguiente, hay pocas secuencias de DNA que
carezcan de un sitio de reconocimiento de esta enzima. La digestión
completa del DNA de inicio con M bol produce fragmentos muy
pequeños. En lugar de ello, se lleva a cabo la digestión parcial de
restricción (concentración baja de enzima, tiempo corto de incu­
bación, etc.) y de esta manera el corte sólo tiene lugar en un núme­
ro pequeño de los posibles sitios de restricción.
La digestión parcial de restricción no sólo produce fragmentos
para clonación grandes convenientes sino que, algo muy importan­
te, también permite la fragm entación aleatoria d el DNA. Por consi­
guiente, para la localización de una secuencia específica, el patrón
de corte es diferente en distintas copias de la misma secuencia de
DNA de inicio (fig. 5-9). Esta fragmentación aleatoria asegura que
la biblioteca contenga tantas representaciones como sea posible del
DNA de inicio. Además, tiene la ventaja de producir clonas con in­
sertos superpuestos. Como resultado, después de caracterizarse el in­
serto de una clona, puede intentarse el acceso a clonas de la misma
región general e identificar aquéllas cuyos insertos muestran ciertas
similitudes con las de la clona original (véase recuadro 8-5).
136 CA ) CINC( AMPLIFICACIÓN DEL DNA: CLONACIÓN DE DNA POR PCR Y BASADA EN CÉLULAS

(i) Lisis c e lu la r
(¡i) E x tra c c ió n d e D N A I 3 |
(i¡i) D ig e stió n p a rc ial co n
n u c le a s a d e res tricció n 5 1 6 | 7
S e c u e n c ia s d e D N A
c ro m o s ó m ic o id é n tic a s

00

O)
I 10 | 11

I
m “c o rta d a s a le a to ria m e n te ”
\g j 12 l 13 i 14 , 15
C élu la s
n u c le a d a s

Lig a r a v e c to r y
p ro c e d e r c o m o en
la fig u ra 5 -7

Fig. 5-9. Elaboración de una biblioteca de DNA genómico.

Todas las células nucleadas de un individuo tienen el mismo contenido genómico de DNA, de tal manera que pueda utilizarse como material de origen
cualquier célula accesible con facilidad (p. ej., glóbulos blancos). Debido a que el DNA se extrae de numerosas células con moléculas de DNA idénticas,
el DNA aislado contiene grandes números de secuencias de DNA idénticas. Sin embargo, la digestión parcial con una endonucleasa de restricción corta el
DNA sólo en un subgrupo pequeño de los sitios de restricción disponibles y el patrón varía entre moléculas individuales y el resultado es un corte casi
aleatorio. Por lo general, esto crea una serie de fragmentos de restricción que, si derivan del mism o locus, pueden compartir algunas secuencias de DNA
comunes (p. ej., el fragmento 6 se superpone de modo parcial en los fragmentos 2 y 3, como se muestra, y asimismo los fragmentos 9 y 10, y 13 y 14).

La complejidad (número de clonas de DNA independientes)
de una biblioteca de DNA genómico puede definirse en térmi­
nos de equivalentes de genoma (EG). Un equivalente de geno-
ma de 1 , llamada b ib lio teca d e un d ob lez , se obtiene cuando el
número de clonas independientes es igual al tamaño del geno­
ma/tamaño promedio del inserto. Por ejemplo, para una biblio­
teca de DNA genómico humano con un tamaño de inserto
promedio de 40 kb, 1 EG = 3 000 Mb/40 kb = 75 000 clonas
independientes. Una biblioteca como ésta, que tiene 300 000
clonas, se denomina en ocasiones biblioteca cuádruple porque
tiene cuatro equivalentes de genoma (EG). Sin embargo, debido
a la variación del muestreo, el número de EG debe ser conside­
rablemente mayor de uno para que tenga una alta posibilidad de
incluir cualquier secuencia particular dentro de esa biblioteca.
En consecuencia, en condiciones normales se intenta preparar
genotecas complejas (> 4 EG).
Genotecas de cDNA
Debido a que la expresión génica puede variar en diferentes cé­
lulas y distintas etapas del desarrollo, el material de inicio para
crear genotecas de cDNA suele ser RNA total de un tejido espe­
cífico o una etapa precisa del desarrollo de la embriogénesis.
Puesto que la inmensa mayoría del mRNA es poliadenilado, se eli­
ge mRNA poli (A)+ mediante el enlace específico a una secuencia
complementaria oligo(dT) o poli(U) conectada a una sefarosa sóli­
da o matriz de celulosa. El mRNA poli (A)+ aislado puede conver­
tirse a continuación, mediante transcriptasa inversa, en una copia
de cDNA de cadena doble. A fin de favorecer la clonación, se ligan
a cada extremo del cDNA en la z a d ores o ligo n u cleó tid o s (a dap ta­
dores) de doble cadena que contienen sitios de restricción apropia­
dos (fig. 5-10).
5.3.5 Con frecuencia se logra la selección recombinante
mediante inactivación insercional de un gen
marcador
Un requerimiento esencial para los sistemas de clonación de DNA
basados en células es un método para detectar las células que contie­
nen la molécula vectora apropiada y, dentro de este grupo, el sub­
grupo que posee el DNA recombinante. La selección generalizada
para recombinantes es útil en la selección de genotecas de DNA
elaboradas a partir de poblaciones de DNA que no se han caracte­
rizado tan bien. Sin embargo, cada vez es más común la selección
dirigida para estudiar d e form a específica la presencia d e alguna se­
cuencia conocida con anterioridad o una m uy relacionada con una
secuencia conocida.
Selección para células transformadas mediante moléculas
vectoras
La identificación de células que contienen la molécula vectora exi­
ge ingeniería o selección de la molécula vectora para que conten­
ga un gen marcador apropiado, cuya expresión proporciona un
medio para reconocer las células que lo contienen. Dos sistemas
marcadores de genes que se utilizan con amplitud se basan en lo
siguiente:
► genes de resistencia a antibióticos. Debe elegirse una cepa de
célula huésped que sea sensible a un antibiótico particular, con
frecuencia ampicilina, tetraciclina o cloranfenicol. El vector co­
rrespondiente se prepara mediante ingeniería para que conten­
ga un gen que confiera resistencia al antibiótico. Después de la
transformación, se siembran las células en una placa de agar
que contiene el antibiótico a fin de rescatar las células transfor­
madas por el vector;
 5.3 PRINCIPIOS DE LA CLONACIÓN DEL DNA BASADA EN CÉLULAS 137

(i) Lisis c e lu la r
(¡i) E x tra c c ió n d e R N A
(Mi) C ro m a to g ra fía d e c o lu m n a
Células de órgano, d e c e lu lo s a d e olíg o (dT)
te jid o o e ta p a del . AAAAAA
desarrollo específicas c .A A A A A A
+• .A A A A A A
(p. ej., células de
cerebro fetal)
T ra n s c rip ta s a in versa

T T T T T T 5' H e te r° d ú p le x m R N A /c D N A

R N -a s a H u O H

’ 5' cD N A de
c a d e n a ú n ic a

P o lim e ra s a d e D N A + n u c le a s a S1

^A A A A A A 3 ' cD N A de
'• T T T T T T 5 ' d o b le c a d e n a

L ig a r e n la z a d o re s d e l o lig o n u c le ó tid o
q u e c o n tie n e la s e c u e n c ia d e re c o n o c im ie n to E c o R I

NNNG AATTCNNN .A A A A A A N N N G A A T T C N N N N
NNNCTTAAGNNN .T T T T T T N N N C TTA A G N N N N

Eco Rl

L ig a r al v e c to r
. AAAAAAí y p ro c e d e r c o m o
■T T T T T T
en la fig u ra 5 -5

Fig. 5-10. Elaboración de una biblioteca de cDNA.

Con frecuencia, en el paso de transcriptasa inversa se utiliza un cebador olígo (dT) a fin de cebar la síntesis de la cadena de cDNA. En fecha más re­
ciente se emplearon mezclas de cebadores oligonucleótídos aleatorios en lugar de proporcionar una representación de secuencias más normal. La RN-
asa H digiere de modo específico RNA enlazado a DNA en un híbrido RNA-DNA. El extremo 3 ' del cDNA de cadena única resultante tiene una tendencia
a hacer de nueva cuenta asas para form ar una horquilla corta. Eso puede usarse para cebar la síntesis de la segunda cadena mediante polimerasa de
DNA y a continuación puede cortarse el asa corta resultante que une las dos cadenas mediante nucleasa S1 que corta de manera específica regiones
de DNA de cadena única.

► complementación con gen de galactosidasa (i. La célula hués­
ped es un mutante que condene un fragmento del gen de galac­
tosidasa (3, pero no puede elaborar ninguna galactosidasa (3
funcional. Se prepara el vector mediante ingeniería para que con­
tenga un fragmento diferente del gen de galactosidasa ¡3. Después
de la transformación se observa la complementación funcional', la
célula huésped y los fragmentos de galactosidasa (3 codificados
por vector son capaces de combinarse para producir una enzi­
ma activa. La actividad de la galactosidasa (3 funcional se valora
mediante la conversión de un sustrato incoloro, Xgal (5-bromo,
4-cloro, 3-indolil (3-D-galactopiranósido), a un producto de co­
lor azul.
Selección recombinante generalizada
Por lo general, las selecciones generalizadas para DNA recombinan­
te se basan en inactivación insercional: se diseña el vector para que
contenga algún gen marcador que confiere cierto fenotipo que pue­
de calificarse con facilidad y contiene dentro de él sitios de restric­
ción únicos para insertar DNA extraño en el gen marcador, que se
inactiva en consecuencia y cambia el fenotipo. Con objeto de lo­
grarlo, es habitual modificar el gen marcador al insertar en él un
polienlazador d e sitio d e clo n a ció n m últiple, un oligonucleótido
de doble cadena diseñado para incluir secuencias de reconocimien­
to de nucleasas de restricción específicas (los sitios de restricción
preexistentes para estas enzimas se eliminan del vector si es necesa­
rio a fin de asegurar la presencia de sitios de clonación únicos).
Debido a que el polienlazador es corto (cerca de 30 pb) y múl­
tiplo de tres nucleótidos de largo (con conservación del marco de
lectura del gen marcador), no afecta la expresión del gen marcador.
Sin embargo, cuando se clona a continuación un fragmento de
DNA extraño dentro del polienlazador, el gen marcador tiene una
inserción grande con la cual inactivarlo. Los sistemas empleados in­
cluyen casi siempre:
► selecciones basadas en galactosidasa (3. En un gen marcador
de galactosidasa (3, la inactivación insercional tiene como
138 j CAPÍTULO CINCO AMPLIFICACIÓN DEL DNA: CLONACIÓN DE DNA POR PCR Y BASADA EN CÉLUIAS

Los cambios de bases en el anticodón de un tRNA pueden permitir que Mutación de un tRNA de glutamina para obtener un supresor ámbar
se inserte un aminoácido en respuesta a un codón de detención. El glu-
tamato tiene dos codones, GAG y GAA, que son reconocidos por dos m o­ G lu Ám bar
léculas de tRNA diferentes. El tRNA61" en la parte superior lleva un C odón 5' G AG 3' 5' UAG 3'
anticodón CUC que reconoce el codón de glutamato GAG. La mutación
A n tic o d ó n 3' C U C 5' 3' A U C 5'
del gen de tRNA puede producir un tRNA61“ mutante que tiene un cambio I I I
C - » A en la base 3 ' en el anticodón. Este tRNA mutante puede recono­ I 1 1
cer ahora el codón de detención UAG ám bar y al insertar un glutamato su­ tR N A tR N A G,u (C —>A) tR N A Glu*
prim e la señal de detención ámbar. El ejemplo en la parte Interior de la (su p re so r
figura ilustra una mutación similar (C - * A) aplicada a la base 3 ' en el an­ á m b a r)
ticodón del otro tRNA61“ , lo que genera en esta ocasión un tRNA mutante
que puede suprimir el efecto de un codón de detención ocre.
Mutación de un tRNA de glutamina para obtener un supresor ocre

Glu O c re
Codón 5 ' G A A 3' 5' UAA 3'

A n tic o d ó n 3' C U U 5' 3' A U U 5'

I I |
I 1 1
tR N A tR N A Glu (C —>A) tR N A Glu*
(su p re so r
ocre)

- ....... ....... 4 , * ^ . . .. ' . *7*i ......................... ’....... ” - ...

■Ufe
Recuadro 5-4. Importancia de los sitios de secuencia m arcados (SSM)
■«
Los sitios de secuencia marcados son medios importantes para mapeo
porque la presencia de esa secuencia puede valorarse de manera muy 1 40
5' CCCAGCGGGCCCGCGGCGCAGGGGCCCGGCGGGGCCCTGG
conveniente mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Casi
ningún SSM es polimórfico y en genomas que se secuenciaron se cono­ CEBADOR A
ce con precisión la localización subcromosómica única de cada segmen­ 41 5' CAGTGAGCATCAGATA — * 3' 80
to de secuencia marcado (SSM). A continuación se muestra un ejemplo GGCCGCCCGGCAGTGAGCATCAGATACAGAACCTAGACGA
de la forma en que se desarrolla el SSM a partir de una secuencia de DNA.
En un genoma complejo com o el humano, las posibilidades de enlace de
81 120
un cebador de 16 nucleótidos de largo a una secuencia relacionada pero
ACCTAG GACCAGTACCTACAAGGTACT CTAGATGATCTAT
diferente, aparte del blanco pretendido, no son insignificantes. Sin embar­
go, en condiciones normales son muy bajas las posibilidades de que am­
bos cebadores se enlacen a secuencias relacionadas no pretendidas que 121 160
tan sólo se encontraban ambas en proximidad cercana y asim ismo en ACTGAGGATCCTATTCAGATCCTAGGTACCACACTGATTA
una orientación apropiada. La especificidad de la reacción puede valo­
rarse de manera sencilla al fraccionar el tamaño de los productos de
am plificación en un gel de agarosa. Si existe un producto de PCR po­ 161 200
AGGATACTAGCTATACGGACATGGCATTACACCCCCGGGG 3'
tente, único, del tamaño aproximado esperado (141 pb en el ejemplo
••••••••••••••••
anterior), hay una excelente posibilidad de que la valoración sea espe­
<------ 3' TGCCTGTACCGTAATG 5'
cífica para la secuencia blanco intentada, lo que define el sitio de se­ CEBADOR B
cuencia marcado (SSM).

resultado células incoloras en presencia de Xgal, en tanto que
las células que contienen el vector no recombinante son azules;
► selecciones basadas en tRNA supresor. Los genes tRNA su-
presores son mutantes y llevan una secuencia anticodón alte­
rada complementaria de uno de los codones de terminación
normales: UAA (ocre), UAG (ám bar) o UGA (ópalo). En res­
puesta al codón de detención importante, el tRNA supresor
inserta un aminoácido (véase recuadro 5-3). De manera carac-
terística, la célula huésped lleva un gen marcador defectuoso
diseñado para que posea un codón de detención prematuro,
que crea un fenotipo que es posible calificar con facilidad. Si
el vector lleva un gen de tRNA supresor adecuado para anular
la mutación del gen marcador, se restablece el fenotipo de ti­
po silvestre. La clonación de DNA extraño dentro del gen de
tRNA supresor provoca inactivación insercional y restablece ei
fenotipo mutante.
 5.3 ! PRINCIPIOS DE LA CLONACIÓN DEL DNA BASADA EN CÉLULAS 139

A. S elección prim aria B) S elecc ió n se cu n d aria

Eít-ategia de selección mediante PCR para la biblioteca ICI-YAC.
Se desarrollan de forma individual 35 000 clonas en 360 platos de
- icrotítulos. Se combinan los cultivos de nueve platos (864 YAC) y
se utilizan para elaborar un fondo común maestro de muestra de
TNA para selección
Se logra la selección tridim ensional m ediante
el análisis del D N A preparado para placa, hileras
y fondo s com unes por colum na

U na d e ocho hileras
de fondos comunes
- (este fondo com ún
tiene A1 -A 1 2 para
nueve placas)

Uno d e nueve
fondos comunes
Mezcla de 864 DNA de YAC = 1 fondo común maestro de placa (es decir,
to dos los YAC en
una placa)
Uno de los 12 fondos comunes por columna
Muestra de DNA analizada mediante PCR (este fondo común tiene A1-H1 para nueve placas)

4 y
Muestras de DNA analizadas mediante PCR

- +1 5 12 20 -+ A B C D E F G H I

Fig. 5-11. Selección de una biblioteca basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

El ejemplo ilustra la selección de una biblioteca YAC humana. Se depositaron alrededor de 35 000 clonas individuales en ios 96 fosos de 360 platos de
microtitulo. Con el fin de facilitar la selección, se generó en total 40 fondos comunes maestros tras combinar todas las 864 clonas en grupos de nueve
platos de microtitulo (platos A-I). Modificado de Jones y cois. (1994), Genomics, 24, pp. 266-275 con autorización de Academic Press Inc. A) La selec­
ción prim aria incluye la valoración mediante PCR de los 40 fondos comunes maestros. En este ejemplo, tres fondos comunes maestros fueron positi­
vos cuando se refirieron contra testigos positivos ( + ) y negativos ( - ) : fondos comunes 5 ,1 2 , 33. B) La selección secundaria identifica YAC único
tras valorar diferentes subgrupos de los 864 YAC en un fondo común maestro positivo, en este caso el fondo común maestro 12. Selección tridim ensio­
nal de cada uno de los nueve fondos comunes de la placa (de 96 YAC cada uno), ocho fondos comunes en hilera (de 106 YAC cada uno), 12 fondos
comunes de columna (de 72 YAC cada uno) e identificación de un YAC positivo en la placa 12G (dibujo de la parte superior), hilera E (dibujo de la par­
te media), columna 5 (dibujo inferior). Este ejemplo incluyó la selección para YAC que contenía una secuencia de cromosoma X anónima. Tomado de
Jones y cois. (1994), Genomics 24 (1), 266-275, con autorización de Elsevier. El Dr. Sandie Herrell, University of Newcastle upon Tiñe, proporcionó
gentilmente las fotografías.

Selección recombinante dirigida mediante hibridación y PCR
La selección de una biblioteca de DNA se lleva a cabo casi siempre
de modo direccional al estudiar células para la presencia de una secuen­
cia de DNA caracterizada antes o alguna relacionada con una se­
cuencia de DNA conocida. Por ejemplo, podría seleccionarse una
biblioteca de DNA con insertos de clonas muy grandes a fin de re­
cuperar una clona recombinante muy grande para análisis funcio­
nal, o bien seleccionarse una biblioteca de DNA de una especie poco
estudiada para secuencias relacionadas con un gen humano bien co­
nocido. Esto puede lograrse mediante selección de DNA basada en
hibridación o con reacción en cadena de la polimerasa (PCR):
► selecció n basada en h ib rid a ció n . Se marca una clona de DNA
específica de interés en alguna forma y a continuación se utiliza
como una sonda de hibridación para identificar colonias de cé­
lulas que contienen la secuencia de interés (véase sección 6.4.1).
► selección basada en PCR. Una vez que se conoce una secuencia
de DNA es posible diseñar una valoración de PCR específica para
estudiar su presencia. Se dice a continuación que la secuencia se
marcó (ya que siempre puede reconocerse mediante la valoración
de PCR específica). Si la secuencia ocurre en un sitio (localiza­
ción) dentro del genoma de interés, entonces se dice que es un si­
tio de secuencia marcado (SSM; véase recuadro 5-4). Los sitios
140 ■) C IN CO AMPLIFICACIÓN DEL DNA: CLONACIÓN DE DNA POR PCR Y BASADA EN CÉLULAS

Cuadro 5-2. Tamaños de DNA insertado que pueden
obtenerse con diferentes vectores de donación.
Vector de clonación
Vectores plásmidos estándar con gran
número de copias
Vectores de inserción de bacteriófago \
Vectores de restitución de bacteriófago X
Vectores cósmidos
Bacteriófago P1
Vectores PAC (cromosoma artificia! P1)
Vectores BAC (cromosoma artificial
bacteriano)
5.4 Sistem as de clonación para
a m p lific ar fragm entos de
Tamaño del inserto diferentes tam años
La clonación del DNA basada en células se utiliza muchas veces co­
0-5 kb
mo un medio para producir cantidades de DNA puro para caracte­
rización física y estudios funcionales de genes individuales, grupos de
0-10 kb genes y otras secuencias del DNA de interés. Sin embargo, el tama­
9-23 kb
ño de las diferentes secuencias del DNA puede variar en notoria me­
dida (p. ej., se sabe que los tamaños de los genes humanos varían
30-44 kb entre 0.1 kb y 2 Mb). Los primeros sistemas de clonación basados en
70-100 kb células sólo podían clonar fragmentos de DNA muy pequeños. Sin
embargo, en fecha reciente se lograron rápidos adelantos en los siste­
130-150 kb mas de clonación que hicieron posible clonar fragmentos de DNA
muy grandes (véase cuadro 5-2).
hasta 300 kb

Vectores YAC (cromosoma artificial de
levadura) 0.2-2.0 Mb
de secuencia marcados son muy útiles para proporcionar mapas
físicos generales de genomas (véase sección 8 .3 .2 ), pero puede
aplicarse el mismo principio en la selección de genotecas. En este
caso, se guardan miles de clonas de células individuales y el DNA
recombinante aislado de cada una de ellas se deposita de modo
individual en fosos de platos para múltiples microtítulos. Pueden
estudiarse fondos comunes de clonas de diferentes grupos de fo­
sos -dispuestos en distintas jerarquías- para la presencia de un
SSM específico a fin de identificar un foso que contiene el DNA
deseado y luego la clona celular original (véase fig. 5 - 11).
5.4.1 Los vectores plásmidos estándar proporcionan
un medio simple para clonar fragmentos
de DNA pequeños en células bacterianas
(y eucariotas simples)
Con la finalidad de adaptar moléculas de plásmidos naturales co­
mo vectores de clonación se llevan a cabo, en condiciones norma­
les, varias modificaciones:
► inserción de un g e n d e resisten cia a a n tib ió tico s (para selec­
cionar al vector; véase sección 5.3.5);
► inserción de un g e n m a rca d o r que incluye en su interior un
p o lien la z a d o r d e sitio d e clo n a ció n m ú ltip le (para seleccio­
nar a los recombinantes; sección 5.3.5).
Como ejemplo, el vector plásmido pUC19 contiene un polienlaza­
dor con sitios de clonación únicos para múltiples nucleasas de res-

Polienlazador MCS
400 420 440 460
. Sacl Sroal Xba I P st I H/ndIII
agtgaattCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGcgtaatcatggtcat

I pUC19
2686 bp

* PR

Fig. 5-12. Mapa del vector plásm ido pUC19.

El origen de la replicación (ori) derivó originalmente de un plásmido parecido a ColE1, pMB1. El gen de resistencia a ampicilina (ApR) permite seleccio­
nar células que contienen la molécula vectora. Se incluye una porción del gen la c l y se expresa para dar un fragmento terminal amino de galactosidasa
beta. A éste lo complementa un gen mutante la c l en la célula huésped: pueden relacionarse los productos del vector y las secuencias de la célula hués­
ped la c l, aunque inactivos de forma individual, para form ar un producto funcional. Se inserta el sitio de clonación múltiple polienlazador de 54 pb (letras
mayúsculas) en el componente vector la c l (letras minúsculas) de manera tal que preserve el marco de lectura y la expresión funcional. Sin embargo, la
clonación de un inserto en múltiples sitios de clonación (MSC) causa inactivación insercional y ausencia de actividad de galactosidasa p.
 5.4 SISTEMAS DE CLONACIÓN PARA AMPLIFICAR FRAGMENTOS DE DIFERENTES TAMAÑOS
C u b ie rta p ro te ín ic a
Fig. 5-13. El fago X puede penetrar en las vías lítica y lisogénica.
tricción y un gen de resistencia a ampicilina que permite identifi­
car células transformadas (fig. 5-12). Además, se logra la selección
de recombinantes mediante la inactivación insercional de un com­
ponente del gen de galactosidasa p y se proporciona una porción
complementaria de este gen mediante una célula huésped de Esche-
richia coli modificada.
5.4.2 Los vectores lambda y cósmido proporcionan
medios eficientes para clonar fragmentos de DMA
moderadamente grandes en células bacterianas
La principal desventaja de los vectores plásmidos reside en que su ca­
pacidad para aceptar fragmentos de DNA grandes es muy limitada:
la mayor parte de los insertos tiene unas cuantas kilobases de largo y
son muy raros los insertos mayores de 5 a 10 kb. Además, los méto­
dos estándar de transformación de células bacterianas con vectores
plásmidos son relativamente ineficientes. Con objeto de superar es­
tas dificultades, se dirigió la atención a una etapa más temprana en
cuanto a la posibilidad de utilizar el bacteriófago lambda como un
vector de clonación. La partícula de virus X tipo silvestre (virión)
141
E xtre m o s
s a lie n te s d e
s e c u e n c ia s eo s
contiene un genoma de casi 50 kb de DNA de doble cadena lineal
empacado dentro de una cubierta proteínica y resultó un mecanismo
de infección de células de E. coli muy eficiente.
Una vez que se fija el virión X a la célula bacteriana, se dese­
cha la cubierta proteínica y se inyecta el DNA lambda en la célula.
En las partes terminales del DNA lambda se encuentran extremos
5 ' salientes de 12 nucleótidos de largo y con secuencia de bases
complementarias. Debido a que estas salientes 5' grandes pueden
formar pares de bases, son extremos pegajosos muy eficaces, simila­
res a los extremos pegajosos pequeños, pero más cohesivos que ellos,
generados por ciertas nucleasas de restricción (véase sección 5.3.2).
Estas propiedades de cohesión se reconocen por el nombre que se
proporciona a esta secuencia (la secuencia eos). Una vez en el inte­
rior de la célula bacteriana, las secuencias eos forman pares de bases
y sellan los cortes en muesca (nicks) mediante ligasas celulares y el
resultado es la formación de un DNA circular de doble cadena. Con
posterioridad, el DNA lambda puede seguir dos vías alternativas
(fig- 5-13):
► ciclo lítico. De manera inicial se replica el DNA X en forma
bidireccional y después mediante un modelo de círculo de
142 ; CAPÍT ULO CINCO AMPLIFICACIÓN DEL DNA: CLONACIÓN DE DNA POR PCR Y BASADA EN CÉLULAS

R eg ió n no
e s e n c ia l

P ro te ín a s d e In te g ra c ió n y R eg u lació n , sín tes is d e D N A

re c u b rim ie n to / y lisis d e l h u é s p e d
re c o m b in a c ió n

Fig. 5-14. Mapa del genoma X que muestra las posiciones de genes (barras verticales).

En los vectores de reemplazo x se elimina la reglón no esencial mediante digestión con endonucleasa de restricción y se deja un brazo \ izquierdo y
uno derecho. Puede ligarse un fragmento de DNA extraño a los dos brazos en lugar del fragmento original “ de relleno", lo que proporciona tamaños má­
ximos del inserto mayores de 20 kb.

L is ò g en o X in d u cid o L is ò g en o X in d u c id o
E. c o li B H B 2 6 8 8 £ c o li B H B 2 6 9 0
Eam sin p ro te in a E D am =¿> sin p ro te in a D
• C o la s X • C o la s X
• P re c a b e z a s c o n p ro te in a E
• P ro te in a D
• P ro te ín a s d e e n s a m b le
• P ro te ín a s d e e n s a m b le P e ro e m p a c a m ie n to d e D N A
P ero n o p re c a b e z a s y a b lo q u e a d o y a q u e no hay
q u e n o h a y p ro te in a E p ro te in a D

L isar y m e z c la r en p re s e n c ia d e D N A
re c o m b in a n te fla n q u e a d o p o r
se c u e n c ia s eo s e s p a c ia d a s p o r
~ 4 0 -5 0 kb (vé as e p. ej., fig .5 -1 6 ).
- 4 0 kb d e D N A re c o m b in a n te C abeza X

C o la X

Fig. 5-15. Puede llevarse a cabo in vitro el empacamiento de DNA en una cubierta proteínica de fago lambda con un lisado mixto de dos lisógenos
\ mutados.

El empacamiento in vivo normal de DNA x supone primero elaborar precabezas, estructuras compuestas de la proteína cápside mayor codificada por el
gen E. Se inserta en la precabeza una unidad de longitud de DNA x y se prepara la unidad de longitud mediante el corte de sitios eos vecinos. A conti­
nuación se inserta una proteína D cápside menor en las precabezas para completar la maduración de la cabeza y los productos de otros
genes sirven como proteínas de ensamble, lo cual asegura la unión de las colas completas a las cabezas completas. Un defecto de la producción de
proteína E, que resulta de una mutación ámbar introducida en el gen E (£am), impide que se formen las precabezas mediante BHB2688. Una mutación
ámbar en el gen D (Dm ) imposibilita la maduración de las precabezas, con el DNA incluido, dentro de cabezas terminadas. Sin embargo, los componen­
tes del lisado mixto de BHB2688/BHB2690 complementan entre sí la deficiencia y proporcionan todos los productos para el empacamiento correcto.

arrollamiento que genera multímeros lineales de la longitud de
unidad. Se sintetizan proteínas de recubrimiento y se recortan
los multímeros X en los sitios eos a fin de generar longitudes de
unidad de genoma X que se empacan dentro de las cubiertas
proteínicas. Algunos de los productos del gen X lisan la célula
huésped y permiten que escapen los viriones e infecten nuevas
células.
► estado lisogénico. El genoma X posee un gen att que tiene un
homólogo en el cromosoma de E. coli. La aposición de los dos
genes att puede propiciar la recombinación entre los genomas
X y E. coli y la integración subsecuente del DNA X dentro del
cromosoma de E. coli. En ese estado, el DNA X se describe co­
mo provirus y la célula huésped como lisògeno porque, si
bien el DNA X puede permanecer integrado de modo estable
por periodos prolongados, tiene la capacidad de separarse del
cromosoma huésped y penetrar en el ciclo litico (fig. 5-13). Los
genes necesarios para la función lisogénica se localizan en un
segmento central del genoma X (fig. 5-14).
Dos genes reguladores, el y ero, controlan la penetración del ci­
clo lírico o el estado lisogénico. Estos dos genes son mutuamente
antagónicos: en el estado litico, domina la proteína ero y condu­
ce a la represión de el, en tanto que en el estado lisogénico
 5.4 SISTEMAS DE CLONACIÓN PARA AMPLIFICAR FRAGMENTOS DE DIFERENTES TAMAÑOS
Z \ A genóm ico blanco
Mbo I S elección
parcial del tam año
: g. 5-16. La ligadura a moléculas vectoras cósmidas cortadas puede producir concatámeros de vector y blanco, que dan por resultado un frag-
- ento de ONA exógeno grande flanqueado por secuencias eos.
i : nina el represor fl y suprime la transcripción de otros genes
L incluido el ero. En células huésped que crecen con normali-
¿ iá , se favorece el estado lisogénico y se replica el genoma X.
_nto con el DNA cromosómico del huésped. El daño de las cé­
lulas huésped favorece una transición al ciclo lítico y ello posi-
r:l;ta que el virus escape de la célula dañada e infecte nuevas
células.
A fin de diseñar vectores de clonación adecuados basados en X
-je necesario crear un sistema que hiciera posible fijar el DNA ex­
traño al replicón X in vitro y que el DNA recombinante resultante
raerá capaz de transformar células de E. coli con gran eficiencia. Es­
to último se logró tras desarrollar un sistema de empaque in vi-
tro, que simuló la forma en que se empaca el DNA X tipo silvestre
en una cubierta proteínica, lo que suministró una gran eficiencia de
infección (fig. 5-15).
En las secciones siguientes se describen varios tipos mayores de
vectores de clonación que se desarrollaron al modificar el fago X o
usar la selección del tamaño impuesta por secuencias eos.
► R eem plazo d e v ecto res A. Sólo las moléculas de DNA de 37 a
52 kb de largo pueden empacarse con estabilidad dentro de la
partícula X. El segmento central del genoma X contiene genes
necesarios para el ciclo lisogénico, pero no esenciales para la
función lítica. Como resultado, pueden eliminarse y reempla­
zarse por un fragmento de DNA extraño. De esta forma es po­
sible clonar DNA extraño hasta de 23 kb de largo y estos
vectores se emplean a menudo para elaborar genotecas de
DNA genómico;
► in serción d e v ecto res A. Los vectores X que se utilizan para ela­
borar genotecas de cDNA no requieren una capacidad de inclu­
sión grande (casi todos los cDNA tienen < 5 kb de largo). El
diseño de vectores de inserción incluye con frecuencia modifi­
cación del genoma X para posibilitar la clonación insercional
dentro del gen d;
► v ecto res cósm id os que contienen secuencias eos insertadas en
un vector plásmido pequeño. Es posible clonar grandes frag­
mentos de DNA extraño (alrededor de 30 a 44 kb) mediante
estos vectores en una reacción de empacamiento in vitro por­
que muchas veces el tamaño total del vector cósmido es de
8 kb (fig. 5-16).
143
B am H I
3 0 -4 2 kb
5.4.3 Es posible clonar grandes segmentos de DNA
en células bacterianas con vectores basados
en bacteriófago P1 y plásmidos de factor F
Vectores de cromosoma artificial bacteriano (BAC)
Muchos vectores usados para la clonación de DNA en células bac­
terianas se basan en el número (grande a mediano) de copias de re­
plicones. El número de copias grande tiene como resultado una
producción considerable de DNA: cada célula en la que se propaga
una molécula vectora posee varias a múltiples copias de la molécula
vectora. Una desventaja importante es que estos vectores muestran
con frecuencia inestabilidad estructural de insertos y ello causa de-
leción o reordenamiento de porciones del DNA clonado. Esta ines­
tabilidad es en particular común en insertos de DNA de origen
eucariota, en los que ocurren con frecuencia secuencias repetidas.
Como resultado, es difícil clonar y conservar intacto DNA grande
en células bacterianas.
Para superar esta limitación, en fecha reciente se enfocó la
atención en vectores basados en replicones con números de copias
bajos, como el plásmido de fecundidad de E. coli, el factor F. Es­
te plásmido contiene dos genes, parA y parB, que conservan el
número de copias del factor F en una a dos por célula de E. coli.
Los vectores basados en el sistema de factor F son capaces de
aceptar fragmentos grandes de DNA extraño (> 300 kb). Los re-
combinantes resultantes pueden transferirse con gran eficiencia al
interior de células bacterianas mediante electroporación (un mé­
todo de exposición de las células a grandes voltajes para alterar la
permeabilidad selectiva de sus membranas plasmáticas). Sin em­
bargo, debido a que los cromosomas artificiales bacterianos (BAC)
contienen un número bajo de copias de replicón, sólo es posible
recuperar de las células huésped cantidades bajas de DNA recom­
binante.
Vectores de bacteriófago P1 y cromosomas artificiales P1
(PAC)
Ciertos bacteriófagos tienen genomas relativamente grandes y per­
miten por consiguiente la posibilidad de desarrollar vectores que
pueden incluir fragmentos grandes de DNA extraño. Uno de ellos
144 j CAPÍTULO CINCO j AMPLIFICACIÓN DEL DNA: CLONACIÓN DE DNA POR PCR Y BASADA EN CÉLULAS

es el b a cterió fa go P l que, al igual que el fago X, empaca su geno-
ma en una cubierta proteínica; se empacan 1 1 0 a l l 5 k b d e DNA
lineal en la cubierta proteínica P l. En consecuencia, se diseñaron
vectores de clonación P 1 en los cuales se incluyeron componentes
P l en un plásmido circular.
Es posible cortar el vector plásmido Pl para generar dos bra­
zos vectores a los cuales pueden ligarse hasta 100 kb de DNA ex­
traño y empacarse dentro de una cubierta proteínica Pl in vitro.
Casi siempre se favorece la adsorción del fago P 1 recombinante a
un huésped adecuado, después de lo cual se inyecta el DNA Pl
recombinante en la célula, se circulariza y puede amplificarse (ex­
tenderse) (Sternberg, 1992). Un adelanto en los límites del tama­
ño de insertos que acepta el sistema de clonación P l básico es el
uso del bacteriófago T4 en sistemas de empacamiento in vitro con
vectores Pl que hace posible recuperar insertos hasta de 122 kb
de tamaño. En fecha más reciente, se combinaron características de
los sistemas Pl y factor F para producir sistemas de clonación
(Iouannou y cois., 1994).
5.4.4 Los cromosomas artificiales de levadura (YAC)
permiten clonar fragmentos de megabase
El sistema para la clonación de fragmentos de DNA muy grandes que
se emplea con mayor frecuencia incluye la formación de cromosomas
artificiales de levadura (YAC; véase Schlessinger, 1990). Es difícil o
imposible propagar ciertas secuencias eucariotas, en especial las que in­
cluyen organizaciones de secuencia repetida, células bacterianas que
carecen de estos tipos de organización de DNA, pero que puede anti­
ciparse que se tolerarán en células de levadura eucariotas. Sin embargo,
la principal ventaja es la capacidad para clonar fragmentos de DNA
muy grandes. Este desarrollo se inició cuando se reconoció que para la
función cromosómica normal no se requiere la gran masa de DNA en
un cromosoma. Como se detalla en la figura 2-5, los componentes
funcionales esenciales de los cromosomas de levaduras son tres:
► se requieren cen tró m ero s para la disyunción de cromátides
hermanas en la mitosis y cromosomas homólogos en la prime­
ra división meiótica;

S itio d e clo n a c ió n
E coRI

i
D N A b la n co

D ig e stió n co n S a m H I y E co R I | D ig e stió n p a rc ial co n E c o R I

1
TEL TRP A R S C E N

URA TEL
t y
TEL TRP A R S C E N L ig a r ▼ URA TEL

Fig. 5-17. Elaboración de YAC.

Las secuencias de DNA vector incluyen: CEN4, secuencia de centrómeros; TEL, secuencias de telómero; ARS1, secuencias de replicación autónoma; Amp,
gen que contiere resistencia a ampicilina; ori, origen de replicación para la propagación en un huésped E. coli. El vector se emplea con una célula huésped
de levadura especializada, AB1380, que es de color rojo porque lleva una mutación ocre en un gen, ade-2, que participa en el metabolismo de la adenina, y
tiene como resultado la acumulación de un pigmento rojo. Sin embargo, el vector lleva un gen SUP4, un gen tfíNA supresor (véase recuadro 5-3), que
supera el efecto de la mutación ocre ade-2 y restablece la actividad tipo silvestre, con colonias incoloras resultantes. Las células huésped también están
diseñadas para tener alelos recesivos trp l y ura3 que pueden complementarse con los alelos TRP1 y URA3 correspondientes en el vector, lo cual proporcio­
na un sistema de selección para identificar células que contienen el vector de cromosoma artificial de levadura (YAC). La clonación de un fragmento de DNA
extraño dentro del gen SUP4 causa inactivación insercional de la función del gen supresor y ello restablece el fenotipo mutante (color rojo).
 5.4 | SISTEMAS DE CLONACIÓN PARA AMPLIFICAR FRAGMENTOS DE DIFERENTES TAMAÑOS ¡ 145

Fig. 5-18. Producción de DNA recombinante de cadena única mediante vectores M13 y fagómidos.

A) Vectores M13. Los vectores M13 son form as repiicativas (FR) de derivados M13 que contienen un componente no funcional del sistema galactosi-
dasa ß de la c l que puede complementarse en su función por la presencia de un componente complementario lacZ en la serie E. cotí JM. El DNA re-
combinante M13 de doble cadena penetra en el ciclo normal de replicación del DNA para generar numerosas copias del genoma, antes de cambiar a
la producción de DNA de cadena única (sólo cadena + ). El fago recombinante maduro sale de la célula sin lisis. B) Vectores fagóm idos. La serie
pBluescript de vectores plásmidos contiene dos orígenes de replicación: uno normal a partir de Co/E1 y un segundo del fago f1 que, en presencia de
un genoma fago filamentoso, especifica la producción de DNA de cadena única. La superinfección de células transformadas con fago WI13 da lugar a
dos tipos de partículas parecidas a fago liberadas de las células: el fago superlnfectante original y los recombinantes plásmidos con una cubierta pro-
teínica de fago. Se utilizan cebadores de secuenciación específicos para el vector fagómldo a fin de obtener secuencias no ambiguas.
146 CAPÍTULO CINCO AMPLIFICACIÓN DEL DNA: CLONACIÓN DE DNA POR PCR Y BASADA EN CÉLULAS
► se necesitan telórn eros para la replicación completa de molécu­
las lineales y proteger así los extremos del cromosoma de ata­
ques de nucleasas;
► Se precisan elementos de secu en cia d e rep lica ción a u tón om a
para la replicación autónoma del DNA cromosómico y se pien­
sa que actúan como orígenes de replicación específicos.
En cada caso, el segmento de DNA necesario para la actividad fun­
cional in vivo en levaduras se limita cuando más a unos cuantos
cientos de pares de bases de DNA (fig. 2-5). Como resultado, fue
posible idear un sistema de clonación novedoso basado en el uso de
replicones cromosómicos (elementos de secuencia de replicación au­
tónoma) como una alternativa a los replicones extracromosómicos
(los que se encuentran en plásmidos y bacteriófagos) e incluye la
formación de un cromosoma artificial.
Con objeto de preparar YAC basta combinar cuatro secuencias
cortas que pueden funcionar en células de levadura: dos telórneros, un
centrómero y un elemento ARS, además de un fragmento de DNA
extraño de tamaño adecuado para obtener una molécula de DNA li­
neal en la cual se coloquen correctamente secuencias de telórneros en
las terminales (fig. 5-17). El producto resultante no puede transfectar-
se de manera directa dentro de células de levadura. En lugar de ello,
es necesario tratar las células de levadura en forma tal que se eliminen
las paredes celulares externas. Los esferoplastos de levadura resul­
tantes pueden aceptar fragmentos exógenos pero son inestables des­
de el punto de vista osmótico y es necesario incluirlos en agar. La
eficiencia total de transformación es muy baja y asimismo la pro­
ducción de DNA clonado (alrededor de una copia por célula). No
obstante, la capacidad para clonar grandes fragmentos de DNA
exógeno (hasta 2 Mb) hizo que los YAC fueran un medio vital en
el mapeo físico (véase sección 8.3.2).
5.5 Sistemas de clonación para
producir DNA de cadena única
y mutagenizado
Son útiles las clonas de DNA de cadena única para varias aplicacio­
nes, incluida la secu en cia ció n d e DNA (debido a que las secuencias
obtenidas se leen con mayor claridad y facilidad) y la mutagénesis
dirigida a sitio (en la cual es preciso alterar un sitio específico en un
DNA clonado en una forma precisa y predeterminada). Las muta­
ciones dirigidas a sitio pueden diseñarse para crear sustituciones es­
pecíficas de nucleótidos específicos, deleciones, entre otros, que
pueden ayudar a identificar residuos aminoácidos fundamentales u
otras secuencias de importancia funcional si se dispone ya de una va­
loración funcional para la secuencia de DNA de interés.
5.5.1 El DNA de cadena única para utilizarse en la
secuenciación de DNA se obtiene con vectores
M13 o fagómidos o amplificación lineal por PCR
Por lo regular se utilizan como plantillas clonas de DNA recombi­
nante de cadena única para secuenciación de DNA con el uso de
vectores basados en ciertos bacteriófagos que adoptan de manera
natural una forma de DNA de cadena única en cierta etapa de su
ciclo de vida. Debido a que ya se conoce la secuencia del vector, es
conveniente emplear un cebador de secuenciación específico de
vector único que sea complementario a una secuencia en el vector
adyacente al sitio de clonación.
Vectores M13
MI 3 es un b a cterió fa go fila m en to so que puede infectar ciertas ce­
pas de E. coli. Su genoma circular de cadena única de 6.4 kb está
encerrado en una cubierta proteínica que forma una estructura fi­
lamentosa larga. Después de adsorberse a la bacteria, penetra el ge­
noma M13 en la célula bacteriana y se convierte en una forma de
doble filamento, la fo r m a rep lica tiva (FR) que sirve como planti­
lla para hacer numerosas copias del genoma. Después de un cierto
tiempo, un producto codificado por fago cambia la síntesis de
DNA a la producción de cadenas únicas que migran a la membra­
na celular. En este sitio se encierran en una cubierta proteínica y se
expulsan cientos de partículas de fago maduras de la célula infecta­
da sin lisarse esta última. Los vectores M 13 se basan en la FR con
un sitio de clonación múltiple para aceptar insertos extraños de ta­
maño limitado. Los últimos pueden transfectarse en cepas adecua­
das de E. coli. Después de un cierto periodo, se obtienen partículas
fago y se despojan de sus cubiertas proteínicas a fin de liberar DNA
recombinante de cadena única para uso directo como plantilla en
reacciones de secuenciación de DNA (fig. 5-18A).
Vectores fagómido
Es posible insertar un segmento pequeño del genoma de un bacterió­
fago filamentoso, como M13 (o los fagos filamentosos relacionados
fd o fl), en un plásmido para formar un vector híbrido conocido co­
mo fagómido. Las secuencias de fago seleccionadas contienen todos
los elementos de acción cis necesarios para la replicación y ensamble
del DNA dentro de partículas fago. Posibilitan el éxito en la clonación
de insertos de varios kilobases de largo (a diferencia de los vectores
M I3 en los que dichos insertos tienden a ser inestables). Después de
la transformación de una cepa adecuada de E. coli con un fagómido
recombinante, se superinfectan las células bacterianas con un fago co­
laborador filamentoso, como f l , que se requiere para proporcionar la
proteína de recubrimiento. Las partículas de fago secretadas de las cé­
lulas superinfectadas son una mezcla de fago colaborador y fagómidos
recombinantes (fig. 5-18B). La población de DNA de cadena única
mixta puede utilizarse de forma directa para la secuenciación del
DNA porque el cebador para iniciar la síntesis de la cadena de DNA
está diseñado para enlazarse de manera específica a una secuencia del
vector fagómido adyacente al sitio de clonación. Los vectores fagómi­
dos usados de modo general incluyen la serie pEMBL de plásmidos y
la familia pBluescript (véase fig. 5-18B).
Amplificación lineal por PCR
En una forma de secuenciación basada en PCR que se conoce como
secu en cia ció n d e ciclo (recuadro 7-1) se utiliza una reacción de PCR
modificada para generar plantillas de cadena única para secuencia­
ción. Esto se logra al utilizar sólo un cebador aislado de tal manera que
se acumule producto de cadena única, pero en una forma lineal en lu­
gar de la amplificación exponencial que se observa en la PCR normal.
5.5.2 La mutagénesis de oligonucleótido incompatible
puede crear un cambio predeterminado de un
nucleótido único en cualquier gen clonado
Muchas valoraciones in vitro de la función génica se dirigen a
obtener información sobre la importancia de aminoácidos indi­
viduales en el polipéptido codificado. Esto puede ser relevante
 5.5 i SISTEMAS DE CLONACIÓN PARA PRODUCIR DNA DE CADENA ÜNICA Y MUTAGENIZADO 147

C ebador
m u ta g é n ic o

S e c u e n c ia
m u ta n te

S e c u e n c ia H om odú plex tip o silvestre

tip o silve stre

H e te ro d ú p le x d e
d o b le c a d e n a
S ín te sis d e n u e vo D N A

H o m o d ú p le x m u ta n te

Fig. 5-19. La mutagánesls de incompatibilidad de oligonucleótido puede crear un punto de mutación deseado en un sitio predeterminado único
dentro de una molécula de DNA clonada.

.a figura sólo ilustra uno de los muchos diferentes métodos de mutagénesis de incompatibilidad de oligonucleótido basada en células. El ejemplo ilustra
¿ uso de un oligonucleótido mutagénico para dirigir la sustitución de un nucleótido aislado en un gen. El gen se clona en M13 a fin de generar un DNA
^com binante de cadena única. Se diseña un cebador oligonucleótido para que su secuencia sea complementaria a un porción de la secuencia del gen
que incluye el nucleótido por mutar (A) y que contiene la base no complementaria deseada en la posición (C, no T). A pesar de la incompatibilidad inter-
n(a. es posible el templado (annealing) del cebador mutagénico y puede extenderse la síntesis de la segunda cadena mediante polimerasa de DNA y se­
carse la hendidura con llgasa de DNA. El heterodúplex resultante puede transformarse en E coli, en tanto que es posible recubrir las dos poblaciones de
-ecombinantes: tipo silvestre y homodúplex muíante. El último puede identificarse mediante hibridación molecular (con el cebador mutagénico como una
sonda olingonucleótida específica de alelo; véase fig. 6-11) o con métodos de amplificación específicos de alelo basados en PCR (véase fig. 5-4).

cuando se intenta estimar si una mutación de sentido erróneo
particular que se encuentra en un gen de una enfermedad cono­
cida es patogénica o por lo general sólo a fin de valorar la con­
tribución de un aminoácido específico a la función biológica de
una proteína.
Un método general difundido incluye la clonación del gen o
cDNA en un vector M13 o fagómido a fin de recuperar DNA re-
combinante de cadena única (véase sección previa). A continuación
se diseña un cebador oligonucleótido mutagénico cuya secuencia se
complementa de forma perfecta con la secuencia del gen en la re­
gión por mutar, excepto por una diferencia aislada: en el sitio d e la
mutación pretendida lleva una base que es complementaria para el nu­
cleótido m uíante deseado en lugar del original. En seguida se permi­
te que el oligonucleótido mutagénico cebe la nueva síntesis de
DNA para crear una secuencia complementaria de longitud com­
pleta que contiene la mutación deseada. El heterodúplex recién for­
mado se utiliza para transformar células y es posible identificar los
genes mutantes deseados al seleccionarlos para la mutación (véase
fig- 5-19).
También es posible introducir otras mutaciones a escala peque­
ña, además de las sustituciones de nucleótido único. Por ejemplo,
puede introducirse una deleción de tres nucleótidos que tiene como
resultado la eliminación de un aminoácido aislado del polipéptido
codificado o una inserción que añade un nuevo aminoácido. A con­
dición de que el oligonucleótido mutagénico sea lo bastante largo,
es capaz de unirse de modo específico a la plantilla del gen incluso
si existe una gran incompatibilidad central. Es posible introducir
mutaciones más grandes aún si se utiliza mutagénesis de casete, en
cuyo caso se elimina una región específica de la secuencia original
del gen original y se reemplaza por casetes de oligonucleótidos (Bed-
well y cois., 1989).
5.5.3 La mutagénesis basada en PCR incluye el
acoplamiento de secuencias o grupos
químicos deseados a una secuencia blanco
y mutagénesis específica de sitio
La mutagénesis dirigida a sitio mediante PCR es cada vez más
usada y se han diseñado varias medidas para permitir sustitucio­
nes, deleciones e inserciones de bases (véase más adelante,
Newton y Graham, 1997). Además de producir mutaciones pre­
determinadas específicas en un DNA blanco, una forma de mu­
tagénesis que se conoce como mutagénesis de adición 5' permite
añadir una secuencia o grupo químico deseado en forma muy si­
milar a la que suele lograrse mediante ligadura de enlazadores
oligonucleótidos.
La mutagénesis de adición 5' es una práctica de uso común en
la que se añade una nueva secuencia o grupo químico al extremo 5'
de un producto de PCR con la creación de cebadores que tienen la
secuencia específica deseada para la parte 3' del cebador, en tanto
que la parte 5' del cebador contiene la secuencia novedosa o una
secuencia con un grupo químico unido. La secuencia 5’ adicional
no participa en la primera etapa de templado (annealing) de la reac­
ción de PCR (sólo la parte 3' del cebador es específica para la se­
cuencia blanco), pero de manera subsecuente se incorpora en el
producto amplificado, lo que genera así un producto recombinan-
te (fig. 5-20A). Varias alternativas habituales para la secuencia 5'
incluyen: d) un sitio de restricción apropiado, que puede facilitar la
clonación subsecuente de DNA basada en células; b) un compo­
nente funcional, por ejemplo una secuencia promotora para expre­
sión de impulso; c) un nucleótido modificado que contiene un
grupo rastreador o un grupo marcado, como un nucleótido bioti-
nilado o fluoróforo.
148 CAPITULO CINCO AMPLIFICACIÓN DEL DNA: CLONACIÓN DE DNA POR PCR Y BASADA EN CÉLULAS

Mutagénesis de cebador incompatible. El cebador (nucleóti- 5.6 S istem as de clonación diseñados

do iniciador) está diseñado para que sólo sea en parte complemen­
tario respecto del sitio blanco, pero en forma tal que aún se una de
manera específica a él. De modo inevitable, eso significa que la mu­
tación se introduce cerca del extremo final del producto de la reac­
ción en cadena de la polimerasa (PCR). Como se ilustra en la figura
18-8, este método se explora al introducir un sitio de restricción
diagnóstica artificial que hace posible seleccionar una mutación co­
nocida. También pueden introducirse mutaciones en cualquier
punto dentro de una secuencia elegida si se usan cebadores incom­
patibles. Se han ideado dos reacciones mutagénicas en las cuales los
dos productos de PCR separados tienen secuencias parcialmente
superpuestas que contienen la mutación. Se combinan los produc­
tos desnaturalizados para generar un producto más grande con la
mutación en una localización más central (Higuchi, 1990; véase
fig. 5-20B).
para expresar genes
Los sistemas de clonación que se describen en la sección 5.4 se
emplean cuando el objetivo es tan sólo amplificar el DNA intro­
ducido a fin de obtener cantidades suficientes para una diversi­
dad de estudios estructurales y funcionales subsecuentes. Sin
embargo, en el caso de secuencias génicas, hay muchas circuns­
tancias en las que en lugar de amplificar y propagar sólo el DNA
clonado, es aconsejable expresar el gen en cierta forma (clona­
ción de expresión). En cada caso, el sistema de clonación nece­
sita proporcionar señales de expresión apropiadas. La clonación
de expresión puede llevarse a cabo con sistemas basados en PCR,
pero a menudo se emplean sistemas de clonación basados en cé­
lulas. Es posible utilizar una gran variedad de sistemas de clona­
ción, de acuerdo con lo siguiente:

A) 5' B) 1M 2
s . 3 ^ 3 -------------------S o t t ----------------------- — 3:
------------
3 ■■ ■■.... ■ ■..—..... — ......■ 5' 3 ■■■ ..................... — ....... ......... = 5'
P C R -A j n n i--------------,
5 n --------------- ^ P C R -B
| 1+1M * . W
I i
r ----—

5 ' ........- ................ 3'

3 ' 1...— ............................ — — 5' E lim inar c e b a d o re s . C o m b in a r A + B,
y d e s n a tu ra liz a r y te m p la r o tra ve z
* (reanneaí) p a ra fo rm a r h e te ro d ú p le x

5 ' ---------------------------------------- 3'

3' --- ----------------- = — 5'
+
5 ' — * -----------------------------------------3 '
3 ' r-------------- ------------------ ^ = 5 '

^ 3 ' e x te n s ió n

5 '-------------------------- *-------------------------* 3'

3 ' ♦ -------------------- .----------<=^ -------- 5'

P C R con
1+ 2

5 ' ---------------------------------------- * ---------------------------------------- 3'

3 ' — — ............................... ^ ........................ — ...— - 5'

Fig. 5-20. M utagénesis de PCR.

A) M u tag én esis añ ad ida 5'. Es posible m odificar los cebadores en el extremo 5 ' a fin de introducir, por ejem plo, un grupo marcado (p. ej.,
fig. 7-1 1), una secuencia que contiene un sitio de restricción apropiado o un prom otor fago para expulsar la expresión génica. B) M u tag én esis
e s p e c ific a de s itio . La m utagénesis que se m uestra puede crear un producto am plificado con una m utación predeterm inada específica locali­
zada en un segm ento central. Las reacciones de la PCR A y B se consideran segm entos de DNA de am plificación superpuestos que contienen
una m utación introducida (por la incom patibilidad de bases deliberada mediante un cebador muíante: 1M o 2M ). Después de com binar los dos
productos, desnaturalizarlos y perm itir que se tem plen (reanneai), la polim erasa de DNA puede extender el extremo 3' de heterodúplex con ex­
trem os 3' en receso. Con posterioridad, puede am plificarse un producto de longitud com pleta con la m utación introducida en un segmento
central con tan sólo los cebadores externos 1 y 2.
 5.6 | SISTEMAS DE CLONACIÓN DISEÑADOS PARA EXPRESAR GENES
► tipo de producto de expresión. Para ciertos propósitos, puede
s<er suficiente obtener un producto de RNA. Los ejemplos in­
tuyen la generación de sondas de RNA antisentido (riboson -
das. véase fig. 6-3) para usarse en estudios de hibridación in situ
de tejidos o la generación de RNA antisentido con la finalidad
de inhibir o destruir la expresión de genes específicos, sea en es­
tudios funcionales o con propósitos terapéuticos (secciones
20.2.6 y 21.7.5). Sin embargo, en muchos casos es convenien­
te un producto proteínico;
► tipo de ambiente. En ocasiones es suficiente expresar el pro­
ducto in vitro. No obstante, con frecuencia suele ser convenien­
te tener la posibilidad de expresar el producto en un sistema
celular particular que puede ser una línea de células procariotas
o eucariotas muy definida.
► propósito del sistema de expresión. El sistema de expresión
puede diseñarse sólo para investigar la expresión. Empero, en
muchos casos, el propósito puede ser recuperar grandes cantida­
des de un producto de expresión, por ejemplo cuando es necesa­
rio generar números considerables de una proteína específica
para ayudar en estudios de cristalografía subsecuentes o como in­
tentos para elaborar anticuerpos específicos contra la proteína.
Ñ; han diseñado muchos vectores diferentes de clonación de expre-
aón para emplearse en distintos sistemas de células huéspedes, que
derivan de células bacterianas o de mamíferos, con vectores especí­
ficos elaborados mediante ingeniería a fin de que sean útiles en ti­
ros específicos de células huésped.
5.6.1 Es posible producir grandes cantidades de
proteínas mediante la clonación de expresión
en células bacterianas
\ luchas veces es necesario clonar cDNA eucariota en un vector de
expresión con objeto de producir compuestos o proteínas de im­
portancia médica para estudios básicos de seguimiento de investi­
gaciones, por ejemplo estudios estructurales. Por lo general, en
estos casos el cDNA se diseña sólo para proporcionar la informa­
ción genética que especifica la secuencia proteínica y las señales de
expresión se proporcionan de forma externa al unir promotores,
elementos reguladores, etc., de potencia adecuada dentro del vector
de expresión. Puesto que el sistema de expresión se basa en DNA
recombinante y también incluye con gran frecuencia la creación de
proteínas de fusión artificiales o proteínas modificadas mediante la
adición de ciertos marcadores peptídicos a ellas, las proteínas resul­
tantes se describen en ocasiones como proteínas recombinantes.
Las células bacterianas tienen la ventaja de crecer con rapidez y
expandirse con facilidad en cultivos hasta volúmenes de cultivo
muy grandes; la célula huésped preferida, bien estudiada para la
expresión de proteínas heterólogas (extrañas), es E. coli (Baneyx,
1999). Es posible expresar una gran variedad de proteínas me­
diante sistemas de expresión basados en p o lim er a sa RNA T7 de
bacteriófago, que es capaz de producir transcritos completos casi
de cualquier secuencia de codificación.
Ya que la producción de grandes cantidades de proteína heteró-
loga puede ser perjudicial, e incluso tóxica, para el crecimiento de
la célula huésped, tiene ventajas controlar la expresión mediante un
promotor inducible. Si se toma en consideración que la polimera­
sa de RNA de E. coli no reconoce el promotor T7, el DNA clona­
do en el vector permanece en gran parte sin expresarse cuando no
existe la polimerasa de RNAT7. La polimerasa de RNA normal del
149
huésped no reconoce el promotor T7, pero para los propósitos de
clonación se usa una cepa que tiene una polimerasa de RNA T7
inducible dentro del cromosoma bacteriano. Por ejemplo, cuando
se emplean los sistemas de clonación de v ecto rp E T (fig. 5-21A), se
modifica el huésped para que contenga una polimerasa de RNA T7
regulada por un promotor lac y en consecuencia pueda inducirse
cuando se desea con el inductor lac isopropil-tio-|3-D-galactopira-
nósido (IPTG). Como resultado, las células transformadas pueden
seleccionarse y desarrollarse en grandes cantidades sin expresión;
con posterioridad puede añadirse IPTG a fin de inducir expresión
y obtenerse las células poco después.
Aunque las bacterias tienen muchas ventajas para la expresión
de proteínas heterólogas, existen varios tipos de limitación:
► p ro cesa m ien to p o stra d u ccion a l. La ausencia de patrones de
glucosilación o fosforilación normales en ciertas proteínas eu­
cariotas producidas en células bacterianas significa que las pro­
teínas se tornan inestables o no muestran actividad biológica o
tan sólo limitada.
► lo n g itu d d e la p ro teín a . Muchas proteínas eucariotas, en es­
pecial algunas proteínas de mamíferos, son mucho más grandes
que las proteínas bacterianas y no pueden sintetizarse con faci­
lidad en E. coli.
► doblamiento y solubilidad de la proteína. Con frecuencia, la
expresión excesiva conduce a la producción de cu erp o s d e in ­
clu sión -agregados insolubles de proteínas dobladas de modo
erróneo—. Los cuerpos de inclusión suelen purificarse con faci­
lidad, pero las más de las veces la proteína expresada sólo pue­
de solubilizarse con situaciones muy desnaturalizantes y un
problema crucial es entonces la forma de lograr el doblamien­
to eficiente in vitro.
Los esfuerzos para incrementar el rendimiento y la solubilidad han
incluido a menudo la producción de proteínas de fusión en las que
se acopla la proteína deseada a una proteína endógena, por ejemplo
proteína de unión de maltosa, tiorredoxina, ubiquitina, etc. Tam­
bién es común modificar los vectores de expresión de proteínas de
tal manera que se añade un marcador de afinidad, que ayuda a la
purificación del recombinante mediante cromatografía de afinidad.
Los dos sistemas favoritos son los siguientes:
► a fin id a d p o r G ST-glutatión. La transferasa de glutatión S
(GST) es una proteína pequeña con una gran afinidad por su
sustrato glutatión. Es posible generar una proteína de fusión
GTS (véase fig. 5-21B) y purificarla mediante enlace selectivo
a una columna que contiene glutatión.
► a fin id a d p o r p o lih istid in a -n íq u el. Las cadenas laterales de
ciertos aminoácidos, como la histidina, tienen una gran afinidad
por algunos iones metálicos. En este caso, los vectores de expre­
sión suelen conducir al acoplamiento de un marcador de afini­
dad de seis residuos consecutivos de histidina (véase fig. 5-23).
Las cadenas laterales del marcador (His)6 se enlazan de manera
selectiva y potente a iones de níquel, lo que contribuye a la pu­
rificación mediante cromatografía de afinidad con una matriz de
níquel-ácido nitrilotriacético.
Genotecas de expresión
En la clonación de expresión se usan muchas veces vectores plásmi-
dos porque es fácil trabajar con ellos y, si el objeto es expresar un
gen específico de interés, son los medios de elección. Sin embargo,
150 CAPITULO CINCO AMPLIFICACIÓN DEL DNA: CLONACIÓN DE DNA POR PCR Y BASADA EN CÉLULAS

A)
Fig. 5-21. Ejemplos de vectores de expresión bacteriana.

A) Vectores de expresión bacteriana pET-3. Es posible una expresión

de alto nivel mediante el promotor bacteriófago T7. El vector también
contiene una secuencia que codifica el péptido guía 10 del gen T7 y un
terminador 10 del gen T7 (T7 ter). Es posible la clonación en el sitio de
clonación Nde\ o BamH1. En este último se elabora una proteína de fu­
sión que contiene 13 aminoácidos en la terminal N a partir del gen 77 10
con la secuencia rápida T7, lo que asegura una traducción de alto nivel.
Se induce la expresión al añadir IPTG que promueve la expresión de un
gen de polimerasa de RNA T7 localizado dentro del cromosoma bacteria­
no modificado. RBS, sitio de unión del ribosoma. B) Vectores de fusión
génica pGEX-4T. Se localiza el sitio de clonación múltiple de tai manera
que se produzca una proteína de fusión después de la transcripción del
promotor tac, que comprende un componente terminal N de GST y un
componente terminal C de la proteína deseada. Primero en fcoR I, se
arreglan los sitios de clonación múltiple para pGEX-4T-1, -2 y -3 de tal
forma que sean posibles marcos de lectura de los tres aminoácidos.
Puede purificarse con facilidad la proteína de fusión GST en una columna
de purificación de afinidad de glutatión, como sefarosa de glutatión 4B, y
cortarse la proteína deseada en el sitio de corte de trombina.

B)
p G E X -4 T -1

T ro m b in a
¡L e u V a l P ro A rg J G ly S e r P ro G lu P h e P ro G ly A rg L e u G lu A rg P ro H is A rg A s p
C TG G TT C C G C G T G G A T C C .C C G G A A T T C C C G G G T C G A C TC G AG C G G C C G Q A T C G T G A C TG A
B am H I
...........................................
EcoRI
J Sal I
U______ ' N o ti Codones de
Sm a I Xho I
d e te n c ió n
P G E X -4 T -2

T ro m b in a
L e u V a l P ro A rg • G ly S e r P ro G ly lie P ro G ly Ser T h r A rg A la A la A la S e r
C TG G TT C C G C G T G G A T C C C C A G G A A TT C C C GGG TCG A C T C G A GCG G C C GCA, TC G TG A
B am H I EcoR I Sal I Not I C odón de
Sm a I Xho I
d e te n c ió n
P G E X -4 T -3

T ro m b in a
¡L e u Vai P ro A rg * G ly S e r P ro A s n S e r A rg V a l A s p S e r S e r G ly A rg IL e V al T h r A s p
C T G G T T C C G C G T G G A T C C , C C G A A T Tp
C C C G G iGiTZ-----
C G A C , T C G A p C G G C C G C ,A T C G T G A C T G A C T G A
B am H I E c o R I 11
-------------- 1O
Sn
all II L_ N o ti Codones de
Sm a I Xho I
d e te n c ió n

T ra n s fe ra s a
d e g lu ta tió n S
 5.6 | SISTEMAS DE CLONACIÓN DISEÑADOS PARA EXPRESAR GENES
n ocasiones la finalidad es generar un gran número de diferentes
-tembinantes como un recurso para expresión, una biblioteca de
acpresión. En estos casos tiene ventajas emplear vectores bacterió-
3 eos A. modificados porque es posible seleccionar con facilidad, en
—:nos comparativos, grandes números de recombinantes.
De manera característica, las genotecas de expresión se elaboran
a eionar cDNA de un tejido de interés con un vector X. como \gtl 1
: XZAP. Mediante exposición a anticuerpo es posible seleccionar fil-
■os que contienen colonias bacterianas individuales infectadas por
a i:'. A continuación pueden propagarse las bacterias que reaccionan
n rorma positiva para aislar la clona de cDNA y, a su vez, usarse la
^ona de cDNA aislada para seleccionar una biblioteca genómica a
sn de identificar el gen afín (cognate).
5.6.2 La exhibición de fago es una forma de clonación
de expresión en la que se expresan proteínas en
superficies de células bacterianas
L; exhibición de fago es una forma de clonación de expresión de
jenes extraños que utiliza un fago (véase Clackson y Wells, 1994).
Se aplican técnicas de ingeniería genética para insertar fragmentos
de DNA extraño en un gen fago con recubrimiento proteínico con­
veniente. En seguida puede expresarse el gen modificado como una
r roteína de fusión que se incorpora en el virión y se muestra en la
; jperficie del fago que, pese a ello, conserva su infectividad (fago
de fusión). Si se dispone de un anticuerpo para una proteína espe­
cifica, es posible seleccionar el fago que muestra esa proteína
mediante enlace preferencial al anticuerpo: puede lograrse la puri-
-.cación de afinidad de viriones que llevan un determinante blanco
de un exceso 108 veces del fago que no lleva el determinante, con
cantidades aun diminutas del anticuerpo importante.
De forma inicial, la exhibición de fago incluyó el uso de fagos
filamentosos, como fd, fl, M13, en los que se incorporaba el gen
extraño en un gen que especificaba una proteína de recubrimiento
menor, como la proteína del gen III (véase fig. 5-22). Se diseñaron
•arias aplicaciones útiles, como las siguientes:
► in geniería d e anticuerpo. Es probable que la exhibición de fago
sea una forma alternativa potente para elaborar anticuerpos, inclui­
dos los anticuerpos humanizados, lo cual evitaría la inmunización
e incluso la tecnología de hibridoma (véase Winter y cois., 1994);
► in gen iería g e n e r a l d e p roteín a s. La exhibición de fago es un
coadyuvante potente para programas de mutagénesis aleatoria
como un medio para seleccionar variantes deseadas de una bi­
blioteca de mutantes;
► estu d io d e in tera ccio n es p r o teín a co n p ro teín a . Esto incluye
un método basado en genotecas que puede emplearse para iden­
tificar proteínas que interactúan con una proteína determinada.
En la misma forma que suelen usarse anticuerpos en la selección
de afinidad, se utiliza como agente selectivo una proteína conve­
niente (o cualquiera otra molécula a la que pueda enlazarse una
proteína). La proteína puede seleccionar el fago de fusión que ex­
hibe cualquiera otra proteína que se enlaza en grado notorio a él.
5.6.3 La expresión génica eucaríota se lleva a cabo con
mayor fidelidad en líneas de células eucariotas
Es posible que las propiedades biológicas de muchas proteínas eu­
cariotas sintetizadas en bacterias no sean muy representativas de las
i 151
moléculas naturales por la falta de procesamiento postraduccional
normal y doblez incorrecto o ineficiente de la proteína. En tanto
que los sistemas bacterianos de expresión tienen la gran ventaja de
expresar la proteína a un nivel muy alto, las desventajas llevaron al
uso alternativo de células eucariotas huéspedes para la expresión
de proteína recombinante, incluidos insectos y mamíferos. Ade­
más de alojar la expresión de proteínas, las células de mamíferos
se usan a menudo como un medio para seleccionar los efectos de
manipulaciones in vitro en secuencias de control transcrípcionalesy
postranscripcionales.
Cuando se emplean líneas de células animales como células
huésped, es necesario considerar la forma en que debe llevarse el
DNA extraño al interior de las células huésped (véase recuadro 5-5
y cuadro 5-3) y la duración de la expresión. En este último caso,
son posibles dos tipos de sistemas de expresión:
► expresión transitoria. Se pretende que el DNA llevado por el
vector de expresión permanezca como un elemento genético
independiente dentro de las células transfectadas, un llamado
episoma, en lugar de integrarse en los cromosomas de la cé­
lula huésped. La expresión del transgén (cualquier gen intro­
ducido en células animales o de plantas) alcanza un nivel
máximo alrededor de dos a tres días después de la transfec-
ción del vector de expresión en la línea de células de mamífe­
ros, pero más adelante disminuye con rapidez la expresión
debido a la muerte celular o pérdida del elemento de expre­
sión formado;
► expresión estable. El DNA transportado por el vector de ex­
presión está diseñado para integrarse en los cromosomas de la
célula huésped. El establecimiento puede requerir alrededor de
un mes, pero una vez establecido deben hallarse los productos
de expresión en todas las células a condición de que el transgén
sea capaz de expresarse.
Expresión transitoria de proteínas de alto nivel en células de
insectos mediante baculovirus
La ex presión d e l g e n d e b a cu lo v iru s es un método difundido pa­
ra producir grandes cantidades de proteínas recombinantes en
células huésped de insectos y los rendimientos proteínicos son
mayores respecto de sistemas de expresión de mamíferos, en tan­
to que los costos son más bajos. En casi todos los casos, el pro­
cesamiento postraduccional de proteínas eucariotas expresadas
en células de insectos es similar al procesamiento de proteínas
que ocurre en células de mamíferos y es posible la expresión de
proteínas muy grandes. Como resultado, las proteínas generadas
en células de insectos tienen actividades biológicas y reactivida­
des inmunológicas comparables a las proteínas expresadas en cé­
lulas de mamíferos.
Para la expresión de proteínas, el baculovirus que se usa es el
virus de polihedrosis nuclear Autographa californica (AcMNPV),
que puede propagarse en ciertos líneas de células de insectos. La
proteína polihedrón viral se transcribe a índices altos y aunque es
esencial para la propagación viral en su hábitat normal, no se re­
quiere en cultivos. Como resultado, es posible reemplazar su se­
cuencia de codificación por la de una proteína extraña. El vector
de clonación está diseñado para expresar la potente proteína he-
teróloga del promotor polihedrina, con niveles consecutivos de
expresión que corresponden a más del 30% de la proteína total
de la célula.
152 IN< AMPLIFICACIÓN DEL DNA: CLONACIÓN DE DNA POR PCR Y BASADA EN CÉLULAS

Sitio d e Proteina de fusión ( a proteina del gen III

V M W vW
clonación
2 Transfectar • proteina extraña)
3 E. coli

etc. Ensam ble y

Conjunto obtención del fago
heterogéneo de Form a
secuencias de cDNA replicativa f,

R ecom binantes
Biblioteca
2 2 2 2 2 de fago
(solución
Añadir acuosa)
anticuerpo
específico
conjugado
con biotina
/ Ab2— B

Ab2 Ab2 Ab2 Ab2 Ab2 Ab2 Añadir

Eluir placa de
Fago purificado Petri C lave:
que expresa B B iotina
proteina 2 recubierta con
estreptavidina S Estreptavidina
y lavar
Enlace selectivo d e fago v_y A52 Anticuerpo
que reconoce
conjugado con biotina Enlace selectivo d e fago proteína 2
(que expresa proteína 2) q u e expresa proteína 2

Fig. 5-22. Exhibición de fago.

Se clona cDNA extraño dentro de vectores fago a fin de expresar proteínas extrañas en la superficie del fago. En este caso se inserta DNA en el gen III
del fago f1 (o M I3, fd), que codifica una proteína de recubrimiento de fago menor. El sitio de clonación está localizado en la región que especifica la se­
cuencia terminal N extrema de la proteína del gen III. Se produce una biblioteca de expresión de fago después de la transfección de E. coli, el ensamble
del fago, la expulsión de las células y la obtención del fago (véase asimismo fig. 5-18). Muchas veces pueden expresarse recombinantes con insertos
en el marco para obtener una proteína de fusión en la que el componente de la terminal N consiste en una secuencia proteínica extraña. Puede enlazarse
de modo específico un anticuerpo específico para una de las proteínas extrañas en el fago que muestra la secuencia, lo que conduce a su purificación.
Esta p u rifica ció n de a finidad permite reconocer secuencias cDNA que codifican una proteína de interés no caracterizada (véase Parmley y Smith, 1988).

Expresión transitoria en células de mamíferos
La expresión de proteínas de mamíferos en células de mamíferos tie­
ne la ventaja obvia de que no existe el problema de corregir el dobla-
miento de la proteína y la modificación postraduccional y es posible
analizar señales y efectos celulares corriente abajo. Los sistemas de
expresión estables en células de mamíferos (que se basan de forma
típica en secuencias de plásmidos integradas a cromosomas) propor­
cionan kilogramos de proteínas complejas en biorreactores de escala
industrial, pero habitualmente requirieron grandes inversiones en
tiempo, recursos y equipo. Como alternativa, se desarrollaron sistemas
de expresión transitoria a gran escala para producir proteínas recom­
binantes en células de mamíferos (Wurm y Bernard, 1999).
Además de llevar la expresión de la proteína, algunas líneas de
células de mamíferos han tenido aplicaciones mayores en la selec­
ción de los efectos de las manipulaciones in vitro en secuencias de
control transcripcionales y postranscripcionales. Un ejemplo ade­
cuado lo proporcionan las células COS, líneas estables de células
de riñón del mono verde africano que derivaron de la línea permi­
siva de células de simios SV40, CV-1. Cuando se infectan células
CV-1 con SV40, se presenta el ciclo lítico SV40 normal. Sin em­
bargo, Gluzman (1981) fue capaz de transformar células CV-1
después de integrar en el cromosoma de CV1 un segmento del ge-
noma SV40 que contenía un origen de replicación mutante.
Las células COS resultantes (CV1 con origen defectuoso de
SV40) expresan constitutivam ente (de manera estable) el antígeno
T grande codificado por SV40, la única proteína viral necesaria
para activar el origen de la replicación SV40. Al expresar el antí­
geno SV40 T grande en una forma estable, las células COS per­
miten introducir cualquier DNA circular con un origen de
replicación SV40 funcional a fin de replicar de forma indepen­
diente los cromosomas de la célula huésped, sin limitación clara
del tamaño. Cuando se transfectan vectores de expresión transito­
ria en células COS, no se obtienen líneas de células permanentes
porque la replicación masiva del vector determina que las células
no sean viables. Incluso aunque sólo se transfecte con éxito una
proporción baja de células, la amplificación del DNA introduci­
do a números considerables de copias en esas células compensa el
índice de captación bajo.
Expresión estable en células de mamíferos
Los transgenes pueden integrarse de manera estable en el DNA cro-
mosómico del huésped, pero el proceso es muy ineficiente y por esa
razón las células raras transformadas de modo estable deben aislar­
se del fondo de células no transformadas mediante selección para al­
gún marcador. Por lo regular se practican dos métodos amplios:
 5.6 | SISTEMAS DE CLONACIÓN DISEÑADOS PARA EXPRESAR GENES
Recuadro 5-5. Transferencia de genes a células anim ales cultivadas
Puede recurrirse a una diversidad de m étodos para transferir genes a
células humanas y animales, pero por lo general se agrupan en dos
clases:
► Transducción. Es la transferencia de genes que median los virus.
Ciertos virus de DNA y RNA animales infectan de manera natural a cé­
lulas humanas y de mamíferos. Las modificaciones de estos virus
permiten utilizarlos como vectores para transferir genes exógenos a
células blanco convenientes con una gran eficiencia. Proporcionan
sistemas de expresión transitoria que ofrecen la expresión de un gran
número de copias, como sucede en los vectores adenovirus, y siste­
mas de expresión estable, por ejemplo los basados en retrovirus, una
clase de virus de RNA cuyo ciclo de vida natural incluye la elabora­
ción de copias de cDNA que se integran en los cromosomas de la cé­
lula huésped (véase cuadro 5-3).
► Transfección. Es la transferencia de genes sin mediación viral. Cabe
señalar que el término translección es análogo al proceso de trans­
form ación en bacterias. Este último término no se aplica al proceso
de transferencia de genes en células animales por su nexo con un fe­
notipo alterado y un crecimiento no restringido (véase más adelante).
Los transgenes pueden transferirse por diferentes medios:
• con la utilización de vectores plásmidos no replicantes.
• con el empleo de vectores plásmidos con replicones virales.
Muchas veces se usan un replicón SV40 (como en las células
COS; véase sección 5.6.3), virus de Epstein-Barr (células huésped
humanas) o virus del papiloma bovino (células huésped de ratón).
► Se dispone de varios métodos de transfección que incluyen el uso de:
• Fosfato de calcio. El fosfato de calcio y el DNA forman copreci-
pitados en la superficie de las células blanco. La elevada concen­
tración del DNA en la membrana plasmática puede incrementar la
eficiencia de la transfección.
A) E s tru c tu ra lip o s ó m lc a
L íp id o
C) T ran sferir D N A
F o s fo líp id o s
153
• Liposomas (vesículas lipídicas artificiales) a los que se enlaza
DNA. Los liposomas pueden formarse de manera espontánea en
solución acuosa después de mezclar de modo artificial moléculas
de fosfolípidos. Los liposomas pueden fusionarse con la membra­
na plasmática y permitir así el acceso al interior de la célula (véa­
se la figura de abajo).
• Electroporación. Es un método difundido en el que se utiliza un
choque eléctrico para producir una despolarización temporal de la
membrana en las células blanco, lo que contribuye al paso de m o­
léculas de DNA grandes.
Sea mediante transducción o transfección, los genes que se transfieren a
células animales (o de plantas) se conocen com o Iransgenes y pueden
tener los diferentes destinos siguientes:
• Transgenes episómicos. Los transgenes que no se integran a los
cromosomas de la célula huésped pueden conservarse en el nú­
cleo en un estado extracromosómico (episoma). Sí se enlaza el
transgén a un vector con un origen de replicación que funciona en
la célula huésped, puede amplificarse, en ocasiones hasta un gran
número de copias. Si el transgén no se acopla a este origen de re­
plicación, persiste sólo un tiempo corto antes de diluirse (a medi­
da que se dividen las células huésped) y degradarse.
• Transgenes integrados. En algunos casos, los transgenes pue­
den integrarse a los cromosomas de la célula huésped y heredar­
se de manera estable. Por lo regular, este estado se describe
como transformación estable (nota: el uso estricto del término
transformación significa que se altera el fenotipo de la célula, de
tal form a que esta última adquiere características de crecimiento
no restringido) y la célula resultante se describe como una línea
celular. La integración es un proceso muy ineficiente y en conse­
cuencia las células transformadas, rara vez estables, deben ais­
larse del fondo de células no transformadas mediante selección
para algún marcador (véase texto).
B) L ip o s o m a s am ó n ic o s y c a tió n ic o s
L ip o s o m a s
a n ió n ic o s
L ip o s o m a s + | 11+
c a tió n ic o s + \ \ //+
F usión
C é lu la b la n co N ú c le o
154 CAPÍTULO CINCO AMPLIFICACIÓN DEL DNA: CLONACIÓN DE DNA POR PCR Y BASADA EN CÉLULAS

CCuadro 5-3. Sistemas de vector viral comunes para expresión en células de mamíferos.
Sistema vector basado en Límites de huéspedes y localización Otros comentarios

Adenovirus Límites amplios de huéspedes mamíferos; por lo general Tamaño del inserto sólo hasta 8 kb; nivel de expre­
episóm ico nuclear sión alto; títulos altos de virus recombinante

Virus adeno relacionado Límites amplios de huéspedes mamíferos; virus silvestre Tamaño del inserto sólo hasta 4.5 kb; requiere ade-
que se integra en el sitio específico en el cromosoma 19 novírus para empaque; expresión estable
humano

Epstein-Barr Se conserva como un episoma nuclear en seres humanos,

monos y perros pero casi nunca en roedores

Herpes simple Límites amplios de huéspedes mamíferos; Utico Tamaño del inserto hasta 150 kb; los virus recombi­
nantes se hacen deficientes para replicación mediante
la deleción de uno de los genes virales importantes

Papiloma Se conserva como un episoma nuclear en roedores (BPV) Se utiliza para el estudio de la regulación génica y la
o seres humanos y monos (HPV) expresión de transgén de alto nivel

Polioma Límites amplios de huéspedes mamíferos; puede integrarse Se replica mejor en células de ratón; se utiliza para
estudiar la regulación génica y la expresión de trans­
gén de alto nivel

Retrovirus Límites variables de huéspedes pero algunos tienen límites Tamaño del Inserto limitado al máximo de 8.5 kb; tí­
amplios de huéspedes mamíferos; se integra como copias tulos bajos de virus recombinante; expresión estable
de cDNA en los cromosomas del huésped

SV40 Límites amplios de huéspedes mamíferos; puede integrarse

pero es episóm ico en presencia del origen de replicación
SV40 junto con antígeno Tgrande

Vaccinia Limites amplios de huéspedes mamíferos; Utico Se usa sobre todo para la expresión excesiva de
transgén

Fig. 5-23. Un vector de expresión de mamíferos: pcDNA3.1/myc-HIS.

La serie pcDNA invitrógena de vectores de expresión plásmídos ofrece
una expresión constitutiva de alto nivel en células de mamíferos. Los
insertos de cDNA clonados pueden transcribirse del promotor potente
citomegalovirus (PCMV) (que asegura una expresión de alto nivel) con
un elemento de secuencia de poliadenílación de hormona del creci­
miento bovina (BGHpA) que permite generar un extremo 3 ' definido al
mRNA producido a partir del inserto. Un marcador génico neo (regu­
lado por un prom otor/intensificador SV40 y secuencia poli A) hace
posible la selección por crecimiento en G418. El polienlazador en la
parte superior contiene un sitio de clonación múltiple, seguido por se­
cuencias que especifican seis residuos de histidina consecutivos
(6xH ís ; tales residuos facilitan la purificación de la proteína recombi-
nante), un marcador epítopo m yc (que posibilita la selección mediante
anticuerpo de la proteína recombinante con un anticuerpo específico
para esta secuencia) y al final señales de terminación de la traduc­
ción. Los componentes para la propagación en E. c o li se indican en
amarillo Incluido un origen permisivo de replicación del plásmido Co-
IE1 (pUCori), un gen de resistencia a ampicilina (Amp) y un origen f1
que proporcionan una opción para producir recombinantes de cadena
única (sección 5.5.1).
 5.6 [ SISTEMAS DE CLONACIÓN DISEÑADOS PARA EXPRESAR
► co m p lem en ta ció n fu n c io n a l d e célu la s h u ésp ed m utantes.
Las células huésped son genéticamente deficientes en alguna
forma, pero puede restablecerse la función original mediante
un m a rca d o r en d ógen o. Es posible transferir el transgén y el
marcador en la forma de moléculas separadas por un proceso
conocido como cotransformación. Un ejemplo es el uso de
células que son deficientes, desde el punto de vista genético,
en cinasa de timidina (Tk ) y un marcador del gen Tk. Se re­
quiere TK para convertir la timidina en monofosfato de timi­
dina (TMP), pero también puede sintetizarse TMP mediante
la conversión enzimàtica a partir de dUME El fármaco a m i-
n op terin a bloquea la reacción dUMP->TMP y, por consi­
guiente, en presencia de este fármaco las células no pueden
crecer a menos que cuenten con alguna fuente de timidina y
un gen Tk funcional. Casi siempre es posible lograr la selec­
ción de células Tk+ en medio HAT (hipoxantina, aminopte-
rina, timidina);
Lecturas adicionales
Colosimo A, Goncz KK, Holmes AR et al (2000) Transfer and
expression of foreign genes in mammaiian cells. Biotechniques
29, 314-331
Higgins SJ, James BD (1999) Protein expression. A practical
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Ling MM, Robinson BH (1997) Approaches to DNA mutagenesis:
an overview. Anal Biochem. 254, 157-178
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Bibliografia
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Chen C, Batzer MA, de Jong P (1994) A new bacteriophage
P1-derived vector for the propagation of large human DNA frag­
ments. Nature Genet. 6, 84-89.
155
► uso d e m arcadores dom ina n tes seleccionables. La principal des­
ventaja de los marcadores endógenos es que sólo pueden utilizarse
en líneas de células huésped mutantes en las que el gen correspon­
diente no es funcional. Como resultado, se reemplazaron en gran
parte los marcadores endógenos por marcadores dominantes se­
leccionables que confieren un fenotipo que es por completo nue­
vo para la célula y por tanto puede usarse en cualquier tipo de
célula. Los marcadores de este tipo suelen ser genes de resistencia
a fármacos de origen bacteriano que pueden suministrar resisten­
cia a fármacos que afectan células eucariotas y bacterianas. Por
ejemplo, los antibióticos aminoglucósidos (entre ellos neom icinay
G418) inhiben la síntesis de proteínas en células bacterianas y eu­
cariotas. El gen de fosfotransferasa de neomicina (neo) confiere
resistencia a neomicina, G418, etc., y de esa manera pueden se­
leccionarse células que se transformaron con el gen neo para que
crezcan en G418. En la figura 5-23 se incluye un ejemplo de un
vector de expresión de mamíferos con un marcador neo.
Old RW, Twyman RM, Primrose SB (2001) Principles of Gene
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Biotechnol. 10, 156-159.
CAPÍTULO SEIS

Hibridación de ácido nucleico:

principios y aplicaciones

Contenido del capítulo

158 CAPÍTULO SEIS HIBRIDACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES
La hibridación de ácido nucleico es un medio fundamental en ge­
nética molecular que aprovecha la capacidad de las moléculas indi­
viduales de ácido nucleico de cadena única para formar moléculas
de cadena doble (es decir, hibridarse entre sí). A fin de que lo an­
terior suceda, las moléculas de cadena única que interactúan deben
tener un grado suficientemente alto de co m p lem en ta ried a d d e ba­
ses. Las valoraciones estándar de hibridación de ácido nucleico in­
cluyen el empleo de una son d a de ácido nucleico marcada para
identificar moléculas de DNA o RNA relacionadas (es decir, con
un grado considerable de similitud de secuencias) dentro de una
mezcla compleja de moléculas de ácido nucleico no marcadas, el
ácido nucleico b la n co (nota: blanco tiene un uso bastante distinto
en la clonación de DNA cuando suele referirse a fragmentos espe­
cíficos de DNA que se pretende amplificar por clonación).
6.1 Preparación de sondas de ácido
nucleico
En las valoraciones estándar de hibridación de ácido nucleico se
m a rca la sonda de alguna manera. Las sondas de ácido nucleico
pueden prepararse como moléculas de cadena única o de cadena
doble (véase fig. 6 - 1), pero la sonda de trabajo debe estar en form a de
cadena única.
Las sondas de DNA convencionales se aíslan mediante clona­
ción de DNA basada en células o por reacción en cadena de poli-
merasa (PCR). En ambas las sondas suelen ser de doble cadena al
inicio. El DNA clonado dentro de células puede variar de tamaño
de 0.1 kb a cientos de kilobases, pero el DNA clonado por PCR
suele tener menos de 1 kb de longitud. Casi siempre las sondas se
marcan incorporando dNTP marcados durante una reacción de
síntesis de DNA in vitro.
T ip o Dh>
I
O rigen D N A b a s a d o en cé lu la s,
c lo n a c k 5n o P C R
Por lo general cadena doble;
C a ra c te rís tic a s
0.1 kb a cientos d e kb para clonas
d e l m a teria l
de DNA conven fo n ales, 0.1 kb
d e inicio
a > 20 kb para pi oductos de PCR
Por lo general síntesis de cadena
M a rc a d o
de DNA basada en polimerasa de
DNA (véase fig. 6-12)
Fig. 6-1. Origen y características de sondas de hibridación de ácido nucleico.
Las sondas de RNA se derivan de moléculas de RNA de cadena
única por lo general de unos cuantos cientos de pb a varios kilobases
de largo. Pueden generarse de modo conveniente de DNA que se clo­
nó en un vector plásmido especializado que contiene una secuencia
promotora fago justo adyacente al sitio de clonación múltiple. Se lle­
va a cabo una reacción de síntesis de RNA con la polimerasa de RNA
fago importante y los cuatro rNTP, de los que cuando menos uno es­
tá marcado. A continuación pueden generarse transcritos de RNA
marcados específicos a partir del inserto clonado.
Las sondas de oligonucleótidos son de cadena única y muy
cortas (por lo general de 15 a 50 nucleótidos de largo). Se preparan
mediante síntesis química (a diferencia de otras sondas que se ori­
ginan de la clonación de DNA). Se añaden mononucleótidos, uno
a la vez, a un mononucleótido inicial, por convención el nucleóti-
do del extremo 3', que primero se enlaza a un apoyo sólido. Las
sondas oligonucleótidas casi siempre están diseñadas con una se­
cuencia específica que se elige en respuesta a información previa
respecto al DNA blanco. Sin embargo, en ocasiones se utilizan co­
mo sondas oligonucleótidos degenerados, que comprenden el
marcado de un grupo de oligonucleótidos relacionados que se sin­
tetizan en paralelo y que se diseñaron para ser idénticos en ciertas
posiciones de nucleótidos pero diferentes en otras. En consecuen­
cia las sondas oligonucleótidas se marcan al incorporar un átomo
de 32P o algún otro grupo marcado en el extremo 5’.
6.1.1 Los ácidos nucleicos pueden marcarse de manera
conveniente in vitro si se incorporan nucleótidos
modificados
Aunque el DNA y el RNA pueden marcarse in vivo mediante la
adición de desoxinucleótidos marcados a células de cultivos de te­
jidos, este procedimiento tiene un uso limitado. Un método mucho
Sondas de
h ib rid ació n
RNA O lig o n u c le ó tid o
Transcripción del
inserto d e DNA
clonado en S ín te sis q u ím ic a
vectores apropiados
C ad e n a única, casi
C a d e n a única;
siem pre hasta unos
p o r lo g e n e ra l
cu antos m iles d e
1 5 a 5 0 nt d e larg o
nucleótidos d e largo
Transcripción “corrida" M arcado final (p. ej., por
de DNA clonado cinasa de polinucleótldo;
(véase fig. 6-3) véase fig. 6-4)
 6.1
—-i: versátil comprende el marcado in v itro : DNA, RNA u oligo-
- -deótidos purificados se marcan in vitro con una enzima conve-
z_;nte para incorporar nucleótidos marcados. Se emplean con
¡jr.z'litud dos tipos principales de procedimientos:
► marcado de síntesis de cadena: es el método estándar de mar­
cado en el que se usa polimerasa de DNA o RNA para hacer co­
pias de DNA o RNA marcadas a partir de un DNA de inicio.
La reacción de síntesis de DNA o RNA in vitro requiere que
cuando menos uno de los cuatro nucleótidos precursores lleve
un grupo marcado. En condiciones normales el DNA se marca
con uno de tres métodos: muesca (wzf¿)-traducción, marcado
con cebamiento aleatorio o marcado mediante PCR. El marca­
do del RNA se logra con un sistema de transcripción in vitro;
► marcado final: es un procedimiento más especializado en el
que se añade un grupo marcado a sólo uno o unos cuantos nu­
cleótidos terminales. El marcado final es útil para marcar oligo-
nucleótidos de cadena única (véase más adelante) y en el m apeo
d e restricción . Ya que sólo se incorporan uno o unos cuantos
grupos marcados, la actividad específica del ácido nucleico
marcado (la cantidad de marcador incorporado dividida entre la
masa total) es inevitablemente mucho menor que la de las son­
das en que se incorporaron múltiples nucleótidos marcados en
toda la longitud de la molécula.
Marcado de DNA mediante muesca y traducción
El procedimiento de muesca y traducción consiste en introducir
roturas en muesca (nicks) de cadena única en el DNA, lo que deja
expuestas las terminales hidroxilo 3' y fosfato 5*. La muesca puede
hacerse al añadir una endonucleasa apropiada, como DN-asa pan­
creática. A continuación la muesca expuesta puede servir como un
punto de inicio para introducir nuevos nucleótidos en el lado hi­
droxilo 3' de la muesca mediante la actividad de polimerasa de
DNA de la polimerasa I de DNA de E. coli al tiempo que se elimi­
nan los nucleótidos existentes del otro lado de la muesca por me­
dio de la actividad de exonucleasa 5,->3 ’ de la misma enzima.
Como resultado, la muesca se mueve en forma progresiva a lo lar­
go del DNA (“se traduce”) en la dirección 5/_>3r (véase fig. 6-2A).
Si la reacción se efectúa a una temperatura hasta cierto punto baja
alrededor de 15°C), no prosigue más de una renovación completa
de la secuencia nucleótida. Aunque no ocurre una síntesis neta de
DNA a estas temperaturas, la reacción de síntesis permite incorpo­
rar nucleótidos marcados en el lugar de los no marcados previos.
Marcado de DNA con cebamiento aleatorio
El método de marcado de DNA con cebamiento aleatorio (que en
ocasiones se conoce como oligomarcado; véase Feinberg y Vogels-
tein, 1983) se basa en la hibridación de una mezcla de todos los po­
sibles hexanucleótidos: el DNA de inicio se desnaturaliza y luego se
enfría con lentitud de manera que hexanucleótidos individuales
puedan enlazarse a secuencias complementarias apropiadas dentro
de las cadenas de DNA. La síntesis de nuevas cadenas de DNA com­
plementarias se ceba por el enlace de hexanucleótidos y es cataliza­
da por la subunidad Klenow de la polimerasa I de DNA de R coli
(que contiene actividad de polimerasa en ausencia de actividad he-
xonucleasa 5'~k3' relacionada). La síntesis de DNA ocurre en pre­
sencia de los cuatro dNTP, de los que cuando menos uno tiene el
grupo marcado (véase fig. 6-2B). Este método produce DNA mar­
cados con actividad específica alta. Como en la mezcla de hexanu­
cleótidos están representadas todas las combinaciones de secuencias,
PREPARACIÓN DE SONDAS DE ÁCIDO NUC 159
el enlace del cebador a la plantilla de DNA ocurre en una forma
aleatoria y el marcado es uniforme en toda la longitud del DNA.
Marcado de DNA mediante PCR
Es posible modificar la PCR estándar para incluir uno o más pre­
cursores nucleótidos marcados que se incorporan en el producto de
la PCR en toda su longitud.
Marcado de RNA
Pueden obtenerse sondas de RNA (ribosondas) mediante la trans­
cripción in vitro de un inserto de DNA clonado en un vector plás-
mido conveniente con un promotor fago. Por ejemplo, el vector
plásmido pSP64 contiene la secuencia promotora SP6 de bacterió­
fago justo adyacente al sitio de clonación múltiple. Luego se em­
plea polimerasa de RNA SP6 para iniciar la transcripción desde un
punto inicial específico en la secuencia del promotor SP6 , transcri­
biendo por completo cualquier secuencia de DNA que se inserta en
los múltiples sitios de clonación. El uso de una mezcla de NTP, de
los que cuando menos uno está marcado, permite generar transcri­
tos radiomarcados de actividad específica (fig. 6-3). Los sistemas de
bacteriófago T3 y promotor T7/polimerasa de RNA también sue­
len emplearse para generar ribosondas. Es factible obtener riboson­
das de sentido y antisentido marcadas a partir de cualquier gen
clonado en estos vectores (el gen puede clonarse en una u otra de
las dos orientaciones) y se utilizan con amplitud en hibridación in
situ de tejidos (sección 6.3.4).
Marcado final
Por lo general los oligonuclétidos de cadena única se marcan con
cinasa de polinucleótido (marcado final con cinasa). El marcado
suele proporcionarse en forma de un 32P en la posición fosfato y de
ATP y el polinucleótido cataliza una reacción de intercambio con
fosfatos de la terminal 5’ (véase fig. 6-4A). Asimismo, puede usarse
marcado final en fragmentos de DNA más grandes, pero a menudo
por métodos alternativos, que incluyen:
► marcado final de relleno (fig. 6-4B): el DNA se trata con una
enzima de restricción apropiada que genera una saliente en el
extremo 5' y se recurre a una actividad de polimerasa para aña­
dir nucleótidos complementarios marcados a fin de “llenar” los
extremos cortados. Lo anterior suele lograrse al utilizar la su b u ­
n id a d K len ow de la polimerasa I de DNA de R coli (véase an­
tes). Según se requiera, los fragmentos marcados pueden cortarse
internamente con otra nucleasa de restricción con objeto de pro­
ducir dos fragmentos marcados en un extremo cada uno que
pueden fraccionarse de tamaño;
► marcado final de 5' mediado por cebador: es un método sim­
ple de PCR en el que se emplea un cebador con un grupo mar­
cado unido a su extremo 5’. Conforme la PCR procede, el
cebador con su extremo 5' marcado se incorpora en el produc­
to de la PCR.
6.1.2 Pueden marcarse ácidos nucleicos mediante
métodos isotópicos y no isotópicos
Marcado y detección isotópicos
Los ácidos nucleicos suelen marcarse mediante la incorporación de
nucleótidos que contienen radioisótopos. Estas sondas radiomar-
160 CAPÍTULO SEIS HIBRIDACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES

A) D N -a s a I

pApGpCpTpApCpGpApCpGpCpTpApTpT ,
pTpCpG pApTpG pCpTpGpCpG pApTpApA.

C o rte o D N -a s a I
m uesca p a n c re á tic a
pol I
OH P
pApG C p T p A p C p G p A p C p G p C p T p A p T p T ,
pTpCpG pApTpG pCpTpGpCpG pApTpApA.

1. 5 - 3 ' e x o n u c le a s a p o lim e ra s a I d e
2. 5 - 3 ' p o lim e ra s a D N A d e E. coli
, dATP, d C T P
I dG TP , d T T P
C o rte o
m uesca
oh p
_/ \
pApGpCpTpApCpG pApCpGpCpT A p T p T .
pTpCpG pApTpG pCpTpGpCpG pApTpApA.

B)

D e s n a tu ra liza r y a s o c ia r (anneal) en p re s e n c ia
I d e u n a m e z c la d e h e x a n u c le ó tid o s a le a to rio s
5 '. — — — — — 3'
I M S '
5' 5' 3'
3' ■ ¡M ■" I 5'
S u b u n id a d K len o w d e p o lim e ra s a D N A
+
dATP, d C T P
I dG TP, d T T P C lave:
T N ucleótido
i i 111i i 1111) 11in r m arcado
11 i 1 1
.T TT T f TT TT TT T T T.
5V - '> 3 5 '
3 '. L 3 5'

Fig. 6-2. Marcado de DNA mediante síntesis de cadenas de DNA in vitro.

A) Traslación de la muesca. La DN-asa I pancreática introduce muescas de cadena única mediante el corte de enlaces (p) fosfodiéster internos y genera
un grupo fosfato 5 ' y una terminal hidroxilo 3 '. La adición de la enzima multisubunidad polimerasa I de DNA de E. coli contribuye con dos actividades
enzimáticas: a) una exonucleasa 5 ' 3 ' ataca la terminal 5 ' expuesta de una muesca y elimina de modo secuencial nudeótidos en dirección 5 ' -> 3 ';
b) una polimerasa de DNA añade nuevos nudeótidos al grupo hidroxilo 39 expuesto, prosigue en la dirección 5' - * 3 ', y en consecuencia reemplaza los
nudeótidos eliminados mediante la exonucleasa y origina el desplazamiento lateral (traslación) de la muesca. B) M arcado cebado en form a aleatoria.
La subunidad Klenow de polimerasa I de DNA de E. coli puede sintetizar nuevas cadenas de DNA radiomarcadas utilizando como plantilla cadenas de
DNA separadas y cebadores exonucleótidos aleatorios.

cadas contienen nudeótidos con un radioisótopo (a menudo 32P,
33P, 35S o 3H), que pueden detectarse de modo específico en solu­
ción o, con mucho mayor frecuencia, dentro de un espécimen só­
lido (autorradiografía; véase recuadro 6 - 1).
La intensidad de una señal autorradiográfica depende de la in­
tensidad de la radiación emitida por el radioisótopo y del tiempo
de exposición, que a menudo puede ser largo (uno o más días, o
aun semanas en algunas aplicaciones). En valoraciones de hibrida­
ción de ácido nucleico se utiliza mucho 32P porque emite partícu­
las |3 de alta energía que proveen un alto grado de sensibilidad de
detección. Sin embargo, tiene la desventaja de que es hasta cierto
punto inestable (véase cuadro 6 - 1).
La energía alta de emisión de partículas beta de 32P puede ser
una desventaja en circunstancias en las que se requiere una resolu­
ción física fina para interpretar imágenes autorradiográficas sin am­
bigüedad. Por tanto en ciertos procedimientos suelen preferirse
radionúclidos que emiten partículas P menos energéticas, por
ejemplo, 35S y 33P en la secuenciación de DNA y la hibridación de
 6.1 ! PREPARACIÓN DE SONDAS DE ÁCIDO NUCLEICO 161

In icio d e tra n s c rip c ió n c o n S P 6

. ATTTAGGTGACACTATAG.I aMt A C AAGCTT.

_i i_______ i
P ro m o to r S P 6 H /n d lll
S itio d e clo n a c ió n m ú ltip le

L in e a riz a r co n e n z im a d e restricció n

I d is tal a p ro p ia d a , p. ej., PvuW

SP6
orí am p p ro In s e rto d e D N A
-fü — w sm m m nM -

l
P o lim e ra s a R N A S P 6
U TP — , CTP, G TP, ATP

AV
In s e rto d e D N A

TTT ,
T T TTTT
N u m e ro s o s tra n s c rito s C lave:
J L lim i»
d e R N A m a rc a d o s T N u c le ó tid o
T T T T T T ttT t
m a rc a d o
TT T T T T T T tT T T T .

Fig. 6-3. Se generan ribosondas (sondas de RNA) por repetición de la transcripción de insertos de DNA clonados en vectores plásmido
especializados.

El vector plásmido pSP64 contiene una secuencia promotora para polimerasa RNA del fago SP6 enlazada al sitio de clonación múltiple (SCM) además
de un origen de replicación (ori) y el gen de resistencia a ampicilina (amp). Después de clonar un fragmento conveniente de DNA en uno de los 11 sitios
únicos de restricción de SCM, el DNA recombinante purificado se lineariza mediante un corte con una enzima de restricción en un sitio de restricción
único justo distal al DNA insertado (en este ejemplo Pvu II). Luego pueden generarse transcritos de RNA marcados específicos de inserto con el uso de
polimerasa de RNA SP6 y una combinación de NTR de los que cuando menos uno está marcado (en este caso UTP).

Principios de la autorradiografía

Autorradiografía es un procedimiento para localizar y registrar un com ­
puesto radlomarcado dentro de una muestra sólida, y comprende la pro­
ducción de una Imagen en una emulsión fotográfica. En las aplicaciones
en genética molecular, la muestra sólida a menudo consiste en DNA de
tamaño fraccionado o muestras de proteínas embebidas en un gel seco,
fijados a la superficie de una membrana de nylon seca o un filtro de nitro-
celulosa, o localizados dentro de muestras de cromatina o tejidos fijados
en un portaobjetos de vidrio. Las emulsiones fotográficas son cristales
de halida argéntica en suspensión en una fase gelatinosa transparente.
Después una partícula (3 o un rayo -y emitido por un radionúclido pasa a
través de la emulsión, los Iones de Ag+ se convierten en átomos de plata
(Ag). La imagen latente resultante puede convertirse luego en otra visible
una vez que la imagen se revela, un proceso de amplificación en el que
cristales enteros de halida argéntica se reducen para proporcionar plata
metálica. El proceso de fijación da por resultado la eliminación de cual­
quier cristal de halida argéntica no expuesto y produce una imagen
autorradiográfica que brinda una representación bidimensional de la dis­
tribución del radiomarcador en la muestra original.
La autorradiografía directa consiste en colocar la muestra en contacto
íntimo con una placa de rayos X, una hoja de plástico con un recubrimien­
to de emulsión fotográfica; las emisiones radiactivas de la muestra pro­
ducen áreas oscuras en la placa revelada. Este método es más adecuado
para detectar radionúclidos de em isión p de potencia débil a media (p.
ej., 3H, 35S, etc.). Sin embargo, no es adecuado para partículas beta de
alta energía (p. ej., de 32P): estas emisiones pasan a través de la película
y causan el agotamiento de la mayor parte de la energía. La autorradio­
grafía indirecta es una modificación en la que una sustancia química
apropiada (centellador o flúor) convierte en luz la energía emitida. En un
método popular se utilizan pantallas de intensificación, hojas de un cen­
tellador Inorgánico sólido que se colocan atrás de la placa en casos de
muestras que emiten radiación de alta energía, como 32P Las emisiones
que pasan a través de una emulsión fotográfica son absorbidas por la
pantalla y convertidas en luz. La imagen se intensifica si se superpone
con efectividad una emisión fotográfica sobre la emisión autorradiográfi­
ca directa.
162 CAPITULO SE IS HIBRIDACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES

A) 5 '( P t □ 3'
32
C in a s a d e
A ' p - p ®
p o lin u c le ó tid o

a< p x s x p ) ^
^ 32
H 3'
& =

B) D N A se lec cio n ad o

D ig e rir co n n u c le a s a d e res tricció n p a ra

fo rm a r sa lie n te s 5 ’ (p. ej., E c o R I)

5' AA TTC C □ G 3'

G C □ CTTAA 5'

P o lim e ra s a D N A K len o w
+
I dATP — , d T T P
TT
5' A A T T C r ---------1 G A A T T 3'
TTAAG C I ZZZ1 C T T A A 5'
11
C o rte co n n u c le a s a d e restricció n en un sitio intern o
p a ra o b te n e r fra g m e n to s d e d ife re n te s ta m a ñ o s
I
TT C lav e:
5' A A TTC G AATT
T N u cleó tid o
T T A A G r... -— CTTAA
m a rc a d o
11 P u rific ar P u rific ar

Fig. 6-4. Marcado final de ácidos nucleicos.

A) M arcado fin a l de oligonucleótidos con cinasa. El fosfato de la terminal 5 ' del oligonucleótido se reemplaza en una reacción de intercambio por
el fosfato 7 de [-y-32P] ATP marcado con 32R El mism o procedimiento puede emplearse para marcar las dos terminales 5 ' de DNA de doble cadena.
B) M arcado fin a l con rellenado. El DNA de interés se corta mediante una nucleasa de restricción apropiada para generar salientes 5 '. Las salientes
actúan como un cebador para polimerasa de DNA Klenow a fin de incorporar nucleótidos marcados complementarios a las salientes. Los fragmentos
marcados en un extremo sólo pueden generarse mediante el corte interno con una enzima de restricción apropiada para generar dos fragmentos de
distinto tamaño que se fraccionan de tamaño con facilidad.

( «adro 6 - Características de radioisótopos que se utilizan con frecuencia para marcar sondas de DNA y RNA.
Radioisótopo Vida media Tipo de descomposición Energía de emisión

H 12.4 años 0.019 Mev

32P 14.3 días 1.710 Mev

33p 25.5 días 0.248 Mev
35S 87.4 días 0.167 Mev
 6.2 ¡ PRINCIPIOS DE LA HIBRIDACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO
tcj idos in situ, y 3H para la hibridación cromosómica in situ. 35S y
B p
tienen vidas medias moderadas. 3H posee una vida media muy
r::>:ongada pero no constituye una ventaja por la energía compara-
—imente baja de las partículas (3 que emite, que requiere tiempos
de exposición muy prolongados.
Los nucleótidos marcados con 3~P y 33P que se usan en las reac-
- : nes de marcado durante la síntesis de la cadena de DNA tienen
d radioisótopo en la posición fosfato alfa, porque los fosfatos P y y
ir los precursores de dNTP no se incorporan en la cadena de DNA
crecimiento. Sin embargo, en el marcado final mediado por ci-
^isa, se emplea ATP [~y—32P] (fig. 6-4A). En nucleótidos marcados
con 35S que se incorporan durante la síntesis de cadenas de DNA o
RNA, el NTP o el dNTP lleva un isótopo 35S en lugar del O del
pupo fosfato a . Los nucleótidos marcados con 3H portan el radio-
totopo en varias posiciones. La detección específica de moléculas
que tienen un radioisótopo se realiza con mayor frecuencia por auto-
radiografía (véase recuadro 6 - 1).
Marcado y detección no isotópicos
Los sistemas de marcado no isotópicos incluyen el uso de sondas no
radiactivas y tienen aplicaciones amplias en una variedad de áreas
Kricka, 1992). Se efectúan dos tipos principales de marcado no ra­
diactivo:
► marcado no isotópico directo: se incorpora un nucleótido que
contiene un grupo marcado unido. Con frecuencia estos siste­
mas comprenden la incorporación de nucleótidos modificados
que contienen un fluoróforo, un grupo químico que puede
fluorescer cuando se expone a luz de cierta longitud de onda
(véase fig. 6-5 y recuadro 6-2).
► marcado no isotópico indirecto, que suele caracterizarse por
el acoplamiento químico de una molécula rastreadora modifi­
cada a un precursor nucleótido. Tras incorporarse en el DNA,
los grupos rastreadores pueden unirse de modo específico me­
diante una molécula de afinidad, una proteína u otro ligando
que tiene una afinidad muy alta por el grupo rastreador. Con­
jugado a la molécula de afinidad se encuentra una molécula o
un grupo marcador que puede detectarse en una valoración
apropiada (fig. 6 -6 ). Las moléculas rastreadoras en nucleótidos
modificados deben sobresalir bastante de la estructura básica de
ácido nucleico a fin de facilitar su detección por la molécula de
afinidad y por consiguiente se requiere un átomo de carbono es­
p a cia d o r largo para separar el nucleótido del grupo rastreador.
Se utilizan de manera amplia dos sistemas de marcado no isotópi­
co indirecto:
► el sistema biotina-estreptavidina emplea la afinidad en extre­
mo alta de dos ligandos: la b io tin a (una vitamina que ocurre de
manera natural), que actúa como rastreador, y la proteína bac­
teriana estrep tavidin a , que es la molécula de afinidad. La bio­
tina y la estreptavidina se unen entre sí en una forma muy
estrecha con una constante de afinidad de 10 l4, una de las más
potentes que se conocen en biología. Pueden prepararse con fa­
cilidad sondas biotinadas con la inclusión de un nucleótido bio-
tinado apropiado en la reacción de marcado (véase fig. 6-7).
► la digoxigenina es un esferoide (que se obtiene de la planta Di-
gitalis) contra el que se elaboró un anticuerpo específico. El an­
ticuerpo específico de la digoxigenina permite detectar
moléculas de ácido nucleico que incorporaron nucleótidos que
contienen el grupo rastreador digoxigenina (véase fig. 6-7).
163
Es posible conjugar una diversidad de grupos o moléculas marcado­
ras a moléculas de afinidad como la estreptavidina o el anticuerpo
específico de digoxigenina. Abarcan varios flu o r ó fo r o s (recuadro
6 -2 ) o enzimas, como fosfatasa alcalina y peroxidasa, que posibili­
tan la detección mediante valoraciones colorimétricas o químicas
de luminiscencia, entre otras.
6.2 Principios de la hibridación
de ácido nucleico
La hibridación de ácido nucleico es una técnica fundamental en ge­
nética molecular. El recuadro 6-3 presenta un glosario de los térmi­
nos importantes a fin de ayudar a los lectores que tal vez no estén
familiarizados con la terminología.
6.2.1 La hibridación de ácido nucleico es un método
para identificar moléculas relacionadas en forma
cercana dentro de dos poblaciones de ácido
nucleico
Definición y justificación
El propósito usual de la hibridación de ácido nucleico es obtener
información de una población de ácidos nucleicos (el blanco) que
no se com prende a la perfección y que por lo general es compleja. Se
logra mediante el uso de una población conocida de moléculas de
ácido nucleico como una sonda con objeto de identificar ácidos
nucleicos relacionados cercanamente dentro del blanco.
La especificidad de la interacción entre la sonda y el blanco pro­
viene de la co m p lem en ta ried a d d e bases, porque ambas poblacio­
nes se tratan de manera tal que asegura que todas las secuencias de
ácido nucleico presentes sean de cadena única. Por consiguiente, si
la sonda o el blanco iniciales son de doble cadena, es necesario se­
parar las cadenas individuales (desn atu ra lizarlas), casi siempre
por calentamiento o tratamiento alcalino. Después de mezclar las
cadenas únicas de la sonda con las cadenas únicas del blanco, se
permite que se “rea so cien ” (t s decir, que se fijen entre sí [rean n eal])
cadenas con secuencias de bases complementarias para formar áci­
dos nucleicos de doble cadena. Cuando lo anterior ocurre se for­
man dos tipos de productos:
► homodúplex: cadenas complementarias dentro de la sonda o
dentro del blanco que se “reasocian” (reanneal) a fin de regene­
rar moléculas de doble cadena que originalm ente se encontraban
en las poblaciones de la sonda o el blanco;
► heterodúplex: un ácido nucleico de cadena única dentro de los
pares de bases de la sonda con una cadena complementaria en
la población blanco. El ácido nucleico de doble cadena que se
forma en este caso es una combinación nueva de cadenas de áci­
do nucleico. Los heterodúplex definen la utilidad de una valo­
ración de hibridación de ácido nucleico porque el objeto total
de la valoración de hibridación es usar la sonda conocida para
identificar fragmentos de ácido nucleico relacionados en el
blanco (fig. 6 - 8 ).
A menudo las sondas son poblaciones de ácido nucleico homogé­
neas (p. ej., un DNA clonado específico o un oligonucleótido sin­
tetizado por medios químicos) y por lo general están marcadas y en
solución. En contraste, las poblaciones de ácido nucleico blanco
son poblaciones complejas no marcadas y suelen enlazarse a un
164 CAPITULO SEIS HIBRIDACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES

B)
A

F u e n te lu m in o s a,
p. ej., lá m p a ra d e
v a p o r d e m e rcu rio

Fig. 6-5. Microscopía de fluorescencia y estructura de fluoróforos frecuentes.

A) Estructura de fluoróforos. El ejemplo de la parte superior muestra fluoresceína-dUTR El grupo de fluoresceína está unido al átomo de carbono 5' de
la uridina por un grupo espaciador de manera que cuando el nucleótido modificado se incorpora en el DNA, el grupo de fluoresceína es fácilmente
accesible. Abajo se encuentra la estructura de la rodamina de la que se derivó una variedad de fluoróforos. B) M icroscopía de fluorescencia. El filtro de
excitación es un filtro de barrera de color que en este ejemplo se eligió para dejar pasar sólo luz azul. La luz azul transmitida tiene una longitud de onda
apropiada para reflejarse con el espejo dicroico (división del haz) hacia la muestra marcada que después fluoresce y emite luz de una longitud de onda
más larga, en este caso luz verde. La longitud de onda más larga de la luz verde emitida significa que pasa en form a directa a través del espejo dicroico.
A continuación la luz pasa a través de un segundo filtro de barrera de color que bloquea las señales fluorescentes Indeseables y deja que la emisión de
fluorescencia verde deseada pase a través del ocular del microscopio. Un segundo dispositivo de división del haz también puede permitir registrar la luz
en una cámara de dispositivo cargado acoplado (DCA).
 6.2 I PRINCIPIOS DE LA HIBRIDACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO 165

5 ' ---------------------------------------------------- 3 '

3 ' -------------------------------------------5'

Marcado de DNA „
..... . Acoplam iento de grupo de
con nuc eotido marcado aue r. . .
. , ,4 afinidad y grupo marcador
lleva un grupo rastreador ■

1 1
9 R 9 ® ? { }

Enlace del grupo de afinidad al rastreador

“ “ “ “

3 ' --------------------------------------------------------------------------------------- I '

i
Detección del marcador mediante
Clave

r Grupo rastreador
f a Grupo de afinidad
H Marcador
valoración fluorim étrica/valoración
enzimàtica, etcétera

Fig. 6-6. Principios generales del marcado no isotópico indirecto.

Con frecuencia la proteína que el grupo rastreador reconoce es un anticuerpo específico, como en el sistema de digoxigenina, o cualquier otro ligando
que tiene una afinidad muy alta para un grupo específico, como la estreptavidina cuando se utiliza biotina como rastreador (véase fig. 6-7). El marcador
puede detectarse de varias maneras. Si lleva un colorante fluorescente específico, es posible detectarlo en una valoración fluorimétrica. De manera
alternativa, puede ser una enzima como fosfatasa alcalina, que suele acoplarse a una valoración enzimàtica y proporciona un producto factible de medir
por medios colorimétricos.

apoyo sólido. Sin embargo, algunas valoraciones de hibridación im­
portantes utilizan sondas no marcadas enlazadas a un apoyo sólido
para interrogar poblaciones de DNA blanco marcadas en solución.
Temperatura de fusión y rigor de la hibridación
La desnaturalización de sondas de DNA de doble cadena suele lo­
grarse calentando una solución del DNA marcado a una tempera­
tura lo bastante alta para romper los enlaces de hidrógeno que unen
entre sí las dos cadenas complementarias de DNA. La energía ne­
cesaria para separar dos cadenas perfectamente complementarias de
DNA depende de varios factores, en especial:
► lo n g itu d d e la ca d en a : los homodúplex largos contienen un
gran número de enlaces de hidrógeno y se requiere más energía
para separarlos; como por lo general el procedimiento de mar­
cado produce sondas de DNA cortas, este aspecto es insignifi­
cante por arriba de una longitud original (es decir, anterior al
marcado) de 500 pb;
► com p o sición d e bases: los pares de bases GC tienen un enlace
más de hidrógeno que los pares de bases AT. En consecuencia
las cadenas con un porcentaje de composición GC alto son más
difíciles de separar que las que tienen una composición de GC
de un porcentaje bajo;
► a m b ien te q u ím ico: la presencia de cationes monovalentes (p.
ej., iones Na+) estabiliza el dúplex, en tanto que ciertas molécu­
las muy polares, como la fo r m a m id a (H-CO-NH3+) y la u rea
(H-jN -C O -N H j ), actúan como desnaturalizantes quími­
cos: desestabilizan el dúplex al alterar los enlaces de hidrógeno
entre pares de bases .
Una medida útil de la estabilidad de un dúplex de ácido nucleico
es la temperatura de fusión ( Tm). Ésta es la temperatura que co­
rresponde al punto medio en la transición de la forma de doble ca-
166 CAPÍTULO SEIS HIBRIDACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES
Sistemas de marcado y detección con fluorescencia
El marcado fluorescente de ácidos nucleicos se desarrolló en la década
de 1980 y su gran valor se demuestra en muchas aplicaciones distintas,
que incluyen hibridación cromosómica in situ, hibridación in situ de tejidos
y secuenciación automatizada de DNA. Los marcadores fluorescentes
pueden usarse en el marcado directo de ácidos nucleicos incorporando
un nucleótido modificado (con frecuencia 2 ’ desoxiuridina 5 ' trifosfato)
que contiene un fluoróforo apropiado, un grupo químico que fluoresce
cuando se expone a una longitud de onda luminosa específica. Los fluo-
róforos populares que se emplean en el marcado directo comprenden:
fluore sceín a, un colorante fluorescente verde pálido; rodam ina, un colo­
rante fluorescente rojo, y am ino m etilcum arina. un colorante fluorescente
azul (véase fig. 6-5A). Asimismo, pueden utilizarse sistemas de marcado
indirecto mediante los cuales nucleótidos modificados que contienen un
grupo rastreador (como biotina o digoxigenina) se incorporan en ácido
nucleico (véase fig. 6- 6) y luego el grupo rastreador se enlaza en forma
específica mediante una molécula de afinidad (como estreptavidina o un
anticuerpo específico a digoxigenina) al que se fija un fluoróforo, por
ejemplo, ácido acético am inom etilcum arina (AAMC), isotiocianato de
fluoresceína (ITCF) u otros derivados de la fluoresceína e isotiocianato
de tetrametilrodamina (ITCTR) u otros derivados de la rodamina.
La detección del fluoróforo en sistemas de marcado directo o indirecto se
efectúa pasando un haz de luz de una fuente luminosa adecuada (p. ej.,
una lámpara de vapor de mercurio en microscopía de fluorescencia, un
láser de argón en la secuenciación automatizada de DNA) a través de
dena a la de cadena única. Esta transición puede seguirse de modo
conveniente si se mide la densidad óptica (DO) del DNA. Las ba­
ses de los ácidos nucleicos absorben con potencia luz ultravioleta
(UV) de 260 nm. Sin embargo, la adsorción por DNA de doble ca­
dena es bastante menor que la de los nucleótidos libres. Esta dife­
rencia, el llamado efecto hipocrómico, se debe a interacciones
entre los sistemas de electrones de bases adyacentes, que provienen
de la forma en que bases adyacentes se apilan en paralelo en una
doble hélice. Por tanto, si el DNA dúplex se calienta de manera gra­
dual, habrá un incremento de la luz que se absorbe a 260 nm (la
DO260) hacia el valor característico de las bases libres. La tempera­
tura a la que se halla un punto medio en el cambio de la densidad
óptima se considera entonces la Tm (véase fig. 6-9).
En genomas de mamíferos, con una composición de bases apro­
ximada de 40% de GC, el DNA se desnaturaliza con una Tm cer­
cana a 87°C bajo condiciones más o menos fisiológicas. La Tm de
híbridos perfectos formados por DNA, RNA o sondas oligonucleó-
tidas puede determinarse según la fórmula que se presenta en el
cuadro 6-2. A menudo se eligen condiciones de hibridación que
permitan promover la formación de heterodúplex y la temperatura
de hibridación suele ser hasta 25°C menor que la Tm. No obstan­
te, después de la hibridación y la eliminación del exceso de sondas
pueden realizarse lavados de hibridación bajo condiciones más rígi­
das para alterar todos los dúplex además de los que se encuentran
entre secuencias relacionadas de manera muy cercana.
Los heterodúplex sonda-blanco poseen una termodinámica
muy estable cuando la región de la formación dúplex contiene ba­
ses perfectamente compatibles. Las incompatibilidades entre las
dos cadenas de un heterodúplex reducen la Tm: para sondas norma­
les de DNA, cada 1% de incompatibilidad reduce la Tm alrededor
de 1°C. Aunque los heterodúplex sonda-blanco no suelen ser tan
un filtro de color apropiado (filtro de excitación) diseñado para transm itir
luz a la longitud de onda de excitación deseada. En sistemas de m icros­
copía de fluorescencia esta luz se refleja sobre la muestra marcada con
fluorescencia en un portaobjetos para m icroscopio por medio de un es­
pejo dicroico, que refleja luz de ciertas longitudes de onda en tanto per­
mite que la luz de otras longitudes de onda pase de modo directo a través
de él. A continuación la luz excita el fluoróforo para que fluoresca y al ha­
cerlo emite luz de una longitud de onda un poco más larga, la longitud de
onda de emisión. La luz emitida por el fluoróforo regresa y pasa directa­
mente por el espejo dicroico, a través de un filtro de barrera apropiado, y
después se transmite al ocular del microscopio, y también puede captu­
rarse con una cámara de DCA (dispositivo cargado acoplado). A conti­
nuación se indican las longitudes de onda de emisión y excitación
máximas de fluoróforos usuales:
Fluoróforo Color Excitación máxima Emisión máxima
(nm) (nm)
AMCA Azul 399 446
Fluoresceína Verde 494 523
CY3 Rojo 552 565
Rodamina Rojo 555 580
Rojo Texas Rojo 590 615
estables como las sondas homodúplex reasociadas (reannealed), es
posible tolerar un grado considerable de incompatibilidad si la re­
gión total de complementariedad de bases es larga (> 100 pb; véa­
se fig. 6 - 10 ).
El incremento de la concentración de NaCl y la disminución de
la temperatura reducen el rigor de la hibridación y mejoran la es­
tabilidad de hetereodúplex incompatibles. Ello significa que pue­
den identificarse miembros comparativamente divergentes de una
familia multigénica o de otra familia de DNA repetido por hibri­
dación si se utiliza como sonda un miembro específico de la fami­
lia. Además puede emplearse como sonda una secuencia génica de
una especie a fin de identificar homólogos en otra especie divergen­
te, a condición de que la secuencia se conserve de modo razonable
durante la evolución.
También es posible elegir condiciones para maximizar el rigor
de la hibridación (p. ej., disminuir la concentración de NaCl e in­
crementar la temperatura), con objeto de fomentar la disociación
(desnaturalización) de heterodúplex incompatibles. Si la región de
complementariedad de bases es pequeña, como en las sondas de oli-
gonucleótidos (casi siempre 15 a 20 nucleótidos), pueden elegirse
condiciones de hibridación de tal índole que una incompatibilidad
aislada torna inestable un heterodúplex (véase sección 6 .3 . 1).
6.2.2 Las cinéticas de reasociación de DNA se definen
mediante el producto de la concentración de 0NA
y el tiempo (C0t)
Cuando se desnaturaliza DNA de doble cadena (p. ej., por calor) y
se permite que la complementariedad de cadenas únicas se asocie
de nuevo (reasocie) para formar DNA de doble cadena, la rapidez
 6.2 PRINCIPIOS DE LA HIBRIDACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO 167

CH, O
OH 3
CH
E s p a c ia d o r C 1 1 3ÍH
O O OH
•H. II II
> / C H = C H - C H 2- N H - C - ( C H 2) 5- N H - C - C H 2 G ru p o ra s tre a d o r
N
I II d e d ig o x ig e n in a
CH

-C H ,
I
D ig o xig en in a-11 -d U T P |
«N?
' c - cV
I I
OH H G ru p o
r a s tre a d o r
O
II
d e b io tin a C
E s p a c ia d o r C 1 6 HN NH
\ /
O C H -C H
H„ / \
.. w C H = C H - C H 2- N H - C - ( C H 2) 3- N H - C - ( C H 2) 3- N H - C - ( C H 2)4- C H CH
N L» \ /
I II s C la v e :
X CH
E n la c e p o te n c ia l d e
® ® ® -c h 2 h id ró g e n o en p a re a -
I m ie n to d e ba se s
C "H H B io tin a -1 6 -d U T P
c u a n d o se in c o rp o ra
C —C" en d o b le h é lic e
I I
OH H

Fig. 6-7. Estructura de nucleótidos modificados con digoxigenina y biotina.

Obsérvese que los grupos digoxigenina y biotina de estos ejemplos están unidos al átomo de carbono 5 ' de la uridina de dUTP mediante grupos
espaciadores que consisten respectivamente de un total de 11 átomos de carbono (digoxigenina-11-UTP) o 16 átomos de carbono (biotina-16-dUTP).
Los grupos digoxigenina y biotina son grupos rastreadores: tras su incorporación en un ácido nucleico se enlazan mediante ligandos específicos que
contienen un marcador unido, como un fluoróforo.

con que las cadenas complementarias se “reasocian” depende de la
concentración inicial del DNA. Si la concentración de secuencias
complementarias de DNA es alta, se reducirá el tiempo que se re­
quiere para que cualquier molécula de DNA de cadena única en­
cuentre una cadena complementaria y forme un dúplex. Cinética
de reasociación es el término que se usa para medir la rapidez a la
que son capaces de encontrarse entre sí moléculas complementarias
de cadena única y formar un dúplex. Existen dos parámetros prin­
cipales: la concentración de inicio (C0) de la secuencia específica de
DNA en moles de nucleótidos por litro y el tiempo de reacción (í)
en segundos. Si se toma en cuenta que el ritmo de reasociación es
proporcional a C0 y t, el valor C0t (que en ocasiones se denomina
valor cot) es una medida útil. El valor CBt también varía según la
temperatura de reasociación y la concentración de cationes mono­
valentes. Como resultado, es usual emplear el valor de referencia fi­
jo: una temperatura de reasociación de 65°C y una concentración
[Na+] de 0.3 M de NaCl.
Casi todas las valoraciones de hibridación utilizan un exceso de
ácido nucleico blanco comparado con el de la sonda a fin de esti­
mular la unión de la sonda con el blanco. Esto se debe a que la son­
da suele ser homogénea y con frecuencia consiste en un tipo aislado
de molécula de DNA o molécula de RNA clonada, pero por lo ge­
neral el ácido nucleico blanco es heterogéneo y comprende, por
ejemplo, DNA genómico o RNA celular total. En el último caso la
concentración de cualquier secuencia puede ser muy baja y en con­
secuencia dar lugar a un ritmo de reasociación lento. Por ejemplo,
si en una Southern blot se utiliza un gen de globina (3 clonado como
sonda para identificar secuencias complementarias en el DNA ge­
nómico humano, este último se encontrará en una concentración
muy baja (el gen de globina (3 es un ejemplo de una frecuencia de
copia única y en este caso sólo representa 0.00005% del DNA ge­
nómico humano). Por tanto es necesario usar varios microgramos
de DNA blanco para impulsar la reacción. En contraste, algunas
otras secuencias están muy repetidas en el DNA genómico (véase
cap. 9) y esta concentración muchísimo mayor de DNA produce
un tiempo de reasociación rápido.
Como la cantidad de ácido nucleico blanco que enlaza una son­
da depende del número de copias de la secuencia reconocida, la in­
tensidad de la señal de hibridación es proporcional al número de
copias de la sustancia reconocida: genes con copia única dan señales
de hibridación débiles, secuencias de DNA muy repetidas propor­
cionan señales muy potentes. Si una sonda particular es heterogé­
nea y contiene una secuencia de interés de copias bajas (como un
gen específico), mezclada con una secuencia de DNA repetida muy
abundante, la señal potente del DNA repetido ocultará por com­
pleto la señal de hibridación débil que se obtiene con la secuencia
de copias bajas. Sin embargo, este efecto puede evitarse mediante la
h ib rid a ció n d e co m p eten cia (véase recuadro 6 -3 ).
168 CAPÍTULO SEIS HIBRIDACIÓN DE ACIDO NUCLEICO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES
Glosario de hibridación de ácido nucleico (para métodos individuales, véase el recuadro 6-4)
Hibridación de oligonucleótido específica de alelo (OEA). Se utilizan
sondas de oligonucleótidos cortas de ca. 20 nucleótidos de largo especí­
ficas para alelos individuales bajo condiciones de hibridación rígidas en
las que la incompatibilidad de una base impide la hibridación satisfacto­
ria. Véase figura 6-11.
Asociación (anneal). Dos ácidos nucleicos de cadena única que compar­
ten suficiente complementariedad de bases formarán un dúplex de DNA
de doble cadena. Asociar significa permitir que se formen enlaces de hi­
drógeno entre dos cadenas únicas y en consecuencia tiene significado
opuesto a desnaturalizar.
Complementariedad de base. Grado al que las secuencias de dos ácidos
nucleicos de cadena única pueden form ar un dúplex de DNA mediante el
pareamiento de bases Watson-Crick (sección 1.2.1).
Hibridación de competencia ( = hibridación de supresión). Reacción de
hibridación en la que una sonda que contiene algunas secuencias de DNA
repetidas sufre un paso de prehibridación para bloquear el acceso a se­
cuencias repetidas en la sonda. Esta última se desnaturaliza primero y se
permite que se reasocie en presencia de una población de DNA no mar­
cada que se enriqueció con DNA repetido: como resultado los elementos
repetidos dentro de la sonda se eliminan con efectividad por fijación a se­
cuencias de DNA repetidas complementarias y dejan disponibles sólo las
secuencias no repetidas.
Desnaturalizar. Separar las cadenas individuales de un DNA dúplex de
doble cadena mediante la rotura de los enlaces de hidrógeno entre ellas
(por calentamiento o tratamiento con un desnaturalizante químico, como
formamida).
Hibridación de fluorescencia in situ (HFIS). Cualquier reacción de hibri­
dación in situ en la que se marcan ácidos nucleicos por fijación de gru­
pos químicos que pueden fluorescer bajo ciertas longitudes de onda.
Heterodúplex. DNA de doble cadena que se form a cuando se permite que
dos secuencias de cadena única con complementariedad de bases par­
cial se asocien (anneal). Los heterodúplex pueden surgir en diferentes for­
mas:
► heterodúplex alélicos. La desnaturalización seguida del enfriamiento
de una muestra de DNA diploide única o una mezcla de muestras de
DNA de diferentes individuos permitirá que cadenas complementarias
de dos alelos que defieren un poco en la secuencia de DNA formen
dúplex compatibles casi a la perfección;
► heterodúplex paralogos. La desnaturalización seguida del enfria­
miento de una muestra de DNA aislada de una célula eucariota com ­
pleja también puede originar la reasociación entre secuencias de DNA
relacionadas no alélicas como los miembros diferentes relacionados
en form a cercana de una familia de genes o de una familia de DNA re­
petido no codificado;
► heterodúplex interespecificos. Muestras de DNA desnaturalizado de
especies con genes relacionados hasta cierto punto cercanos, por
ejemplo, humano y ratón, se mezclan y se permite que cadenas úni­
cas se reasocien (reanneal).
Homodúplex. DNA de doble cadena que se forma cuando se permite que
dos secuencias de cadena única con complementariedad de bases per­
fecta se asocien (anneal).
Valoración de hibridación. Una reacción de prueba en la que se utiliza un
ácido nucleico conocido (la sonda) para buscar secuencias relacionadas
en un conjunto heterogéneo de secuencias de DNA (el blanco). En una
valoración de hibridación estándar la sonda es marcada y por lo general
en solución, en tanto que el blanco no se marca y suele enlazarse a un
apoyo sólido. En la hibridación inversa sucede lo contrario.
Hibridación in situ. Una reacción de hibridación en la que una sonda se
híbrida a ácidos nucleicos de células o cromosomas que se montaron en
un portaobjetos de vidrio, por ejemplo, DNA desnaturalizado de crom oso­
mas en metafase (hibridación cromosómica in situ, sección 2.4.2) o
RNA preparado de cortes de tejido (hibridación de tejido in situ). Véase
sección 6.3.4.
Temperatura de fusión ( r j . Medida de la estabilidad de un dúplex de
ácido nucleico, es la temperatura que corresponde al punto medio en la
transición de formas de cadena doble a cadena única. De manera conve­
niente, esta transición puede seguirse midiendo la densidad óptica del
DNA a una longitud de onda de 260 nm. Véase figura 6-9.
Sonda. Población de ácido nucleico conocido que se usa para interrogar
una población heterogénea compleja de ácido nucleico en una valoración
de hibridación. Originalmente puede ser de doble cadena, pero a fin de
que actúe com o una sonda tiene que desnaturalizarse para obtener cade­
nas únicas. Aunque por lo general la sonda es marcada y en solución,
véase valoraciones de hibridación inversa.
Reasociar. Asociar de nuevo (reannef) después de un paso de desnatu­
ralización previo.
Cinéticas de reasociación. Ritmos a los que se reasocian cadenas de
DNA complementarias. Las cadenas de DNA muy repetido se reasocian
con rapidez; las secuencias de copia única lo hacen con lentitud.
Valoración de hibridación inversa. Una valoración en la que el blanco se
marca y por lo general se encuentra en solución en tanto que la sonda no
se marca y suele estar enlazada a un apoyo sólido. Los ejemplos inclu­
yen valoraciones dot-blot inversa e hibridación de microarreglo.
Hibridación de sustracción. Método basado en hibridación para identifi­
car secuencias de ácido nucleico que se sabe que existen en una pobla­
ción (la población plus) pero que no se encuentran en otra población
relacionada en form a cercana (la población m inus). La hibridación se di­
seña para que tenga la población ( - ) en gran exceso y en consecuencia
actúe como un DNA impulsor, lo que asegura que todas las secuencias
relacionadas en la población ( + ) se eliminen como heterodúplex y deja
las secuencias deseadas que se encuentran sólo en la población ( + ) .
Blanco. Población heterogénea compleja de ácido nucleico que se inte­
rroga en una valoración de hibridación mediante un ácido nucleico cono­
cido, a menudo homogéneo. Por lo general no marcado y enlazado a un
apoyo sólido pero en las valoraciones de hibridación inversa los blancos
están marcados y en solución.
 6.2 PRINCIPIOS DE LA HIBRIDACIÓN DE ACIDO NUCLEICO 169

un
rm
D N A b la n c o | Sonda de D N A j
(M e z c la d e d ife re n te s (P o r lo g e n e ra l h o m o g é n e o
fra g m e n to s d e D N A ) y m a rc a d o )

D e s n a tu ra liza r

M e z c la r y p e rm itir
1112
rea so c iac ió n
(reanneal) n n

r
rm 2112
mi ITTI
C lave:
D N A b la n c o re a s o c ia d o H e te ro d ú p le x S o n d a D N A re a s o c ia d a
(reannealed) T M a rc a d o
s o n d a -b la n c o (reannealed)

Fig. 6-8. La valoración de hibridación de ácido nucleico requiere la formación de heterodúplex entre sondas de ácido nucleico de cadena única
marcadas y secuencias complementarias dentro de un ácido nucleico blanco.

Se considera que la secuencia de la sonda se relaciona con firmeza a con un segmento central de uno de los muchos tipos de moléculas de ácido
nucleico en el blanco. El mezclado de la sonda y el blanco desnaturalizados produce una sonda reasociada (reannealed)-sonda homodúplex (abajo a la
derecha) y homodúplex blanco-blanco (abajo a la izquierda), pero también heterodúplex formados entre el DNA sonda y cualquier molécula de DNA
blanco que se relacione en form a importante en cuanto a la secuencia (centro abajo). Si se dispone de un método para eliminar el DNA sonda que no
está enlazado al DNA blanco, es posible identificar con facilidad los heterodúplex mediante métodos que pueden detectar el marcador.

6.2.3 Es posible utilizar una gran variedad de

Fig. 6-9. La desnaturalización de DNA ocasiona un incremento de ia
densidad óptica.
D0SS y DOqs indican la densidad óptica del DNA de cadena única (SS)
y DNA de cadena doble (DS) respectivamente. La diferencia entre
ambas constituye el efecto hipocrómico (véase texto).
valoraciones de hibridación de ácido nucleico
Aunque en los experimentos iniciales de hibridación de ácido nu­
cleico se empleaba la hibridación en solución, que incluía el mezcla­
do de soluciones acuosas de sonda y ácidos nucleicos blanco, la
concentración muy baja de secuencias de copia única en genomas
complejos significaba que los tiempos de reasociación eran inevita­
blemente lentos. Un medio que se usa mucho para aumentar la ra­
pidez de la reasociación consiste en incrementar de modo artificial
la concentración total de DNA en la solución acuosa al eliminar
moléculas de agua (p. ej., con la adición de concentraciones altas de
polietilenglicol).
Una alternativa a la hibridación en solución que facilita la de­
tección de moléculas reasociadas consiste en inmovilizar el DNA
blanco en un apoyo sólido, como una membrana de nitrocelulosa
o nylon, al que se enlaza con facilidad DNA de cadena única. La fi­
jación de la sonda marcada al DNA blanco inmovilizado puede se­
guirse luego eliminando la solución que contiene la sonda de DNA
libre, lavando en forma extensa la membrana y secándola como
preparación para la detección.
170 CAPI 11 LO SEIS HIBRIDACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES

Cuadro 6 -2 . Ecuación para calcular Tm.

Híbridos Tm(°C)

DNA-DNA 81.5 + 16.6(log10[Na+] a) + 0.41 (%GCb) - 500/L0

DNA-RNA o RNA-RNA 79.8 + 18.5(log10[Na+] a) + 0.58(%GCb) + 11,8(%GCb)2 - 820/L0

oligo-DNA u oiigo-RNA:d

Para < 20 nucleótidos 2 (/„)

Para 20 a 35 nucleótidos 22 + 1.46 (/„)
a0 para otro catión monovalente, pero sólo es preciso en los límites de 0.01 a 0.4 M.
bSólo preciso para 30 a 75% de GC.
°L = longitud de dúplex en pares de bases.
doligo = oligonucleótido: /„ = longitud efectiva del cebador = 2 x (núm. de G + C) + (núm. de A + T).
Nota: para cada 1% de formamida, la Tm se reduce alrededor de 0.6° C, en tanto que la presencia de 6 M de urea reduce la Tm alrededor de 30°C.

Ésta el base de las valoraciones de hibridación de ácido nuclei­ co, es posible diseñar una variedad muy amplia de valoraciones de
co estándar que se utilizan en la actualidad. Sin embargo, en fecha hibridación de ácido nucleico (recuadro 6-4).
más reciente también se popularizaron las valoraciones de hibri­
dación inversa. En estos casos la población de la sonda no está
marcada y se fija al apoyo sólido, en tanto que el ácido nucleico 6.3 Valoraciones de hibridación
blanco se marca y se presenta en solución acuosa. Por consiguiente de ácido nucleico m ediante
cabe señalar que la distinción entre sonda y blanco no se basa en es­ sondas de DNA clonado para
pecial en cuál es la población marcada y cuál es la población no
seleccionar poblaciones de ácido
marcada. Por el contrario, la consideración importante es que el
DNA blanco debe ser la población compleja, comprendida de modo nucleico no clonado
imperfecto, que la sonda (cuya identidad molecular se conoce) in­
Las múltiples aplicaciones en genética molecular incluyen obtener
tenta interrogar. Según la naturaleza y forma de la sonda y el blan-
una clona individual de DNA y usarla como sonda de hibridación
para seleccionar la presencia de secuencias relacionadas dentro de
un blanco complejo de DNA o RNA no clonado. En ocasiones la
Sonda de DNA: Sonda valoración se restringe a sólo verificar la presencia o ausencia de se­
convencional o lig o n u c le ó tid a
cuencias relacionadas con la sonda. En otros casos es posible obte­
ner información útil del tamaño de las sustancias complementarias,
su localización subcromosómica o sus localizaciones dentro de teji­
TTTTTTTTTTTT dos o grupos de células específicos.
E s ta b le p e rfe c ta E s ta b le
6.3.1 En la hibridación dot-blot, un método rápido
de detección, suelen emplearse sondas de
oligonucleótidos específicas de alelo
In c o m p a tib ilid a d
ZZZZZMZZZZI ú n ic a El procedimiento general de dot-blotting consiste en obtener una
(p. ej., alélica)
E s ta b le In e s ta b le a solución acuosa del DNA blanco, por ejemplo, DNA genómico to­
rig o r d e tal humano, colocar manchas en una membrana de microcelulosa
h ib rid ació n alto o de nylon y después permitir que se seque. La técnica variante de
2 0 % d e in c o m p a tib ilid a d slot-blotting comprende colocar con pipeta el DNA a través de
(p. ej., s e c u e n c ia s una hendidura individual en una plantilla apropiada. En ambos
d e c o d ific a c ió n d e
métodos se desnaturalizan las secuencias del DNA blanco ya sea
genes hum anos y
E s ta b le d e ratón) por exposición previa a calor o exposición del filtro que las contie­
a rigor d e ne a un álcali. Las secuencias de DNA blanco desnaturalizadas in­
h ib rid ació n móviles ahora en la membrana se exponen a una solución que
re d u c id o contiene secuencias de cadena única de la sonda marcadas (con fre­
cuencia se marca con 32P a fin de optimar la detección). Tras per­
Fig. 6-10. La hibridación de ácido nucleico puede identificar mitir que transcurra el tiempo suficiente para la formación de
secuencias blanco considerablemente divergentes de una sonda heterodúplex sonda-blanco, la solución de la sonda se decanta y la
de ácido nucleico convencional o idénticas a una sonda de membrana se lava para eliminar el exceso de sondas que puedan ha­
oligonucleótidos. berse enlazado en forma inespecífica al filtro, que a continuación se
seca y expone a una placa autorradiográfica.
 6.3 I VALORACIONES DE HIBRIDACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO MEDIANTE SONDAS DE DNA 171

Valoraciones de hibridación de ácido nucleico estándar e inversa

VALORACIONES ESTÁNDAR Sonda marcada en solución Blanco no marcado enlazado en apoyo sólido

Dot blot (fig. 6-11)
Southern blot (fig. 6-12 para
el método; figs. 7 - 9 ,18-12B y
18-12C para ejemplos)
Northern blot (fig. 6-13)
Hibridación cromosomica in situ
(p. ej., figs. 2-16 a 2 -1 8 ,1 4 -1 2 )
Hibridación tisular in situ
(fig. 6-15)
Colony blot (fig. 6-16)
Levantamiento de placa
Valoración de hibridación de
clona en rejilla (fig. 6-17)
Cualquier DNA o RNA marcado pero Población de DNA o RNA complejo; no fraccionada por
con frecuencia un oligonucleótido tamaño, pero manchada directamente en la membrana
Cualquiera A menudo DNA genómico complejo (pero pueden ser
clonas de DNA individuales); digerido con nucleasa de
restricción y fraccionado por tamaño, luego transferido a
membrana
Cualquiera Población de RNA complejo (p. ej., RNA celular total o poli
A + RNA) que se fraccionó por tamaño y a continuación se
transfirió a una membrana
Por lo general una clona genómica DNA dentro de cromosomas (con frecuencia en metafase)
marcada de células lisadas en un portaobjetos para microscopio
Por lo general una ribosonda u RNA dentro de las células de cortes de tejido fijados en un
oligonucleótido antisentidos marcados portaobjetos para microscopio
Cualquiera Colonias de células separadas después de sembrarlas en
placa de agar y después transferidas a una membrana
Cualquiera Colonias bacterianas infectadas por fago separadas luego
de sembrarlas en una placa de agar y transferirlas a una
membrana
Cualquiera Clonas manchadas robóticamente en una membrana en
arreglos geométricos

VALORACIONES INVERSAS Blanco marcado en solución Sondas sin marcas enlazadas a un apoyo sólido

Dot blot inversa DNA complejo Oligonucleótidos manchados en una membrana

Microarreglo de DNA o de
oligonucleótidos presintetizados
(fig. 6-19)
Microarreglo de oligonucleótidos
fig. 17-18)
DNA complejo Clonas de DNA u oligonucleótidos manchados
robóticamente en un portaobjetos para microscopio
DNA complejo Oligonucleótidos sintetizados en vidrio
- -

Una aplicación útil de dot-blotting comprende la distinción en­
tre alelos que difieren por la sustitución inclusive de un nucleótido
; slado. Para efectuarla se elaboran sondas con oligonucleótido es-
r»ecífico de alelo (OEA) a partir de secuencias que abarcan el sitio
iriable del nucleótido. Por lo general las sondas OEA tienen 15 a
20 nucleótidos de largo y suelen emplearse bajo condiciones de hi-
r ridación a las que el dúplex de DNA entre sonda y blanco es esta­
ble sólo si la com plem entariedad de bases entre ellos es perfecta: es
suficiente una incompatibilidad aislada entre la secuencia de la son­
da v el blanco para tornar inestable el heterodúplex corto (fig. 6 - 10 ).
C¿si siempre esto incluye diseñar los oligonucleótidos de tal manera
q je ocurran diferencias de un nucleótido entre los alelos en un seg­
mento central de la secuencia oligonucleótida, lo que en conse­
cuencia maximiza la inestabilidad termodinámica de un dúplex
^compatible. Esta discriminación puede usarse para una variedad
propósitos de investigación y diagnóstico. Aunque el OEA puede
emplearse en la hibridación convencional Southern blot (véase más
idelante), es más conveniente utilizarlo en valoraciones dot-blot
véase fig. 6 - 11 ).
Otro método dot blotting con OEA recurre a una técnica dot
rlotting inversa. Esto significa que las sondas oligonucleótidas no
están marcadas y se encuentran fijas a un filtro o una membrana en
tinto que el DNA blanco está marcado y se proporciona en solu­
ción. Se considera que el enlace positivo del DNA blanco marcado
a un oligonucleótido específico en la membrana indica que el blan­
co tiene esa secuencia específica. Tanto este método como las téc­
nicas de microarreglo de DNA relacionadas tienen muchas
aplicaciones diagnósticas.
6.3.2 Las hibridaciones Southern blot y Northern blot
detectan ácidos nucleicos cuyo tamaño se
fraccionó mediante electroforesis en gel
Hibridación Southern blot
En este procedimiento el DNA blanco se digiere con una o más en-
donucleasas de restricción cuyas secuencias de reconocimiento sue­
len ser de 4 a 6 pb de largo, lo que genera fragmentos que tienen
varios cientos o miles de pares de bases de longitud. Los fragmen­
tos de restricción se fraccionan de tamaño mediante electroforesis
en gel de agarosa, se desnaturalizan y transfieren a una membrana
de nitrocelulosa o nylon para hibridación (fig. 6-12). Durante la
electroforesis de fragmentos de DNA, que tienen una carga negati­
va por los grupos fosfato, se repelen del electrodo negativo hacia el
positivo y se tamizan a través del gel poroso. Los fragmentos de
DNA más pequeños se mueven más rápido. La rapidez de migra-
172 CAPITULO SEIS HIBRIDACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES

N o rm a l H e te ro c ig o to H o m o c ig o to d e c é lu la fa lc ifo rm e

ßAßA ßAßs ßs ßs
Dot ;
b lo t

H ib rid a c ió n

ß A -A S O 5' TG ACT CCT GAG GAG AAG TC 3'

‘ H f S ín te sis d e O E A

G iù 10
|N O R M A L | [3A 5 ' G T G C A C CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT G C C ---------------3 '
C a d e n a d e s e n tid o

S E C U E N C IA S G E N IC A S M u ta c ió n d e c é lu la fa lc ifo rm e

[M U T A N T E I ß S 5 'G T G CAC CTG ACT CCT GTG GAG AAG TCT G C C ................. 3'
C a d e n a d e s e n tid o Val

S ín te s is d e O E A

ß S-ASO 5 ' TG ACT CCT gH g GAG AAG TC 3'

H ib rid a c ió n

Dot
b lo t o
ßAßA qA qS
ßs ßs
N o rm al H e te ro c ig o to H o m o c ig o to d e c é lu la fa lc ifo rm e

Fig. 6-11. La hibridación dot-blot de oligonucleótido específica de alelo (OEA) puede identificar individuos con la mutación de célula falciforme.

El dot blot esquemático de la parte superior muestra el resultado del sondeo con un OEA específico para el alelo de globina beta normal (p A-0EA; que
se muestra justo abajo). Los resultados son positivos (círculos negros) en individuos normales y heterocígotos, pero negativos en homocigotos de
célula falciforme (círculo de guiones, blanco). La dot blot de la parte inferior muestra el resultado del sondeo con un OEA específico para el alelo
de globina (3 de célula falciform e ((3S-0EA; se muestra justo arriba) y en este caso los resultados son positivos para homocigotos y heterocígotos de
célula falciforme, pero negativos para individuos normales. El p A-0EA y el |3S-0EA se diseñaron para que tuvieran 19 nucleótidos de largo en este caso
elegidos de los codones 3 a 9 de secuencias del gen de globina (iA y p s de sentido respectivamente rodeando el sitio de mutación de células
falciformes. El último es una sustitución de nucleótido único (A - * T) en el codón 6 en el gen de globina p, que resulta en una sustitución GAG
(Glu)-KBIG (Val) (véanse secuencias medias).

ción de fragmentos entre 0.1 y 30 kb de largo depende de su lon­
gitud, pero muy poco de la composición de bases. Por tanto los
fragmentos de estos límites de tamaño se fraccionan de tamaño en
un sistema de electroforesis en gel de agarosa convencional.
Una aplicación importante de la hibridación Southern blot en
genética de mamíferos es el uso de una sonda para identificar se­
cuencias relacionadas que pueden pertenecer al mismo genom a (ade­
más de los miembros de una familia de genes o secuencias de DNA
relacionados en términos evolutivos) o a otros genom as (p. ej., un
gen ortólogo, que es un equivalente directo del gen que se utiliza co­
mo sonda). Una vez que se demuestra que una sonda recién aisla­
da se relaciona con otras secuencias no caracterizadas, puede
intentarse aislar los otros miembros de la familia mediante la selec­
ción de genotecas d e DNA genóm ico (sección 5.3.4). Asimismo, la
selección puede realizarse en muestras de DNA genómico de dife­
rentes especies (una z o o b lo t) con objeto de identificar secuencias
conservadas entre diferentes especies (véase fig. 7-9). Como las se­
cuencias de codificación están comparativamente muy bien conser­
vadas, éste es un medio para identificar DNA codificante.
Hibridación Northern blot
La hibridación Northern blot es una variante de la Southern blot-
ting en la que el ácido nucleico blanco es RNA no digerido en lu­
gar de DNA. Una utilidad principal de este método es obtener
información de los patrones de expresión de genes específicos. Una
vez que se clona un gen, puede emplearse como sonda e hibridarse
contra un Northern blot que contiene, en diferentes sendas, mues­
tras de RNA aisladas de una variedad de tejidos distintos (véase fig.
6-13). Es posible que los datos obtenidos proporcionen informa­
ción respecto a la gama de tipos de células en los que el gen se ex­
presa y la abundancia relativa de transcritos. Además, al revelar
 6.3 j VALORACIONES DE HIBRIDACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO MEDIANTE SONDAS DE DNA
D N A b la n c o
D ig e rir c o n e n d o n u c le a s a
d e res tricció n
A p lic a r a fo s o s in d ivid u ale s
en un gel d e a g a ro s a
M ig ra c ió n
P es o
m o le c u la r a lto
P eso
m o le c u la r b a jo
D e s n a tu ra liza r en álcali
A p lic a r a u n a m e m b ra n a
d e n itro c e lu lo s a o nylon
M e m b ra n a T ran sferir D N A
G el
■ f
a la m e m b ra n a
Fig. 6-12. La hibridación Southern blot detecta fragmentos de DNA blanco que se fraccionaron de tamaño mediante electroforesis en gel.
transcritos de diferentes tamaños, puede brindar pruebas de distin­
tas isoformas (p. ej., resultantes de promotores alternativos, sitios
de empalme, sitios de poliadenilación, etc.).
6.3.3 La electroforesis en gel de campo pulsado
extiende la hibridación Southern al incluir la
detección de moléculas de DNA muy grandes
La electroforesis en gel de agarosa estándar puede resolver fragmen­
tos de DNA de tamaño limitado, de 100 pb a unas 30 kb, como
resultado del efecto d e tamizaje, las moléculas de DNA pasan a tra­
vés de poros en el gel de agarosa y las pequeñas pueden migrar con
mayor rapidez por los poros. Sin embargo, por arriba de un cierto
tamaño de fragmento de DNA, el efecto de tamizado ya no es efi­
caz y la resolución de fragmentos de DNA mayores de 40 kb es en
extremo limitada. Ya que muchos genes de mamíferos y otras uni­
dades de secuencia funcionales son muy grandes, se requieren mé­
todos de electroforesis alternativos para separar fragmentos de
DNA muy grandes.
La electroforesis en gel de campo pulsado (EGCP) es una
modificación más reciente de la electroforesis en gel de agarosa que
puede resolver fragmentos de DNA de un tamaño que varía de
173
S onda de DNA
A ñ a d ir m a rcad o r,
p. ej., m a rc a d o r
ra d ia c tiv o (*)
í
D e s n a tu ra liza r
p o r c a lo r
H ib rid a r a
D N A b la n c o
in m o v iliza d o
*
L a v a r el
exceso de
sonda de DNA
A p lic a r p la c a
d e ray o s X
P la c a
M e m b ra n a
unas 20 kb a varios Mb de largo. Aunque las moléculas de DNA
muy grandes incluidas en cromosomas de mamíferos —casi siempre
de cientos de Mb de longitud— no pueden separarse por tamaño
con este método, se sabe que nudeasas de restricción especializa­
das cortan DNA de vertebrados muy rara vez y producen fragmentos
de restricción grandes que pueden separarse por tamaños mediante
la electroforesis en gel de campo pulsado (EGCP). Estas enzimas,
que también se conocen como en d on u clea sa s d e restricció n co r ­
ta d ora s raras, a menudo identifican secuencias de reconocimiento
abundantes en GC que contienen uno o más dinucleótidos CpG.
Puesto que el dinudeótido CpG se observa con poca frecuencia en
DNA de vertebrados, el DNA humano y los DNA de otros vertebra­
dos tienen comparativamente pocas secuencias de reconocimiento de
enzimas de restricción que cortan las secuencias que contienen CpG
(cuadro 6-3).
El DNA genómico preparado no suele ser adecuado para
EGCP porque los procedimientos relacionados con la lisis de célu­
las y la purificación del DNA producen fuerzas de desgarro que
causan una fragmentación considerable del DNA. En lugar de ello,
el DNA se aísla en una forma que permita reducir al mínimo la ro­
tura artificial de las moléculas grandes y luego se digieren con en­
donucleasas de restricción cortadoras raras apropiadas. Para
174 CAPÍTULO SEIS HIBRIDACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES
LLI
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LU
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Fig. 6-13. La hibridación Northern biot se usa para valorar los
patrones de expresión gruesos de un gen.
El Northern blotting consiste en fraccionar de tamaño muestras de
RNA total [o mRNA poll(A)+ purificado], transferir a una membrana e
hibridar con una sonda de ácido nucleico marcada apropiada. El ejemplo
muestra el empleo de una sonda cDNA marcada del gen FMR1
(síndrome de retraso mental por X frágil). Se detectaron concentraciones
más altas en el cerebro y el testículo (4.4 kb), con expresión
decreciente en placenta, pulmones y riñones respectivamente. Se
encuentran múltiples transcritos más pequeños en el corazón.
Reproducido de Hinds y col. (1993) con autorización de Nature
Publishing Group.
preparar DNA de peso molecular alto se mezclan muestras de célu­
las, por ejemplo, glóbulos blancos, con agarosa fundida y después
se transfieren a fosos en un formador de bloques y se dejan enfriar.
Como resultado las células quedan atrapadas en bloques sólidos de
agarosa (fig. 6-14). Se remueven los bloques de agarosa y se incu­
ban con enzimas hidrolíticas que se difunden a través de los poros
pequeños en la agarosa y digieren componentes celulares, pero de­
jan casi intacto el DNA cromosómico de peso molecular alto. A
continuación pueden incubarse bloques individuales que contienen
DNA de peso molecular alto purificado en un amortiguador que
incluye una endonucleasa de restricción cortadora rara.
Con objeto de separar por tamaño los fragmentos de restricción
grandes incluidos dentro de los bloques de agarosa, estos últimos se
colocan en fosos en un extremo de un gel de agarosa contenido en
un aparato de EGCP. Como en la electroforesis en gel convencio­
nal, el DNA de carga negativa se repele del electrodo negativo y mi­
gra en el campo eléctrico. Sin embargo, durante una carrera de
EGCP la orientación relativa d el g e l y el campo eléctrico se altera de
manera periódica, p o r lo general m ediante el ajuste de un interruptor
para proporcionar pulsos de potencia breves, activando alternativa­
m ente dos campos orientados en form a diferente (fig. 6-14). Variantes
de la técnica recurren a un campo eléctrico único pero con rever­
siones periódicas de la polaridad ( electro fo resis en g e l d e in versión
d e cam po), o rotación periódica del gel o los electrodos.
En general cada uno de los diferentes métodos es el principio de
un campo eléctrico discontinuo de modo que las moléculas de DNA
se fuerzan de manera intermitente a cambiar su conformación y di­
rección de migración durante su paso a través del gel. El tiempo
que una molécula de DNA requiere para alterar su configuración y
reorientarse por sí misma en la dirección del nuevo campo eléctri­
co depende por completo del tamaño; por tanto pueden fraccionar­
se con eficiencia fragmentos de DNA hasta de varios Mb de
tamaño, inclusive DNA intacto de cromosomas de levadura com­
pletos (Schwartz y Cantor, 1984).
6.3.4 Sondas de hibridación in situ se hibridan
para desnaturalizar DNA de una preparación
de cromosomas o RNA de un corte de tejido
fijado en un portaobjetos de vidrio
Hibridación cromosómica in situ
Un procedimiento simple para marcar genes y otras secuencias de
DNA consiste en hibridar una sonda de DNA marcada apropiada
contra DNA cromosómico que se desnaturalizó in situ. Para efec­
tuarlo se hace una preparación de cromosomas en un portaobjetos
para microscopio que se seca al aire (con frecuencia cromosomas en
metafase o prometafase de linfocitos de sangre periférica o líneas de
células linfoblastoides). El tratamiento con ribonucleasa (RN-asa)
y proteinasa K produce DNA cromosómico purificado en forma
parcial, que se desnaturaliza al exponerlo a formamida. Se dispone
entonces de DNA desnaturalizado para hibridación in situ con una
solución añadida que contiene una sonda de ácido nucleico marca­
da, recubierto con un cubreobjetos. Según la técnica particular que
se utiliza, el bandeo cromosómico de los cromosomas puede arre­
glarse antes o después del paso de hibridación. Como resultado, la
señal obtenida tras eliminar el exceso de sonda puede correlacionar­
se con el patrón de bandeo cromosómico con objeto de identificar
un mapa de localización para las secuencias de DNA que la sonda
reconoce. El uso de técnicas de h ib rid a ció n d e flu o r es cen cia in si­
tu (HFIS) revolucionó la hibridación cromosómica in situ (véase
sección 2.4.2).
Hibridación de tejidos in situ
En este procedimiento se hibrida una sonda marcada contra RNA
en cortes de tejido (Wilkinson, 1998). Los cortes se elaboran de te­
jido embebido en parafina o congelado por medio de un criostato y
luego se montan en un portaobjetos de vidrio. La mezcla de hibri­
dación que incluye la sonda se aplica al corte en el portaobjetos y
se protege con un cubreobjetos de vidrio. Por lo general la mezcla
de hibridación tiene una concentración de formamida de 50% a fin
de disminuir la temperatura de hibridación y minimizar los proble­
mas de evaporación.
Aunque se utilizan cDNA de doble cadena como sondas, se pre­
fieren las sondas de RNA complementario de cadena única (ribo-
sondas): la sensibilidad de las sondas iniciales de cadena única suele
ser más alta que la de las sondas de doble cadena, quizá porque una
proporción de la sonda de doble cadena desnaturalizada se renatu-
raliza para formar una homodúplex de sondas. Las ribosondas de
cRNA que son complementarias al mRNA de un gen se conocen
 6.3 VALORACIONES DE HIBRIDACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO MEDIANTE SONDAS DE DNA I 175

Cuadro 6 3. Ejemplos de endonucleasas de restricción “cortadoras raras”.

Enzima Origen Corte de secuencia; CG = CpG; N = A, C, G o T Tamaño de fragmento promedio
esperado (kb) en DNA humano3

Sma 1 Serratia marcescens CCCGGG 78

SssHil Bacillus stearothermophilus GCGCGC 390

Sacli Streptomyces lividans CCGCGG 390

Sffl Streptomyces fimbriatus GGCCNNNNNGGCC 400

Atoa Norcadia otitidis-caviarum GCGGCCGC 9 766

‘ Asumiendo 40% de G + C y una frecuencia de CpG 20% de la esperada.

S an gre^
R eunir E 1 0 I © E2
} — g ló b u lo s
b la n c o s
A g a ro s a
fu n d id a
±m N

T ran sferir la m e z c la
a c a v id a d e s en un m o ld e
p a ra fo rm a r b lo q u e s
y p e rm itir q u e el a g a r
s e so lid ifiq u e V © © <
In c u b a r en E2 I i E1
C élu la s
__ i___
p ro te in a s a K a tra p a d a s I
y SDS
P o ro en
In a c tiv a r a g a ro s a
p ro te in a s a K;
la var p a ra elim in ar In te rru p to r p e rió d ic o (pulsación)
, d e s e c h o s ce lu la res d e e n e rg ía e n tre p a re s d e
e le c tro d o s (E1 y E2)
D ig e rir co n Insertar bloques

n u c le a s a d e en fo s o s d e
res tricció n gel d e a g a ro s a M ig ra c ió n
DNA de
c o rta d o ra rara n e ta
peso
m o le c u la r
a lto a tra p a d o

Fig. 6-14. Fraccionamiento de DNA de peso molecular alto de células hematológicas mediante electroforesis en gel de campo pulsado.

como ribosondas antisentido y pueden obtenerse mediante clona­
ción de un gen en la orientación inversa en un vector apropiado co­
mo pSP64 (fig. 6-3). En estos casos la polimerasa fago sintetizará
transcritos marcados de la cadena de DNA opuesta a la que en con­
diciones normales se transcribe in vivo. Los testigos útiles para estas
reacciones incluyen ribosondas de sentido que no deben hibridarse a
mRNA excepto en los casos raros en que las dos cadenas de DNA
de un gen se transcriben.
El marcado de sondas se realiza con radioisótopos seleccionados,
en especial 35S, o mediante marcado no isotópico. En el primer ca­
so la sonda hibridada se visualiza por procedimientos autorradiográ-
ficos. A menudo la localización de los granos de plata se observa só­
lo con microscopía de campo oscuro (no se permite que llegue luz
directa al objetivo; en su lugar, los rayos de luz que iluminan se di­
rigen de un lado de manera que sólo penetra luz dispersa en las len­
tes del microscopio y la señal aparece como un objeto iluminado
contra un fondo negro). Sin embargo, la microscopía de campo
brillante (en la que la imagen se obtiene por transmisión directa de
la luz a través de la muestra) proporciona una detección de señal más
adecuada (véase fig. 6-15). El marcado con fluorescencia es un mé­
todo de marcado no isotópico popular y la detección se efectúa por
microscopía de fluorescencia (véanse recuadro 6-2, fig. 6-5).
176 ,o HIBRIDACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES

6.4 Valoraciones de hibridación
m ediante el uso de DNA blanco
clonado y m icroarreglos
Algunas de las técnicas descritas en la sección anterior (p. ej„ la hi­
bridación Southern blot y la hibridación dot-blot) también se em­
plean para estudiar tanto DNA clonado como DNA no clonado.
Sin embargo, las técnicas que se describen en las dos secciones si­
guientes se usan para analizar DNA clonado. En una tercera sec­
ción se describen tecnologías de microarreglos muy potentes
desarrolladas en fecha más reciente.
6.4.1 La hibridación colony blot y la de levantado de
placa son métodos para seleccionar colonias o
placas bacterianas separadas
Como se describe en la sección 5.3.5, suele ser posible seleccionar e
identificar colonias de bacterias u otras células huésped apropiadas
que contienen DNA recombinante por la capacidad del inserto
para inactivar un gen vector marcador (p. ej., galactosidasa @, o un
gen de resistencia a antibióticos). No obstante, si el DNA recombi­
nante apropiado contiene una secuencia de DNA que se relaciona
muy de cerca con una sonda de ácido nucleico disponible puede
detectarse en forma específica por hibridación. En el caso de células
bacterianas utilizadas para propagar plásmidos recombinantes se
permite que las colonias de células crezcan en una superficie de agar
y luego se transfieren por contacto de superficie a una membrana de
nitrocelulosa o nylon, un proceso que se conoce como blotting co­
lony (manchado de colonias) (véase fig. 6-16). De otra manera la
mezcla de células se disemina en una membrana de microcelulosa o
nylon colocada en la parte superior de la superficie de agar nutrien­
te y se permite que se formen colonias directamente en la parte su­
perior de la membrana. En cualquiera de los métodos, la membrana
se expone después a álcali para desnaturalizar el DNA antes de hi-
bridarlo con una sonda de ácido nucleico marcada.
Tras la hibridación, se elimina la solución sonda, el filtro se la­
va en forma extensa, se seca y se envía para autorradiografía con
una placa de rayos X. La posición de las señales radiactivas poten­
tes se relaciona contra una placa maestra que contiene el patrón ori­
ginal de colonias a fin de identificar las que contienen DNA
relacionado con la sonda. A continuación puede tomarse y ampli­
ficarse de manera individual el cultivo antes de la extracción y pu­
rificación del DNA recombinante.
Puede realizarse un proceso similar cuando se utilizan vectores
fago. Las placas que se forman después de la lisis de células bacte­
rianas por fago contendrán partículas residuales de fago. Se coloca
una membrana de nitrocelulosa o nylon en la parte superior de la
placa de agar en la misma forma que la anterior y cuando se remue­
ve de la placa constituye una copia fiel del material fago en las placas,
un método llamado levantamiento de placa. El procesamiento
subsecuente del filtro es idéntico al del esquema que se muestra en
la figura 6-16.
6.4.2 Los arreglos de alta densidad en rejillas de clonas
de células transformadas o clonas de DNA
incrementaron de modo considerable la eficiencia
de la selección de genotecas de DNA
La creación de genotecas de DNA complejo demandó métodos
más eficientes de selección de clonas. En lugar de sólo sembrar las
colonias de células en una placa en un plato para cultivo celular y

Fig. 6-15. La hibridación de tejida in situ proporciona patrones de expresión gánica de alta resolución.

El ejemplo muestra el patrón de hibridación producido mediante una ribosonda antisentido de cadena pesada de miosina p marcada con 35S contra un
corte transversal del tejido de un embrión de ratón de 13 días. Las áreas oscuras representan un marcado potente, notable en los ventrículos del
corazón. Proporcionada por el doctor David Wilson, University of Newcastle upon Tyne, UK.
 6.4 ! VALORACIONES DE HIBRIDACIÓN MEDIANTE EL USO DE DNA BIANCO CLONADO 177

M e m b ra n a
n itro c e lu lo s a /n y lo n

C o lo c a r la m e m b ra n a
en la p a rte s u p e rio r d e a g a r
q u e c o n tie n e co lo n ia s
b a c te ria n a s s e p a ra d a s

In v ertir la m e m b ra n a y c o lo c a rla s o b re n u e v a
s u p e rfic ie d e ag ar; p e rm itir q u e las co lo n ia s
P e rm itir la re c u p e ra c ió n reg e n ere n en la p a rte s u p e rio r del filtro
d e c é lu la s o rig in ale s
\

P la c a m a e s tra C re c im ie n to en ,
cu ltivo P R é p lic a d e l filtro en a g a r n u e vo
/ \ Id e n tific a r en líq u id o I I
¡ co lo n ia s / \ Q u ita r la m e m b ra n a
p o s itiva s y co n c o lo n ia s unidas;
p a s a rla s a A s u m e rg irla en
cu ltivo en líq uido s o lu c io n e s su ces iva s

a) D e s n a tu ra liza n te
b) N e u tra liza r
c) L a var
d) S e c a r/fija r D N A
P la c a d e .
rayos X

1. H ib rid a r con
s o n d a m a rc a d a
D N A b a c te ria n o
fija d o a la
m e m b ra n a
2. L a var
3. A u to rra d io g ra fía

Fig. 6-16. La hibridación colony blot consiste en replicar colonias en una membrana durable antes de la hibridación con una sonda de ácido
nucleico marcado.
Este método se usa para Identificar colonias que contienen DNA recombinante, debería disponerse de una sonda marcada.

transferirlas a una membrana en el colony blotting estándar se pre­
firió tomar colonias individuales y transferirlas a membranas gran­
des en el formato de un a rreg lo en rejilla d e a lta densidad.
El proceso de generar arreglos se simplificó mucho con la apli­
cación de dispositivos robóticos para enrejado que permitió au­
tomatizar la realización del manchado necesario colocando con
pipetas las clonas dispuestas en platos de microtítulo en coordena­
das lineales predeterminadas en una membrana. Los filtros de clo­
nas de alta densidad resultantes permitieron la selección rápida y
eficiente de genotecas (véase fig. 6-17) y posibilitaron copiarlas y
distribuirlas a numerosos laboratorios en todo el mundo.
6.4.3 La tecnología de microarreglos de DNA extendió
muchísimo la potencia de la hibridación de ácido
nucleico
Los microarreglos de DNA recién desarrollados mejoraron la tec­
nología de valoración por hibridación gracias a su enorme capaci­
dad de miniaturización y automatización (Schena y cois., 1998).
Aunque es una reminiscencia de los arreglos basados en filtros, la
construcción de microarreglos incluye procedimientos muy distin­
tos. Por lo general las superficies relacionadas son portaobjetos de
un microscopio de vidrio tratados por medios químicos en lugar de
las membranas porosas, aunque en fecha más reciente se observa
una tendencia a utilizar sustratos más porosos, por ejemplo, super­
ficies de vidrio recubiertas con nitrocelulosa, como esfuerzo para
enlazar más DNA e incrementar la sensibilidad. Existen dos tipos
muy distintos de tecnología de microarreglo según las diferencias
en la forma en que se generan y llevan muestras de ácido nucleico
a los microarreglos:
► microarreglos de ácidos nucleicos presintetizados. En este
caso los ácidos nucleicos que se encuentran en los microarreglos
se sintetizaron antes (con frecuencia consisten en conjuntos de
clonas de DNA diferentes pero en principio pueden ser conjun­
tos de oligonucleótidos sintetizados con anterioridad). Aquí la
construcción del microarreglo significa que se manchan clonas
178 CAPÍTULO SEIS HIBRIDACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES
Fig. 6-17. Los filtros de hibridación de clonas en rejilla facilitaron el
mapeo físico del genoma humano.
La figura ilustra la autorradiografía de una membrana que contiene
clonas de YAC humanos (es decir, DNA total de clonas de levadura
individuales que contienen YAC humanos). La membrana alberga un
total de 17 664 clonas que se colocaron en arreglos en rejilla de
una unidad rejilla de 6 x 6 clonas. Las señales de hibridación incluyen
señales débiles de todas las clonas con una sonda marcada con 35S
de DNA de levadura total aunadas a señales potentemente hibridantes
obtenidas con una sonda de cromosoma del sexo único marcada con
32P (DXYS646). Fotografía original del doctor Mark Ross, Sanger
Centre, Cambridge. Reproducida de Ross y Stanton (1995) En:
Current Protocols in Human Genetics, Vol. 1, este material se utilizó
con autorización de Wiley-Liss, Inc., una subsidiaria de John Wiley &
Sons, Inc.
de DNA o de oligonucleótidos individuales en sitios separados
en la superficie de un portaobjetos para microscopio, especifi­
cados mediante coordenadas x,y precisas en una parrilla minia-
turizada (fig. 6-18A). Aunque la alta precisión en el suministro
de las muestras requiere dispositivos de pintado por contacto
robóticos muy complicados, pueden encontrarse instrucciones
detalladas para preparar este tipo de dispositivos en
http://cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/
► microarreglos de oligonucleótidos sintetizados in situ. Este
método lo propuso por primera vez por la compañía Affymetrix
y casi siempre comprende una combinación de tecnología de
fotolitografía de la industria de semiconductores con la quími­
ca de síntesis de oligonucleótidos. En este caso se ensamblan in
situ muchos miles de oligonucleótidos distintos en la superficie
de un portaobjetos de vidrio, en una serie de pasos de síntesis
secuenciales que incluye la adición de un nucleótido a la vez. El
proceso requiere el acoplamiento covalente de mononucleóti-
dos a una molécula enlazadora que termina con un grupo pro­
tector fotolábil (fig. 6-18B).
Se usa una fotomáscara para determinar las posiciones que reaccio­
nan con la luz: una abertura en la fotomáscara en un sitio particu­
lar admitirá luz de una fuente luminosa externa, destruyendo los
grupos protectores fotolábiles. A continuación se utiliza una reac­
ción química de acoplamiento para añadir un tipo particular de nu­
cleótido al nuevo sitio desprotegido y el proceso se repite con una
máscara diferente, pero las posiciones ocultadas por la máscara se
protegerán de la luz. En esta forma es posible construir secuencias
de oligonucleótidos específicas en sitios predeterminados según el
ordenamiento de orificios cortados en el fotolitógrafo que se em­
plea para ese paso de síntesis. La similitud con la producción de
chips de silicón condujo a popularizar el uso del término chip de
DNA para los microarreglos de este tipo. A causa de la compleja
tecnología necesaria para producirlos, los chips de DNA deben ad­
quirirse de compañías especializadas.
Como en el dot-blotting inverso (sección 6.3.1), las tecnologías
del microarreglo de DNA operan con un método de hibridación de
ácido nucleico inverso. La son d a es el grupo de ácidos nucleicos no
marcados fijada al microarreglo. Aunque resulta complejo, la son­
da es la cantidad conocida y se utiliza para interrogar el b la n co que
a pesar de consistir en ácidos nucleicos marcados en solución se de­
riva de fuentes de las que se desea información.
La reacción de hibridación puede llevarse a cabo una vez que se
construye o compra un microarreglo, y se aísla una fuente de ácido
nucleico a investigar. El blanco se marca con un flu o r ó fo r o y se de­
ja que entre en contacto con el microarreglo, lo que permite que se
formen heterodúplex de sonda-blanco, después de lo cual el lavado
por hibridación reduce al mínimo al marcador no enlazado de ma­
nera específica. En la mayor parte de las hibridaciones de microa­
rreglos se utilizan dos fluoróforos, por lo general Cy3 (excitación de
canal verde) y Cy5 (excitación de canal rojo).
Tras la hibridación, el marcado fluorescente enlazado se detecta
con un ex plorador lá ser de alta resolución y el proceso de explora­
ción incluye adquirir una imagen de ambos fluoróforos para elaborar
una imagen de relación. El patrón final de hibridación se obtiene me­
diante el análisis de la señal emitida de cada punto en el arreglo con
un p rogra m a d e com p u ta d ora d e im á gen es digita les que convier­
te la señal en una paleta de colores según su intensidad (fig. 6-19).
Aunque la tecnología para establecer microarreglos de DNA se
desarrolló sólo hasta fecha muy reciente, ya tiene numerosas aplica­
ciones importantes y se espera que su efecto en investigación bio-
médica y métodos diagnósticos futuros sea profundo. Las
principales aplicaciones comprenden:
► selecció n d e expresión. El enfoque de la mayor parte de los es­
tudios actuales basados en microarreglos es la vigilancia de los
niveles de expresión de RNA (Granjeaud y cois., 1999), que pue­
de realizarse con microarreglos de clonas de cDNA (fig. 6-19)
o de oligonucleótidos específicos de gen (por lo general prepa­
rados mediante síntesis de oligonucleótidos in situ; véase figs.
17-18 y 19-6, y sección 19.3.3).
► selecció n d e v a ria ción d e DNA. Para este propósito general se
requieren microarreglos de oligonucleótidos y se diseñaron va­
rias aplicaciones. La nueva secuenciación del genoma mitocon-
drial humano mediante microarreglos de DNA fue una prueba
satisfactoria del poder de esta tecnología para estimar la varia­
ción de secuencias a gran escala en individuos (véase fig. 7-4).
También tiene un potencial enorme para valorar la presencia de
mutaciones en genes de enfermedad conocidos. Además se efec­
túan grandes esfuerzos para identificar y catalogar marcadores
de polimorfismo de nucleótido único (PNU) humanos.
 6.4 j VALORACIONES DE HIBRIDACIÓN MEDIANTE EL USO DE DNA BLANCO CLONADO 179

A)

B)
F U E N T E L U M IN O S A

F o to m á s c a ra

G ru p o s
p ro te c to re s fo to lá b ile s S IN T E S IS

O b le a d e vidrio

u>1 A C A T
w G T C C P a s o s d e fo to o c u lta c ió n y síntesis re p e tid o s
0)
c C T C G
co T C G A

Fig. 6-18. Preparación de microarreglos de DNA de oligonucleótidos.

A) Manchado robótico para la elaboración de microarreglos de DNA. Izquierda: un robot para microarreglos en forma de mesa que contiene
160 portaobjetos con cuatro placas del microtítulo, dos estaciones para lavado y el secador. Derecha: escáner láser que muestra la mesa óptica,
abastecedores de energía para los láser y enfriamiento con tubo fotomultipllcador, la etapa Ludí y lentes (véase Cheung y cois., 1999 para mayores
detalles). El micromanchado de muestras mediante el robot puede realizarse por contacto físico entre las agujas de manchado y la superficie sólida (de
jn portaobjetos para microscopio) con un método de chorro de tinta (ink-jetting) que se utiliza en las imprentas estándar (la muestra se carga en una
Doquilla en miniatura equipada con una piezoeléctrica ajustada y se usa una corriente eléctrica para expulsar una cantidad precisa de líquido del chorro
-acia el sustrato). Fotografías proporcionadas por Aldo Massimi, Raju Kucherlapati y Geoffrey Childs del Albert Einstein College of Medicine. Reimpresas
de Cheung y cois. (1999) Nature Genet. 21 (Suppl.), 15-19, con autorización de Nature Publishing Group. B) Preparación de un microarreglo de
oligonucleótidos combinando fotolitografía y síntesis in situ de oligonucleótidos. Estos últimos se sintetizan in situ en pasos secuenciales comenzando
:ssde un mononucleótido 3 ' que está anclado a la superficie de una oblea de vidrio. La fotolitografía comprende la modificación de la oblea de vidrio
con grupos protectores fotolábiles que pueden eliminarse cuando se exponen a la luz y el uso de fotomáscaras construidas con cuidado que permiten
que pase luz a través de ellas hacia coordinadas espaciales seleccionadas cuidadosamente. En las áreas de la oblea que reciben la luz que pasa a
ravés de la fotomáscara, la eliminación de los grupos protectores fotolábiles permite un nuevo paso de síntesís. En este ejemplo se muestra el
í::D lam iento de timidina junto con un grupo fotolábil protector.
180 i CAPÍTULO SEIS j HIBRIDACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES

9 9 , * & ■-
• • 0 4 O 9 9 « O C » 9 >3
Fig. 6-19. Perfil de expresión génica mediante hibridación a un
* •» 090 O 'O $ 9 3 : .j « * • microarreglo de clona de cDNA.
> • & :a 5 « . ö ö 0 Ífr • -3 U 4>
» o « a a d -9 9 Q 99 Un microarreglo de DNA de 1.0 cm2 que contenia 1 046 clonas de
® o & ®o ¿ a * j #
•oí»« >0 o : #; o *j -*o o ... o : una genoteca de cDNA de una célula sanguínea humana completa se
o« 3íO a ■
O O 09
Í O ü O <3 0 3 9 . . O
hibridó con una sonda de cDNA marcada con fluorescencia preparada
G & :ü p O & & 0 0 á O O - É ‘0 & 9 9 9 9 0 0 0 0 0 0 0 O medíante transcripción inversa a partir de mRNA de médula ósea
O’ © 4# Clo O '"
O0 ■
w !O «o-. 0 9 o-. a o humana. Las exploraciones láser confocales del marcador fluorescente
, ¿»O ^ #3 J>0 9 O están representadas en una escala de seudocolor en arco iris para
d o w -o 5 9 9 . - o o
O ö 0 0 3 a - 900 O O í ó ó a - V " O indicar la cuantificación gruesa de niveles de expresión: los niveles
90 * -O *oo o 9 a 9 9 v, a o
- ®í590 . so : o O :¿9 de fondo son de color violeta, luego progresan a través del índigo,
» Ö Q 9 0 9 2 azul-verde, amarillo, naranja hasta el rojo, que es la expresión más
rn m ^ • m o■
=
>9 O o 9 -.
•■
> -»»9 ?a0 9 o 9 o 9* abundante. El formato paralelo del arreglo permite comparaciones
^ 9 9 « «• « «• • • •? < »
9 9 W^9 9 9 9 9 « m ,>
precisas y mediciones diferenciales de la expresión. Fotografía
■
Y-m 9 t» - «* 9 proporcionada por el doctor Mark Schena, Stanford. Reproducido de
9 c> 9 o 9«
- •# ^ • «
9 99 O» >5» * 9 « O > 9 9 9 9 *• :.■ '•> - ¿ 9 9 + ■.-) 9 > O « -3 v Strachan y cois. (1997) Nature Genetics 16,12 6-1 32, con autorización
*» ■
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de Nature Publishing Group.
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«a> *P 1 ♦ # di ■ ■í * , -■» » 9 A «* 9 «» «9 9 9
*» m m m * mm m m 9 m ■ « 9 •

Lecturas adicionales

Molecular Probes. Handbook of Fluorescent Probes and

Research Products at http://www.molecularprobes.com/hand- Schena M (2002) Microarray analysis. John Wiley and Sons, New
book/ York.
Sambrook J, Russell D (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Various authors (1999) The Chipping Forecast. Nature Genet. 21
Manual, 3rd Edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold (Suppl.), 1-60.
Spring, Harbor, NY Various authors (2002) The Chipping Forecast II. Nature Genet. 32
Schena M (1999) Microarrays: A Practical Approach. Oxford (Suppl.), 465-552.
University Press, Oxford.

Bibliografía

Cheung VG, Morley M, Aguilar F, Masslmi A, Kucherlapati R, (eds NJ Dracopoli, JL Haines, BR Korf, CC Morton, CE
Childs G (1999) Making and reading microarrays. Nature Seiderman, DT Moir, D Smith). John Wiley & Sons, New York
Genet. 21 (Suppl.), 15-19. pp. 5.6.1-5.6.30.
Feinberg AP, Vogelstein B (1983) A technique for radiolabeling Schena M, Heller RA, Theriault TP, Konrad K, Lachenmeier E.
DNA restriction endonuclease fragments to high specific activi­ Davis RW (1998) Microarrays: biotechnology’s discovery plat­
ty. Anal. Biochem. 132, 6-13. form for functional genomics. Trends Biotechnoi 16, 301 -306.
Granjeaud S, Bertucci F, Jordan BR (1999) Expresión profiling: Schwartz DC, Cantor CR (1984) Separation of yeast chromo­
DNA arrays in many guises. BioEssays 21, 781-790. some-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis
Hinds HL, Ashley CT, Sutcliffe JS ef at. (1993) Tissue specific Cell 37, 67-75.
expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in Strachan T, Abitbol M, Davidson D, Beckmann JS (1997) A nev.
fragile X síndrome. Nature Genet. 3, 36-43. dimension for the Human Genome Project: towards compre­
Kricka LJ (1992) Nonisotopic DNA Probing Techniques. Academic hensive expression maps. Nature Genet. 16, 126-132.
Press, San Diego, CA. Wilkinson D (1998) In Situ Hybridization: A Practical Approach. 2r>c
Ross MT, Stanton VPJ (1995) Screening large-insert libraries by Edn. IRL Press, Oxford.
hybridization. In: Current Protocols in Human Genetics, Vol. 1.
CAPÍTULO SIETE

Análisis del DNA y estructura ,

variación y expresión génicas

Contenido del capítulo

182 CAPITI LO SIETE ANÁLISIS DEL DNA Y ESTRUCTURA, VARIACIÓN Y EXPRESIÓN GÉNICAS
.1 Secuenciación y genotipificación
de DNA
Los individuos de una especie portan diferencias genéticas, mu­
chas de las cuales pueden tener consecuencias importantes. Por
tanto, si bien fue fundamental comprometer tanto esfuerzo a los
proyectos del genoma, aún serán de interés el mapeo y la secuen­
ciación de DNA de individuos dentro de una especie, en especial
la humana, y la tipificación de la variación del DNA (genotipi­
ficación) .
Aun cuando los métodos tradicionales de mapeo y secuencia­
ción o físicos a gran escala serán útiles para obtener nuevas secuen­
cias del genoma, los superarán técnicas más potentes, por completo
automatizadas, para establecer la estructura del DNA, de manera
directa o en la búsqueda de variaciones génicas. La hibridación de
microarreglos basada en oligonucleótidos, por ejemplo, permite la
nueva secuenciación (resecuenciación) del DNA de individuos una
vez que se establece una secuencia de referencia.
Recuadro 7-1. Producción de plantillas de secuenciación de DNA de cadena única
Las plantillas de cadena única para secuenciación de DNA pueden ob­
tenerse mediante:
► la elaboración de DNA recombinante de cadena única utilizando vec­
tores de clonación especializados como M13 o fagómides, un méto­
do que se utiliza con amplitud; véanse sección 5.5.1 y fig. 5-18. Aqui
la síntesis de DNA complementario se ceba mediante un cebador de
secuenciación universal que es complementarlo de la secuencia del
vector que flanquea el sitio de clonación y también puede emplearse
para cebar la síntesis de nuevas cadenas para cualquier recombinan­
te de cadena única que se produzca por medio de ese vector (véase
fig. Inferior Izquierda);
Inserto
Puede utilizarse un cebador de secuenciación universal a fin de
secuenciar muchos DNA de plantilla diferentes
7.1.1 La secuenciación estándar de DNA incluye la
síntesis enzimàtica de DNA mediante terminadores
de cadena didesoxinucleótidos específicos de bases
Aunque los métodos clínicos para la secuenciación del DNA aún
tienen ciertas aplicaciones (Maxam y Gilbert, 1980) (p. ej., secuen­
ciación de oligonucleótidos; véase sección 7.2.4), la vasta mayoría
de la secuenciación actual de DNA utiliza un método enzimàtico
desarrollado por Freed Sanger, quien obtuvo un segundo premio
Nobel (el primero lo recibió por el desarrollo de la secuenciación
de proteínas). En el método de secuenciación didesoxi, el DNA se
proporciona en forma de cadena tínica (véase recuadro 7-1 ) y actúa
como plantilla para formar una cadena de DNA complementaria
nueva in vitro mediante una polimerasa de DNA apropiada. Hay
cuatro reacciones paralelas, cada una de la cuales contiene los cua­
tro dNTP aunados a una proporción pequeña de uno de los cuatro
didesoxinucleótidos (ddNTP) análogos que servirán como un ter-
minador de cadena específico de bases.
► secuenciación de ciclo (también llamada secuenciación de am pli­
ficación lineal). Como la PCR estándar, la secuenciación de ciclo usa
una polimerasa de DNA termoestable y un formato de desnaturaliza­
ción del ciclo de temperatura, asociación (annealing) y síntesis de
DNA. La diferencia radica en que en la secuenciación de ciclo sólo se
emplea un cebador e incluye un terminador de cadena ddNTR El uso
de sólo un cebador significa que el producto se acomoda de manera
lineal, a diferencia del Incremento exponencial del producto durante la
PCR estándar (véase fig. inferior derecha).
5' I 3'
i
3'C I 5'
D esnaturalizar por calor
y asociar (anneal)
el ce b ad o r único
51
o
o
o
W 3'í □ 5'
0
1 Síntesis d e D N A en presencia
l de cuatro d N T P aunados
a un d d N T P * y polim erasa
de D N A term oestable
La secuenciación del ciclo incluye la amplificación lineal mediante
un cebador aislado para iniciar la síntesis de DNA
 7.1 | SECUENCIACIÓN Y GENOTIPIFICACIÓN DE DNA
Los ddNTP se relacionan muy de cerca con los dNTP norma-
js : sólo difieren en que carecen de un grupo hidroxilo en la posición
te. carbono 39 así como en e l carbono 29 (fig. 7-1). Puede incorpo-
-use un didesoxinucleótido en la cadena de DNA en crecimiento
si formar un enlace fosfodiéster entre su átomo de carbono 59 y el
:jrbono 39 del nucleótido incorporado con anterioridad. Sin em-
r irgo, como los ddNTP carecen del grupo hidroxilo 39, cualquier
idNTP que se incorpore en una cadena de DNA en crecimiento
zo puede participar en el enlace fosfodiéster en su átomo de carbo­
no 39 y por consiguiente originará la terminación súbita de la sín­
tesis de la cadena.
La cadena de DNA en crecimiento se marca mediante el asegu-
-¿miento del marcado de uno de los cuatro dNTP o del cebador con
jji grupo radioisótopo o un fluoróforo característico. Al establecer
.ma concentración de ddNTP mucho más baja que su análogo
dNTP normal, habrá una competencia entre una molécula específi­
ca de ddNTP y un exceso de moléculas análogas de dNTP para in­
fusión en la cadena de DNA en crecimiento -si se incluye un
cNTP, la extensión de la cadena continúa, pero a veces se incorpo­
ra un ddNTP y da lugar a la terminación de la cadena-. En conse­
cuencia cada reacción es una reacción parcial porque la terminación
¿e la cadena ocurrirá de manera aleatoria en una de las posibles elec-
;iones para un tipo específico de base en cualquier cadena de DNA.
Puesto que el DNA en una reacción de secuenciación de DNA
casi siempre es una población de moléculas idénticas, cada una de
las cuatro reacciones específicas de base generará un conjunto de
—aginemos de DNA marcados. Los fragmentos de DNA sintetiza­
dos en cada una de las cuatro reacciones abarcarán una gama de ta­
maños diferentes. Tienen un extremo 59 común pero extremos 39
■.ariables (el extremo 59 se define por el cebador de secuenciación;
los extremos 39 son variables porque la inserción del ddNTP selec­
cionado ocurre en form a aleatoria en una de las múltiples posicio­
nes distintas que aceptarán esa base específica) (véase fig. 7-2).
Los fragmentos que difieren de tamaño incluso en un nucleóti­
do aislado pueden fraccionarse de tamaño en un g e l d e p olia crila -
NH,
HC
HC
® ® ® — o -c h 2 v \
mi
Fig. 7-1. Estructura de un didesoxinucleótido, 2 ,3' didesoxi CTP (ddCTP).
N ota: el grupo hidroxilo unido al carbón 3 ' en nucleótidos normales es
reemplazado por un átomo de hidrógeno (se muestra en el cuadro
sombreado).
183
m ida desnaturalizante (un gel que contiene una concentración al­
ta de un agente desnaturalizante -como urea 8 M - que asegura que
el DNA que migra permanezca de cadena única). Con anterioridad
en las reacciones de secuenciación de DNA se utilizaba el marcado
con radioisótopos como 35S o 33P y después de exponer el gel de se­
cuenciación secado a una placa de rayos X, la secuencia se leía ma­
nualmente siguiendo las bandas sucesivas en la autorradiografía.
Los métodos de secuenciación de DNA automatizados superaron
este problemático método.
7.1,2 Secuenciación automatizada de DNA y
resecuenciación basada en microarregios
Secuenciación automatizada de DNA
La secuenciación automatizada de DNA utiliza el m arcado con
fluorescencia-, el DNA se marca mediante la incorporación de un
cebador o dNTP que porta un flu oró fo ro (un grupo químico capaz
de fluorescer; véase sección 6.1.2). El uso de diferentes fluoróforos
en las cuatro reacciones específicas de base significa que, a diferen­
cia de la secuenciación convencional de DNA, todas las cuatro
reacciones pueden cargarse en una sola línea. Durante la electrofo-
resis, un monitor detecta y registra la señal de fluorescencia confor­
me el DNA pasa a través de un punto fijo en el gel (fig. 7-3A). Esto
proporciona un rendimiento en forma de perfiles de intensidad pa­
ra cada uno de los diferentes fluoróforos de colores al tiempo que
la información se guarda electrónicamente (fig. 7-3B). Si se sabe
que la secuencia de DNA es codificante, el producto obtenido pue­
de traducirse de inmediato en diferentes marcos de lectura a fin de
deducir una secuencia polipéptida.
Aunque muchos secuenciadores automatizados de DNA recurren
a la electroforesis en planchas de gel de acrilamida, en la secuenciación
de DNA de alta productividad se emplean secuenciadores capilares
en los que las muestras de DNA migran a través de tubos capilares de
vidrio largos muy delgados que se llenaron con el gel (véase Meldrum,
2000). Es posible lograr un mayor grado de automatización si se
evita la necesidad de gel en moldes grandes.
Nueva secuenciación mediante hibridación de microarregios
Una vez que las secuencias se establecieron, en principio pueden
usarse como secuencias de rtferencia con objeto de ayudar a diseñar
oligonucleótidos para secuenciación de DNA basada en hibridación.
Ello comprende la síntesis de oligonucleótidos in situ en una super­
ficie de vidrio para que actúe como una sonda de hibridación a fin
de estudiar el DNA a secuenciar (véase sección 6.4.3 para el princi­
pio de microarregios de oligonucleótidos). La nueva secuenciación
(resecuenciación) puede efectuarse mediante la hibridación de mi-
croarreglos en una forma muy automatizada con una productividad
que excede con mucho la de la secuenciación automatizada del
DNA. Un caso de estudio incluyó la “resecuenciación” de DNA mi-
tocondrial de 16.5 kb (mtDNA) (Chee y cois., 1966; véase fig. 7-4),
pero la secuenciación a muy gran escala por hibridación de microa-
rreglos implica grandes desafíos técnicos.
7.1.3 Genotipificación básica de polimorfismos
de sitio de restricción y número variable
de polimorfismos de repetición tándem
Dos tipos básicos de polimorfismo son factibles de genotipificarse
por medio de métodos simples: polimorfismos de sitio de restricción
184 | CAPÍTULO SIETE ANÁLISIS DEL DNA Y ESTRUCTURA, VARIACIÓN Y EXPRESIÓN GÉNICAS

Plantilla de DNA d e caden a única

+20 +1
5' ■ - CGAATGCTCAGGCCATCATC.
IIIIIIIIIIIIII
I5'
Síntesis de ! C ebador
DNA nuevo !
n n u c le ó tid o s
d e la rg o

F r a c c io n a m ie n to
L o n g itu d d e l s e g ú n e l ta m a ñ o
r e a c c ió n ] ( t e r m in a c p n c jd A T P )
D N A s in te tiz a d o
! *
i AG c n + 2 n + 20 = G
AGTAG : n + 5
3' 5' n + 13
ÁG TCCG G TAG TAG t n + 19 = C
ACGAGTCCG GTAGTAG : n + 16
n + 18 = T

n + 17 = T
r e a c c ió n ( t e r m in a c o n d d C T P )
n + 16 = A

n + 15 = C
.C G G T A G T A G c n + 9
CCGG TAG TAG c n + 10 n + 14 = G
3' . C G A G T C C G G T A G T A G t: 5' n + 15
C TTAC GAG TCCG G TAG TAG c n + 19 n + 13 = A

n + 12 = G

r e a c c ió n ( t e r m in a c o n d d G T P ) n + 11 = T

n + 10 = C
n +1
. GTAG c n + 4 n + 9 = C
„ GTAGTAG c n + 7
3' , GGTAGTAG c 5' n + 8 n + 8= G
. G TCCG G TAG TAG c n + 12
, GAGTCCGGTAGTAG= n + 14 n+ 7 = G
G C TTAC GAG TCCG G TAG TAG c r? + 20
n+ 6 = T

n + 5 = A
[T i r e a c c ió n ( t e r m in a c o n d d T T P
n + 4 = G

n+ 3 = T
. TAG l n + 3
. TAG TAG : n + 6
3' . T CCGG TAG TAG : 5' n + 11 n+ 2 = A
.T A C G A G T C C G G T A G T A G c n + 17
TTAC G AG TCCG G TAG TAG : n +18 n + 1 = G

Fig. 7-2. La secuenciación de dldesoxi DNA se basa en la incorporación aleatoria de termlnadores de cadena específicos de base durante la sínte­
sis de DNA in vitro.

El cebador de secuenciación se enlaza de manera específica a una región 3 ' de la secuencia deseada de DNA y ceba la síntesis de una cadena de DNA
complementaria en la dirección indicada. Se llevan a cabo cuatro reacciones específicas de base paralelas, cada una de ellas con los cuatro dNTP y con
un ddNTR La competencia para la incorporación en la cadena de DNA en crecimiento entre un ddNTP y su análogo dNTP normal produce una población
de fragmentos de diferentes longitudes. Los fragmentos tendrán un extremo 5 ' común (definido por el cebador de secuenciación) pero extremos 3 ' varia­
bles según se haya insertado un didesoxinucleótido (que se muestra con un círculo lleno arriba). Por ejemplo, en la cadena de reacción específica A la ex­
tensión ocurre hasta que se incorpora un nucleótido ddA (se muestra como A con un círculo rojo lleno arriba). Esto dará lugar a una población de
fragmentos de DNA de longitudes n + 2, n + 5, n + 13, n + 16 nucleótidos, etc., cuyo fraccionamiento de tamaño, como se muestra a la derecha, pro­
ducirá la secuencia siguiente de n = 1 a n + 20, GATGATGGCCTGAGCATTCG, que es el complemento inverso de la secuencia que se muestra en la par­
te superior izquierda.
 7.1 i SECUENCIACIÓN Y GENOTIPIFICACIÓN DE DNA 185

Computadora

Salida

Lá ser D e te c to r

B)
450 460 470 480 490 500 510 520
ATTCACACTTG AGTAACTCG CTATCCATTTCTTCCAATG TCTCTTCAG CCATCATGTCTTCTATCTCTG TG TCGG A

Fig. 7-3. Secuenciación automatizada de DNA con cebadores fluorescentes.

A) Principios de la secuenciación automatizada de DNA. Los cuatro productos de reacción se cargan en hileras únicas de gel de electroforesis o en
capilares de gel únicos. Se utilizan cuatro colorantes fluorescentes separados como marcadores para las reacciones específicas de base (el marcador
puede incorporarse mediante su fijación a un ddNTP específico de base o su unión al cebador y teniendo cuatro grupos de cebadores que correspon­
den a las cuatro reacciones). Durante la electroforesis se enfoca un haz láser en una posición específica constante en el gel. Conforme los fragmentos
de DNA individuales migran después de esta posición, el láser causa la fluorescencia de los colorantes. La fluorescencia máxima ocurre a diferentes lon­
gitudes de onda para los cuatro colorantes, la inform ación se registra por medios electrónicos y la secuencia interpretada se almacena en una base de
datos de computadora. B) Ejemplo de producción total de secuencia de DNA. Se muestra una producción típica de datos de secuencia como una su­
cesión de perfiles de intensidad específicos de colorante (y por tanto específicos de base). El ejemplo que se ilustra muestra una secuencia de cDNA
:e l gen polihomeótico humano recién identificado PHC3 (Tonkin y cois., 2002). Datos proporcionados por la doctora Emma Tonkin, Institute of Human
Genetics, University of Newcastle upon Tyne, UK.

>N'P) y polimorfismos de número variable de repetición tándem
~.'NTR). En el recuadro 7-2 se describen varios polimorfismos de­
rivados.
Genotipificación de polimorfismos de sitio de restricción (SNP)
En el estudio de la susceptibilidad a enfermedades frecuentes a me­
nudo se emplean polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) co­
mo marcadores y para detectarlos se diseñó una variedad de
métodos automatizados de genotipificación de alto rendim iento (véa­
se recuadro 18-2). Un subgrupo de SNP origina una pérdida o una
ganancia de un sitio de restricción (polimorfismos de sitio de res­
tricción o SNP) y con frecuencia se tipifican a pequeña escala por
métodos de genotipificación simples.
En el pasado los SNP se tipificarían mediante hibridación Sout-
hem con una sonda cercana para detectar el fragmento de restricción
iterado y cuando este tipo de valoración se usaba los SNP se descri-
r :an como polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción
(RFLP; véase fig. 7-5A para el principio general). Sin embargo, en la
actualidad es más sencillo emplear un método basado en PCR para
tipificar un SNP: se diseñan cebadores a partir de secuencias que
flanquean el sitio de restricción polimórfico y el producto amplifica­
do se corta con la enzima de restricción apropiada y se fracciona de
tamaño mediante electroforesis de gel de agarosa (fig. 7-6).
Genotipificación de polimorfismos de número variable de
repetición tándem (VNTR)
El polimorfismo microsatélite es un tipo de VNTR en el que el tama­
ño del arreglo y el de las repeticiones tándem son cortos (véase recuadro
7-2 para nombres alternativos) y por tanto resulta conveniente llevar a
cabo la tipificación mediante PCR. Los cebadores se diseñan a partir de
secuencias que se sabe que flanquean un locus microsatélite específico,
lo que permite la amplificación mediante PCR de alelos cuyos tamaños
varían por unidades integrales repetidas (fig. 7-7). A continuación los
productos de la PCR pueden fraccionarse de tamaño mediante
186 CAPÍTULO SIETE } ANÁLISIS DEL DNA Y ESTRUCTURA, VARIACIÓN Y EXPRESIÓN GÉNICAS

A) C)
3 46 0 g —> a
-O H

13 708
W B jg assafr* 3 460
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Fig. 7-4. Nueva secuenciación (resecuenciación) del genoma mitocondrial mediante hibridación de microarreglo chip-oligonucleótido único.
A) Imagen del arreglo hibridado a 16.6 kb del RNA blanco mitocondrial (hilera L) aunado a un mapa del genoma de mtDNA. B) Una porción del patrón de
hibridación amplificado. C) Capacidad del arreglo para detectar y leer diferencias de base única en una muestra de 16.6 kb. Dos secuencias blanco dife­
rentes se hibridaron en paralelo a distintos chips. Los patrones de hibridación se compararon para las cuatro posiciones diferentes en la secuencia. El gru­
po superior de cada par muestra la hibridación de una secuencia de referencia y el inferior indica el patrón generado por una muestra tomada de un paciente
con neuropatía óptica hereditaria de Leber. Se detectaron con claridad tres mutaciones patógenas conocidas en los nucleótidos 3 460, 4 216 y 13 708.
Para comparación, el cuarto grupo del conjunto muestra una región alrededor de la posición 11 778 que es idéntica en las dos muestras. Reimpreso con
autorización de Chee y cois. (1996). Science 274, 610-614, American Association for the Advancement of Science.

electrofbresis en gel de poliacrilamida. En condiciones normales la
PCR incluye un precursor nucleótido radiactivo o fluorescente que se
incorpora en los productos de la PCR pequeños y facilita su detec­
ción. Los productos de la PCR se desnaturalizan antes de la electrofo-
resis para asegurar el fraccionamiento de alelos de tamaño adecuado.
La figura 7-8 muestra un ejemplo del uso de un microsatélite (CA)n
Los polimorfismos de VNTR minisatélite suelen tipificarse me­
diante hibridación Southern. El DNA se digiere con una(s) enzi-
ma(s) de restricción que se sabe que corta(n) en sitios de flanqueo
cercanos a la secuencia VNTR importante. Esto produce un frag­
mento de restricción que contiene el VNTR aunado a la secuencia
única de DNA vecino. Una sonda obtenida de la última secuencia
puede detectar la variación de longitud como un polimorfismo de
longitud de fragmento de restricción (RFLP) (véase fig. 7-5B).
7.2 Id en tificación de genes en DNA
clonado y e s tab lecim ien to
de su estru ctu ra
La identificación de genes en DNA clonado se basa en la valoración
de las propiedades específicas del gen. Dos características principa­
les permiten distinguir el DNA de los genes del DNA que no tie­
nen una función de codificación: d) conservación evolutiva total alta
 7.2 ! IDENTIFICACIÓN DE GENES EN DNA CLONADO Y ESTABLECIMIENTO DE SU ESTRUCTURA
Recuadro 7-2. C lases com unes de polimorfismo de DNA susceptibles a m étodos simples de genotipificación
Como se detalla en el capítulo 11, una variación del DNA puede ocurrir a
diferentes niveles. En ocasiones se observan grandes cambios, como
duplicaciones, inserciones, deleciones y transposiciones de kilobases, y
aun extensiones de DNA de tamaño megabase, algunas de las cuales se
relacionan con enfermedades. Sin embargo, los cambios más frecuentes
en la secuencia de DNA incluyen sustituciones, inserciones y deleciones
de nucleótidos únicos. No suelen relacionarse con una enfermedad a me­
nos que alteren una secuencia de codificación o una secuencia regula­
dora importante. Una variación del DNA se describe com o p o lim o rfism o
si es lo bastante frecuente en una población para que pueda explicarse
por una mutación recurrente (véase sección 11.1). Los polim orfism os
que pueden genotipificarse de manera simple corresponden a dos clases
básicas:
► SNP (polimorfismos de nucleótido único). Un SNP es un polim or­
fism o que se origina por el cambio de un nucleótido aislado. Suele va­
lorarse mediante secuenciación del DNA (secciones 7.1.1; 7.1.2) o
valoraciones de extensión del cebador (recuadro 18-2);
► polimorfismo VNTR (número variable de repeticiones tándem). Un
polim orfism o que surge por inestabilidad en un arreglo de repeticio­
nes tándem que causa un cambio en el número de unidades de repe­
tición. Aunque es un término general que incluye polim orfism o de
VNTR microsatélite y VNTR minisatélites (véase más adelante), a me­
nudo se utiliza con laxitud para indicar la clase minisatélite.
e b) expresión para dar transcritos de RNA. En la inmensa mayoría
de los casos los transcritos de RNA se someten a empalme (splicing,
corte y unión) y se traducen para dar polipéptidos (y en consecuen­
cia se distinguen por tener m arcos d e lectu ra abiertos [MLA] lar­
gos). Además con frecuencia los genes de vertebrados se relacionan
con islotes CpG (véase recuadro 9-3). Estas características posibili­
taron el desarrollo de una variedad de métodos para identificar ge­
nes DNA de vertebrados clonados (Monaco, 1994).
Métodos de rutina para identificar genes
Una vez que se dispuso de clonas de DNA genómico, los genes se de­
finieron mediante métodos simples como primer recurso. A fin de es­
tudiar las pruebas de expresión, los métodos estándar incluyen
selección de genotecas de cDNA (sección 5.3.5), la realización de
PCR-RT (sección 5.2.1) y sondas de prueba hibridantes contra Nort­
hern blots (fig. 6-13). Después las valoraciones de expresión suelen ex­
tenderse a valoraciones de hibridación in situ contra RNA en cortes
de tejido (fig. 6-15). El método alternativo para buscar la conserva­
ción evolutiva solía confiar en la zooblot para identificar secuencias
muy conservadas a través de una gama de especies (véase fig. 7-9). En
fecha más reciente, la búsqueda de homología de bases de datos de se­
cuencia se constituyó en un medio importante para identificar genes:
si una secuencia de prueba se relaciona de manera cercana con alguna
otra secuencia de codificación hay una buena posibilidad de que tam­
bién sea una secuencia codificante (véase recuadro 7-3).
Además de los métodos de rutina para identificar genes, se uti­
lizan dos procedimientos más especializados: atrapamiento de exón
mediante valoración artificial de empalme (splicing) de RNA y se­
lección del cDNA.
187
Algunas subclases derivadas de las clases anteriores de polimorfismos son:
► SNP (polimorfismo del sitio de restricción). Un SNP es un subgru-
po de SNP en el que el cambio en el nucleótido causa pérdida o ga­
nancia de un sitio de restricción. Se tipifica mediante PCR o, de
manera alternativa, hibridación Southern, en cuyo caso el polim orfis­
mo también puede describirse como un RFLP (véase abajo);
► RFLP (polimorfismo de longitud de fragmento de restricción). Un
polim orfism o que produce un cambio en la longitud de un fragmento
de restricción y se tipifica mediante hibridación Southern. Puede pre­
sentarse en dos formas:
• como resultado de un SNP (véase antes);
• como resultado de variación de la longitud de un fragmento de res­
tricción que contiene un arreglo VNTR moderadamente largo de
repeticiones tándem. Los sitios de restricción de flanqueo no
cambian, pero la longitud entre ellos puede aumentar o dism inuir
según el número de unidades repetidas.
► VNTR microsatélite [también llamado polimorfismo de repetición
tándem corto (PRTC) o polimorfismo de repetición de secuencia
simple (PRSS)]. Un tipo de VNTR en el que son pequeños tanto el
arreglo (por lo general de 100 pb) como la unidad repetida, casi siem­
pre de 1 a 4 nucleótidos de largo; véase también la sección 9.4.3;
► VNTR minisatélite (a menudo se abrevia de manera confusa como
VNTR). En este caso el tamaño del arreglo es más o menos largo y
con frecuencia la unidad repetida tiene 9 a 65 pb de longitud; véase
también sección 9.4.2.
7.2.1 El atrapamiento de exón identifica secuencias
expresadas mediante una valoración artificial
de empalme (splicing) de RNA
El empalme (corte y unión) de RNA comprende la fusión de secuen­
cias exónicas a nivel del RNA y la excisión de secuencias intrónicas.
Los espliceosomas son capaces de realizarlo in vivo mediante el reco­
nocimiento de ciertas secuencias en los límites exón-intrón: una se­
cuencia donadora d e em palm e en la unión entre un exón y su intrón
corriente abajo (3 ’), y una secuencia aceptora d e em palm e en la unión
entre un exón y su intrón corriente arriba (5') (véase fig. 1-15). Un
cósmide u otra clona de DNA genómico apropiada que contiene un
exón interno flanqueado por secuencias intrónicas contendrá en con­
secuencia el donador de empalme funcional y secuencias aceptoras.
Es posible identificar exones en DNA genómico clonado me­
diante la subclonación de DNA en un vector de expresión apropia­
do y su transfección a una línea de células eucariotas apropiada en
la que el DNA insertado se transcribe en RNA y el RNA transcri­
to se somete a empalme (corte y unión) de RNA. Estas técnicas se
conocen como atrapamiento de exón (a menudo se denominan am­
plificación de exón si se utiliza una PCR para recuperar los exones y
una copia de cDNA del RNA cortado y unido [empalmado]). Por
ejemplo, en el método de Church y colaboradores (1994) el DNA se
subclona en un vector de expresión plásmide pSPL3 (fig. 7-10A) que
contiene un minigén artificial que puede expresarse en una célula
huésped apropiada. El minigén consiste en: un segmento del geno-
ma del virus simiano 40 (SV40) que comprende un origen de repli-
cación aunado a una secuencia promotora potente; dos exones
competentes de empalme separados por un intrón que contiene un
sitio de clonación múltiple, y un sitio de poliadenilación SV40.
188 CAPÍTULO SIETE ANÁLISIS DEL DNA Y ESTRUCTURA, VARIACIÓN Y EXPRESIÓN GÉNICAS

SV40 produce un transcrito de RNA que por lo general se empal­

A) ma para incluir los dos exones del minigén. Sin embargo, si el
DNA clonado dentro del intrón intermedio contiene un exón fun­
cional, los exones extraños pueden empalmarse a los exones que se
encuentran en el minigén del vector. Después de elaborar una co­
pia de cDNA por medio de transcriptasa inversa, las PCR que uti­
lizan cebadores específicos para secuencias del exón vector deben
distinguir entre el empalme normal y el empalme que incluye exo­
A le lo s
nes en el inserto de DNA (véase fig. 7-10B).

7.2.2 La selección de cDNA identifica secuencias

expresadas en clonas genómicas mediante
la formación de heterodúplex

V a lo ra c ió n a ) d ig e rir c o n n u c le a s a d e re s tric c ió n R El método de selección de cDNA implica hibridar un DNA com­

b ) fra c c io n a r d e ta m a ñ o e n g e l plejo clonado, como el inserto de un YAC, a una mezcla compleja
c ) h ib rid a r c o n s o n d a m a rc a d a de cDNA, como los insertos de todas las clonas de cDNA en una
A le lo s (x + y) o x , y genoteca de cDNA (Lovett, 1994). El principio que sustenta la téc­
nica es que los cDNA afines (cognate) correspondientes a los genes
G e n o tip o s mmmm X + y x + y
que se encuentran dentro del YAC se enlazarán de preferencia con
y el DNA del cromosoma artificial de levadura (YAC); varias rondas
x de hibridación deben conducir al enriquecimiento enorme de las
a, a a, b b, b secuencias deseadas de cDNA, lo que permite identificar los genes
correspondientes. Se requiere un bloqueo considerable de secuen­
cias de DNA repetidas.
Los primeros métodos que se usaron inmovilizaban los YAC, pe­
B) ro las técnicas más modernas emplean una reacción de hibridación
en solución y métodos de captura de biotina-estreptavidina (véase
fig. 7-11). Como todos los sistemas que se basan en expresión, el
Los alelos método depende de niveles apropiados de expresión génica (los cD­
v arían en los NA afines [cognate] no deben ser muy raros en la población de ini­
n ú m e ro s de -
cio). Además es posible que se pasen por alto genes que contienen
rep eticione s
tá nde m exones muy cortos porque los heterodúplex que se formaron con
cDNA afines tal vez no posean la estabilidad suficiente. Otro pro­
blema es que los cDNA pueden enlazarse a seudogenes que mues­
tran un grado alto de homología con los genes funcionales afines.

7.2.3 Obtención de secuencias de cDNA de longitud

completa: grupos de clonas superpuestas
A le lo s (c o m o e n A a rrib a ) y amplificación PCR-RACE

T a m añ os d e a le lo : x + y + (n x re p eticione s) en la q u e n es v a ria ble
Fig. 7-5. Tipificación de un RFLP mediante una valoración basada en
hibridación.
Una prioridad inicial en la definición de la estructura génica con­
siste en obtener una secuencia de cDNA de longitud completa y de­
finir los sitios de inicio y terminación de la traducción y el (los)
sitío(s) de poliadenilación.

A) Tipificación de un RFLP tipo PCR. Éste es el tipo usual de RFLP y se

debe a una alteración menor de la secuencia de DNA que causa pérdida (o
ganancia) del sitio de restricción. Este tipo de polimorfismo es más fácil
de tipificar mediante una valoración de PCR; véase figura 7-6. B) Tipifica­
ción de un RFLP tipo VNTR Sólo se utiliza una valoración de hibridación
si la expansión y la contracción de la VNTR incluyen cambios de longitud
importantes. De otra manera se emplea una valoración tipo PCR.
El DNA recombinante se transfecta en células COS que, como
se explica en la sección 5.6.3, permiten que cualquier DNA circu­
lar que contiene un origen de replicación SV40 se replique de mo­
do independiente del DNA celular. La transcripción del promotor
Definición de grupos de clonas superpuestas
Un método inicial para obtener una secuencia de cDNA de longi­
tud total consistió en seleccionar una variedad de diferentes geno-
tecas de cDNA y a continuación mapear la extensión de las
superposiciones de los insertos de clonas positivas (por secuencia­
ción o por mapeo basado en PCR/hibridación). Como resultado
se estableció una serie de clonas de cDNA superpuestas, un conti­
guo de clona de cDNA (para un ejemplo, véase el contiguo para
el cDNA de fibrosis quística en Riordan y cois., 1989). La secuen­
ciación completa o seleccionada de una clona definirá una secuen­
cia consenso que puede proporcionar una secuencia de cDNA de
longitud completa.
 7.2 j IDENTIFICACION DE GENES EN DNA CLONADO Y ESTABLECIMIENTO DE SU ESTRUCTUR \ 189

8
A lelo 1
- I

..ninnai
R
A lelo 2
i *
' X —
um iliai

l (1) A m p lific a r

(2) C o rta r el p ro d u c to d e la P C R co n e n z im a d e res tricció n R

I

(3) F ra c c io n a r d e ta m a ñ o m e d ia n te ele c tro fo re s is en gel

I
----------- a + b

. ........ . . K

A le lo s 1 ,1 2 ,2 1 ,2

C lave:
S itio d e la

n n u c le a s a
d e res tricció n

Fig. 7-6. Los polimorfismos de sitio de restricción pueden tipificarse fácilmente mediante PCR como una alternativa a las valoraciones de RFLP laboriosas.

Los alelos 1 y 2 se distinguen por un polim orfism o que altera la secuencia de nucleótidos de un sitio de restricción específico para la nucleasa de restric­
ción R. El alelo 1 posee el sitio, pero el alelo 2 tiene un nucleótido(s) alterado X, X ' y en consecuencia carece de él. Pueden diseñarse cebadores de PCR
a partir de secuencias que flanquean el sitio de restricción para elaborar un producto corto. La digestión del producto de la PCR con enzima R y el frac­
cionamiento de tamaño pueden conducir a la tipificación simple para los dos alelos.

PCR-RACE para extender cDNA de cadena corta
Aunque la PCR-RT puede ayudar a definir transcritos, una varian­
te de la PCR-RT, la técnica RACE (amplificación rápida de extre­
mos de cDNA), tiene eficacia particular para extender secuencias
cortas de cDNA a fin de lograr un cDNA de longitud completa
(Forman y cois., 1988). La PCR-RACE es una modificación de la
PCR de anclaje de la reacción en cadena de la polimerasa de trans-
criptasa inversa (RT-PCR). Su justificación es amplificar secuencias
entre una región aislada caracterizada con anterioridad en el mR-
NA (cDNA) y una secu en cia d e an cla je acoplada a los extremos 5'
o 3'. Se diseña un cebador (a partir de la secuencia interna conoci­
da) y el segundo cebador se elige de la secuencia de anclaje impor­
tante (véase fig. 7-2).
7.2.4 Mapeo de sitios de inicio de transcripción
y definición de límites exón-intrón
Con frecuencia se localizan secuencias reguladoras importantes cer­
ca de los sitios de inicio de transcripción. Aunque es posible que la
PCR-RACE 5' permita rescatar secuencias correspondientes al ex­
tremo 5' de un mRNA (y por consiguiente, el sitio de inicio de la
transcripción), se utilizan de preferencia dos métodos principales
para definir el sitio de inicio transcripcional: protección de nuclea­
sa S 1 y extensión del cebador. La estructura exón-intrón puede de­
terminarse mediante la referencia de la secuencia de cDNA contra
las secuencias de clonas de DNA genómicas afines (cognate). Des­
pués puede intentarse terminar la caracterización del gen a nivel ge-
nómico mediante la secuenciación de regiones promotoras,
secuencias de flanqueo 5' y 3', y secuencias de intrón.
Protección de nucleasa S1
La endonudeasa SI es una enzima obtenida del moho Aspergillus
oryzae que corta RNA y DNA de cadena única pero no moléculas
de cadena doble. Para mapear el sitio de inicio de transcripción de
un gen se requiere una clona de DNA genómico que se piensa que
contiene el sitio de inicio. A continuación la clona de DNA se di­
giere con una endonudeasa de restricción apropiada para generar
un fragmento que se espera que contenga el sitio de inicio de trans­
cripción. Como se muestra en la figura 7-13A, la hibridación al
mRNA afín y la digestión con nucleasa S 1 definen la distancia del
190 ANÁLISIS DEL DNA Y ESTRUCTURA, VARIACIÓN Y EXPRESIÓN GÉNICAS

© Usar cebadores de PCR P1, P2 para am plificar alelos en muestras de DNA genómico
40 bp .................... .. - P2
A lelo 1 = (C A )16
CA] CAICA CA CA CA C ACA CA CA CA CA CA CA CA CA
GTIGTIGT GT GTlGT GT GT g t Ig t i g t I g t íg t . g t GTlGT
P1
40 pb
P ro d u c to d e la P C R = 8 0 + 3 2 = 1 1 2 pb

P2
A elo 2 = (C A )i M ----------

- CA CA CA CA CA CA U A U A (JA UA CAjCA CA CA
— GT GT GT GT GT GT ftT ftT P J P,T GTÍGT GT GT
P1
------- ►
P ro d u c to d e la P C R = 8 0 + 2 8 = 1 0 8 p b

P2
A lelo 3 = (C A )n

P1

P ro d u c to d e la P C R = 8 0 + 2 2 = 1 0 2 p b

(2 ) Desnaturalizar productos de la PCR y fraccionar de tam año mediante electrofosis en gel de poliacrilamida

@ A u to rra d io g ra f ía

Fig. 7-7. Se utiliza PCR para tipificar polimorfismos de repetición tándem cortos (PRTC).

El ejemplo ilustra la tipificación de un marcador microsatélite, en este caso un polim orfism o de repetición de dinucleótido (CA)/(TG) que tiene tres alelos
como resultado de una variación en el número de las repeticiones (CA)/(TG). En la autorradiografía cada alelo está representado por una banda superior
mayor y dos “ bandas sombreadas” menores (véase fig. 7-8). Los individuos A y B tienen los genotipos (entre paréntesis) siguientes: A(1,3); B(2,2).

sitio de inicio de la transcripción a partir del extremo no marcado
del fragmento de restricción. Cuando se requiere una localización
más precisa puede secuenciarse el fragmento de DNA marcado en
el heterodúplex mediante un método químico de secuenciación de
DNA (véase Maxam y Gilbert, 1980). Cabe señalar que, en gran
parte en la misma forma, también puede utilizarse el mapeo con
nucleasa SI con objeto de mapear otros límites entre DNA codifi­
cante y no codificante, como los límites de exón-intrón (véase más
adelante) y el extremo 3' de un transcrito.
mentos del cDNA y utilizarse en secu en ciación cíclica d e l DNA
con clonas genómicas desnaturalizadas conforme la secuenciación
de DNA forma plantillas (véase recuadro 7-1). La secuencia obte­
nida debe cruzar un límite exón-intrón, a menos que el exón sea
muy grande, en cuyo caso quizá se requieran cebadores de secuen­
ciación adicionales. Por supuesto, una vez que se secuenció un ge­
noma, lo único que se requiere es una referencia cruzada de clonas
cDNA contra la secuencia genómica disponible.

Extensión dei cebador 7 .3 Estudio de la expresión génica

El método es muy similar al de la protección de nucleasa SI. En es­
te caso el fragmento de restricción elegido debe ser más corto que
el mRNA y la saliente se llena mediante transcriptasa inversa (fig.
7-13B). Como con el mapeo con nucleasa SI, es posible localizar
con más precisión el sitio de inicio de transcripción si se recurre al
método de secuenciación química de Maxam y Gilber (1980) a fin
de secuenciar la cadena de DNA marcada.
Determinación de la organización exón-intrón
Aunque no todos los genes humanos tienen intrones (véase cuadro
9-5), cuando se encuentran suelen ser grandes en comparación con
los exones. La presencia de intrones suele inferirse por el mapeo
comparativo de clonas genómicas y de cDNA afines. Una vez que
la secuencia completa del cDNA se establece, es posible diseñar ce­
badores de secuenciación según se requiera a partir de varios seg­
7.3.1 Principios de la selección de expresión
La selección de expresión puede realizarse a diferentes niveles y uti­
lizarse una diversidad de tecnologías distintas. El blanco lo consti­
tuyen transcritos de RNA o proteínas. En la expresión proteínica
aún suelen emplearse anticuerpos muy específicos, pero los trans­
critos de RNA pueden seguirse por diferentes tipos de métodos.
Por lo general incluyen hibridación molecular con una sonda de
ácido nucleico antisentido específica o cierta variante de la reacción
PCR-RT. Sin embargo, se diseñaron algunos métodos alternativos
ingeniosos como el SAGE (análisis seriado d e expresión g é n ica ),
que rastrea grandes números de transcritos individuales siguiendo
marcadores de secuencia corta representativos (véase sección
19.3.2), Los parámetros importantes en la expresión génica son el
origen del material de estudio, la resolución de expresión y el ren­
dimiento (véase fig. 7-14).
 7.3 I ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN GENICA 191

Origen del material de estudio

Fig. 7-8. Ejemplo de tipificación para una repetición CA.
El ejemplo muestra la tipificación de miembros de una familia grande con
el marcador (CA)/(TG) D17S800. Las flechas de la izquierda indican la
banda superior (principal) que se observa en diferentes alelos 1-7. Ob­
sérvese que los alelos individuales presentan una banda superior poten­
te seguida de dos “ bandas sombreadas" inferiores, una de intensidad
intermedia justo subyacente a la banda superior potente y una que es
muy débil y se localiza inmediatamente abajo de la primera banda som ­
breada. Para los individuos indicados, los genotipos (entre paréntesis)
son los siguientes: 1(3,6); 2(1,5); 3(3,5); 4(2,5); 5(3,6); 6(2,5); 7(3,5);
8(3,6); 9(3,5); 10(5,7); 11(3,3); 12(2,4); 13(3,3); 14(3,6); 15(3,3); 16(3,4).
Obsérvese también que en el último caso la banda media es particular­
mente intensa porque contiene tanto la banda principal para el alelo 4 co­
mo la banda sombreada principal para el alelo 3. Se piensa que el
principal mecanismo que origina la producción de bandas sombreadas
en repeticiones tándem de dinucleótidos es el pareamlento erróneo de
cadena deslizada (véase sección 11.3.1) (Hauge y Litt, 1993).
El material de estudio puede variar mucho. Con frecuencia se pre­
paran extractos de RNA/cDNA o proteínicos sin refinar, pero en
otros casos la expresión se muestrea en cortes de tejidos o aun en
embriones complejos fijados de una manera que permita conservar
la morfología original in vivo. La expresión también puede estu­
diarse en células vivas en cultivo de tejido (pero siempre queda la
duda de lo representativas que son en relación con el mismo tipo
de células in vivo). En organismos experimentales vivos en los que
los tejidos son ópticamente transparentes, es posible rastrear la ex­
presión génica con ayuda de marcadores fluorescentes.
Los métodos recientes de microdisección con captura láser
comprenden el uso de láser a fin de microdisecar tejidos para pro­
ducir poblaciones celulares puras de fuentes como biopsias de teji­
dos y tejidos teñidos, inclusive células aisladas (véase Schutze y
Lahr, 1998; Simone y cois., 1998). Estos adelantos permitirán en­
focar una diversidad de análisis de expresiones génicas en células
aisladas o en poblaciones celulares homogéneas que serán más re­
presentativas del estado in vivo de las líneas celulares.
Resolución de la expresión génica
Algunos métodos se diseñaron sólo para rastrear la expresión gruesa de
genes en extractos de RNA o de proteínas. Estos patrones de expresión
de resolución baja suelen intentarse como un método de primer paso.
Además de ser capaces de muestrear la expresión en diferentes tejidos,
pueden brindar información útil del tamaño del producto y las posi­
bles isoformas. En contraste, es posible obtener una expresión de alta
resolución mediante métodos que rastrean patrones de expresión den­
tro de una célula, o en grupos de células y tejidos con una organización
espacial representativa de la organización normal in vivo.

SHOX2 SHOX
■njS' COcOO<Df
E S c t S g 'Om>cD
sr'H ■o e <5
i i
CCI£rOCLÜ>00 í í í X

— 23 kb — 23 kb

— 9.4 kb — 9.4 kb

— 6.6 kb — 6.6 kb

— 4.4 kb — 4.4 kb

— 2.3 kb 2.3 kb
— 2.0 kb 2.0 kb

Fig. 7-9. La hibridación zooblot identifica secuencias conservadas en términos evolutivos.

Algunos genes muestran una conservación extraordinaria a través de las especies; en otros es menor, inclusive el que se ilustra aquí. El gen SHOX humano se loca­
liza en la región seudoautosómica m ayor en la punta de Xp/Yp (fig. 12-15). Es un locus para algunos síndromes de estatura baja que se caracterizan por anorma­
lidades esqueléticas y pueden contribuir de manera importante al síndrome de Turner. Aunque se conserva en una diversidad de mamíferos distintos, los roedores
carecen de él (véase panel derecho, líneas a la izquierda) como resultado de la deleción del gen en el pasado evolutivo, quizás en una etapa temprana del linaje que
condujo a roedores. La secuenciación reciente del genoma de ratón confirmó la ausencia de un homólogo de SHOX. El gen SH0X2 autosómico relacionado está
mucho más conservado (panel izquierdo). Reproducido de Clement-Jones y cois. (2000) Human Molec. Genet. 9 ,696, con autorización de Oxford University Press.
192 SIE ANÁLISIS DEL DNA Y ESTRUCTURA, VARIACIÓN Y EXPRESIÓN GÉNICAS

Recuadro 7-3. Investigación de homología en b ases de datos

Se diseñaron programas de computadora potentes con objeto de buscar ba­
ses de datos de secuencias de ácido nucleico y proteínas para compatibili­
dad de secuencia significativa (homología de secuencia) con una secuencia
de prueba en investigación. Los que más se utilizan son los diferentes pro­
gramas BLAST y FASTA (véase Ginsburg, 1994 y el cuadro de abajo).
Programa Compara _________ ________________
FASTA Una secuencia nucleótida con una base de datos o una
secuencia de aminoácidos con una base de datos de
secuencias proteínicas.
TFASTA Una secuencia de aminoácidos con una base de datos
de secuencia de nucleótidos traducida en los seis mar­
cos de lectura
BLASTIN Una secuencia nucleótida con una base de datos de se­
cuencia nucleótida
BLASTX Una secuencia nucleótida traducida en los seis marcos de
lectura con una base de datos de secuencia proteínica
EST BLAST Una secuencia cDNA/EST con bases de datos de se­
cuencias cDNA/EST
BLASTP Una secuencia de aminoácidos con una base de datos
de secuencia de proteínas
TBLASTN Una secuencia de aminoácidos con una base de datos
de secuencia de nucleótidos traducida en los seis mar­
cos de lectura
Nota: puesto que el diseño de programas comparables como FASTA y
BLASTN es distinto, pueden brindar resultados diferentes (véase Gins­
burg, 1994). Todos los programas anteriores son accesibles a través de
la Internet de diversos centros, como el US National Center for Biotech­
nology Information (http://www.ncbi.nih.gov/) y el European Bioinforma-
tics Institute (http://www.ebi.ac.uK/)
Los programas como BLAST y FASTA utilizan algoritmos para identificar ali­
neamientos de secuencia óptimos y por lo general muestran la producción
total como una serie de comparaciones a manera de pares entre la secuen­
cia de prueba (secuencia de interrogación) y cada secuencia relacionada
que identifica el programa en la base de datos (secuencias tema).
Pueden seguirse diferentes métodos para calcular las alineaciones de se­
cuencia óptimas. Por ejemplo, en alineaciones de secuencia de nucleótidos
el algoritmo diseñado por Needleman y Wunsch (1970) busca maximizar
el número de nucleótidos compatibles. En contraste, en otros programas,
com o el de Waterman y cois. (1976), el objetivo es reducir al mínimo el
número de incompatibilidades. Las comparaciones de alineamientos de
secuencia a manera de pares son comparativamente simples cuando las
secuencias de estudio son compatibles de manera muy cercana y tienen
longitudes similares, de preferencia idénticas. Cuando las dos secuencias
que se comparan son muy diferentes entre sí, y en especial cuando hay
diferencias claras en la longitud a causa de deleciones/inserciones, quizá
se requiera un gran esfuerzo para calcular la alineación óptima (véanse
los siguientes renglones).

G AT A TTA TC A C TG G A G C C TGGCA G G A G C T G A TA TTA TC A C TG G A G C C TG G C A G G A G C T

*** **** ★**★■***★★★★ *-k-k★*★* Q ★★★ *★★★ ★★★★★★★★★★ *
G A T T T T A T G A C T G G A G C C T G A -A G G A G C T G A T T T T A T G A C T G G A G C C T -G A A G G A G C T

Dificultad en las alineaciones de secuencias. En este caso las secuencias de dos nucleótidos se relacionan claramente pero en la secuencia GGC que se
muestra en la parte superior hay incertidumbre en cuanto a la mejor alineación con la secuencia GA correspondiente en la secuencia inferior.

Si la secuencia que se investiga es de codificación, entonces pueden aña­
dirse alineamientos de secuencias de nucleótidos mediante alineamientos
paralelos de secuencias de aminoácidos utilizando el marco de lectura de
traducción supuesto para la secuencia de codificación. Esto se debe a que
hay 20 aminoácidos diferentes pero sólo cuatro nucleótidos distintos. Las
alineaciones de secuencias de aminoácidos a manera de pares también
pueden apoyarse en las subclases químicas de aminoácidos. Las sustitu­
ciones conservadoras son cambios de nucleótidos que ocasionan el cam­
bio de un aminoácido pero en las que el nuevo aminoácido está relacionado
químicamente con el aminoácido sustituido y casi siempre pertenece a la
misma subclase (recuadro 11-3). Como resultado, los algoritmos que se
emplean para comparar secuencias de aminoácidos por lo general recurren
a una matriz de calificación en la que se disponen pares de calificaciones
en una matriz 20 x 20 donde las más altas concuerdan con aminoácidos
idénticos y aquellos que son de carácter similar (p. e j„ isoleucina y leuci-
na) y las calificaciones más bajas se asignan a aminoácidos que son de un
carácter diferente (p. ej., isoleucina y aspartato; véase Henikoff y Heni-
koff, 1992). La producción total típica proporciona dos resultados totales
por porcentaje de secuencia relacionada, que a menudo se denominan %
de identidad de secuencia (compatibilidad de residuos idénticos sólo) y
% de similitud de secuencia (compatibilidad tanto de residuos idénticos
com o de los relacionados químicamente; véase el grupo abajo).

Calificación = 58.2 bits (125), esperada = 9e-08

Identidades = 39/120 (32%), positivas = 57/120 (47%), vacios = 9/120 (7%)

Interrogación : 1 AKLLIKHDSNIGIPDVEGKIPLHWAANHKDPSAVHTNRCILDAAPTESLLNWQDYEGRTP 60
A + LL++HD+ + G PLH A +H + + V+ +L + W Y TP
Tema: 548 AELIEHDAHPNAAGKNGLTPLHVAVHHNN-- LDIVKLLLPRGGSPHSPAWNGY---TP 601
Interrogación : 61 LHFAVADGNLTWDVLTSY-ESCNITSYDNLFRTPLHWAALLGHAQIVHLL1ERNKSGTI 119
LHA + V L Y S N S + TPLH AA GH + + V LLL + + G +
Tema: 602 LHIAAKQNQIEVARSLLQYGGSANAESVQGV— TPLHLAAQEGHTEMVALLLSKQANGNL 659

Identidad de secuencia y similitud de secuencia. La producción de BLASTP es resultado de la interrogación de la base de datos de proteínas Swiss-prot con una secuen­
cia de interrogación de aminoácidos de 165-283 de la proteina inversina recién identificada. La secuencia tema que aquí se muestra es una secuencia de anquirina de eritro­
cito de ratón. El programa considera no sólo la identidad de secuencia (39 de las 120 posiciones, o 32%, tiene residuos idénticos en las dos secuencias; que se muestran
con letras rojas), sino también la similitud de secuencia (indicadas aquí como “positivas") en la que 19 posiciones adicionales tienen aminoácidos químicamente similares
(se señalan con + ),
 7.3 ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN GÉNICA 193

(1)
A) B) I
x y scm
—
t n
SD SA SD SA

lia llb

Patrón de em palm e I Patrón d e em palm e

lia + llb

cDNA ID

i
P ro d u c to I ■) II
d e la P C R

E xó n a tra p a d o

1. F ra g m e n to d e c lo n a d e D N A g e n ó m ic o en sitio d e c lo n a c ió n m ú ltip le (S C M )
2. T ra n s fe c ta r a c é lu la s C O S
3. E xp re sió n d e l p ro m o to r S V 4 0 - » p ro d u c to d e R N A
4. A islar R N A y u sarlo c o m o p la n tilla p a ra e la b o ra r c D N A
5. A m p lific a r en P C R c o n c e b a d o re s e s p e c ífic o s p a ra e x o n e s en el v e c to r

Fig. 7-10. Atrapamiento de exón mediante el vector pSPL3.

A) Vector plásm ide pSPL3. Este vector “en lanzadera” puede propagarse en £ coli (por medio del origen de replicación orí y la selección para resistencia
a ampicilina) y en células COS de mono (mediante el origen de replicación funcional SV40) (Church y cois., 1994). El vector pSPL3 contiene un minigén
(en negro): la transcripción ocurre del promotor SV40 y el RNA experimenta empalme controlado por la maquinaria de empalme de RNA de la célula hués­
ped, lo que resulta en la fusión de las dos secuencias de exón del vector. B) Patrones de em palm e (co rte y unión). El patrón normal de empalme que se
observa cuando se presentan exones del vector está indicado por el patrón de empalme I. Si un fragmento de DNA genómico clonado en un pSPL3 con­
tiene un exón con un donador de empalme funcional (DE) y secuencias aceptares de empalme (AE), puede ocurrir un patrón de empalme diferente (lia +
llb). Los dos patrones de empalme (corte y unión) pueden distinguirse a nivel del cDNA utilizando varios cebadores de PCR específicos de vector, y el
fraccionamiento del tamaño en geles suele conducir a la recuperación del exón amplificado del DNA genómico.

Rendimiento de la expresión génica Hibridación Northern blot

Algunos métodos están diseñados para obtener datos de expresión
de sólo uno o un número muy pequeño de genes a la vez (expre­
sión de rendim iento bajó). Otros pueden rastrear al mismo tiempo
la expresión de muchos genes al mismo tiempo y en algunos casos
en los que un proyecto de genoma identificó todos los genes de un
organismo suele ser posible conducir la selección d e expresión d el
genom a com pleto (véase sección 19.3).
Este método proporciona patrones de expresión de resolución bajos
mediante la hibridación de un gen o una sonda de cDNA a RNA to­
tal o extractos de RNA total o RNA poli(A)+preparados de diferen­
tes tejidos o líneas celulares. Como el RNA se fracciona de tamaño
en un gel, es posible estimar el tamaño de los transcritos. La presen­
cia de múltiples bandas de hibridación en una línea puede indicar la
existencia de isoformas de diferente tamaño (véase fig. 6-13).

Hibridación in situ de tejidos

7.3.2 Análisis de expresión génica basado en
hibridación: del análisis de un gen aislado a
la selección de la expresión del genoma completo
La selección tradicional de la expresión basada en hibridación ha
tenido un rendimiento bajo, enfocada al análisis de transcritos de
RNA de uno o sólo unos cuantos genes a la vez, pero la resolución
puede variar de baja a alta. Sin embargo, en fecha reciente los aná­
lisis de expresión génica basados en microarreglos anunciaron un
nuevo tipo de rendimiento muy alto de análisis de la expresión de
resolución baja que permite el muestreo simultáneo de transcritos
de RNA de miles de genes a la vez.
Por lo general se obtienen patrones de expresión espacial de alta resolu­
ción de RNA en tejidos y grupos de células mediante hibridación in
situ de tejidos. Los tejidos suelen congelarse o embeberse en cera y lue­
go se seccionan con un micrótomo para obtener cortes muy delgados
(p. ej., 5 micrones de grosor) que se montan en un portaobjetos para
microscopio. La hibridación de una sonda apropiada específica de gen
al tejido en el portaobjetos puede brindar luego imágenes de la expre­
sión detalladas representativas de la distribución del RNA en el tejido
de origen (véase fig. 6-15). A menudo los tejidos utilizados incluyen los
embrionarios que poseen la ventaja de que su tamaño en miniatura per­
mite seleccionar la expresión de muchos tejidos en un mismo corte.
194 CAPÍTULO SIETE ANÁLISIS DEL DNA Y ESTRUCTURA, VARIACIÓN Y EXPRESIÓN GÉNICAS

C lo n a de D N A g e n ó m ic o N u m e ro sa s c lo n a s d e DNA
(YAC, c ó s m id e , etc.) en g e n o te c a s de cD N A
wwwwvw^HI BVlMMMMMMM
/wwwwvwvw-HSSI H g^A M M A M A M A A

V e c to r In s e rta r V e cto r
D ig e rir c o n c o rta d o re s d e 4 pb
Lig a r e n la za d o re s ( ¡ S i ) | Insertos de PCR con
I Í L cebadores específicos de vector

/V W W W W íW i
-■^WO
vW vAAAAAMM
/wwwwwvwfi g-vA/WVMMAMM
PCR mediante
>=>-
cebadores específicos de ((§))
enlazador marcados con biotina
HHHHHHHHhAAAAAAAA/v
1
fW
tM
AAAAA/
# -■ 4 - I 2
} 3 e tc é te ra

H ib rid a r d e s p u é s de b lo q uje
e a rr '^ / r ereppee tic io n e s
N u evo c ic lo

N r is / 3

r® /~ T \ 3
%

C u en tas p a ram a g n é tica s

cu b iertas con e strap tivid in a

Im án ^ Captura de todos los

fragmentos marcados con biotina
C a p tu ra de c u e n ta s
* co n im án
E lusión y a m p lific a c ió n c o n PCR
* m e d ia n te c e b a d o re s e s p e c ífic o s
de v e c to r cD N A

Fig. 7-11. Selección de cDNA mediante captura de cuentas magnéticas.

El método se basa en la formación de heterodúplex entre cadenas únicas de una clona de DNA genómico única (con el número 1) y una población de cD­
NA compleja, como los insertos de una genoteca de cDNA (numerados 1 ,2 ,3 , etc.). Las cadenas de DNA genómico se marcan con un grupo biotina (uni­
do a cebadores de PCR que se incorporan durante la amplificación). La reacción de hibridación favorecerá la formación de heterodúplex que incluyen las
clonas de cDNA afínes con la clona de DNA genómico. En este ejemplo se consideran afines la clona 1 de DNA genómico y la clona 1 de cDNA, es decir,
contienen secuencias comunes que permiten que cadenas en sentido opuesto se enlacen entre sí para form ar un heterodúplex. Los productos de la hibri­
dación con un grupo biotina (inclusive heterodúplex DNA genómico-cDNA) se enlazarán a cuentas paramagnéticas recubiertas con estraptavidina y pue­
den eliminarse de otros componentes de la reacción mediante un imán. A continuación las cuentas separadas pueden tratarse a fin de eludir las moléculas
que contienen biotina y, por medio de cebadores de PCR específicos para las secuencias vectores que flanquean el cDNA, es posible amplificar el cDNA
enlazado. Esta población se envía para ciclos de hibridación adicionales con objeto de enriquecer el cDNA deseado.
 7.3 j ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN GENICA 195

3 ' P C R -R A C E 5 ' P C R -R A C E

A A A A A A A -------- A „ 3' 5' - A A A A A A A -------- A „ 3'

3' < - 5'
\
R T con cebad or
R T con Interno antisentido
I
I

V
ce b ad o r d e an claje 5' - -A A A A A A A -------- A „ 3'
5' -------------------A A A A A A A ----------K 3'
3 '- 5'

I
3'
T ran sfera sa term inal
y dA TP
D esnaturalizar; asociar I
cebad or interno d e sentido 5' - ------------------------ A A A A A A A ----------A „ 3'
3' A A A A A A A -
^ 5'
^ ----------------- A A A A A ¡ « « « 3 3 '
D esnaturalizar; asociar
3' ___ 5 ' ce b ad o r d e an claje y exten d er

D esnaturalizar; asociar
I ce b ad o r d e anclaje
3' AAAAAAA
5 I ^ ----------------- A A A A A [»««««««] 3'
3% : ____ ]5 '

P C R con cebad ores

interno y d e anclaje
i
I

I
| -------------------A A A A A f ^ ^ l 3' AAAAAAA-

□ --------------------T T T T T B3USS3 5 ' D esnaturalizar; asociar

ce b ad o r prim ario y ex tender
AAAAA
TTTTT

P C R con cebad ores

interno y d e an claje
AAAAA ■ ■ 3'
TTTTT 5'

Fig. 7-12. La PCR-RACE puede facilitar el aislamiento de secuencias de los extremos 5' y 3' del cDNA.
Una etapa preliminar en la PCR-RACE incluye la introducción de una secuencia mediante una form a de mutagenesis añadida 5 ' (véase sección 5.5.3).
A) 3 PCR-RACE. Se utiliza un cebador de inicio antisentido con una secuencia de extensión 5 ’ específica (secuencia de anclaje, con frecuencia > 15 nu-
cleótidos de largo) que se incorpora al transcrito cDNA en el paso de transcriptasa inversa. Luego se emplea un cebador interno en sentido para generar
una segunda cadena corta que termina en una secuencia complementaria a la secuencia de anclaje original. Después se inicia la PCR usando el cebador
interno en sentido y un cebador de secuencia de anclaje. B) 5 PCR-RACE. En este caso se emplea un cebador interno antisentido para cebar la síntesis
de una plantilla de mRNA (rojo) de una primera cadena parcial de cDNA (negro). Se añade una poli(dA) al extremo 3 ' del cDNA usando transferasa term i­
nal. La síntesis de la segunda cadena se ceba con un cebador en sentido con una secuencia de extensión específica (andador). Esta cadena se emplea
como plantilla para un paso adicional de síntesis con el cebador interno para producir una copia complementaria de la secuencia de anclaje. A continua­
ción puede efectuarse la PCR con cebadores de secuencia interna y de anclaje.
196 CAPITULO SIETE : ANÁLISIS DEL DNA Y ESTRUCTURA, VARIACIÓN Y EXPRESIÓN GÉNICAS

A) 5' B) 5' 3'

3 ' ---------- 5'
7 -32P ( • ) C in a s a d e p o lin u c le ó tid o y -32P (• )
C in a s a d e p o lin u c le ó tid o

*--------
-M e z c la r con M e z c la r con
R N A to tal
R N A to tal
3' - -------- * 5 3'
5 '- AAAAA 3' -----------• 5 '
A A A A A 3'
N u c le a s a S1 RT +
dNTP
3 '- 3'
5 '- • 5'
5'- -A A A A A 3 '

E le ctro fo res is E le ctro fo res is

d e s n a tu ra liz a n te ; d e s n a tu ra liza n te ;
a u to rra d io g ra fía a u to rra d io g ra fía

Fig. 7-13. El sitio de inicio de la transcripción puede mapearse mediante protección de nucleasa S1 o valoraciones de extensión del cebador.

A) Valoración de protección de nucleasa S1. Se sospecha que un fragmento de restricción del extremo 5 ' de un gen clonado contiene el sitio de inicio de
transcripción. Se marca terminalmente en los extremos 5' y luego se desnaturaliza y mezcla con el RNA total de las células en que se piensa que el gen im­
portante está expresado. El mRNA afín puede hibridar la cadena DNA antisentido para formar un heterodúplex RNA-DNA. El tratamiento subsecuente con nu­
cleasa S1 produce el corte progresivo de la secuencia de DNA 3 ' saliente hasta el punto en que el DNA se híbrida al extremo 5 ' del mRNA. El fraccionamiento
de tamaño en un gel de electroforesis desnaturalizante permite identificar la diferencia de tamaño entre el DNA original y el DNA después del tratamiento con
nucleasa S1. B) Valoración de extensión del cebador. En este caso se elige de modo deliberado que el fragmento de restricción que se sospecha contie­
ne el sitio de inicio de la transcripción sea pequeño. La hibridación con un mRNA afín dejará el mRNA con un extremo 5 ' saliente. El DNA puede servir co­
mo un cebador para que la transcriptasa inversa (RT) extienda su extremo 3' hasta alcanzar el extremo 5 ' del mRNA. El aumento de tamaño después del
tratamiento con transcriptasa inversa (+R T) comparado con el que tenía antes del tratamiento (-R T ) mapea el sitio de inicio de la transcripción. Con am­
bos métodos puede lograrse un mapeo más preciso si el DNA se secuencia después del tratamiento con S1 o transcriptasa inversa (RT).

Hibridación in situ de montaje total
Una extensión de la hibridación in situ de tejidos es el estudio de la
expresión en un embrión completo. La hibridación in situ de monta­
je total es un método popular para rastrear la expresión durante el
desarrollo en embriones completos a partir de organismos vertebrados
modelo. Por las dificultades éticas y prácticas para efectuar análisis
equivalentes de genes humanos, suele confiarse en la extrapolación
de análisis realizados en embriones de ratón (véase fig. 7-15). La
cantidad hasta cierto punto alta de tejido disponible significa que
el método es más o menos sensible y la automatización de la técnica
incrementó su popularidad.
Perfil de expresión génica de células únicas
El empleo de sondas marcadas de manera apropiada permite ras­
trear secuencias de RNA específicas dentro de células aisladas a fin
de identificar los sitios de procesamiento, transporte y localización
citoplásmicos de RNA. La hibridación fluorescente in situ (FISH)
cuantitativa y la microscopía digital de imágenes posibilitan inclu­
sive observar transcritos de RNA o aislados in situ (Femino y cois..
1998). Un refinamiento adicional recurre a combinaciones de dife­
rentes tipos de sondas de oligonucleótidos marcadas en múltiples
sitios con una diversidad de fluoróforos con espectros distintos.
Ello permitió rastrear de manera simultánea los transcritos de múl­
tiples genes (Levsky y cois., 2002).
Selección de la expresión a gran escala mediante
microarreglos
La capacidad para preparar oligonucleótidos de alta densidad o m i­
croarreglos de clonas de cDNA en superficies de vidrio transforme
las selecciones de la expresión génica (véase sección 6.4.3 para los
procedimientos generales). En algunos genomas que ya se secuen-
ciaron por completo existe la posibilidad de seleccionar la expresión
del genoma completo y por tanto vigilar al mismo tiempo la expre­
sión de cada gen aislado en un organismo (véase sección 19.3).

R E S O L U C IÓ N R E N D IM IE N T O
RNA Alta Bajo
B aja Bajo
B a ja A lto
P R O T E ÍN A A lta Bajo
B aja B ajo
B aja Alto
Fig. 7-14. El mapeo de expresión puede efectuarse a diferentes niveles.
Rendimiento se refiere al número de genes/proteínas que pueden estudiarse a la vez.
7.3.3 Análisis de expresión génica basados en PCR:
PCR-RT y exhibición diferencial de mRNA
Como se describe en la sección 5.2, las grandes ventajas de la PCR
son su rapidez, sensibilidad y sencillez. Aunque no es adecuada pa­
ra aportar patrones de expresión espaciales (p. ej., como lo hace la
hibridación in situ de tejidos), suele proporcionar patrones de ex­
presión gruesos, rápidos, que pueden ser valiosos.
Reacción en cadena de ia polimerasa de transcriptasa
inversa (PCR-RT) convencional
La PCR de transcriptasa inversa (PCR-RT; véase sección 5.2.1 para
el principio básico) puede brindar una cuantificación gruesa de la
expresión de un gen particular (útil en tipos de células o tejidos cu­
yo acceso en gran cantidad no es fácil, p. ej., embriones humanos
tempranos en etapa preimplantación; véase Daniels y cois., 1995).
La sensibilidad extrema de la PCR implica que también es posible
utilizar la PCR-RT para estudiar la expresión en células aisladas.
Además la PCR-RT puede ser útil para identificar y estudiar dife­
rentes isoformas y un transcrito de RNA. Por ejemplo, pueden pro­
ducirse diferentes isoformas de mRNA mediante empalme (corte y
unión) alternativo e identificar cuándo cebadores específicos de
exón reconocen productos de amplificación extra además de los pro­
ductos esperados (para un ejemplo, véase Pykett y cois., 1994).
Exhibición diferencial de mRNA
El uso de cebadores de PCR parcialm ente degenerados (cebadores
en los que la elección de bases en ciertas posiciones es deliberada­
7.3 I ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN GÈNICA 197
EJEM PLO S
Hibridación in situ d e tejido
H ibridación in situ celular
H ibridación N orthern blot
Hibridación dot blot d e R N A
P C R -R T
Valoración d e protección d e ribonucleasa
Hibridación de microarreglo de DNA
Exhibición diferencial
Análisis seriado de expresión génica (SAGE)
Inm unocitoquím ica
M icroscopia d e inm unofluorescencia
Inm unoblotting (w estern blotting)
Electroforesis con gel 2 -D
Esp ectrom etría d e m a sa
mente flexible) permite diseñar formas modificadas de PCR-RT
que pueden rastrear la expresión de muchos genes al mismo tiem­
po. Una de estas técnicas es la exhibición diferencial de mRNA.
Se utiliza un cebador oligo(dT) m odificado que en su extremo 3'
tiene un nucleótido único diferente (es decir, A, C o G pero no T)
o un dinucleótido distinto (como CA). Como resultado se unirá a
la cola poli(A) de un subgrupo d e mRNA (Liang y cois., 1993). Por
ejemplo, si el oligonucleótido TTTTTTTTTTTCA (=TnCA)
se utilizó como cebador, cebará de modo preferencial la síntesis de
cDNA a partir de los mRNA en que el dinucleótido TG precede
a la cola poli (A).
El cebador corriente arriba suele ser una secuencia corta arbitra­
ria (con frecuencia de 10 nucleótidos de largo) pero a causa de la
incompatibilidad, en especial en el extremo 59, puede unirse a mu­
chos sitios más de los esperados para un decámero. Los patrones de
amplificación resultantes están diseñados en forma deliberada para
producir una escalera compleja de bandas cuando se fraccionan de
tamaño en un gel de poliacrilamida largo (fig. 7-16).
A diferencia de las selecciones del microarreglo de DNA, la ex­
hibición diferencial de mRNA es un medio para vigilar al mismo
tiempo la expresión de múltiples genes en los que las identidades
de los genes que se rastrean no se establecieron con anterioridad. Por
consiguiente, en lugar de seleccionar la expresión de genes conoci­
dos, es un simple método de selección de la expresión. Su principal
uso suele darse en estudios de expresión génica comparativa para
identificar la forma en que la expresión génica se altera cuando se
comparan dos orígenes (p. ej., la comparación de dos tipos de cé­
lulas en diferentes etapas fisiológicas o del desarrollo). Es posible
que esto permita identificar un subgrupo pequeño de genes cuyos
patrones de expresión son distintos entre los tipos celulares.
198 CAPITULO SIETE j ANÁLISIS DEL DNA Y ESTRUCTURA, VARIACIÓN Y EXPRESIÓN GÉNICAS
Fig. 7-15. Montaje com pleto en hibridación in situ.
El ejemplo muestra la expresión Pax9 en un embrión de ratón E9.5 (día
9.5 embrionario = 9.5 días poscoito). La expresión es evidente en la re­
gión craneofacial (CF; en lo que se desarrollará hacia mesénquima na­
sal), las bolsas faríngeas (PP), las somitas (S) y la yema de la cola (T).
Fotografía proporcionada por el doctor Heiko Peters, Institute of Human
Genetics, Uníversity of Newcastle upon Tyne, UK.
7.3.4 En las selecciones de expresión de proteínas
suelen utilizarse anticuerpos muy específicos
Por su diversidad y sensibilidad exquisitas en la detección de proteí­
nas, los anticuerpos tienen múltiples aplicaciones en investigación y
su potencial terapéutico es considerable (véase sección 21.3.4). Aun­
que de manera tradicional los anticuerpos se aislaban mediante la
inmunización de animales, ahora se usan cada vez más anticuerpos
genéticamente manipulados por ingeniería (véase recuadro 7-4). Por
lo general se emplean anticuerpos para detectar proteínas por dife­
rentes métodos y es posible recurrir a sistemas de marcado distintos.
Sistemas de marcado y detección de anticuerpos
Los anticuerpos pueden marcarse en diferentes formas y, como en el
marcado y la detección de ácido nucleico, es posible utilizar anticuer­
pos en sistemas de detección directa o indirecta. En los métodos de
detección directa, el anticuerpo purificado se marca de manera apro­
piada con una molécula rastreadora (p. ej., fluoresceína, rodamina,
biotina, etc.; véase también la sección 6 . 1.2 ) y luego se usa de mane­
ra directa para enlazar la proteína blanco. En los sistemas de d etec­
ción indirecta el anticuerpo primario se emplea como una molécula
intermedia y no se une de modo directo a un grupo marcado.
Una vez que se enlaza a su blanco, el anticuerpo primario es enla­
zado a su vez por un reactivo secundario que se conjuga con un grupo
rastreador. Un reactivo secundario usual es la proteína A, una proteína
que se encuentra en la pared celular de Staphylococcus aureus. Por razo­
nes que se desconocen, la proteína A se enlaza con firmeza a sitios en
las regiones constantes segunda y tercera de la porción Fe de la cadena
pesada de Ig. Como alternativa es posible utilizar un anticuerpo secun­
dario (un anticuerpo formado contra un anticuerpo primario).
Los grupos rastreadores típicos pueden ser un fluorocromo (sección
6 . 1.2 ), una enzima (p. ej., peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alca­
lina, galactosidasa (3, etc.) o bien oro coloidal. Los sistemas de detec­
ción directa tienen la desventaja de requerir la conjugación de una gran
variedad de anticuerpos primarios a moléculas rastreadoras, en tanto
que los sistemas indirectos ofrecen el uso de anticuerpos secundarios de
afinidad purificada disponibles en el comercio. Los sistemas de detec­
ción y marcado para su empleo con métodos específicos de rastreo de
la expresión proteínica se delinean en el cuadro 7-1.
Inmunoblotting (Western blotting)
Este método está diseñado para seguir la expresión gruesa de pro­
teínas mediante extractos celulares que se fraccionan de acuerdo
con el tamaño. Lo anterior suele lograrse por medio de SDS-PAGE
unidim ensional, una forma de electroforesis en gel de poliacrilami-
da (^>oliíJcrylamide gel dectrophoresis) en la que la mezcla de pro­
teínas extraídas se disuelve primero en una solución de sulfato
sódico de dodecilo (SDS), un detergente aniónico que altera casi
todas las interacciones no covalentes en proteínas naturales. Asi­
mismo se añaden mercaptoetanol o ditiotreitol para reducir enlaces
de disulfuro. Después de la electroforesis es posible observar las
proteínas fraccionadas tiñendo con un colorante adecuado (p. ej.,
azul Coomassie) o un colorante argéntico.
También pueden emplearse geles PAGE tridimensionales: la prime­
ra dimensión incluye enfocamiento isoeléctrico, que es la separación según
la carga en un gradiente de pH, y la segunda dimensión, en ángulos rec­
tos con la primera, comprende el fraccionamiento de tamaño median­
te SDS-PAGE (véase Stryer, 1995). En este caso las proteínas
fraccionadas se transfieren (blotted, manchan) a una hoja de nitrocelu-
losa y luego se exponen a un anticuerpo específico (véase fig. 7-17).
Inmunocitoquímica (inmunohistoquimica)
Esta técnica se relaciona con el estudio del patrón total de expresión
a nivel proteínico, dentro de un tejido o de otra estructura multice­
lular. En consecuencia puede considerarse como el equivalente en
las proteínas de los métodos de hibridación in situ de tejidos que se
utilizan para seleccionar la expresión de RNA. Como en el último
caso, los tejidos casi siempre se congelan o embeben en cera y des­
pués se seccionan en cortes muy delgados con un micrótomo antes
de montarse en un portaobjetos. Se permite que un anticuerpo es­
pecífico apropiado se una a la proteína en el corte de tejido y esto
puede proporcionar datos de la expresión susceptibles de relacionar
con la tinción histológica de cortes de tejido vecino (fig. 7-18).
Microscopía de inmunofluorescencia
Este método se emplea cuando se investiga la localización subcelu-
la rá t una proteína de interés. Un colorante fluorescente adecuado,
como fluoresceína o rodamina, se acopla al anticuerpo deseado, lo
que permite localizar la proteína importante dentro de la célula por
medio de microscopía de fluorescencia (véase fig. 6-5B).
 7.3 ! ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN GENICA 199

A) B)
P oblación heterogénea T||A T||C T||G
de mRNA I II II I
10 11 12 16 10 11 12 16 10 11 12 16
A A A A A A ..A ,
A A A A A A ...A n
A A A A A A ...A n

T ranscriptasa inversa con

c e b a d o r oligo(dT) m od ifica do,
I p. ej., TIIG

------------------- \C¡AAAAAA...An
------------------ G T T T T T T T T T T T

i A m p lifica ció n de PCR con

TIIG y c e b a d o r nu cle ótido

k
10 arb itrario , p. ej.,
TCGATACAGG

TCG ATACAG G - -C A A A A A A A A A A
AGCTATG TCC - -G T T T T T T T T T T T

I m m m '

E lectroforesis en
gel de po lia crilam id a

Fig. 7-16. La exhibición diferencial de mRNA es un método de PCR-RT modificado para explorar la expresión génica multiplex.
A) Representación esquem ática. El RNA total de dos o más tipos de células se transcribe inversamente con un cebador oligo (dT) modificado (en este
ejemplo, TTTTTTTTTTTG o T ^G para abreviar), que debe cebar de manera preferencial la síntesis de cDNA a partir de la secuencia de mRNA en la que
una C precede a la cola poli(A). La amplificación se realiza con un cebador arbitrario y los productos se fraccionan de tamaño en un gel de poliacrilami­
da. Las diferencias en las bandas de amplificación entre las fuentes de RNA que se comparan (A y B) indica la expresión diferencial. B) Una aplicación:
identificación de genes que se expresan en forma diferencial en distintas etapas del desarrollo del corazón del ratón (días embrionarios 10 , 1 1 , 1 2 y 16).
Se usaron tres grupos de condiciones de reacción, con un cebador T ^G en cada caso y uno de los tres cebadores arbitrarios diferentes AP1, AP2 y AP3.
La figura muestra una sección del gel en la que puede observarse el cambio de intensidad en varias bandas en diferentes etapas del desarrollo. Un cam­
bio en particular notable (indicado por la flecha) resultó ser globlna p. Fotografía proporcionada por Andy Curtis y David Wilson, University of Newcastle
upon Tyne, UK.
200 CAPÍTULO SIETE ANÁLISIS DEL DNA Y ESTRUCTURA, VARIACIÓN Y EXPRESIÓN GÉNICAS

Recuadro 7-4. Obtención de anticuerpos

MÉTODOS TRADICIONALES PARA OBTENER ANTICUERPOS tigar ia expresión. La expresión de este producto en las células deseadas
puede vigilarse por medio del anticuerpo específico para la marca del epi­
Por tradición los anticuerpos contra productos génicos humanos se ob­
topo con objeto de rastrear la proteína. A continuación se muestran los
tienen mediante la inyección repetida de animales apropiados (p. e j„ roe­
marcadores de epitopos que más se utilizan.
dores, conejos, cabras, etc.), con un inmunógeno adecuado. A menudo
se utilizan dos tipos de inmunógeno:

► péptidos sintéticos. Se observa la secuencia de aminoácidos (dedu­ Secuencia

cida de la secuencia conocida de cDNA) y se diseña un péptido sin­ del marcador Origen Localización Acm
tético (con frecuencia de 20 a 50 aminoácidos de largo). La idea es
que, cuando se conjuga con una molécula adecuada (p. e j„ hemocia- DYKDDDDK FLAG sintético Terminal N, C Anti-FLAG M1
nina adherente de ajuste perfecto), el péptido adopta una conforma­
EQKLISEEDL c-Myc humano Terminal N, C 9E10
ción semejante a la del segmento correspondiente del polipéptido
natural. Aunque este método es hasta cierto punto simple, el éxito pa­ MASMTGGQQMG G enT710 Terminal N Ac Marcador T7
ra generar anticuerpos específicos apropiados está lejos de ser segu­ QPELAPEDPED Proteína D de HSV Terminal C Ac Marcador HSC
ro y resulta difícil predecirlo;
RPKPQQFFGLM Sustancia P Terminal C NC1/34
► proteínas de fusión. Un método alternativo consiste en insertar una
secuencia apropiada de cDNA en un gen bacteriano modificado in­ YPYDVPDYA Influenza HA1 Terminal N, C 12CA5
serto en un vector de clonación de expresión apropiado. El razona­
miento es que se producirá un mRNA híbrido que se traducirá para Flag[Q33], virus de herpes simple, HSV.
proporcionar una proteína de fusión con una región terminal N deri­
vada del gen bacteriano y el resto proveniente del gen insertado
(véase figura). A pesar de que la secuencia bacteriana terminal N ANTICUERPOS POR INGENIERÍA GENÉTICA
suele diseñarse para ser muy corta, puede conferir ciertas ventajas. Los anticuerpos generados por los métodos clásicos anteriores provie­
Por ejemplo, suele brindar una secuencia de señal a fin de asegurar nen de animales. Sin embargo, una vez que los diversos genes de inmu­
la secreción de la proteína de fusión hacia el medio extracelular, lo noglobulina se clonaron fue factible utilizar la tecnología de corte y
que simplifica su purificación y puede proteger la proteína extraña de ligadura de DNA para generar nuevos anticuerpos, inclusive tanto anti­
su degradación dentro de la bacteria. Como la proteína de fusión cuerpos parcialmente humanizados com o anticuerpos plenamente hu­
contiene la totalidad, o casi, de la secuencia polipéptida deseada, la manos (véase sección 21.3.4). Por ejemplo, ratones transgénicos se
probabilidad de producir anticuerpos específicos puede ser razona­
blemente alta.
Si el sistema inmunitario de los animales respondió, deben secretarse an­
SCM
ticuerpos específicos hacia el suero. El suero rico en anticuerpos (anti­
suero) que se reúne contiene una mezcla heterogénea de anticuerpos,
elaborados por un linfocito B diferente [porque los reordenamientos del
gen de inmunoglobulina son específicos de célula y también de tipo ce­
lular (linfocito B), véase sección 10.6]. Los diferentes anticuerpos reco­
nocen distintas partes (epitopos) del inmunógeno (antisuero policlonal).
Sin embargo, es posible elaborar una preparación homogénea de anti­
cuerpos al propagar una clona de células (originalmente derivadas de un
linfocito B).
Como las células B tienen un período de vida limitado en cultivo, es pre­
ferible establecer una línea celular inmortal: las células que producen an­
ticuerpo se fusionan con células derivadas de un tum or de célula B
inmortal. A partir de la mezcla heterogénea resultante de células híbridas
se seleccionan las que tienen tanto la capacidad para elaborar un anti­
cuerpo particular como la propiedad de multiplicarse de manera indefini­
da en cultivo. Estos hibridomas se propagan como clonas individuales,
cada una de las cuales puede proporcionar una fuente permanente y es­
table de un tipo aislado de anticuerpo monoclonal (Ame).
C lo n a d e c D N A
Los métodos anteriores para elaborar anticuerpos no siempre garantizan
la producción de anticuerpos específicos adecuados. Un método alterna­
Í e n S C M (s itio d e
c lo n a c ió n m ú ltip le )
tivo para rastrear la expresión subcelular de una proteína de interés con­ y e x p re s a r
siste en utilizar un anticuerpo obtenido con anterioridad a fin de seguirlo
como resultado de su enlace a un epitopo acoplado de modo artificial |3 -g a l p ro te ín a X
(marcado de epitopo). En este procedimiento se genera un producto de N m— m c
DNA recombinante acoplando una secuencia que codifica un epitopo, pa­ P ro te ín a d e fu s ió n
ra el que se dispone del anticuerpo obtenido antes, a la secuencia de co­
dificación de la proteína de interés en form a muy similar a la figura,
Con frecuencia las proteínas de fusión se diseñan como
excepto que en este caso el sistema vector está diseñado para expresar­
inmunógenos para formar anticuerpos
se en células de mamíferos u otras células en las que se pretende inves­
 7.3 1 ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN GÉNICA ; 201

manipularon mediante ingeniería para que contuvieran locus de inmuno-
globulina humana a fin de permitir la producción in vivo de anticuerpos
plenamente humanos.
Es posible que los métodos recientes eviten por completo la necesidad de
recurrir a la tecnología de hibridoma e inmunización. La potente te cn olo­
gía de exhibición de lago permite elaborar un repertorio casi ilimitado de
anticuerpos humanos con especificidades contra antígenos extraños y
propios (véase Winter y cois., 1994). La esencia de este método es que
los segmentos génicos que codifican las secuencias variables de cadena
pesada y ligera del anticuerpo se clonan y expresan en la superficie de un
bacteriófago filamentoso, y los fagos raros se seleccionan de una pobla­
ción compleja mediante el enlace con un antígeno de interés (véase sec­
ción 19.4.6 para una explicación completa).
El vector plásmide que aquí se muestra tiene un origen de replicación (ori)
y un gen de resistencia a la ampicilina (ampR) diseñado para crecer en E.
coli. El sitio de clonación múltiple (SCM) se localiza justo adyacente a un
gen lacZ que puede codificar galactosidasa p y la transcripción del pro­
motor lacZ (P,ac) ocurre en la dirección que la flecha muestra. Se clona
una secuencia de cDNA de un gen de interés (gen X) en una orientación
apropiada dentro del sitio de clonación múltiple (SCM). La expresión del
promotor lacZ dará por resultado una proteína de fusión galactosidasa be-
ta-X que puede producirse en grandes cantidades y utilizarse como un in-
munógeno para estimular la producción de anticuerpos a la proteína X.
Una alternativa popular consiste en usar proteínas de fusión GST, en las
que la transferasa de glutatión S se acopla a la proteína de interés y la
proteína de fusión puede purificarse con facilidad mediante cromatogra­
fía de afinidad con el empleo de columnas de glutatión y agarosa.

Cuadro Marcado y detección de anticuerpo para rastrear la expresión proteínica.

Marcador Método de detección Aplicación

Yodo-125 Placa de rayos X Inmunoblotting

Enzima Sustrato cromógeno detectado a simple vista inmunoblotting; inmunocitoquímica

Biotina Avidina o estreptavldina acoplada a diversos marcadores Inmunoblotting; inmunocitoquímica

Fluorocromo Microscopía de fluorescencia (fig. 6-5B) Inmunocitoquímica; microscopía de inmunofluorescencia

1 2 C 3 4 5 C 6 7 8

- 4 0 0 kD a

D istro fin a - 200

(blot)

- 100

M io s in a
(aell Fig. 7-17. Inmunoblotting (Western blotting) detecta proteínas que se
fraccionaron de tamaño en un gel de electroforesis.
B) 1 2 C 3 4 5 C 6 7 8
Inmunoblotting consiste en detectar polipéptidos después del fraccio­
namiento de tamaño en un gel de poliacrilamida y transferirlos (“blotting”,
- ,4 0 0 kD a
manchado) a una membrana. Este ejemplo ilustra su aplicación en la
D istrofin a detección de distrofina con el uso de dos anticuerpos. El anticuerpo
- 200
(blot) Dy4/6D3 es especifico para el dominio de bastón y se generó con un
- 100 inmunógeno de proteína de fusión (véase recuadro 7-4). El anticuerpo
Dy6/C5 es específico para la reglón terminal C y se generó a partir
de un inmunógeno péptido sintético. Reproducido de Nicholson y
cois. (1993) con autorización de BMJ Publishing Group. Fotografía
proporcionada por Louise Anderson (antes Nicholson), University of
M io s in a Newcastle upon Tyne, UK.
(□en
202 CAPÍTULO SIETE i ANALISIS DEL DNA Y ESTRUCTURA, VARIACIÓN Y EXPRESIÓN GÉNICAS
Estudios ultraestructuraIes
La microscopía electrónica brinda una resolución aún más alta de
la localización intracelular de un producto génico o de otra molé­
cula. Por lo general el anticuerpo se marca con una partícula elec-
trodensa, como esferas de oro coloidal.
7.3.5 Los marcados autofluorescentes de proteínas
constituyen un medio potente para rastrear
ia localización subcelular de proteínas
La proteína verde fluorescente (PVF) es una proteína de 238 ami­
noácidos que se identificó primero en la medusa Aequoria victoria.
Proteínas similares se expresan en muchas medusas y al parecer ori­
ginan la luz verde que emiten y son estimuladas por la energía que
se obtiene después de la oxidación de luciferina u otra fotoproteí-
na (véase Tsien, 1998). Cuando el gen de PVF se clonó y tranfectó
en células blanco en cultivo, también se marcó la expresión de PVF en
células heterólogas por la emisión de luz fluorescente verde. Esto
significa que la PVF es una p roteín a a u tofluorescen te; puede actuar
por sí misma como un fluoróforo funcional. Por estas razones suele
ser útil como rastreador único, ya que no requiere otros agentes, co­
mo anticuerpos, cofactores, sustratos enzimáticos, etc. Como resul­
tado, es posible seguir con facilidad la PVF mediante microscopía
convencional y de fluorescencia confocal, y se constituyó en un
medio popular para rastrear la expresión de genes en animales (véa­
se sección 20.3.1).
Fig. 7-18. Inmunocitoquímica.
En este ejemplo se seleccionó la expresión de tubulina p en un corte
transversal de cerebro de un embrión de ratón de 12.5 días. El sistema
de detección de anticuerpo utilizado identificó la expresión como una
reacción de color pardo basada en peroxidasa de rábano picante/3,3'
diaminobencidina. La histología subyacente se reveló mediante contra­
tinción con azul de toluidina. Abreviaturas: LV, ventrículo lateral; D, dien­
cèfalo; R protuberancia. Fotografia proporcionada por Steve Lisgo,
Institute of Human Genetics, University of Newcastle upon Tyne, UK.
Fig. 7-19. El marcado con la proteína verde fluorescente constituye
un medio potente para rastrear la expresión de proteínas.
Este ejemplo muestra una célula HeLa viva transfectada en forma transito­
ria que expresa una proteina de la enfermedad de Batten marcada con PVF.
CLN3 se clonó en el vector de expresión de PVF, pEPVF-N1, de manera que
produjo una proteína constituida por la proteina de la enfermedad de Bat­
ten con una secuencia de PVF acoplada a su terminal C (un marcador
PVF). Esta célula es un ejemplo de una proporción pequeña de células He-
La que expresan CLN3P/PVF en un patrón vesicular punteado distribuido
en la totalidad del citoplasma. Estos análisis, y otros, indican que la pro­
teina de la enfermedad de Batten es una proteína integral de la membrana
de Golgi. Reproducido de Kremmidiotis y cois. (1999) Hum. Mol. Genet.
8,523-531, con autorización de Oxford University Press.
Las aplicaciones de mayor éxito y popularidad suelen usar la
PVF como un marcador en una proteína de fusión en la que se aco­
pla la proteína cuya expresión se rastreará. En estos casos el objeti­
vo principal es investigar la localización subcelular de la proteína en
investigación. La PVF en sí misma no se localiza de manera especí­
fica dentro de las células: en casi todos los tipos de células la fluores­
cencia de la PVF al parecer está diseminada de modo homogéneo en
la totalidad del núcleo, el citoplasma y procesos celulares distales. Es
posible recurrir a la ingeniería genética para producir vectores que
contienen una secuencia de codificación de PVF dentro de la que
una secuencia de codificación para una proteina, X, no caracteriza­
da puede clonarse. El producto de fusión PVF-X resultante puede
transfectarse en células blanco adecuadas, como células de mamífe­
ros cultivadas, y la expresión de la proteína de fusión PFV-X vigilar­
se a fin de rastrear la localización subcelular de la misma. Véase la
figura 7-9 para un ejemplo del rastreo de la expresión de la protei­
na producida por CLN3, el gen relacionado con la enfermedad de
Barten, una afección neurodegenerativa de la niñez.
PARTE DOS

Genoma humano y su relación

con otros genomas

8 P royectos d e l gen o m a y orga n ism os m od elos 207

9 O rgan ización d e l gen o m a hu m an o 239

10 Expresión g èn ica h u m an a 275

11 In estab ilid ad d e l gen om a hum ano: m u tación y reparación d e l DNA 315

12 L ugar d e l h om b re en e l á rb o l d e la vid a 351

CAPÍTULO OCHO

Proyectos del genoma

y organismos modelos

Contenido del capítulo

 CAPÍTULO OCHO PROYECTOS DEL GENOMA Y ORGANISMOS MODELOS
.1 Im p o rtan cia pionera de los
proyectos del genom a
8.1.1 Los proyectos del genoma prepararon el camino
para los estudios sistemáticos del universo interno
Después de muchos siglos de investigación se integró un conoci­
miento aproximado, cuando menos de las partes más accesibles del
universo externo. La escala es impresionante y algunos conceptos
están desde luego fuera de la experiencia normal del hombre (¡co­
mo las 13 dimensiones que en la actualidad se piensa que existen!).
Sin embargo, también hay un universo interno (dentro del hombre)
que en buena medida aún no se explora y tiene asimismo una esca­
la extraordinaria (la complejidad del cerebro humano es un ejem­
plo útil: alrededor de 1011 neuronas y 1015 interconexiones).
Hasta fecha reciente, las exploraciones del universo interno del
hombre eran modestas y de escala limitada. La aplicación del mi­
croscopio al estudio de las células y las estructuras subcelulares pro­
porcionó una vía importante hacia este mundo interno; a ella le
siguieron adelantos pioneros en bioquímica y a continuación bio­
logía molecular y celular. Hoy en día, al inicio de un nuevo mile­
nio, se cuenta con el equilibrio para pasar de estas investigaciones
iniciales a un plano por completo superior. Ahora es posible llevar
a cabo una exploración seria y sistemática del universo interno del
hombre.
El factor que allanó el camino para esta nueva fase del descubri­
miento fue el Proyecto del Genoma Humano (PGH), una labor
en verdad internacional. Comenzó de forma oficial en 1990 y fue
el primer “proyecto grande” de la biología, con un tiempo proyec­
tado de 15 años. El PGH y otros proyectos de genomas buscaron
por primera vez conocer las instrucciones químicas precisas que de­
finen a los organismos vivientes, las secuencias completas del geno­
ma (el g en o m a se refiere al corpus total de las diferentes moléculas
de DNA; véase el glosario de genómica en el recuadro 8-1). Para
muchos científicos, esto fue el equivalente en biología de la tabla
periódica; toda la materia puede reducirse a una tabla periódica de
elementos, pero a un nivel más alto; así, todo ser viviente puede re­
ducirse a una tabla periódica de genes.
Objetivos del Proyecto del Genoma Humano (PGH)
La principal justificación del PGH fue adquirir información funda­
mental sobre la constitución genética que podría ampliar el cono­
cimiento científico básico de la genética humana y el papel de
diversos genes en la salud y la enfermedad. Desde que se publicó en
1981 la secuencia pequeña (16.5 kb) del DNA mitocondrial huma­
no (mtDNA) (véase sección 9.1.2), el principal objetivo del PGH
fue secuenciar el genoma nuclear, inmensamente más grande (cer­
ca de 3 000 Mb). Como un primer paso para lograrlo, se requerían
mapas genéticos humanos de alta resolución que sirvieran como
una estructura central (armazón) para construir mapas físicos de
gran precisión, hasta culminar en el mapa físico final, la secuencia
completa del genoma humano.
Además del objetivo primario de mapear y secuenciar el geno­
ma nuclear humano, el PGH previo desde el principio varios pro­
yectos auxiliares:
► d esa rro llo d e tecn o lo g ía s y h erra m ien ta s a p rop ia d a s. Esto
incluía desarrollo de los métodos de mapeo genético y físico,
tecnología de secuenciación del DNA, diseño y elaboración
de bases de datos e informática para análisis de secuencias, et­
cétera;
► p r o y e cto s d e l g en o m a p a r a cin co o rga n ism os m od elos: la bac­
teria E. coli, la levadura Saccharomyces cerevisiae, el gusano re­
dondo Caenorhabditis elegans, la mosca de la fruta Drosophila
melanogaster y el ratón. En este caso, el objeto fue doble: pro­
porcionar información abundante necesaria para estos organis­
mos modelos y asimismo pruebas y casos para practicar y
depurar las diversas tecnologías y herramientas que fueran ne­
cesarias para el proyecto del genoma humano;
► efecto s éticos, lega les y sociales. Una parte importante del cos­
to total se dedicó a este componente fundamental, pero fácil de
pasar por alto.
Alrededor del año 2003 se habían logrado los objetivos de la secuen­
ciación del genoma humano y los genomas de los cinco organismos
modelos iniciales y se disponía de las secuencias a través de internet.
Durante el curso del PGH se iniciaron otros proyectos de genomas
para una amplia variedad de otros organismos modelos y hacia ma­
yo de 2003 se habían determinado las secuencias del genoma de
otros 140 organismos (véase sección 8.4). Los estudios auxiliares
adicionales se preocuparon de la extensión de la variación de la se­
cuencia dentro del genoma humano.
8.1.2 Se espera que los beneficios médicos y científicos
de los proyectos del genoma sean enormes
Para muchos biólogos y genetistas humanos, el PGH fue una mi­
sión histórica. Un justificación mayor aún fueron los beneficios
médicos anticipados (Collins y McKusick, 2001; Subramanian y
cois., 2001; Van Ommen, 2002). Para trastornos hereditarios
que dependen de un gen aislado mayor es factible el diagnóstico
amplio prenatal y presintomático de afecciones en individuos
con riesgo de tener un gen de la enfermedad. Además, se utiliza
la información sobre la estructura génica para valorar el modo en
que funcionan genes individuales y la forma en que se regulan.
Esta información proporciona explicaciones que se requieren
con urgencia para procesos biológicos en seres humanos. Tam­
bién cabía esperar que proporcionara una estructura para el de­
sarrollo de nuevos tratamientos de enfermedades y extender los
métodos terapéuticos actuales. Se espera que la aplicación a gran
escala de la selección de mutaciones represente un cambio radical
en la conducta para el cuidado médico: pasar del tratamiento de
una enfermedad avanzada a la prevención d e la anormalidad, con
base en la identificación del riesgo individual (m ed icin a p e r so n a ­
lizada) .
Sin embargo, aunque estas posibilidades son fascinantes, es
posible que haya dificultades inesperadas para comprender con
precisión y amplitud la manera en que funcionan y se regulan al­
gunos genes (las precauciones precedentes son en realidad el len­
to progreso para predecir la estructura de las proteínas a partir de
la secuencia de aminoácidos y la falta de conocimientos sobre la>
formas precisas en que se coordina la regulación de la expresión
del gen de globina, décadas después de obtenerse las secuencias-
de importancia). Además, los trastornos de gen único que serían
los blancos más fáciles para desarrollar terapéuticas novedosas
son muy raros; las alteraciones más comunes son multifactorií-
les y representan grandes desafíos. Por consiguiente, aunque loi
datos obtenidos en el proyecto del genoma humano tendrán de
modo inevitable un valor médico, es posible que algunas de las
 8.1 IMPORTANCIA PIONERA DE LOS PROYECTOS DEL GENOMA
Recuadro 8-1. Glosario de genóm ica
CentiMorgan (cM): unidad de distancia en un mapa genético (véase más
adelante); en el genoma humano IcM corresponde más o menos a una
distancia en el mapa físico de 1 Mb.
CentiRay (cR): unidad de distancia en un mapa híbrido por radiación
(véase más adelante).
Clona: las clonas de DNA son poblaciones de moléculas de DNA idénti­
cas que se purificaron mediante métodos de clonación basados en célu­
las (sección 5.3.1) o por PCR (sección 5.2.1).
Contiguo: serie de clonas de DNA que contienen insertadas moléculas de
DNA derivadas de regiones próximas y superpuestas de un cromosoma;
véase recuadro 8-5.
Marcador de DNA: término general para una secuencia de DNA que se
colocó, o puede situarse, en un mapa genético (si se trata de marcado­
res polimórficos; véase más adelante) o un mapa físico (en el caso de
todos los marcadores).
Islote de CpG: tira corta de DNA abundante en GC, con frecuencia < 1
kb, que contiene dinucleótidos CpG no metilados frecuentes. Los islo­
tes de CpG tienden a marcar los extremos 5 ' de genes; véase recuadro
9-3.
genoteca de DNA: conjunto de clonas de DNA que tiene com o fin re­
presentar de fo rm a colectiva una población de inicio de DNA. Para una
genoteca de DNA genómico, el DNA de inicio es el DNA total de una
población celular determinada (que muestra poca variación entre los
diferentes tipos de células); cuando se trata de una genoteca de cD­
NA, el DNA de inicio es cDNA preparado mediante transcriptasa inver­
sa de RNA de cadena única de un tejido especifico (con una variación
muy considerable en el cDNA de diferentes tejidos); véase secciones
5.3.4 y 5.3.5 para la form a en que se preparan y seleccionan las ge-
notecas.
EST (marcador de secuencia expresado): un STS expresado (sitio de
secuencia marcado: véase más adelante) que se obtiene al seleccionar
de modo aleatorio una clona de cDNA para secuenciación y el diseño de
cebadores específicos a fin de amplificar de manera particular mediante
PCR el fragmento correspondiente de DNA genómico.
Mapa genético: es un mapa que se basa en el rastreo de la herencia de
fenotipos, marcadores polim órficos, o ambos, a través de generaciones;
los locus polim órficos están colocados relativamente entre sí con base en
la frecuencia con que se recombinan durante la meiosis; la unidad de dis­
tancia es 1 centiMorgan (1 cM) que indica una posibilidad de recom bi­
nación del 1 %.
Genoma: nombre colectivo para las diferentes moléculas de DNA que se
encuentran en las células de una especie particular; en seres humanos el
genoma comprende 25 moléculas de DNA diferentes: un tipo único de
DNA mitocondrial y 24 moléculas de DNA nuclear diferentes (véase sec­
ción 9.1.1). Sin embargo, debido a que la cantidad de DNA en el núcleo
es tan grande, a menudo se utiliza de manera general el término genoma
para referirse al grupo de moléculas de DNA nuclear (denominado con
mayor precisión genoma nuclear: con frecuencia, el DNA mitocondrial se
describe como genoma mitocondrial)
aplicaciones médicas relevantes requieran aún un tiempo consi­
derable para desarrollarse.
A medida que se transita hacia la era posgenoma se han
emprendido enormes esfuerzos internacionales para determinar
la forma en que la secuencia del genoma humano puede espe­
cificar a una persona y cómo se relaciona el DNA de otros or­
ganismos con el del hombre y sus biologías. La información
209
i
Mapeo de célula híbrida: pueden asignarse marcadores de DNA humano
a una localización cromosómica o subcromosómica específica mediante
grupos de diferentes células híbridas que contienen un complemento total
de cromosomas de una especie de roedor (hámster o ratón) y un subgrupo
variable de cromosomas humanos o fragmentos de cromosomas huma­
nos rotos medíante exposición a rayos X (híbridos por radiación; véase
recuadro 8-4).
Marcador microsatélite: es una variedad de marcador de DNA que se
emplea de modo habitual, en buena medida porque los marcadores de es­
te tipo puede ser muy polim órficos; véase figuras 7-7 y 7-8.
Mapa físico: es un mapa que proporciona información sobre la estructu­
ra lineal de moléculas de DNA; el mapa físico más detallado es la secuen­
cia de nucleótidos.
Marcadores polimórficos: los marcadores polim órficos (genéticos)
son secuencias de DNA que muestran variación entre los individuos y
se usan para elaborar mapas genéticos de acuerdo con la form a en que
se segregan alelos en fam ilias grandes. Los marcadores pueden loca­
lizarse dentro de las secuencias de codificación u otros componentes
génicos, pero se hallan sobre todo en el DNA no codificante. Los m ar­
cadores que se utilizan con frecuencia son microsatélites y SNP, aun­
que con anterioridad se empleaban RFLP e incluso polim orfism os
proteínicos.
Mapa híbrido por radiación (HR): es un mapa de un genoma en el cual
los STS se interrelacíonan según sea la frecuencia con que se separan
mediante roturas cromosómicas inducidas por radiación. La frecuencia
se valora tras analizar un grupo de líneas de células híbridas (ser huma-
no-hámster) que contienen diferentes patrones de fragmentos cromosómi-
cos humanos generados de modo inicial por exposición a rayos X. La
unidad de distancia del mapa es 1 centiRay (1 cR), que indica una posi­
bilidad de 1 % de que ocurra una rotura entre dos locus.
RFLP (polimorfismo de longitud de fragmento de restricción): es un ti­
po de marcador de DNA que se usó en extenso con anterioridad, pero con
muy poca frecuencia en la actualidad porque no suele ser muy polim órfi-
co y no es fácil tipificarlo; véase la sección 7.1.3.
SNP (polimorfismo de nucleótido único): los SNP suministran un tipo de
marcador de DNA que se ha empleado cada vez más. Ocurren con gran
frecuencia en el DNA-y pueden tipificarse con facilidad mediante métodos
automatizados, lo que hace posible analizar al mism o tiempo enormes
cantidades de muestras; véase la sección 7.1.3 y el recuadro 18-2 don­
de se describe la forma en que se tipifican los polim orfism os de nucleó­
tido único (SNP).
STS (sitio de secuencia marcado): cualquier secuencia corta (por lo ge­
neral < 500 pb) representada de manera única en un genoma y para la
cual se diseñan cebadores que permiten la amplificación especifica de
esa secuencia mediante PCR (véase recuadro 5-4). Los STS se obtenían
al secuenciar de manera aleatoria los extremos de clonas genómicas y
por consiguiente muchas veces no eran polim órficos, pero se sabe que
un subgrupo de STS es polim órfico, incluidos los marcadores microsa­
télites (véase antes).
sobre la secuencia obtenida por el estudio de la estructura de
genomas (genómica convencional) ha facilitado el camino pa­
ra la aparición de otros métodos a gran escala que permitan in­
vestigar la función de los genomas (g e n ó m ic a fu n c io n a l) y la
manera en que se vinculan entre sí los diferentes genomas ( g e ­
n ó m ica c o m p a r a tiv a ). Estos temas se comentan en el capítulo
19 y la sección 12.3.
210 CAPITULO OCHO PROYECTOS DEL GENOMA Y ORGANISMOS MODELOS

8.2 Fundam ento y organización del mentación aleatoria del genoma, pero fue posible estudiarlos para
Proyecto del Genoma Hum ano observar los marcadores de DNA particulares que contenían y ve­
rificar si compartían marcadores con insertos en otras clonas. De
ser así, las clonas tenían con frecuencia insertos de DNA superpues­
8.2.1 Los polimorfismos de DNA y las nuevas tecnologías tos y fue posible producir mapas ordenados de clonas de DNA de
de clonación de DNA allanaron el camino para la acuerdo con la superposición entre los insertos de DNA, los llama­
secuenciación del genoma humano dos co n tigu o s d e clonas.

Desde mediados de la década de 1950 se contaba ya con un mapa

8.2.2 El Proyecto del Genoma Humano se llevó a cabo
físico muy general del genoma humano -un mapa citogenético ba­
sado en la distinción de los cromosomas por tamaño y forma-. Con
en grandes centros de genoma con capacidades
la finalidad de progresar hacia mapas físicos muy detallados se re­ de secuenciación de alto rendimiento
quirieron nuevas medidas. Un problema principal fue que parecía
imposible el objetivo inicial de obtener un mapa genético humano Organización del Proyecto del Genoma Humano
—que actuara como una estructura central para construir mapas físi­
Si bien el U.S. Human Genome Project proporcionó el impulso
cos detallados-. En lugar de ello, los genetistas humanos se limita­
inicial para el proyecto del genoma humano consolidado pública­
ban a vigilar, a medida que se elaboraban desde hacía décadas, los
mente, otros países desarrollaron con rapidez sus propios proyectos
m apas g e n é tico s típ ico s de Drosophila y el ratón, que después se
de genoma humano. Centros en el Reino Unido y Francia se apre­
depuraban de forma continua.
suraron a distinguirse y en fecha más reciente hubo contribuciones
Los mapas genéticos habituales se basan en gen es. Se elaboran
considerables de centros en otros países, de forma notable Japón y
al cruzar diferentes mutantes para determinar si los genes de dos lo-
Alemania. Con objeto de coordinar los diferentes esfuerzos nacio­
cus están ligados o no. Sin embargo, nunca podría lograrse un ma­
nales, se estableció en 1988 la Human Genome Organization
pa genético humano común porque la frecuencia del matrimonio
(HUGO, Organización d el Genoma Humano) con libertad para fa­
entre dos individuos que sufren diferentes trastornos genéticos es
cilitar el intercambio de recursos de investigación, fomentar el de­
cada vez más pequeña. Sin un mapa genético que proporcionara
bate público y asesorar en relación con las implicaciones de la
puntos de fijación era difícil imaginar cómo diseñar mapas físicos
investigación del genoma humano (McKusick, 1989).
detallados de todos los cromosomas.
Debido a la gran escala del proyecto, la tecnología necesaria pa­
Un punto decisivo fue el reconocimiento cada vez mayor, a fines
ra la secuenciación del genoma humano se concentró en unos
de la década de 1970, de que mucha (en realidad la gran mayoría)
cuantos centros de genoma muy grandes con capacidades de se­
de la variación de secuencias en el genoma humano ocurría fuera de
cuenciación en proporciones industriales (fig. 8-1). La secuencia­
los genes y podía valorarse. La variación que se había estudiado hasta
ción de DNA basada en el marcado fluorescente automatizado se
entonces se enfocó a continuación en polimorfismos de proteínas. constituyó en la norma y el advenimiento de la secu en cia ció n d e
Sólo fue factible estudiar unos cuantos marcadores de proteínas por­ DNA basada en ca p ila res (sección 7.1.2) proporcionó un refuer­
que el DNA de codificación es una fracción muy pequeña (2%) del zo muy necesario para la secuenciación de alto rendimiento. Para el
genoma y no propensa a variaciones (porque es esencial en sentido PGH cinco grandes centros se encargaron de la mayor parte de la
funcional y está muy conservada en la evolución). En contraste, la
inmensa mayoría del > 98% del DNA humano que no es codifi­
cante no está bien conservado y es muy susceptible a cambios de la
secuencia de DNA.
A finales de la década de 1970 se dispuso por primera vez de
métodos para valorar la variación d el DNA (mediante la selección
para p o lim o rfism o s d e lo n g itu d d e l fr a g m en to d e restricció n o
RFLP-, recuadro 8-1). Por último, se tornó una posibilidad la idea
de construir un mapa genético humano atípico y amplio (Botstein
y cois., 1980). Desde esa fecha en adelante, los genetistas humanos
elaborarían mapas de enlace genético cada vez más detallados me­
diante marcadores de DNA que se dispersaran al azar en la totali­
dad del genoma humano. Tras llevar a cabo pruebas para observar
si en estudios de familias se segregaban juntos alelos específicos de
dos o más marcadores, fue factible asignar marcadores de DNA a
un gr u p o d e u n ión particular. Fue posible a su vez asignar grupos
de unión individuales a cromosomas específicos mediante el mapeo
físico de uno o más de los marcadores constituyentes (p. ej., al se­
ñalar un marcador e hibridarlo en una preparación de cromosomas Fig. 8-1. Secuenciación de DNA a gran escala en el Wellcome Trust
en metafase [véase figs. 2-16 y 2-17] o al utilizar grupos de células Sänger Institute.
híbridas [véase sección 8.3.2]).
El Wellcome Trust Sänger Institute, en Hinxton, Reino Unido, ha sido el
Otra necesidad básica fue el desarrollo de tecnologías de clona­
contribuyente independiente principal del Proyecto del Genoma Huma­
ción de DNA potentes que posibilitaran ensamblar clonas que con­
no patrocinado de forma pública al que puede tenerse acceso en
tenían grandes piezas de DNA (g e n o te ca s d e DNA d e in serto
http://www.sanger.ac.uk
gra n d e). Los insertos de las clonas se habían creado mediante frag­
 8.2 FUNDAMENTO Y ORGANIZACIÓN DEL PROYECTO DEL GENOMA HUMANO 211

........... " ...............

FISH Unión de Unión:
Híbridos de células m últiples
somáticas puntos Lods, homocigosidad
Híbridos por radiación (C EPH , etc.) de pares de hermanos

Ensamble M a p a d e arm azón Localización inicial del

de contiguos m a rcad o r-m arca d o r gen de enfermedad
Clave:

O Inform aciones
M apa M apa
físico genético M é to d o s
—
físicos
U_____ £ ------- M é to d o s
M a p a del g e n o m a hum ano g enéticos

» N ube
S ec u en cia ció n Identificación á J8 negra
gènica

Fig. 8-2. Medidas y métodos científicos utilizados en el Proyecto del Genoma Humano.
El principal impulso científico para este proyecto se inició con el aislamiento de clonas genómicas y cDNA humanas (mediante clonación basada en cé­
lulas o PCR). A continuación se emplearon para construir mapas genéticos y físicos de alta resolución antes de obtener el mapa físico final, es decir, la
secuencia completa de nucleótidos de las 3 000 Mb del genoma nuclear. De manera inevitable, el proyecto interactuó con la investigación sobre el tra ­
peo e identificación de genes de enfermedades humanas. Además, proyectos auxiliares incluyeron el estudio de la variación genética (el Proyecto de Di­
versidad del Genoma Humano; sección 8.3.7), proyectos de genoma para organismos modelos (sección 8.4) e investigación sobre implicaciones
éticas, legales y sociales. Los datos obtenidos se canalizaron hacia bases de datos de mapeo y secuencias que permitieron el acceso y análisis de da­
tos electrónico rápidos. EST, marcador de secuencia expresado; STS, sitio de secuencia marcado.

secuencia, el Wellcome Trust Sanger Institute del Reino Unido y
cuatro centros de Estados Unidos: The Whitehead Institute^Massa-
chussetts Institute of Technology en Massachusetts, Washington Uni-
versity, DoE Joint Genome Institute y Baylor College of Medicine. Al
interactuar con los anteriores y algunos otros grandes centros se
creó una red mundial de laboratorios pequeños que trataban sobre
todo de mapear e identificar genes de enfermedades y de manera
característica se enfocaron en regiones subcromosómicas muy es­
pecíficas (véase fig. 8 -2 ).
La comunicación entre la red de centros del genoma y los labo­
ratorios adjuntos se basaba (y aún ahora) en la comunicación elec­
trónica. La necesidad de manejar y almacenar la enorme cantidad
de datos sobre secuenciación que se producían con rapidez obligó
a desarrollar grandes bases de datos electrónicas que, cuando me­
nos para los esfuerzos de mapeo y secuenciación patrocinados de
forma pública, son accesibles a través de internet. Puede conducir­
se así el análisis desde terminales de computadora remotas en todo
el mundo. Según fuera el origen de los datos de información, se dis­
puso de dos tipos de bases de datos:
► centrales d e depósito para alm acenar datos sobre mapeo y secuen­
ciación producidos de manera global. Décadas antes de iniciar­
se el proyecto del genoma se establecieron bases de datos de
secuencias de DNA y proteínas universales, pero hasta fecha
más reciente se formaron bases de datos de mapeos específicas
d e especie especializadas, como la G enom e d a ta b a se ( GDB
Base de datos del genoma), una base de datos de mapas diri­
gida en particular a almacenar datos sobre mapeo humano
(n ota : existe una nomenclatura específica para nombrar los
segmentos de DNA y ios genes en diferentes especies; véase
las lecturas adicionales y el recuadro 8-2 para la terminología
en seres humanos).
► bases de datos para almacenar información producida a nivel local.
A fin de mejorar su eficiencia, los grandes centros de secuencia­
ción de genoma almacenaron los datos obtenidos en sus labora­
torios en bases de datos especializadas. A diferencia de la entrada
de datos, es libre el acceso a los datos a través de la red de los
centros de genoma patrocinados de forma pública.
212 CAPÍTULO OCHO PROYECTOS DEL GENOMA Y ORGANISMOS MODELOS

8.3 Cómo se m apeó y secuenció
el genom a humano
El Proyecto del Genoma Humano se proyectó para 15 años, de
1990 a 2005, pero el progreso fue más rápido de lo esperado. Se
desarrollaron mapas genéticos antes del tiempo previsto y se fa­
cilitó la etapa final de la secuenciación del DNA a gran escala por
los adelantos en secuenciación de DNA basada en fluorescencia
automatizada y el impulso adicional que resultó de la competen­
cia con una compañía privada, Celera. Alrededor del año 2003
estaba disponible para todos a través de internet una secuencia
esencialmente terminada. Véase el recuadro 8-3 acerca de los
años en que se consiguieron algunos de los principales aconteci­
mientos.
8.3.1 Los primeros mapas genéticos humanos útiles
se basaron en marcadores microsatélites
La verificación al inicio de la década de 1980 de que ya era asequi­
ble la elaboración de un mapa genético humano amplio suscitó es­
fuerzos de consideración para diseñar uno. El primero de esos
mapas se publicó en 1987 y se basó sobre todo en p o lim o rfism o s
d e lo n g itu d d e l fr a g m en to d e restricción (RFLP). A pesar de su
heroico logro, el mapa de RFLP tuvo limitaciones notorias: el es-
paciamiento promedio entre los marcadores era considerable y, más
importante aún, los marcadores de RFLP no son muy informativos
(sólo dos alelos) y no es tan fácil tipificarlos.
Con posterioridad se desplazó la atención hacia la elaboración
de mapas con m a rca d o res m icro sa télites, cuya ventaja es la de ser
muy informativos, fáciles de tipificar y se dispersan en la totali­
dad del genoma (véase sección 9.4.3 y figs. 7-7 y 7-8). En el
transcurso de otros cinco años, los investigadores del laboratorio
Généthon en Francia publicaron el primer mapa de enlace del ge­
noma humano basado en microsatélites (Weissenbach y cois.,
1992) y dos años después un consorcio internacional publicó un
mapa mejorado, basado en esencia en microsatélites con una den­
sidad de marcadores alta, cerca de un marcador cada centimorgan
(cM) (Murray y cois., 1994).
El mapa genético humano de alta resolución publicado en 1994
satisfizo el primer objetivo científico del Proyecto del Genoma Hu­
mano e hizo posible ahora una estructura central importante para
desarrollar mapas físicos detallados de todos los cromosomas. A
partir de entonces, el principal enfoque del PGH sería desarrollar y
depurar mapas físicos que condujeran al mapa físico final, la se­
cuencia completa de DNA de cada cromosoma (véase sección
8.3.2). Pese a ello, el mapeo genético del genoma humano conti­
nuó en dos direcciones esenciales:
► d ep u ra ción d e m apas m icrosatélites. En la actualidad, el mapa
más detallado es el elaborado por el grupo genético deCODE
en Islandia, que incluyó la tipificación de 5 136 marcadores mi­
crosatélites en 146 familias, con un total de 1 257 acontecimien­
tos meióticos (Kong y cois., 2002).
► d esa rro llo d e m apas d e p o litn o rfism o d e n u cleó tid o ú n ico
(SNP) (sección 8.3.7).

Recuadro 8 2. G e n e s humanos y nomenclatura del segm ento de DNA

La nomenclatura que se utiliza la decidió el comité de momenclatura de HUGO. A los genes y seudogenes suele asignárseles símbolos de dos a seis ca­
racteres. Las secuencias de seudogenes se indican con una P después del símbolo importante del gen. En secuencias de DNA anónimas, el convenio
es utilizar D ( = DNA) seguida de 1-22, X o Y a fin de indicar la localización cromosómica, a continuación S para un segmento único, Z para una fam i­
lia de DNA repetido específica de cromosoma o F para una familia de DNA de múltiples locus, y finalmente un número de serie. La letra E después del
número de una secuencia de DNA anónima indica que se sabe que se expresa la secuencia.
Símbolo Interpretación
CRYB1 Gen para polipéptido (3-1 cristalino
GAPD Gen para deshidrogenasa de gliceraldehído 3-fosfato
GAPDL7 Gen 7 parecido a GAPD, estado funcional desconocido
GAPDP1 Seudogen GAPD 1
AK1 Gen para cinasa de adenilato, locus 1
AK2 Gen para cinasa de adenilato, locus 2
PGK1*2 Segundo alelo en el locus PGK1
B3P42 Punto de rotura número 42 en el cromosoma 3
DYS29 Segmento único de DNA número 29 en el cromosoma Y
D3S2550E Segmento único de DNA número 2 550 en el cromosoma 3, se sabe que se expresa
D11Z3 Número 3 de la familia de DNA repetido específico del cromosoma 11
DXYS6X Segmento de DNA en el cromosoma X, con una homología conocida en el cromosoma Y, y que representa el 6o. par XY homólogo por
clasificar
DXYS44Y Segmento de DNA en el cromosoma Y, con un homólogo conocido en el cromosoma X, 44o. par XY homólogo
D12F3S1 Segmento de DNA en el cromosoma 12, primer miembro de la familia 3 de múltiples locus
DXF3S2 Segmento de DNA en el cromosoma X, segundo miembro de la familia 3 de múltiples locus
FRA16A Sitio frágil A en el cromosoma 16
 8.3 I CÓMO SE MAPEÓ Y SECUENCIÓ EL GENOMA HUMANO
Recuadro 8-3. Principales acontecim ientos en el mapeo y secuenciación del genoma humano
1956: Se determinó el primer mapa físico del genoma humano; la m icros­
copía de luz de tejido teñido revela que las células del hombre contienen
46 cromosomas, con un total de 24 tipos diferentes de ellos.
1977: Fred Sanger y sus colaboradores en Cambridge, Reino Unido, pu­
blicaron el método de secuenciación de didesoxi-DNA, que aún es la ba­
se de la tecnología de secuenciación de DNA actual más de un cuarto de
siglo después.
1980: Botstein y cois., (1980) advirtieron que era posible construir un ma­
pa genético mediante un grupo de marcadores de DNA aleatorios (RFLP).
1981: Fred Sanger y cois., publicaron la secuencia completa del DNA mi-
tocondrial humano (véase sección 9.1.2).
1984: Reunión en Alta, Utah, patrocinada de manera parcial por el U.S.
Department of Energy (DoE) para valorar los métodos de detección y ca­
racterización de mutaciones y proyectar tecnologías futuras. Una conclu­
sión principal fue que se requería un programa de secuenciación de
grandes dimensiones, complejo y caro, para detectar mutaciones con
una gran precisión.
1987: El U.S. Department of Energy Report on a Human Genome Initia-
tive considera tres objetivos principales: creación de mapas físicos depu­
rados de cromosomas humanos; desarrollo de tecnologías de apoyo y
facilidades para la investigación del genoma humano; y expansión de las
redes de comunicación y capacidades de computación y bases de datos.
1988: Los U.S. National Institutes of Health (NIH) establecen una Office
of Human Genome Research (conocida más adelante como National
Center fo r Human Genome Research) a fin de coordinar las actividades
sobre genoma de NIH en cooperación con otras organizaciones estadou­
nidenses. La Human Genome Organization (HUGO) se estableció en el
mism o año para coordinar esfuerzos internacionales y tiene la libertad de
facilitar el intercambio de recursos de investigación, fomentar el debate
8.3.2 Los primeros mapas físicos de alta resolución del
genoma humano se basaron en contiguos de
clonas y referencias de sitios de secuenciación
marcados (STS)
Métodos generales en el mapeo físico del genoma humano
Aunque en la elaboración de diferentes mapas genéticos humanos
se utilizaban distintos tipos de marcadores, hubo un principio sub­
yacente común, los marcadores se tipificaron en miembros de una
variedad de familias de múltiples generaciones y se introdujeron los
datos en la computadora para buscar marcadores con alelos de co-
segregación. El mapeo físico es diferente porque son posibles mu­
chos tipos distintos de mapa (véase cuadro 8-1). El primer mapa
físico del genoma humano se basó en bandeo cromosómico y se ob­
tuvo hace más de 40 años (véase fig. 2.14 para ver un ejemplo mo­
derno de un mapa de bandeo cromosómico).
Si bien la resolución es burda, los mapas citogenéticos propor­
cionaron un armazón general muy útil para ordenar las secuencias
de DNA humano mediante hibridación in situ y los puntos de ro-
cura citogenéticos definidos suministraron herramientas para el
mapeo adicionales. De igual modo, se generaron m apas d e restric­
ció n d e lím ites la rgos al emplear nucleasas de restricción de corte ra­
ro, por ejemplo, para producir un mapa de restricción NoA de 2 1 q
(Ichikawa y cois., 1993). No obstante, en el contexto del PGH, el
primer mapa físico de alta resolución del genoma humano fue po­
213
público y asesorar sobre las implicaciones de la investigación del geno­
ma humano (McKusick, 1989).
1990: Lanzamiento oficial del Proyecto del Genoma Humano (PGH) des­
pués de autorizar un proyecto de tres mil millones de dólares para 15
años en Estados Unidos.
1991: Se establece la Genome Database (GDB), una reserva para datos
sobre el mapeo del DNA humano.
1992: Jean Weissenbach y cois., del laboratorio Généthon de Francia pu­
blican el primer mapa de enlace genético humano amplio basado en mar­
cadores microsatélites (Weissenbach y cois., 1992).
1993: Daniel Cohén y cois., del laboratorio Généthon de Francia publican
un mapa físico de primera generación del genoma humano, basado en In­
sertos de clonas de DNA grandes (Cohén y cois., 1993).
1995: Eric Lander y colegas del Whitehead Institute/Massachusetts Institute
of Technology publican el primer mapa físico detallado del genoma humano,
basado en sitios de secuenciación marcados (Hudson y cois., 1995).
1998: Un consorcio internacional dirigido por investigadores del Sanger
Centre de Inglaterra (Deloukas y cois., 1998) publica el GeneMap '98, el
primer mapa razonablemente amplio de marcadores basados en genes.
1999: Un consorcio internacional dirigido por investigadores del Sanger
Centre, Inglaterra, publica la primera secuencia completa de un crom oso­
ma humano, el cromosoma 22 (Dunham y cois., 1999).
2001: Publicación de esquemas de trabajo generales acerca de la secuen­
cia del genoma humano (que comprende alrededor de 90% de la secuen­
cia total) por un consorcio internacional de investigadores patrocinados
con recursos públicos y por una compañía privada, Celera (International
Human Gene Sequencing Consortium, 2001; Venter y cois., 2001).
2003: Se termina la secuencia del genoma humano.
sible tras establecer g e n o te ca s d e clo n a s d e DNA g e n ó m ico me­
diante clonas de DNA basadas en células (véase en la sección 5.3.4
los principios generales). Una vez que se dispuso de ellas, fue facti­
ble seleccionar las genotecas con la finalidad de identificar clonas
individuales que pudieran agruparse a continuación en grupos de
clonas con insertos originados del mismo cromosoma y región subcro-
mosómica. Por último, sería posible organizar las clonas en grupos
que abarcaran regiones subcromosómicas grandes y al final cromo­
somas completos.
Para preparar genotecas de clonas de DNA genómico fue habi­
tual comenzar con una línea celular permanente (linfoblastoide) pa­
ra proporcionar una fuente continuamente renovable de una
población celular homogénea. Después de aislar el DNA genómico
de la línea celular con métodos estándar, se corta el DNA con una
nucleasa de restricción y se clona en un vector apropiado a fin de
preparar la genoteca de DNA genómico de elección. Por lo general,
los intentos iniciales usaban vectores lambda y cósmido para crear
genotecas con insertos entre 15 y 40 kb (sección 5.4.2). Los inser­
tos de clonas podían seleccionarse (al inicio mediante hibridación
con una clona de cDNA pequeña aislada de forma previa, pero en
fecha más reciente con PCR) y a continuación mapearse con facili­
dad a una región subcromosómica mediante h ib rid a ció n crom osó-
m ica in situ (véase figs. 2-16 y 2-17; nota: el mapeo de clonas de
cDNA mucho más cortas mediante su hibridación a cromosomas
de metafase fue mucho más difícil a nivel técnico que mapear grandes
clonas genómicas y casi nunca se intentó).
214 CAPÍTULO OCHO i PROYECTOS DEL GENOMA Y ORGANISMOS MODELOS

Cuadro 8-1. Es posible utilizar diferentes tipos de mapas físicos para trazar el mapa del genoma nuclear humano.
Tipo de mapa Ejemplos/metodología Resolución
Citogenético Mapas de bandeo cromosómico Una banda promedio tiene varios Mb de DNA

Mapas de punto de rotura Grupos de células híbridas somáticas que contienen frag­ La distancia entre puntos de rotura cromosómicos
cromosómica mentos de cromosomas humanos derivados de transloca­ adyacentes en un cromosoma suele tener varios Mb
ción o deleción cromosómicas naturales

Mapas de híbridos por radiación (HR) monocromosómícos La distancia entre puntos de rotura tiene con fre­
cuencia muchos Mb

Mapas de HR del genoma completo La resolución puede ser tan alta como 0.5 Mb

Mapa de restricción Mapas de restricción de cortador raro, p. e j„ mapas Not\ Varios cientos de kb para mapas de restricción de
cortador raro

Mapa de contiguo de clona Clonas YAC superpuestas El inserto promedio de YAC tiene varios cientos de
kb de DNA

Clonas cósmidas superpuestas El inserto cósmido promedio es de 40 kb

Mapa de STS (sitio de secuen­ Requiere información de secuencia previa de clonas orde­ Es posible menos de 1 kb. pero los mapas estándar
cia marcado) nadas de tal modo que puedan ordenarse los sitios de se­ de STS tienen resoluciones de decenas de kb
cuencia marcados (STS)

Mapa de EST (marcador de Requiere secuenciación de cDNA y a continuación otra vez La resolución promedio del genoma nuclear humano
secuencia expresado) mapeo de los cDNA para otros mapas físicos es - 9 0 kb

Mapa de secuencia de DNA Secuencia completa de nucleótidos de DNA cromosómico 1 pb

En las primeras genotecas de DNA genómico humano, la in­
mensa mayoría de las clonas era anónima (porque se desconocía la
identidad de su DNA insertado) y carecía de mapeo. De modo gra­
dual se caracterizaron cada vez más clonas de cDNA diferentes, lo
que permitió identificar las clonas de DNA genómicas correspon­
dientes (afines) y en seguida mapearse en regiones subcromosómi-
cas (fue más fácil caracterizar clonas de cDNA porque tenían
insertos cortos que podían secuenciarse con relativa rapidez y las
genotecas eran menos complejas, con tipos particulares de clonas
que a menudo predominaban por expresión génica diferencial, por
ejemplo, transcritos de globina en muestras de sangre).
Con objeto de ayudar a mapear clonas de DNA genómico hu­
mano, se desarrollaron métodos adicionales, entre ellos los si­
guientes:
► en riq u ecim ien to d e l DNA d e in icio. En lugar de usar DNA
del genoma completo, se purificaron cromosomas individuales
mediante cito m etría d e flu jo con los mismos principios em­
pleados para fraccionar células en un seleccionador celular
FACS. Tras reunir suficientes números de un tipo particular de
cromosoma, se crearon g e n o te ca s d e DNA esp ecífica s d e cr o ­
m osom a (Davies y cois., 1981). Además, los procedimientos
de m icro d isecció n cro m o sóm ica hicieron posible elaborar ge­
notecas de DNA a partir de DNA aislado de una región sub-
cromosómica específica (Ludecke y cois., 1989).
► m a p eo d e célu la h íb rida . Después de secuenciar un tramo cor­
to al final de una clona genómica se diseñó una valoración de
PCR para esta secuencia específica y a continuación se utilizó
para tipificar un grupo de células híbridas ideadas para carecer
de ciertos cromosomas o regiones subcromosómicas humanos
(véase recuadro 8-4).
► u n ión g e n é tica a un fragmento de DNA colocado con anterio­
ridad en el mapa físico mediante una de las diversas técnicas de
mapeo descritas.
Mapa físico dei genoma humano basado en cromosomas
artificiales de levadura (YAC)
Al inicio del Proyecto del Genoma Humano en 1990, las genote­
cas de DNA genómico disponibles contenían insertos hasta de 40
kb de largo (clonas cósmidas), que en la inmensa mayoría de los ca­
sos eran anónimos y no estaban mapeados en gran parte. Debido al
tamaño muy grande del genoma humano, una genoteca cósmida,
con un tamaño de inserto promedio de unos 40 kb, requeriría va­
rios cientos de miles de clonas diferentes a fin de asegurar una pro­
babilidad alta, que se aproximara al 100 %, de que el genoma se
representara en la genoteca. Seleccionar estas genotecas complejas a
fin de aislar clonas individuales y organizar estas últimas en grupos
relacionados eran labores atemorizantes.
Para reducir el problema de seleccionar números inmensos de
clonas y facilitar su organización en grupos relacionados resultaban
atractivos los sistemas de clonación que ofrecían insertos de tama­
ños muy grandes. Se desarrollaron métodos novedosos con la fina­
lidad de lograr este objetivo y se obtuvieron cromosomas eucariotas
artificiales. El sistema cromosómico se basó en cromosomas de le­
vadura lineales en los que se sabía que sólo eran indispensables se­
cuencias muy pequeñas para la función del cromosoma. Mediante
la purificación de estas secuencias y tras combinarlas a continua­
ción con fragmentos de DNA humano grandes fue posible hacer
moléculas híbridas que contenían insertos humanos del tamaño de
megabases, pero que se comportaban aún como cromosomas en
 8.3 CÓMO SE MAPEÓ Y SECUENCIÓ EL GENOMA HUMANO 215

Recuadro 8-4. Mapeo de células híbridas

PRINCIPIOS BÁSICOS DE HÍBRIDOS DE CÉLULAS SOMÁTICAS

Bajo ciertas condiciones experimentales es posible inducir la fusión entre C é lu la h u m a n a C é lu la d e rató n o h á m s te r
sí de células cultivadas de diferentes especies, lo cual crea híbridos de
células somáticas. Para propósitos de mapeo humano, las células híbri­
das se preparan de manera característica al fusionar células humanas
con células de roedores (ratón o hámster). Los productos iniciales de la
fusión se denominan heterocariones, porque las células contienen un nú­
cleo humano y otro de roedor. Por último, los heterocariones prosiguen
hacia la mitosis y se disuelven las dos envolturas nucleares. Más adelan­
te se unen entre sí los cromosomas humanos y de roedor en un solo nú­
cleo. Estas células híbridas son inestables. Por razones desconocidas, la
mayor parte de los cromosomas humanos no se replica en rondas sub­
secuentes de división celular y se pierde. Esto da lugar al final a una va­
riedad de líneas celulares híbridas más o menos estables, cada una de las
cuales contiene un juego completo de cromosomas de roedor además de
unos cuantos tipos de cromosomas humanos (véase la primera figura del
recuadro). En esencia, los cromosomas humanos se pierden en forma
aleatoria, pero pueden controlarse mediante selección.
Es posible emplear grupos de células híbridas con diferentes subgrupos
de cromosomas humanos para mapear un gen o una secuencia de DNA
humano de un cromosoma humano específico. Sin embargo, es más efi­ P é rd id a a le a to ria
ciente usar grupos de híbridos monocromosómicos (células que sólo d e c ro m o s o m a s
contienen un tipo aislado de cromosoma humano), que representan en h u m an o s
conjunto todos los 24 tipos de cromosomas humanos (Cuthbert y cois.,
1995). Para formar un híbrido monocromosómíco se exponen células hu­ S ó lo u n o s c u a n to s J u e g o c o m p le to d e
manas de donador a colcemida, lo que causa que se divida el juego de c ro m o s o m a s c ro m o s o m a s
hum anos d e ro e d o r
cromosomas en paquetes subnucleares menores (m icro núcleos). La
centrifugación subsecuente puede precipitar la formación de m icrocélu-
H íb rid o d e c é lu la s o m á tic a e s ta b le
las que consisten en un micronúcleo aislado con un anillo delgado de ci­
toplasma, rodeado por una membrana plasmática intacta. Se fusionan las
microcélulas con células de roedor receptoras (fusión microcelular) a fin
de generar híbridos, algunos de ellos con un cromosoma humano aisla­ P rin cip io de híbridos de células som áticas.
do (véase, por ejemplo, Warburton y cois., 1990).
HÍBRIDOS POR RADIACIÓN algunos híbridos aunque no en otros. Aunque el patrón de integración de
También es posible mapear un gen o una secuencia de DNA humano a los fragmentos es sobre todo aleatorio, marcadores individuales propor­
una localización subcromosómica mediante grupos de híbridos por ra­ cionan patrones de tipificación relacionados si se localizan com o vecinos
cercanos en un cromosoma particular. El principio de un mapa híbrido
diación, células híbridas que contienen fragmentos de cromosomas hu­
por radiación recuerda el análisis de enlace meiótico (cap. 13): cuanto
manos integrados con un juego completo de cromosomas de roedor. Los
fragmentos de cromosomas humanos se generan al someter las células más cerca se encuentren entre si dos secuencias de DNA en un crom o­
soma, más baja es la probabilidad de que se separen por la ocurrencia al
del donador a una dosis letal de radiación que provoca roturas cromosó-
micas (el tamaño promedio del fragmento depende de la dosis de radia­ azar de un punto de rotura entre ellas. La frecuencia de rotura cromosó-
mica entre dos marcadores puede definirse por un valor o, análogo a la
ción). Después de radiar las células del donador se fusionan con células
frecuencia de recombinación en el mapeo meiótico. El valor o varía de ce­
del roedor receptor y se usa un sistema de selección para tomar las cé­
ro (los dos marcadores nunca se separan) a 1.0 (los dos marcadores
lulas del receptor que captaron algunos de los fragmentos cromosómicos
del donador (véase Walter y cois., 1994). siempre se separan).
Al igual que en el mapeo meiótico, theta subestima la distancia entre mar­
Con anterioridad se utilizaban grupos de híbridos por radiación mono­
cadores que están muy apartados en el mismo cromosoma, en este ca­
cromosómicos en los que la linea celular donadora era un híbrido monocro-
mosómico: en este caso se integrarían fragmentos del tipo aislado de so debido a que la célula puede captar dos marcadores en fragmentos
cromosoma humano a fragmentos de los cromosomas de roedor rotos en separados. Una estimación más precisa la proporciona una función de
mapeo de HR, D = — ln(1 —o), que es análogo a la función de mapeo
el juego de cromosomas de roedor de la célula receptora (Cox y cois.,
1990). Se superaron por grupos de híbridos por radiación del genoma Haldane que se utiliza en el análisis de enlace meiótico (sección 13.1).
completo en los que el donador es una célula diploíde humana normal D se mide en centiRays (cR) y depende de la dosis de radiación, de tal
radiada (Walter y cois., 1994). En cualquier híbrido, sólo se integra una pro­ manera que se contrasta contra el número de rads. Por ejemplo, una dis­
porción de las piezas de los cromosomas humanos rotos y, por consiguien­ tancia de 1 cRgooo entre dos marcadores representa una frecuencia de 1 %
te, los diferentes híbridos poseen distintas fracciones del genoma humano de rotura entre ellos después de exponerse a 8 000 rads de rayos X.
integrado en el juego de cromosomas del roedor receptor. En el Proyecto del Genoma Humano son en particular im portantes dos
Un mapa híbrido por radiación (HR) puede elaborarse al tipificar un gru­ grupos de híbridos por radiación. El grupo Genebridge 4 consiste en 93
po de híbridos con un juego de marcadores de DNA humano. Debido a híbridos por radiación ser hum ano-criceto con un tamaño promedio del
que los híbridos individuales tienen diferentes subgrupos del genoma hu­ fragmento humano de 25 Mb y 32% de retención de cualquier secuen­
mano pero superpuestos, se encuentran los distintos marcadores en cia humana particular en cada híbrido. Los laboratorios pueden mapear
216 CAPÍTULO OCHO PROYECTOS DEL GENOMA Y ORGANISMOS MODELOS

Recuadro 8-4. (con tinuació n)

cualquier STS desconocido al calificar los híbridos 93 Genebridge y
com parar el patrón con los patrones de marcadores mapeados antes,
que se conservan en un servidor central (figura, parte inferior). Un se­
gundo grupo ser humano-criceto, el Grupo Stanford G3, se llevó a ca­
bo tras utilizar una dosis de radiación más alta, de tal manera que el
tamaño promedio del fragmento humano fue más pequeño. Los 83 hí­
bridos en G3 tienen un promedio de 16% de retención del genoma hu­
mano, con un tamaño promedio del fragmento de 2.4 Mb. Por consi­
guiente, puede utilizarse G3 para un mapeo más fino. Es posible tener
acceso a los impresionantes resultados del uso a gran escala de estos
grupos en http:w w w.ncbi.nlm .nih.gov/genem ap98/ (Deloukas y cois.,
1998).

Fusionar con células TK de

hám ster
Dosis letal de
Fibroblastos humanos radiación ^ Células con cromosomas w C élulas híbridas
normales fragm entados (TK+)

Mapeo de HR en laboratorio periférico

S TS por m apear
S eleccionar 100 a 200 híbridos
diferentes (cada uno conserva
25 a 3 0 % del g enom a hum ano
en fragm entos pequeños)

PCR am plifica STS C rom osom as de ratón que contienen

en cada híbrido fragm entos d e D N A hum ano integrados (■) H ibridar con
STS m apeados
conocidos

Igualar
patrón
Base de datos sobre
servidor central

Localización

Mapeo de híbrido por radiación.

células de levadura, los llamados cromosomas artificiales de leva­
dura (YAC; véase la sección 5.4.4 para más detalles).
Las genotecas de YAC con un tamaño promedio de inserto, por
ejemplo de 1 Mb, requerirían cerca de 12 000 a 15 000 clonas sólo
para ser razonablemente representativas del genoma humano y ten­
drían la ventaja de permitir incluir en una clona aislada genes gran­
des (aunados a grupos de genes u otros segmentos funcionales).
Con base en este razonamiento, Daniel Cohén y colaboradores del
laboratorio CEPH de París elaboraron un mapa del genoma huma­
no basado en YAC, el primer mapa físico de alta resolución más o
menos detallado (Cohén y cois., 1993). De manera subsecuente, el
mismo grupo publicó un mapa de YAC actualizado que incluía tal
vez 75% del genoma humano y consistía en 225 contiguos con un
tamaño promedio de 10 Mb (Chumakov y cois., 1995).
El principio subyacente en los mapas de YAC (y todos los otros
mapas físicos basados en clonas), es ordenar las clonas en la genote­
ca a partir de la región subcromosómica de origen para los insertos
de DNA. El mapa se construye al definir grupos de clonas en las
que el inserto de DNA deriva de una región subcromosómica común
y en los que el inserto de DNA de cualquier clona se superpone en
el inserto de DNA de algunas otras clonas en el grupo de clonas.
Esto significa que la región subcromosómica relevante está repre­
sentada por una disposición lineal de clonas superpuestas en parte
sin dejar ningún intersticio. Este grupo contiguo de secuencias de
DNA clonadas se denomina contiguo de clona (véase recuadro 8-5).
Mapa del sitio de secuencia marcado (STS) del genoma
humano de alta resolución
La precisión de los mapas de contiguo de clona depende en esencia
del grado al cual el DNA de la clona insertado representa en reali­
dad la secuencia genómica original. A pesar de que el mapa de YAC
humano fue un logro impresionante, hubo áreas considerables del
genoma no representadas en el mapa y una limitación inherente
notable: muchas veces los DNA insertados no eran representacio­
nes fieles del DNA genómico. Los insertos grandes de YAC son
 8.3 i CÓMO SE MAPEÓ Y SECUENCIÓ EL GENOMA HUMANO
propensos a reordenamientos (que incluyen pérdida de secuencias
internas) y se observó un problema de consideración con el q u im e-
rism o (en el que una célula aislada transformada contenía dos o
más piezas de DNA humano de porciones no contiguas del geno­
ma, a menudo de diferentes cromosomas, como resultado de coli­
gadura o cotransformación; véase respectivamente figs. 5-5A y 5-5B).
Para prevenir posibles problemas consecutivos a la falta de fidelidad
de insertos de la clona, las medidas de mapeo físico del PGH insistie­
ron, asimismo, en la necesidad de elaborar mapas basados en sitios de
secuencia marcados (STS; véase recuadro 5-4). Con una densidad su­
ficientemente alta de STS notables podía evitarse el problema de la
inestabilidad del inserto en genotecas de YAC: un gran número de STS
significaría que la cobertura física de cualquier región problema podría
restablecerse con rapidez al tipificar STS de otros tipos de clonas (BAC,
Pl, PAC, etc.). Con base en este razonamiento, Eric Lander y colabo­
radores del Whitehead Institute of Biomedical Research and Massa-
chusetts Institute of Technology publicaron el logro sobresaliente de
un mapa de STS humano con más de 15 000 STS y un espaciamien-
to promedio de menos de 200 kb (Hudson y cois., 1995).
El mapa de STS humano fue un mapa físico integrado en el cual
los STS se utilizaron para tipificar: a) un grupo de célu las híbridas
p o r ra diación humanas (véase recuadro 8-4); y b) la genoteca CEPH
YAC. Los marcadores de los STS fueron de dos tipos, no polimórfi-
cos y polimórficos. Los marcadores STS no polimórficos incluyeron
STS derivados mediante la secuenciación aleatoria de clonas genómi-
cas y a continuación se elaboraron cebadores de PCR de regiones no
repetidas y STS seleccionados de secuencias de cDNA (con cebadores
correspondientes a secuencias no separadas por un intrón), los llama­
dos m arcadores d e secu en cia expresados o EST (véase sección
8.3.4). Los marcadores de STS polimórficos consistieron en esencia en
marcadores microsatélites, a la mayoría de los cuales los había utiliza­
do el grupo Généthon en el mapeo genético humano.
El mapa de STS publicado por Hudson y colaboradores (1995)
proporcionó un esquema físico extenso del genoma humano y, de­
bido a que incluía más de 2 400 EST, suministró asimismo un ma­
pa génico humano embrionario. En adelante, el enfoque del proyecto
del genoma humano sigue dos direcciones: creación de mapas géni-
cos (transcritos) de alta resolución y uso del mapa de STS existente
a fin de proporcionar una estructura para construir contiguos de
clonas mediante clonas de cromosomas artificiales bacterianos (BAC).
8.3.3 La etapa final del Proyecto del Genoma Humano
dependió en vital medida de los contiguos
de clonas BAC/PAC
Métodos de secuenciación
Debido a que los insertos de YAC no son con frecuencia represen­
taciones fidedignas del DNA de inicio original, se requerían mapas
de contiguos de clonas del genoma humano de segunda generación
con objeto de suministrar el DNA humano clonado a secuenciar.
Se seleccionaron cromosomas artificiales BAC y P l (PAC) como
sistemas de clonación porque si bien el tamaño de sus insertos (100
a 250 kb) es mucho más pequeño que los de YAC, esta desventaja
es más que superada por la mayor fidelidad del inserto (véase sec­
ción 5.4.3). Por consiguiente, podría utilizarse como plantilla físi­
ca para secuenciación una variedad de diferentes BAC humanos y
en menor grado genotecas de cromosomas artificiales Pl (PAC).
El método de secuenciación que se usó en el Proyecto del Ge­
noma Humano consolidado se basó en secuenciación en escopeta­
217
zo jerárquica (en contraste, Celera empleó una medida de secuen­
ciación en escopetazo del genom a completo; véase fig. 8-3). Secuen­
ciación en escopetazo significa que se corta de manera aleatoria un
DNA de inicio en fragmentos pequeños, de modo característico
mediante sonicación seguida de reparación del extremo y los frag­
mentos resultantes se clonan en un vector a partir del cual es posi­
ble preparar DNA recombinante de cadena única con facilidad y
usarse de forma directa en la secuenciación (véase recuadro 7-1).
En el método de secuenciación en escopetazo jerárquica, el DNA uti­
lizado para secuenciación en escopetazo son los insertos purificados
de clonas de BAC individuales que se colocaron con precisión en un
mapa físico; en contraste, la secuenciación en escopetazo del genoma
completo comprende la secuenciación en escopetazo de manera di­
recta del DNA genómico aislado (fig. 8-3).
La base de la metodología de secuenciación usada en la secuen­
ciación del genoma humano fue el método de dideoxisecuencia-
ción que desarrollaron hace un cuarto de siglo Fred Sanger y
colaboradores. Aunque no había cambiado el método subyacente,
se introdujeron varios adelantos en la eficiencia al automatizar va­
rios aspectos de la generación de secuencias y el análisis de datos. El
desarrollo de secuenciadores de DNA automatizados basados en
marcado fluorescente y después secuenciadores capilares (véase sec­
ción 7.1.2) permitió rendimientos de secuenciación mucho más al­
tos. Varios programas de computadora especiales ayudaron a la
interpretación y ensamble de secuencias, en especial el PHRED
(que analiza trazos de secuencias crudas y proporciona una califica­
ción de calidad en cada posición de base a fin de indicar con un gra­
do de confianza que la llamada base asignada es correcta) y el
PHRAP (que ensambla secuencias crudas en contiguos de secuen­
cias tras seleccionar secuencias superpuestas compartidas por dos o
más clonas independientes en escopetazo).
El problema con el DNA repetido
El ensamble de secuencias de clonas individuales para identificar
superposiciones (y por consiguiente reconstruir la secuencia del
genoma) depende de modo decisivo de una suposición importan­
te: las secuencias superpuestas están representadas de form a singular
dentro del genoma. Sin embargo, una fracción muy grande (cerca
de 50%) del genoma humano se integra con DNA repetido (sec­
ciones 9.4 y 9.5). Se conocían bien clases de DNA entremezcladas
muy repetidas, por ejemplo las repeticiones LINE-1 y Alu y, en
consecuencia, se evitaron siempre que fue posible cuando se bus­
caban pruebas de superposiciones importantes entre las secuencias
de clonas.
A pesar de las precauciones anteriores, resultarían problemáticas
áreas muy ricas en secuencias repetidas conocidas, en tanto que otra
preocupación era la de repeticiones de números de copias bajas no iden­
tificadas con anterioridad (una preocupación muy real ya que de ma­
nera subsecuente se encontró que una fracción valorable del genoma
había sufrido duplicación segmentaria, con secuencias que abarcaban
decenas de kilobases y en ocasiones cientos de kilobases presentes en
dos o más regiones del genoma; véase sección 12.2.5). Cuando me­
nos en el PGH, el método de clonación en escopetazo jerárquica fa­
cilitó el ensamble de secuencias, en tanto que el de clonación en
escopetazo del genoma completo utilizado por la compañía privada
Celera implicaba grandes demandas en potencia de computación y
los críticos argumentaron que si se empleaba en el aislamiento esta me­
dida, estaba condenada a fracasar por la complejidad y el alto conte­
nido de repeticiones en el genoma humano (véase recuadro 8 -6 ).
218 CAPÍTULO OCHO PROYECTOS DEL GENOMA Y ORGANISMOS MODELOS

Recuadro 8-5. Mapeo físico mediante formación de contiguos de clonas

La elaboración de genotecas de DNA genómico incluye una digestión de
restricción parcial del DNA por clonar controlada de manera cuidadosa.
De forma característica, la enzima que se emplea para producir fragmen­
tos de restricción del DNA de inicio es Mbo\ que identifica una secuencia
de reconocimiento de 4 pb (IGATC) y cabría esperar que, en promedio,
cortara el DNA una vez cada 300 pb. En lugar de exponer el DNA de ini­
cio a concentraciones muy bajas de la enzima y por períodos cortos, só­
lo se corta un número muy pequeño del total de sitios de restricción
disponibles. Por ejemplo, cuando se preparan genotecas de BAC, el ta­
maño del fragmento de clonación deseado tiene alrededor de 200 kb y a
fin de lograrlo deben cortarse menos de 1% de los sitios Mbo\ disponi­
bles para corte.
El DNA de inicio se consigue de millones de células diploides y por lo tan­
to cada uno de los 23 tipos originales de molécula de DNA humano (que
corresponden a los 23 tipos diferentes de cromosomas) están represen­
tados por millones de copias idénticas del par original de moléculas de
DNA cromosómico. Sin embargo, cuando se someten a digestión por
restricción parcial, se cortan de manera aleatoria las moléculas de DNA.
En consecuencia, para cualquier región subcrom osómica determinada, el
millón de moléculas importantes revela diferentes patrones de corte de
sitio de restricción (véase figura, parte superior).
Como resultado de la digestión por restricción parcial, se generan frag­
mentos diferentes que poseen secuencias superpuestas derivadas de la
misma región subcromosómica. Aunque los fragmentos individuales se
clonan en diferentes células huésped, es posible identificar clonas con in­
sertos superpuestos al seleccionar similitudes entre los insertos de distin­
tas clonas y definir al final un juego de clonas con insertos superpuestos
de tal manera que está representada toda la secuencia original de DNA en
la región cromosómica, sin vacíos, dentro de los insertos de este grupo
de clonas, un llamado contiguo de clona (véase figura, parte media).

DNA de inicio: una población de m oléculas de DNA

C orte parcial (aquí = una vez cada

15 sitios en promedio)
1

Fragm entos su p erp u e sto s ---------» Clona en diferentes células

Dibujo superior. Generación de fragmentos de DNA superpuestos mediante corte de restricción parcial.

Dibujo en medio. Un contiguo de clona (una serie de clonas con insertos de DNA superpuestos de modo parcial).

TG F MAD 327 AN X 2115 2113 291 21 1 2109 2112 145 EGR ACTA3 2116 2114 90 HKZ 286
a IV H10
967b10■
432a12 -( )----- ( h
973c8 -
682g6 - -< h
772h3 - -< )----- ( h
792f4
850q4 — • - —------ ( h
747f5 — * - -i )----- ( h
941 g 2 — • - -i h
7 6 3 h 1 0 — • ---------( ) - -i h
D ibujoinferior. Ejemplo de un contiguo de STS eneilcrom osom a2.
Los marcadores en la parte superior incluyen STS de genes (TGFa, MAD, etc.) y asimismo marcadores anónimos (D2S327, D2S2115, etc., que se abre­
vian aquí al eliminar el prefijo D2S). Las clonas son de YAC y los paréntesis indican ausencia de STS esperado, con mayor probabilidad com o resulta­
do de reordenamientos internos del cromosoma artificial de levadura (YAC).
 8.3 CÓMO SE MAPEÓ Y SECUENCIÓ EL GENOMA HUMANO 219

••• • ;. - w • ' - • ' C- • ' . Í Í W ’ ; í, y, ' • 1 -- '• • •-- - ' ' '•

Recuadro 8 5. (c o n tin u a c ió n )

Las clonas con insertos superpuestos pueden identificarse en diferentes
formas. En el caso del mapa de YAC humano (sección 8.3.2) se recono­
cieron las clonas superpuestas mediante hibridación clona con clona
(con una sonda formada a partir de un YAC para hibridar opuesta a las
otras clonas YAC) o una huella digital de clona (tras comparar clonas
para observar si comparten patrones característicos de espaciamiento de
secuencias repetidas o sitios de restricción particulares). En fecha más
reciente, el método preferido ha sido el mapeo del contenido de STS.
como se demostró en el mapa STS publicado por Hudson y colaborado­
res (1995). En este caso, todas las clonas se tipifican para la presencia
de cada uno de un grupo de marcadores de sitio de secuencia marca­
do y a continuación se segregan en grupos, sea que las clonas conten­
gan dos o más marcadores de STS específicos en común (véase figura,
dibujo inferior).

A) Escopetazo jerárquico B) Escopetazo de genoma completo

G enom a

C o n tig u o d e clo n a s d e in s erto g ra n d e

F ra g m e n ta c ió n a le a to ria

S e c u e n c ia c ió n y
e n s a m b le Y T 1

A n c la je

E n s a m b le d e l g e n o m a

Fig. 8-3. Diferentes medidas de secuenciación en escopetazo para secuenciar el genoma humano.
A) Secuenciación en escopetazo jerárquica. Se fragmenta el DNA genómico humano mediante digestión por restricción parcial y los fragmentos de
restricción grandes resultantes se clonan en vectores BAC a fin de generar una genoteca de clonas de cromosomas artificiales bacterianos (BAC). Las
clonas de BAC se organizan en contiguos grandes tras tipificar todas las clonas mediante marcadores STS a fin de identificar clonas con insertos super­
puestos. Los insertos de clonas de BAC seleccionados se clonan y secuencian en escopetazo. Los fragmentos secuenciados de un BAC se ensamblan
a continuación para dar la secuencia de BAC y se integran secuencias completas de BAC con objeto de eliminar superposiciones. B) Secuenciación en
escopetazo del genoma completo. En este caso, se envía de modo directo DNA genómico aislado para clonación y secuenciación en escopetazo y las
piezas secuenciadas se ensamblan en contiguos grandes que abarcan megabases. Adaptado de Waterston y cois., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 2002; 99,
p. 3713, con autorización de la National Academy of Sciences, USA.

8.3.4 Los primeros mapas de genes humanos de alta
densidad se basaron en marcadores
de secuencias expresados (EST)
Al inicio del PGH se discutió con amplitud la decisión de abarcar
la totalidad (secuenciación de tres mil millones de bases) o enfocar­
se primero en una fracción muy pequeña que representaba la se­
cuencia del DNA de codificación, que era con mucho la parte más
interesante y de relevancia médica. Quienes apoyaron la secuencia­
ción del genoma completo predominaron al final en la discusión y
resaltaron que podría ser difícil encontrar todos los genes (algunos
genes pueden tener una expresión muy restringida) y que cierto
DNA no codificante posee importancia funcional, por ejemplo en
el caso de elementos reguladores y secuencias esenciales para la fun­
ción cromosómica. No obstante, en los años iniciales del proyecto,
los intereses comerciales competidores tornaron una prioridad el
hallazgo de genes.
Un método inicial incluyó la secuenciación a gran escala de
secuencias cortas en las regiones no traducidas 3' (RNT) de clo­
nas de cDNA que se habían seleccionado de modo aleatorio de
una diversidad de genotecas de cDNA humano (Adams y cois.,
1991). Estas secuencias cortas se describieron como marcadores
de secuencia expresados (EST) porque, al igual que para los si­
tio s d e secu en cia m a rca d o s más generales, la secuencia permitía
diseñar una valoración específica de PCR para la secuencia expre­
sada (las secuencias genómicas que especifican secuencias de RNT
3' están separadas de manera menos común por intrones que el
DNA codificante y en consecuencia los cebadores de PCR de un
220 CAPÍTULO OCHO PROYECTOS DEL GENOMA Y ORGANISMOS MODELOS
Recuadro 8 - 6 . Cooperación, com petencia y controversia en proyectos del genoma
Cooperación y competencia en proyectos de genomas patrocinados de
forma pública
Debido a su escala, los proyectos de genomas son empresas mayores.
En muchos casos hubo loables intentos de cooperación: com partir recur­
sos entre diferentes centros y laboratorios, subdivisión acordada de dife­
rentes labores del proyecto, etc. El proyecto del genoma de la levadura
fue un excelente ejemplo que incluyó la cooperación muy organizada en­
tre distintos centros europeos que se extendió de forma subsecuente a la
cooperación en el análisis funcional. En otros casos suelen ser obvias las
tensiones com o resultado de la feroz competencia entre diferentes labo­
ratorios y la duplicación desperdiciada de esfuerzo, por ejemplo en el pro­
yecto del genoma de E. coli. En este caso se desarrolló una carrera de
competencia entre estadounidenses y japoneses que condujo a un final
muy cerrado: el laboratorio estadounidense depositó su secuencia en el
GenBank una semana antes que el grupo japonés.
Tensiones entre los sectores público y privado: patentes génicas
Las diferentes prioridades de los sectores público y privado provocaron
puntos de tensión en los proyectos del genoma. Un área inicial de dispu­
ta se relacionó con las patentes génicas. El primer problema se presen­
tó en 1991, cuando el U.S. NIH solicitó las patentes de más de 7 000
fragmentos de clonas de cDNA del cerebro humano, cuyas secuencias se
habían establecido como parte de un ejercicio de mapeo de EST condu­
cido por Craig Venter. Este intento se encontró con la amplia oposición de
la comunidad-científica, en especial porque no se sabía nada sobre las
funciones de las secuencias expresadas. Bajo presión, la oficina estadou­
nidense de patentes rechazó las solicitudes. Surgió por primera vez una
nueva pregunta importante: ¿guién es el propietario del genoma huma­
no? (véase Thomas y cois., 1996). Así, a muchas personas la idea del
monopolio comercial de lo que es tan sólo la herencia genética del hom­
bre les pareció alarmante y ofensiva.
Con posterioridad, Venter dejó los NIH para establecer un nuevo institu­
to con respaldo comercial, el Institute of Genome Research, adoptó una
conducta fabril para la secuenciación de EST y reunió en poco tiempo el
m ayor banco de datos sobre genes humanos del mundo. En abril de
1994 la compañía farmacéutica SmithKIine Beecham invirtió 80 millones
de libras esterlinas para un interés exclusivo en la base de datos de Ven­
ter y anunció a los científicos que sólo podrían tener acceso a él si acep­
taban conceder los primeros derechos a cualquier descubrimiento
patentable. Una vez más, la posibilidad de una corporación que intenta­
ba monopolizar el control de una gran parte del genoma humano expre­
sado alarmó a la comunidad científica. Muchos pensaron que podría
solicitarse la patente después de identificar la función de un gen, pero no
antes. Se otorgaron miles de patentes por secuencias de DNA humano
en las que la secuencia se vinculó con alguna característica funcional
EST de una RNT 3’ amplifican con frecuencia la secuencia espe­
cífica en una muestra de DNA genóm icó). Más adelante se extendió
la secuenciación a los extremos 5' de clonas de cDNA y por último
se obtuvieron secuencias de los extremos de cientos de miles de clo­
nas de cDNA humanas.
Después de obtener un gran número de EST humanos (por
grupos de investigación privados y patrocinados con medios públi­
cos), la labor siguiente fue comenzar a colocarlos en mapas físicos
del genoma humano. Esto incluyó la tipificación de contiguos de
YAC para la presencia de EST individuales o la selección de grupos
de h íb rid o s p o r ra d ia ció n de ser humano-criceto (véase sección
8.3.2 y asimismo recuadro 8-4 para la descripción del principio de
híbridos por radiación). Con anterioridad se había obtenido me-
(véase Thomas y cois., 1996), pero en octubre de 1998 la oficina esta­
dounidense de patentes concedió la primera patente para una secuen­
cia de EST (a Incyte Pharmaceuticals). Como lo describió Knoppers
(1999), el problema de la patentabllídad del genoma humano aún es un
problema.
Tensiones entre los sectores público y privado: secuenciación del
genoma
También existen controversias acerca de la secuenciación del genoma
patrocinado en form a privada. Los esfuerzos de secuenciación del geno­
ma humano y de ratón por Celera se establecieron en una competencia
intensa con los proyectos patrocinados de forma pública fundados mu­
cho antes. De manera audaz, Celera afirmó en 1999 que su técnica de
escopetazo del genoma completo (véase texto y fig. 8-3) podría produ­
cir un bosquejo de la secuencia del genoma humano en dos años, lo cual
superaba la medida más lenta de mapeo y secuenciación clona por clo­
na del PGH patrocinado con recursos públicos.
Asi, se publicaron de modo simultáneo los informes del PGH y Celera y
ello anunció el logro de esquemas de secuencias del genoma humano
(International Human Genome Sequencíng Consortium, 2001; Venter y
cois., 2001). Sin embargo, nunca fue una carrera igual, porque en todas
las etapas Celera declinó poner a disponibilidad con facilidad y libertad
sus datos (se negó el acceso externo a su inform ación e incluso cuan­
do se terminaron exigió elevados cargos por suscripción y los datos no
dejaron de ser restringidos). En sorprendente contraste, los laboratorios
patrocinados de form a pública se habían comprometido a poner a dis­
posición de inmediato y ampliamente la nueva inform ación sobre se­
cuencias (con actualizaciones cada 24 horas en internet).
Al igual que cualquiera otro, Celera tuvo acceso continuo y libre a los da­
tos de secuenciación del DNA que provenían del PGH público y, de mane­
ra desvergonzada, capturó bloques muy considerables de los datos de
secuencia del genoma humano disponibles, los reprocesó y alimentó los
datos resultantes en su recopilación personal. Como resultado, el esfuer­
zo de secuenciación de Celera parasltó en extensa medida los datos públi­
cos generados. Sí se toma en cuenta que la técnica de Celera se basaba
en el método de escopetazo del genoma completo más difícil, se suscitó
un enorme escepticismo en cuanto a que la secuencia del genoma huma­
no publicada por Venter y colegas (2001) fuera en alguna forma una vin­
dicación de la técnica de escopetazo del genoma completo. En cambio,
Waterston y colaboradores (2002) proporcionaron datos que indicaban
que la secuencia de Celera publicada por Venter y colegas (2001) no era
una secuencia independíente del genoma humano en lo absoluto (ya que
gran parte de los datos sobre secuencia de Celera resultó de la captura y
reempacamiento de grandes cantidades de la secuencia del proyecto del
genoma humano [PGH]).
diante estudios de hibridación una distribución cromosomica ge­
neral de los genes humanos (fig. 8-4), pero la colocación de un gran
número de EST en mapas físicos fue el primer método sistemático
para construir un mapa gènico humano.
El dato del mapeo se integró en relación con el mapa genético
humano y luego se cruzó para referencia con mapas de bandas ci-
togenéticas de los cromosomas. Con el fin de definir un grupo
d e genes no redundante, se intentó integrar información del ma­
peo en los diferentes EST, como en el caso del sistema UniGen
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/). Schuler y colaboradores
(1996) y Deloukas y colegas (1998) editaron los primeros mapas de
genes humanos razonablemente amplios. En el último caso se pu­
blicaron posiciones en el mapa de lo que se estimaba (de manera in-
 8.3 CÓMO SE iMAPEÓ Y SECUENCIÓ EL GENOMA HUMANO 221

correcta) que eran 30 000 genes humanos y en esa época se pensa­

ba que representaban un poco menos de la mitad del total del catá­
logo de genes humanos. Sin embargo, la secuenciación del genoma
humano proporcionó una sorpresa inesperada (véase sección si­
guiente).

8.3.5 El esquema de la secuencia del genoma humano

sugirió 30 000 a 35 000 genes humanos, pero es
difícil estimar un total preciso
Antes de secuenciarse el genoma humano, las predicciones sobre el
número total de genes humanos (basadas en extrapolaciones de una
diversidad de grupos de datos limitados) oscilaban entre 60 000 y
100 000 genes. Después de publicarse en el año 2001 los esquemas 6 7 8 9 10 11 12
de secuencias, la estimación revisada arrojó una cifra sorprendente
por baja, tal vez sólo cercana a 30 000 a 35 000 genes. Con apenas
50% más genes que C. elegans, un gusano largo de 1 mm que sólo
tiene 959 células somáticas, se había infligido otro golpe al orgullo
humano, tal vez incluso más contundente que la p a r a d o ja d e l va ­ 13 14 15 16 17 18
lo r Cestablecida desde hacía mucho tiempo (el contenido de DNA
celular no siempre se relaciona con la complejidad funcional; algu­
nos tipos de amebas tienen en notable proporción más DNA por
célula que el hombre; véase cuadro 3-1).
19 20 21 22
Dificultades en el establecimiento del número preciso
de genes humanos
Aun en el año 2003, después de secuenciar en esencia todo el ge­
Fig. 8-4. Mapa inicial de la distribución de genes humanos
noma humano, todavía no se conocía con seguridad el número de
de la totalidad del genoma.
genes del hombre, aunque las estimaciones más recientes (Ensembl
build 29) sugieren un total cercano a 30 000 o tal vez incluso me­ Casi todos los genes humanos se vinculan con islotes CpG (véase re­
nor de esa cifra (véase las comparaciones de ser humano-ratón en cuadro 9-3). Se marcó una fracción de un islote CpG humano purifica­
el artículo del M ouse Genome Sequencing Consortium, 2002). Con do con un colorante rojo Texas y se híbrido en cromosomas humanos
objeto de comprender la dificultad para estimar el número preci­ en metafase (Craig y Bickmore, 1994). Las reglones cromosómicas de
so de genes, es instructivo considerar cómo se definen los genes. replicación tardía (en especial inactivas en sentido transcripcional) se
Tal y como se detalla en la sección 7.2, sólo existen dos criterios muestran en verde (como resultado de la incorporación de bromodeso-
específicos de genes esenciales: transcripción a RNA y prueba de xiurldina [BrdU] marcada con isotocianato de fluoresceina). Las regio­
secuencias conservadas durante la evolución. Sin embargo, identi­ nes amarillas (superposición de señales roja y verde) indican regiones
ficar por medios experimentales todos los genes con base en cual­ de replicación tardía abundantes en genes (o, estrictamente, islotes
quiera de estos criterios es muy difícil a nivel práctico por las CpG). Las reglones del genoma de replicación temprana con pocos ge­
siguientes razones: nes son invisibles (ya que no se contratiñen), al igual que ios centró-
meros (en los que no tiene acceso el anti-BrdU). En ciertos
► aunque muchas veces la investigación de secuencias de transcri­
cromosomas (p. ej., cromosoma 22) se encuentra una cantidad génica
tos relacionados suele ser compensadora (Camargo y cois.,
abundante (que se muestra con el color rojo de la fracción del islote
2002), es posible que en las genotecas de cDNA disponibles no
CpG marcada), en tanto que otros (p. ej., cromosomas 4 ,1 8 , X, Y) tie­
se interpreten bien los genes que se expresan en valores muy
nen muy pocos genes. Adaptado de Craig y Bickmore, Nature Genet.
bajos, que tienen localizaciones celulares y etapas de desarrollo
1994;7:376-381, fig. 1, con autorización de Nature Publishing Group.
infrecuentes, o ambas cosas;
► puede ser difícil identificar los genes que codifican RNA no
traducidos cuando no existe un marco de lectura abierto valo- ► in vestigación d e h om ología con tra bases d e d atos d e secu en ­
rable. cia. Para cualquier secuencia de prueba puede compararse la
Como resultado de lo anterior, a menudo se pasan por alto genes si compatibilidad de la secuencia de nucleótidos con todas las se­
se utilizan sólo métodos experimentales; así, cuando se publicó el cuencias de nucleótidos en bases de datos disponibles y tal vez
esquema de las secuencias del genoma humano había un apoyo ex­ pueden equipararse secuencias de polipéptidos traducidas contra
perimental tal vez para sólo 11 000 genes; los otros se predijeron todas las secuencias de proteínas conocidas (véase cuadro 8-2 y
mediante computadoras (a n á lisis in silico). Los programas basa­ recuadro 7-3). A medida que se añaden más y más secuencias a
dos en computadoras usados para identificar genes (Zhang, 2002) las bases de datos de secuencias, se constituyen en un medio en
comparan una secuencia de prueba con otras secuencias génicas co­ particular eficaz para identificar secuencias que se conservaron
nocidas (selección de homología) e intentan identificar exones durante la evolución, lo que representa una indicación de man­
(programas de predicción de exón): tenimiento de la función;
222 CAPÍTULO OCHO ! PROYECTOS DEL GENOMA Y ORGANISMOS MODELOS

Cuadro 8-2. Principales bases de datos electrónicas que sirven como depósitos de secuencias de nucleótidos o proteínas.
Tipo de base de datos Base de datos Localización URL
SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS GenBank Conservada por el U.S. National Center for Biotechnology http://www.ncbi.nlm.nih.gov
Information (NCBI) en U.S. National Institutes of Health
(NIH)

EMBL Conservada por el European Bioinformatics Institute (EBI) http://www.ebi.ac.uk

en Hlnxton, cerca de Cambridge, Reino Unido

DDBJ Conservada por el National Institute of Genetics, Japón, en http://www.ddbj.nig.ac.jp/

Mishima, Shizouka

SECUENCIA DE PROTEÍNAS SWISSPROT Secuencias de proteínas con anotación de alta calidad. http://ca.expasy.org/sprot/
Conservada en colaboración conjunta en el Swiss Institute http://www.ebi.ac.uk/swissprot/
of Bioinformatics, Ginebra, y el European Bioinformatics
Institute (EBI), Hinxton, Reino Unidos

TREMBL Traducciones de secuencias de codificación de la base de http://www.ebi.ac.uk/trembl/

datos EMBL no depositadas aún en Swiss-Prot http://ca.expasy.org/sprot/

PIR Conservada en colaboración conjunta por U.S. National Bio­ http://pir.georgetown.edu/

medical Research Foundation (NBRF), Georgetown; Japan http://www.ddbj.nig.ac.jp/
International Protein Information Database, en Japón (Jl- http://mips.gsf.de/
PID); y Munich Information Center for Protein Sequences http://www.hgm p.m rc.ac.uk/
(MIPS). Disponible en muchos sitios a nivel mundial.

► p rogra m a s d e p r ed icció n d e exón. En algunos programas sólo
se emplea información sobre la secuencia informada, como el
difundido programa GENSCAN (véase Burge y Karlin, 1997).
Otros usan como referencia la selección basada en homología
conservadora. Sin embargo, hasta la fecha incluso el mejor de
estos programas, como GENSCAN, sólo ha resultado modera­
damente satisfactorio para reconocer exones cuando se compa­
ra con genes cuyas organizaciones exónicas estaban establecidas
con anterioridad. Las comparaciones cruzadas por especies su­
ministraron otro medio importante para identificar exones, ya
que a diferencia de la mayor parte de las secuencias del genoma,
los exones tienden a conservarse bien durante la evolución (véa­
se p. ej., Batzoglou y cois., 2000);
► progra m a s d e com p u ta dora in tegrados p a ra en co n tra r genes.
Se han diseñado varios programas de computadora que usan ba­
ses de datos basados en homología de secuencia general junto con
programas ideados para identificar elementos y exones relaciona­
dos con genes. Por lo general se producen en la forma de gráficas.
Los programas comunes son N1X (http://www.hgmp.mrc.ac.uk/
Registered/Webapp/nix/; véase fig. 8-6 para el rendimiento de
este programa) y G enotator (véase http://www.fruitfly.org/"nomi/
genotator/genotator-paper.html).
A pesar del valor de las predicciones de genes y exones basadas en
computadora, aún existen problemas en la estimación del número
de genes humanos, que incluyen predicciones mayores y menores.
Por ejemplo, puede ocurrir una predicción mayor cuando grupos de
genes al parecer separados son en verdad diferentes partes de un so­
lo gen muy grande, o efecto de artefactos de cDNA (por la forma en
que se elaboran las genotecas de cDNA, algunos cDNA no empal­
mados en apariencia son artefactos consecutivos al cebamiento de
cadenas complementarias por vías oligo(dA) en DNA genómico).
La predicción m enor suele ocurrir por la dificultad para encontrar ge­
nes con exones muy pequeños y expresión restringida y hallar y con­
firmar genes que codifican RNA no traducido.
8.3.6 Etapas finales del Proyecto del Genoma Humano:
anotación de genes y ontología génica
A medida que la secuenciación del genoma humano llegaba a la fase fi­
nal, se dedicaron grandes esfuerzos al desarrollo de nuevos programas
de computadora que permitieran buscar información en las cantidades
enormes del genoma humano en una forma sistemática y fácil de uti­
lizar. El diseño inteligente de buscadores de genoma como E nsem bl
(desarrollado en colaboración entre el Wellcome Trust Sanger Ins-
titute y el European Bioinformatics Institute) proporciona interfáses
gráficas para seleccionar información del genoma de cromosomas
individuales y regiones subcromosómicas. Quienes lo usan pueden na­
vegar con rapidez en la secuencia de un cromosoma humano seleccio­
nado, pasar de una gran escala a la escala de nucleótidos e identificar
genes y exones, RNA y proteínas vinculadas. Un elemento central de
la navegación son las herramientas de cambios (click-over) que hacen
posible una miríada de conexiones con otras bases de datos y progra­
mas (incluidos los enlaces directos a otras secuencias del genoma en­
sambladas, en especial el genoma de ratón) y que permite a quienes
lo emplean avanzar a través de una información solicitada (véase
http://www.ensembl.org/ y fig. 8-5). Conforme se desarrolla cada vez
más información sobre genes y otras unidades funcionales, se dispone
de una anotación génica más informativa y precisa, en actualizacio­
nes frecuentes y periódicas de los buscadores generales del genoma.
Otro adelanto importante es la ontología génica, en la que se de­
sarrollan vocabularios sistemáticos y jerárquicos a fin de definir la fun­
ción de los genes. El Gene Ontology (GO) Consortium incluyó la
colaboración entre investigaciones que estudian genomas humanos y
otros para desarrollar un sistema común de definición de la función
génica que pueda aplicarse a todos los organismos (Gene Ontology
Consortium, 2000, 2001; véase asimismo http://www.geneontology.
org/). El uso de un vocabulario común posibilitará investigar a través
de múltiples proteínas y especies para características comunes. El Ge­
ne Ontology Consortium desarrolló tres ontologías separadas -proceso
biológico, com ponente celular y fu n ción molecular—para describir los
 8.3 CÓMO SE MAPEÓ Y SECUENCIÓ EL GENOMA HUMANO 223

CronsoM 3 i l,.,i ..1 . ~ H iíT K Z ir ir ~ ~ ~

Banda del g27.1

croraosoüia 3 1
17!. « 11b 181. «3 Hb

(cont iguoos)
flarcadores
D3S34I2 D3S247Í C3S43Í8 D3S1MÍ
SFNl^eí 0K3111
D3S3423
Genes
l «W K 7t HBEUB l HCCCÍ ll » l« « 4 2 L53ÍNT5 LKLHL6
l ftTPli6
genes I GENES EHSftlBL PREDICHOS (CONOCIDOS! I GENES ENSfitIBL PREDICHOS (NUEUOS)

179.48 Hb 179.49 Hb 179.50 Hb 179.51 Hb 179.52 Hb 179.53 Hb 179.54 Hb 179.55 Hb 179.56 Hb 179.57 Hb
Longitud ■*»----------------------------------------------- 108. 00 Kb-----------------------------------------------«

NCBI Niiwro ife caradtarfat ia*s efe TOSÍ m m ia región

Secuencias de referencia »'*m > de ceroRtíPÍstiraB <te en esta regtán
□ Coepat ibi i idades de ratón
0 Unigén a
0 Proteínas i
Inuestigoción de gen

OHíi (contiguos)

Effisaiüb! transcrito

ilSE transcrito

Inuestigoción de gen

0 Proteínas

B Unigen

T~TT
□ mRHfi husionos liz z ili
ZZZ1ZO
X X ~r— t~ z rz x i
Secuencias de referencia
NCBI
179.48 Hb 179.49 Hb 179.50 Hb 179.51 Mb 179.52 Hb 179.53 Hb 179.54 Hb 179.55 Hb 179.56 Hb 179.57 Hb

Uía tile
WmmKBBmmBm PN>li-484H&

Leyenda de gene3
I GEHES EHSflTfflL PREDICHUS (NUEUOS)

Fig. 8-5. Las interfases gráficas en la búsqueda general de Ensembl genome permiten navegar con facilidad a través de cromosomas individuales
en secuencias genómicas ensambladas.
La búsqueda general de Ensembl genome (http://www.ensembl.org) se desarrolló por una colaboración entre el Wellcome Trust Sanger Institute y el Eu-
ropean Bioinformatics Institute y permite una búsqueda general por cromosoma para varias secuencias genómicas ensambladas, Incluidas la humana y
la del ratón. Después de seleccionar de forma inicial el cromosoma 3 humano, se eligió una región subcromosómlca que abarcaba el borde 3q26.33-
3q27.1 mediante clicks en un ideograma de cromosómico (que se muestra con el cuadro rojo abierto en el dibujo de la parte superior). Se muestra la
reglón seleccionada expandida, en el dibujo de la parte media, definida como la región de 1 Mb de 179.03 a 180.03 Mb. El cuadro rojo abierto en el di­
bujo de la parte media es un segmento de 100 kb (179.48 a 179.58 Mb) y se muestra en una imagen aumentada en el dibujo de la parte inferior, que
¡lustra gen, exón, RNA, estructura proteínica, etcétera.
224 CAPÍTULO OCHO PROYECTOS DEL GENOMA Y ORGANISMOS MODELOS

productos génicos y ello permite la anotación de propiedades mole­
culares a través de especies. Cada vocabulario está estructurado como
gráficas acíclicas dirigidas, en las que cualquier término puede tener
más de un parentesco o ninguno, uno o más descendientes. Esto en­
riquece mucho más los intentos para describir la biología de lo que
sería posible con una gráfica jerárquica. En la actualidad, el vocabu­
lario de la GO posee más de 11 000 términos que con el tiempo ten­
drán, todos, definiciones estrictas para su uso.
8.3.7 Son importantes los análisis de la variación de
secuencias del genoma humano para la
investigación antropológica y médica
► an á lisis fo ren se. La precisión de las pruebas basadas en DNA
que se llevan a cabo para identificar personas o confirmar rela­
ciones biológicas cercanas ( p e r fil d e DNA) depende, en parte,
del conocimiento de la forma en que varían los marcadores
diagnósticos de DNA de una población a la siguiente.
► in vestiga ció n m édica. Las enfermedades comunes son multi-
factoriales y puede ser frustrante y difícil identificar los genes
subyacentes (véase cap. 15). En fecha reciente se consagró un
esfuerzo enorme a la identificación de variantes genéticas que
pueden explicar diferencias entre poblaciones humanas respec­
to de la mayor susceptibilidad a anomalías particulares o, de
hecho, la resistencia comparativa a ciertas afecciones.

Al inicio, el Proyecto del Genoma Humano se concibió para obte­

ner la secuencia de nucleótidos de un conjunto de fragmentos de
DNA humano clonados que llegaba en total a uno o unos cuantos
genomas haploides. Lo que no consideró fue la diversidad genética
de los seres humanos. De modo subsecuente, se consideró conve­
niente la información sobre esta última en diferentes contextos:
► an tropología . La información debe ser útil en investigación an­
tropológica e histórica en el rastreo de los orígenes humanos,
movimientos de población prehistóricos y estructura social.
Proyecto de Diversidad del Genoma Humano
La idea de una esfuerzo global para el estudio de la diversidad de la
secuencia del genoma humano, el Proyecto de Diversidad del Ge­
noma Humano (HGDP, por sus siglas en inglés) lo propusieron
Cavalli-Sforza y colaboradores (1991). El énfasis se dirigió de mane­
ra predominante a la necesidad de reunir muestras de DNA de un
gran número de grupos étnicos. Sin embargo, aunque apoyado por
HUGO, este proyecto ha tenido enormes dificultades (véase Greely,

GRAIL/Prom
TSSW /Promotor
GENSCAN/Prom
Fex I I!
Hexon I I ü
MZEF I I
Genemark I I 1
GRAIL 4-4 - -H h
G enefl rider
Gen F
GENSCAN
G enes F i l I -M
Gen HMM 4 -t-
BLAST/trembl i i g— m - -M -
-4—1— 1- -H -

Ü4-
GENSCAN/p o i i a d e n i la c ¡ 6 n
G enes F /p o i i a d e n i la c ión
GRflIL /p o I i a d e n i Iac ión
I 1 I fi
BLAST/ecolí
BLA ST/vector
ílasker reP*t I I I ■■ I I I ■ I
E x p lo r a c ió n de tRNR-SE

Fig. 8-6. Hallazgo de genes mediante análisis de secuencias genómicas basado en computadora.

Este ejemplo muestra el análisis NIX (véase texto) de una secuencia CAP de una región del cromosoma 12q24.1 que incluye el locus de la enfermedad
de Darier. El tamaño de nucleótido de la región se ilustra con la barra en la parte inferior. El análisis incluye el uso de programas para buscar elementos
relacionados con genes como secuencias promotoras (triángulos verdes invertidos en la parte superior), sitios de poliadenilación (triángulos invertidos
de color ocre) y diversos programas de predicción de exón (GRAIL, GENSCAN, etc.). Las homologías importantes con otras secuencias a niveles de nu­
cleótidos y proteínas se indican con los cuadros para los diversos programas B LA S ! Datos proporcionados por Víctor Ruiz-Perez y Simón Cárter, Uni-
versity of Newcastle upon Tyne, UK.
 8.4 1 PROYECTOS DE GENOMAS PARA ORGANISMOS MODELOS
2001). Desde el inicio estuvo acosado por una falta conspicua de pa­
trocinio. Mientras que el principal objetivo de este proyecto fue tan
sólo reconocer marcadores para grupos étnicos y seguir los orígenes
de la migración y los linajes ancestrales humanos, no fue tan persua­
sivo el caso para obtener fondos a gran escala.
El HDGP también ha estado perseguido por controversias.
En algunos casos, los investigadores visitaron poblaciones huma­
nas aisladas en los límites de la supervivencia, obtuvieron mues­
tras con rapidez sin tomar tiempo para explicar su importancia y
a continuación las dejaron sin comunicación ulterior, o muy po­
ca. Si bien quienes lo proponen se refieren a la necesidad de sal­
vaguardar la herencia cultural del hombre, los críticos suelen
utilizar de manera agotadora términos como gen ética d e helicóp­
tero para referirse a la conducta insensible de entrada rápida y sa­
lida rápida practicada con frecuencia para obtener muestras.
Mapas de polimorfismo de nucleótido único (SNP)
Si bien los marcadores microsatélites muy polimórficos están distri­
buidos en la totalidad del genoma, no son susceptibles en particular
de tipificación automatizada y sólo ocurren alrededor de una vez ca­
da 30 kb. Los p o lim o rfism o s d e n u cleó tid o ú n ico (SNP) no son
muy polimórficos (de forma característica sólo dos alelos), pero pue­
den tipificarse con facilidad mediante automatización y ocurren con
mucha frecuencia en el genoma, en promedio alrededor de una vez
cada kilobase en el genoma humano (véase sección 7.1.3 y recuadro
18-2 para la descripción de la forma en que se tipifican). Como re­
sultado, los mapas de SNP humanos encontraron aplicaciones im­
portantes en la elaboración de mapas genéticos, incluso de más alta
resolución que eran necesarios para investigar regiones cromosómi-
cas que se esperaba que incluyeran genes de enfermedades comunes.
En 1999 se inauguró el In tern a tio n a l SNP C onsortium L td
como una sociedad no lucrativa entre Wellcome Trust y alrededor de
una docena de compañías privadas, sobre todo farmacéuticas. En el
transcurso de dos años proporcionó un mapa de SNP humano con
un total de 1.42 millones de SNP, que equivalen aproximadamen­
te a un SNP cada dos kilobases (Grupo Internacional de Trabajo
del Mapa de SNP, 2001). En la actualidad se llevan a cabo grandes
esfuerzos a fin de mapear genes para enfermedades comunes me­
diante mapas de SNP de alta densidad y se ha concedido asimismo
un interés comercial a las aplicaciones fa rm a co gen ó m ica s.
8.3.8 Sin las salvaguardas apropiadas, el Proyecto
del Genoma Humano podría conducir
a la discriminación contra portadores de genes
de enfermedades y también al resurgimiento
de la eugénica
Cualquier adelanto científico importante conlleva el temor de la ex­
plotación. El PGH no es la excepción y los beneficios percibidos del
proyecto también tienen su lado oscuro. Cuando se conozcan todos
los genes humanos y pueda detectarse una gran cantidad de mutacio­
nes que se acompañen de una enfermedad, se obtendrá un enorme
beneficio para dirigir la prevención de anormalidades a los individuos
con genes de la afección demostrados. Pese a ello, podría usarse la
misma información para discriminar a esas personas. Por ejemplo,
existe la genuina y difundida preocupación de que las compañías de
seguros pudieran exigir pruebas de selección genética a gran escala
para la presencia de genes que confieren susceptibilidad a trastornos
comunes, como diabetes, afecciones cardiovasculares, cánceres y va­
225
rios trastornos mentales. En consecuencia, a las personas por comple­
to sanas pero portadores de estos alelos adjuntos de enfermedad po­
dría negárseles los seguros de vida o médicos. Por supuesto, esta
discriminación sólo se llevaría a cabo a pequeña escala por el momen­
to; un hecho que es alarmante para muchos es la posibilidad de
discriminación de un porcentaje muy grande de personas en la so­
ciedad. Asimismo, es esencial preservar el derecho de las personas a
no saber. Un principio ético fundamental en todas la asesoría y las
pruebas genéticas es que la información genética sólo debe generarse
en respuesta a una solicitud explícita de un paciente adulto del todo
informado.
Otra área problemática es el aspecto del determinismo biológi­
co y si el conocimiento amplio de los genes humanos fomentaría
una revisión de la eugénica, esto es, la aplicación del apareamiento
selectivo u otras técnicas genéticas a fin de “mejorar” las calidades
humanas (Garver y Garver, 1994). En años pretéritos, los movi­
mientos eugénicos negativos en algunos países (incluidos Estados
Unidos y Alemania) discriminaron a individuos que se juzgaban in­
feriores en alguna forma y se los forzó a esterilizarse. Existe de igual
modo la preocupación con la m ejo ría g e n é tica a fin de seleccionar
de manera positiva cualidades hereditarias que se juzgan conve­
nientes (véase Etica en el recuadro 3 del cap. 21). En reconocimien­
to de los problemas anteriores, el U.S. Human Genome Project
(Proyecto del Genoma Humano Estadounidense) dedicó grandes
recursos para apoyar proyectos de investigación sobre los efectos
ético, legal y social (véase, p. ej., http://www.nhgri.nih.gov/ELSI).
8.4 Proyectos de genom as para
organism os m odelos
El mapeo del genoma humano no fue el único enfoque científico del
Proyecto del Genoma Humano; desde un principio se reconoció con
claridad el valor de secuenciar los genomas de cinco organismos mo­
delos fundamentales y desde entonces la lista se tornó sustancial.
Incluye una amplia variedad de microorganismos microbianos
unicelulares y asimismo varios microorganismos modelos multicelula­
res, muchos de ellos en particular adecuados para análisis genético. En
parte, la secuenciación de genomas más pequeños se considera también
como piloto para la secuenciación a gran escala del genoma humano.
Alrededor de mayo de 2003 estaban terminados los genomas de más
de 140 microorganismos (o casi concluidos; véase http://wit.integra-
tedgenomics.com/GOLD/; http://www2.ebi.ac.uk/genomes/).
8.4.1 Existe una enorme diversidad de proyectos
de genoma procariotas
Diversidad de proyectos de secuenciación
del genoma procariota
Desde hace mucho tiempo se estableció una diversidad de modelos
procariotas (véase recuadro 8-7). De manera característica, los ge­
nomas procariotas son pequeños (con frecuencia sólo una o unas
cuantas megabases) y en especial factibles de una secuenciación
comparativamente rápida, que dio por resultado el pronto desarro­
llo de muchos proyectos de genoma procariota. Alrededor de ma­
yo de 2003 se habían secuenciado ya los genomas de un total de
122 procariotas diferentes (16 archaea y 106 bacterias) y se encon­
traban en curso los de otros 342 (23 archaea, 319 bacterianos) (véa­
se, asimismo, Doolittle, 2002).
226 CAPÍTULO OCHO PROYECTOS DEL GENOMA Y ORGANISMOS MODELOS
El primer genoma procariota terminado (en 1995) fue el geno­
ma de H aem ophilus in flu en z a e de 1.83 Mb. Fue un hecho sobre­
saliente: la primera vez que se secuenciaba el genoma de un
organismo que vive con libertad (véase Tang y cois., 1997). Más ade­
lante se logró una diversidad de otros primeros', el genoma de la en­
tidad autónoma autorreplicante más pequeña (M ycoplasm a genitaliu m
en 1995), el primer genoma archaeal (M eth a n ococcu s ja n n a sch ii en
1996) y a continuación el logro relevante de la secuencia completa del
genoma de E. c o li de 4.6 Mb (véase Pennisi, 1997).
La lista de organismos procariotas cuyos genomas ya se secuen-
ciaron muestra diferentes prioridades. En algunos casos, el impul­
so se centró en comprender las relaciones evolutivas entre diferentes
microorganismos, como en los genomas de archaea (véase Olsen y
Woese, 1997) y en Mycoplasma genitalium en comprender lo que
constituye un genom a mínimo, que es el genoma celular más peque­
ño conocido (que en la actualidad se sabe que sólo tiene 470 ge­
nes). En otros casos, como en E. coli y Bacillus subtilis, la prioridad
fue tan sólo una investigación básica más amplia sobre microorga­
nismos experimentales comunes. Para muchos investigadores el
premio mayor ha sido E. coli, la bacteria estudiada de modo más in­
tenso. Como hecho sorprendente, si se toma en cuenta la enorme
cantidad de investigación previa, casi el 40% de los 4 288 genes
identificados de manera inicial no tenía función conocida y se
constituyeron en el objeto de una investigación intensiva. Sin em­
bargo, para muchos otros microorganismos, la principal motiva­
ción para secuenciar el genoma es su trascendencia médica.
Proyectos del genoma procariota relacionado
con enfermedades
En algunos casos se eligieron procariotas para la secuenciación del
genoma por sus vínculos conocidos con enfermedades crónicas
(véase Danesh y cois., 1997) o porque se sabía que eran agentes cau­
sales de enfermedad (véase cuadro 8-3). Además de obtener un co­
nocimiento más completo de estos microorganismos, cabe esperar
que la nueva información conduzca a medios diagnósticos más sen­
sibles y nuevos objetivos para establecer fármacos/vacunas.
8.4.2 El proyecto del genoma de S. cerevisiae fue el
primero de muchos proyectos de genomas
protistas exitosos
Los p ro tista s son eucariotas unicelulares, un término que incluye a
animales unicelulares (p rotoz oa rios), hongos celulares y plantas
unicelulares. Se efectuó una diversidad de proyectos del genoma
protista, en algunos casos por la necesidad de comprender microor­
ganismos modelos básicos y en otros como medio para combatir
una anomalía causada por protozoarios patógenos.
Proyecto del genoma de Saccharomyces cerevisiae
La levadura con gemación S acch a rom yces cer ev isia e es un hongo
unicelular y desde hace mucho tiempo es un microorganismo mode­
lo eucariota favorito, en parte porque es muy susceptible al análisis
genético (recuadro 8-7). Consorcios europeos y estadounidenses se-
cuenciaron sus 16 cromosomas y Goffeau y colegas (1996) publica­
ron la secuencia completa. Esto representó otro acontecimiento
importante en biología: la primera secuencia completa de una célula
eucariota. Los datos indican que los genes de levadura están agrupa­
dos de forma estrecha y espaciados en promedio una vez cada 2 kb.
De los 6 340 genes, alrededor del 7% especifica RNA no traducido.
Aunque es uno de los organismos estudiados de manera más inten­
sa, 60% de sus genes no tenía una función determinada por medios
experimentales cuando se publicó por primera vez la secuencia. No
obstante, fue factible demostrar que una fracción valorable de los ge­
nes de levadura posee un homólogo mamífero identificable y por
consiguiente sólo en alrededor del 25% de los genes de la levadura
no hubo indicio alguno sobre su función (Botstein y cois., 1997). La
conclusión satisfactoria de este proyecto dio paso en la actualidad a
análisis funcionales a gran escala (véase cap. 19).
Proyecto del genoma de Schizosaccharomyces pombe
La levadura de fisión es otro hongo unicelular que desde hace mu­
cho tiempo se ha convertido en un microorganismo modelo prefe­
rido (véase recuadro 8-7). Wood y colaboradores (2002) publicaron
la secuencia completa de 13.8 Mb y reveló un total de 4 824 genes
que codifican proteínas. Los datos mostraron una gran diferencia
entre los genomas de S. cerevisiae y S. pombe, incluidos cientos de
genes que se encuentran en S. Pombe, pero al parecer no en S. cere­
visiae y viceversa, diferencias en el número de intrones (4 700 en S.
pom be comparados con sólo 275 en S. cerevisiae) y elementos trans-
ponibles (muy pocos en S. pom be cuando se comparan con S. cere­
visiae), etcétera.
Proyecto del genoma de Plasmodium falciparum
El informe de Gardner y colaboradores (2002) de la secuenciación
del genoma de P falciparum fue otro acontecimiento de importan­
cia: era la primera vez que se secuenciaba el genoma de un parásito
eucariota. P. falciparum es el parásito mortífero del paludismo y la
publicación simultánea del genoma completo de su huésped, el
mosquito A nophelesgambiae (véase sección 8.4.4), ofrece una nue­
va dimensión en la batalla contra el paludismo, con frecuencia un
padecimiento mortal que causa la muerte de un millón de personas
cada año, sobre todo en el África subsahariana.
Otros proyectos de genomas de protistas
Los otros proyectos de genomas de protistas incluyen los del geno­
ma de varios protozoarios patógenos relacionados con infecciones
parasitarias en el hombre. En casi todos los casos, son sustanciales
los tamaños del genoma, de manera característica de 30 a 90 Mb
(véase cuadro 8-3). Además, se desarrollaron proyectos de genoma
para otros microorganismos bien estudiados y que son factibles de
análisis bioquímico/genético, incluidos los mohos A spergillus ni-
d u la n s y N eurospora crassa.
8.4.3 El proyecto del genoma de Caenorhabditis elegans
fue el primer proyecto de un genoma animal
terminado
Proyecto del genoma de Caenorhabditis elegans
Aunque es un organismo simple, sólo alrededor de 1 mm de largo,
C. elegans se ha considerado como un modelo importante del desa­
rrollo y también fue útil para modelar otros procesos relevantes pa­
ra las células humanas (véase recuadro 8 - 8 ). Debido al gran tamaño
de su genoma (casi 100 Mb), el proyecto del genoma de C. elegans
también se considera como el modelo piloto más importante para
 8.4 PROYECTOS DE GENOMAS PARA ORGANISMOS MODELOS
Una diversidad de organismos unicelulares es en particular adecuada pa­
ra análisis genéticos y bioquímicos y ofrece las relevantes ventajas de
tiempos de generación en extremo rápidos, facilidad de cultivo a gran es­
cala, etc. Aunque relacionados de modo muy distante con el hombre en
términos evolucionistas, tienen ventajas para estudiar múltiples factores
científicos y médicos. Los beneficios para genetistas humanos e investi­
gadores médicos incluyen nuevas informaciones sobre una extensa va­
riedad de áreas de investigación, algunas con aplicaciones médicas
claras, entre ellas las siguientes:
► Función génica y procesos celulares: durante la evolución se conser­
varon de manera extraordinaria muchas actividades celulares centra­
les de crucial im portancia. Es posible obtener información sobre la
forma en que funcionan los diversos genes de mamíferos y la natu­
raleza de los procesos celulares esenciales, como la biogénesis de
los ribosomas, el control del ciclo celular, el transporte a través de la
membrana, la función de polimerasa, etc., si se estudian genes y pro­
cesos equivalentes en organismos unicelulares;
► Patogenia: se sabe que muchos microorganismos unicelulares cau­
san enfermedades y durante años la medicina ha luchado con fre­
cuencia para encontrar fármacos u otros tratamientos eficaces
apropiados. Mediante la determinación de los genomas completos de
estos organismos patógenos y el estudio de la base molecular exac­
ta de la forma en que causan afección cabría esperar nuevas informa­
ciones sobre la manera de abordar a los m icroorganism os
patógenos;
► Evolución: los análisis de secuencia proporcionan el medio más útil
para comprender la forma en que los microorganismos se relacionan
entre sí. Por consiguiente, si bien el análisis de secuencias de rRNA
proporcionó el camino para establecer la división fundamental en tres
reinos de vida mayores: archaea, bacterias y eucariotas (recuadro
12-4), sin duda alguna la comparación completa de las secuencias
genómicas suministrará informaciones adicionales importantes; véa­
se también la figura 1 2 -22.
BACTERIAS
Desde hace mucho tiempo, una m ultiplicidad de bacterias, no patóge­
nas en condiciones normales, se toma com o modelo de m icroorganis­
mos, en especial Escherichia cotí en form a de bastón, que vive en el
intestino del hombre y otros vertebrados (es una relación simbiótica:
contribuye a sintetizar la vitam ina K y las vitaminas del complejo B que
el hombre absorbe). Gracias a los estudios intensivos durante décadas,
ha sido posible obtener más conocim ientos de E. co li que de cualquie­
ra otro tipo de célula y la m ayor parte del conocim iento sobre los me-
! canísm os fundamentales de la vida, incluidas la replicación, la
transcripción de DNA, la síntesis de proteínas, etc, proviene de estudios
de este m icroorganism o.
Además, por supuesto, diversas bacterias patógenas causan enferme­
dades de gravedad variable. Entre ellas se encuentran las cepas de E.
co li, que ocasionan infecciones en el hombre, incluidas meningitis, sep­
ticemia e infecciones de vías urinarias e intestinales. Un ejemplo notorio
es E. coli 0157:H7 que, com o resultado de la adquisición de una se­
cuencia particular de bacteriófago en años pretéritos, se m odificó de
modo genético para producir una toxina. En algunos casos, esta última
produce hemorragia intensa que puede ser m ortal en niños pequeños o
personas de edad avanzada; en otros pacientes suele provocar insufi­
ciencia renal. Se iniciaron diversos proyectos de genoma com o intento
para obtener las secuencias completas de microorganism os patógenos
(véase cuadro 8-3).
227
ARCHAEA
En la categoría Archaea se incluyen procariotas cuya form a semeja de
manera superficial a las bacterias, pero se diferencian de estas últimas
en una etapa muy temprana de la evolución. De modo inicial se encon­
traron en ambientes poco comunes, a menudo extremos: temperaturas
muy altas en aguas termales y cerca de grietas de respiraderos en ma­
res profundos, aguas con pH o salinidad extremos, lodazales de panta­
nos carentes de oxígeno, depósitos profundos de petróleo bajo la tierra
y el fondo de océanos. Sin embargo, en la actualidad se sabe que habi­
tan ambientes más familiares, como suelos y lagos, y se han encontra­
do en el tubo digestivo de vacas, termitas y vida marina en donde
producen metano.
Los sistemas m etabólicos y de conversión de energía de archaea son
similares a los de las bacterias, pero los sistemas utilizados para tratar
y procesar inform ación genética (replicación, transcripción, traducción
de DNA) se relacionan de modo más estrecho con los de eucariotas, en
comparación con sus correspondientes bacterianos. No se sabe que ar­
chaea se vincule con enfermedades y el principal interés en el estudio
de sus genomas radica en su posición como un reino muy separado de i
otras form as de vida; por consiguiente, la atención se centra en cono­
cer más sobre la form a en que evolucionaron para ser tan diferentes.
LEVADURAS (HONGOS UNICELULARES)
Las levaduras son hongos unicelulares y también eucariotas. Son com u­
nes en hojas y flores de plantas, suelo y agua salada y asimismo se en­
cuentran en la superficie de la piel y el intestino de animales de sangre
callente, en donde pueden vivir de form a simbiótica o com o parásitos. De
manera característica, se replican por gemación en lugar de fisión bina­
ria: el citoplasma y el núcleo en división de la célula original se continúan :
al principio con la yema, o levadura hija, antes de depositarse la nueva
pared celular para separar a ambas.
Las levaduras han resultado valiosos m icroorganism os modelos por­
que se sabe que se conservó en sum o grado una diversidad de m olé­
culas fundamentales, desde las levaduras hasta los mamíferos. Como
hecho Im portante, se halló que las versiones humanas de varios ge­
nes del ciclo celular y reparación de DNA de levaduras participan de
form a directa en la división de células humanas. El mal funcionam ien­
to suele conducir a cáncer o defectos del nacim iento. La actividad ;
norm al de estos genes se estudia con m ayor facilidad en células de
levaduras, que se manipulan en el laboratorio. Esto proporciona infor- j
maciones de im portancia sobre sus m ecanism os en seres humanos,
que ayudan a realizar experimentos directos en tipos de células más
com plicadas. En consecuencia, el estudio del control de la división
celular en levaduras es esencial para la salud humana a fin
de com prender muchos trastornos clínicos. Por lo general, las levadu­
ras no causan enfermedades, pero algunas levaduras patógenas -e n
particular las especies C andida- constituyen un problem a de salud
común.
► Saccharomyces cerevisiae es una levadura de gemación que
desde hace mucho tiem po es im portante en la elaboración de pa­
nes y cerveza. Debido a que es simple y fácil de desarrollar, se tra­
ta de un organism o favorito para investigación básica y uno de los
eucariotas estudiados de manera más extensa. En parte por una al­
ta frecuencia de recom binación no hom ologa, ha sido muy recep­
tivo a análisis genéticos. Por lo regular se usa com o modelo para
estudiar varios aspectos de biología celular, incluidos el control del
ciclo de la célula, el transporte de proteínas y la regulación trans-
cripcional.
continúa en la página siguiente
228 CAPITOLO OCHO PROYECTOS DEL GENOMA Y ORGANISMOS MODELOS
Recuadro 8-7. (co n tin u ació n )
► Schizosaccharomyces pombe es una levadura de fisión y con un
tiempo de generación rápido (dos a cuatro horas). Sólo hasta fecha
más reciente se estudió bastante, en especial como un modelo del con­
trol (existe una fase G2 precisa del ciclo) y la diferenciación del ciclo
celular. Se relaciona de forma distante con S. cerevisiae y en algunos
aspectos de la estructura de los cromosomas y el procesamiento del
RNA se vincula de modo más próximo con eucariotas más altos que S.
cerevisiae.
► Candida albicans se encuentra de manera natural en la boca de per­
sonas sanas, pero puede causar irritación y en ocasiones infecciones
debilitantes en individuos cuyo sistema inmunitario no es tan activo
como el normal; provoca algodoncillo vaginal y bucal, exantema del
pañal y otras anomalías.
PROTOZOARIOS (ANIMALES UNICELULARES)
Los protozoarios son un grupo grande de animales unicelulares (no foto-
sintéticos) que incluyen amebas, flagelados y ciliados (que se desplazan
con la ayuda de seudópodos, flagelos y cilios, respectivamente) y otros
microorganismos con ciclos de vida complejos. Tienen interés para inves­
tigadores biomédicos como modelos de diversas facetas de la biología ce­
lular y del desarrollo y asimismo porque muchos son parásitos que causan
enfermedades. Los últimos pueden ser huéspedes de bacterias patógenas
(que ocasionan afecciones como la enfermedad de los legionarios, salmo-
nelosis, tuberculosis, y otras) o producen anormalidades directas:
► Entamoeba histolytica: una ameba parasitaria que provoca enferme­
dad gastrointestinal grave.
► Tripanosomas: parásitos flagelados que producen la fiebre tropical
conocida como enfermedad del sueño.
► Giardia: un parásito flagelado que causa diarrea grave.
► Plasmodium: provoca el paludismo.
► Toxoplasma: produce afecciones digestivas y daño de órganos in­
ternos.
Como modelos de biología celular y del desarrollo, el principal interés se
enfocó en Dictyostelium discoldeum, una llamada ameba social: aun-
la secuenciación a gran escala del genoma humano. El éxito del pro­
yecto del genoma lo consiguieron Wellcome Trust Sanger Institute y
la Washington University School of Medicine (Consorcio de Secuen­
ciación de C. elegans, 1999). Fue otro logro de trascendencia que
proporcionó por primera vez las instrucciones genéticas para un ani­
mal multicelular (m etaz oario).
En el proyecto del genoma de C. elegans se publicó de forma
inicial un total de casi 19 OOO genes que codifican polipéptidos y
más de 1 000 genes que codifican moléculas de RNA no traduci­
das, lo que proporcionó un espaciamiento promedio de un gen
cada 5 kb. Al parecer, ocurre un número sorprendentemente
grande de genes como parte de o p ero n es en los que se transcriben
genes individuales que forman parte de transcritos de RNA mul-
tigénicos grandes. A la fecha, tras la aparición del informe inicial,
la comparación con secuencias publicadas de alguna otra parte re­
veló que casi uno de cada tres de los genes de C. elegans recién
identificados mostraba similitudes con genes conocidos con ante­
rioridad y 12 000 de los genes que codifican polipéptidos no te­
nían una función conocida y casi todos eran genes predichos sin
confirmación experimental.
De los 19 000 genes que codifican polipéptidos publicados, só­
lo se dispone de prueba experimental de apoyo para tan sólo 9 000
que es típico su crecimiento en la forma de células separadas e indepen­
dientes, las células pueden interactuar para form ar estructuras multice­
lulares cuando se someten a condiciones adversas como la inanición.
Hasta 100 000 células producen señales entre sí al liberar el cAMP qui-
mioatrayente y se congregan unas y otras mediante quim iotaxis para fo r­
mar un montículo rodeado por una matriz extracelular. Este mecanismo
para generar un microorganismo multicelular difiere de form a radical de
los pasos iniciales de la embriogénesis de los metazoarios. Sin embar­
go, los procesos subsecuentes dependen de la comunicación intercelu­
lar tanto en Dictyostelium com o en metazoarios. Este microorganismo
es singular para estudios de citocinesis, motilldad, fagocitosis, quim io­
taxis, transducción de señales y aspectos del desarrollo, com o selección
celular, formación de patrón y determinación del tipo de célula. Muchas
de estas conductas y mecanismos bioquímicos celulares no existen o
son menos accesibles en otros organismos modelos.
Aún no se investigan los ciliados de manera tan extensa como las otras
clases de protozoarios. El único ciliado al que se concedió más atención
es Tetrahymena, un microorganism o de agua dulce que habita por lo ge­
neral en corrientes, lagos y estanques; en la actualidad se considera un
proyecto de genoma para Tetrahymena thermophila (véase Turkewitz y
cois., [2002]). Tetrahymena tiene células grandes (40 a 50 ^.m a lo largo
de su eje anteroposterior) y, al igual que otros ciliados, las células po­
seen una variedad notable de estructuras celulares muy complejas y es­
pecializadas. Como es típico de los ciliados, el aparato nuclear de
Tetrahymena está constituido por dos tipos de núcleos diferentes desde
el punto de vista estructural y funcional, un fenómeno que se conoce co­
mo dim orfism o nuclear. El m icronúdeo es la línea germen, es decir, al­
macena información genética para la progenie sexual. Es diploide y
contiene cinco pares de cromosomas. El macronúcleo (MAC) es el nú­
cleo somático, esto es, el núcleo se expresa de form a activa durante la
multiplicación vegetativa y no se transmite a la progenie sexual DNA de
MAC conocido. Tetrahymena es un modelo bien establecido para biolo­
gía celular y del desarrollo y el principal interés se relaciona con la m o­
tilldad de células redondas, los reordenamientos de DNA programados
por el desarrollo, la secreción regulada, la fagocitosis y la conservación
y función del telómero.
J
casos; los casi 10 000 genes predichos restantes sólo se identifica­
ron mediante análisis de secuencia basados en computadora. Aná­
lisis subsecuentes para estudiar estos genes en busca de pruebas de
transcritos de RNA correspondientes sugirieron que cuando menos
80% de los genes predichos por computadora era auténtico, lo que
llevó a Reboul y colegas (2001) a concluir que C. elegans tiene
cuando menos 17 300 genes. En la actualidad se realizan grandes
esfuerzos para investigar la función específica de genes y programas
de mutagénesis química a gran escala que intentan producir un
gran número de fenotipos mutantes.
8.4.4 Los proyectos del genoma de metazoarios se
enfocan sobre todo en modelos del desarrollo
y enfermedades
El éxito del proyecto de secuenciación de C. elegans anunció una
era nueva y confiable. Para contribuir a los escasos proyectos de ge-
nomas animales de larga duración (p. ej., D. melanogaster) se desa­
rrolló una plétora de nuevos proyectos con diferentes motivaciones:
► investigación básica (p. ej., el deseo de conocer por completo
modelos valiosos del desarrollo);
 8.4 PROYECTOS DE GENOMAS PARA ORGANISMOS MODELOS 229

Cuadro 8 -3 . Guerras contra gérmenes: ejemplos de proyectos de genomas para microorganismos patógenos (véase las lecturas
adicionales para obtener fuentes en internet).
Microorganismos Tamaño del genoma Enfermedad concomitante
(número de cromosomas)

Bacterias
Bacillus anthracis 4.5 Mb (1) Carbunco
Bordetella pertussis 3.88 Mb (1) Tosferina
Borrelia burgdorferi 0.95 Mb (1) Enfermedad de Lime
Chlamydia pneumoniae 1.0 Mb (1) Afección respiratoria; cardiopatía coronaria
Chlamydia trachomatis 1.7 Mb (1) Tracoma, una causa principal de ceguera
Clostridium difficile. 4.4 Mb (1) Diarrea relacionada con antibióticos; colitis seudomembranosa
Helicobacter pylori 1.67 Mb (1) Úlceras pépticas
Mycrobacterium leprae 2.8 Mb (1) Lepra
Mycrobacterium tuberculosis 4.4 Mb (1) Tuberculosis
Ricketssia prowazekii 1.1 Mb (1) Tifus
Salmonella typhi 4.5 Mb (1) Fiebre tifoidea
Treponema pallidum 1.1 Mb (1) Sífilis
Vibrio cholerae 2.5 Mb (1) Cólera
Yersinia pestis 4.38 Mb (1) Peste

Protozoarios
Leishmania m ajor 33.6 Mb (36) Leishmaniasis
Plasmodium falciparum 23 Mb (14) Paludismo
Trypanosoma brucei 54 Mb (22)a Tripanosomosis africana (enfermedad dei sueño)
Trypanosoma cruzi 87 Mb (> 4 2 ) Tripanosomosis americana (enfermedad de Chagas)

Organizada en la forma de 1 1 pares.

► comercial (p. ej., proyectos de genoma para granjas de animales).
► médicos (p. ej., comprender modelos de enfermedad y la pato­
genia secundaria a nematodos parasitarios o bien originada por
vectores de enfermedades como mosquitos, los portadores del
paludismo).
Proyecto del genoma de D. melanogaster
Este proyecto se condujo al principio en gran parte como una co­
laboración entre la University of California en el Berkeley laboratory
y un consorcio de laboratorios europeos, pero después se incorpo­
ró una importante compañía privada, Celera. La secuencia publica­
da por Adams y colaboradores (2000) no fue la secuencia completa
del genoma, de 165 Mb, sino la de casi toda la porción eucromáti-
ca de alrededor de 120 Mb en la que reside la inmensa mayoría de
los genes. La versión 3.0 publicada en agosto-septiembre de 2002
eliminaba la mayor parte de los intervalos en la secuencia de eucro-
matina (http://www.fruitfly.org/sequence/index.html).
El informe inicial de la secuencia del genoma de Drosophila in­
cluyó 13 601 genes que codifican polipéptidos, con una densidad
génica de alrededor de uno por 9 kb. La cifra baja de genes fue una
sorpresa cuando se comparó con los 19 000 genes que codifican
polipéptidos de C. elegans, que se publicó primero, un organismo
más simple con tal vez sólo 10% del número de células de D. m e­
lanogaster. Con la finalidad de relacionar D. melanogaster con espe­
cies de Drosophila, relacionadas de forma más distante, en fecha
reciente se iniciaron otros proyectos de genoma, en particular el
proyecto de D. pseudoobscura.
Proyecto del genoma de Anopheles gambiae
Anopheles gam biae es un mosquito que disemina el parásito mortal
del paludismo, Plasmodium falciparum . Con el patrocinio propor­
cionado sobre todo por el U.S. NIH-NIAID y el Ministerio Francés
de Investigación, se secuenció el genoma de Anopheles gam biae me­
diante una colaboración entre Celera Genomics, el centro nacional
francés de secuenciación Génoscope y el Institute for Genome Re­
search (TIGR), en asociación con varios grupos de investigación de
universidades (Holt y cois., 2002 ). Su secuencia se publicó de forma
simultánea con la de Plasmodium falciparum (véase sección 8.4.2) y
ofreció una nueva dimensión en la lucha contra el paludismo.
Proyecto del genoma del ratón (Mus musculus)
Debido a diversas características, el ratón proporciona el modelo de
genoma más importante para el proyecto del genoma humano (véa­
se recuadro 8 - 8 ) y se esperaba que tuviera en esencia el mismo nú­
mero de genes. Los esfuerzos para la secuenciación del genoma del
ratón patrocinada con recursos públicos se iniciaron en 1999 y al
principio se planeó obtener un esquema de la secuencia hacia el año
2005. Sin embargo, cuando la compañía privada Celera anunció en­
tonces su intención de secuenciar el genoma del ratón en dos años,
se llevaron a cabo esfuerzos conjuntos para acelerar el esfuerzo pú­
blico de secuenciación. Con ese fin se formó el Mouse Genome Se-
quencing Consortium (MGSC) con los U.S. National Institutes of
Health y el U.K.’s Wellcome Trust en asociación con tres compañías
privadas (GlaxoSmithKline, Merck Genome Research Institute y
Affymetrix, Inc.). El esfuerzo de secuenciación de MGSC se delegó
230 CAPÍTULO OCHO PROYECTOS DEL GENOMA Y ORGANISMOS MODELOS

Recuadro 8 - 8 . Animales multicelulares m odelos para com prender el desarrollo, las enferm edades y la
función génica
Se recurre a una amplia variedad de modelos animales multicelulares pa­
ra conocer los procesos básicos del desarrollo y la biología celular, con
objeto de comprender la función génica y como modelos de enfermeda­
des, El espectro es amplio, desde gusanos y moscas invertebrados has­
ta diferentes especies de peces, ranas, aves y mamíferos; véase Hedges
(2002) y asimismo las figuras 12-23 y 12-24 para conocer la filogenia.
CAENORHABDITIS ELEGANS (GUSANOS REDONDOS)
► sistema nervioso. Existe un diagrama completo de Interconexiones
del sistema nervioso: se conocen todas las 302 neuronas y las unio­
nes entre ellas. C. elegans también posee genes para la mayor parte
de los componentes moleculares conocidos del cerebro de vertebra­
dos. En tanto que muchos científicos piensan que el cerebro humano
es tan complejo que nunca se tendrá la esperanza de comprenderlo
por completo, el conocimiento del sistema nervioso simple de C. ele­
gans proporcionará mucha información y será importante conocer
los genes de C. elegans para entender su sistema nervioso.

► envejecimiento. Se estudia con facilidad porque el gusano se desa­

rrolla a partir de una célula hasta la form a de crecimiento completa
en el transcurso de tres días y sólo sobrevive dos semanas. Se han
identificado numerosas mutaciones en C. elegans que dan por re­
sultado prolongaciones notorias del periodo de vida y algunos m u­
tantes viven cinco veces más tiempo que los gusanos de tipo
silvestre.

► apoptosis. Los genes que participan en la apoptosis (muerte celular

programada) suelen conservarse bastante y se comprendió bien el
patrón de apoptosis en el desarrollo de C. elegans (al principio se for­
C. elegans es un nematodo o gusano redondo (en comparación con los
ma un total de 1 090 células en el hermafrodita, pero 131 células es­
gusanos planos y los segmentados). Los gusanos redondos superan en
número a todas las otras criaturas complejas del planeta, se encuentran tán programadas para m orir durante el desarrollo).
casi en cualquier parte del mundo templado y prosperan en el suelo. Pue­ DROSOPHILA MELANOGASTER
den vivir libremente (C. elegans) o como parásitos. Los gusanos redon­
dos infestan a mil millones de seres humanos y diseminan enfermedades,
que incluyen la ceguera de los ríos y la elefantiasis, y devoran cosechas.
C. elegans tiene 1 mm de largo. Hay dos sexos: masculino (XO) y her-
mafrodita (XX), una hembra modificada que es el sexo predominante. Al
producir espermatozoos y huevos puede fecundarse y dar por resultado
homoclgosidad para alelos. El macho se desarrolla por la pérdida ocasio­
nal de uno de los dos cromosomas X del hermafrodlta y éste se aparea
de preferencia con machos, según estén disponibles. El linaje celular es
Invariable y hay 959 células somáticas en el hermafrodlta y 1 031 en el
macho adultos.
C. elegans es un modelo importante del desarrollo, puede cultivarse con
facilidad en el laboratorio (en placas de agar con alimentación de bacte­
rias o en cultivo líquido) y es muy susceptible de análisis genéticos. En el
último caso, además de los métodos estándar de knocking out de la fun­
ción génica a nivel del DNA, es posible lograr la inactivación temporal de
la expresión de genes específicos mediante tecnología de RNA de inter­
ferencia (RNAi). En este método, el investigador inyecta en el oocito RNA
de doble cadena para el gen de interés. El RNA de doble cadena inactiva
la expresión del gen homólogo y los fenotipos mutantes que resultan pue­
den examinarse para buscar indicios de la función génica (véase sección
20 .2 .6 ).
Varias características determinan que C. elegans sea un buen organismo
modelo para estudios de biología del desarrollo y otros relacionados:
► estudios de expresión. Debido a que C. elegans es transparente du­
rante todo su ciclo de vida, es posible unir el gen de proteína verde
fluorescente (PVF\ véase recuadro 20-4) con un gen de C. elegans y La mosca de la fruta se llama así por su inclinación por la fruta descom­
utilizarse para encontrar el sitio en donde se expresó el gen en el gu­ puesta. Tiene un ciclo de vida corto, es en particular dócil para análisis
sano. genéticos com plicados y se ha estudiado en extenso durante muchas
décadas. Se ha analizado de manera sistemática un gran número de
► estudios de linaje. La transparencia de C. elegans hace posible ob­
mutantes y obtenido una cantidad inmensa de inform ación sobre la fun­
servar y seguir cada célula durante el desarrollo. Como resultado, y ción génica (véase Perrimon [1998] para hallar un resumen de los nue­
debido a la invariabilidad del linaje celular, se conoce el linaje exacto vos adelantos en el estudio de la función génica). Una diversidad de
de cada célula de C. elegans -inform ación que se desconoce en to­ características y conductas contribuyó al mapeo genético y el análisis
dos los otros organismos multicelulares. funcional:
 8.4 I PROYECTOS DE GENOMAS PARA ORGANISMOS MODELOS 231

Recuadro 8 - 8 . Animales multicelulares modelos para comprender el desarrollo, las enfermedades y la

función génica (c o n tin ú a )
► cromosomas polilenos. Son cromosomas de interfase de 2 mm de métodos genómicos comparativos en estas tres especies proporcionan
largo que se encuentran en las células de las glándulas salivales en una ventana notable sobre la evolución del genoma de vertebrados.
las etapas larvarias. Son característicos porque se producen por re- ► Pez cebra (Brachydanio rerio)
plicación repetida sin separarse hacia núcleos hijos y el resultado es
un juego de 1 024 copias de DNA dúplex, único en condiciones nor­
males, dispuestas lado a lado como las pajillas para beber dispues­
tas en una caja. Debido a esta amplificación paralela del DNA, los
cromosomas politenos son únicos entre los cromosomas de interfa­
se porque son visibles al m icroscopio de luz. Como resultado de su
configuración extendida, permiten localizar con precisión (decenas de
kilobases) puntos de rotura cromosómicos y detectar con exactitud
clonas de DNA mediante hibridación in situ.
► elem ento P. Este elemento transponible de Drosophila permite varios
tipos de manipulación experimental, entre ellos mutagénesls (véase
Spradling y cois., 1995) y transgénesis (véase sección 20.2.2). La re-
El pez cebra es un pequeño animal de agua dulce originario de ríos en la
combinación desigual entre Insertos de elemento P adyacentes tam ­
India y común en la actualidad en acuarios de todo el mundo. Tiene un
bién puede ocasionar deleclones precisas.
tiempo de generación corto y en cada apareamiento produce una gran
► mediante el sistema GAL4-UAS de expresión génica condicional es po­ cantidad de huevos. Es un modelo principal del desarrollo de vertebrados:
sible restringir la expresión espacial y temporal de transgenes. Son fac­ la fecundación es externa, de tal manera que son accesibles todos los as­
tibles selecciones de mutagénesis a gran escala y en fecha reciente se pectos del desarrollo y el embrión es transparente, lo que facilita identifi­
empleó tecnología de RNAi (véase antes) a fin de inactivar en forma car mutantes del desarrollo. Los genes de importancia en el desarrollo de
transitoria genes específicos. En muchos casos (tal vez dos tercios de vertebrados suelen estar muy bien conservados y por consiguiente los
genes que controlan el desarrollo humano tienen en condiciones norma­
los 12 000 genes de Drosophila) la pérdida de la función no da lugar a
les ortólogos reconocibles en el pez cebra. Las selecciones de mutagé­
un fenotipo mutante, pero la expresión errónea del transgén suele pro­
nesls a gran escala proporcionaron un gran número de mutantes del
porcionar indicios sobre la función génica al producir fenotipos negati­
desarrollo valiosos y algunos de ellos se emplean como modelo de tras­
vos dominante/dominante. Las selecciones de una generación para tornos humanos (véase recuadro 20-6). Se ha usado asimismo la tecno­
supresores/intensificadores de fenotipos mutantes dominantes pueden logía de interferencia de RNA (véase antes) a fin de inactivar genes
identificar genes que ¡nteractúan. Es posible usar el sistema de recom- específicos.
binasa flp-frt de la levadura para inducir clonas mitóticas y formar así ► Pez soplador, como Takifugu rubripes rubripes (véase abajo) y Te-
placas homocigotas que permiten observar los fenotipos de mutacio­ traodon nigroviridis (véase más adelante).
nes recesivas letales en etapas tardías del desarrollo. También puede
utilizarse la recombinación mitótica en la selección de una generación
a fin de calificar los fenotipos mutantes en clonas y recuperar mutacio­
nes letales que afectan el desarrollo ulterior.
Aunque Drosophila es un invertebrado y tal vez el número de genes de
Drosophila representa sólo la mitad de los genes humanos, existen no
obstante ciertas similitudes notables entre los genes humanos y los de
Drosophila. Gran parte de la diferencia en el número de genes se debe a
fenómenos de duplicación génica que dan por resultado familias de ge­
nes más grandes en seres humanos y una proporción grande de genes Tiene valor sobre todo en genómica comparativa (sección 12.3). El pez
de Drosophila tiene homólogos humanos, Incluidos los genes subyacen­ soplador posee un genoma muy compacto, casi con el mismo número de
tes de muchos trastornos genéticos y los de cáncer. El nivel de homolo­
gía posibilita tener éxito en la selección electrónica para reconocer cDNA
humanos correspondientes a genes mutantes de Drosophila (Banfi y cois.,
1996). Muchos de los genes muy bien conservados tienen funciones im ­
portantes en el desarrollo temprano que, en términos comparativos, se
comprende bien en Drosophila y muchas de las vías relevantes en el de­
sarrollo inicial y en algunos otros procesos similares cruciales están
esencialmente conservadas, desde Drosophila hasta mamíferos. Como
resultado, puede emplearse Drosophila como un sistema modelo para ex­
plorar la función génica y los patrones de interacción de genes que tienen
importancia directa para sistemas humanos.
PECES
Por lo general se emplean como modelos diferentes peces, en especial el
pez cebra, que es un modelo excelente del desarrollo y cada vez más im ­
portante de enfermedades, el pez soplador por su genoma muy compac­
to y, en fecha más reciente, medaka, otro gran modelo de desarrollo. Los
232 j CAPITULO OCHO PROYECTOS DEL GENOMA Y ORGANISMOS MODELOS
R ecuadro 8 8. A n im a le s multicelulares m odelos para com prender el desarrollo, las enferm edades y la
______________ fu n c ió n génica (co n tin ú a)
genes que los mamíferos, comprim ido en un genoma de sólo casi una
séptima parte del tamaño de los genomas humano o del ratón. La con­
servación de exones y secuencias reguladoras importantes ayuda a iden­
tificar equivalentes humanos mediante mapeo comparativo (véase Clark,
1999).
► Medaka
El medaka (Oryzias latipes) es un pez de agua dulce pequeño y ovíparo
que se encuentra de manera predominante en Japón. Es un modelo de
desarrollo cada vez más importante relacionado de form a distante con el
pez cebra (los dos separados de un ancestro común tal vez hace más de
110 millones de años). Al igual que el pez cebra, es muy adecuado para
los análisis genéticos y embriológicos, con un tiempo de generación cor­
to (dos a tres meses), cepas endogámicas, mapas genéticos, transgéne­
sis, atrapamiento de intensificadores y disponibilidad de células madre
(Wlttbrodt y col., 2002). Los fenotipos recuperados de selecciones del
desarrollo en medaka y el pez cebra señalan un espectro no superpuesto
de fenotipos embrionarios y letales.
POLLO
El pollo tiene varias ventajas com o m odelo del desarrollo. Del m ism o
modo que los mamíferos, las aves son amniotas (el embrión tiene
membranas am nióticas) y su desarrollo se asemeja muy de cerca al de
los mamíferos. Sin embargo, mientras que un em brión de mamífero
depende de la madre para su nutrición (con intercam bio a través de la
placenta), los embriones de aves no tienen placenta y por consiguien­
te son sistemas de autodesarrollo. Debido a que el em brión de pollo se
desarrolla fuera del cuerpo, es accesible en todas sus etapas. Además
de obtenerse con facilidad, el em brión del pollo tiene la ventaja de ser
grande y relativamente transparente, lo que permite llevar a cabo con
facilidad manipulaciones m icroquirúrgicas delicadas. En consecuen­
cia, representa un excelente sistema en el que es posible com binar es­
tudios moleculares con embriología habitual (véase Brown y cois.,
2003).
Las manipulaciones experimentales com unes en em briones de pollo
incluyen m aniobras quirúrgicas e injerto de tejidos; transferencia gé­
nica mediada por retrovirus; electroporación de em briones en desa­
rrollo y cultivo em brionario. Además, el pollo sum inistra un sistema
único para el estudio de procesos celulares: la línea de c élu las DT40.
Las células DT40 del pollo continúan la diversificación de sus genes
de inm unoglobulina y, com o hecho único entre las líneas de células de
vertebrados disponibles, pueden llevar a cabo recom blnación hom o­
loga a un índice que se aproxima al de la recom binacíón ilegítim a. Co­
mo resultado, es posible efectuar en la línea celular cultivada deleción
génica dirigida y análisis de m utación con relativa conveniencia. Se
han logrado rápidos adelantos en transgénica de pollo, tecnología de
célula madre (CM) em brionaria y criopreservación de esperma, célu­
las de blastodisco, células germen prim ordiales y células madre em ­
brionarias (ME). Estas tecnologías más recientes harán posible la
creación de sistem as basados en pollos para crear modelos de enfer­
medades humanas.
XENOPUS (RANA AFRICANA CON GARRAS)
La rana africana adquirió su nombre (xenopus, es decir, pata extraña) por
las garras afiladas en los dedos de sus patas traseras membranosas fuer­
tes y grandes. Desde hace mucho tiempo es un modelo favorito de desa­
rrollo embrionario y biología celular; son accesibles todas las etapas del
desarrollo y el tamaño comparativamente grande de los huevos y embrio­
nes muy tempranos facilita las micromanipulaciones, incluidos las microin-
yecciones (mRNA, anticuerpos y oligonucleótidos antisentido), injertos de
células y experimentos de marcado. A mediados de la década de 1990
(véase Beck y Slack, 2001) se desarrollaron métodos potentes para gene­
rar embriones transgénicos y se han planeado selecciones para mutagéne-
sis impresionantes para X. tropicalis.
Fotografía de Amaya y cols., Trends Genet 1998;14:253-255, © Elsevier.
► Xenopus laevis (izquierda en la fotografía anterior)
X. leavis tiene un tiem po de generación prolongado de uno a dos años
y puede inducirse para que produzca a la vez 300 a 1 000 huevos, que
son grandes (1 a 1.3 m m ). Ha resultado un gran modelo para estable­
cer los m ecanism os de las decisiones tempranas de destino, el patrón
del plan básico del cuerpo y la organogénesis. Las contribuciones en
biología celular y bioquím ica incluyen trabajo básico sobre replicación
crom osóm ica, ensamble de crom atina y nuclear, componentes del c i­
clo celular, elementos citoesqueléticos y vías de señalamiento. X. lae­
vis tiene un genoma alotetraploide (se duplica un número muy elevado
de genes com o resultado de un fenómeno de duplicación del genoma
que ocurrió tal vez hace 30 millones de años, aunque muchos de los
genes duplicados de manera original se perdieron desde entonces) y
una desventaja notoria es que no ha sido fácil llevar a cabo análisis ge­
néticos.
 8.4 PROYECTOS DE GENOMAS PARA ORGANISMOS MODELOS
Recuadro 8 8 . A n im a le s multicelulares m odelos para com prender el desarrollo, las enferm edades y la
f u n c ió n gènica (con clusión)
► Xenopus tropicalis (derecha en la fotografía anterior)
La rana X. tropicalis más pequeña tiene un tiem po de generación com ­
parativamente corto ( < 5 meses) y puede inducirse para que produz­
ca 1 000 a 3 000 huevos a la vez, aunque más pequeños que los de
X. laevis. Se relaciona desde el punto de vista evolutivo m uy de cerca
con esta últim a, pero tiene un genoma diploide y es más dócil para los
análisis genéticos.
RATÓN
Es el organismo modelo que se consideró más importante para el pro­
yecto del genoma humano (véase Melsler, 1996). Es la especie de mamí­
fero con la genética más desarrollada y es un modelo del desarrollo de
mamíferos que se utiliza con amplitud. Su tamaño pequeño y tiempo de
generación corto hicieron posibles programas de mutagénesis a gran es­
cala y cruzamientos genéticos extensos, además de que varias caracte­
rísticas contribuyen al mapeo génico y de fenotipos (véase recuadro
14-2). En virtud del nivel de conservación de secuencias comparativa­
mente alto entre las secuencias de codificación humanas y del ratón, ca­
si todos los genes humanos tienen un homólogo en el ratón fácil de
identificar. Están conservados segmentos cromosómlcos grandes entre
el ratón y el hombre (figs. 14 -7 ,1 4 -8 ) y, por consiguiente, si se mapea a
una gran resolución una región del genoma de ratón es posible utilizar la
información para formular predicciones sobre la región ortóloga del ge­
noma humano (y viceversa). Esto es en particular relevante en Investiga­
ción médica porque el ratón ortólogo y las mutantes humanas suelen
mostrar fenotipos similares, de tal manera que la clonación posicional de
a tres de los principales centros relacionados con el proyecto del ge­
noma humano: Wellcome Trust Sanger Institute, Whitehead Insti­
tute/MIT y Baylor College of Medicine.
En abril del 2001, Celera anunció que su proyecto rival de secuen-
ciación del ratón había proporcionado una cobertura seis veces mayor
del genoma de ratón, incluidas las secuencias de tres cepas de ratón:
129Xl/SvJ, DBA/2J y A/J. No se dispuso libremente de los datos de
la secuencia de Celera; por el contrario, se restringió el acceso a los que
estuvieron preparados para pagar los elevados honorarios de suscrip­
ción. En mayo del 2002, el MSGS anunció que había completado un
campo siete veces mayor del genoma del ratón C57BL/6J terminado
en 96% y que pudo consultarse de inmediato en internet, antes de pu­
blicarse un artículo convencional en una revista en diciembre del
2002 (Mouse Genome Sequencing Consortium, 2002).
Se dispuso de otras versiones de los datos de secuencia del ge­
noma del ratón como resultado del Ensembl proyect, una colabo­
255i ^
un gen de enfermedad en una especie puede tener una gran im portancia
para la otra especie (sección 14.3.5). La capacidad para desarrollar rato­
nes con modificaciones genéticas predeterminadas de la línea germen
(mediante tecnología transgénica y blancos génicos en células madre
embrionarias) es un medio potente para estudiar la expresión y función
génicas y crear modelos de enfermedades humanas en el ratón. Véase el
capítulo 20 para más detalles.
RATA
Las ratas, mucho más grandes que los ratones, son desde hace muchos
años el mamífero de elección para análisis fisiológicos, neurológicos, far­
macológicos y bioquímicos. También pueden proporcionar sistemas ge­
néticos modelos para trastornos vasculares y neurológicos humanos
complejos, com o hipertensión y epilepsia (por diversas razones no exis­
ten modelos de ratón para estas afecciones). No obstante, el análisis ge­
nético en ratas de laboratorio está mucho menos avanzado que en
ratones, en parte debido al costo relativamente alto de los programas de
apareamiento de ratas y la dificultad actual para modificar la línea germen
de ratas mediante blancos génicos. Sin embargo, en fecha reciente se
elaboraron mapas genéticos y físicos de alta resolución y en la actualidad
se dispone de la secuencia genómlca.
ración entre el European Bioinformatics Institute y el Wellcome
Trust Sanger Institute (http://www.ensembl.org/Mus musculus), a
través de la University of California en Santa Cruz (http://geno-
me.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm2). Los datos de la estruc­
tura inicial de la secuencia sugirieron que el ratón tenía el mismo
número de genes que el hombre (cerca de 30 000 o un poco me­
nos de esta cifra; véase Mouse Genome Sequencing Consortium,
2 00 2 ), pero con algunas diferencias interesantes (véase sección
12.4.1). Además de proporcionar datos importantes sobre los ge­
nes del ratón y la estructura de su genoma, los datos también han
sido valiosos en la definición de la variación de la secuencia y en
genóm ica comparativa. Por ejemplo, ha resultado muy útil la com­
paración con la secuencia del genoma humano para definir se­
cuencias muy conservadas (no sólo la codificación del DNA sino
asimismo secuencias reguladoras y otras) y conocer la evolución
del genoma (sección 12.3.2).
234 CAPÍTULO OCHO PROYECTOS DEL GENOMA Y ORGANISMOS MODELOS

Otros proyectos del genoma de metazoarios (véase cuadro
8-4)
► P royectos d e l gen o m a d e aves. El primero en la lista es el p o llo
por su importancia como modelo de desarrollo (recuadro 8 - 8).
► P royectos d e l g en o m a d e p eces. Hacia fines del año 2002 se
había obtenido la mayor parte de la secuencia genómica de dos
especies de p e z sop la d or, un modelo de un genoma de verte­
brados compacto y del p ez cebra, un modelo del desarrollo y
cada vez más importante de enfermedad y función genica (véa­
se cuadro 8-4 y recuadro 8 - 8 ).
► P royectos d e l gen o m a d e la rana. Como se detalla en el recua­
dro 8 - 8 , el X enopus es un modelo excelente del desarrollo y se
estableció el compromiso de secuenciar el genoma de Xenopus
tropicalis, que es más tratable desde el punto de vista genético
que Xenopus laevis, que se ha estudiado más.
► P ro yecto s d e l g en o m a d e la m osca. Además de Drosophila y
proyectos del mosquito (sección 8.4.4), se inició asimismo un
proyecto de genoma para la a b eja que es interesante por: a) sus
instintos sociales potentes y caracteres conductuales únicos
(útil para los neurobiólogos); b) su importancia en la salud hu­
mana (las posibles consecuencias relevantes de las picaduras de
abeja y como modelo para resistencia a los antibióticos, inmu­
nidad, reacciones alérgicas, etc.; y c) su importancia para la co­
munidad agrícola como polinador.
► P ro yecto s d e l g en o m a d e gu sa n os. Además de los proyectos
para nematodos que viven libremente (el proyecto terminado de
C. elegans [sección 8.4.3] y el proyecto más reciente para se­
cuenciar una especie relacionada de modo distante, C. briggsae
[véase sección 12.3.2]), se desarrolló un importante proyecto
de colaboración entre el Wellcome Trust Sanger Institute y la
University of Washington y la University of Edinburgh a fin de

Cuadro 8-4, Proyectos de genomas de metazoarios importantes (animales multicelulares) (véase las lecturas adicionales para
obtener fuentes de referencia electrónicas).
Clase animal Especie (nombre común) Tamaño del genoma Centro de coordinación3

Ascidios Ciona intestinalis (ascidia) 200 Mb US DOE Joint Genome Institute

Aves Gallus gallus (pollo) 1 200 Mb Washington University

Peces Brachydanio rerio (pez cebra) 1 900 Mb Wellcome Trust Sanger Institute
Fugu rubripes (pez soplador) 400 Mb International Fugu Genome Consortium
Tetraodon nigroviridis (pez soplador) 350 Mb Genoscope, Paris
Ranas Xenopus tropicalis 1 700 Mb US DoE Joint Genome Institute
Insectos Apis mellifera (abeja) 270 Mb Baylor College of Medicine
/letfes aegypti (mosquito de la fiebre amarilla) 780 Mb TIGR (The Institute for Genome Research)
Anopheles gambiae (mosquito del paludismo) 278 Mb International (pero sobre todo Celera & Genoscope)
Drosophila melanogaster (mosca de la fruta; región 165 Mb Celera/Drosophila Genome Center/Howard Hughes
de eucromatina) Medical Institute

Drosophila pseudoobscura (región de eucromatina) 125 Mb Baylor College of Medicine

Mamíferos Sos taurus (vaca) 3 000 Mb Baylor College of Medicine
Canis familiarís (perro) 2 800 Mb Whitehead/MIT
Mus musculus (ratón) 2 500 Mb Mouse genome sequencing consortium/Celera
Pan troglodytes (chimpancé común) 3 500 Mb Whitehead/MIT and Washington University
Rattus norvegicus (rata) 3 100 Mb Baylor College of Medicine
Gusanos Caenorhabditis elegans 100 Mb Wellcome Trust Sanger Institute/WashingtonUniverslty
redondos Caenorhabditis briggsae 80 Mb Washington University
Erizo de mar Strongylocentrotus purpuratus 800 Mb Baylor College of Medicine (probablemente)
aLas direcciones en la red para ios principales centros de secuenciación relacionados son las siguientes:

Baylor College of Medicine of Genome Sequencing Center http://hgsc.bcm.tmc.edu/

Celera http://www.celera.com /
DoE Joint Genome Institute http://www.jgi.doe.gov/
Genoscope http://www.genoscope.cns.fr/
TIGR (The Institute for Genome Research) http://www.tigr.org/

Washington University Genome Sequencing Center http://genome.wustl.edu/

Wellcome Trust Sanger Institute http://www.sanger.ac.uk/
Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research http://www-genome.wi.m it.edu
 8.4 PROYECTOS DE GENOMAS PARA ORGANISMOS MODELOS
secuenciar cientos de miles de EST de alrededor de 20 especies de
n em a tod os parásitos. Se incluye a Ascaris lumbricoides, que es
el parásito nematodo más común de seres humanos y que se es­
tima que infecta a 1.47 mil millones de individuos (la afección
puede ocasionar neumonía originada por la migración de los
gusanos a través de los pulmones, bloqueo del tubo digestivo o
los conductos biliar o pancreático; véase http://nematode.net).
► P royectos d e l gen o m a d e m am íferos. En fecha reciente se ini­
ciaron proyectos para secuenciar los genomas de:
• el ch im p a n cé, el relacionado más de cerca con el hombre.
El interés en la secuenciación del genoma del chimpancé
proviene de un nexo evolucionista muy próximo al hombre.
La información puede suministrar datos valiosos sobre en­
fermedades en las que las correspondientes en chimpancés
son raras o así parece porque existen varios trastornos mé­
dicos que afectan a los seres humanos pero no a los chim­
pancés (p. ej., la progresión de HIV a sida, paludismo
inducido por Plasmodium falciparum)-, véase Cyranoski
[2002] y Olson y Varki [2003];
• la rata es un modelo valioso para investigación cardiovascular,
psicológica y fisiológica. El Baylor College of Medicine anun­
ció una estructura preliminar de la secuencia del genoma y la
envió al GenBank en noviembre de 2002. La secuencia incluye
90% del genoma (2 560 Mb del total estimado de 2 800 Mb;
véase http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/projects/rat/);
• la vaca, o v eja y cerd o son animales de granja valiosos;
• el p e r r o es un modelo de enfermedad valioso (los perros su­
fren muchas de las mismas afecciones que los seres huma­
Lecturas adicionales
Borsani G, Ballabio A, Banfi S (1998) Una guía práctica para
orientarse personalmente en el laberinto de bases de datos so­
bre el genoma. Hum. Mol. Genet. 7, 1641-1648.
Ejemplar de Base de datos of Nucleic Acid Research (2003)
Nucí. Acid Res. 31, 1-516.
Hedges SB (2002) The origin and evolution of model organism.
Nature Rev. Genet. 3, 838-849.
Ejemplar de Nature sobre el Genoma humano (15 de febrero
2001). Nature 409, 813-958 (los artículos están disponibles
electrónicamente en http://www.nature.com/genomics/human/).
Ejemplar de Science sobre el Genoma humano (16 de febrero 2001).
Scbnce 291,1177-1351 ((los artículos están disponibles electrónicamen­
te en http:/A«ww.sciencemag.org/contenWol291/issue5507/index.shtml).
Ejemplar de Nature sobre el Genoma del ratón (5 de diciem bre 2002).
Nature 420, 509-590 (los artículos están disponibles electrónicamente
en http:/AAWw.nature.com/nature/mousegenome/index.html/).
Guía para usuarios sobre el Genoma humano Nature Genetics
Supplement, Septiembre de 2002 (disponible electrónicamente a través
de Nature Genome Gateway en http:/Mww.nature.com/genomics/).
Wilkie T (1993) Perilous Knowledge: the Human Genome Project
and is Implications. Faber and Faber, New York.
Información electrónica sobre el Gene Ontology Consortium
en http://www.geneontology.org/)
Información electrónica sobre el Proyecto del genoma huma­
no (y proyectos relacionados); puede encontrarse en mu­
chos sitios. Los sitios útiles en la red incluyen los siguientes:
235
nos). El perro también es un modelo de importancia para
genética de la conducta y se utiliza con amplitud en inves­
tigación farmacéutica.
► P royectos d e l g en o m a d e an im a les m a rin os sim ples.
• El erizo d e m a r ha sido un sistema modelo notorio durante
muchos años en el estudio de biología básica, en particular
la biología del desarrollo. Es un deuterostoma y por consi­
guiente se relaciona en términos comparativos muy de cerca
con vertebrados y el hombre (véase fig. 12-23). Existe un
gran cúmulo de información sobre la expresión génica y el
erizo de mar es un modelo útil para aprender la forma en
que las vías de genes y proteínas regulan el crecimiento y el
desarrollo. En fecha reciente se inició un proyecto de geno­
ma para Strongylocentrotus purpuratus.
• Los a scid io s (llamados, asimismo, tunicados) son un grupo
de animales marinos que pasan la mayor parte de su vida
unidos a muelles, rocas o la parte inferior de botes. Pertene­
cen al phylum urochordata y se relacionan en realidad más
de cerca con los vertebrados que la mayor parte de otros
animales invertebrados. Ciona intestinalis tiene el genoma
más pequeño de cualquier cordado manipulable por medios
experimentales y proporciona un buen sistema para explo­
rar los orígenes evolucionistas del linaje cordado. Dehal y
colaboradores (2002 ) publicaron un esquema de la secuen­
cia del genoma de C. intestinalis. El genoma de 117 Mb tie­
ne alrededor de 16 000 genes y análisis genómicos
comparativos con genomas de vertebrados secuenciados
han suministrado valiosa información sobre la evolución de
cordados y vertebrados.
• el U.S. N a tio n a l H u m a n G e n o m e R e se a rch In stitute (NG H R I)
en http://www.nghri.nih.gov/
• el U.S. N a tio n a l C e n te r fo r B io te c h n o lo g y In form ation (N CB I)
en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
• el Genome Web maintained at the UK Human Genome
Mapping Resource Centre en
http://www.hgmp.mrc.ac.uk/GenomeWeb/
• la Genome Web conservada en el
http://www.nature.com/genomics/
Información electrónica sobre Proyectos de genomas para
microorganismos y organismos modelo; pueden encontrar­
se en diversos sitios, que incluyen:
• Base de datos sobre el genoma microbiano TIGR, en
http://www.tigr.org/tdb/mdb/mdbcomplete.html y
http://www.tigr.org/tdb/mdb/mdbinprogress.html
• The European Bioinformatics parasite genome webpage en
http://www.ebi.ac.uk/parasites/paratable.html
• Página en la red sobre el genoma parasitario
http://www.rna.ucla.edu/par/
• The U.S. national Human Genome Research Institute's sitio
en la red
http://www.genome.gov/Pages/Research/Sequencing/
Proposals/
Información electrónica sobre Organismos modelo, incluyen:
• El sitio de organismo modelo de NIH, en
http://www.nih.gov/science/models
236 I CAPÍTULO OCHO PROYECTOS DEL GENOMA Y ORGANISMOS MODELOS
• La Model Organisms Virtual Library en
http://www.ceolas.org/VL7mo/
• El sitio de NCBI Model Organisms en
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/model/
• Glosario de organismos Modelo y otros, en
http://www.genomicglossaries.com/content/rnodelorgan-
isms.glossary.asp
• Proyecto en la red el Tree of Life, en http://tolweb.org/tree/
Listas de resúmenes electrónicos de todos los Proyectos de
genomas; pueden encontrarse en diversos sitios, incluyendo:
• Una lista de proyectos de genomas terminados y en curso
recopilados por Integrated Genomics en http://ergo.integra-
tedgenomics.com/GOLD/
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and Human Genome Project. Science 252, 1651-1656.
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• Una lista de proyectos de genomas terminados y en curso
recopilados por the European Bioinformatics Institute en
http://www2.ebi.ac.uk/genomes/
Indagadores del Genoma humano y bases de datos integra­
das, incluyen:
• Ensembl en http://www.ensembl.org
• NCBI Map Viewer en
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgibin/Entrez/map-search
• UCSC Genome Browser en http://genome.ucsc.edu
• Base de datos integrada The HOWDY en
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CAPÍTULO NUEVE

«- ■ . ■ ■ ■ i

Organización del genoma humano

Contenido del capítulo

9.1 Organización general del genoma humano
9.2 Organización, distribución y función de genes RNA humanos
9.3 Organización, distribución y función de genes humanos que
codifican polipéptidos
9.4 DNA no codificante de repetición tándem
9.5 DNA no codificante repetido disperso

Recuadro 9-1 Variación del número de copias del genoma en células humanas
Recuadro 9-2 Autonomía limitada del genoma mitocondrial
Recuadro 9-3 Metilación del DNA e islotes CpG
Recuadro 9-4 Especificidad de anticodón de tRNA citoplásmico eucariota
Recuadro 9-5 Genoma humano y estadísticas de genes humanos
240 CAPÍTULO NUEVE ORGANIZACIÓN DEL GENOMA HUMANO

9.1 Organización general del genom a
hum ano
9.1.1 Generalidades del genoma humano
Genoma humano es el término que se utiliza para describir la infor­
mación genética total (contenido de DNA) de las células humanas.
En realidad, comprende dos genomas: un gen o m a n u clea r complejo
con unos 30 000 genes y un gen o m a m itoco n d ria l muy simple con
37 genes (fig. 9-1). El genoma nuclear proporciona el gran volumen
de información genética esencial, que en su mayor parte especifica la
síntesis de polipéptidos en ribosomas citoplásmicos.
Las mitocondrias poseen ribosomas propios y los muy pocos ge­
nes del genoma mitocondrial que codifican polipéptidos producen
mRNA que se traduce en los ribosomas mitocondriales. Sin embar­
go, el genoma mitocondrial sólo especifica una porción muy peque­
ña de las funciones mitocondriales específicas; el mayor volumen
de los polipéptidos mitocondriales lo codifican genes nucleares y se
sintetiza en ribosomas citoplásmicos, antes de llevarse al interior
de las mitocondrias.
Las comparaciones entre seres humanos y ratones demostraron
que menos de 5% del genoma está conservado de forma notoria,
incluido 1.5% para el DNA codificante y un porcentaje un poco
mayor que comprende secuencias conservadas dentro de secuencias
no traducidas, elementos reguladores, etc. (Mouse Genome Se-
quencing Consortium, 2002; Dermitzakis y cois., 2002). Casi todo
el DNA codificante se emplea para elaborar mRNA y en conse­
cuencia polipéptidos, pero una minoría importante (cuando menos
5% y tal vez casi 10%) de los genes humanos especifica RNA no
codificante (es decir, no traducido) (gen es RNA). En fecha recien­
te se identificó una diversidad de genes RNA nuevos, lo que obli­
gó a una revaloración de la función del RNA.
Las secuencias codificantes pertenecen con frecuencia a familias
de secuencias relacionadas (fam ilias d e secu en cia s d e DNA) que
pueden organizarse en grupos en uno o más cromosomas o disper­
sarse. Estas secuencias duplicadas surgieron por diversos mecanis­
mos de d u p lica ció n g é n ica que ocurrieron en el transcurso de la
evolución. La secuenciación del genoma proporcionó la primera
valoración de la duplicación de todo el genoma y reveló una canti­
dad considerable de d u p lica ció n segm en ta ria específica de prima­
tes (como resultado de duplicaciones muy recientes se encuentran
bloques de secuencias relacionados muy de cerca en diferentes cro­
mosomas o distintas regiones de un cromosoma aislado; sección
12.2.5 y fig. 12-13; véase Bailey y cois., 2002).
Los mecanismos que dan lugar a genes duplicados también ori­
ginan secuencias no funcionales relacionadas con el gen, entre ellas
seu d o gen es y fr a g m en to s g é n ico s (sección 9.3.6). Existen numero­
sas copias defectuosas de genes RNA diseminadas en la totalidad
del genoma; asimismo, para algunos genes que codifican polipépti­
dos también se encuentran muchos genes relacionados: análisis de
las secuencias terminadas de los cromosomas 21 y 22 predicen un
total cercano a 20 000 genes en el genoma (Harrison y cois., 2002;
Collins y cois., 2003).
Al igual que en otros genomas complejos, un componente muy
considerable del genoma humano está constituido por DNA no c o ­
difica n te. Un componente valorable está organizado en repeticio­
nes tándem de cabeza a cola (-►-*-> ~f), pero la mayor parte consiste
en repeticiones dispersas que se originaron de transcritos de RNA

1 .5 % -3%

<2 %
-5 %

I I Muy conservado (codificación)

I . I Muy conservado (otros)
I I Repeticiones basadas en
transposón
d ] Heterocromatina
Genoma nuclear I I Otros no conservados Genoma mitocondrial
(24 m o lé c u la s d e D N A lineal (un D N A circ u la r d e d o b le c a d e n a
d e d o b le c a d e n a , 3 2 0 0 M b ; - 3 0 0 0 0 d e 1 6 .6 kb; 3 7 g en es)
genes)

Fig. 9-1. Organización del genoma humano.

La linea punteada en la parte media representa el tamaño relativo del genoma mitocondrial mediante la misma escala para el genoma nuclear.
Obsérvese asimismo la diferencia notable entre los dos genomas en la extensión del DNA muy conservado (secuencia de codificación, secuencia
reguladora, etc.) y la fracción de DNA no codificante muy repetida.
 9.1 I ORGANIZACIÓN GENERAL DEL GENOMA HUMANO 2

por retro tra n sp o sició n (las transcriptasas inversas celulares pueden
copiar transcritos de RNA para elaborar cDNA natural que puede
integrarse en cualquier parte del genoma).
9.1.2 El genoma mitocondrial consiste en un dúplex
de DNA circular pequeño empacado a densidad
con información genética
Estructura general y herencia del genoma mitocondrial
El genoma mitocondrial humano está definido por un tipo único
de DNA circular de doble cadena cuya secuencia completa de nu-
deótidos ya se estableció (Anderson y cois., 1981; véase asimismo la
base de datos del genoma mitocondrial Mitomap en http://www.
mitomap.org/). Tiene 16 569 pb de largo y 44% de extensión (G
— C). Las dos cadenas de DNA tienen composiciones de bases di-
rerentes en grado notable: la cadena pesada (H, del inglés heavy)
s rica en guaninas, la cadena ligera (L, del inglés light) es abun­
dante en citosinas. Aunque el DNA mitocondrial es en especial de
¿oble cadena, una sección pequeña muestra una estructura de
DNA d e ca d en a trip le debido a la síntesis repetida de un segmen­
to corto de la cadena pesada de DNA, el DNA 7S (véase fig. 9-2 y
Clayton, 1992, para una revisión general de la transcripción y re-
plicación de DNA mitocondriales en animales). De manera carac­
terística, las células humanas contienen miles de copias de la
molécula de DNA mitocondrial de doble cadena, pero la cifra pue­
de variar de forma considerable en diferentes tipos de células (véa­
se recuadro 9-1).
Durante la formación del cigoto, el espermatozoo contribuye al
óvulo con su genoma nuclear pero no con el mitocondrial. En con­
secuencia, al genoma mitocondrial del cigoto lo determina de ma­
nera exclusiva el que se encuentra de modo original en el óvulo no
fecundado. Por consiguiente, el genoma mitocondrial es de heren­
cia materna: los varones y las mujeres heredan sus mitocondrias de
la madre pero los varones no las transmiten a las generaciones sub­
secuentes. Por esta razón, los genes o las variantes de DNA codifi­
cados de forma mitocondrial suministran el patrón de genealogía
que se muestra en la figura 4-4. Durante la división celular mitóti-
ca, las moléculas de DNA mitocondrial de la célula en división se
segregan en una forma aleatoria a las dos células hijas.

C lave:

0 H, 0 L, origen y dirección
de la síntesis de las cadenas
pesada y ligera
PH, PL, origen y dirección
de la transcripción de las
cadenas pesada y ligera

□ G e n e s rR N A
G e n e s tR N A
I
G e n e s q u e c o d ific a n
p ro teín as
—•—— —i—g———------- "

Rg. 9-2. Genoma mitocondrial humano.

E asa D tiene una estructura de triple cadena debido a la síntesis duplicada de una tira de la cadena pesada (H, del inglés heavy). La transcripción de
¿ cadena pesada se origina a partir de dos promotores espaciados cercanos en la región del asa D (agrupados por razones de claridad com o PH).
_a transcripción de los promotores PH sigue la dirección dextrógira alrededor del círculo, pero en sentido levógiro del promotor PL de cadena ligera.
Et ambos casos se cortan los transcritos primarios grandes a fin de generar RNA para genes individuales. Todos los genes carecen de intrones y están
agrupados muy de cerca con un caso de genes superpuestos: el gen de ATP-asa 8 cubre de modo parcial al gen de ATP-asa 6 (véase fig. 9-3). Otros
jsnes que codifican polipéptidos especifican siete subunídades de deshidrogenasa NADH (ND4L y ND1-ND6)', tres subunidades de oxidasa de
atocrom o c (C01-C03) y citocrom o b (CYB).
242 CAPÍTULO NUEVE ORGANIZACIÓN DEL GENOMA HUMANO
R ecuadro 9-1. Variación del núm ero de co p ia s del g en o m a en célu las hum anas
Con frecuencia, los libros de texto indican que las células de un organis­
mo muestran poca variación en su contenido de DNA y ello es sin duda
cierto cuando se compara con el contenido de RNA o proteínas. No obs­
tante, puede haber diferencias notorias en el contenido de mtDNA y el de
DNA nuclear en diferentes tipos de células.
► Variación del número de copias del genoma mitocondrial. Ciertas
células (p. ej., células de la piel diferenciadas de form a terminal) ca­
recen de cualquier mitocondria y por consiguiente no tienen mtDNA.
El número de copias de mtDNA en otras células somáticas varía pe­
ro, de manera característica, es de 1 000 a 10 000 (p. ej., los linfoci-
tos poseen alrededor de 1 000 moléculas de mtDNA). Los gametos
son excepcionales: las células espermatozoos tienen unos cuantos
cientos de copias de mtDNA y los oocitos tal vez 100 000, lo que
constituye más de 30% del DNA del oocíto.
► Variación del número de copias del genoma nuclear. Las células
nucleadas (dlploldes) muestran poca variación en el contenido de
Genes mitocondriales
El genoma mitocondrial humano consiste en 37 genes. En 28 de
ellos, la cadena pesada es la cadena de sentido; en los otros nueve,
la cadena de sentido es la ligera (fig. 9-2). De los 37 genes, un to­
tal de 24 especifica un producto RNA maduro; 22 moléculas de
tRNA mitocondrial y dos moléculas de rRNA mitocondrial; un
rRNA 23S (un componente de la subunidad grande de los riboso-
mas mitocondriales) y un rRNA 16S (un componente de la subu­
nidad pequeña de los ribosomas mitocondriales). Los 13 genes
restantes codifican polipéptidos que se sintetizan en ribosomas mi­
tocondriales.
Cada uno de los 13 polipéptidos codificados por el genoma mi­
tocondrial es una subunidad de uno de los co m p lejo s resp ira torios
mitocondriales, las enzimas de múltiples cadenas de la fo s fo r ila ­
ció n ox idativa que están encargadas de la producción de ATP. Sin
embargo, existen casi 100 diferentes subunidades polipéptidas en el
sistema mitocondrial de fosforilación oxidativa y por lo tanto la in­
mensa mayoría la codifican genes nucleares (véase recuadro 9-2). El
genoma nuclear codifica a todas las otras proteínas mitocondriales
y se traducen en ribosomas citoplásmicos antes de llevarse al inte­
rior de las mitocondrias (recuadro 9-2; fig. 1-11).
Código genético mitocondrial
El código genético mitocondrial se usa para descodificar los trans­
critos de cadenas pesada y ligera a fin de proporcionar un total de
sólo 13 polipéptidos. Esta carga funcional muy pequeña permitió
que el código genético mitocondrial derivara del código genético
“universal” (que retienen los genes nucleares por la necesidad de
conservar las funciones de los 30 000 genes). Hay 60 codones mi­
tocondriales de sentido, uno menos que en el código genético nu­
clear, y cuatro codones de detención, dos de los cuales, UAA y
UAG, sirven asimismo como codones de detención en el código ge­
nético nuclear, pero los otros dos son AGA y AGG y especifican ar-
ginina en el código genético nuclear (véase fig. 1-22). UGA
codifica triptófano en lugar de servir como codón de detención y
AUA especifica metionina no isoleucina.
DNA, pero la ploid ía diferencial significa que en algunas células hay
divergencias sustanciales en el contenido de DNA: nuliploidia -c é lu ­
las que carecen en lo absoluto de DNA, tal y com o se observa en m u­
chos tipos de células diferenciadas de modo terminal, como
eritrocitos (que no tienen núcleo) y células de la piel diferenciadas de
modo terminal (sin organelos)-; haploidia -existe la mitad del conteni­
do de DNA de las células diploides en las células óvulo y espermato­
zoo-; poliploidía -algunas células tienen de manera natural muchas
copias del juego normal de cromosomas como resultado de re p lica ­
ción endom itólica (en la cual las células llevan a cabo varias rondas
de duplicación de DNA pero sin ninguna división celular; p. ej., las cé­
lulas de regeneración del hígado y otros tejidos son tetraploides de
manera natural y los megacariocitos gigantes de la médula ósea pue­
den contener hasta 16 veces la cantidad de DNA de células diploides),
o com o efecto de fu sió n c e lu la r s in c itia l (p. ej., las células de las
fibras musculares se form an por fusión de múltiples células y dan
lugar a células únicas con múltiples núcleos; véase fig. 3-3).
El genoma mitocondrial codifica todas las moléculas de rRNA
y tRNA que necesita para sintetizar proteínas, pero se basa en los
genes codificantes nucleares para proporcionar todos los otros com­
ponentes (como los componentes proteínicos de ribosomas mito­
condriales, sintetasas de aminoacil-tRNA, etc.). Puesto que sólo
existen 22 tipos diferentes de tRNA mitocondrial humano, las mo­
léculas de tRNA individuales deben estar disponibles para interpre­
tar varios codones distintos. Ello es posible por el b a m b oleo d e la
ter cer a b a se en la interpretación del codón. Ocho de las 22 mo­
léculas de tRNA tienen anticodones que son capaces de reconocer
familias de cuatro codones que sólo difieren en la tercera base y 14
reconocen pares de codones que son idénticos en las posiciones de
las dos primeras bases y comparten una purina o una pirimidina en
la tercera base. For consiguiente, entre ellas, las 22 moléculas de tR­
NA mitocondrial pueden reconocer un total de 60 codones [(8 X
4) + (14 X 2)].
Además de sus diferencias en la capacidad genética y distintos
códigos genéticos, los genomas mitocondrial y nuclear difieren en
muchos otros aspectos de su organización y expresión (cuadro 9 - 1).
DNA codificante y no codificante
A diferencia de su contraparte nuclear, el genoma mitocondrial hu­
mano es muy compacto: alrededor de 93% de las secuencias de
DNA representa secuencias codificantes. Todos los 37 genes mito­
condriales carecen de intrones y están empacados de forma estrecha
(en promedio uno por 0.45 kb). Las secuencias codificantes de al­
gunos genes (en especial los que codifican las subunidades seis y
ocho de la ATP-asa mitocondrial) muestran cierta superposición
(figs. 9-2 y 9-3) y en casi todos los otros casos las secuencias codifi­
cantes de genes vecinos están contiguas o separadas por una o dos
bases no codificantes. Algunos genes carecen incluso de codones de
terminación; con la finalidad de superar esta deficiencia, tienen que
introducirse codones UAA a nivel postranscripcional (Anderson y
cois., 1981; véase la fig. 9-3).
La única región importante conocida que carece de algún DNA
codificante es la región de desplazamiento del asa (D). Esta es la
región en que se genera una estructura de DNA de cadena triple
 9.1 ORGANIZACIÓN GENERAL DEL GENOMA HUMANO 243

----------------------------------------------------
Recuadro 9-2. A utonom ía lim itada del geno m a m itocondrial

C om ponente m itocondrial C odificado por el genom a m itocondrial C odificado por el genom a nuclear

Componentes del sistema de fosforilación oxidativa 13 subunidades > 80 subunidades

I Deshidrogenasa de NADH 7 subunidades > 41 subunidades
Reductasa de succinato de CoQ 0 subunidades 4 subunidades
i Complejo citocrom o b-c 1 1 subunídad 10 subunidades
V Complejo de oxidasa c de citocrom o 3 subunidades 10 subunidades
. Complejo de sintasa de ATP 2 subunidades 14 subunidades
Componentes del aparato de síntesis de proteínas 24 Cerca de 80
Componentes rRNA 2 rRNA Ninguno
Componentes tRNA 22 tRNA Ninguno
Proteínas ribosómicas Ninguna Cerca de 80
Otras proteínas mitocondriales Ninguna Todas (p. ej., polimerasas de DNA y RNA
mitocondriales aunadas a muchas otras
enzimas, proteínas estructurales y de
transporte, etc.)

Cuadro 9-1. Genomas nuclear y mitocondrial humanos.

Genoma nuclear Genoma mitocondrial

Tamaño 3 200 Mb 16.6 kb

Número de diferentes moléculas de DNA 23 (en células XX) o 24 (en células XY); todo lineal Una molécula de DNA circular

'...mero total de moléculas de DNA por célula 46 en células dlploides, pero varía según sea Con frecuencia varios miles (pero variable;
la ploidia véase recuadro 9-1)

Proteina relacionada Varias clases de proteínas histona y no histona Gran parte sin proteínas

\jm e r o de genes - 3 0 000-35 000 37

Zensidad génlca - 1/100 kb 1/0.45 kb

DNA repetido Más de 50% del genoma, véase figura 9-1 Muy poco

Tfanscripción El mayor volumen de genes se transcribe Con transcripción de múltiples genes de

de modo individual (unidades de transcripción cadenas pesada y ligera (unidades
monocistrónicas) de transcripción policistrónicas)

n ro ne s Se encuentra en la mayor parte de los genes No hay

S de DNA de codificación -1 .5 % -9 3 %

.s o de codón Véase figura 1-22 Véase figura 1-22

: ecombinación Cuando menos una vez por cada par de meiosis No es obvia
homologa

-terencia Mendellana para secuencias en X y autosomas; Materna de manera exclusiva

paterna para secuencias en Y

?•:: la síntesis duplicada de una pieza corta de DNA de cadena H,
que se conoce como DNA 7S (véase fig. 9-2). La replicación de las
hienas H y L es unidireccional y se inicia en sitios de origen espe­
je o s . En la primera, es en el asa D y sólo después de sintetizarse
--i- dos tercios de la cadena H (mediante la cadena L como plan­
tilla y tras desplazar la cadena H antigua) se expone el origen para
la replicación de la cadena L. Con posterioridad, prosigue la repli­
cación de la cadena L en la dirección opuesta y emplea como plan­
tilla la cadena H (fig. 9-2). El asa D contiene también el promotor
predominante para la transcripción de las cadenas H y L. A dife­
rencia de la transcripción de genes nucleares, en la que casi siempre
se transcriben por separado genes individuales con promotores se­
parados, la transcripción del DNA mitocondrial se inicia desde los
promotores en la región del asa D y continúa en direcciones opuestas.
244 CAPÍTULO NUEVE ORGANIZACIÓN DEL GENOMA HUMANO

I----------------------A TP -asa8 -

8 366 8 522 8 577 9 202 9 206

1 53 6 8

M et P ro Lis Trp Tre Lis lie C is S e r L eu H is S e r Leu P ro P ro G ln S e r D e te n c ió n )

a t g -----------\ --------- c c Á a a a t g a a c g a a a a t c t g t t c g c t t c a t t c a t t g c c c c c a c a a t c c t a g g c c t a ACATA $
M e tA s n G lu A sn Leu F e A la S e r F e lie A la P ro Tre lie Leu Gli Leu Tre ¿
-I 17 226
I---------------------- A TP-asa 6 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------►

Fig. 9-3. Los genes de las subunidades 6 y 8 de ATP-asa mitocondrial se superponen y traducen de manera parcial en diferentes marcos
de lectura.

Nota: los genes superpuestos comparten una cadena en sentido común, la cadena H. Las coordenadas de la secuencia de codificación son las siguientes:
subunidad 8 de ATP-asa, 8 366-8 569; subunidad 6 de ATP-asa, 8 527-9 204. La terminal C del gen de la subunidad 6 de ATP-asa está definida por
la introducción postranscripcional de un codón UAA: después de la transcripción se corta el RNA más allá de la posición 9 206 y se poliadenila y el
resultado es un codón UAA en el que los dos primeros nucleótidos derivan de TA en las posiciones 9 205-9 206 y el tercer nucleótido es la primera A
de la cola poli(A). Se sabe que otros genes humanos están superpuestos, pero con frecuencia se transcriben a partir de cadenas opuestas.

para las dos cadenas diferentes, alrededor del círculo a fin de gene­
rar grandes transcritos multigénicos (véase fig. 9-2). De forma sub­
secuente, se generan los RNA maduros por el corte de transcritos
multigénicos.
9.1.3 El genoma nuclear consiste en 24 moléculas
de DNA diferentes que corresponden a los
24 cromosomas humanos distintos
Tamaño y estructura de los cromosomas humanos
De forma característica, el núcleo de una célula humana contiene
más de 99% del DNA celular (excepto algunas células especializa­
das, sobre todo el oocito; véase el recuadro 9-1). El genoma nuclear
está distribuido entre 24 tipos distintos de moléculas de DNA li­
neal de doble cadena, cada una de las cuales tiene histonas y otras
proteínas no histona enlazadas a ellas para conformar un cromoso­
ma. Los 24 diferentes cromosomas (22 tipos de autosomas y dos
cromosomas del sexo, X e Y) pueden distinguirse con facilidad con
las técnicas de bandeo cromosómico (fig. 2-15) y en gran parte se
clasificaron en grupos de acuerdo con el tamaño y, en cierto grado,
con la posición del centrómero (cuadro 2 - 3 ).
El DNA seleccionado para secuenciación en el Proyecto del Ge­
noma Humano no fue el genoma nuclear total, sino la p o r ció n eu -
crom á tica , que comprende casi 3 000 Mb. También existen más de
200 kb de h etero cro m a tin a co n stitu tiv a condensada de manera
permanente y en regiones inactivas en sentido transcripcional, que
proporcionan un tamaño total del genoma del orden de 3 200 Mb.
Por consiguiente, el tamaño promedio de un cromosoma humano
se aproxima a 140 Mb, pero con una variación considerable entre
los cromosomas y cantidades variables de heterocromatina consti­
tutiva (cuadro 9-2). La última comprende segmentos de alrededor
de 3 Mb en cada centrómero además de componentes grandes en
varios cromosomas, incluidos los brazos cortos de los cromosomas
acrocéntricos 13, 14, 15, 21 y 22, el brazo largo del cromosoma Y
y las regiones grandes de los brazos largos de los cromosomas 1, 9
y 16 (que corresponden a constricciones cromosómicas secundarias-,
véase cuadro 9-2 y fig. 2-15 para una visión gráfica).
Composición de bases del genoma nuclear humano
El esquema de las secuencias del genoma humano (International
Human Cenóme Sequencing Co'nsortium, 2001; Venter y cois., 2001)
sugiere un promedio de 41% de GC de la extensión del genoma
para el componente de eucromatina. Sin embargo, la composición de
bases varía en grado considerable entre los cromosomas, de 38%
de GC para los cromosomas 4 y 13 hasta 49% en el cromosoma
19. De igual modo, varía con amplitud a lo largo de los cromoso­
mas. Por ejemplo, el contenido promedio de GC en el cromosoma
17q es de 50% en las 10.3 Mb distales pero disminuye a 38% en
las 3.9 Mb adyacentes. Existen regiones de menos de 300 kb con
variaciones incluso más amplias del contenido de GC, por ejemplo
de 33.1 a 59.3%.
Hay una correlación clara entre la composición de GC y el grado
de tinción con Giemsa durante el bandeo cromosómico. Por ejem­
plo, 98% de las clonas de inserto grande que mapean las bandas G
más oscuras está en regiones de 200 kb con un contenido bajo de GC
(promedio de 37%), mientras que más de 80% de las clonas que ma­
pean las bandas G más claras se halla en regiones de alto contenido
de GC (promedio de 45%). Sin embargo, los análisis de datos no
apoyan la existencia de isócoros estrictos, que se definen como regio­
nes a gran escala de composición homogénea y se clasifican en cinco
grupos, según sea el diferente porcentaje de composición de GC (In­
ternational Human Genome Sequencing Consortium, 2001).
La proporción de algunas combinaciones de nucleótidos puede
variar en grado considerable. Por ejemplo, al igual que otros genomas
nucleares de vertebrados, el genoma nuclear humano tiene una esca­
sez notable del dinucleótido CpG (es decir, próximo a residuos de ci-
tosina y guanina en la misma cadena de DNA en la dirección 5' 3';
“p” indica enlace fosfodiéster). Al tomar en cuenta la cifra promedio
total de 41% de GC, las frecuencias de bases individuales son C =
G = 0.205 y, por consiguiente, la frecuencia esperada del dinucleóti­
do CpG es (0.205)2 = 0.042. Sin embargo, la frecuencia de CpG ob­
servada se aproxima a la quinta parte. A pesar de la falta general de
CpG, ciertas regiones pequeñas de DNA activas en sentido transcrip­
cional tienen la densidad esperada de CpG y, de manera importante,
no están metiladas (islotes CpG, véase recuadro 9-3).
 9.1 I ORGANIZACIÓN GENERAL DEL GENOMA HUMANO 245

Cuadro 9-2. Contenido de DNA de cromosomas humanos.

Cromosoma Cantidad total Cantidad de Cromosoma Cantidad total Cantidad de
de 0NA (Mb) heterocromatina (Mb) de DNA (Mb) heterocromatina (Mb)

1 279 30 13 118 16

2 251 3 14 107 16

3 221 3 15 100 17

4 197 3 16 104 15

5 198 3 17 88 3

6 176 3 18 86 3

7 163 3 19 72 3

8 148 3 20 66 3

9 140 22 21 45 11

10 143 3 22 48 13

11 148 3 X 163 3

12 142 3 Y 51 27

Datos resumidos del International Human Genome Sequence Consortium (2001). Al utilizar estas cifras, el tamaño del genoma humano total es de 3 289 Mb, pero se sabe
que esta cifra (y las cantidades totales de cromosomas individuales) incluye algunas duplicaciones artefactuales; un valor más realista podría ser ~ 3 200 Mb.

9.1.4 El genoma humano contiene alrededor de 30 000
a 35 000 genes distribuidos de forma irregular
pero las cifras son inexactas
Número de genes humanos
En la actualidad se piensa que la cifra total de genes del genoma hu­
mano oscila entre 30 000 y 35 000. Dado que con excepción de 37
de ellos todos se localizan en el genoma nuclear, esto proporciona
un estimado general de 1 400 genes por cromosoma en promedio.
La gran mayoría de estos genes codifica polipéptidos, pero una mi­
noría importante (cuando menos 5% y tal vez alrededor de 10 %)
especifica moléculas de RNA no traducidas (sección 9.2).
El International Human Genome Sequencing Consortium (2001)
v Venter y colaboradores (2001) estimaron 30 000 a 40 000 y 26 000
a 38 000 genes, respectivamente, aunque apoyaron las predicciones
más cercanas a las cifras inferiores de estos límites. Estos cálculos
fueron mucho más bajos que los anteriores basados en grupos de
datos incompletos (véase sección 8.3.5), pero hay una gran incer-
ridumbre acerca del número preciso de genes. En primer lugar,
existen dificultades generales para identificarlos. Cuando se publicó
el esquema de secuencias del genoma en el año 2 0 0 1 , se identifi­
caron con seguridad alrededor de 11 000 genes y mediante análisis
de secuencias basados en computadora se predijeron muchos miles
más. La predicción de genes que codifican polipéptidos basada en
computadora suele ser muy útil, pero no siempre es segura (falso-
positivos y falta de precisión en la identificación de exones genui-
nos; véase Zhang, 2002). Es en especial mala la predicción de genes
RNA basada en computadora; véase la sección 8.3.5.
La cifra de genes humanos comparativamente baja fue una sor­
presa. Después de todo, en el gusano redondo de 1 mm de largo,
muy simple, Caenorhabditis elegans (que consiste sólo en 959 célu­
las somáticas y tiene un genoma de una trigésima parte del tamaño
del genoma humano), se demostró con anterioridad que posee
19 099 genes que codifican polipéptidos y más de 1 000 genes
RNA (consorcio de secuenciación de C. elegans, 1998). Es posible
que la complejidad del genoma no siempre sea paralela a la com­
plejidad biológica (Drosophila melanogaster tiene de manera sustan­
cial menos genes que C. elegans), pero los genomas secuenciados de
invertebrados (p. ej., insectos, gusanos redondos, erizo de mar)
tienden a mostrar un orden de 14 000 a 20 000 genes, en tanto que
los vertebrados (seres humanos, ratón, pez soplador, etc.) se incli­
nan hacia una cifra aproximada de 30 000 a 35 000 (véase cuadro
12-4). También suele explicarse la baja cifra inesperada de genes a
partir del incremento muy grande de la complejidad transcripcio-
nal que se esperaría a medida que aumenta el número de genes, por
ejemplo de 20 000 a 30 000 (Claverie, 2001) y la complejidad adi­
cional que cabe esperar por la frecuencia mayor de empalme (corte
y unión) alternativo en genomas complejos (Maniatis y Tasic,
2002; véase sección 10.3.2).
Distribución de genes humanos
Los genes humanos no están distribuidos de manera uniforme en
los cromosomas. Las regiones constitutivas de heterocromatina ca­
recen de genes pero incluso dentro de la porción eucromática del
genoma puede variar de manera sustancial la densidad génica entre
regiones cromosómicas y asimismo en los cromosomas completos.
246 CAPÍTULO NUEVE ORGANIZACIÓN DEL GENOMA HUMANO

Recuadro 9-3. Metilación del DNA e islotes CpG

Es probable que la metilación del DNA tenga sitios biológicos diferentes.

En algunas especies, como la levadura S. cerevisiae y el gusano redondo
C. elegans, al parecer no ocurre en absoluto; en muchas otras tiene sitios
relevantes. En bacterias, la metilación del DNA se restringe en gran parte
a una proporción de residuos adenina y citosina y quizá actúa como un
mecanismo de defensa del huésped: las endonucleasas de restricción de
la célula huésped reconocen y cortan DNA fago invasor (no metilado) en
secuencias de tecot\oc\m\en\o especificas, peto \as mismas secuencias
en el DNA huésped están metiladas de forma especifica y por consiguien­
te protegidas de segmentación (véase recuadro 5-2).
Cuando ocurre en metazoarios (animales multicelulares), la metilación del
DNA suele incluir la metilación de una proporción de residuos de citosina,
con 5-m etilcitosina (Cm) resultante. En D. melanogaster, la cantidad de
metilación de DNA es muy baja y casi toda la 5-metilcitosina se encuen­
tra en dinucleótidos CpT (Cmpt). En otros animales, el dinucleótido CpG
es un blanco común para la metilación de citosina mediante metiltransfe-
rasas de citosina específica y forma CmpG (véase figura, grupo A). Los
genomas de la mayor parte de los Invertebrados -aparte de D rosophila-
tienen valores moderadamente altos de CmpG que se encuentra concen­
trado en dominios grandes de DNA metilado separado por dominios tam ­
bién grandes de DNA no metilado (m etilación en m osaico).
Los vertebrados muestran los valores más altos de 5-metilcitosina en el
reino animal y en este caso la metilación está diseminada en la totalidad
del genoma. Se sabe que la metilación del DNA tiene consecuencias im ­ / c\
HN C -C H ,
portantes para la expresión génica y permite que patrones particulares de
ella se transmitan de manera estable a células hijas (sección 10.4.2). Se CH
ha sugerido asimismo que proporciona una forma de defensa de huésped NH
contra transposones (sección 10.4.3). Aunque la metilación está disemi­ Tim in a
nada en la totalidad del genoma de vertebrados, sólo un porcentaje pe­ (formas de incompatibilidad con G;
queño de citosinas está metilado (alrededor de 3% en el DNA humano, reconocida de manera ineficiente por
el sistema de reparación del DNA)
sobre todo como CmpG con un porcentaje pequeño como CmpNpG, en el
que N es cualquier nucleótido).
A) La citosina en los dinucleótidos CpG es un blanco para metilación en
Desde el punto de vista químico, la 5-metilcitosina es inestable y propen­ el carbono 5 y forma 5-metilcitosina.
sa a desaminación, lo que tiene com o resultado timina (véase la figura, Esta última se desamina de forma espontánea para formar timina (T), a la que
grupo A). Las otras bases también son propensas a desaminación (p. e j„ reconoce de manera insuficiente el sistema de reparación del DNA y por tanto
la citosina no metilada es proclive a la desaminación para formar uraci- tiende a persistir (empero, la desaminación de citosina no metilada forma uracilo,
al que sí reconoce el sistema de reparación del DNA). El dinucleótido CpG de los
lo). Durante periodos prolongados de la evolución disminuyó de manera
vertebrados se sustituye de modo gradual por TpG y CpA.
gradual el número de dinucleótidos CpG en el DNA de vertebrados debi­
do a la conversión lenta pero constante de CpG en TpG (y en CpA en la
cadena complementaria). Aunque la frecuencia total de CpG en el geno­ se extienden cientos de nucleótídos, con frecuencia al marcar los extre­
ma de vertebrados es baja, hay tiras pequeñas de DNA no metilado que mos 5' de genes. Cuando se filtró el esquema de la secuencia del geno­
se caracterizan por tener la frecuencia CpG esperada normal. Estos Islo­ ma humano para eliminar secuencias de DNA no codificante repetidas
tes de densidad de CpG norm al (islotes CpG) son en términos compara­ con número alto de copias, se identificaron alrededor de 30 000 islotes
tivos abundantes en GC (de manera característica más de 50% de GC) y CpG (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001).
 9.2 ORGANIZACIÓN, DISTRIBUCIÓN Y FUNCIÓN DE GENES RNA HUMANOS
La primera información general sobre la distribución de genes en el
genoma completo se obtuvo después de hibridar fracciones de islo­
tes CpG purificados del genoma a cromosomas en metafase. Con
base en lo anterior, se concluyó que la densidad génica debe ser al­
ta en regiones subteloméricas y que algunos cromosomas (p. ej., 19
y 22) tienen abundancia de genes en tanto que otros (como X, 18)
son escasos en ellos (fig. 8-4). Las predicciones de la densidad dife­
rencial de islotes CpG y génica se confirmaron más adelante cuan­
do se publicaron esquemas de secuencias que incluían alrededor de
90% del genoma (International Human Genome Sequencing Con-
sortium, 2001 ).
La diferencia en el porcentaje de GC entre las bandas pálidas y
oscuras con Giemsa indica asimismo densidades génicas diferencia­
les porque los cromosomas (p. ej., el 19) y las regiones (como las
bandas G pálidas) abundantes en GC también son comparativa­
mente abundantes en genes. Por ejemplo, el complejo de antígeno
de leucocitos humanos (HLA) ricos en genes (180 genes en un tra­
mo de 4 Mb) está localizado dentro de la banda pálida 6p21.3, en
tanto que una completa de 2.4 Mb de DNA que al parecer está de­
dicada casi de modo exclusivo al gen único mammoth, el gen de la
distrofina, está situada dentro de una banda G oscura.
9.2 Organización, distribución y
función de genes RNA hum anos
Aunque la gran mayoría de los genes humanos codifica polipépti-
dos (sección 9.3), una minoría significativa especifica moléculas de
RNA no codificante (esto es, no traducidas) como su producto fi­
nal y también se describen como genes RNA (Eddy, 2001; Hutten-
hofer y cois., 2002; Storz, 2002; véase asimismo la base de datos de
RNA no codificante en http://biobases.ibch.poznan.pl/ncRNA/). El
genoma mitocondrial es excepcional porque 65% (24/37) de los
genes especifica moléculas RNA maduras pero incluso en el geno­
ma nuclear tal vez haya alrededor de 3 000 genes RNA, que cons­
tituyen casi 10% del número total de genes (fig. 9-4).
Es probable que los estimados actuales del número de genes RNA
sean conservadores (por la dificultad para identificar genes RNA en
DNA secuenciado; véase sección 8.3.5). En análisis amplios de
transcritos de ratón (sección 9.2.3) y en los basados en microcon-
figuraciones de transcritos de los cromosomas humanos 21 y 22
(Kapranov y cois., 2002) se interpretó que sugieren muchos más trans­
critos que los esperados por las cifras génicas previstas. Además de
los genes RNA, hay muchos fragmentos de seudogenes/genes rela­
cionados, en especial en los genes RNA transcritos por la polime-
rasa 111 de RNA.
En común con otros genomas celulares, la mayor parte de los
genes RNA conocidos está dedicada a elaborar moléculas que ayu­
dan en el proceso general de expresión génica (fig. 9-4). Algunos, de
forma notable las familias rRNA y tRNA, participan en la traduc­
ción de mRNA. Muchas otras familias de RNA están relacionadas
con la maduración d el RNA e incluyen corte y modificación específica
de bases de otras moléculas de RNA (mRNA, rRNA, tRNA y otras
especies de RNA). Además, en fecha reciente se identificó un nú­
mero notorio de otros genes RNA que pertenecen a diferentes cla­
ses de RNA. Muchos tienen, o se espera que tengan, funciones
reguladoras de importancia y resaltan la diversidad funcional muy
considerable de las moléculas de RNA (cuadro 9-3; sección 9.2.3).
247
I snoR N A
-2 0 0 -1 7 5
-100 M H f sn R N A
■ m iR N A
17 5 I I rR N A
[ I tR N A
E3 RNA
•250 an tisen tid o
500
Fig. 9-4. Genes RNA humanos de acuerdo con la clase.
La mejor estimación (hacia mediados del año 2003) era de más de
3 000 genes RNA humanos distribuidos entre las diferentes clases que
se muestran. Nota: a) por razones operacionales (véase texto), el
esquema de las secuencias del genoma humano excluyó grupos
génicos rRNA y las cifras que se proporcionan se estimaron a partir de
otros datos; 6) debido a la dificultad para identificar genes RNA (véase
sección 8.3.5), es posible que el número de algunas categorías de
RNA pequeñas, como los miRNA, sean grandes subestimaciones; c) la
cifra predicha de genes RNA antlsentido se basa en datos de Collins y
colaboradores (2003) y está apoyada por análisis equivalentes en el
ratón (véase FANT0M Consortium y el RIKEN Genome Exploration
Research Group Phase I & II Team, 2002).
9.2.1 Un total de casi 1 200 genes humanos codifican
rRNA o tRNA y están organizados sobre todo en
grupos génicos grandes
Genes RNA ribosómicos (rRNA)
Existen alrededor de 700 a 800 genes rRNA humanos, organizados
en particular en grupos de repetición tándem y muchos seudogenes
relacionados. Las familias multigénicas homogéneas que ocurren en
arreglos tándem están representadas menos en el esquema de se­
cuencias del genoma humano (debido a la selección de enzimas de
restricción utilizadas en la elaboración de genotecas de BAC y la de­
cisión para posponer la secuenciación de BAC con huellas digitales
de baja complejidad que indican DNA de repetición tándem). Co­
mo resultado, podría suponerse el número preciso de genes rRNA
a partir del esquema de secuencias del genoma humano.
Además de las moléculas mitocondriales de rRNA 16S y 23S,
existen cuatro tipos de tRNA citoplásmico, tres vinculados con la
subunidad ribosómica grande (rRNA 28S, 5.8S y 5S) y uno con la
subunidad ribosómica pequeña (rRNA 18S). De ellos, a los rRNA
28S, 5.8S y 18S los codifica una u tiid a d d e tra n scrip ció n ú n ica
(véase fig. 10 - 2 ) que está organizada en cinco grupos, cada uno con
30 a 40 repeticiones tándem, localizados en los brazos cortos de los
cromosomas humanos 13, 14, 15, 21 y 22.
Los genes rDNA 5S ocurren asimismo en configuraciones tán­
dem, de las cuales la más grande se encuentra en los cromosomas
lq4l-42, cerca del telómero. Existen 200 a 300 genes 5S verdaderos
en estos arreglos pero al parecer hay muchos seudogenes dispersos. La
245 CAPÍTULO NUEVE ORGANIZACIÓN DEL GENOMA HUMANO

Cuadro 9-3. Diversidad funcional del RNA humano.

Clase de RNA Ejem plos Función

A) CLASES PRINCIPALES DE RNA QUE PARTICIPAN EN LA EXPRESIÓN GÉNICA GENERAL

RNA ribosómico (rRNA) 16S rRNA Componente de la subunldad ribosómica mitocondrial pequeña (fig. 9-2)
23S rRNA Componente de la subunidad ribosómica mitocondrial grande (fig. 9-2)
28S, 5.8S, y 5S rRNA Componentes de la subunidad ribosómica citoplásmica grande (fig. 10-2)
18S rRNA Componente de la subunidad ribosómica citoplásmica pequeña (fig. 10-2)

RNA de transferencia (tRNA) 22 tipos de tRNA mitocondrial Enlace a codones en mRNA mitocondrial (fig. 9-2)
49 tipos de tRNA citoplásmico Enlace a codones en mRNA citoplásmico (fig. 9-4)

RNA nuclear pequeño (snRNA) Muchos, incluidos:

(participa en el empalme de RNA) U 1,U 2, U4 y U6 snRNA Componentes de espliceosomas mayores
U5snRNA Componente de espliceosomas mayores y menores
U4acat, U6acat, U11 y U12 snRNA Componentes de espliceosoma menor
U7snRNA Terminación transcripcional de mRNA de histona

RNA nucleolar pequeño (snoRNA) Más de 100 tipos diferentes:

(participa en la modificación y cerca de 80 C/D box snoRNA Metilación específica de sitio del grupo OH 2 ' de rRNA
procesamiento del RNA) cerca de 15 H/ACA snoRNA Modificación específica de sitio de rRNA por formación de seudouridina
U 3 y U8 snoRNA Procesamiento de rRNA

B) OTRAS CLASES DE RNA (véase también base de datos de RNA no codificante en http://biobases.ibch.poznan.pl/ncRNA/)

Micro-RNA Cuando menos 200 clases Moléculas de RNA regulador (sección 9.2.3) muy pequeñas
probables (—22 nucleótidos)

Inactivación del cromosoma X X/S7RNA Véase sección 10.5.6

relacionado 75/XRNA Véase sección 10.5.6

Impronta relacionada Muchos, p. ej., RNAW79 Véase figura 10-24 para algunos ejemplos

Específica de sistema nervioso p. ej., RNA BC200 ?

RNA antisentido Tal vez alrededor de 1 500 tipos p. ej., a H0XA11, MSX1, etc. (véase fig. 10-24)

Otras Telomerasa de RNA Componente de telomerasa (sección 2.2.5)

PC43RNA Antígeno 3 de cáncer de próstata
PCGEMmm Expresado en gran exceso en cáncer de próstata
Sfí/IJRNA Coactivador específico de varios receptores de esferoides
TTY2RNA Familia específica de testículo
7SKRNA Regulador transcripcional negativo del alargamiento de polimerasa II de RNA
7SLRNA Componente de la partícula de reconocimiento de señal para proteínas de
transporte

principal justificación para la repetición de genes rRNA citoplás-
micos se basa en dosis de genes: con una cifra comparativamente
grande de estos genes, la célula puede satisfacer la demanda enor­
me de ribosomas citoplásmicos necesarios para la síntesis de pro­
teínas.
Genes RNA de transferencia (tRNA)
Además de los 22 genes tRNA mitocondriales, el esquema de se­
cuencias del genoma humano publicado en 2001 reveló un total de
497 genes nucleares que codifican moléculas de tRNA citoplásmi-
cas y 324 posibles seudogenes derivados de tRNA. Por consiguien­
te, al parecer, los seres humanos tienen menos genes que especifican
tRNA citoplásmico que un gusano (584), pero más que la mosca
(284). En metazoarios, el número de genes tRNA no se relaciona
con la complejidad del organismo, sino más bien con demandas es­
peciales para abundancia de tRNA en ciertos tejidos o etapas del
desarrollo embrionario (p. ej., la rana Xenopus laevis tiene oocitos
grandes que deben estar cargados cada uno con 40 ng de tRNA; la
demanda alta de tRNA se satisface al disponer de miles de genes
tRNA).
Los 497 genes tRNA citoplásmicos pueden agruparse en 49 fa­
milias según sean sus especificidades de anticodón. Aunque el có­
digo genético universal proporciona 61 codones de sentido
diferentes que deben reconocer los anticodones en moléculas de
tRNA, el bamboleo en la posición de la tercera base de los codones
significa que cuando la posición de la tercera base en un codón es
pirimidina (U o C), un anticodón aislado puede formar un par de
bases con los dos codones alternativos. La elección del anticodón
para interpretar codones humanos alternativos sigue reglas genera­
les para el tRNA citoplásmico eucariota (recuadro 9-4). Con base
en ello, cabría predecir un total de 46 clases diferentes de tRNA hu­
mano pero, a pesar de la generalidad del bamboleo de la tercera ba­
se, tres pares de estos codones [AU(U/C), UA(U/C), AA(U/C)]
son sensibles al parecer a dos anticodones cada uno y por consi­
guiente hay tres clases adicionales de tRNA (véase fig. 9-5). Sólo
 9.2 ORGANIZACIÓN, DISTRIBUCIÓN Y FUNCIÓN DE GENES RNA HUMANOS
Recuadro 9-4. Especificidad de anticodón del tRNA citoplásmico eucariota
Como en la interpretación de codones mitocondriales (sección 9.1.2), el
bam boleo de la te rcera base significa que no hay una correspondencia
1:1 entre los codones de mRNA citoplásmico y los anticodones tRNA que
los reconocen. En este caso, mediante un anticodón aislado pueden re­
conocerse codones alternativos que difieren porque tienen una C o U en
la tercera posición de bases. Las reglas de descodificación para codones
de mRNA citoplásm ico son las siguientes:
► codones en "cajas de dos codones" (codones que terminan con ü/C
que codifican un aminoácido diferente en comparación con los que
terminan con A/G). En este caso, una G en la posición base 5 ' en el
anticodón tRNA descodifica de manera característica la posición
bamboleante U/C. Por lo tanto, no hay un tRNA con un anticodón &AA
para correspondencia con el codón UUJ! para Fe, pero el anticodón
6AA puede reconocer codones UUU y UUC en el mRNA (véase fig.
9 -5 )-;.
► codones no glicina en “ cajas de cuatro codones" (codones en los
que U, C, A y G en la posición bamboleante codifican el mism o am i­
noácido, pero no la glicina). En este caso, la posición bamboleante
U/C la descodifica una inosina (I) en la posición 5 ' en el anticodón
(la inosina se produce p o r m odificación postranscripcional de una
adenina: se sustituye el grupo amino en el carbón 6 de la adenosina
existe una correlación muy general del número de genes tRNA hu­
manos con la frecuencia de aminoácidos (cuadro 9-4).
Aunque, al parecer, los genes tRNA están esparcidos en la tota­
lidad del genoma humano (con excepción de los cromosomas 22 y
Y, se encuentran en todos los cromosomas), hay un agrupamiento
notable. Más de la mitad de ellos (280 de 497) reside en el cromo­
soma 6 (que contiene 140 genes tRNA, incluidos casi todos los ti­
pos diferentes de gen tRNA, en una región de sólo 4 Mb en 6p2)
o el 1 (en donde están agrupados de forma laxa muchos de los ge­
nes tRNA de Asn y Glu). Además, muchos de los otros genes tR­
NA están agrupados; por ejemplo, 18 de los 30 tRNA de Cis se
hallan en una tira de 0.5 Mb del cromosoma 7.
9.2.2 Los RNA nuclear y nucieolar pequeños están
codificados por familias génicas grandes
esparcidas en una gran proporción
Además del rRNA y el tRNA, otras dos clases mayores de RNA
participan en la ayuda de la expresión génica general: el RNA nu­
clear pequeño (snRNA) y el RNA nucieolar pequeño (snoRNA).
Los codifican familias de casi 100 genes (snRNA) o un poco más
(snoRNA) que, aunque diseminadas, muestran cierto agrupamien­
to de subfamilias.
Genes RNA nucleares pequeños (snRNA)
El conjunto heterogéneo de moléculas RNA nucleares pequeñas
(snRNA) incluye muchas con uridina abundante y se denominan
de la forma correspondiente; por ejemplo, snRNA U3 representa el
tercer RNA nuclear pequeño rico en uridina por clasificar. Varios
son del tipo RNA espliceosómico y se requieren para la función de
los espliceosomas mayor y menor (véase cuadro 9-3) y una familia
de más de 80 genes los codifica. Más de 70 de estos genes especifi­
249
v'- ¿ " .- y ■
m Sm m m m ím tm
p o r un grupo carbonilo C = 0 ). Por ejemplo, a los codones GUS1 y
GU£ de la caja valina de cuatro codones los descodifica un tRNA con un
anticodón de AAC, que sin duda se modifica en JAC. Además del pa-
reamiento de bases con C y ü, la inosina también puede formar un
par de bases con A (y por consiguiente el anticodón |AC puede reco­
nocer a cada uno de GUU, GU£, GUfi). A fin de evitar una posible lec­
tura traduccional errónea, en cajas de dos codones no pueden
utilizarse tRNA con inosina en la base 5 ’ del anticodón-;
► codones de glicina. Un anticodón SCC, en lugar del anticodón ICC
esperado, codifica los codones GGU y GGC.
Sólo se requieren 16 anticodones para descodificar los 32 codones ter­
minales en una pirimidína. Por consiguiente, el grupo mínímo de antico­
dones es de 61 (el número de diferentes codones de sentido), menos 16
= 45. No obstante, además de un tRNA especializado lleva un anticodón
al codón UGA (que en condiciones normales funciona como un codón de
detención). En estados de selenio alto, esta tRNA codifica UGA sólo en un
número muy pequeño de casos a fin de insertar el 2 1 o. aminoácido, se/e-
nocisteina, en un grupo selecto de selenoproteinas" (todos los cuales
tienen actividades de oxidorreducción [rédox]; en mamíferos, la reducta-
sa de tiorredoxina y la peroxídasa de glutatión son de las selenoproteinas
que se encuentran de modo más amplio).
can snRNA utilizados en el espliceosoma mayor; incluyen 44 genes
identificados que especifican snRNA U 6 y 16 que especifican snR­
NA U l.
Algunas pruebas indican agrupamiento, sobre todo en el caso
de las familias snRNA U l y U2; empero, debido a la forma en que
se seleccionaron los BAC para obtener el esquema de las secuencias
del genoma (véase antes), hay una representación menor en la se­
cuencias del esquema. Se sabía con anterioridad que los genes RNA
U2 se localizaban en el locus RNU2, una estructura tándem de 6 .1
kb unidades casi idénticas en 17q21-q22 que es muy variable en el
número de unidades repetidas (de seis a más de 30 repeticiones).
Los genes RNA U 1 están agrupados con alrededor de 30 copias en
el locus RNU1 en lp36.1, aunque se piensa que este agrupamien­
to está organizado en forma laxa e irregular. Existe un gran número
de secuencias no funcionales relacionadas (seudogenes, fragmentos
génicos, etc.); por ejemplo, se han identificado 1 135 secuencias re­
lacionadas con snRNA U 6 en el esquema de secuencias (Internatio­
nal Human Genome Sequencing Consortium, 2001).
Genes RNA nucleolares pequeños (snoRNA)
Una familia grande de RNA nucleolares pequeños (snoRNA) se
usa en especial en el nucléolo para dirigir o gu iar modificaciones de
bases específicas de sitio en rRNA (Smith y Steitz, 1997; Filipo-
wicz, 2000 ), pero también se sabe que llevan a cabo modificaciones
de bases en otros RNA estables, incluido el snRNA U 6 . Existen dos
subfamilias. La snoRNA caja C/D participa sobre todo en la guía
de las metilaciones 2'-0-ribosa específicas de sitio (hay 105 a 107 va­
riedades de esta metilación en rRNA). Los genes snoRNA H/ACA
intervienen sobre todo en la guía de seudouridilaciones específicas de
sitio (en las que se isomeriza la uridina para formar seu d ou rid in a ,
la base modificada más común; para el rRNA se requieren 95 seu­
douridilaciones diferentes).
250 CAPÍTULO NUEVE ORGANIZACIÓN DEL GENOMA HUMANO

UUU AAAO UCU AG A10 UAU AUA 1 UGU ACAO

Fe
UUC A G AA14 UCC
7 GGAO T ir
UAC G UA11
C is
UGC
\
G CA 30
Ser
UUA ~ UAA 8 UCA UGA 5 Detención — U A A UUA 0 Detención ~ UGA U C A 0*
Leu
UUG ~ CAA 6 UCG CGA 4 Detención ~ UAG CUAO Trp ~ UGG CCA 7

CUU A A G 13 CCU A G G 11 CAU AUG 0 CGU ACG 9

H is
CUC GAGO CCC GGGO CAC G U G 12 CGC GCG 0
Leu Pro A rg
CUA UAG 2 CCA U G G 10 CAA U U G 11 CGA UCG 7
G ln [
CUG CAG 6 CCG CGG 4 CAG C U G 21 CGG CCG 5

AUU A A U 13 ACU AGU 8 AAU AUU 1 AGU ACUO

lie
AUC GAU 1 ACC GGU 0
A sn
AAC G U U 33
S er
AGC
\ GCU 7
Tre
AUA UAU 5 ACA U G U 10 AAA U U U 16 AGA UCU 5
Lis A rg i
M et AUG C A U 17 ACG CGU 7 AAG C U U 22 AGG CCU 4

~ GUU - J A A C 20 ~ GCU y A G C 25 " GAU AUCO GGU ACC 0

GUC GAC 0 GCC GGC 0
A sp
- GAC G U C 10 GGC
\ G C C 11
Val A la Gli
GUA ~ UAC 5 GCA ~ U G C 10 “ G A A — U U C 14 GGA UCC 5
G lu
L GUG - C A C 19 - GCG - CGC 5 - GAG — C U C 8 GGG CCC 8

Fig. 9-5. Número de genes tRNA humanos clasificados de acuerdo con el anticodón.

Los codones están unidos por líneas a los anticodones (no modificados) en el lado derecho. Las líneas unidas en forma de V enlazan codones alternativos
que terminan en una U o C que pueden descodificarse por la acción de un anticodón aislado debido al bamboleo de la tercera base. El número siguiente
de cada anticodón es el número de genes humanos que codifican tRNA con ese anticodón. Por consiguiente, por ejemplo, en la parte superior del lado
izquierdo se observa que el codón de fenilalanina UUU no lo descodifica un anticodón AAA, ya que no hay genes tRNA que lleven ese anticodón. Las
adeninas sombreadas casi con seguridad se modifican como ¡nosinas (véase recuadro 9-4). Nota: a) a pesar de la provisión de la tercera base
bamboleante, los genes únicos codifican al parecer tRNA con anticodones que quizá no se esperaba que se necesitaran (AUA, AUU y GAU); b) el
asterisco a continuación del anticodón UCA significa que hay un tRNA poco común que lleva este anticodón, que en ocasiones interpreta un subgrupo
pequeño de codones UGA como selenocisteína en lugar de detención; véase recuadro 9-4. Modificado de International Human Genome Sequencing
Consortium (2001), Nature 409, 860-921, con autorización de Nature Publishing Group.

Los snoRNA aislados especifican una, o cuando mucho dos, de
estas modificaciones. Los snoRNA se encuentran con frecuencia
dentro de los intrones de otros genes y aunque al parecer casi todos
los genes snoRNA son de copia única y están esparcidos, se cono­
cen algunos grupos grandes, entre ellos dos que se hallan dentro de
la unidad de transcripción grande SNURF-SNRPN tn 15q. Los úl­
timos genes se imprentan de manera paterna, se expresan en el ce­
rebro y se considera que poseen un papel relevante en el síndrome
de Prader-Willi (véase fig. 10-24 y las referencias que incluye).
9.2.3 Los micro-RNA y otros RNA reguladores nuevos
son desafiantes preconcepciones sobre
la extensión de la función del RNA
Los libros de texto suelen insistir en la importancia de las proteínas
como puntos finales de la expresión génica por la amplia variedad
de sus funciones y su importancia en la regulación de la expresión
génica. Por lo general, las moléculas de RNA se han considerado
menos importantes (¡el artículo de Venter y cois., 2001, del esque­
ma de Celera de la secuencia del genoma, no presentó ningún aná­
lisis sobre genes RNA humanos!). No obstante, en años recientes,
diversos descubrimientos han llevado a una revaloración radical de
la función del RNA. El reconocimiento en 1982 de que algunas
moléculas de RNA podrían tener una función catalítica (y en con­
secuencia actuar como una ribozima) condujo a la identificación
de funciones catalíticas en varios otros tipos de RNA. Se incluyen
aquí rRNA (datos recientes de cristalografía con rayos X indican
que el rRNA cataliza la formación del enlace péptido, no las proteí­
nas; Nissen y cois., 2000) y asimismo snRNA (Valadkhan y Manley,
2001).
Se ha estudiado bien una diversidad de moléculas de RNA fun­
damentales, entre ellas la telom era sa d e RNA (véase sección 2.2.5)
 9.2 ORGANIZACIÓN, DISTRIBUCIÓN Y FUNCIÓN DE GENES RNA HUMANOS 251

Cuadro 9-4. Distribución de genes en familias génicas de tRNA citoplásmico humano de acuerdo con el aminoácido
especificado.
Aminoácido Frecuencia* Número de genes de Aminoácido Frecuencia* Número de genes de
tRNA correspondientes tRNA correspondientes

Alanina 7.06% 40 Usina 5.65% 38

Arginína 5.69% 30 Metionina 2.23% 17

Aspartato 4.78% 10 Fenilalanina 3.75% 14

Asparagina 3.58% 34 Prolina 6.10 % 25

Císteína 2.25% 30 Selenocísteína < 0.0 1 % 1

Glutamina 4.63% 32 Serína 8.00% 26

Glutamato 6.93% 22 Treonina 5.31% 25

Glicina 6.62% 24 Triptófano 1.30% 7

Histidína 2.56% 12 Tirosina 2.76% 12

Isoleucína 4.43% 19 Valina 6.1 2 % 44

Leucina 9.95% 35

•Frecuencia promedio en la extensión del proteoma humano.

y el RNA SRP (conocido asimismo como RNA 7SL) de la p a r tícu ­
la d e reco n o cim ien to d e señ a l (el complejo de ribonucleoproteí-
nas que reconoce la secuencia de señal en las proteínas destinadas a
enviarse fuera de la célula para permitir el paso de proteínas a tra­
vés de la membrana celular). En fecha más reciente se identificó
una interesante variedad de nuevas moléculas de RNA humano con
funciones reguladoras conocidas o posibles. Éste es un proceso con­
tinuo, pero el análisis más amplio de transcritos de mamíferos hasta
la fecha (del genoma de ratón) sugiere que un porcentaje conside­
rable de transcritos corresponde a RNA no codificantes (FANTOM
Consortium y RIKEN Genome Exploration Research Group Pha-
se I & II Team, 2002).
Micro-RNA: nuevas moléculas de RNA regulador pequeñas
Los micro-RNA (miRNA) son moléculas de RNA muy pequeñas
(cerca de 22 nucleótidos de largo) que pueden funcionar como re­
guladores antisentido de otros genes (Ambros, 2001; Gottesman,
2002). Derivan de precursores más largos, unos -70 nucleótidos de
largo que contienen una repetición invertida que permite la forma­
ción de horquillas de RNA de doble cadena. Un tipo de ribonuclea-
sa III (específica de RNA de doble cadena), que se conoce como
d ic e r , corta estos RNA precursores de horquillas. Las primeras de
estas secuencias descritas en animales, RNA lin-4 y let-7, se identi­
ficaron como RNA tem p o ra l p eq u eñ o (stRNA) mediante análisis
genéticos en C. elegans. RNA lin-4 y let-7 se regulan durante el de­
sarrollo y también controlan varios programas del desarrollo por sí
mismos. Actúan como reguladores antisentido al enlazarse a se­
cuencias complementarias en la 3' UTR del mRNA de genes blan­
co, inhibir la traducción y, por consiguiente, reprimir la síntesis de
las proteínas del gen blanco (fig. 9-6A). Se ha demostrado asimis­
mo que otros miRNA, por ejemplo en plantas, son reguladores del
desarrollo y este hallazgo, aunado a la conservación evolucionista
potente del miRNA, condujo a esperar funciones similares para los
miRNA de mamíferos.
Se han operado varios métodos para identificar miRNA de ma­
míferos (véase Gottesman, 2002, para un resumen) y sus resultados
fueron la identificación reciente de miRNA nuevos en seres huma­
nos y ratones (Lagos-Quintana y cois., 2001, 2002; Mourelatos y
cois., 2002). Para la época en que se escribió este libro (mediados del
2003), se estimaban alrededor 200 genes miRNA humanos. Aun­
que están diseminados en muchos cromosomas, las pruebas indican
cierto agrupamiento, en especial un grupo cuando menos de siete
genes miRNA dentro de una región de 0.8 kb en el cromosoma 13
(Mourelatos y cois., 2002). En la actualidad se llevan a cabo esfuer­
zos activos para identificar genes blanco por la probabilidad de que
los miRNA de mamíferos tengan funciones reguladoras de impor­
tancia.
a«ote; se piensa que este tipo de actividad de ribonucleasa forma parte de un
sistema genético de vigilancia conservado que puede degradar un mRNA especifico
en respuesta a la presencia de RNA de doble cadena correspondiente al mRNA
específico. Puede utilizarse en ciertos análisis experimentales, que se conocen como
RNA de interferencia (¡RNA), para inactivar de forma específica genes blanco
dentro de células al cortar el RNA largo de doble cadena producido por transgenes
introducidos de modo artificial para crear moléculas de RNA antisentido de unos 22
nucleótidos de largo (conocidas como siRNA, RNA de interferencia corto). Las
moléculas de siRNA pueden formar pares de bases con mRNA del gen endógeno que
corresponde al transgén introducido y, en consecuencia, inhibir de manera específica
la expresión (véase sección 20.2.6).
252 CAPÍTULO NUEVE ORGANIZACIÓN DEL GENOMA HUMANO

A)
U U u A
u c C C G A C c c A GAG U G
I I T r r r i I I I I GI U
I I I I I lin-4
A G G G C U G G G U C A c u c G U
C U c c C u

U A U
U G A G G G A G G U U G G U
I I I I I I I I I i r t I I le t-7
A U U C C c u u u A A C C A
u A C C
G U

C A
G U G C C U C G U C A A G U A A C C A G G A U A G G C U G U m ir-26 a
III l i l i l í I I I I I I I T i l l i l i I I í f I I I
C G C G G G G C A G U U C A U U G G U U C U A U C C G G U A
A C

B) lin-14 3 ' U TR

lin-28 3 ’ UTR

lin-42 3 ' UTR

d a f-1 2 3 ’ U TR

lin-41 3’U TR ------------------------------------------------------- — ----------^ _ _ -------------------------------- ------------------- - 200 n t

— = le t-7
GUU A AUU __ _ A
lin-415’ UUAUACAACC CUAC CUCA 5' UUAUACAACC CUGCCUC - lm-4
let-7 3 ’ GAUAUGUUGG GAUG GAGU 3' GAUAUGUUGG GAUGGAG
U AU U AU U

Fig. 9-6. Los micro-RNA son RNA muy cortos (21 a 22 nucleótidos) que pueden funcionar como reguladores antisentido.

A) Estructura precursora del miRNA. Los stRNA lin-4 y let-7 de C. elegans pertenecen a la clase mIRNA y muestran una similitud importante con
miRNA de mamíferos como el miRNA mir-26a humano. Las secuencias maduras de micro-RNA (miRNA) (sombreadas) derivan de un precursor con
repeticiones invertidas (que forman una RNA en horquilla por enlace intramolecular de hidrógeno). El corte del RNA en horquilla se lleva a cabo por un
tipo de nucleasa RN-asa III que se conoce com o “ dicer” (máquina cortadora). En ocasiones, dos miRNA diferentes derivan del mism o precursor.
B) Regulación antisentido por los RNA lin-4 y let-7. El mRNA de genes blanco regulado por los RNA lin-4 y le t-7 tiene regiones en sus 3 ' UTR que
muestran complementaridad muy notoria con estos miRNA. El pareamiento de bases no suele ser perfecto, como se demuestra en el pareamiento de
bases predicho entre el RNA le t-7 y sus dos secuencias blanco en la secuencia 3 ' UTR lin-41. Tomado de Banerjee y Slack (2002), Bioessays 24,
119-129, reimpreso con autorización de Wiley-Liss, Inc., una subsidiaria de John Wiley & Sons, Inc.

Genes que codifican moléculas de RNA reguladoras
de tamaño moderado a grande
Un número cada vez mayor de genes especifica RNA no codifican­
te de tamaño moderado a grande con funciones reguladoras cono­
cidas o posibles (muchos pueden relacionarse con moléculas de
“mRNA no c o d ific a n t e porque son transcritos por polimerasa II
de RNA y se someten a recubrimiento y poliadenilaciónb). Inclu­
yen genes que especifican RNA 7SK, un regulador transcripcional
negativo del alargamiento de la polimerasa II de RNA (Yang y col.,
2001); RNA SRA1 (a ctiv a d o r d e l re cep to r d e esfero id es) que sir­
ve como un coactivador específico de varios receptores de esferoi­
des (Lanz y cois., 1999); y X IS T , que es central para la inactivación
d el cromosoma X (sección 10.5.6).
Se conocen asimismo varios RNA antisentido reguladores, de
tamaño moderado a grande, entre ellos el transcrito antisentido
TSIX, que regula XIST, una variedad de transcritos antisentido que
bNota: mediante comparación, la polimerasa I de RNA transcribe los RNA 28S, 18S y
5.8S; la polimerasa III de RNA transcribe los rRNA 5S, tRNA, snoRNA y miRNA; los
snRNA son una mezcla sorprendente: algunos los transcribe la polimerasa III de RNA
y otros la polimerasa II de RNA.
9.3 ORGANIZACIÓN, DISTRIBUCIÓN Y FUNCIÓN DE GENES HUMANOS QUE CODIFICAN POLIPÉPTIDOS 253

regulan genes improntos (sección 10.5.5; véase fig. 10-24 para al­
gunos ejemplos) y un gran número de otros transcritos antisentido
(Lehner y cois., 2002). Aunque no se conoce con precisión el núme­
ro total de estos transcritos antisentido en el genoma humano, en
una revaloración reciente de los genes en el cromosoma 22 huma­
no se reconocieron 16 posibles genes RNA antisentido, lo que su­
giere que puede haber alrededor de 1 500 genes RNA antisentido
en el genoma humano (Collins y cois., 2003). En apoyo de lo ante­
rior, FANTOM Consortium y el RIKEN Genome Exploration Re­
search Group Phase I & II Team (2002) predijeron en un estudio
muy amplio varios cientos de RNA antisentido en el ratón median­
te las estimaciones más conservadoras.
9.3 Organización, distribución y
función de genes hum anos que
codifican polipéptidos
9.3.1 Los genes humanos muestran una enorme
variación de tamaño y organización interna
Diversidad de tamaño
En organismos simples, como las bacterias, los genes tienen un ta­
maño comparativamente similar y suelen ser muy cortos; en los
complejos es considerable la variación de tamaño de los genes, en
especial en el genoma humano (fig. 9-7). El tamaño enorme de al­
gunos genes humanos significa que la transcripción puede tomar
tiempo y requerir alrededor de 16 horas para el gen de distrofina de
2.4 Mb (Tennyson y cois., 1995). Aunque existe una correlación di­
recta entre los tamaños del gen y el producto, hay algunas ano­
malías notables. Por ejemplo, la apolipoproteína B tiene 4 563
aminoácidos y la codifica un gen de 45 kb, pero la proteína más
grande que codifica el gen de distrofina de 2.4 Mb sólo posee 3 685
aminoácidos.
Diversidad en la organización exón-intrón
Una minoría muy pequeña de genes humanos carece de intrones
(véase cuadro 9-5) y éstos poseen casi siempre un tamaño pequeño.
En los que tienen intrones, se observa una correlación inversa entre
el tamaño del gen y la fracción del DNA codificante (fig. 9-7). Ello
no se debe a que los exones en genes grandes sean más pequeños
que los de genes pequeños: el tamaño promedio del exón en genes
humanos es menor de 200 pb y, aunque se conocen exones muy
grandes (véase recuadro 9-5), el tamaño del exón es comparativa­
mente independiente de la longitud del gen (cuadro 9-6). Por el
contrario, hay una gran variación en las longitudes de intrones y los
genes grandes tienden a tener intrones muy grandes (la colágena de

A ) M e n o s d e 1 0 kb B) M e n o s d e 1 0 0 kb

0 6 10 kb 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 kb
h + —I
■ tR N A Tir 100% A lb ú m in a s é ric a 1 2 %
M H isto ria H 4 100% ■e f C o lá g e n a a-, (II) 2 0 %
In te rfe ro n a 100% # ■ ■ 4 FRTH 4 %
l i l i l
ií i
In s u lin a 3 3 % | ¡ ' *■■■■■■ A p o lip o p ro te ín a B 3 3 %
i G lo b in a ¡5 3 8 % | i R e c e p to r L D L 11 %
I • 1 I I I I l i l i l í
N i H L A c la s e I 4 6 % -— 4 ! I ! I i H id ro x ila s a d e
fe n ila la n in a 3 %

C ) M á s d e 1 0 0 kb
0 100 200 300 40 0 500 600 700 800 90 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 2 0 0 1 8 0 0 1 9 0 0 2 4 0 0 2 5 0 0 kb
------ 1 1-1--------- 1---------1--------- 1--------- h ------ 1--------- ¡---------1---------¡---------1---------¡----- ^ ------j - ----- ¡------^ ------ 1---------1—
I I I I I I I I I I I I I I
i ¡F acto r V III 3% ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡
i i I I I I I I I I I I I I
ii r
R»TIFT
VQ*2c..-41%/o i! i
( i
( ,i ,i i, ,• ,' ,i ' , ,1 |
1
i i i i i i i i i i i i i i
— *-N F l 4% ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !
U tro fin a 1 .4 %
Inmunoglobulina de cadena pesada*
In m u n o g lo b u lin a d e c a d e n a lig e ra k *
i i i i t i i i i i i i i i
— 4 - ü D istro fin a 0 .6 %

Fig. 9-7. Los genes humanos varían de tamaño y contenido de exones en enorme proporción.
Se muestra el contenido de exones como porcentaje de las longitudes de los genes indicados. Obsérvese la relación por lo general inversa entre la
longitud del gen y el porcentaje del contenido de exones. Los asteriscos resaltan que las longitudes proporcionadas para los locus de las cadenas
pesada y ligera de Ig indicadas corresponden a organizaciones de la linea germinal. (Los genes de Ig y del receptor de célula T tienen organizaciones
únicas, que requieren reordenamientos somáticos específicos de célula a fin de expresarse en linfocitos B o T, respectivamente; véase sección 10.6.)
RTFQ, regulador transmembranoso de la fibrosis quística; FRTH, transferasa de fosforribosilo de hipoxantina; NF1, neurofibromatosis tipo 1.
254 CAPÍTULO NUEVE ORGANIZACIÓN DEL GENOMA HUMANO
Cuadro 9-5. Ejemplos de genes humanos con secuencias de codificación ininterrumpidas.
Para listas más detalladas, véase http://exppc01.uni-muenster.de/expath/frames.htnn
Todos los 3 7 genes mitocondriales
Muchos genes RNA (en especial genes que codifican RNA pequeños, p. e¡„ casi todos los genes tRNA, pero también algunos RNA grandes, como RNA
XIST)
Retrogenes (véase cuadro 9-11)
Interferones
Genes de histona
Muchos genes de ribonucleasa
Genes de proteina de choque p o r calor
Muchos receptores acoplados a proteina G
Ciertos genes con cajas HMG (p. ej., SRY, muchos genes SOX)
Varios genes de receptor de neurotransm isor y receptor de hormona, p. e j„ receptores de dopamina D1 y D5, receptor de serotonina 5-HT1B, receptor
de angiotensina II tipo 1, receptor péptido formil, receptor de bradicinina B2, receptor adrenérgico 2a
tipo 7 y los genes titin son excepciones muy notables; véase cuadro
9-6). Pese a ello, la transcripción de intrones largos requiere tiem­
po y energía y la selección natural favorece intrones cortos en genes
muy expresados (Castillo-Davis y cois., 2002).
Diversidad del contenido de DNA repetido
Con frecuencia, los genes tienen componentes de DNA repetido
dentro de intrones no codificantes y secuencias de flanqueo, pero
además se encuentran secuencias de DNA repetido de diferentes
extensiones en DNA codificante. Es común la repetición tándem
de secu en cia s m icro sa télites (elementos de secuencia cortos; véase
sección 9.4.3) y muchas reflejan tan sólo frecuencias esperadas des­
de el punto de vista estadístico para ciertas composiciones de bases.
También es muy común la repetición tándem de secuencias que co­
difican d o m in ios p r o te ín ico s conocidos o supuestos y pueden ser
ventajosas desde el punto de vista funcional en algunos casos al pro­
porcionar un blanco biológico más disponible. En ocasiones, la ho­
mología de secuencias entre las repeticiones puede ser muy alta; en
otras es posible que sea muy baja (véase cuadro 9-7).
9.3.2 Algunas veces están agrupados genes similares
desde el punto de vista funcional en el genoma
humano, pero con mayor frecuencia están
esparcidos en diferentes cromosomas
Como se comenta en la sección 9.2, algunas familias de genes RNA
están agrupadas. En familias génicas que codifican polipéptidos,
muchas veces se hallan genes que codifican productos idénticos, o
algunos con secuencias muy relacionadas, en uno o más grupos que
pueden estar diseminados en varios cromosomas. Sin embargo, en
el genoma suelen estar dispersas algunas familias de genes funcio­
nales que codifican productos que sólo tienen com ponentes con­
servados (dominios, elementos importantes, etc.). De manera
característica, los genes que codifican productos funcionales rela­
cionados que no muestran una homología de secuencia muy im­
portante están esparcidos.
Genes idénticos en sentido funcional
Se sabe que dos o más copias génicas idénticas codifican a unos
cuantos polipéptidos humanos. Con frecuencia los codifican genes
recién duplicados en un grupo génico, por ejemplo los genes dupli­
cados de globina alfa. Además, de modo muy ocasional algunos ge­
nes en diferentes cromosomas codifican polipéptidos idénticos. Son
ejemplos los siguientes:
► genes de histona. La base de datos de secuencias de histona NH-
GRI incluye una lista de un total de 86 diferentes secuencias de
histona distribuidas en 10 cromosomas distintos, aunque con
dos grupos grandes en 6 p (http://genome.nhgri.nih.gov/histo-
nes/chrmap.shtml), pero algunos miembros de la subfamilia
son idénticos aunque codificados por genes en diferentes cro­
mosomas;
► genes d e ubiquitina. La u biqu itina , de 76 aminoácidos, es una
proteína muy conservada que tiene una función esencial en la
degradación de proteínas y la respuesta celular de estrés. Los ge­
nes humanos de ubiquitina se encuentran en locus diferentes
distribuidos en varios cromosomas. Algunos están en una serie
de repeticiones de secuencias codificantes de longitud completa
que se someten a cotranscripción (unidades d e transcripción po-
licistrónicas). Otros son monómeros (pero fusionados con genes
ribosómicos de proteínas y constituyen unidades d e transcrip­
ción bicistrónicas, véase Nei y cois., 2000; sección 9.3.3).
Genes similares en sentido funcional
Una gran fracción de los genes humanos es miembro de familias gé­
nicas en las que los genes individuales están relacionados m uy d e cer­
ca pero no son idénticos en su secuencia. En muchos de estos casos
los genes están agrupados y surgieron por duplicación génica tán­
dem, como en el caso de los diferentes miembros de cada uno de
los grupos de los genes de las globina a y (3 (véase fig. 9-11). Los
genes que codifican productos relacionados con claridad, pero que
se hallan en distintos cromosomas, suelen estar menos relacionados,
como se observa en los genes de las globina a y (3. No obstante,
9.3 | ORGANIZACIÓN, DISTRIBUCIÓN Y FUNCIÓN DE GENES HUMANOS QUE CODIFICAN POLIPÉPTIDOS | 255

Recuadro 9-5. Genoma humano y estadísticas de genes humanos

Tamaño del genoma -3 200 Mb

Genoma nuclear ~ 3 200 Mb
Genoma mitocondrial 37 kb
Componente eucromático ~ 2 900-3 000 Mb
Heterocromatina constitutiva > 2 0 0 Mb (cuadro 9-2; fig. 2-15)
Fracción muy conservada > 1 0 0 Mb (> 3% )
DNA codificante - 5 0 Mb (-1 .5 % )
Otros (regulador, etc.) - 1 0 0 Mb (3%)
DNA duplicado de forma segmentaria > 1 5 0 Mb (> 5 % )
DNA repetido no codificante > 50% del genoma
Repeticiones basadas en transposón - 1 400 Mb (-4 3 % ; véase cuadro 9-15)
Número de genes - 3 0 000-35 000
Genoma nuclear - 3 0 000-35 000 (sección 9.1.3)
Genoma mitocondrial 37 (sección 9.1.2)
Por cromosoma Promedio de - 1 400; pero depende de la longitud y tipo de cromosoma (véase fig. 8-4);
- 6 0 por banda en una preparación cromosómica de 550 bandas
Genes gue codifican polipéptidos - 3 0 000, pero gran inseguridad
Genes RNA - 3 000, pero cierta inseguridad (véase fig. 9-4)
Seudogenes - 2 0 000
Densidad génica -1 /1 0 0 kb en el genoma nuclear; 1/0.45 kb en el genoma mitocondrial
Tamaño génico (extensión genómica) Promedio = 27 kb, pero enorme variación (véase fig. 9-7).
Distancia intergénica Promedio = cerca de 75 kb en el genoma nuclear.
Numero de islotes CpG - 3 0 000 (en secuencias del genoma filtrado para eliminar repeticiones no codificantes)
Número de exones Promedio = 9. Por lo regular se correlaciona con la longitud del gen, pero hay una amplia variación.
Numero más grande 363 (en el gen titin)
Número más pequeño 1 (es decir, sin intrones; cuadro 9-5)
Tamaño de exón Promedio = 122 pb para exones internos con variación de longitud comparativamente pequeña,
pero los exones 3' pueden ser más largos de forma notoria (Zhang, 1998).
Exones más grandes Muchas kb de largo, p. ej., el exón 26 del gen apoB (APOB) es de 7.6 kb
Exones más pequeños < 10 pb
Tamaño de intrón Variación enorme; correlación directa potente con el tamaño génico (véase cuadro 9-6);
Intrones más grandes Cientos de kb, p. e j„ el intrón 8 del gen WWOX humano es - 8 0 0 kb.
Intrones más pequeños Decenas de pb
Tamaño de mRNA Promedio alrededor de 2.6 kb, pero gran variación (¡mRNA titin tiene > 115 kb de largo!)
5 ' UTR Promedio alrededor de 0.2-0.3 kb
3 ' UTR Promedio alrededor de 0.77 kb pero es probable que sea una subestimación por menos información
de 3 ' UTR largas
Tamaño del RNA no codificante Muy variable; de - 2 1 - 2 2 nucleótidos (micro-RNA) a muchos kb, p. ej., XIST (17 kb)
Tamaño de polipéptidos Promedio alrededor de 500-550 aminoácidos
Polipéptido más grande Titin: 38 138 codones en el gen titin (pero variación de longitud considerable)
Polipéptidos mas pequeños Decenas de aminoácidos, p. ej., varias hormonas pequeñas, etc.

en la familia génica homeobox HOX, que consiste en grupos de
anos 10 genes en cada uno de cuatro cromosomas, genes indivi­
duales en diferentes cromosomas pueden estar más relacionados
entre sí que respecto de los miembros del mismo grupo génico (fig.
.2-9). Además de lo anterior, genes que codifican isoformas especí-
r.cas de tejido relacionadas, o isozimas específicas de compartimien­
to subcelular, casi siempre se localizan en diferentes cromosomas
véase cuadro 9-8).
Genes relacionados en sentido funcional
Algunos genes codifican productos que es muy posible que no ten­
gan una secuencia relacionada muy cercana, pero se relacionan con
claridad desde el punto de vista funcional. Los productos pueden
ser subunidades de la misma proteína o estructura macromolecular,
componentes de la misma vía metabólica o del desarrollo o tal vez
se requieran para enlazarse de manera específica entre sí como los
256 1 CAPÍTULO NUEVE | ORGANIZACIÓN DEL GENOMA HUMANO

Cuadro 9-6. Tamaños promedio de exones e intrones en genes humanos.

Producto génico Tamaño del gen (kb) Número de exones Tamaño promedio Tamaño promedio
de exón (pb) de intrón (pb)

tRNA,ír 0.1 2 50 20

Insulina 1.4 3 155 480

Globina p 1.6 3 150 490

HLA clase 1 3.5 8 187 260

Albúmina sérica 18 14 137 1 100

Colágena tipo VII 31 118 77 190

Complemento C3 41 29 122 900

Hidroxilasa de fenilalanina 90 26 96 3 500

Factor VIII 186 26 375 7100

CFTR (fibrosis qulstlca) 250 27 227 9100

Titin 283 363 315 466

Distrofina 2 400 79 180 30 770

Cuadro 9-7. Ejemplos de DNA intragénico de codificación repetida a gran escala.

Producto génico Tamaño de repetición Núm. de Homología de secuencia de nucleótidos
codificada en aminoácidos copias entre copias

Involucrina 10 59 Homología alta para 39 repeticiones centrales

¿Apolipoproteína? (a) 114 = repeticiones parecidas 37 Homología alta; 24 de las repeticiones tienen una
a kringle 4a secuencia idéntica

Plasminógeno ~ 75-80 5 Homología baja pero dominios proteínicos conservados

(kringles3)

Colágena 18 57 Homología baja pero elementos de aminoácidos

conservados basados en (Gli-X-Y)6
Albúmina sérica 195 3 Homología baja

Genes de proteínas ricos en prolina 16-21 5 Homología baja

Tropomiosina de cadena a 42 7 Homología baja

Inmunoglobullna de cadena e, región C 108 4 Homología baja

Distrofina 109 24 Homología baja

aUn kringle es una secuencia rica en cisterna que contiene tres puentes disulfuro internos y crea una estructura en forma de “pretzel".

ligandos y sus receptores importantes. En casi todos estos casos, los
genes no están agrupados y suelen hallarse en diferentes cromoso­
mas (véase cuadro 9-8 para algunos ejemplos).
9.3.3 En ocasiones se encuentran en el genoma
humano genes superpuestos, genes dentro de
genes y unidades de transcripción policistrónicas
Organización génica bidireccional y genes superpuestos
de modo parcial
Los genomas simples tienen densidades génicas altas (por lo gene­
ral uno por 0.5 kb, 1 kb y 2 kb en los genomas de mitocondrias
humanas, E. coli y S. cerevisiae, respectivamente) y a menudo
muestran ejemplos de genes superpuestos de forma parcial. Pue­
den utilizarse diferentes marcos de lectura, algunas veces de una
cadena en sentido común (véase fig. 9-3). Los genes de organismos
complejos están mucho menos agrupados (sólo un gen por 100 kb
en el genoma nuclear humano) y no son tan comunes los genes su­
perpuestos. Sin embargo, en ocasiones se encuentran genes veci­
nos muy cercanos, algunos con sus extremos 5' separados por unos
cuantos cientos de nucleótidos y que se transcriben de cadenas
opuestas. Esta o rga n iz a ción g é n ica b id ire ccio n a l suele encon­
trarse, por ejemplo, en los genes de reparación de DNA y pueden
proporcionar regulación común del par génico (Adachi y Lieber,
2002).
9.3 ORGANIZACIÓN, DISTRIBUCIÓN Y FUNCIÓN DE GENES HUMANOS QUE CODIFICAN POLIPÉPTIDOS 257

Cuadro 9-8. Distribución de genes que codifican productos relacionados desde el punto de vista funcional.
Genes que codifican Organización Ejemplos

El mismo producto Con frecuencia agrupados pero Los dos genes de globina a en 11p (fig. 9-11); genes que codifican rRNA
también pueden estar en (fig. 10-2); algunas subfamlias de histona
diferentes cromosomas (véase httD://aenome.nhari.nih.aov/histones/chrmaD.shtmh

Isoformas o isozimas de En ocasiones agrupados; Agrupamiento de genes de amilasa pancreática y salival (1p21); no hay
proteína específica de tejido algunas veces no sinténicos sintenia de genes de actina a expresados en músculo esquelético (1 p) y
cardiaco (15q)

Isozimas en diferentes Por lo general no sinténica Isozimas citoplásmica (c) y mitocondrial (m) para diversas enzimas, p. ej.,
compartimientos celulares deshidrogenasa de aldehido (c)-9q y deshidrogenasa de aldehido (m)-12q;
cinasa de timidina (c)-17q y cinasa de timidina (m)-16q

Enzimas en la mism a vía Por lo general no sinténica Genes de enzimas codificantes en esteroidogénesis: hidroxilasa 8q de
metabòlica 1 1 esteroides; hidroxilasa 1 0q de 17 esteroídes; hidroxilasa 6p de 21
esteroides

Subunidades de la misma Por lo general no sinténica Globina a -1 6p y globina (3-11 p; cadena pesada de ferritina 11 q y
proteína cadena ligera de ferritina 22q

Componentes de vía de señal Por lo general no sinténica JAK1 -1 p; STAT1-2q

que interactúan

Ligando más receptor Por lo general no sinténica Insulina 11 p y receptor de insulina 19p; interferón p-9p; interferón p
relacionado de receptor 21 q

Los g e n e s su p erp u estos d e fo r m a p a r cia l en los genomas nu­
cleares compuestos de mamíferos son raros y, cuando se presentan,
suelen transcribirse a partir de dos cadenas de DNA diferentes. Se
observa una agrupación génica fuerte en regiones subcromosómicas
con abundancia de GC y las regiones de densidad génica en parti­
cular alta muestran con frecuencia algunos casos de genes super­
puestos. Por ejemplo, la región clase III del complejo HLA en
6p21.3 tiene una densidad génica aproximada de casi un gen por
! 5 kb y se sabe que incluye varios ejemplos de genes superpuestos
fig. 9-8A).
Genes dentro de genes
Los genes RNA nucleolares pequeños (snoRNA) son poco comunes
porque casi todos están localizados dentro de otros genes, a menudo
algunos que codifican una protema vinculada con el ribosoma o una
proteína nucleolar. Es posible que esta disposición se conservara pa­
ra permitir la producción coordinada de proteínas y componentes
de RNA del ribosoma (Tycowski y cois., 1993). Además de los genes
¿noRNA, algunos otros, incluidos varios genes que codifican poli-
péptidos, se hallan dentro de intrones de genes más grandes. Los
eiemplos ilustrativos son el gen NF1 (neurofibromatosis tipo I; tres
genes internos pequeños transcritos de la cadena opuesta; véase fig.
9-8B); el gen F8 (factor VIII de la coagulación sanguínea; dos genes
internos transcritos en direcciones opuestas; véase fig. 11-20 ); y el
gen RB1 (susceptibilidad al retinoblastoma; un gen interno transcri­
to de la cadena opuesta; véase fig. 9-19).
_ nidades de transcripción policistrónicas
unidades de transcripción policistrónicas (es decir, multigéni-
son comunes en los genomas simples de bacterias y asimismo
encuentran con gran frecuencia en C. elegans. El genoma mito-
a» d ria l humano simple (sección 9.1.2.) y los grupos mayores del
gen rRNA (fig. 10-2) proporcionan dos ejemplos de unidades de
transcripción policistrónica en el genoma humano. Además, se co­
nocen algunos ejemplos raros de unidades de transcripción bicis-
trónicas que codifican polipéptidos en el genoma nuclear: la
transcripción se inicia a partir de un gen y continúa a través de un
gen contiguo corriente abajo para suministrar una proteína precur­
sora que se corta para proporcionar diferentes proteínas.
Por lo regular se considera que las cadenas A y B de la insulina
derivan de una unidad de transcripción bicistrónica (fig. 1-23), pe­
ro están relacionadas de manera estrecha desde el punto de vista fun­
cional. Sin embargo, algunas veces las unidades de transcripción
bicistrónicas generan proteínas distintas desde el punto de vista fun­
cional. Por ejemplo, los genes UBA52 y UBA80 crean ubiquitina y
una proteína ribosómica, S27a o L40, respectivamente. Otros genes
de ubiquitina están organizados como repeticiones tándem de se­
cuencia codificante completa que forman unidades de transcripción
policistrónicas (véase Nei y cois., 2000). En los genes de ubiquitina
no hay intrones pero en otras unidades de transcripción bicistróni­
cas se requiere empalme (corte y unión) para enlazar transcritos de
exones de un gen en los de un gen corriente abajo. La unidad de
transcripción SNURF-SNRPN proporciona un ejemplo de dos po­
lipéptidos codificados por diferentes exones (Gray y cois., 1999), pe­
ro también se utiliza para hacer transcritos de RNA no traducidos
que se improntan de forma paterna; véase la figura 10-24.
9.3.4 Las familias génicas que codifican polipéptidos
pueden clasificarse de acuerdo con el grado
y extensión de la relación de la secuencia
en miembros de la familia
Un gran porcentaje de genes humanos que se expresan de modo ac­
tivo, y codifican RNA no codificante y polipéptidos, es miembro
de familias de secuencias de DNA que muestran una gran simili-
258 CAPITOLO NUEVE ORGANIZACIÓN DEL GENOMA HUMANO

A)
C4B CYP C4A 1C7
21 Ps / G11 G5b CKIIB \B 1 4 4 LTB nb6
G11a 1kBL MICA NOB1 NOB2

PBX2 I G15 TN-X

RD G10 PERB10 \ \ I P5-6
' Bf I G9 2
G18 I G14 \ X BAT1 PERB6 \ \ \ / DHFRPs
I / G13 / / C2 I G9a | G8 \ MICB \ \ \ \ | / / 1 7 NOB3

PPIPs

I I T T I------- 1
---- ---- 1
---- ---- 1
---- ---- 1
---- n— i
1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 (2080)
0.9 Mb: -70 genes

B) E xó n 2 6 Exó n 27
Intrón
— ► 26
Cadena de sentido 3'
5' I 1 ------
del gen NF1
Cadena antisentido 3 ' L 5'
del gen NF1

OGMP EVI2B EVI2A

i-------- 1 h- I- H
2.2 kb 10 kb 4 kb

Fig. 9-8. Genes superpuestos y genes dentro de genes.

A) Genes superpuestos. Los genes en la región clase III del complejo HLA están empacados de forma estrecha y superpuestos en algunos casos.
B) Genes dentro de genes. El intrón 26 del gen de la neurofibromatosis tipo 1 (NF1) contiene tres genes de dos exones internos cada uno transcritos de
la cadena opuesta a la utilizada para transcribir el gen NF1. Los genes son: OGMP, glucoproteína de mielina del oligodendrocito; EVI2A y EVI2B,
homólogos humanos de genes murinos que tal vez participen en la leucemogénesis y se localicen en sitios de integración viral Bcotrópicos.

tud secuencial. Sin embargo, la extensión de la secuencia comparti­
da y la organización de los miembros de la familia pueden variar en
gran proporción. Es posible que muchos miembros de la familia no
sean funcionales (seudogenes y fragm entos génicos; véase más adelan­
te) y acumulen en poco tiempo diferencias de secuencias, que con­
ducen a una divergencia secuencial notable.
Familias génicas comunes
Los miembros de familias génicas comunes muestran una gran ho­
mología de secuencias en la mayor parte de la longitud del gen o,
cuando menos, en el componente de DNA codificante. Los ejemplos
incluyen familias del gen de histona (las histonas están muy conser­
vadas y los miembros de subfamilias son virtualmente idénticos) y las
familias del gen de las globinas a y (3 (los miembros de una familia
individual muestran un alto grado de similitud secuencial).
Familias génicas que codifican productos con dominios
grandes y muy conservados
En algunas familias génicas hay una homología en especial notable
dentro de regiones específicas de los genes muy conservadas; la si­
militud secuencial correspondiente entre la porción restante de la
secuencia codificante en los diferentes genes puede ser muy baja. A
menudo, estas familias codifican factores de transcripción que tie­
nen funciones importantes en el desarrollo temprano y la secuencia
conservada codifica un dominio proteínico que se requiere para en­
lazarse de forma específica al DNA de genes blancos seleccionados
(véase cuadro 9-9).
Familias génicas que codifican productos con secuencias
típicas conservadas de aminoácidos cortos
Es posible que algunos miembros de ciertas familias génicas no se
relacionen de forma evidente a nivel de las secuencias de DNA, pe­
ro no obstante codifican productos génicos que se caracterizan por
una función general común y la presencia de secuencias típicas muy
cortas conservadas, como la caja DEAD, la secuencia Asp-Glu-Ala-
Asp (DEAD en el código de una letra de aminoácidos) o la repeti­
ción WD (triptófano-aspartato); véase la figura 9-9.
Superfamilias génicas
Los miembros de una superfamilia de genes se relacionan de mo­
do mucho más distante en términos evolucionistas que los de una
familia de genes de dominio/secuencia típica común o conservada.
Codifican productos relacionados desde el punto de vista funcional
en un sentido general y sólo muestran una homología de secuencia
muy débil en un segmento grande, sin secuencias típicas de ami­
noácidos conservadas muy importantes. Por el contrario, es posible
que haya algunas pruebas de características estructurales generales
comunes y una función general vinculada. Los ejemplos ilustrativos
son:
► la su p erfa m ilia d e in m u n o glob u lin a (fig. 9-10): una familia
muy grande que incluye los genes de inmunoglobulina (Ig), ge­
nes del receptor de célula T, genes HLA y muchos otros. Los ge­
nes codifican productos divergentes en grado considerable a
nivel secuencial, pero que funcionan en el sistema inmunitario
y contienen dominios parecidos a inmunoglobulina (Ig);
9.3 j ORGANIZACIÓN, DISTRIBUCIÓN Y FUNCIÓN DE GENES HUMANOS QUE CODIFICAN POLIPÉPTIDOS 259

Cuadro 9-9. Ejemplos de genes humanos con elementos de secuencia típica que codifican dominios muy conservados.
Fam ilia génica N úm ero de genes Elem entos de secuencia típ ic a/d o m in io

Genes homeobox 38 genes HOX (véase fig. 12-9) Homeobox especifica un homeodominio de unos 60 aminoácidos.
más 214 genes homeobox huérfanos Se ha definido una amplia variedad de diferentes subclases

Genes PAX 9 Box pareada codifica un dominio pareado de - 1 2 8 aminoácidos;

los genes PAX suelen tener además un tipo de homeodominio conocido
como homeodominio tipo pareado

Genes SOX 18 Caja HMG parecida a SRY que codifica un dominio de unos 69 aminoácidos

Genes TBX 18 Caja T que codifica un dominio de unos 170 aminoácidos

Genes de dominio en horquilla 49 El dominio en horquilla tiene - 1 1 0 aminoácidos de largo

Genes de dominio POU 24 El dominio POU tiene - 1 5 0 aminoácidos de largo

A) C a ja D E A D
2 2 -4 2 1 9 -2 9 1 7 -2 9 1 7 -2 3 19-51 1 1 5 -1 9 2 2 0 -2 5
nh 2— axxgxgkt PTR ELA GG TPGR DEAD SAT ARGXD H R IG R — C O O H

B) 6 -9 4 23-41
R e p e tic ió n W D ( -------------------G H ------------------- W D j ) n = 4 -1 6

C e n tro

Fig. 9-9. Algunas familias génicas se definen por productos génicos relacionados desde el punto de vista funcional que llevan secuencias
típicas muy cortas de aminoácidos conservados.

A) Secuencias típicas en la familia caja DEAD. Esta familia génica codifica productos relacionados con los procesos celulares que incluyen la alteración
de la estructura secundaria del RNA, como el inicio de traslación y empalme (corte y unión). Son obvias ocho secuencias típicas de aminoácidos muy
Dien conservadas, incluida la caja DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp). Los números se refieren a los límites de tamaño que suelen encontrarse en secuencias
ntermedías de aminoácidos (véase Schmid y Linder, 1992). X, cualquier aminoácido. Véase la contraportada para el código de aminoácidos de una
letra. B) Familia repetida WD. Esta familia génica codifica productos que participan en una diversidad de funciones reguladoras, como la regulación
de la división celular, transcripción, señalamiento transmembranoso, modificación de mRNA, etc. Los productos génicos se caracterizan por cuatro a 16
repeticiones tándem de WD, que consisten en alrededor de 44 a 60 aminoácidos cada una y que contienen una secuencia central de longitud fija que
comienza con un dipéptido GH (gii-his) y termina en el dipéptido WD (Trp-Asp) precedido por una secuencia de longitud variable (véase Smith y cois.,
1999).

► la su p erfa m ilia d e globin a : una familia pequeña que no sólo
incluye los miembros de las familias génicas de las globinas a y
(3 (fig. 9-11) que funcionan en el transporte de oxígeno y el al­
macenamiento de sangre, sino también genes equivalentes que
codifican globinas musculares y cerebrales, mioglobina y neuro-
globina, respectivamente (véase fig. 12-4);
► la su p erfa m ilia d e l recep to r a co p la d o a p r o te ín a G: una fa­
milia muy grande y diversa de receptores que median señales in­
ducidas por ligando entre los ambientes extracelular e
intracelular a través de la interacción con proteínas G intracelu-
lares. Comparten una estructura común de siete segmentos
transmembranales de hélice a , pero casi siempre tienen una si­
militud secuencial baja (< 40%) entre sí.
9.3.5 Los genes en familias génicas humanas pueden
estar organizados en grupos pequeños o
esparcidos con amplitud, o ambas cosas
Las familias génicas humanas pueden clasificarse en las que mues­
tran pruebas de agrupamiento génico cercano y las que se encuen­
tran diseminadas en varios sitios cromosómicos diferentes. Sin
embargo, esta clasificación es un poco arbitraria ya que algunas fa­
milias génicas consisten en múltiples grupos de genes en diferentes
sitios cromosómicos (véase cuadro 9-10) y otras, como la familia
de genes de histona (http://genome.nhgri.nih.gov/histones/chr-
map.shtml), pueden estar dominadas por uno o dos grupos grandes
pero también tienen varios g en es h u érfa n o s esparcidos.
260 CAPITULO NUEVE ORGANIZACIÓN DEL GENOMA HUMANO

C adena
lig era

G !
C adena^
pesada
\
bQ
c°-
G v
C adena
pesada

G \ \
\
( <bp Q <S* v/ —v
^ O
Cadena
% if.O 1 a o y 8o
g ! pesada
O Y s - s f C J r
(V s,S M)
g ì G ! I O G ! I O
i i i i i
C^S / " 'S S^~ x -s S Cadena
V I
.^ s
(
v_>s
V I I V )
G l I O G l I O C C I I C —t
s v _ y (p2M)
lig era

T4 T8 In m u n o g lo b u lin a en R e c e p to r A n tíg e n o A n tíg e n o

la s u p e rfic ie c e lu la r d e c é lu la T H L A c la s e I H L A c la s e I

Fig. 9-10. Los miembros de la superfamilia Ig son proteínas de superficie con tipos similares de estructura de dominio.

Se ilustran unos cuantos ejemplos de la superfamilia Ig grande. Muchos miembros son dímeros que consisten en dominios variables (V) extracelulares
localizados en los extremos N y dominios constantes (C), situados en los extremos terminales C (membrana proximal). La cadena ligera de antígenos
HLA clase I, microglobulína p 2, tiene un dominio constante único y no abarca la membrana. Se vincula con la cadena pesada transmembranosa que
tiene dos dominios variables y uno constante, lo que crea una estructura total similar a la de los antígenos HLA clase II.

10 20 30 40 50 60
—i— —i— C la v e
Gen
^2 a2 a-! 9 □ expresado
Vlj1 ¥«2 Val
G ru p o d e g lo b in a a 16 p 1 3 .3 -m - E xp resad o ,
□ pe ro e s ta d o
in cierto

e Gy Ay v|/(3 s □ S eu d o g en

G ru p o d e g lo b in a p 11 p 1 5 .5 -m-m ---------------------------------□ - —
I i~ - o

Grupo de hormona del crecimiento 17q23

- ü — O - i b — □ -------- □ -
h G H -N C S -L C S -A h G H -V C S -B

G aipo de albúmina 4q12

A LB AFP A LF G C /D B P

20 40 60 80 100 120 14 0 160 180

Fig. 9-11. Ejemplos de familias génicas agrupadas humanas.

Los genes en un grupo tienen una secuencia relacionada de cerca y se transcriben de manera característica a partir de la misma cadena. Es incierto el
estado funcional de los genes de globina 9 y genes CS-L. Las escalas en la parte superior (grupos de globina y hormona del crecimiento) y en la
inferior (grupo de albúmina) aparecen en kilobases.
9.3 ORGANIZACIÓN, DISTRIBUCIÓN Y FUNCIÓN DE GENES HUMANOS QUE CODIFICAN POLIPÉPTIDOS 261

Cuadro 9-10. Ejemplos de familias multigénicas agrupadas y dispersas.

Fam ilia N úm . de O rganización Localización(es)
copias crom osóm ica(s)

A) FAMILIAS GÉNICAS AGRUPADAS

Fam ilias génicas de grupo único
Grupo génico de hormona del crecimiento 5 Agrupado dentro de 67 kb; un seudogen convencional 17q22-24
Grupo génico de globina a 7 Agrupado en - 5 0 kb (véase fig. 9-11) 16p13.3
Genes de cadena pesada HLA clase 1 -20 Agrupado en más de 2 Mb (véase fig. 9-12) 6p21.3

Fam ilias génicas de grupos m últiples

Genes HOX 38 Organizado en cuatro grupos en 2p, 7 ,1 2 ,1 7 (véase fig. 12-9)
Familia génica de histona 61 Grupos de tamaño moderado en unas cuantas localizaciones; Muchos
dos grupos grandes en el cromosoma 6
Familia génica del receptor olfatorio > 900 Alrededor de 25 grupos grandes diseminados en la totalidad Muchos
del genoma

B) FAMILIAS GÉNICAS DISPERSAS

Deshidrogenasa de piruvato 2 Gen que contiene un intrón y un retrogen expresado en testículo Xp22; 4q22-q23
Aldolasa 5 Tres genes funcionales y dos seudogenes en cinco cromosomas Muchos
diferentes
PAX 9 Los nueve son genes funcionales Muchos
NF1 (neurofibromatosis tipo I) > 12 Un gen funcional en 17q; otros son copias de DNA defectuoso Muchos; sobre todo
no procesadas (fig. 9-13) pericentroméricos
Cadena pesada de ferritina > 15 Un gen funcional en el cromosoma 11; casi todos son Muchos
seudogenes procesados

Familias génicas organizadas en un grupo aislado
Se piensa que los genes en un grupo génico individual se originan
por fenómenos de d u p lica ció n g é n ica tá n d em (fig. 12-3). Son ob­
vias diferentes organizaciones:
► organización génica tándem. Los genes están muy relacionados
entre sí en términos de la secuencias y la función, aunque cier­
tos miembros de la familia tal vez no sean funcionales. Existen
muy pocos ejemplos de genes que codifican polipéptidos (los
genes de poliubiquitina son un ejemplo notable), pero varias fa­
milias de genes RNA (rRNA, U2 snRNA) muestran esta orga­
nización;
► grupo cerrado. Los genes no están muy repetidos en tándem;
por el contrario, están agrupados de manera estrecha y puede
regularlos una región d e control d el locus única; véase el ejemplo
de los grupos de genes de las globinas a y P en la figura 9-11.
Los genes individuales suelen mostrar una gran identidad se-
cuencial y funcional entre sí, pero muchos miembros de la fa­
milia pueden ser seudogenes (sección 9.3.6);
► grupos compuestos. Sin embargo, en otras familias génicas agru­
padas la relación física entre los genes en un grupo puede ser
menos cercana y es posible que un grupo de genes relacionados
también contengan dentro de él genes que no están relaciona­
dos en la secuencia y la función, lo que constituye un gr u p o g é ­
n ico com pu esto. Por ejemplo, el complejo HLA en 6p21.3 lo
dominan familias génicas que codifican antígenos de clases
HLA clases I y II y varios factores de complemento séricos, pe­
ro miembros individuales de la familia pueden estar separados
por genes no relacionados en sentido funcional, como los
miembros de la familia génica de la 21 -hidroxilasa de esteroides,
etcétera.
Familias de genes organizadas en múltiples grupos génicos
Algunas familias de genes están organizadas en múltiples grupos.
En ocasiones, estos últimos pueden estar relacionados muy de cer­
ca en el mismo cromosoma como resultado de una duplicación re­
ciente, por ejemplo los grupos invertidos que contienen los genes
SMN1 y SMN2 vinculados con la atrofia muscular espinal (véase
Frugier y cois., 2002). No obstante, con mayor frecuencia están dis­
tribuidos en dos o más sitios cromosómicos. Son evidentes diferen­
tes organizaciones. Algunas familias muestran una similitud
comparativamente alta entre genes en diferentes grupos; en otras es
menor. Un ejemplo notable es la fa m ilia génica del receptor olfatorio
que codifica un repertorio diverso de receptores que permiten dife­
renciar miles de distintos aromas. Los más de 900 miembros de es­
ta familia están organizados en grupos grandes en más de 25 sitios
cromosómicos diferentes y representan todos los cromosomas apar­
te de los cromosomas 20 y Y (Glusman y cois., 2001).
La homología secuencial suele ser mayor dentro de un grupo
que entre varios (compárese, por ejemplo, los miembros del gru­
po de la globina a en l 6 p con los del grupo de la globina p en 1 lp;
véase fig. 12-4), pero en ocasiones, debido a selección funcional
fuerte, los genes en diferentes grupos pueden estar más relaciona­
dos entre sí respecto de los de un mismo grupo, como en el caso de
los genes HOX(fig. 12-9).
Familias génicas dispersas
Los miembros de algunas familias están diseminados en dos o más
sitios cromosómicos diferentes. Los genes en distintas localizacio­
nes suelen divergir mucho en sus secuencias, a menos que ocurra
una duplicación génica relativamente reciente o una presión de se­
lección considerable para conservar las secuencias. Es posible que
los miembros de la familia se originen por:
262 t CAPÌTOLO NUEVE ORGANIZACIÓN DEL GENOMA HUMANO

genom as diferentes. El genoma mitocondrial original pudo pro­
ceder de una bacteria aerobia con transferencia subsecuente de
muchos de los genes bacterianos originales al genoma nuclear.
Como resultado, este último contiene genes duplicados, que co­
difican isoformas específicas de citoplasma y específicas m itocon-
driales para ciertas enzimas y otros productos metabólicos
fundamentales (véase cuadro 9-8 para algunos ejemplos).
acontecim ientos antiguos de duplicación d el gen!genom a. De ma­
nera característica, las familias de este tipo sólo contienen unos
cuantos miembros, como se observa en la familia génica PAX, y
al parecer evolucionaron por una combinación de aconteci­
mientos de duplicación génica, duplicación del genoma, o am­
bas, durante un periodo prolongado del tiempo evolucionista.
Por lo general, todos los miembros de la familia, o muchos de
ellos, son funcionales y la homología secuencial importante en­
tre los productos génicos puede restringirse a dominios cruciales
fundamentales, por ejemplo el dominio pareado de productos
del gen PAX.
m ediante sucesos d e retrotransposición. Algunas familias génicas se
expandieron en fecha comparativamente reciente en términos
evolucionistas por un proceso mediante el cual el RNA transcri­
to de uno o un número pequeño de genes funcionales se con­
vierte por acción de la transcriptasa inversa celular en cDNA
natural, que a continuación se integra en alguna parte de los
cromosomas. La mayor parte de estas copias no es funcional,
pero algunas familias génicas tienen un gen funcional que con­
tiene un intrón y una copia génica procesada funcional (véase
sección siguiente).
9.3.6 En familias multigénicas se encuentran casi
siempre seudogenes, copias de genes truncadas
y fragmentos génicos
Las familias de genes que codifican polipéptidos (y genes RNA) se
caracterizan por copias defectuosas (seudogenes), en esencia de toda
la secuencia de un gen funcional (o cuando menos su secuencia co­
dificante) o de porciones de ella, por ejemplo cop ia s tru n ca d a s que
carecen de los extremos 5' o 3' o fr a g m en to s internos, en algunos
casos un exón aislado. Se encuentra una gran variedad de diferentes
clases. Los ejemplos siguientes ilustran los tipos de copias génicas
defectuosas que se hallan en diferentes tipos de familias génicas.
Seudogenes no procesados en un grupo génico
Con frecuencia, grupos génicos individuales tienen copias defectuosas
de genes que se copiaron a nivel de DNA genóm ico por du plicación
g én ica tándem. Las copias pueden contener secuencias que corres­
ponden a exones, intrones y regiones promotoras de los genes funcio­
nales (seudogenes no procesados), pero suele reconocerse que son
defectuosas por la presencia de codones de terminación inapropiados
en secuencias que corresponden a exones. Se encuentran ejemplos co­
munes en los grupos de globinas a y (3 (véase fig. 9 - 11).

A) 3' UTR
L a-) a 2 a 3 T M CY v V M W -

B) -2.2 Mb

B C
H = H > B K } 0 -D 0 « -{ X 1 » -

M / n t a a2Í
3' UTS
\a2 «3 TM

3' UTS
CY W A V W - agl— _ (I3 TM CY ^ v A M W -

Fig. 9-12. Las familias génicas agrupadas contienen con frecuencia seudogenes no procesados y genes truncados o fragmentos génicos:
ejemplo de la familia de gen HLA clase I.

A) Estructura del mRNA de una cadena pesada HLA clase I. El mRNA de longitud completa contiene una secuencia que codifica polipéptidos; los
cuadros representan diferentes dominios, como sigue: L, secuencia rápida; a ,, a 2, a 3, dominios extracelulares; TM, secuencia transmembranosa; CY,
cola citoplásmica; y una secuencia no traducida 3 ' (3' UTS). En esencia, los tres dominios extracelulares a r a 3 los codifica un exón aislado. No se
muestra la 5 ' UTS muy pequeña. B) Grupo génico de la cadena pesada de HLA clase I. El grupo se localiza en 6p21.3 y comprende alrededor de
20 genes. Incluye seis genes expresados (azul), cuatro seudogenes no procesados de longitud completa ( ¥ ) y una variedad de copias génicas
parciales (cuadros rojos, abiertos, pequeños). Algunos de estos últimos están truncados en el extremo 5 ' (p. ej., el siguiente a HLA-B), otros en el
extremo 3 ' (como el siguiente a HLA-F) y algunos contienen exones únicos (p. ej., el siguiente a HLA-E).
9.3 ORGANIZACIÓN, DISTRIBUCIÓN Y FUNCIÓN DE GENES HUMANOS QUE CODIFICAN POLIPÉPTIDOS ¡ 263

Genes truncados y fragmentos de genes internos
en un grupo genico
La familia del gen HLA clase I en 6p21.3 es un ejemplo típico de
un grupo genico caracterizado por seudogenes no procesados, co­
pias de genes truncadas y fragmentos génicos. Aunque el número
de genes HLA de clase I puede variar en distintos cromosomas 6 s,
el análisis amplio de uno de ellos identificó 17 miembros de la fa­
milia agrupados en 2 Mb que comprendían: seis genes expresados,
cuatro seudogenes de longitud completa convencionales, cinco co­
pias de genes truncadas y dos fragmentos génicos internos peque­
ños (Geraghty y cois., 1992; véase fig. 9-12). La familia también se
originó por duplicaciones génicas tándem y las copias de genes
fragmentados surgieron por cruzamiento desigual o intercambio de­
sigual d e cromátides hermanas (sección 11.3.2).
Seudogenes no procesados en una familia genica dispersa
Dos ejemplos ilustrativos son las secuencias relacionadas con los ge­
nes NF1 (neurofibromatosis tipo I) y PKD1 (enfermedad poliquís-
tica del riñón adulto). Estos genes se localizan, de manera
respectiva, en 17ql 1.2 , cerca del centròmero (pericentrom éricd), y
16pl3.3, cerca del telómero (subteloméricd). De manera caracterís­
tica, las regiones pericentroméricas humanas están compuestas de
secuencias que se copiaron en época reciente durante la evolución
y que se hallan en varios cromosomas. Las regiones subteloméricas
también son comparativamente inestables y propensas a duplica­
ción (Eichler, 2001; Mefford yTrask, 2002). Son una contribución
importante a la d u p lica ció n segm en ta ria específica de primates
que constituye más de 150 Mb del genoma humano, aunque al pa­
recer el efecto de inestabilidad es en parte específico de cromoso­
mas (véase Bailey y cois., 2002; sección 12.2.5).
En el gen NF1, están distribuidas en siete diferentes cromoso­
mas cuando menos 11 copias de fragmentos no procesados de seu-
dogén/gen (que contienen secuencias que semejan intrones NF1 y
asimismo exones), nueve de ellas localizadas en las regiones pericen­
troméricas (Regnier y cois., 1997; véase fig. 9-13). El gen PKD1 tie­
ne 46 exones que abarcan 50 kb. Se replicó con fidelidad una copia
del gen 5' truncado que comprende alrededor de 70% del gen
(exones 1 a 34 más intrones intermedios) cuando menos tres veces
y se insertó en un sitio más proximal en 16pl3.1 (European
Polycystic Kidney Disease Consortium, 1994).
Seudogenes procesados en una familia génica dispersa
que codifica polipéptidos
Las familias génicas dispersas poseen casi siempre copias de genes
defectuosas que contienen secuencias que corresponden a los exo­
nes de un gen funcional (pero no los intrones) y por lo general in­
cluyen en un extremo una secuencia oligo (dA)/(dT). Estos
seudogenes procesados se copiaron a nivel d el cDNA por retro-
transposición (véase asimismo sección 9.5.1). Las transcriptasas in-

G en N F 1 1 7 q 1 1.2; 6 0 ex o n e s

l l l l l l l l ll IIIIIII I I IIIIIII IIIIIIIIIIII IIIIIIIMI MIHHIHB

10b 27b 2 q 1 2 -q 1 3
l * * l I I I I I I l |* * * * * ** * * * * | 14p11oq11
' II I I I I I I I 22p11< > q 11

39 -41
7 11 1617

l l l***l 4 f 12q11 -H+

1 8 p 1 1 .2 1 1 p 1 4 .3
21 p 1 1 < > q 1 1

13 27b

111111111111H H+h
1 5 p 1 1 .2 (2x)

Fig. 9-13. Los seudogenes no procesados esparcidos se originan a partir del gen de NF1 perlcentromérico (neurofibromatosis tipo I).
Los exones están representados como rectángulos verticales delgados. Para conveniencia, los intrones en el gen NF1 se representan como si tuvieran
longitudes iguales. Aunque el gen NF1 tiene 60 exones, la numeración de los exones discurre del uno al 49 con ciertos exones vecinos a los que se
asignó el mism o número, pero distintas letras (p. ej., exones 10a, 10b y 10c). Se encuentran copias de seudogenes muy homólogos del gen NF1 en
otras ocho o más localizaciones del genoma, sobre todo en regiones pericentroméricas. En cada caso, el seudogén sólo comprende una copia de una
porción de la longitud total del gen, con algunos exones e intrones intermedios. Son aparentes los reordenamientos de los seudogenes. Algunos
causaron deleción de exones e intrones (se muestran con asteriscos). Uno participó en una inversión de tal manera que la copia 39 del exón está
invertida en comparación con las copias de exones contiguos. Datos proporcionados gentilmente por Nick Thomas y Meena Upadhyaya, University of
Wales College of Medicine.
264 CAPÍTULO NUEVE ORGANIZACIÓN DEL GENOMA HUMANO

E1 E2 E3
3'
Tran scrip ció n y 5'
H
p ro c e s a m ie n to d e R N A In te g ra c ió n en
D N A c ro m o s o m ic o
E1 E2 E3
5' □ □ □ A A A A ..... A„ 3' mRNA AAAAANn 3'
T ra n s c rip ta s a ■•TTTTT 5'
in v ersa
S ín te sis d e la
E1 E2 E3 segunda cadena
3' 5' cDNA y re p a ra c ió n d e D N A

5 ' ---------- A A A A A N „ □ □ □ A A A A ..... A A A A A A N n

3 ' ---------- 1 1 1 1 i N'„ □ □ □ T T T T ..... T T T T T T N '„

Fig. 9-14. Los seudogenes y retrogenes procesados se originan por transcripción inversa de transcritos de RNA.

La función de la transcriptasa inversa podrían proporcionarla las repeticiones LINE-1. El modelo de la integración que se muestra en la figura sólo es una
de varias posibilidades. En este caso, se considera la integración como roturas tambaleantes (indicadas por flechas onduladas) en secuencias ricas en
A, pero podrían recibir la asistencia de la endonucleasa LINE-1 (sección 9.5.2). Si se incluye una secuencia abundante en A en un extremo saliente 5 ’ ,
podría form ar un híbrido con el extremo distal de poli(T) del cDNA, lo que facilita la síntesis de la segunda cadena. Debido a las roturas tambaleantes
durante la integración, la secuencia insertada está flanqueada por repeticiones directas cortas (secuencias en cuadros). E1-E3 representan exones; R
promotor. Las copias transpuestas no llevan un promotor y por consiguiente, en condiciones normales, no se expresan y adquieren mutaciones perjudi­
ciales {seudogenes procesados). Sin embargo, algunas copias procesadas de genes que codifican polipéptidos son funcionales (retrogenes), tras in­
tegrarse en un sitio adyacente a un promotor funcional y estar sujetas a presión de selección para conservar la función (cuadro 9-11).

Cuadro 9 -1 1. Ejemplos de retrogenes humanos sin intrones y su homología parental que contiene intrones.
(para mayor información, véase http://exppc01 .uní-muenster.de/expath/frames.htm)

R e tro g e n H o m o lo g ía q u e c o n tie n e in tró n P ro d u c to

GK2en 4q13 GK1 en Xp21.3 Cinasa de glicerol

PDHA2 en 4q22-q23 PDHA1 en Xp22 Deshidrogenasa de piruvato

PGK2 en 6p12.3 PGK en Xq13 Cinasa de fosfoglicerato
TAF1L en 9p13.3 TAF1 en Xq13.1 Factor proteínico relacionado de enlace de caja TATA, 250 kDA
MYCL1 en 1p34.2 MYCL2 en Xq22-23 Homología del oncogen v-m yc
GLUD1 en 10q23.3 GLUD2 en Xq25 Deshidrogenasa de glutamato
SNAIL1L1 en 2q33-q37 SNAIL1 en 20q13 Regulador del desarrollo relacionado con caracoles

versas celulares transcriben mRNA en cDNA natural, que a conti­
nuación se integran al DNA cromosómico (fig. 9-14) con mayor
probabilidad con ayuda de la maquinaria de transposición LINE-1
(véase sección 9.5.2). Los seudogenes procesados pueden ser muy
prolíficos. Por ejemplo, hay 79 proteínas en ribosomas citoplásmi-
cos y una familia de 95 genes de proteínas ribosómicos (16 son du­
plicados), pero se identificó en el genoma nuclear una asombrosa
cifra de 2 090 seudogenes procesados de este tipo (Zhang, 2002).
De forma característica, los seudogenes procesados no se expre­
san (por falta de una secuencia promotora), aunque se conocen al­
gunos ejemplos de genes procesados expresados. En este caso, se
integró el cDNA natural en un sitio del DNA cromosómico que,
por azar, está adyacente a un promotor que puede impulsar la ex­
presión de la copia del gen procesado. La presión de selección pue­
de asegurar la expresión continua de la copia del gen procesado que
entonces se considera un retrogen. Se conoce una diversidad de re­
trogenes sin intrón que tienen patrones de expresión específicos de
testículo y con frecuencia son homólogos autosómicos de un gen li­
gado a X que contiene un intrón (véase cuadro 9-11). La presión
de selección en este caso puede ser el requerimiento para la expre­
sión durante la meiosis masculina cuando son activos de modo
transcripcional los genes autosómicos, pero cuando se silencian
ambos cromosomas X y Y se condensan para formar heterocroma-
tina. Sin embargo, algunos retrogenes funcionales son copias de ge­
nes no ligados a X, como una copia del regulador del desarrollo
SNAIL1 (Locascio y cois., 2002).
 9.4
Seudogenes procesados en una familia génica que
codifica RNA
Aunque el tamaño de algunas familias génicas dispersas que codifi­
can polipéptidos comprueba el éxito de la retrotransposición como
un mecanismo para generar copias de genes procesados, el éxito de
' =s retrotransposiciones (en términos de un número alto de copias)
se lleva a cabo en realidad a partir de transcritos de polimerasa III
de RNA. Por ejemplo, se considera que la familia de rep etició n Alu
véase sección 9.5.3) surgió como seudogenes procesados copiados
iel gen de RNA que codifica SRP (llamado asimismo RNA 7SL),
un componente de la partícula de reconocim iento de señal. Los genes
como el de este ejemplo, que se transcriben mediante polimerasa
III de RNA, suelen contener un prom otor interno (fig. 10-4) que fa­
cilita la expresión de copias recién transpuestas en regiones permi­
sivas del genoma.
9.3.7 Se ha iniciado la clasificación del proteoma
humano, pero aún son inciertas las funciones
precisas de muchas proteínas humanas
La secuenciación del genoma humano proporcionó información
valiosa sobre el grupo predicho de proteínas humanas, el proteoma
humano. Se habían asignado con anterioridad funciones proteíni-
cas en muchos genes, pero el análisis de un gran número de genes
nuevos permitió extender las clasificaciones previas. Varias bases de
datos están dedicadas a registrar características de secuencia que son
compartidas por múltiples proteínas e indican funciones comunes
o relacionadas (aunque no todas las proteínas pueden asignarse a las
categorías disponibles porque algunas proteínas no parecen com­
partir secuencias con otras). Las bases de datos que se utilizan in­
cluyen a menudo la base d e d a tos In terP ro conservada por el
European Bioinformatics Institute y la base d e datos P fam preserva­
da en el Wellcome Trust Sanger Institute (véase las lecturas adicio­
nales). Las categorías incluyen las siguientes:
Cuadro 9 -12 . Las 15 principales familias de proteínas en el proteoma humano.
Datos obtenidos en enero de 2003 de la base de datos InterPro conservada por el European Bioinformatlc Institute en http://www.ebi.ac.uk/proteome/
Referencia InterPro Nombre de la familia proteínica
IPR000272 Receptor acoplado a proteina G parecido a rodopsina
IPR000719 Cinasa de proteína
IPR001909 Caja KRAB (caja relacionada con Kruppel)
IPR001806 Superfamilia GTP-asa Ras
IPR005821 Proteína de transporte iónico
IPR000387 Fosfatasa de proteina específica de tirosina y fosfatasa de proteína de especificidad doble
IPR001254 Proteasa de serina, familia tripsina
1PR000379 Esterasa/lipasa/tioesterasa, sitio activo
IPR007114 Superfamilia facilitadora mayor (SFM)
1PR001993 Transportador mitocondrial de sustrato
IPR001664 Proteína de filamento intermedio
IPR001128 Citocromo P-450
I DNA NO CODIFICANTE DE REPETICIÓN TÁNDEM 265
► fa m ilia s d e p r o te ín a s (con base en la similitud funcional gene­
ral): véase el cuadro 9-12;
► d o m in ios d e p ro teín a s: véase el cuadro 9-13. El gran número
de dedos de cinc testifica su importancia en una amplia varie­
dad de interacciones DNA-proteína;
► rep eticio n es d e p ro teín a s: las más comunes son la repetición
beta de la proteína G WD-40 (-400 compatibilidades proteíni-
cas) y la repetición de ancirina (> 260 compatibilidades de pro­
teínas).
Se ha iniciado asimismo la clasificación funcional y el G ene O nto-
lo g y (GO) con sortiu m definió categorías de clasificación funcional
de acuerdo con el componente celular en que opera la proteína, su
función molecular y el proceso biológico total al que contribuye
(sección 8.3.6). Por supuesto, este es un proceso constante: aún es
necesario determinar las funciones de muchos genes humanos me­
diante varios métodos. En la figura 9.15 se ilustra una clasificación
inicial de las proteínas humanas según sean la función molecular y
el proceso biológico.
9.4 DNA no codificante de repetición
tándem
Con frecuencia se reconoce DNA humano no codificante muy re­
petido en disposiciones (o bloques) de repeticiones tándem de una se­
cuencia que puede ser simple (1 a 10 nucleótidos) o compleja en
grado moderado (decenas a cientos de nucleótidos). Pueden obser­
varse configuraciones individuales en unos cuantos sitios cromosó­
micos diferentes o en muchos de ellos. Según sea el tamaño de la
configuración pueden definirse tres subclases mayores: DNA satéli­
te, DNA minisatélite y DNA microsatélite (cuadro 9-14). El DNA
satélite es inactivo desde el punto de vista transcripcional, al igual
que la inmensa mayoría del DNA minisatélite, pero en el DNA mi­
crosatélite un porcentaje considerable (aunque muy pequeño) se
localiza en DNA codificante.
Proteínas compatibles
826
688
314
192
149
139
128
112
100
86
85
84
266 CAPÍTULO NUEVE ORGANIZACIÓN DEL GENOMA HUMANO

Cuadro 9-13. Los 15 principales dominios proteínicos en
el proteoma humano
Datos obtenidos en enero de 2003 de la base de datos InterPro en
http://www.ebi.ac.uk/proteome/
9.4.1 El DNA satélite consiste en disposiciones muy
largas de repeticiones tándem que pueden
separarse del volumen del DNA mediante
centrifugación de gradiente de densidad

Referencia Nombre del dominio Número total El DNA satélite humano está constituido por configuraciones muy
InterPro proteínico en el proteoma grandes de DNA de repetición tándem. La unidad repetida puede
ser una secuencia simple (sólo unos cuantos nucleótidos de largo)
IPR007087 Dedo de cinc, tipo C2H2 28 654 o alguna compleja en moderada proporción (cuadro 9-14; véase
IPR002126 Caderina
Singer, 1982). El DNA satélite integra la mayor parte de las regio­
4131
nes heterocromáticas del genoma y se encuentra de manera notoria
IPR006209 Dominio parecido al tactor 3107
en la cercanía de los centrómeros (h etero cro m a tin a p ericen tr o m é-
de crecimiento epidérmico (EGF)
ricá). Cuando la unidad repetida es muy corta, la composición de
IPR003006 Inmunoglobulina/complejo 2 387 bases de las unidades repetidas, y asimismo la composición total de
de histocompatibilidad mayor bases del DNA satélite, puede variar de forma sustancial del DNA
IPR002048 Banda EF de enlace de calcio 1 885 genómico total. Como resultado, ha sido posible separar de la ma­
IPR001452 Dominio SH3 1 815 sa de DNA tres DNA satélite humanos, los satélites I, II y III, me­
diante centrifugación de gradiente d e densidad boyante. Cada clase
IPR003961 Fibronectina, tipo III 1 812
satélite incluye varias diferentes familias de secuencias de DNA de
IPR000504 Región RNP-1 de enlace de RNA 1 783 repetición tándem (subfamilias satélite), algunas de las cuales se
(secuencia típica de
comparten entre distintas clases. Los satélites II y III contienen so­
reconocimiento de RNA)
bre todo repeticiones de secuencias simples pero también es obvia
IPR001356 Flomeobox 1 435 una estructura de orden más alto.
IPR002965 Extensína rica en prolina 1 229
IPR001478 Dominio PDZ/DHR/GLGF 1 143 DNA alfoide y heterocromatina centromérica
IPR001841 Dedo de cinc, RING 1 132
No es posible resolver con facilidad mediante centrifugación de
IPR001849 Parecido a plecastrina 1 061 gradiente de densidad otros tipos de secuencias de DNA satélite. Se
IPR000210 Dominio BTB/P0Z 494 han identificado primero por digestión del DNA genómico con
IPR005225 Dominio pequeño de proteína 189 una endonucleasa de restricción que, de modo característico, tiene
de enlace de GTP un sitio de reconocimiento único en la unidad básica repetida. Ade­
más del tamaño de esta última (monómero), estas enzimas produ-

A)
70 f B)
60
60-
50
*50 <
1>
5T ■I 40
•*->
c 40
<B
p g 30
o 30 o
Q.
20 “■ 20

10 10 -

0 i fhiJ Ikfli [Tu i [Tu QlLDl f i l i l í — lUlll.LllH III lili III „11 mii n-.
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Fig. 9-15. Clasificación de proteínas humanas y de ratón basada en sus funciones moleculares y los procesos biológicos en que participan.

Los términos de ontologia gènica (0G) se agruparon en una decena de categorías situadas dentro de ontologías más grandes de función m o le cu lar (A)
y proceso bioló gico (B). Barras azules: proteínas de ratón; barras rojas: proteínas humanas. Modificado a partir de Mouse Genome Sequencing
Consortium (2002), Nature 420, 520-562, con autorización de Nature Publishing Group.
 9.4 ! DNA NO CODIFICANTE DE REPETICIÓN TÁNDEM
cen un patrón típico de multímeros de longitud de unidad debido
i la pérdida ocasional aleatoria del sitio de restricción en algunas de
las repeticiones (Singer, 1982). El satélite alfa (o DNA alfoide)
consiste en repeticiones tándem de una unidad repetida de 171 pb
v constituye el mayor volumen de la heterocromatina centroméri-
ca. La divergencia alta de secuencias entre miembros individuales
de la familia DNA alfoide significa que existen subfamilias especí­
ficas para cada uno de los cromosomas humanos (Choo y cois.,
1991).
Aún es necesario aclarar la función precisa del DNA satélite
i véase Csink y Henikoff, 1998; Henikoff y cois., 2001). El DNA
centromérico de cromosomas humanos consiste en buena medida
de varias familias de DNA satélite (véase fig. 9-16). De ellas, sólo
se sabe que el satélite a se encuentra en todos los cromosomas y sus
unidades repetidas contienen con frecuencia un sitio de enlace pa­
ra una proteína centrómera específica, CENP-B. Se ha demostrado
que las configuraciones satélites alfas clonadas diseminan centró-
meros nuevos en células humanas, lo cual indica que el satélite alfa
ejerce una acción importante en la función del centròmero (Grimes
yCook, 1998).
9.4.2 El DNA minisatélite está compuesto de
configuraciones de tamaño moderado
de repeticiones tándem y con frecuencia se
localiza en telómeros o cerca de ellos
El DNA minisatélite comprende un conjunto de disposiciones de
tamaño moderado de secuencias de DNA de repetición tándem
que están dispersas en porciones considerables del genoma nuclear
(cuadro 9-14). Al igual que las secuencias de DNA satélite, no se
transcriben en condiciones normales (pero véase más adelante).
Las secuencias de DNA minisatélite hipervariable son muy
polimórficas y están organizadas en más de 1 000 configuraciones
Cuadro 9-14. Principales clases de DNA humano de repetición tándem.
Clase Tam año de la unidad
de repetición (pb)
DNA satélite (a menudo estructuras dentro 5-171
de 100 kb para varias Mb de límite de tamaño)
a (DNA alfoide) 171
p (familia Sau3A) 68
Satélite 1 (abundante en AT) 25-48
Satélites 2 y 3 5 La mayor parte, quizá todos los cromosomas
DNA minisatélite (a menudo estructuras 9-64
dentro de los límites de 0.1-20 kb)
Familia telomérica 6 Todos los telómeros
Familia hipervariable 9-64
DNA microsatélite (es decir, repeticiones 12
de secuencia simple, RSS)
(estructuras típicas < 100 pb)
267
C . ;)-«— S a té lite p
= } rD N A
| S a té lite alfo id e -.— S a té lite P
t í
■*— S a té lite P
| S a té lite s 2 y 3
satélite adicional 1
S < — S a té lite s 2 y 3
^ S a t é l i t e alfo id e
y otras repeticiones
21
Fig. 9-16. Organización del DNA satélite en centrómeros.
Se muestran las localizaciones de diferentes clases de DNA satélite en
los cromosomas 9 y 21 (uno de los cinco cromosomas acrocéntricos
autosómicos). La ilustración se modificó a partir de Tyler-Smith y
Willard (1993) Curr. Opin. Genet. Dev. 3, 390-397, con autorización de
Elsevier.
(desde 0.1 a 20 kb de largo) de repeticiones tándem cortas (Jeffreys,
1987). Las unidades repetidas en diferentes disposiciones hiperva-
riables cambian de tamaño en grado notable, pero comparten una
secuencia central común, GGGCAGGAXG (en la que X es cual­
quier núcleotido), que es similar en tamaño y contenido de G a la
secuencia chi, una señal para recombinación generalizada en E. co-
li. Si bien muchas de las configuraciones se hallan cerca de telóme-
ros, ocurren varias secuencias de DNA minisatélite hipervariable en
otros sitios cromosómicos. Aunque la gran mayoría de las secuen­
cias de DNA minisatélite hipervariable no se transcribe, se sabe que
se expresan algunos casos raros (p. ej., el locus MJJC1; Swallow y
cois., 1987).
Aún no se dilucida la importancia del DNA minisatélite hiper­
variable, aunque algunas publicaciones indican que es un “punto
crítico” (punto caliente) para recombinación homologa en células
P rin c ip al(es) lo c aliza ció n (e s)
cro m o só m ica (s); estado transcripcional
Sobre todo en centrómeros; no se transcribe
Heterocromatina centromérlca de todos los cromosomas
De forma notable la heterocromatina centromérica de 1, 9 ,1 3 ,1 4 ,
15, 21, 22 y Y
Heterocromatina centromérlca de casi todos los cromosomas y
otras regiones heterocromáticas
En los telómeros o cerca de ellos de todos los cromosomas;
la inmensa mayoría no se transcribe
Todos los cromosomas, con frecuencia telómeros cercanos
Esparcido en la totalidad de los cromosomas; algunas configuraciones
pequeñas de secuencia muy simple
268 CAPÍTULO NUEVE j ORGANIZACIÓN DEL GENOMA HUMANO
humanas (Wahls y cois., 1990). No obstante, encontró muchas apli­
caciones. Se caracterizaron varios locus individuales y se utilizan co­
mo marcadores genéticos, aunque la localización preferencial en las
regiones subteloméricas limitó su uso para estudios de enlace de to­
do el genoma. Un aplicación mayor es la huella de DNA, en la cual
puede hibridarse una sonda de DNA aislada que contiene la se­
cuencia central común de forma simultánea con múltiples locus de
DNA minisatélite en todos los cromosomas, con un consecuente
patrón complejo de hibridación específico de individuo (véase sec­
ción 18.7.1).
Otra gran familia de secuencias de DNA minisatélite se encuen­
tra en las terminales de cromosomas, los telómeros. Los principales
constituyentes del DNA telomérico de los cromosomas humanos
son unidades de hexanucleótidos de repetición tándem de 3 a 20
kb, en especial TTAGGG, que se añaden mediante una enzima es­
pecializada, telomerasa. Actúan como amortiguadores para proteger
los extremos de los cromosomas de su degradación y pérdida y pro­
porcionan un mecanismo para la replicación de los extremos del
DNA lineal de los cromosomas; estas repeticiones simples tienen a
su cargo de manera directa la función del telómero (fig. 2 -6 ; sec­
ción 2 .2 .5 ).
9.4.3 El DNA microsatélite consiste en configuraciones
cortas de repeticiones tándem simples y está
disperso en la totalidad del genoma humano
Los DNA microsatélites, también conocidos como repeticiones
de secuencias simples (RSS), son disposiciones pequeñas de repe­
ticiones tándem de una secuencia simple (por lo general menor de
10 pb). Están diseminados en la totalidad del genoma, constituyen
más de 60 Mb (2% del genoma) y se piensa que surgieron sobre to­
do por deslizamiento d e replicación (fig. 11-5). Las configuraciones
de repeticiones dinucleótidas son el tipo más común y constituyen
alrededor de 0.5% del genoma. Son muy comunes las repeticiones
CA/TG (una por 36 kb) y con frecuencia muy polimórficas (figs.
7-7, 7-8). También son muy comunes las repeticiones AT/TA (una
por 50 kb) y AG/CT (una por 125 kb), pero muy raras las repeti­
ciones CG/GC (una por 10 Mb) debido a que el dinucleótido
CpG es propenso a la metilación y desaminación subsecuente (sec­
ción 9.1.3).
De las repeticiones de mononudeótidos, son muy comunes las
corridas de A y T (véase fig. 9-19 para ejemplos intragénicos) y mu­
cho más raras las de G y C. En términos comparativos, son raras
clases individuales de repeticiones tándem de trinucleótidos y tetra-
nudeótidos, pero a menudo son muy polimórficas y se investigan
cada vez más para desarrollar marcadores muy polimórficos. Véase
los cuadros 14 y 15 del International Human Genome Sequencing
Consortium (2001) para obtener información más amplia.
Se desconoce la importancia del DNA microsatélite. Las repeti­
ciones alternadas purina-pirimidina, como repeticiones tándem del
par de dinucleótidos CA/TG, son capaces de adoptar una confor­
mación de DNA alterada, Z-DNA, in vitro, pero existen pocas
pruebas de que lo lleven a cabo en la célula. Aunque por lo general
el DNA microsatélite se identifica en DNA intergénico o dentro de
los intrones de genes, se han registrado unos cuantos ejemplos den­
tro de las secuencias génicas codificantes y suelen ser puntos críti­
cos de mutación porque son propensos a deslizamiento de
replicación (véase fig. 11-14 para algunos ejemplos) y en ciertos ca­
sos limitados a expansión inestable (secciones 1 1.5.2 y 16.6.4).
9.5 DNA no codificante repetido
disperso
9.5.1 Las repeticiones derivadas de transposón
constituyen hasta > 40% del genoma humano y
surgieron sobre todo por intermediarios de RNA
Casi todos los DNA no codificantes repetidos dispersos en el geno­
ma humano derivan de elementos transponibles (llamados asi­
mismo transposones), secuencias movibles de DNA que pueden
migrar a diferentes regiones del genoma (Smit, 1996; Prak y Kaza-
zian, 2000). Es posible reconocer que cerca del 45% del genoma
pertenece a esta clase (International Human Genome Sequencing
Consortium, 2001; Li y col., 2001), pero gran parte del DNA “úni­
co” restante también debe derivar de copias antiguas de transposo­
nes que se desviaron muy lejos para reconocerse como tales.
Muchas veces descartados con anterioridad como DNA chatarra,
cada vez existen más pruebas que indican que estos transposones
pueden ser valiosos para las células de mamíferos (véase Dennis,
2002).
En seres humanos y otros mamíferos existen cuatro clases prin­
cipales de transposones, pero sólo una muy pequeña minoría se
transpone de modo activo. Pueden organizarse en dos grupos según
sea el método de transposición:
► retrotransposones (que también se abrevian como retroposo-
nes). En este caso, el mecanismo de copia utiliza transcriptasa
inversa para formar copias de cDNA de transcritos de RNA,
que semeja la forma en que se generan los seudogenes y retro-
genes procesados (sección 9.3.6). La tra n sp osición rep lica tiva
(o copia) asegura que se haga una copia de una secuencia exis­
tente después de lo cual la copia migra y se inserta en cualquier
parte del genoma. A este grupo corresponden tres clases de
transposones de mamíferos: elementos nucleares dispersos lar­
gos (LINES); elementos nucleares dispersos cortos (SINES); y
elementos parecidos a retrovirus que contienen repeticiones ter­
minales largas;
► transposones de DNA. Los miembros de esta cuarta clase de
transposones migran por tra n sp osición con serva d ora . No hay
copia de la secuencia; por el contrario, se corta la secuencia y a
continuación se inserta de nueva cuenta en cualquier parte del
genoma (un mecanismo de “cortar y pegar”).
De acuerdo con su capacidad o imposibilidad para transponerse de
manera independiente, los elementos transponibles pueden ser au­
tónomos o no autónomos (fig. 9-17). De las cuatro clases de elemen­
to transponible, predominan LINES y SINES y se describen con
mayor detalle en las secciones 9.5.2 y 9.5.3, respectivamente. En
este inciso se describen de manera breve las otras dos clases.
Transposones humanos de repeticiones terminales
largas (RTL)
Los transposones RTL incluyen elementos similares a retrovirus
autónomos y no autónomos que están flanqueados por r ep eticio ­
n es term in a les la rga s (RTL) (directas) que contienen elementos
reguladores transcripcionales necesarios. Los miembros autónomos
se conocen como secu en cia s retro vira les en d ógen a s (o SRE) y
contienen genes g a g y p o l, que codifican una proteasa, transcripta­
sa inversa, RNA-asa H e integrasa. Hay tres clases mayores de SRE
humanas (SREH) que constituyen un total de casi 4.6% del geno-
 9.5 ¡ DNA NO CODIFICANTE REPETIDO DISPERSO 269

AUTÓNOM O NO AUTÓ NO M O

O RF1 O R F 2 (p o l)
—> P ►
L IN E S I—• — I H ■ n n — n iB ( A )n — i
6-8 k b

S IN E S — ► — ► (A)n
1 0 0 -3 0 0 p b

RTL R TL
P a re c id o a re tro v iru s
P g a g p o i (env) R TL (g a g ) R T L
(T ra n s p o s o n e s R TL)
6-11 kb 1 .5 -3 k b

T ra n s p o s o n e s D N A fó s ile s — *• tra n s p o s a s a P ____ ^ ^ ^

6 -3 k b 8 0 p b -3 k b

Fig. 9-17. Familias de transposones de mamíferos.

Sólo una proporción pequeña de los miembros de cualquiera de las familias que se muestran arriba puede ser capaz de someterse a transposición;
muchos miembros perdieron esta capacidad y adquirieron mutaciones inactivadoras y muchos son copias truncadas cortas. Véase las figuras 9-18 y
9-19 para las estructuras típicas de ciertos elementos humanos transponibles. Modificado a partir de International Human Genome Sequencing
Consortion (2001), Nature 409, 860-921, con autorización de Nature Publishing Group.

Cuadro 9-15. Principales clases y familias de DNA repetido dispersas en el genoma humano (excluido el cromosoma Y).
Clase Familia Núm. de copias Fracción dei genoma (%)

SINE Familia Alu ~ 1 200 000 10.7

MIR ~ 450 000 2.5

MIR3 ~ 85 000 0.4

UNE Familia LINE-1 - 600 000 17.3

Familia LINE-2 - 370 000 3.3

Familia LINE-3 ~ 44 000 0.3

Elementos RTL Familias SRE ~ 240 000 4.7

MaLR - 285 000 3.8

Transposón de DNA MER-1 (Charlie) - 213 000 1.4

MER-2 (Tigger) ~ 68 000 1.0

Otros ~ 60 000 0.4

Datos del International Human Genome Sequencing Consortium, 2001; Mouse Genome Sequencing Consortium, 2002.

ma humano (cuadro 9-15). Muchísimas son defectuosas y durante
millones de años han sido en extremo raras las transposiciones. Sin
embargo, el grupo muy pequeño SREH-K muestra una conserva­
ción de genes retrovirales intactos (Lower y cois., 1996) y algunos
miembros de la subfamilia SREH-K10 sufrieron transposición en
época comparativamente reciente de la evolución. Los elementos
retrovirales no autónomos carecen del gen p o ly con frecuencia tam­
bién del gen ga g (la secuencia interna se pierde por recombinación
homologa entre las RTL de flanqueo). La familia MaLR de estos
elementos constituye casi 4% del genoma (cuadro 9-15).
270 ¡ CAPÍTULO NUEVE j ORGANIZACIÓN DELGENOMA HUMANO

Fósiles de transposones de DNA humano
Los transposones de DNA tienen repeticiones terminales inverti­
das y codifican una tra nsposasa que regula la transposición. Re­
presentan casi 3% del genoma humano y pueden agruparse en
diferentes clases que suelen subdividirse en muchas familias con
orígenes independientes (véase Smit, 1996, y la base de datos Rep-
Base de secuencias repetidas en http://www.girinst.org/). Existen
dos familias humanas mayores, MERI y MER2, además de una
diversidad de familias menos frecuentes (cuadro 9-15). Casi sin ex­
cepción, todas las secuencias de transposón de DNA humano resi­
dentes ya no son activas y por consiguiente son transposones fósiles.
Los transposones de DNA tienden a tener periodos de vida cortos
dentro de una especie, a diferencia de algunos otros elementos
transponibles como LINES (sección 9.5.2). No obstante, al pare­
cer, muy pocos genes funcionales humanos se originaron de trans­
posones de DNA, en especial genes que codifican las recombinasas
RAG1 y RAG2 y la proteína mayor de unión de centròmero
CENPB (véase asimismo Jurka y Kapitonov, 1999; Smit, 1999; In­
ternational Human Genome Sequencing Consortium, 2001).
9.5.2 Algunos elementos LINE-1 humanos se transponen
de modo activo y permiten la transposición de
SINES, seudogenes y retrogenes procesados
Los elementos nucleares dispersos largos (LINE) son elementos
transponibles muy satisfactorios y tienen una historia evolucionis­
ta larga. Como elementos transponibles autónomos, pueden codi­
ficar los productos necesarios para asegurar la retrotransposición,
incluida la transcriptasa inversa esencial. Los LINES humanos se
integran con tres familias relacionadas de forma distante: LINE-1
(L-l), LINE-2 y LINE-3, que comprenden en conjunto alrededor
del 20% del genoma (cuadro 9-15). Se localizan sobre todo en re­
giones eucromáticas y están situados de preferencia en las bandas G
oscuras abundantes en AT (positivas a Giemsa) de cromosomas en
metafase (Korenberg y Rykowski, 1988). De las tres familias huma­
nas, LINE-1 (o L-l) es la única que aún lleva a cabo de modo ac­
tivo la transposición, es predominante y constituye alrededor del
17% del genoma. Es el elemento transponible humano más impor­
tante y se encuentra asimismo en otros mamíferos, incluidos los ra­
tones (Ostertag y Kazazian, 2001).
El elemento LINE-1 (L-l) de longitud completa tiene alrede­
dor de 6.1 kb de largo y codifica dos proteínas: una proteína de en­
lace de RNA y una proteína con actividades de endonucleasa y
transcriptasa inversa (fig. 9-18A). De manera excepcional, se loca­
liza un prom otor interno dentro de la 5'UTR y por consiguiente las
copias de transcritos de longitud completa llevan consigo su pro­
motor propio que puede utilizarse después de la integración en una
región permisiva del genoma. Después de la traducción, se ensam­
bla el RNA LINE-1 con sus proteínas codificantes propias y se
mueve hacia el núcleo. La endonucleasa corta un dúplex de DNA
en una cadena dejando un grupo OH 3’ libre que sirve como ce­
bador para la transcripción inversa del extremo 3' de RNA LINE.
El sitio preferido de corte de las endonucleasas es TTTT¿A y por
ello la preferencia para integrar regiones con abundancia de AT. El
DNA abundante en AT tiene muy pocos genes y por lo tanto su
tendencia a integrarse en el DNA abundante en AT significa que
LINES impone una carga mutacional más baja, lo que facilita que
su huésped se ajuste a ellos.
Con frecuencia, la transcripción inversa no prosigue durante la
integración hasta el extremo 5' y como resultado hay inserciones
truncadas, no funcionales. Por consiguiente, casi todas las repeti­
ciones derivadas de LINE son cortas, con un tamaño promedio de
900 pb para todas las copias LINE-1 y sólo alrededor de una en
100 copias es de longitud completa. La maquinaria LINE-1 tiene a
su cargo la mayor parte de la transcripción inversa en el genoma y

5' UTR O RF1 O R F2 3' UTR

AAAAAA-
A) Elemento LINE-1
n TTTTTT-

i
p40 T ra n s c rip ta s a in versa
y e n d o n u c le a s a

16 0
5' 130 .3 '
AAAAAA» A A A A A A .- ll
B) D ím e ro A lu I TTTTTT- TTTTTT- ■

32

Fig. 9-18. Elementos humanos de repetición LINE-1 y Alu.

A) Elemento LINE-1. El elemento LINE-1 (L-1) de 6.1 kb tiene dos marcos de lectura abiertos: un 0RF1 de 1 kb que codifica una proteína de enlace de
RNA y un 0RF2 de 4 kb que especifica una proteína con actividades de endonucleasa y transcriptasa inversa. Está situado un promotor interno dentro
de una región de DNA no traducida que antecede 0RF1 (llamada por convención 5'UTR), en tanto que en el otro extremo hay una secuencia (A)„/(T)„,
que a menudo se describe com o la poli(A) cola 3 '. La endonucleasa LINE-1 corta (4) una cadena de un dúplex de DNA, de preferencia dentro de la
secuencia TTTT4A y la transcriptasa inversa utiliza el extremo OH 3 ’ liberado para cebar la síntesis de cDNA. Los nuevos sitios de inserción están
flanqueados por una duplicación de un sitio blanco pequeño de siete a 20 pares de bases (pb). B) Repetición Alu. Se muestra el dímero Alu estándar de
consenso con dos repeticiones similares que terminan en una secuencia parecida a (A)„/(T)„. Tienen diferentes tamaños debido a la inserción de un
elemento de 32 pb con la repetición más grande. Existen asimismo monómeros Alu en el genoma humano, al igual que varias copias truncadas de
monómeros y dímeros.
 9.5 DNA NO CODIFICANTE REPETIDO DISPERSO 271

rem ite la retrotransposición de los SINE no autónomos y la crea-
n de seudogenes y retrogenes procesados (Esnault y cois., 2000;
>?jción 9.3.6). De las cerca de 6 000 secuencias LINE-1 de longi-
completa, alrededor de 60 a 100 son capaces aún de sufrir
—preposición y, en ocasiones, causan enfermedades al alterar la fun-
n del gen después de insertarse en una secuencia conservada im-
portante (sección 11.5.6).
9.5.3 Las repeticiones Alu ocurren más de una vez
cada 3 kb en el genoma humano y pueden
someterse a selección positiva
elementos nucleares dispersos cortos (SINES) tienen alrede-
dor de 100 a 400 pb de largo, suelen ser muy útiles para formar co-
¡onias en genomas de mamíferos y dan por resultado una
diversidad de familias con un número de copias notorio. Algunos
>.NES humanos son específicos de primates, como la familia Alu;
:rros no están restringidos a los primates y también se encuentran
en marsupiales y monotremas y se describieron como familias MIR
del inglés mammalian-wide interspersed repeat, repetición disper-
en mamíferos) (cuadro 9-15). Los SINES no codifican ninguna
rroteína y no son autónomos. LINES y SINES comparten secuen­
cias en su extremo 3' y se ha demostrado que SINES se desplaza
por el compañero vecino LINES (Kajikawa y Okada, 2002). Me­
diante parasitación de la maquinaria de transposición del elemento
LINE, SINES puede alcanzar grandes números de copias.
Los SINES de mamíferos se originaron a partir de copias de
tRNA (en muchos casos) o RNA SRP(7SL), como sucede en la re­
petición Alu (Ullu y Tschudi, 1984) y la rep etició n B1 del ratón
(véase sección 12.4.1). A los genes que codifican tRNA y RNA
SRP los transcribe la polimerasa III de RNA y son poco comunes
porque poseen prom otores internos (fig. 10-4). Sin embargo, el pro­
motor de polimerasa III interno llevado por las repeticiones Alu no
es suficiente para la transcripción activa in vivo y se requieren se­
cuencias de flanqueo apropiadas para su activación. Por consiguien­
te, después de la integración se torna inactiva una copia Alu recién
transpuesta, a menos que se coloque de manera fortuita en una re­
gión que permite que sea activo el promotor.
La repetición Alu es la secuencia más abundante en el genoma
humano y ocurre en promedio más de una vez cada 3 kb (Interna­
tional Human Genome Sequencing Consortium, 2001; Li y cois.,
2001). Existe una serie de subfamilias Alu de diferentes edades evo­
lutivas con sólo alrededor de 5 000 copias que se integraron en el
genoma en los últimos cinco millones de años desde la divergencia

13 14 15 16 22 23
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12, 18 19 20 2 1 \ 7 2 4 2 5 2 6 27

E xo nes I
RB1
U 16

5'
Repeticiones
Alu

t -

5' -------------------1----------- {-§--------------------------1 ------------ ■ ---------------------------- ■ --------------3'

Repeticiones
U N E -1 3' -------- 1----H------■ -------1 -------------- I— I-------------------------------------------- 1 ---------------------------5'

5' -|---------- — t---------------3'

Repeticiones
(A W (T)n
' 3
I
| III II II I I I III, | III I 11 IIII I1 I 1 11
/\ Js \ / 1 1

kb -|------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1 i i
0 20 40 60 80 100 120 140 160 18 0

Fig. 9-19. Localizaciones de las repeticiones Alu, LINE-1 y (A)„/(T)„ dentro del gen de susceptibilidad al retinoblastoma humano, RB1.

El intrón 17 de 72 kb contiene un gen receptor acoplado a proteína G, U16, que se transcribe de modo activo en la dirección opuesta al gen R B I. La
línea superior (5' -» 3 ') de cada par muestra los elementos de repetición orientados en la dirección en sentido RB1\ la línea inferior (3' - * 5) los muestra
en la orientación antisentido. Hay 46 repeticiones Alu y 17 elementos UNE-1 (algunos agrupados de cerca se muestran con líneas divergentes), todos
localizados dentro de intrones. Sólo dos de los elementos LINE-1 se aproximan a la longitud completa de 6.1 kb. Las secuencias (A)„/(T)„ (n = 12 o
mayor) indicadas sólo son las que se hallan fuera de las repeticiones dispersas. No se encontraron ejemplos de (C y (G )„ para n = 12 o mayores.
Redibujado a partir de Toguchida y colaboradores (1993), Genomics 17, 535-543, con autorización de Elsevier.
272 CAPÍTULO NUEVE ORGANIZACIÓN DEL GENOMA HUMANO
de los seres humanos y los monos africanos (véase Batzer y Deinin-
ger, 2002). La repetición Alu de longitud completa tiene alrededor
de 280 pb de largo y consiste en dos repeticiones tándem, cada una
de unos 120 pb de longitud seguida de una secuencia corta que es
abundante en residuos A en una cadena y residuos T en la cadena
complementaria. Sin embargo, existe asimetría entre las repeticio­
nes tándem: una repetición contiene una secuencia interna de 32
pb que falta en la otra (fig. 9-18B). Son comunes asimismo monó-
meros, que sólo contienen una de las dos repeticiones tándem y
varias versiones truncadas de dímeros y monómeros, que propor­
cionan un promedio de extensión del genoma de 230 pares de
bases.
Las repeticiones Alu poseen un contenido relativamente alto de
GC, aunque están esparcidas en especial en la totalidad de las re­
giones eucromáticas del genoma, y se localizan de preferencia en las
bandas cromosómicas R abundantes en GC y asimismo en genes, en
contraste notable con la localización preferencia! de LINES en
DNA rico en AT (Korenberg y Rykowski, 1988). No obstante,
cuando se ubican dentro de genes están, al igual que los elemen­
tos LINE-1, confinadas en intrones y regiones no traducidas (fig.
9-19). A pesar de la tendencia a localizarse en DNA abundante en
GC, las repeticiones Alu d e transposición reciente muestran una pre­
ferencia por DNA abundante en AT semejante a las de LINE, pe­
Lecturas adicionales
Human Genome Nature Issue (15 February 2001). Nature 409
813-958 (papers are available electronically via the Nature
Genome Gateway at http://wvwv.nature.com/genomics/human/)
Human Genome Science Issue (16 February 2001). Science 291,
1177-1351 (papers are available electronically at http://www.
sciencemag.org/content/vol291issue5507/index.shtml/)
InterPro proteome analysis database at http://www.ebi.ac.uk/
proteome/
MITOMAP human mitochondrial genome database at
http://www.mitomap.org
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the genomic distribution of alpha satellite DNA on all the human
ro las Alu progresivamente más viejas muestran una predisposición
cada vez más potente hacia DNA abundante en GC (International
Human Genome Sequencing Consortium, 2001).
La predisposición en la distribución total de Alu a regiones ri­
cas en GC (y, por consiguiente, con abundancia de genes) puede
resultar de una presión de selección potente. Ello sugiere que las re­
peticiones Alu no son tan sólo parásitos del genoma sino que llevan
a cabo una contribución útil a las células que las contienen. Se sa­
be que algunas secuencias Alu se transcriben de forma activa y es
posible que se incorporaran para una función útil. El gen BCYRN1
que codifica un RNA citoplásmico pequeño neural, BC200, surgió
de un monómero Alu y es una de las pocas secuencias Alu que son
activas desde el punto de vista transcripcional bajo circunstancias
normales (Martignetti y Brosius, 1993). En muchas especies, los SI-
NE se transcriben en condiciones de estrés y los RNA resultantes
enlazan una cinasa de proteína específica (PKR) y bloquean su ca­
pacidad para inhibir la traducción de proteínas. Los RNA SINES
promoverían en consecuencia la traducción de proteínas bajo es­
trés. Tal vez una función general de los SINES (Schmid, 1998) es
regular la traducción de proteínas (pueden transcribirse con rapidez
RNA SINES en grandes cantidades de miles de elementos y fun­
cionar sin traducción proteínica).
Mouse Genome Nature Issue (5 December 2002). Nature 420
447-590 (papers are available electronically via the Nature Ge­
nome Gateway at http://www.nature.com/nature/mousegeno-
me/index.html)
NCBI guide to on-line information resources on the human
genome at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/
Noncording RNAs Database at http://biobases.ibch.poz-
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Pfam protein domain family database at http://www.sanger.
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CAPÍTULO DIEZ

Expresión gènica humana

Contenido del capítulo

Recuadro 10-1 Restricción espacial y temporal de la expresión génica en células de mamíferos 276
Recuadro 10-2 Clases de elementos de secuencia de acción cis que participan en la regulación
276 CAPÍTULO DIEZ EXPRESIÓN GÈNICA HUMANA
10.1 G eneralidades de la expresión
gènica en células hum anas
Aunque los mecanismos de control que regulan la expresión de ge­
nes humanos pueden ser más complejos que los de eucariotas infe­
riores, se aplican muchos de los mismos principios básicos. Los
mamíferos son organismos multicelulares en particular complejos y
por esa razón quizá no sorprenda que algunos de los mecanismos
que controlan la expresión genica de mamíferos no se empleen en
bacterias o algunos otros eucariotas. La expresión se restringe de
manera espacial y temporal (recuadro 10-1). Aunque simplista, es
conveniente considerar tres niveles amplios a los que la regulación
genica puede operar:
► regulación tra nscripcional d e la expresión gènica . El principal
control de la regulación gènica en eucariotas ocurre a nivel del
inicio de la transcripción, a través del promotor central de un
gen, y a nivel de la incorporación y el procesamiento de la po­
limerasa de RNA importante. El enlace de factores de trans­
cripción al promotor inicia la expresión genica. Los niveles
basales de transcripción pueden modularse por el enlace de fac­
tores proteínicos a otras regiones reguladoras en secuencias de
flanqueo o intrónicas cercanas;
Recuadro 10-1. Restricción espacial y temporal de la expresión génica en células de mamíferos
RESTRICCIÓN ESPACIAL DE LA EXPRESIÓN GÉNICA
Es necesario que los genes cuidadores se expresen esencialmente en to­
dos los tipos de células nucleadas porque codifican un producto funda­
mental indispensable para satisfacer una función general en todas las
células, por ejemplo, síntesis de proteínas, producción de energía, etc.
Sin embargo, numerosos genes eucariotas muestran patrones de expre­
sión génica específica de tejido mucho más restringidos. La restricción
espacial de la expresión génica puede ocurrir a diferentes niveles:
► patrón múltiple de órgano/tejido. En algunos casos un gen puede
desempeñar un tipo de función similar en diferentes sistemas orgáni­
cos. Es posible que en la regulación de genes blanco en varios siste­
mas orgánicos diferentes participe una diversidad de genes que
tienen una función crucial en el desarrollo temprano, por ejemplo, el
gen hedgehog sónico se expresa en diversas partes del sistema ner­
vioso, en las extremidades en desarrollo y en alguna otra parte. En
otros casos un gen puede codificar distintas variantes (isoformas) en
diferentes tejidos mediante promotores específicos de tejido o empal­
me alternativo específico de tejido. En algunos casos éstos pueden
tener diferentes funciones (sección 10.3.2);
► tejido, linaje celular o tipo de célula específicos. Algunos genes
tienen una función apropiada para un tipo de célula o linaje celular
particular, como el gen de globina beta que se expresa en células eri-
troides;
► células individuales. Algunos genes especializados elaboran distintos
productos en células individuales que pertenecen al mismo tipo celular.
Por ejemplo, los diferentes linfocitos B en una persona expresan distin­
tas moléculas de anticuerpo (específicas de células), las diversas célu­
las T producen distintos receptores de célula T y neuronas olfatorias
individuales elaboran diferentes receptores olfatorios. Nota: también es
posible que ocurra variación en la expresión entre distintas células del
mismo tipo en un tejido como resultado de expresión monoalélica alea­
toria (como en la inactivación del cromosoma X; sección 10.5.6);
► regulación postran scripcion a l d e la expresión gén ica . Abarca
mecanismos que operan a nivel del procesamiento de RNA, el
transporte de mRNA, la traducción, la estabilidad del mRNA,
el procesamiento de proteínas, los blancos proteínicos, la esta­
bilidad de proteínas, etc. A nivel del procesamiento de RNA,
diferentes mecanismos como el empalme de RNA (que en rea­
lidad es un mecanismo cotranscripcional) permiten que un gen
genere una diversidad de productos génicos distintos (isofor-
mas). La regulación de la traducción suele incluir el reconoci­
miento de secuencias reguladoras en regiones no traducidas
por factores proteínicos de acción trans;
► m ecanismos epigenéticos y control d e largo alcance d e la expresión
génica. Los factores genéticos dependen de cambios en la secuen­
cia del DNA. Las modificaciones adicionales que son hereditarias
(de la célula a la célula hija o del padre al niño) pero que no depen­
den de cambios en la secuencia d el genom a se describen como epi-
genéticas. La mediación del DNA es uno de los muy pocos
mecanismos epigenéticos que se sabe operan en células de mamí­
feros, en las que desempeñan una función muy importante en la
regulación génica (Bird, 2002). Además de actuar como un mé­
todo general para conservar la represión de la transcripción, par­
ticipa de manera crucial en mecanismos que operan en algunos
► distribución intracelular. Las proteínas de diferentes genes se trans­
portan a distintos sitios intracelulares (o extracelulares). En algunos ca­
sos diferentes isoformas de la misma proteína pueden enviarse a
distintas localizaciones intracelulares (sección 10.3.2). Además se re­
quieren mecanismos de control génico a fin de enviar mRNA para algu­
nos genes a diferentes localizaciones intracelulares (sección 10.2.6).
RESTRICCIÓN TEMPORAL DE LA EXPRESIÓN GÉNICA
► Etapa del ciclo celular. Además del silenciam iento génico general
a gran escala conform e los crom osom as se condensan en la m ito-
sis, algunos genes sólo se expresan en momentos específicos del
ciclo celular. Por ejemplo, m uchos genes de histona sólo se expre­
san en la fase S (síntesis de DNA) y la expresión de varios regula­
dores del ciclo celular está programada para ocurrir en etapas
específicas del mismo.
► Etapas del desarrollo. En las etapas muy tempranas del desarrollo
no se observa transcripción; en lugar de ello las células disponen de
RNA sintetizado con anterioridad. Más adelante se expresan en forma
pasajera ciertos genes en etapas específicas. Algunas familias géni-
cas contienen miembros que se expresan en diferentes etapas del de­
sarrollo, por ejemplo, los genes de globina (figs. 10 -22 ,10 -23).
► Etapa de diferenciación. Conforme las células se diferencian, sus
genomas se modifican y producen patrones de expresión génica alte­
rados. En algunas células diferenciadas terminalmente no ocurre
transcripción. Hasta el nacimiento de Dolly, la oveja clonada, solía
pensarse que las modificaciones del genoma que dan lugar a la pro­
gresión a una célula somática adulta nucleada eran irreversibles (sec­
ción 20.2.2);
► Expresión inducible. Algunos genes se activan en respuesta a indi­
cios ambientales o señalamiento extracelular de otras células (sec­
ción 10.2.5). Esta expresión génica se revierte con facilidad si el
factor inductor se suprime.
 10.2 CONTROL DE LA EXPRESIÓN GENICA POR ENLACE DE FACTORES PROTEÍNICOS.
genes para asegurar que en condiciones normales sólo se exprese
uno de los dos alelos de la herencia paterna (expresión monoalé-
lica), inclusive aunque la secuencia nucleótida del alelo no expre­
sado sea idéntica a la del alelo expresado. El resultado de los
mecanismos epigenéticos suelen ser la perpetuación de la altera­
ción de la conformación de la cromadna en distancias largas.
El cuadro 10-1 presenta una revisión general de los diferentes me­
canismos que participan en la regulación de la expresión de genes
humanos.
10.2 Control de la expresión génica
por e n la c e de facto res proteínicos
de acción trans a secuencias
reguladoras de acción cis en
DNA y RNA
Gran parte del control de la expresión génica (sea que ocurra a ni­
vel del inicio de la transcripción , el procesamiento de RNA, la tra­
ducción, el transporte de RNA, etc.) comprende el enlace de
factores proteínicos a secuencias reguladoras de ácido nucleico. Es­
Cuadro 10-1. Generalidades de la regulación de la expresión génica en células humanas.
Mecanismo de expresión selectiva
Transcripcional
Modificación de historia, remodelación de cromatina
Enlace de factores de transcripción específicos de tejido a elementos
de acción cis de un gen aislado
Enlace directo de hormonas, factores de crecimiento o intermedios a
elementos de respuesta en elementos de transcripción inducibles
Uso de promotores alternativos en un gen único
Postranscripcional
Empalme alternativo
Poliadenilación alternativa
Edición de RNA específico de tejido
Mecanismos de control traduccional
Mecanismos epigenéticos/control de largo alcance por la estructura
de la cromatina
Exclusión aléllca
Control de largo alcance por la estructura de la cromatina
Señalamiento de largo alcance dependiente de la posición celular
277
tas últimas pueden ser secuencias de DNA que se encuentran en la
cercanía del gen o aun dentro del mismo, o secuencias transcritas
del RNA precursor o mRNA. Los factores proteínicos que partici­
pan en la regulación de la expresión génica y que son codificados
por genes que se localizan a distancia deben migrar a su sitio de ac­
ción y en consecuencia se denominan factores de acción trans. En
contraste, las secuencias reguladoras a las que se enlazan suelen ser
de acción cis porque se encuentran en la misma molécula de DNA
o RNA que el gen o transcrito de RNA que se regula.
Control mediante enlace de DNA y proteína
En células eucariotas, un punto de control de la expresión génica
mayor se encuentra a nivel del inicio de la transcripción. Puesto que
la cromatina es una estructura muy organizada y densamente em­
pacada que no permite con facilidad el acceso a polimerasas de
RNA, se requieren enzimas de rem odelación d e la crom atina para
alterar su doblez y estructura básica con objeto de convertirla en
una estructura más abierta y activa que permita que la transcripción
se realice. Se sabe que tres tipos de polimerasas de RNA diferentes
transcriben distintas clases de genes (véase cuadro 1-4) y en cada ca­
so se trata de enzimas grandes, consistentes en 8 a 14 subunidades.
Ejemplos
Véase sección 10.2.1
Véase cuadro 10-3
Elementos de respuesta cAMR elementos de respuesta de hormonas
esferoides, etc. (véase cuadro 10-4; fig. 10-10)
Véase figura 10-14 para el gen de distrofina y figura 10-20 para el gen
D nm tl
Sección 10.3.2; figuras 10-15 y 10-16
Sección 10.3.2; figura 10-15E
Sección 10.3.3.; figura 10-17
Sección 10.2.6; figura 10-13; figura 9-6
Reordenamientos del DNA en linfocitos B y T que producen inmunoglo-
bulinas específicas de célula y receptores de célula T (sección 10.6.1)
Inactivación por el producto génlco XIST de muchos genes en el único
cromosoma X en el que se expresa en células femeninas (sección
10.5.6)
Exclusión alélica aleatoria por mecanismos desconocidos, p. e j„ IL-2,
IL-4, PAX5, etc. (sección 10.5.3; recuadro 10-4)
Impronta de ciertos genes (secciones 10.5.4,10.5.5)
Competencia por intensificadores o silenciadores (p. ej., la expresión
de globina; véase secciones 10.5.2 y 10.5.5)
Efectos de la posición (sección 10.5.1)
Sección 10.4.1
278 CAPÍTULO DIEZ EXPRESIÓN GÈNICA HUMANA
Las polimerasas de RNA transcriben genes después del enlace
de proteínas {factores d e transcripción) a secuencias reguladoras de
DNA específicas dentro del gen o en su cercanía. Los factores de
transcripción pueden ser de dos clases:
► se requieren factores d e transcripción general para la transcripción
de la mayor parte de los promotores para una clase específica de
polimerasa de RNA (es decir, los factores de transcripción gene­
ral son sobre todo únicos para una clase de polimerasa, aunque
las tres clases de polimerasas comparten cuando menos un fac­
tor, la p roteín a d e en lace d e la caja TATA). Por ejemplo, en los
genes codificadores de polipépddos una polimerasa particular,
la polimerasa de RNA II, actúa en conjunto con factores de
transcripción general relacionados a fin de producir un nivel ba­
sai de transcripción;
► los factores d e transcripción especializados pueden modular nive­
les de expresión basai e incluyen fa cto res d e transcripción espe­
cíficos d e tejid o y factores relacionados con la transcripción de
juegos de genes específicos. Las proteínas que se enlazan a se­
cuencias de DNA específicas y estimulan la transcripción se co­
nocen como activadoras (o transactivadoras). Las que tienen
un efecto antagónico, de silenciamiento de la actividad trans-
cripcional, se denominan represoras.
Además de los factores de transcripción que pueden activar o repri­
mir la expresión gènica tras el enlace de DNA, una variedad amplia
de proteínas reguladoras afecta la expresión genica pero no se enlaza
a l DNA en sí mismo, sino más bien a los factores de transcripción. Es­
tas proteínas se conocen como coactivadoras o correpresoras (según
se unan a activadores o represores de la transcripción; véase Lemon
yTjian, 2000 ).
Control mediante enlace de RNA y proteína
Aparte de los factores de transcripción, para regular la expresión gè­
nica se utilizan proteínas de enlace de RNA. Los ejemplos mejor es­
tudiados comprenden el enlace a secuencias reguladoras en
secuencias de mRNA no traducidas, que permiten controlar la tra­
ducción de la expresión gènica. Asimismo cabe esperar que en el
control de la expresión gènica a nivel del procesamiento diferencial
del RNA participen interacciones específicas del enlace RNA y pro­
teina, como en el caso del enlace de proteínas SR y HnRNP a pre-
mRNA a fin de modular la elección de exones en el empalme (corte
y unión). Los últimos mecanismos se comentan por separado en la
sección 10.3 con objeto de ilustrar la enorme complejidad de los
mecanismos de expresión que suelen emplearse para descodificar
genes únicos y la importancia de las grandes cantidades de isofor-
mas que pueden producirse como resultado.
10.2.1 La modificación de la histona y la remodelación
de la cromatina facilitan el acceso a la
cromatina mediante factores de enlace de DNA
El DNA sin actividad transcripcional está organizado en una estruc­
tura cromatínica condensada que muestra una vinculación estrecha
entre las histonas centrales y el DNA. El empacamiento denso de
los nucleosomas puede denegar el acceso a una diversidad de dis­
tintas proteínas necesarias para interactuar con el DNA, no sólo
las proteínas que participan en la expresión gènica, sino también
factores necesarios para la replicación del DNA, su reparación, etc.
La estructura local de la cromatina puede alterarse de manera re­
versible de una conformación condensada a una más accesible me­
diante la modificación de la histona y la remodelación cromatíni­
ca.
Modificación de la histona
Las histonas están organizadas en nucleosomas de forma tal que sus
colas (en especial los extremos terminal N) salen del octámero de
histona. Las colas terminal N expuestas de las cuatro histonas cen­
trales tienen una secuencia muy conservada y desempeñan funcio­
nes cruciales en la regulación de la estructura de la cromatina. Se
sabe bien que las histonas H3 y H4, en particular, contienen cier­
tos aminoácidos que están sujetos a modificación (véase Goll y Bes-
tor, 2002 y fig. 10-1). Se piensa que el patrón total resultante de las
modificaciones del residuo de histona en regiones específicas de la
cromatina forma un código de histona que rige un resultado final
biológico particular (véase Berger, 2002; Turner, 2002).
La acetilación de la histona es una de las modificaciones de la
histona (que también abarcan metilación, fosforilación y ubiquiti-
nilación) mejor investigadas. Varias acetiltransferasas d e histona
(HAT) catalizan la adición de grupos acetilo (CH3CO—) al grupo
amino e—NH3+ en las cadenas laterales de hasta 13 de los 30 resi­
duos de lisina en las colas terminales N expuestas de un octámero
de histona. Las HAT funcionan como coactivadores de la transcrip­
ción. Es posible que esto se deba en parte a la pérdida de cargas po­
sitivas cuando las cadenas laterales de lisina cargadas se modifican,
lo que produce una afinidad reducida entre histonas y DNA. Las
histonas modificadas también son blancos para maquinarias de re­
modelación de la cromatina (véase más adelante). El efecto neto
consiste en facilitar el acceso de la polimerasa de RNA y los facto­
res de transcripción a la región promotora. Las desacetilasas d e his­
tona {HDAC) tienen el efecto opuesto, eliminar grupos acetilo y
promover la represión transcripcional. Se piensa que las HDAC se
incorporan como parte de un complejo correpresor en respuesta a la
m etilación d el DNA (sección 10.4.3; véase fig. 10-21).
Diferentes clases de metiltransferasas dirigidas a ciertos residuos
de arginina y lisina en las histonas efectúan la metilación de la his­
tona. Aunque la metilación de la arginina de la histona participa en
la activación de la transcripción, la metilación de la lisina de la his­
tona puede ser una señal para la represión transcripcional, como en
la metilación de H3K9 (histona 3, lisina en la posición 9) que pue­
de inducirse después de la desacetilación del mismo residuo (sec­
ción 10.4.2; véase fig. 10-21).
Remodelación de la cromatina
Los complejos de remodelación de la cromatina dependientes de
ATP recurren a la hidrólisis del ATP para cambiar en forma tem­
poral la estructura de los nucleosomas (véase Narlikar y cois., 2002).
Es posible que la remodelación de la cromatina facilite el acceso de
varias proteínas al DNA. Aun después que el complejo de remode­
lación del DNA se disocia, los nucleosomas pueden permanecer
cierto tiempo en un estado remodelado en el que los contactos en­
tre DNA e histona se tornan laxos. En algunos casos la remodelación
incluye la alteración de la posición de los nucleosomas, lo que deter­
mina que se deslicen a lo largo del DNA. Como resultado del desli­
zamiento del nucleosoma, secuencias antes envueltas alrededor de
octámeros de histona se vuelven más accesibles. Además algunos
complejos de remodelación pueden restablecer el estado de inactivi­
dad transcripcional.
 10.2 CONTROL DE LA EXPRESIÓN GENICA POR ENLACE DE FACTORES PROTEÍNICOS. 279

(Me)

© A [r] T K Q T A T G G |K i A P [R j K Q L A T K
HISTONA
H3
2 4 9 10 14 17 18 23

HISTONA
H R L R D N I Q G
H4

Clave ( a c ) A c e tila c ió n

(M
M ee)) M e tila c ió n

F o s fo rilac ió n
( p)

Fig. 10-1. Modificaciones de las histonas H3 y H4.

Se muestran las modificaciones de residuos de la terminal N de las histonas 3 y 4 (que son parte de las colas expuestas cuando se encuentran en
el octámero de histona). Obsérvese que H3K9 (el residuo lisina en la posición número 9 de la histona H3) puede acetilarse y también metilarse. La
acetilacion se acompaña de cromatina con actividad transcripcional pero si la región de la cromatina se metila en CpG, las proteínas que se enlazan a
CpG pueden incorporar desacetilasas de histonas que conducirán a la eliminación de residuos acetilo y el residuo H3K9 se metila después mediante
una metiltransferasa de histona enlazada a las proteínas de unión CpG. El residuo H3K9 metilado es luego un blanco para enlace por proteina que induce
la condensación de la cromatina (véase fig. 10-2 1 ).

Los complejos de remodelación de la cromatina se encuentran
en diferentes variedades y cada uno contiene múltiples subunida-
des (por lo general >10) . Además de dominios de ATP-asa, portan
otros dominios que interactúan con histonas modificadas, lo que
perm ite la acción ordenada entre la m odificación de la histona y la re­
m odelación d e la cromatina. Comprenden los bromodominios de la
familia SWI/SNF, que se sabe interactúan con residuos de lisina
acetilados en histonas, y los cromodominios de la familia Mi-2 que
interactúan con lisinas metiladas (véase Berger, 2002; Narlikar y
cois., 2002 ).
10.2.2 La transcripción mediante polimerasas de RNAI
y III requiere tactores de transcripción ubicuos
Las polimerasas de RNA I y III en células eucariotas están dedica­
das a transcribir genes para formar moléculas de RNA (rRNA, tR-
NA, etc.) que colaboran en la expresión de los genes codificadores
de polipéptidos. Los genes transcritos son genes cuidadores ya que
en esencia todas las células requieren rRNA y tRNA para contribuir
en la síntesis de proteínas. Como resultado, se necesitan factores de
transcripción ubicuos para asistir a las polimerasas de RNA I y III.
Transcripción mediante polimerasa de RNA I
La polimerasa de RNA I está limitada al nucléolo y dedicada a la
transcripción de los genes de rRNA 18S, 5.8S y 28S. Los últimos
se encuentran organizados de manera consecutiva en una u n idad
d e transcripción policistrón ica de 13 kb (véase fig. 10-2). Una uni­
dad compuesta por la unidad de transcripción de 13 kb y un espa­
cia d or no transcrito de 27 kb adyacente se repiten en forma
tándem cerca de 30 a 40 veces en los brazos cortos de cada uno de
los cinco cromosomas acrocéntricos humanos, en las regiones nu-
cleolares organizadoras. Los cinco grupos resultantes de genes rR­
NA, cada uno de los cuales tiene alrededor de 1.5 Mb de largo, se
denominan DNA ribosómico o rDNA.
La transcripción de los genes rRNA 28S, 5.8S y 18S inicia tras
el enlace de los dos factores de transcripción a un elemento promo­
tor central en el sitio de inicio de la transcripción y a un elem ento
d e con trol corrien te arriba localizado más de 100 nucléotidos co­
rriente arriba. Uno de los factores de transcripción, U B F (del inglés
upstream b in din g fa ctor, factor de enlace corriente arriba) es un
homodímero y sus subunidades idénticas pueden enlazarse prime­
ro al elemento promotor central y el elemento de control corriente
arriba, uniéndolos entre sí de manera que el segundo factor, SL1
(factor selectivo 1, que en el ratón se conoce como TIF-1B, véase fig.
10-3), pueda enlazarlos. Los factores de transcripción enlazados in­
corporan después polimerasa de RNA I para formar un complejo
de inicio.
El transcrito primario expresado a partir de la unidad de trans­
cripción única de 13 kb es un rRNA precursor 45S que experimen­
ta una variedad de reacciones de corte y modificaciones específicas
de base (efectuadas por un gran número de tipos de RNA nucleo-
lares peq ueñ os diferentes,) a fin de generar las especies maduras de
rRNA 28S, 5.8S y 18S (véase fig. 10-2). Por consiguiente estos ge-
280 CAPÍTULO DIEZ EXPRESIÓN GÈNICA HUMANA

Unidad de transcripción rDNA Espaciador intergénico

— 1 3 k b ------- H l — '------- - 2 7 k b -------------\

ITS1 IT S 2
ETS 18S 5 .8 S 28S
DNA

Transcrito AJ. *
primario ■— 0 — I 45S

Y? - Q —
*i 41S

C D £
20S [ i -ü — 3 32S

5 .8 S
□
18S I 28S

Fig. 10-2. Las principales especies de rRNA humano se sintetizan mediante el corte de una unidad de transcripción común de 13 kb que es parte
de una unidad de 40 kb de repetición tándem.
Las flechas pequeñas señaladas por las letras A a D indican las posiciones del corte de precursores de RNA por endonucleasa. El corte del precursor 41S
en B genera dos productos: 20S + 32S. Tras el corte del precursor 32S en D, y la excisión del rRNa 5.8S pequeño, se realiza el enlace de hidrógeno entre
el rRNA 5.8S y un segmento central complementario del rRNA 28S. Los cerca de 6 kb de secuencias de RNA que se originan a partir de las unidades
espaciadoras transcritas internas y externas (ETS, ITS1 e ITS2) se degradan en el núcleo. S es el coeficiente de sedimentación, una medida de tamaño.

nes difieren de la inmensa mayoría de los genes nucleares, que se
transcriben en forma individual. En lugar de ello, la transcripción
de rRNA se semeja a la transcripción de mtDNA (sección 9.1.2;
fig. 9.2): ambos dan por resultado transcritos multigénicos que
proporcionan productos relacionados funcionalmente. Sin embar­
go, este uso poco habitual de los transcritos poligénicos primarios
no es diferente en principio de la forma en que a veces se corta un
producto d e traducción primario único para generar dos o más poli-
péptidos relacionados en términos funcionales (véase el ejemplo de
la insulina humana en la fig. 1-23).
Transcripción mediante polimerasa de RNA III
La polimerasa de RNA III también participa en la transcripción de
una diversidad de genes cuidadores, que codifican varias moléculas
de RNA pequeñas estables, como las de rRNA 5S, tRNA, RNA
7SL y algunas de las moléculas de snRNA necesarias para el empal­
me de RNA. Estos genes se distinguen por promotores situados
dentro de la secuencia de codificación del gen, en lugar de corrien­
te arriba de la misma. Se encuentra un promotor bipartido en ge­
nes tRNA, constituido por dos secuencias bien conservadas, las
cajas A y B, pero el promotor del gen rRNA 5S consiste en un ele­
mento aislado, la caja C. Se piensa que en cada caso la transcrip­
ción mediante polimerasa de RNA III prosigue por el enlace de
factores de transcripción ubicuos a los elementos promotores, se­
guido del enlace subsecuente de otros factores y por último de la
incorporación de la polimerasa (fig. 10-4).
10.2.3 La transcripción mediante polimerasa de
RNA II requiere juegos completos de secuencias
reguladoras de acción cis y factores de
transcripción específicos de tejido
La polimerasa de RNA II tiene a su cargo la transcripción de todos
los genes codificadores de polipéptidos y también ciertas especies del
gen de snRNA. La polimerasa de RNA II (como las polimerasas de
RNA I y III) depende de factores de transcripción general auxiliares
y se conocen varios que pueden tener una estructura compleja. Por
ejemplo, TFIID consiste en la proteína de enlace a la caja TATA,
TBP (que también se relaciona con las polimerasas de RNA I y III),
además de varios factores asociados a TBP, o proteínas TAF (véase
también cuadro 10-2). El complejo de polimerasa y factores de trans­
cripción generales se conoce como aparato de transcripción basal y
es todo lo necesario para iniciar la transcripción. Los genes se expre­
san de modo constitutivo a un índice mínimo determinado por el
prom otor central (véase más adelante) a menos que elementos regula­
dores positivos o negativos adicionales (que pueden localizarse a cier­
ta distancia lejana o ser componentes intrínsecos de la región promotora
en sí misma) aumenten o enciendan el ritmo de transcripción.
Algunos de los genes que codifican polipéptidos son genes cuida­
dores, pero a diferencia de los genes transcritos por las polimerasas de
RNA I y III, un gran porcentaje de genes transcritos por la polimera­
sa de RNA II muestra patrones de expresión restringidos a tejido o es­
pecíficos de tejido. Como el DNA en diferentes células nucleadas de
un individuo es en esencia idéntico, la identidad de una célula, sea un
 10.2 CONTROL DE LA EXPRESIÓN GENICA POR ENLACE DE FACTORES PROTEÍNICOS.
E lem en to de Elem en to
control corriente prom otor
arriba (E C C A ) central (E P C )
-100
I
Enlace del factor de enlace
corriente arriba (FEC A ) y
factor 1 de selectividad (SL1)
EPC
Incorporación de polimerasa
de R N A I
I T F IIIB
Polim erasa de R N A I
Fig. 10-3. Inicio de la transcripción por polimerasa de RNA I.
Un posible modelo considera el enlace inicial de las dos subunldades Idénti­
cas del factor de enlace corriente arriba con el elemento de control corriente
arriba y el elemento promotor central. Ello fuerza el acercamiento de estas
dos secuencias y posibilita su enlace subsecuente por el factor de selectivi­
dad 1 (SL1; cuatro subunidades). La estructura estabilizada permite el en­
lace de otros factores (no se muestra) y después de polimerasa de RNA I.
hepatocito o un linfocito T, por ejemplo, se define en muy gran par­
te por las proteínas que la célula elabora. Por tanto, además de los fac­
tores de transcripción general ubicuos, los factores de transcripción
específicos de tejido o restringidos a tejido regulan la expresión de
muchos genes codificadores de polipéptidos mediante el reconoci­
miento y la unión de elementos de secuencia de acción cis específicos.
El gran tamaño de los genomas nucleares de mamíferos y la nece­
sidad general de sistemas de control más complicados impuesta por la
presencia de números muy grandes de genes que interactúan determi­
nan que los elementos de control en células eucariotas sean muy elabo­
rados. Con frecuencia la regulación de la expresión de genes humanos
individuales está controlada por varios juegos de elementos regulado­
res de acción cis. Si bien los elementos reguladores individuales pueden
estar compuestos por múltiples elementos de secuencia corta (por lo
general de 4 a 8 nucléotidos de largo) distribuidos en unos pocos cien­
tos de pares de bases, las diferentes clases de elemento regulador que
modulan la expresión de un gen aislado pueden localizarse a distancias
considerables. Es posible reconocer una diversidad de distintos tipos de
elementos de acción cis, inclusive promotores, intensificadores, silen­
ciadores, elementos de enlace (aisladores) y elementos de respuesta
(véase recuadro 10-2 y figs. 10-5 y 10-6).
281
A)
G en tR N A
+1 A caja B caja +7
G en R N A 5S
+1 _________ C caja
B)
P o lim erasa
d e R N A III
Fig. 10-4. Los genes de tRNA y rRNA 5S tienen promotores localiza­
dos dentro de la secuencia de codificación.
A) Posiciones de los elementos promotores en los genes de tRNA y
rRNA 5S. Los elementos promotores A y B en los genes de tRNA se
localizan en las secuencias que especifican el asa D y las asas Ti|)CG
respectivamente (véase estructura del tRNA en la fig. 1-7B). B) Inicio
de la transcripción de un gen de tRNA. El enlace del factor de trans­
cripción TFIIIC a los elementos promotores permite el enlace subse­
cuente del factor TFIIIB trim érico a la secuencia justo corriente arriba
del sitio de inicio de la transcripción. En respuesta al enlace del factor
TFIIIB, se enlaza polimerasa de RNA III e Inicia la transcripción. En los
genes rRNA 5S se observa un mecanismo similar pero en este caso se
requiere el enlace de un factor de transcripción adicional, TFIIIA, a la
caja C y el enlace del factor TFIIIA permite el enlace subsecuente de
TFIIIB seguido por la incorporación de TFIIIC y polimerasa de RNA III,
como sucede en los genes tRNA.
A menudo secuencias intensificadoras y silenciadoras confieren
la especificidad de tejido y la especificidad de la etapa de desarrollo
de la expresión génica, y se identifica una diversidad de secuencias de
acción cis que factores de transcripción específicos de tejido recono­
cen de modo específico. Por ejemplo, con frecuencia la expresión es­
pecífica de células eritroides es señalada por una de dos secuencias:
TGACTCAG (o su complemento inverso CTGAGTCA; ambas
son reconocidas por el factor de transcripción específico eritroide
NF-E2) o la secuencia [A/T]GATA[A/G] (o su complemento in­
verso, ambas reconocidas por la serie de factores de transcripción
GATA. Véase la figura 10-7 para ejemplos y el cuadro 10-3 para
otros elementos específicos de tejido de acción cis).
282 CAPÍTULO DIEZ | EXPRESIÓN GÈNICA HUMANA

Cuadro 10-2. Composición de la subunidad de la polimerasa de RNA II eucariota y factores de transcripción general
relacionados.
Factor Número de subunidades Funciones

Polimerasa II 12 Cataliza la síntesis de RNA

TFIID 12 Reconoce el promotor central y proporciona una estructura central en la que el resto de la maquinaria
transcripcional general puede ensamblarse. Consiste en la proteína de unión TATA (PUT) y varios facto­
res relacionados con PUT (FAP)

TFIIB 1 Une PUT, elige el sitio de inicio e incorpora polimerasa II

TFIIA 3 Estabiliza la unión de TFIIB y PUT

TFIIF 2 Une polimerasa II y TFIIB

TFIIE 2 Incorpora TFIIH que contiene una helicasa y una cinasa de proteína

TFIIH 9 Desenrolla DNA en el promotor; fosforila el dominio terminal C de la polimerasa II, lo que origina un
cambio de conformación. La polimerasa activada se desune de los factores de transcripción generales y
adquiere nuevas proteínas para ayudarla a que se transcriba en distancias largas sin disociarse del DNA

N ota: en la nomenclatura de factores de transcripción generales se utiliza el prefijo común TF (factor de transcripción) seguido de un número romano
para la polimerasa RNA relacionada.

Además de promover en forma activa la transcripción específi­
ca de tejido, algunos elementos silenciadores de acción cis confie­
ren especificidad de tejido o de etapa del desarrollo bloqueando la
expresión en todos los tejidos excepto el deseado. Por ejemplo, el ele­
mento silenciador restrictivo neural (NRSE) reprime la expresión
de varios genes en todos los tejidos aparte de los neurales (Schoen-
herr y cois., 1996). Un factor de transcripción que se enlaza al NR­
SE y que se denomina en diversas formas NRSF (factor silenciador
restrictivo neural) o REST (factor silenciador de transcripción RE-
1) se expresan de manera ubicua en tejido diferente del neural y en
precursores neuronales durante el desarrollo temprano, pero más
adelante no se expresa en neuronas más maduras (posmitóticas). Al
parecer NRSF/REST es capaz de incorporar un correpresor, co-
REST, que se cree que sirve para incorporar la maquinaria molecu­
lar que puede inducir el silenciamiento transcripcional a través de
regiones cromosómicas contenedoras de genes expresados neuro-
nalmente (Lunyak y cois., 2002).
10.2.4 Los factores de transcripción contienen
elementos estructurales conservados
que permiten el enlace de DNA
Los factores de transcripción reconocen y enlazan una secuencia
nucleótida corta, por lo general como resultado de una complemen-
tariedad extensa entre la superficie de la proteína y las características
de superficie de la doble hélice en la región de enlace. Aunque las
interacciones individuales entre aminoácidos y nucleótidos son dé­
biles (casi siempre enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos e interac­
ciones hidrófobas), la región de enlace de DNA y proteína suele
caracterizarse por cerca de 20 de estos contactos, que en conjunto
aseguran que el enlace sea potente y específico. En factores de
transcripción humanos y otros eucariotas suele ser posible identi­
ficar y localizar dos funciones distintas en diferentes partes de la
proteína:
► un dominio de activación, que activa la transcripción de los
genes blanco una vez que el factor de transcripción se enlazó a
ellos. Se piensa que los dominios de activación estimulan la
transcripción por interacción con factores de transcripción ba-
sales a fin de ayudar a la formación del complejo de transcrip­
ción en el promotor. Aunque no tan bien estudiados como los
dominios de enlace de DNA, se sabe que algunos contienen en
abundancia residuos de aspartato y glutamato (dominios d e ac­
tivación ácidd)\ otros son ricos en prolina o glutamato;
► un dominio de enlace de DNA permite el enlace específico del
factor de transcripción a sus genes blanco. Se identifican varios
elementos estructurales conservados que muchos diferentes
factores de transcripción con especificidades muy distintas
comparten, inclusive las secuencias típicas cremallera de leuci-
na, hélice-asa-hélice, hélice-giro-hélice y dedo de cinc que se
describen más adelante. Cada una de las secuencias típicas utiliza
hélices a (o en ocasiones hojas (i; véase fig. 1-24) para enlazar­
se al surco mayor del DNA. Es claro que, aunque las secuen­
cias típicas en general proporcionan la base para el enlace de
DNA, el conjunto preciso de elementos secuenciales en el domi­
nio de enlace de DNA constituye la base para el reconocimiento
específico de secuencia necesario. Casi todos los factores de
transcripción se enlazan a DNA como homodímeros, con la re­
gión de enlace de DNA de la proteína usualmente distinta de
la región a cargo de la formación de dímeros.
Secuencia típica cremallera de leucina
La cremallera de leucina es una tira helicoidal de aminoácidos
abundantes en residuos de leucina (que por lo general se observa
una vez cada siete residuos de aminoácidos, es decir, una vez cada
dos giros de la hélice; véase fig. 10 - 8 ), que forma con facilidad un
dímero. Cada unidad monómero consiste en una hélice a antipáti­
ca (grupos laterales hidrófobos de los aminoácidos constituyentes
 10.2 CONTROL DE LA EXPRESIÓN GENICA POR ENLACE DE FACTORES PROTEÍNICOS.
Recuadro 10-2. C lases de elem entos de secuencia de acción c/s que participan en la regulación de la
transcripción de genes codificadores de polipéptidos
Los PROMOTORES son combinaciones de elementos de secuencia cor­
ta (por lo general, localizados en la región inmediata corriente arriba del
gen, a menudo dentro de 200 pb del sitio de inicio de la transcripción),
que sirven para iniciar la transcripción. Pueden subdividirse en distintos
componentes:
► Promotor central, que dirige el complejo basal de transcripción para
que inicie la transcripción del gen. En ausencia de elementos regula­
dores adicionales permite la expresión constitutiva del gen, pero a va­
lores muy bajos (basales). Por lo general los elementos promotores
centrales se localizan muy cerca del sitio de inicio de la transcripción,
alrededor de las posiciones de nucleótidos -4 5 + 4 0 (véase Butler y
Kadonaga, 2002). Como se ilustra en la figura 10-5, incluyen: la caja
TATA que se localiza en la posición cerca de -2 5 , rodeada por se­
cuencias abundantes en GC y reconocidas por la subunidad de pro-
teina de enlace TATA de TFIID; la secuencia BRE que se encuentra
justo corriente arriba del elemento TATA y alrededor de -3 5 y que es
reconocida por el elemento TFIIB; la secuencia Inr (iniciadora) loca­
lizada en el sitio de inicio de la transcripción y enlazada por TFIID; el
elemento promotor corriente abajo o EPCA, ubicado alrededor de la
posición + 3 0 en relación con la transcripción y reconocido por TFIID.
► Región promotora próxima! la secuencia que se ubica justo corrien­
te arriba del promotor centra! por lo general de -5 0 a -2 0 0 pb (po­
dría decirse que los elementos promotores que se encuentran más
corriente arriba se mapean a la región promotora distal). Casi siempre
se localizan elementos promotores no centrales adicionales en la
región promotora proxímal (aunque pueden encontrarse también en
la región promotora central). Incluyen: cajas GC (llamadas asimismo
cajas Sp1, la secuencia consenso es GGGCGG que suele encontrar­
se en múltiples copias dentro de 100 pb del sitio de inicio de la trans­
cripción y está enlazada por el factor de transcripción Sp1 ubicuo);
cajas CCAAT típicamente localizadas en la posición -7 5 . Las cajas
CCAAT son reconocidas por CTF (factor de transcripción de enlace de
CCAAT, que también se conoce como NF-1, por factor nuclear I) y por
CBF (factor de enlace de la caja CCAAT, que también se conoce co­
mo NF-Y, por factor nuclear Y). Obsérvese que las cajas CCAAT y GC
sirven para m odular la transcripción basal del promotor central y ope­
ran com o secuencias intensificadoras (véase sección siguiente), en
tanto que los elementos silenciadores (véase más adelante) también
pueden ser componentes Integrales del promotor.
ven hacia un lado; grupos polares ven al otro lado, véase fig. 1-24).
Las dos hélices a de los monómeros individuales se unen entre sí
una distancia corta para formar un superarrollamiento (véase sec­
ción 1. 5 .5) y las interacciones predominantes ocurren entre ami­
noácidos hidrófobos opuestos de los monómeros individuales. Más
allá de esta región las dos hélices a se separan, de manera que el
dímero total es una estructura en forma de Y. Se piensa que el dí-
mero sujeta la doble hélice de un modo muy similar a como una
pinza ase una hilera de ropa tendida (véase fig. 10-9). Además de
formar homodímeros, las proteínas cremallera de leucina en ocasio­
nes forman heterodímeros según la compatibilidad de superficies
hidrófobas de los dos monómeros diferentes. Esta formación de he-
terodímero constituye un mecanismo de control de combinaciones
importante en la regulación génica.
283
Los INTENSIFICADORES son elementos de control transcripcional positivo
en particular frecuentes en las células de eucariotas complejos como los
mamíferos, pero que no existen o están muy poco representados en euca­
riotas simples, por ejemplo, la levadura (véase Martin, 2001). Sirven para
incrementar el nivel basal de transcripción que se inicia a través de elemen­
tos del promotor centra! A diferencia de este último, sus funciones son in­
dependientes tanto de su orientación como, en cierto grado, de su distancia
desde los genes que regulan. Los elementos Intensificadores pueden loca­
lizarse distantes de los genes que regulan (p. e j„ la región de control del
locus de la globina (3 fig. 10-23). A menudo los intensificadores se encuen­
tran dentro de un tramo de sólo 200 o 300 pb, varios elementos reconoci­
dos por factores de transcripción ubicuos más varios identificados por
factores de transcripción específicos de tejido (fig. 10-7). Además algunos
elementos intensificadores pueden ser componentes integrales de promo­
tores, como se observa en las cajas CCAAT y GC (véase antes).
Los SILENCIADORES sirven para reducir los niveles de transcripción.
Aunque menos bien estudiados, suelen distinguirse dos clases: los silen­
ciadores clásicos (también llamados elementos silenciadores) son ele­
mentos independientes de la posición que dirigen un mecanismo de
represión transcripcional activo; elementos reguladores negativos, que
son elementos dependientes de posición que dan por resultado un meca­
nismo de represión pasivo (véase Ogbourne y Antalis, 19998). Cuando se
estudiaron en genes humanos, se describieron elementos silenciadores
en diversas posiciones: cerca del promotor, a cierta distancia corriente
arriba y asimismo dentro de irrtrones. Sin embargo, la prueba de estas se­
cuencias suele basarse en estudios in vitro de enlace de DNA y su impor­
tancia in vivo aún es incierta.
Los ELEMENTOS DE ENLACE (AISLADORES) son regiones de DNA, con
frecuencia abarcan de 0.5 a 3 kb, que actúan para bloquear (o aislar) la
diseminación de la influencia de agentes que tienen un efecto positivo (in­
tensificadores) o negativo en la transcripción (silenciadores, efectos re­
presores similares a heterocromatina). Véase Bell y cois. (2001).
Los ELEMENTOS DE RESPUESTA modulan la transcripción en respuesta
a estímulos externos específicos. Suelen localizarse a una distancia cor­
ta corriente arriba de los elementos promotores (a menudo dentro de 1 kb
del sitio de inicio de la transcripción). Una diversidad de estos elementos
responde a hormonas específicas (p. ej., ácido retinoico u hormonas es­
feroides como glucocorticoides) o a segundos mensajeros intracelulares
como AMP cíclico (véase sección 10.2.5 y cuadro 10-4).
Secuencia típica hélice-asa-hélice
La secuencia típica hélice-asa-hélice (HAH) se relaciona con la cre­
mallera de leucina y debe diferenciarse de la de hélice-giro-hélice
(HGH) que se comenta en la sección siguiente. Consiste en dos héli­
ces ot, una corta y una larga, unidas por un asa flexible. A diferencia
del giro corto de la secuencia típica HGH, el asa de la HAH es lo bas­
tante flexible para permitir el doblamiento hacia atrás de forma que
las dos hélices pueden empacarse una contra la otra, es decir, las dos
hélices se encuentran en planos paralelos entre sí, en contraste con las
dos hélices de la secuencia típica HGH (fig. 10-8). La secuencia típi­
ca HAH media tanto el enlace de DNA como la formación de un dí­
mero proteínico (véase fig. 10-9) y permite la formación ocasional de
un heterodímero. Sin embargo, en el último caso se forman heterodí­
meros entre una proteína HAH de longitud completa y una proteína
284 CAPÍTULO DIEZ EXPRESIÓN GÈNICA HUMANA

-T F IID
CTF CBF
T F IIB
o o
... ■
C C A A T C A JA B R E TATA C A JA

L o c a liza c ió n — 75 - 3 7 a - 3 2 -3 1 a - 2 6

S e c u e n c ia GGG C C ...T C C A„AC°

CCAAT C C A CGCCTATAAA
consenso TT ATT GGTT^

Fig. 10-5. Localizaciones conservadas en eucariotas complejos para elementos promotores reguladores enlazados por factores de transcripción
ubicuos.

N ota: el promotor central de genes individuales no necesita contener todos los elementos. Por ejemplo, muchos promotores carecen de una caja TATA y
utilizan en su lugar el elemento iniciador análogo en funciones (INR). Las cajas GC también suelen encontrarse en promotores pero sus localizaciones
son más variables (véase fig. 10-6 y fig. 1-13 para algunos ejemplos). BRE, elemento de reconocimiento TFIIB; DPE, elemento promotor corriente abajo.
Adaptado de Butler y Kadonga (2002) Genes Dev. 16, 2583-2592 con autorización de Coid Spring Harbor Laboratory Press.

S P1 PD X1 OCT1 USF PD X1 CREB PD X1 IEF1 PD X1 PU R 1 TBP

i---------------------- 1-----------------------1----------------------- 1---------------------- 1______________ i______________ i_______________ i

-3 5 0 -3 0 0 -2 5 0 -2 0 0 -1 5 0 -1 0 0 -5 0 +1

Fig. 10-6. El promotor del gen de insulina humano contiene una diversidad de elementos de secuencia reconocidos por factores de transcripción
ubicuos y específicos de tejido

Las flechas indican el enlace de factores de transcripción (hilera superior) a elementos de secuencia reguladores (cuadro) que se encuentran corriente
arriba del gen de insulina humana. Los factores de transcripción ubicuos o que se expresan con amplitud se muestran en negro; los que se indican en
rojo son específicos de células beta pancreáticas. El factor de transcripción PDX1 se enlaza a cuatro elementos de secuencia de la forma C(C/T)TAATG
que se encuentran en el promotor de insulina (A1, A2, A3, A5). Abreviaturas; CRE, elemento de respuesta cAMP; NRE, elemento regulador negativo.

Cuadro 10-3. Ejemplos de secuencias de a cció n cis reconocidas por factores de transcripción restringidos a tejidos y
específicos de tejido.
Secuencia de unión consenso Factor de transcripción Patrón de expresión

(A/T)GATA(A/G) GATA-1, -2, etcétera Células eritroides

TGACTCAG NF-E2 Células eritroides
GTTAATNATTAAC ( = elemento P) HNF1 Hígado, riñón, estómago, intestino, bazo
T(G/A)TTTG(C/T) HNF-5 Hígado
ATGCAAAT P0U2F2 (OTF-2) Células linfoides
GCCTGCAGGC Ker1 Queratinocitos

(C/T)TAAAAATAA(C/T)3 MBF-1 Miocitos

(C/T) TA (A/T) AAATA (A/G ) MEF-2 Miocitos

CAACTGAC MyoD Mioblastos + míotubos

(C/A)A(C/A)AG TCF-1 Células T

 10.2 CONTROL DE LA EXPRESIÓN GENICA POR ENLACE DE FACTORES PROTEÍNICOS.
TCGACCCTCTGGAACCTATCAGGGACCACAGTCAGCCAGGCAAGCACATC
« - GATA-1
TGCCCAAGCCAAGGGTGGAGGCATGCAGCTGTGGGGGTCTGTGAAAACAC
4 - caja CACC
GATA-1 -► N F -E 2 -*
TTGAGGGAGCAGATAACTGGGCCAACCATGACTCAGTGCTTCTGGAGGCC
AACAGGACTGCTGAGTCATCCTGTGGGGGTGGAGGTGGGACAAGGGAAAG
« - NF-E2 4 - caja CACC
GATA-1 -►
GGGTG AATGGTACTGCTGATTACAACCTCTGGTGCTGCCTCCCCCTCCTG
4 - caja CACC
TTTATCTGAGAGGGAAGGCCATGCCCAAAGTGTTCACAGCCAGGCTTCAG
4 - GATA-1
Fig. 10-7. El sitio regulador de la globina alfa HS-40 contiene muchos
elementos de reconocimiento para factores de transcripción especí­
ficos de eritroides.
Obsérvese que el sitio HS-40 parece una región de control del locus
para el grupo del gen de globina a (sección 10.5.2).
HAH truncada que carece de la longitud total de una hélice a ne­
cesaria para enlazar el DNA. El heterodímero resultante no es capaz
de enlazar apretadamente DNA. Como resultado, se piensa que los
heterodímeros HAH actúan como un mecanismo de control que per­
mite la inactivación de proteínas reguladoras génicas específicas.
Secuencia típica hélice-giro-hélice
La secuencia típica HGH es un elemento común que se encuentra
en homeocajas y varios otros factores de transcripción. Consiste en
dos hélices a cortas separadas por una secuencia corta de aminoá­
cidos que induce un giro, de modo que las dos hélices a se orien­
tan de manera diferente (es decir, las dos hélices no están situadas
en el mismo plano, a diferencia de las de la secuencia típica HAH;
fig. 10-8). La estructura es muy similar a la secuencia típica de enla­
ce de DNA de varias proteínas reguladoras de bacteriófago como la
proteína ero X cuyo enlace a DNA se estudió mediante cristalogra­
fía de rayos X. En el caso tanto de la proteína ero X como de las se­
cuencias típicas HGH eucariotas, se cree que si bien la HGH suele
mediar el enlace de DNA, la hélice más terminal C actúa como una
hélice de reconocimiento específica porque se ajusta dentro del
surco mayor del DNA (fig. 10-9) y controla la secuencia precisa de
DNA que se reconoce.
Secuencia típica en dedo de cinc
La secuencia típica en dedo de cinc incluye el enlace de un ion de
cinc por cuatro aminoácidos conservados para formar un asa (de­
285
dos), una estructura que a menudo se repite en forma tándem.
Aunque se conocen varias formas distintas, las frecuentes abarcan
el enlace de un ion Zn2+ por dos residuos de cisterna y dos de his-
tidina, o cuatro residuos de cisteína, todos ellos conservados. La es­
tructura resultante puede consistir luego en una hélice a y una hoja (3
unidas entre sí por coordinación con el ion Zn2+, o de dos hélices a .
En cualquiera de estos casos el principal contacto con el DNA se
efectúa por la unión de la hélice a al surco mayor. Por lo general el
dedo de cinc C2H2 (Cis2/His2) comprende alrededor de 23 ami­
noácidos con dedos vecinos separados por una tira de alrededor de
siete a ocho aminoácidos (fig. 10 - 8 ).
10.2.5 Una diversidad de mecanismos permite
la regulación transcripcional de la expresión
génica en respuesta a estímulos externos
La expresión génica de células eucariotas puede modificarse de ma­
nera semipermanente conforme las células se diferencian o de mo­
do temporal en una forma fácilmente reversible en respuesta a
señales extracelulares (expresión génica inducible). Indicios am­
bientales, como las concentraciones extracelulares de ciertos iones y
moléculas nutricionales pequeñas, el choque por temperatura, etc.,
pueden alterar mucho los patrones de expresión génica en células
expuestas a cambios en estos parámetros. Los animales multicelu­
lares complejos también presentan requerimientos fundamentales
para que las células se comuniquen entre sí y son posibles diferen­
tes modalidades de señalam iento celu la r (secciones 3.2.1 y 3.2.2).
En algunos casos la alteración de la expresión génica ocurre a nivel
de la transcripción y puede ofrecer ciertas ventajas. En otros la ex­
presión génica se altera modulando la transcripción.
Aunque la regulación transcripcional en respuesta al señala­
miento celular puede adoptar varias formas distintas, el pu nto f i ­
nal siem pre es e l mismo: un factor de transcripción antes inactivo
se activa de modo específico y luego se une a secuencias regulado­
ras específicas localizadas en los promotores de genes blanco, lo
que modula su transcripción. En la transcripción regulada por mo­
léculas de señalamiento o sus intermediarios estas secuencias re­
guladoras suelen denominarse elementos de respuesta (véase
cuadro 10-4).
Factores de transcripción inducibles por ligando
Hormonas hidrófobas y morfógenos pequeños como hormonas es­
feroides, tiroxina y ácido retinoico pueden difundirse a través de la
membrana plasmática de la célula blanco y enlazar receptores intra-
celulares en el citoplasma o el núcleo. Estos receptores (a menudo
llamados receptores nucleares d e horm onas) son factores de trans­
cripción inducibles: tras enlazarse el ligando homólogo, la proteína
receptora se vincula con un elemento de respuesta de DNA especí­
fico localizado en las regiones promotoras de tal vez 50 a 100 genes
blanco y activa su transcripción.
Aunque la tiroxina y el ácido retinoico no se relacionan desde
los puntos de vista estructural y biosintético con las hormonas es-
teroides, sus receptores pertenecen a una superfamilia común de re­
ceptores nucleares. La familia se caracteriza por dos dominios
conservados: un dom inio d e en lace d e DNA ubicado centralmente
de unos 68 aminoácidos y un dom inio d e en la ce d e ligando que tie­
ne alrededor de 240 aminoácidos y se sitúa cerca de la terminal C
(fig. 10-10). El dominio de enlace de DNA contiene dedos de cinc
y se enlaza como un dímero al reconocer cada monómero uno de
286 CAPÍTULO DIEZ EXPRESIÓN GÈNICA HUMANA

Asa

H élice-a HAH

Hélice-a

Hélice-a
Hélice-a

COOH

Cremallera
Dedo de leucina
de Zn de la ><
hélice-a
Hélice-a
H
H
X

Fig. 10-8. Secuencias típicas estructurales que suelen encontrarse en factores de transcripción y en proteínas de enlace de DNA.

Abreviaturas: HGH, hélice-giro-hélice; HAH, hélice-asa-hélice. Nótese que el monómero cremallera de leucina es antipático [es decir, tiene residuos hi­
drófobos (leucinas) consistentemente en una cara de la hélice, véase fig. 1-24], Dos de estas hélices pueden alinearse con sus caras hidrófobas en
oposición para form ar una estructura superenrollada.

HGH Dimero cremallera

Dimero HAH
de leucina

Reconocimiento
de la hélice

Fig. 10-9. Enlace a la doble hélice de elementos estructurales conservados en factores de transcripción.

Nota: los monómeros individuales del dimero hélice-asa-hélice (HAH) y el dimero cremallera de leucina están indicados con colores distintos para dife­
renciarlos, pero pueden ser idénticos (homodímeros). Los heterodimeros HAH y los heterodímeros cremallera de leucina pueden proporcionar un nivel
más alto de regulación (véase texto).

los dos hexanucleótidos en el elemento de respuesta. Los dos hexa-
nucleótidos son repeticiones invertidas o directas por lo general se­
paradas por tres o cinco nudeótidos (fig. 10-10). En ausencia de
ligando, el receptor se inactiva por represión directa de la función
del dominio de enlace del DNA por el dominio de enlace del ligan­
do, o por el enlace a una proteína inhibidora, como en el receptor
glucocorticoide (fig. 10- 11 ).
Activación de factores de transcripción por transducción de
señal
A diferencia de las hormonas o morfógenos liposolubles, las mo­
léculas de señalamiento hidrófilas, como las hormonas polipéptidas,
no pueden difundirse a través de la membrana plasmática. En lugar
de ello se enlazan a un receptor específico en la superficie celular.
 10.2 CONTROL DE LA EXPRESIÓN GÈNICA POR ENLACE DE FACTORES PROTEINICOS. 287

Cuadro 10-4. Ejemplos de elementos de respuesta en la expresión génica inducible.

Elemento de respuesta consenso (E.R.) Respuesta a Factor proteínico que reconoce E.R.

(T/G)(T/A)CGTCA cAMP CREB (también llamado ATF)

CC (A/T) (A/T)(A/T) (A/T) (A/T) (A/T)GG Factor de crecimiento sérico Factor de respuesta sérico

TTNCNNNAAA Interferon gamma Stat-1

TGCGCCCGCC Metales pesados Mep-1

TGAGTCAG Ésteres de forbol AP1

CTNGAATNTTCTAGA Choque por calor HSP70, etcétera

Nota : véase también elementos de respuesta hormonal en fig. 10-10.

Después del enlace de la molécula ligando, el receptor sufre un cam­
bio de conformación y se activa en tal forma que la señal pasa a tra­
vés de otras moléculas dentro de la célula (transducción d e señal;
véase sección 3.2.1).
Muchos receptores de superficie celular tienen una actividad de
cinasa o pueden activar cinasas intracelulares (véase cuadro 3.3), y
las vías de transducción de señal suelen caracterizarse por la interre-
lación reguladora compleja de cinasas y fosfatasas que pueden acti­
var o reprimir intermediarios por fosforilación/desfosforilación. En
muchos casos cualquiera de estos dos últimos procesos induce una
alteración de la conformación. En la activación de una molécula de
señalamiento, la conformación alterada con frecuencia significa que
no se inhibe más un factor de señalamiento por alguna secuencia re­
presora presente en una proteína inhibidora a la que está enlazada,
o en un dominio o secuencia típica dentro de su estructura propia.
En términos de la activación transcripcional, dos mecanismos
generales permiten la transmisión rápida de señales de receptores
de la superficie celular al núcleo, y ambos incluyen fosforilación de
proteínas: se activan cinasas de proteína y luego se translocan del
citoplasma al núcleo, donde fosforilan factores de transcripción
blanco; factores de transcripción inactivos almacenados en el cito­
plasma se activan por fosforilación y se translocan al interior del
núcleo. En las dos secciones siguientes se presentan ejemplos que
ilustran los dos mecanismos anteriores (véase también Karin y
Hunter, 1995).
Señalamiento hormonal a través de la vía del AMP cíclico
El AMP cíclico es un segundo mensajero importante (véase cuadro
10 - 5 ) que actúa en respuesta a una diversidad de hormonas y otras
moléculas de señalamiento. Se sintetiza a partir del ATP por una
enzima enlazada a la membrana, la ciclasa de adenilato. Las hormo­
nas que activan esta última se unen a un receptor de superficie ce­
lular de la clase de receptor acoplado a proteína G. La unión de la
hormona con el receptor promueve la interacción de este último
con una proteína G que consiste en tres subunidades, a , (3 y "y.

A) RECEPTOR DE ESTEROIDE B) ELEMENTO DE RESPUESTA

777
AGAACA nnn TGTTCT
RG TCTTGT nnn ACAAGA

553
AGGTCA nnn TGACCT
TCCAGT nnn ACTGGA

432
AGGTCA nnnnn AGACCA
RAR TCCAGT nnnnn TCTGGT

408
AGGTCA TGACCT
Clave TCCAGT ACTGGA
■ Dominio de enlace de DNA 427
■ Dominio de enlace de ligando AGGTCA nnn AGGTCA
RVD TCCAGT nnn TCCAGT

Fig. 10-10. Receptores de esteroides y elementos de respuesta respectivos.

A) Estructura de miembros de la superfamllia del receptor nuclear. Los números se refieren al tamaño de la proteína en aminoácidos. RE, receptor
de estrógenos; RG, receptor de glucocorticoides; RF¡ receptor de progesterona; RAR, receptor de ácido retinoico; RT, receptor de tiroxina; RVD, receptor
de vitamina D. B) Elementos de respuesta. Obsérvese: a) que con frecuencia los elementos de respuesta son repeticiones hexanucleótidas invertidas
perfectas, pero los elementos de respuesta del ácido retinoico y la vitamina D3 son repeticiones hexanucleótidas directas imperfectas; b) todos los hexa-
nucleótidos tienen la secuencia general AGNNCA con los dos nucleótidos centrales (se muestran sombreados) que confieren especificidad y pertenecen
a una de las tres clases: GT, AC o AA.
288 CAPÍTULO DIEZ EXPRESIÓN GENICA HUMANA

• Glucocorticoide la activa para que permita la liberación de las dos subunidades con
actividad catalítica que a continuación penetran en el núcleo y fos-
i forilan un factor de transcripción específico, CREB (proteína de
unión de CRE). El CREB activado después activa la transcripción
de genes con el elemento de respuesta cAMP (fig. 10-12A).

Activación de NF-k B a través de señalamiento por el factor

de necrosis tumoral
El NF-kB es un factor de transcripción que participa en una diver­
sidad de aspectos de la respuesta inmunitaria. En estado inactivo, el
NF-/cB permanece en el citoplasma, donde se encuentra en comple­
jo con una subunidad inhibidora, I k B. Sin embargo, esta última
puede ser un blanco para la degradación después de la fosforilación.
La destrucción consiguiente de I«B permite que NF-kB se trasloque
al núcleo y active sus diversos genes blanco. La fosforilación de I/cB
Núcleo se logra por una cascada de cinasas después de que el factor de ne­
crosis tumoral (TNF) se enlaza a un receptor específico de TNF de
la superficie celular y causa la activación del factor 2 relacionado con
el receptor de TNF (TRAF2; véase fig. 10-12B).
Activación del gen blanco

10.2.6 El control traduccional de la expresión génica

Después de esta interacción, la subunidad a de la proteína G se
activa, lo que origina su disociación y estimula la ciclasa de ade-
nilato.
El incremento del cAMP intracelular producido por la ciclasa
de adenilato activada puede activar luego la transcripción de se­
cuencias blanco específicas que contienen un elem ento de respuesta
cAMPo CRE. Esta función del cAMP es mediada por la enzima ri­
ñosa de proteína A. El AMP cíclico se une a la cinasa de proteína y
puede incluir el reconocimiento de secuencias
reguladoras UTR por proteínas de enlace de RNA
La síntesis de proteína es el principal paso final de la expresión gé­
nica y un punto de control importante para la regulación. En el ini­
cio de la traducción en eucariotas participa una serie compleja de
proteínas y se conocen diferentes vías para iniciar la traducción
(véase Dever, 2002). Aunque la elección del codón de inicio AUG
(metionina) es fundamental, algunos genes realizan elecciones al­
ternativas del codón de inicio en un mRNA, que producen isofor-
mas que varían en su secuencia terminal N —véase el ejemplo del
gen del tumor de Wilms, WT1 en la figura 10.16A-. La importan­
cia de estas isoformas aún no se aprecia bien.
Asimismo está demostrado que un número creciente de especies
de mRNA eucariotas y de mamíferos contienen secuencias regula­
doras en sus secuencias no traducidas, con mayor frecuencia en el
extremo 3’ (véase Wickens y cois., 1997). También se identificaron
varias proteínas de unión de RNA eucariotas y de mamíferos, y se
comprobó que se enlazan a secuencias reguladoras específicas que
se encuentran en secuencias no traducidas, por lo que proporcionan
la base para el control traduccional de la expresión génica (Siomi y
Dreyfuss, 1997). Está identificada una diversidad de dominios de
enlace de DNA e incluyen elementos que se relacionaron antes con

Cuadro 10-5. Ejemplos de mensajeros secundarios en el señalamiento celular.

Mensajero secundario Características

AMP cíclico (cAMP) Producido a partir de ATP por la ciclasa de adenilato. Los efectos suelen mediarse a través de la cinasa de proteína
A. Véase ejemplo de la activación del factor CREB (fig. 10-12A)

GMP cíclico (cGMP) Producido a partir de GTP por la ciclasa de guanilato. La función mejor caracterizada es la recepción visual en ojos
de vertebrados

Fosfolípidos/Ca2+ Activación corriente abajo de receptores acoplados a proteina G y de cinasas de tirosina proteínicas. La hidrólisis de
4,5-bis-fosfato de fosfatidilínositol (PIP2) proporciona diacilglicerol y 1,4.5-trifosfato de inositol (IP3) que activa la ci­
nasa de proteina C y desplaza C a ^ de depósitos intracelulares.
 10.2 CONTROL DE LA EXPRESIÓN GENICA POR ENLACE DE E\CTORES PROTEÍNICOS. 289

A) / ^ \ __
H orm on a
’ k/ ~ \ R ec ep to r de
O O n horm ona
C iclasa d e adenilato
B)
f*é

C inasa d e I r r
proteina A { i g X C ) ' (g ) (g ) / ...
0 — 0
IKKK IKKK ac tivada

Ubiquitinilación
y degradación

A ctivación de genes
blanco que contienen CRE

si\
A ctivación d e genes blanco

Fig. 10-12. Genes blanco seleccionados pueden expresarse en forma activa en respuesta a estímulos extracelulares mediante transducción de la
seAal de los receptores de superficie celular activados.

A) Activación de una cinasa de proteína y translocación al núcleo: el señalamiento hormonal a través de AMP cíclico-cinasa de proteína A señala
una vía de transducción. El enlace de hormona a un receptor especifico de la superficie celular promueve la interacción del receptor con una proteína G.
La subunidad a de la proteína G activada se disocia del receptor y estimula la ciclasa de adenilato enlazada a la membrana para que sintetice cAMR
Este último se enlaza a las subunidades reguladoras de cinasa de proteína A, lo que permite la liberación de las subunídades catalíticas (c) que migran
al núcleo y activan el factor de transcripción CREB (proteína de enlace CRE) mediante fosforilación. CREB activado se enlaza a elementos de respuesta
cAMP en los promotores de genes blanco. B) Activación de un factor de transcripción citoplásmico (NF-kB) y translocación al núcleo. El enlace de
TNF origina un cambio en su receptor de membrana, que le permite incorporar varias proteínas de señalamiento ¡ntracelulares. Estas últimas se incorpo­
ran a su vez y activan IKKK, una cinasa que fosforiía IKB, la cinasa Ik B. En condiciones normales IKB está enlazada a NFkB pero la adición de grupos
fosfato a IKB la marca para ubiquitinilación y degradación. La NFkB liberada tiene una secuencia de localización nuclear expuesta que ahora permite que
migre al núcleo, donde activa un grupo de genes blanco.

propiedades de enlace de DNA de factores de transcripción, como
dedos de cinc y homeodominios (Siomi y Dreyfuss, 1997).
Traslado de RNA
Puede considerarse que la interacción entre elementos reguladores
de acción cis en el RNA y las proteínas de enlace de RNA de acción
trans modifica la estructura del RNA en diversas formas: facilitan­
do u obstaculizando interacciones con otros factores de acción
trans; alterando la estructura de RNA de orden más alto; uniendo
entre sí secuencias de RNA inicialmente remotas, o proporcionan­
do señales de localización o blanco para el transporte de moléculas
de RNA a sitios intracelulares específicos (tránsito de RNA). Se sa­
be que múltiples mRNA eucariotas y de mamíferos se transportan
como partículas de ribonucleoproteína (RNP) a sitios específicos
dentro de algunos tipos de células, en especial del sistema nervioso
(véase Hazelrigg, 1998). Por ejemplo, mRNA tau se localiza en las
porciones proximales de axones en lugar de dendritas, en tanto que
muchas moléculas de mRNA se hallan en neuronas maduras y el
mRNA de la proteína básica de mielina se transporta con la ayuda
de cinesina a los procesos de oligodendrocitos.
El tránsito de RNA puede constituir un medio más eficiente pa­
ra localizar proteínas que sólo las transportan: es posible que un
mRNA aislado origine muchas moléculas de proteína distintas, si
se asume que puede comprometerse con ribosomas. Suelen consi­
derarse varios pasos secuenciales: represión traduccional inicial,
transporte dentro de la célula, localización (al destino subcelular es­
pecífico) y luego traducción dependiente de la localización. En fe­
cha reciente se identificaron secuencias reguladoras fundamentales
para varios pasos de este proceso en las secuencias no traducidas.
290 CAPITULO DIEZ EXPRESIÓN GENICA HUMANA

sobre todo en la 3' UTR de muchas especies de mRNA, (véase
Wickens y cois., 2002 ).
Control traduccional de la expresión genica en respuesta a
estímulos externos
El control traduccional de la expresión gènica puede permitir una res­
puesta más rápida a estímulos ambientales alterados que la alternativa
de activar la transcripción. El metabolismo del hierro brinda dos
ejemplos muy útiles. El incremento de los valores de hierro estimula
la síntesis de la proteína de enlace de hierro, ferritina, sin ningún
aumento correspondiente en la cantidad de mRNA de ferritina. En
contraste, la disminución de las concentraciones de hierro estimula
la producción del receptor de transferrina (RTF) sin ningún efecto
en la producción de mRNA del receptor de transferrina. La 5 ’ UTR
tanto del mRNA de la cadena pesada de la ferritina como la de mR­
NA de la cadena ligera contiene un elemento de respuesta al hierro
(ERH) único, una secuencia reguladora de acción cis específica que
forma una estructura en horquilla. Varias de estas secuencias ERH
también se encuentran en la 3' UTR del mRNA del receptor de
transferrina (véase Klausner y cois., 1993). La regulación se ejerce me­
diante el enlace del ERH por una proteína de enlace del ERH especí­
fica que se activa a concentraciones bajas de hierro (véase fig. 10-13).
Control traduccional de la expresión gènica durante
el desarrollo temprano
La expresión gènica durante la maduración del oocito y sus etapas
embrionarias más tempranas está regulada a nivel de la traducción,
no de la transcripción (véase De Moor y Richter, 2001). Tras la fe­
cundación de un oocito humano, al principio no se elabora mRNA
hasta la etapa de cuatro a ocho células, cuando la transcripción ci-
gó tica se activa, es decir, la transcripción de los genes que se en­
cuentran en el cigoto. Antes de esta época las funciones celulares
son especificadas por el mRNA m aterno que se sintetizó con ante­
rioridad durante la oogénesis.
La extrapolación de estudios en organismos modelo sugeriría
que los oocitos almacenan una diversidad de mRNA en una forma
inactiva, que se caracteriza por tener colas oligo(A) cortas. Estos
mRNA se sometieron antes a desadenilación y la cola oligo(A) cor­
ta resultante indica que no pueden traducirse. Después, en la fecun­
dación o más adelante durante el desarrollo, las especies mRNA
inactivas almacenadas pueden activarse mediante poliadenilación
citoplásmica, lo que restablece el tamaño normal de la cola poli(A).
Se utiliza el mismo tipo de actividad de polimerasa poli(A) que en
la poliadenilación estándar de mRNA recién formado (que ocurre
en el núcleo) pero además de la señal AAUAAA, el mRNA requiere
un elem ento d e poliaden ilación citoplásm ica abundante en uridina
corriente arriba (véase Wahle y Kuhn, 1997).
Otros dos mecanismos que regulan la traducción de algunos
mRNA durante el desarrollo son el ocultamiento traduccional (por
el que las proteínas de enlace de RNA pueden reconocer y enlazar
secuencias específicas en las 3' UTR de los mRNA, y en consecuen­
cia reprimir la traducción; véase Gray y Wickens, 1998) y la regula­
ción antisentido. En este último caso se sabe que algunos mRNA
son regulados por una secuencia de RNA complementaria, como
sucede en los microRNA, RNA muy pequeños que en algunos casos
regulan los genes durante el desarrollo por enlace a secuencias com­
plementarias en sus 3' UTR (véase fig. 9-6 y Bannerjee y Slack,
2002; Pasquinelli y Ruvkun, 2002).

B) PE-ERH inactiva

+Fe

jüüL
PE-ERH de enlace de RNA

AAAAA
5' UTS 3 ' UTS c o d ific a n te ^ ^
mRNA de cadena H de ferritina ! mRNA TfR
3' UTS

Enlace de PE-ERH
a uno o más ERH

AAAAA AAAAA
Inhibición del inicio
ERH en mRNA
de la traducción
de cadena H de Protege mRNA
ferritina humana de degradación

Fig. 10-13. La proteína de enlace de ERH regula la producción de la cadena pesada de ferritina y el receptor de transferrina por enlace a elemen­
tos de respuesta al hierro (ERH) en regiones no traducidas 5' o 3 .

A) Estructura del ERH en la 5 ' UTR de la cadena pesada de ferritina. B) el enlace de la proteína de enlace de ERH a la ferritina y los mRNA del receptor
de transferrina tiene efectos contrastantes en la síntesis de proteínas.
 10.3 TRANSCRIPCIÓN Y PROCESAMIENTO ALTERNATIVOS DE GENES INDIVIDUALES 291

10.3 Transcripción y procesam iento
altern ativo s de genes individuales
Además del control que ejercen en la selección de genes específicos
i o sus transcritos) para activación o represión, los mecanismos de
control también pueden seleccionar entre transcritos alternativos
específicos de un gen aislado. El uso de un promotor diferencial o
acontecimiento de procesamiento diferencial de RNA pueden pro­
ducir un gran número de isoformas distintas y estos mecanismos y
otros desafían la definición clásica de un gen.
10.3.1 El uso de promotores alternativos puede generar
isoformas específicas de tejido
Se sabe que varios genes de mamíferos individuales tienen dos o más
promotores alternativos, que pueden dar lugar a productos de ex­
presión alternativos (isoform a s) con diferentes propiedades (véase
Avoubi y Van de Ven, 1996). Con frecuencia los promotores indi­
viduales impulsan la transcripción de versiones alternativas de un
primer exón que luego se empalma en cada caso a un juego común
de exones corriente abajo. Sin embargo, además algunos promoto­
res alternativos se localizan en porciones más distales de un gen
p rom oto res a ltern a tivos in tern os) e impulsan la expresión de pro­
ductos truncados, como se observa en algunos promotores en el gen
de distrofina (véase más adelante). Las isoformas pueden conferir:
► especificidad de tejido (una ocurrencia frecuente porque dife­
rentes promotores pueden contener distintos elementos regu­
ladores; véase el ejemplo del gen de distrofina humano más
adelante);
► especificidad de etapa del desarrollo (p. ej., el gen del factor II
de crecimiento similar a insulina);
► localización subcelular diferencial (como isoformas solubles y
enlazadas a membrana);
► capacidad funcional diferencial (p. ej., en el receptor de proges-
terona);
► regulación génica específica de sexo (véase el caso del gen de
metiltransferasa D nm tl (sección 10.4.2; fig. 10-20).
Uno de los ejemplos más celebrados del uso del promotor diferen­
cial en humanos se relaciona con el gen de distrofina gigante que
comprende un total de más de 79 exones distribuidos alrededor de
2.4 Mb de DNA en Xp21. Es posible utilizar cuando menos siete
diferentes promotores alternativos. Tres de ellos se ubican cerca del
sitio de inicio convencional y comprenden un promotor específico
de corteza cerebral, un promotor específico de músculo localizado
100 kb corriente abajo y un promotor que se emplea en las células
de Purkinje del cerebelo y se encuentra 100 kb más corriente aba­
jo (véase fig. 10-14). El uso de estos promotores produce isoformas
grandes con un peso molecular de 427 kDa (denominadas Dp427,
en las que Dp = proteína distrofina, y con frecuencia se añade un
sufijo para indicar especificidad de tejido, por ejemplo Dp427m a
fin de indicar la isoforma específica de músculo). Las tres isoformas
Dp427 difieren en su secuencia de aminoácidos del extremo termi­
nal N como resultado del empleo de tres diferentes alternativas pa­
ra el exón 1. Además de los promotores alternativos que codifican
las isoformas grandes convencionales, pueden usarse cuando menos
otros cuatro promotores alternativos internos, que generan isofor­
mas más pequeñas (fig. 10-14).
10.3.2 Los genes humanos son propensos a empalme
(corte y unión, splicing) y poliadenilación
alternativos
Por lo general el uso de promotores alternativos comprende el empleo
de exones alternativos al inicio de la transcripción, pero otros meca­
nismos, en especial el empalme alternativo, contribuyen a la utiliza­
ción a gran escala de exones alternativos. Números inesperadamente

R CNS s G
r t r * .
500 1 000 1 500 2 000 2 500

C1 M1 P1 2 5 10 15 20 R 130 40 CNS1 45 50 55 S1 60 G1 70 79
I I I_I i I I

lili lililí
I l I 1 I I
■ i
D p427 Dp260 D p140 D p116 Dp71

Fig. 10-14. Cuando menos siete promotores distintos pueden utilizarse para generar la expresión específica de tejido y de tipo celular del gen de
distrofina.

En a parte superior se ilustran las posiciones de los siete promotores alternativos: C, cortical; M, músculo; R Purkinje; R, retiniano ( + cerebro
- -núscuio cardiaco); CNS, sistema nervioso central (+ riñón); S, células de Schwann; G, general (expresada casi de manera ubicua, pero no detectable
=r- músculo esquelético por completo diferenciado). En la parte inferior se ¡lustran las posiciones aproximadas de los exones. Nota: cada promotor utiliza
su primer exón propio (en rojo: C1, M 1, P1, CNS1, S1 y G1) junto con exones corriente abajo (en azul). Los promotores internos se localizan justo
re c e n te arriba de los exones que se indican como sigue: R, exón 30; CNS, exón 45; S, exón 56; G, exón 63. La longitud completa de las distrofinas
C. M y P se aproxima a 427 kDa (Dp427). Los promotores internos R, CNS, S y G generan isoformas progresivamente más pequeñas: Dp260, Dp140.
Dpi 16 y Dp71. Se sabe que ocurre empalme alternativo, en especial en el extremo 3 '; para mayor información véase http://www.dmd.nl/isoforms.lTtrr
292 CAPÍTULO DIEZ EXPRESIÓN GÈNICA HUMANA

bajos de genes en algunos organismos complejos {Drosophilay los hu­
manos tienen, respectivamente, alrededor de 0.7 X y 1.5 X el núme­
ro de genes que un gusano de 1 mm de largo simple, C. elegam)
sugieren que la complejidad biológica podría depender en gran medi­
da de la expresión alternativa de genes (Maniatis y Tasic, 2002; Ro-
berts y Smith, 2002 ).
Empalme alternativo: prevalencia y patrones
Cuando menos 50% (y con mucha probabilidad un porcentaje
bastante más alto) de los genes humanos sufre empalme alternativo,
por el que están representadas diferentes combinaciones de exones
en transcritos del mismo gen durante el procesamiento del RNA.
Muchos genes pueden generar en principio numerosas isoformas a
nivel del RNA, pero no suele ser claro qué tantos de los posibles
transcritos alternativos tienen importancia biológica (aunque la im­
portancia de algunos es clara; véase más adelante). Diversas clases
de empalme alternativo pueden ocurrir y dar lugar a combinacio­
nes alternativas de exones de codificación y de exones no codificantes,
y de va rian tes d e lo n gitu d d e l exón que comparten alguna secuencia
(véase fig. 10-15). Las consecuencias para los genes codificadores
de polipéptidos son varias:
► diferentes isoform as d e proteínas. Esto puede llevarse a cabo
por combinaciones alternativas de exones de codificación o va­
riantes de exones codificantes que producen diferencias de
aminoácidos. En ocasiones es posible elaborar proteínas que
carecen de un dominio completo funcionalmente importante
o una señal de localización importante, con consecuencias fun­
cionales significativas (véase recuadro 10-3);
► diferen tes secu en cias no traducidas. Combinaciones alternati­
vas de exones no codificantes y variantes de exones no codifican­
tes dan por resultado diferentes secuencias 5' o 3' no traducidas
y en ocasiones distintos sitios de poliadenilación (véase fig. 10-15).
Aunque la importancia funcional de diferir secuencias no tra­
ducidas no suele ser clara, en algunos genes es un fenómeno
notable -p. ej., el mRNA del receptor de hormona del creci­
miento muestra cuando menos ocho secuencias 5' UTR dife­
rentes como resultado de empalme alternativo (Pekhletsky y
cois., 1992).

A) Intrón retenido

!------- "1------- ! E) Múltiples sitios poli(A)

B) Sitios de empalme 5' com petidores

F) Exones casete

C) Sitios de empalme 3' com petidores

G) Exones mutuamente exclusivos

Fig. 10-15. Tipos de acontecim iento de em palme alternativo.

Es posible incluir u omitir (brincar) exones casete F) internos en forma independiente de otros exones (omisión de exón) en tanto que ocurren exones
mutuam ente exclusivos G) en arreglos de dos o más exones, sólo uno de los cuales puede seleccionarse a la vez para incluirse en el RNA maduro. Los
ejemplos ilustrativos de algunos de estos acontecimiento son los siguientes: exones casete, exón 5 del gen WT1 (fig. 10-16A); variantes de longitud de!
exón debidas a sitios de empalme 5 ' competidores B), variantes de! exón 9 en el gen WT1 (fig. 10-16A); exones mutuamente exclusivos, variantes para
exones 4 . 6, 9 o 17 del gen Dscam (fig. 10-16B). La elección de promotores alternativos también introduce exones 5’ alternativos (véase fia. 10-14).
Adaptado de Roberts y Smith (2002) Curr. Opin. Chem. Biol. 6,375-383 con autorización de Elsevier. Obsérvese que además de! empalme alternativo, en
el genoma humano también se encuentran ejemplos ocasionales de empalme trans. En tanto que el empalme alternativo junta secuencias transcritas de
diferentes combinaciones de exones dentro de una unidad de transcripción única en una cadena de DNA única, el empalme trans reúne secuencias transcritas
de exones que pertenecen a distintas unidades de transcripción en diferentes cadenas de DNA (véase Finta y Zaphiropoulos, 2002; Maniatis y Tasic, 2002).
 10.3 TRANSCRIPCIÓN Y PROCESAMIENTO ALTERNATIVOS DE GENES INDIVIDUALES
El empalme (corte y unión) alternativo puede originar gran núme­
ro de isoformas posibles, inclusive hasta las asombrosas 38 016 iso-
formas de proteínas del gen de Drosophila Dscam (Schmucker y
cois., 2000; véase fig. 10-16B). Está demostrado que algunas de es­
tas alternativas son reguladas de manera específica por el desarrollo
v los tejidos. En algunos genes bien estudiados se demostró que for­
mas alternativas de empalme están en extremo bien conservadas,
como las isoformas +KTS y -KTS del gen WT1 del tumor de
Wilms (fig. 10-16A; recuadro 10-3), que se conservan en organis­
mos relacionados de modo distante como el pez soplador.
Empalme alternativo: regulación
El mejor sistema modelo que se conoce para comprender la regu­
lación del empalme es la vía de la determinación del sexo en Dro­
sophila, que también controla la dosis génica. Se utiliza empalme
alternativo en cada rama de esta vía a fin de controlar la expresión
de reguladores transcripcionales o de proteínas relacionadas con la
cromatina que influyen en la transcripción y un control del empal­
me tanto positivo como negativo es evidente (véase López, 1998).
Los reguladores de empalme candidatos en células de mamíferos
son la fa m ilia SR de proteínas de unión de RNA [que tienen un
dominio terminal C preciso abundante en dipéptidos serina(S) y
arginina(R)] y algunas proteínas HnRNP (partícula de ribonu-
cleoproteína nuclear heterogénea). Se sabe que estas proteínas pro­
mueven varios pasos en el ensamble de espliceosomas y que
también se enlazan a secuencias intensificadoras de empalme, se­
cuencias reguladoras que pueden incrementar el reconocimiento
del sitio de empalme (véase Blencowe 2002; Cáceres y Kornblihtt,
2002; Fairbrother y cois., 2002).
Poliadenilación alternativa
El uso de señales de poliadenilación alternativa en mRNA humano
también es muy frecuente y se identifican diferentes tipos de polia­
denilación alternativa (véase Edwards-Gilbert y cois., 1997). En
muchos genes se encuentran dos o más señales de poliadenilación
en la 3' UTR y los transcritos poliadenilados de manera alternati­
va pueden mostrar especificidad de tejido; en otros casos es posible
Recuadro 10-3. El empalme (corte y unión, splicin g ) alternativo puede alterar las propiedades funcionales
de una proteína
La lista siguiente, que está muy lejos de ser completa, tiene como fin ilus­
trar algunas formas en que las propiedades biológicas de una proteína
pueden alterarse como resultado del empalme alternativo. Para una infor­
mación más amplia véase López (1 9 9 8 ) y Graveley (2001).
► Isoformas especificas de tejido, por ejemplo, las Isoformas tropo-
mlosina y calcitonina (esta última incluye la calcltonina expresada por
la tiroides y el péptido neural relacionado con el gen de calcitonina).
► Isoformas enlazadas con la membrana y solubles. La localización
de las proteínas puede regularse mediante la generación de formas
solubles de numerosos receptores de membrana, por ejemplo, HLA
clases I y II, IgM, CD8, receptor de hormona del crecimiento, IL-4, IL-
5, IL-7, IL, eritropoyetina, G-CSF, G-MCSF, LIF (factor inhibidor de leu-
cina) y el receptor de señalamiento de apoptosis FAS.
► Localización intracelular alternativa. Un ejemplo útil lo proporciona
el gen del tumor de Wilms WT1 que especifica una proteína con cua­
293
que se pongan en juego señales de poliadenilación alternativa des­
pués del empalme alternativo.
10.3.3 La edición de RNA es una forma rara
de procesamiento por la que se introducen
cambios específicos de bases en el RNA
La edición de RNA es una forma de procesamiento postranscrip-
cional que puede incluir inserción y deleción mediada por enzimas
de nucleótidos o sustitución de nucléotidos únicos a nivel del RNA.
Al parecer la edición de RNA con inserción o deleción es una propie­
dad peculiar de la expresión génica en mitocondrias de protozoarios
cinetoplástidos (como los tripanosomas) y mohos de limo. A me­
nudo la edición de RNA con sustitución se utiliza en algunos sis­
temas, como en las mitocondrias y los cloroplastos de plantas
vasculares en las que mRNA individuales pueden someterse a múl­
tiples eventos de edición C “* U o U C.
No se dispone de pruebas de inserción o deleción en la edición
de RNA en mamíferos, pero se observa edición con sustitución en
un número limitado de genes (véase Gerber y Keller, 2001). La edi­
ción de RNA que se sabe que ocurre incluye sobre todo desamina-
ción (eliminación de grupos amino) de residuos de citosina o
adenina muy seleccionados (catalizada por una familia de desami-
nasas dependientes de RNA), pero también puede ocurrir transa-
minación (modificación por adquisición de un grupo amino),
como en el caso de la edición U -* C en el gen del tumor de Wilms
(véase fig. 10-16A). Las dos clases de edición de RNA que se basan
en desaminación conocidas son:
► edición C ~>U. Se observa en muy pocos genes, en especial el
gen de apolipoproteína APOB humano en el que se estudió
bien. En el hígado, el gen APOB codifica un transcrito de mR­
NA de 14.1 kb y un producto de 4 536 aminoácidos, apoBlOO.
Sin embargo, en el intestino una desaminasa de citosina especí­
fica, APOBEC1, convierte una citosina aislada en el nucléotido
6 666 en uridina, lo que en consecuencia genera un codón de
detención prematuro. El mRNA truncado (7 kb) codifica un
producto, apoB48, idéntico en secuencia a los 2 152 primeros
aminoácidos de apoBlOO (fig. 10-17). La desaminasa inducida
tro dedos de cinc en su terminal C y tiene hasta 24 isoformas diferen­
tes. El empalme diferencial puede conducir a la inclusión u la omisión
de una secuencia que especifica tres aminoácidos, KTS, que rige la
localización nuclear (véase fig. 10-16A).
► Alteración de la función. Las isoformas + K T S y -K T S del produc­
to del gen WT1 también difieren en su capacidad para enlazarse a se­
cuencias especificas de DNA en genes blanco. Se piensa que las
primeras participan en el enlace de factores de empalme; las últimas
pueden tener una función más general enlazando dominios que alo­
jan factores de transcripción general. Otros ejemplos comprenden:
isoformas del factor de transcripción (que activan/reprimen la trans­
cripción según la naturaleza de los dominios incluidos o excluidos
del producto proteíníco; véase López, 19 9 8) e isoformas que pro­
mueven e inducen la apoptosis de diversos genes, como el gen Ich-
1 (caspasa 2).
294 CAPÍTULO DIEZ EXPRESIÓN GÈNICA HUMANA

p o r activación (AID), una enzima que participa en la recombi­
nación y mutación de DNA de inmunoglobulina, muestra un
similitud considerable con APOBEC1 pero al parecer desami­
na desoxiáú&mzs (sección 10 .6 );
► edición A —►I. La efectúan miembros de la fa m ilia ADAR de
desaminasas (desaminasa de adenosina que actúa en RNA) en
mRNA que codifica ciertos canales de iones controlados por li­
gando, inclusive los receptores de glutamato y proteínas rela­
cionadas. Una adenosina se desamina para dar inosina (I), una
base que no suele encontrarse en el mRNA (el grupo amino en
el carbono 6 de la adenosina es sustituido por un grupo carbo-
nilo C = O). La inosina se comporta como guanosina; forma
pares de bases de preferencia con citosina y durante la síntesis
de proteínas es traducida como si fuera G cuando se encuentra
en un codón. En el caso del gen del receptor B de glutamato,
por ejemplo, la edición de RNA reemplaza un codón CAG
(glutamina) por CIG, que se traduce como si fuera CGG y da
arginina. Con frecuencia este tipo de edición que origina una
Gln —>Arg se dertomina edición Q/R (según el código de le­
tras único para los dos aminoácidos relacionados).
Aunque aún no se conoce con certeza todo su significado, en ma­
míferos la edición de RNA es importante para la supervivencia (p.
ej., los knock-out de genes ADAR de ratones individuales pueden
dar varios fenotipos). Es posible que surgiera en la evolución a fin
de corregir errores a nivel del genoma, pero también puede propor­
cionar una forma de regulación de la expresión y medios adiciona­
les para crear una diversidad de proteínas.
10.4 Expresión génica diferencial:
orígenes a través de a s im etría y
perpetuación hasta m ecanism os
epigenéticos como m etiiación
del DNA
El concepto de especificidad tisular de la expresión génica humana se
estableció hace mucho tiempo. Lo que resulta menos claro es la for­
ma en que estos patrones se establecieron inicialmente. Si se conside­
ra que el contenido de DNA de todas las células nucleadas en un
organismo es casi idéntico, los mecanismos genéticos no explicarían
cómo se desarrolló por primera vez la expresión génica diferencial en
las células. Para explicar lo anterior C. H. Waddington recurrió a me­
canismos epigenéticos de control génico durante el desarrollo. Los
mecanismos genéticos explican estados hereditarios (caracteres) que
resultan de cambios en la secuencia del DNA (mutaciones), pero los
mecanismos epigenéticos describen estados hereditarios que no de­
penden de la secuencia de DNA. En fecha reciente se identificó que en
las células de los vertebrados opera una variedad de mecanismos epi­
genéticos, aun algunos que pueden perpetuar estados particulares de
expresión génica en linajes de células somáticas.

A) WT1
U ZF ZF ZF ZF
CUG AUG AUG 1 1 2 3 4
\
> ' ' A A A A ACA A A A

1 2 3 4\5/6 7 8 9\/~ïÔ

B) Dscam
Exón 4 Exón 6 Exón 9 Exón 17
Dominio lg Dominio lg Dominio lg Dominio TM
12 variantes 48 variantes 33 variantes 2 variantes

Fig. 10-16. Diferencias funcionales y potencial complejidad masiva por empalme alternativo en el gen del tumor de Wilms WT1 y el gen de Dscam
de D rosophila respectivamente.

A) Empalme de WT1. Son posibles 24 isoformas debido a una combinación del uso alternativo de tres codones de inicio diferentes en el exón 1, una
sustitución de edición de RNA U —►C en el exón 6 y dos acontecimientos de empalme alternativos: omisión variable (brinco) del exón 5 y variación de
la longitud para el exón 9 (a causa de sitios de empalme 5' competidores para el intrón 9). La variación del exón 9 da por resultado inclusión u omisión
de un péptido KTS. Las isoformas +KTS se localizan específicamente en sitios espliceosómicos en el núcleo y se piensa que participan en el enlace de
factores de empalme, en tanto que las isoformas -KTS se distribuyen de manera más general en el nucleoplasma y pueden tener una función más ge­
neral en el enlace de dominios que alojan factores de transcripción generales (Larsson y cois., 1995). B) Empalme de Dscam. Puede generarse un total
de 38 016 (12 x 48 x 33 x 2) isoformas posibles seleccionando variantes mutuamente exclusivas para cada uno de los exones 4, 6 y 9 que codifi­
can dominios similares a inmunoglobulina y para el exón 17 que codifica una región transmembrana (véase Schmucker y cois., 2000). Adaptado de Ro-
berts y Smith (2002). Curr. Opin. Chem. Biol. 6, 375-378 con autorización de Elsevier Science.

Gen 5 -
ApoB
\nm
HÍGADO
6 666
5 ' ------------jCAAr-------UAA AAAA...An 3'
ij Traducción
1 2 1 52 2153 4 536
NHol I ICOOH
ApoB100
Fig. 10-17. Edición de RNA específico de tejido durante el procesamiento del gen de apoliproteína B humano {flPOB).
En el codón hepático 2 1 5 3 (CAA) en las posiciones nucleótidas 6 666-6 668 de la APOB el mRNA especifica glutamina. Sin embargo, en el intestino,
la edición de RNA C -> U en la posición 6 666 ocasiona el reemplazo del codón CAA por el codón de detención, UAA, cuyo resultado es un producto
más corto, ApoB48.
10.4.1 Es muy probable que la expresión génica
selectiva en las células de embriones
de mamíferos se desarrollara en respuesta
a fenómenos de señalamiento intercelulares
de corto alcance
La explicación de los patrones de expresión subsecuentes específi­
cos de tejidos, de células y de la etapa del desarrollo requiere algu­
nos mecanismos para establecer una asimetría o un eje en el óvulo
fecundado o en una etapa muy temprana del desarrollo. En Dro­
sophila, el huevo es inherentemente asimétrico por la transferencia
de productos génicos de células nodrizas situadas de manera asimé­
trica. Al principio el embrión se desarrolla como un sincitio multi-
nucleado (una célula grande) y la regionalización depende de la
respuesta de núcleos individuales a gradientes de largo alcance de
moléculas reguladoras. Sin embargo, en mamíferos la célula óvulo
es hasta cierto punto pequeña y el desarrollo embrionario tempra­
no crea un agregado al parecer simétrico de células individuales. No
obstante, el desarrollo se torna asimétrico.
La generación de asimetría en las células de los mamíferos po­
dría derivarse de indicios de posición tempranos. Algunos aspectos
del desarrollo temprano son inherentemente asimétricos, inclusive
el punto de entrada del espermatozoo durante la fecundación, la fi­
jación del embrión en la pared uterina durante la implantación y la
localización de células con respecto a sus vecinas. Conforme el em­
brión se desarrolla en una pelota de células y después en tanto se
desarrollan estructuras más complejas, las células individuales va­
riarán en cuanto al número de células vecinas disponibles. Los
acontecimientos de señalamiento intercelular directo o señalamien­
to intercelular de corto alcance pueden constituir un medio para
10.4 EXPRESIÓN GÈNICA DIFERENCIAL 295
[CAA! TAA
■ H fH
Exón 26
INTESTINO
6 666
5 ' ------ — |CAA|------ -|UAA — AAAA...An 3'
Edición de R N A C —»U
5 '---------- |UAA|----- H u AA|------ AAAA...An 3'
, Traducción
1 2152
I ICOOH — Proteína
ApoB48
identificar la posición de las células y desencadenar la expresión gé­
nica diferencial. Por ejemplo, si una molécula de señalamiento in­
tercelular tiene un alcance de un diámetro celular, entonces las
células en el exterior de la blástula (sección 3.7.2; fig. 3-13) recibi­
rán diferentes señales de las que están rodeadas por células vecinas
en todos los lados y los diferentes indicios de posición pueden
traducirse en una expresión génica diferencial. A medida que se
desarrollan sistemas celulares particulares durante, por ejemplo, la
organogénesis (que se lleva a cabo sobre todo entre la cuarta y la no­
vena semanas embrionarias), factores de crecimiento o diferencia­
ción de tipo celular particular pueden inducir la expresión de factores
de transcripción específicos de la etapa del desarrollo, de tejido, o de
ambos.
10.4.2 La metilación del DNA es un factor epigenético
importante en la perpetuación de la represión
génica en células de vertebrados
Una vez que los patrones de expresión diferencial se establecen, los
mecanismos epigenéticos pueden asegurar que se hereden de modo
estable cuando las células se dividen, proporcionando una forma de
memoria celular que se transmite a través de linajes celulares. Los
mecanismos epigenéticos pueden asegurar la herencia estable de un
estado con actividad transcripcional (conformación de cromatina
“abierta”) para algunos genes o regiones del genoma blanco o, de
manera alternativa, organizar la cromatina de algunas regiones del
genoma para que adopte una forma muy condensada, sin actividad
transcripcional. Hoy en día se considera que en el desarrollo animal
operan cuando menos dos, y tal vez tres, diferentes mecanismos
epigenéticos:
296 CAPITULO DIEZ EXPRESIÓN GENICA HUMANA
► mediación de DNA: un mecanismo epigenético en el que la
cromatina se organiza en estados cerrados, sin actividad trans-
cripcional (véase más adelante);
► regulación génica policardada-tritórax. El grupo de represores
policardados y el grupo tritórax de activación conservan la ex­
presión correcta de varios reguladores del desarrollo fundamen­
tales (inclusive los genes homeóticos) mediante el cambio de la
estructura de la cromatina, sea a una conformación “cerrada”
(reprimida en términos de transcripción) o “abierta” (con acti­
vidad transcripcional); véase Mahmoudi y Verrijzer, 2001);
► modificación de la histona: un tercer mecanismo epigenético
probable que puede originar la perpetuación de estados de ex­
presión en localizaciones genómicas específicas (Turner, 2002;
véase sección 10 .2 . 1).
En la actualidad se reconoce que la mediación del DNA es un meca­
nismo epigenético importante que interactúa con la modificación de
la histona (véase sección 10.4.3) a fin de permitir la transmisión es­
table de estados de cromatina que reprimen la expresión génica de
una célula diploide a las células hijas (véase Bird, 2002). Sin embar­
go, la función precisa de la metilación del DNA en eucariotas aún no
se comprende a la perfección y muestra diferencias claras de especie
(véase recuadro 9.3). Las metiltransferasas de citosina de los vertebra­
dos reconocen una secuencia blanco CpG pero difieren de las meti-
< GpC < desarrollarse, ocurre n ueva metilación. Esto conduce a una metila­
i Metiltransferasa
< GPC <
Duplicación
de DNA
> CpG) > embargo, la extensión de esta metilación varía en diferentes linajes
< GP¿ <
Fig. 10-18. Un requerimiento para que la metiltransferasa especifica
reconozca una secuencia blanco hemimetilada perpetúa la metilación
de CpG.
La secuencia CpG tiene una simetría de diada. Después de la metila­
ción del blanco hemimetilado (metilado sólo en una cadena), las dos
cadenas metiladas se separarán en la duplicación del DNA y actuarán
como plantillas para la síntesis de dos cadenas hijas no metiladas. Los
dúplex hijos resultantes proporcionarán ahora nuevos blancos hemime-
tilados para continuar el mismo patrón de metilación.
lasas bacterianas, que muestran una preferencia potente por el reco­
nocimiento de un blanco de DNA hemimetilado (uno que ya está
metilado sólo en una cadena). La secuencia CpG muestra simetría de
diadas y, por tanto, tras la replicación del DNA las cadenas de DNA
recién sintetizadas recibirán el mismo patrón de metilación CpG que
el DNA parental (fig. 10-18). En consecuencia el patrón de metila­
ción de CpG puede transmitirse de modo estable a células hijas. La
perpetuación de un patrón de metilación preexistente también se co­
noce como metilación de conservación y en células de mamíferos la
efectúa la metiltransferasa D nm tl.
El patrón de distribución de 5-metilcitosinas en el genoma de
células somáticas diferenciadas varía según el tipo de célula pero la
metilación de conservación asegura que los patrones de metilación
en linajes de células somáticas individuales sean muy estables. No
obstante, durante el desarrollo temprano ocurren cambios notables
en la metilación, que constituyen una forma de reprogramación
epigenética (véase Razin y Kafri, 1994; Reik y cois., 2001; Li,
2002). Dos tipos principales de reprogramación epigenética se ob­
servan durante el desarrollo (véase fig. 10-19).
Reprogramación en células germinales
Las células germ inales prim ordiales del embrión (células a partir de
las cuales se derivan los gametos) comienzan con DNA muy meti­
lado, pero luego ocurre una desmetilación progresiva durante el de­
sarrollo. Para el tiempo en que las células germinales primordiales
penetraron en las gónadas, la desmetilación es en gran parte com­
pleta y terminará poco después. Sin embargo, después de la dife­
renciación gonadal y conforme las células germinales comienzan a
ción sustancial del DNA de las células espermatozoo y óvulo de
mamíferos. El genoma del espermatozoo está metilado con más in­
tensidad que el genoma de los óvulos y se evidencian diferencias es­
pecíficas de sexo en los patrones de metilación, en especial en locus
improntos (véase Merteneit y cois., 1998 para referencias).
Reprogramación en el embrión temprano
El genoma del oocito fecundado es un agregado de los genomas del
espermatozoo y el óvulo, y tanto éste como el embrión muy tempra­
no están metilados de modo sustancial con diferencias de metilación
en muchos genes de los alelos paternos y maternos. Después, en las
etapas de mórula y blástula temprana en el embrión preimplanta-
ción, la totalidad d e l gen om a se desmetila. Todavía más tarde, en la
etapa de pregastrulación, ocurre una n ueva m etilación amplia. Sin
celulares: los linajes d e células som áticas se median con intensidad;
los linajes derivados d e l trofohlasto (que dan lugar a la placenta, el
saco vitelino, etc.) están submetilados; las células germ in ales p r i­
m ordiales tem pranas no se afectan; su DNA genómico permanece
en gran medida no metilado hasta después de la diferenciación go­
nadal (como se describió antes).
La contribución de las diferentes metiltransferasas a la nueva me­
tilación aún no se define. Las metiltransferasasDnmt3ay Dnmt3bson
candidatas firmes pero no suficientes por sí mismas. En lugar de ello
parece probable que interactúen con la metiltransferasa Dnmtl. El
gen D nm tl se expresa altamente en células germinales masculinas,
oocitos maduros y en el embrión temprano, y la expresión está suje­
ta a regulación específica del sexo como resultado del uso de promo­
tores específicos de oocitos y de espermatocitos (véase fig. 10-20 ).
 10.4 EXPRESIÓN GÈNICA DIFERENCIAL 29"

D iferenciación D esarrollo de Fecundación M órula Biastocisto Pregastrulación Diferenciación

gonadal células germ inales tem prano gonadal
Etapa del desarrollo

Fig. 10-19. Cambios en la metilación del DNA durante el desarrollo de mamíferos.

Las etapas del desarrollo para la gametogénesis y el desarrollo embrionario temprano se expandieron con fines de claridad; las del desarrollo tardío, in­
dicadas por cortes dobles, se redujeron. Obsérvense los cambios muy rápidos en la metilación del DNA durante: a) la gametogénesis: la metilación
nueva da lugar a genomas sustancialmente metilados en el espermatozoo y el óvulo (aunque con diferencias tanto en el nivel total de metilación como
en el patrón de metilación en estos genomas; véase texto) y b) el em brión tem prano donde ocurre una onda de desmetílación de todo el genoma en la
etapa preimplantacíón (mórula y blástula temprana) y es seguida poco después por nueva metilación a gran escala que se inicia en la etapa de pregas­
trulación. La última es en particular notable en linajes somáticos y en menor extensión en linajes de trofoblastos, y da lugar a la placenta y el saco viteli-
no, pero no ocurre en las células germinales primordiales (las células del embrión que por último originan las células espermatozoo y óvulo).

10.4.3 La metilación del DNA animal puede constituir
una defensa contra transposones lo mismo que
la expresión génica reguladora
Aunque al parecer no todos los eucariotas están sujetos a metilación del
DNA, su función en células animales parece fundamental y el knock-
out dirigido del gen de metiltransferasa de citosina en ratones produce
letalidad embrionaria. Sin embargo, la función precisa de la metilación
del DNA en células animales aún no se aclara. Los conceptos actuales
se enfocan en particular en dos aspectos de las células animales: el ta­
maño del genoma (los animales tienen genomas comparativamente
grandes con números considerables de genes y también grandes núme­
ros de familias con DNA muy repetidos que pertenecen a la clase
transposón) y el modo de desarrollo (en especial la variación en térmi­
nos del periodo de vida y el índice de recambio celular). Dos concep­
tos muy contrastantes respecto a la función principal de la metilación
del DNA en células animales son el tema de una gran controversia: el
m odelo d e defensa d el huésped y el m odelo d e regulación génica.
ped considera que la función principal de la metilación del DNA en
células animales es conferir una forma de protección del genoma, pe­
ro en este caso mediante el control de la diseminación de transposones
(Yoder y cois., 1997). Cerca de 45% de las secuencias de DNA en el ge­
noma humano puede clasificarse como perteneciente a familias de
transposones y se sabe que una fracción pequeña de estas secuencias en
el genoma humano y en otros genomas sufre transposición activa (sec­
ción 9.5). Está demostrado que las familias de transposones en los ge­
nomas humano y otros están intensamente mediadas (se cree que
alrededor de 90% de las 5-metilcitosinas se localizan en familias de re-
trotransposones) y por consiguiente suele considerarse que la metila­
ción del DNA es un mecanismo para reprimir esta transposición, que
si no se controla cabría esperar que dañara las células. No obstante, da­
tos recién obtenidos de un cordado invertebrado, d o n a intestinalis, al
parecer no son compatibles con el modelo de defensa del genoma:
múltiples copias de un retrotransposón aparentemente activo y de una
fracción grande de SINE muy repetidos eran de manera predominan­
te no metilados, en tanto que, en contraste, al parecer los genes esta­
ban metilados (Simmen y cois., 1996).

Defensa del huésped como una función principal Regulación génica como principal función
para la metilación del DNA de la metilación del DNA
Como la función de restricción y modificación de la metilación del Por lo general se piensa que la metilación del DNA en vertebrados
DNA en bacterias (véase recuadro 5.2), el modelo de defensa del hués­ es un mecanismo de silenciamiento de la transcripción y puede
298 CAPÍTULO DIEZ EXPRESIÓN GÉNICA HUMANA
O ocito Células som áticas
pl- *” p ¡ pp^- Esperm atocitos
------- *1-------------- ---------------------------- h - H -------------1—
"^oo ^ so"^ sp 2 3 4 5 rrelacionan con silenciamiento transcripcional. Además la exten­
Fig. 10-20. Los promotores específicos de sexo regulan el gen de me-
tiltransferasa D nm tl.
Al parecer el gen de metiltransferasa D n m tl es la metiltransferasa de
DNA de sostén predominante en células de ratón y también puede ser
la principal metiltransferasa nueva. Se expresa altamente en células
germinales del varón, oocitos maduros y en el embrión temprano. Hay
cinco exones pero con una elección variable entre tres diferentes posi­
bilidades para el exón 1 como resultado del uso de promotores alterna­
tivos (de manera muy similar a las elecciones del promotor alternativo
para las diferentes isoformas de distrofina p427; véase fig. 10-14).
Son: exón 1 sq (que se utiliza en células somáticas), exón 1 q (que se
emplea en oocitos) y exón 1sp (que se usa en esfiermatocitos). El
exón específico de oocitos se relaciona con la producción de cantida­
des muy grandes de metiltransferasa Dm ntl activa, que está truncada
en la terminal N y permanece en el citoplasma durante las etapas ulte­
riores del crecimiento. El exón específico de espermatocitos interfiere
con la traducción e impide la producción de D m ntl durante el cruza­
miento en la etapa de meiosis masculina. Véase Mertineit y cois. (1998).
constituir una posición de abandono. Las secuencias de DNA con
actividad transcripcional no deben estar mediadas (cuando menos
en las regiones promotoras). Si bien la metilación del DNA en in­
vertebrados puede servir para reprimir los transposones y otras fami­
lias de secuencia repetidas, tal vez adquirió una función especial en
vertebrados como un mecanismo para regular la expresión de genes
endógenos y reducir el ruido transcripcional (al silenciar una frac­
ción grande de genes cuya actividad no es necesaria en una célula).
El argumento contrario es que el estado de metilación de las re­
giones 5' de genes específicos de tejido no puede correlacionarse
con la expresión en diferentes tejidos y la función de la metilación
en la expresión génica se da en funciones biológicas especializadas
que resultan de mecanismos (p. ej., impronta, etc.) que utilizan ex­
presión génica específica de alelo (Walsh y Bestor, 1999).
Metilación del DNA y expresión génica
El DNA de la cromatina con actividad transcripcional y sin ella di­
fiere en varias características que incluyen el grado de compacta-
ción y la extensión de su metilación (véase cuadro 10-6). En tanto
Cuadro 10-6. Características relacionadas con cromatina transcripcionalmente activa e inactiva.
Característica Cromatina con actividad transcripcional
Estructura de la cromatina Conformación abierta, extendida
Metilación de DNA Relativamente no metilada, en especial
en regiones promotoras
Acetilación de histona Histonas acetiladas
que la metilación de islotes CpG corriente abajo de promotores no
bloquea la transcripción continua a través de estas regiones (Jones,
1999), no hay duda que las regiones promotoras metiladas se co­
sión de la acetilación d e la histona es un factor importante (véase
también sección 10.2.1). Acetiltransferasas de histona específicas
añaden grupos acetilo a residuos de lisina cerca de la terminal N de
proteínas histona e inducen una conformación de cromatina más
abierta; la desacetilación de la histona promueve la represión de la
expresión génica.
Los procesos de metilación del DNA y la modificación de la
histona están relacionados (véase Li, 2002). Se cree que la repre­
sión de las secuencias CpG metiladas en las regiones promotoras
es mediada por proteínas que se enlazan de manera específica a
CpG metilados. Se identifican dos de estas proteínas, MeCPl y
MeCP2 (proteínas de enlace de CpG metiladas 1 y 2) y está de­
mostrado que la última es esencial para el desarrollo embrionario
y como un represor de la transcripción. La MeCP2 silencia la ex­
presión génica en parte por la incorporación de actividad de
HDAC, que ocasiona la remodelación de la cromatina. La elimina­
ción del grupo acetilo de H3K9 (histona 3, residuo lisina 9) va segui­
da de la metilación de H3K9 ayudada por MeCP2, y la metilación
de la histona resultante es una señal para incorporar proteínas como
HP1 que conducen a que la cromatina se condense (véase Fuks y
cois., 2 0 0 2 , referencias en la misma y fig. 10 -21 ).
10.5 Control de largo alc a n c e de la
expresión y la im pronta génicas
10.5.1 La estructura de la cromatina puede ejercer un
control en la expresión génica de largo alcance
A diferencia de los genes bacterianos, los de eucariotas suelen trans­
cribirse individualmente. De manera característica, promotores y
elementos relacionados corriente arriba controlan la expresión de
un gen aislado con un punto de inicio de transcripción localizado
dentro de 1 kb del elemento de control. Sin embargo, algunos ele­
mentos de acción cis ejercen un control de largo alcance sobre una
región cromosómica mucho más grande y cada vez se cuenta con
más evidencias de la regulación coordinada de grupos génicos.
Asimismo estudios en que los genes se recolocan en alguna otra
parte del genoma sugieren que los cromosomas están organizados en
dominios funcionales de expresión génica (dominios de cromatina),
tal vez como resultado de modificaciones d e la histona (véase sección
10.2.1). Por ejemplo, cuando se transloca genes a nuevas regiones
Cromatina sin actividad transcripcional
Conformación muy condensada; en particular aparente en
la heterocromatina (tanto heterocromatina facultativa como
heterocromatina constitutiva)
Metilada, inclusive en regiones promotoras
Histonas desacetiladas
 10.5 CONTROL DE LARGO ALCANCE DE LA EXPRESIÓN Y LA IMPRONTA GÉNICAS 299

M e C P 2 + S in
M e t iltr a n s fe r a s a
3 /d e s a c e t ila s a M e tiltr a n s f e r a s a HP1 e tc é te ra
de DNA
d e h is to n a d e lis in a

C r o m a tin a C r o m a tin a a c tiv a

a c tiv a (a b ie rta ) (c o n d e n s a d a )

Clave
— Colaacetilo

Fig. 10-21. La mediación del DNA puede mediar la represión transcripcional mediante desacetilación de histona y metilación de H3K9 de histona.

Los dinucléotidos CpG son blancos para metilación del DNA y, a su vez, los CpG metilados lo son para el enlace especifico por proteínas com o MeCP2.
Esta última actúa como un represor transcripcional e incorpora un complejo correpresor que consiste en el represor del factor de transcripción mSin3A
y desacetllasas de histona. MeCP2 también puede enlazar metiltransferasa de histona de tal manera que cuando H3K9 (la lisina en la posición 9 en la
Droteina histona 3) se desacetila, después se metila. H3K9 metilada es un blanco para proteínas heterocromatinízantes com o HP1 que ocasionan que la
cromatina se condense e ¡nactive transcrípcíonalmente (véase Fuks y cois., 2003).

cromosómicas (sea como resultado de fenómenos de rotura cromo- Inactivación de X

íomica espontáneos o en experimentos de transgénesis), suele ocurrir
Al parecer la inactivación del cromosoma X en mamíferos es inicia­
_ma expresión génica aberrante, inclusive aunque el gen completo y
da por un gen aislado, X1ST, que se expresa de manera única en el
tas secuencias de control necesarias en sus secuencias de flanqueo in­
cromosoma X inactivado (sección 10.5.6). Aunque este efecto no
mediatas se conserven intactos. Se piensa que los dominios cromosó-
se comprende, debe ser mediado por algún tipo de cambio estruc­
micos vecinos están separados por aisladores (llamados también
tural de la cromatina de largo alcance. Es así porque un agente difu­
elementos límite) que actúan como barreras contra los efectos de in-
sible mediado por X1ST no sería capaz de afectar sólo el cromosoma
tensificadores y silenciadores distales (véase Bell y cois., 2001).
X en el que el gen XISTse expresa.

Competencia por intensificadores o silenciadores

En ocasiones el control de largo alcance de la expresión génica pa­
rece depender de la competencia entre genes agrupados por un in-
tensificador. Al parecer esto es una característica de la expresión del
;;n de globina, como se describe en la sección 10.5.2.
Efectos de la posición inducidos por heterocromatina
Estudios de reordenamientos cromosómicos en Drosophila demos­
traron que la proximidad con centrómeros, telómeros o bloques de
heterocromatina puede suprimir la expresión génica, tal vez por al­
teración de la estructura de un dominio de cromatina grande (efec­
tos de la posición inducidos por heterocromatina). Aunque los
tipos de efecto d e la posición similares aún no se caracterizan bien en
el hombre, en estudios de puntos de rotura cromosómicos relacio-
-ados con enfermedades en humanos surgieron evidencias de efec­
tos de largo alcance que controlan la expresión génica en dominios
cromosómicos grandes. Los ejemplos son puntos de rotura cromo-
somicos que causan aniridia y displasia campomélica pero localiza­
dos a varios cientos de kilobases del locus de enfermedad afectado,
PAlX6y SOX9 (véase Kleinjan y Van Heyningen, 1998).
Los síndromes de Prader-Willi y de Angelman (véase recuadro
16-6 ) portan juntos efectos de posición, impfonta y metilación del
DNA. Se identificó una secuencia de acción cis análoga a la región
de control del locus de globina que rige la metilación específica de
radre y la expresión génica de una región cromosómica de tamaño
megabase 15ql 1 .
10.5.2 Una región de control de locus común puede
coordinar la expresión de genes individuales
en grupos génicos
Algunos grupos génicos humanos muestran pruebas de expresión
coordinada de genes individuales en el grupo. Por ejemplo, genes
individuales en la globina a , la globina (3 y los cuatro grupos
génicos HOX se activan de manera secuencial en una secuencia
temporal que se corresponde con su orden lineal en el cromosoma. La
expresión específica de etapa en los genes de globina se correlacio­
na con localizaciones alternativas de la producción de hemoglobi­
na durante el desarrollo. Por tanto, temprano en el desarrollo
embrionario las hemoglobinas se elaboran en una membrana ex-
traembrionaria, el saco vitelino, pero el hígado se constituye en el
principal sitio de síntesis en el feto antes de ceder su lugar a la mé­
dula ósea en adultos. Esta progresión del desarrollo se acompaña de
genes de encendido y apagado en cada uno de los dos grupos prin­
cipales de globina, que generan formas un poco diferentes de he­
moglobina (cambio de hemoglobina; fig. 10 -22 ).
Se propuso que la expresión de los genes en grupos génicos de
globina (y en algunos grupos de genes) es coordinada por una región
de control de locus (RCL) que se localiza a cierta distancia corrien­
te arriba del grupo génico. Las RCL son regiones de control domi­
nantes definidas por su capacidad en valoraciones transgénicas: la RCL
está acoplada a un gen de prueba o un grupo de genes que después
se transfectan y se permite que se integren en otro genoma. Cuando
lo anterior sucede, la RCL puede dirigir la expresión de alto nivel de
300 CAPÍTULO DIEZ EXPRESIÓN GÉNICA HUMANA
Grupo
Grupo
gènico de gènico de
globina a globina ß
Expresión
embrionaria
(en el saco vitelino)
Cambio 1,
5 a 6 semanas
de gestación
Expresión
fetal (en hígado)
Cambio 2,
justo antes
de nacer
Expresión T
en adulto P(+S)
(en médula ósea)
Fig. 10-22. Ocurre un cambio de la hemoglobina humana en dos eta­
pas precisas del desarrollo.
los genes ligados en todos los sitios de integración examinados (y en
niveles moderadamente constantes por copia génica). En contraste,
cuando se unen intensificadores a genes y se estudian en la misma
forma de recorrido, el gen unido puede mostrar una expresión muy
variable según el sitio de integración y por tanto el intensificador es­
tá sometido a efectos de posición negativos. Como resultado, las RCL
semejan intensificadores porque son capaces de activar la transcrip­
ción, pero también tienen un efecto dominante porque pueden ven­
cer señales de control negativas en el sitio de integración.
Al parecer la expresión de alto nivel impulsada por una RCL en
un sitio ectópico (cualquier sitio distinto a su localización normal en
el genoma) es consecuencia de dos actividades separables: el esta­
blecimiento de un dominio activo de cromatina “abierto” y la acti­
vación génica directa. La conformación abierta de dominios de
cromatina con actividad transcripcional los torna más accesibles a
corte por la enzima DN-asa I. Un hecho compatible con esta rela­
ción es que suele considerarse que la RCL de globina p humana
comprende secuencias cortas de cinco sitios mayores hipersensi-
bles a DN-asa I que se encuentran en el DNA de células eritroides
(pero no en e l DNA de células que no expresan d e modo significativo
genes d e globina). Los sitios hipersensibles a DN-asa I están agrupa­
dos en una región de 10 kb que se localiza alrededor de 50 a 60 kb
corriente arriba del gen de globina (3, en tanto que la RCL de glo­
bina a se ubica en un sitio hipersensible a DN-asa específica eri-
troide, HS-40, situado 60 kb corriente arriba del gen de globina a
( fig . 10-23A).
La secuencia de DNA en estos sitios hipersensibles a DN-asa I
semeja secuencias intensificadoras porque contiene un conjunto de
sitios de unión para factores de transcripción tanto ubicuos como
específicos de tejido (véase fig. 10 -7 ).
Aunque otros sitios hipersensibles a DN-asa I se localizan en los
promotores de los genes de globina, muestran especificidad de eta­
pa del desarrollo. Por ejemplo, en el hígado fetal los promotores de
los dos genes "y, los genes |3 y 8 , están marcados por sitios hipersen­
sibles a DN-asa I, pero en la médula ósea adulta los dos genes 7 ya
no poseen actividad transcripcional y sus promotores no muestran
más sitios hipersensibles a DN-asa I. Se cree entonces que el cam­
bio en la expresión del gen de globina específico de la etapa del de­
sarrollo ocurre por competencia entre los genes de globina para
interacción con su RCL respectiva y activación específica de etapa
de elementos silenciadores específicos de gen. Por ejemplo, la trans­
cripción del gen de globina e (HBE1) es estimulada de modo prefe-
rencial por la RCL vecina en la etapa embrionaria. Sin embargo, en
el feto la expresión de globina e se suprime después de la activación
de un silenciador y la expresión de globina 7 se torna dominante
(fig. 10-23B).
Sin las RCL respectivas, la expresión del gen de globina es insig­
nificante pero la naturaleza precisa del mecanismo de control aún
no se comprende con claridad. Aunque los modelos iniciales con­
sideraron que la formación de un asa del DNA intermedio lleva
elementos de RCL en contacto físico directo con promotores espe­
cíficos de los genes corriente abajo a fin de activarlos, en la actuali­
dad las interacciones simples entre RCL y el promotor no parecen
probables (Bulger y Groudine, 1999). Es más sorprendente aún que
en tanto que la RCL de la globina (3 humana puede inducir la aber­
tura de la cromatina en sitios ectópicos, al parecer no es capaz de
realizarlo cuando se encuentra en su localización original en el grupo
de globina (3, donde sólo puede comportarse como un intensificador de
transcripción simple (véase Bulger y cois., 2002). Este hecho, aunado
a la apreciación reciente de diferencias de especie importantes, in­
dica que este campo es muy fluido y se aconseja al lector interesa­
do que consulte la bibliografía más reciente.
10.5.3 Algunos genes humanos muestran expresión
selectiva de sólo uno de los dos alelos parentales
Los genes ligados a X en mujeres y todos los genes autosómicos son
bialélicos porque en condiciones normales tanto el padre como la
madre contribuyen con un alelo cada uno. En varones que poseen
un cromosoma X y uno Y, casi todos los genes ligados al sexo son
monoalélicos-. la mayor parte de los múltiples genes en X no tiene un
homólogo funcional en el cromosoma Y y se sabe que algunos de los
pocos genes del cromosoma Y son específicos de Y, como SRY, el
principal locus determinante del sexo masculino (sin embargo, se
conocen unos cuantos casos en los que se encuentran homólogos gé-
nicos funcionales en los cromosomas X e Y; sección 12.2.8).
Por costumbre se asume que se expresan tanto los alelos paterno
como materno de genes bialélicos, a menos que una o ambas copias
hayan tenido una mutación que afecta la expresión. Es claro que la
expresión puede ser específica de tejido y tipo celular, pero no suele
observarse una diferencia intrínseca entre las capacidades funciona­
les de los dos alelos. Sin embargo, en humanos y otros mamíferos se
conocen varios genes bialélicos en los que la expresión de un alelo
parental, sea el paterno o el materno, pero no ambos, está reprimi­
da normalmente en ciertas células (lo que constituye la forma de ex­
clusión alélica). En estas células se dice que el gen importante
muestra hemicigosidad funcional: sólo una mitad del producto gé-
nico máximo se obtiene normalmente incluso aunque las secuencias
de ambos alelos parentales sean compatibles a la perfección con la expre­
sión génica normal y aun idénticas. En algunos casos la exclusión alé­
lica puede ser una propiedad de células o tejidos seleccionados, en
tanto que en otras células del mismo individuo suelen expresarse
con normalidad ambos alelos.
 10.5 CONTROL DE LARGO ALCANCE DE LA EXPRESIÓN Y LA IMPRONTA GÉN1CAS 301

A) 10 20 30 40 50 60 70 kb

HS-40
V 51 V a2 V a l
Grupo de
-------------------- g lob ina a
RCL
Gy Ay vP
HS4 HS3 HS2 Grupo de
globina p
Y
RCL

Fig. 10-23. La expresión génica en los grupos del gen de globina « y p puede controlarse mediante regiones de control de locus comunes.
A) Organización de los grupos del gen de globina a y p. Las regiones de control de locus (RCL) consisten en uno o más sitios hipersensibles a
DN-asa I específicos eritroides (HS-40, etc.) localizados corriente arriba del grupo. Las flechas indican la dirección de la transcripción de los genes ex­
presados. El estado funcional del gen de globina theta es incierto: se expresa, pero la globina e no se incorpora en ninguna molécula de hemoglobina.
B) Regulación propuesta de la expresión génica por la RCL de globina fi. Las flechas de color rojo fuerte indican un intensificador potente por la
RCL en los genes indicados, lo que resulta en un nivel de expresión alto; las flechas rojas punteadas indican efectos correspondientemente débiles.
Este modelo es motivo de cierta controversia; véase texto.

Aunque al principio se consideró una rareza, la expresión mo-
noalélica de genes bialélicos se demuestra en un número cada vez
mayor de genes humanos. Es posible que participen una diversidad
de mecanismos de expresión distintos así como dos clases amplias
de mecanismos (véase Chess, 1998; Ohlsson y cois., 1998):
► exclusión alélica según e l p a d re d e origen (impronta). En algu­
nos casos la elección de cuál de las dos copias heredadas se expre­
sa no es aleatoria. Esto significa que para algunos genes el alelo
cuya expresión se reprime siempre es el de herencia paterna; en
otros siempre es el alelo de herencia materna (sección 10.5.4);
► exclusión alélica in dep en d ien te d el p a d re d e origen. En este ca­
so la decisión en cuanto al alelo que se reprime de ambos al
principio es aleatoria, pero más adelante ese patrón de exclu­
sión alélica se transmite de manera estable a las células hijas
después de la división celular. Puede participar una diversidad
de mecanismos (recuadro 10-4).
10.5.4 La impronta genómica incluye diferencias en la
expresión de alelos según el padre de origen
Varias observaciones en mamíferos sugirieron que los genomas ma­
terno y paterno de un individuo no son equivalentes (recuadro
10-5). Aunadas a las diferencias genéticas entre el DNA del geno-
ma del espermatozoo y el genoma del oocito, se observan diferen­
cias epigenéticas. Una distinción importante en ambos es la
cantidad total de metilación del DNA (el genoma del espermato­
zoo está metilado de modo más extenso que el genoma del oocito)
y el patrón de metilación del DNA en clases específicas de secuen­
cias del DNA. Por ejemplo, la secuencia LINE1 está muy metilada
en espermatozoos, pero sólo en parte en el oocito (véase Razin y
Kafri, 1994; Yoder y cois., 1997). Algunos locus génicos individua­
les presentan también diferencias importantes entre la extensión de
la metilación de alelos paternos y maternos. Por ejemplo, el alelo
paterno del gen H 19está intensamente metilado; el alelo materno
está submetilado.
Como lo sugieren las observaciones del recuadro 10-5, las dife­
rencias entre los genomas paterno y materno dan lugar a variacio­
nes en la expresión entre los alelos paterno y materno. La impronta
genómica (también llamada impronta gam ética o parental) en ma­
míferos describe la situación en que no hay equivalencia en la ex­
presión de alelos en ciertos locus génicos, según el padre de origen
(Reik y cois., 2001; Sleutels y Barlow, 2002). En todos (o al menos
algunos) los tejidos en que se expresa el gen, la expresión del alelo
de herencia paterna o el alelo de herencia materna está reprimida
en forma consistente, lo que resulta en una expresión monoalélica.
302 1 CAPÍTULO DIEZ EXPRESIÓN GÈNICA HUMANA

Recuadro 10-4. Mecanismos que dan por resultado expresión monoalélica a partir de genes bialélicos en
células humanas

M e c a n is m o E je m p lo s d e g e n e s im p o rta n te s y lo c a liz a c ió n c e lu la r d e la e x p re s ió n m o n o a lé lic a

A. Exclusión alélica según e l padre de origen

Im p ro n ta g e n ó m ic a
U n n ú m e ro p e q u e ñ o de g e n e s (vé a s e L e c tu ra s a d ic io n a le s p a ra d e ta lle s de l Im p rin te d
G ene C a ta lo g u e , C a tá lo g o de g e n e s im p ro n to s ). A u n q u e la s lo c a liz a c io n e s c e lu la re s d e ­
p e n d e n d e l s itio en q u e se e x p re s e u n ge n in d iv id u a l, c a b e s e ñ a la r q u e a lg u n o s g e n e s im ­
p ro n to s m u e s tra n e x p re s ió n m o n o a lé lic a en c ie rto s tip o s c e lu la re s , p e ro b ia lé lic a e n o tro s
(c u a d ro 1 0 -7 )

B. Exclusión alélica aleatoria (independiente d e l padre de origen)

E x c lu s ió n a lé lic a p o r L im ita d o a c ie rto s g e n e s lig a d o s a X s ó lo e n m u je re s . E x p re s ió n del a le lo de l c ro m o s o m a
in a c tiv a c ió n d e X X n o in a c tiv a d o s ó lo en la s c é lu la s en q u e s e e x p re s a n g e n e s (s e c c ió n 1 0 .5 .6 ).

E x c lu s ió n a lé lic a d e s p u é s de l E x p re s ió n d e l g e n d e in m u n o g lo b u lin a en lin fo c ito s B; e x p re s ió n de l g e n re c e p to r d e c é lu la

re o rd e n a m ie n to p ro g ra m a d o T en lin fo c ito s T (s e c c ió n 1 0 .6 .3 )
de l D N A

E x c lu s ió n a lé lic a p o r m e c a n is m o s G e n e s de l re c e p to r o lfa to rio en n e u ro n a s ; g e n e s de l re c e p to r de c é lu la N K, c ie rto s g e n e s

d e s c o n o c id o s d e in te rle u c in a (112, IL 4 )\ X IS T (en c é lu la s d e l e m b rió n fe m e n in o te m p ra n o ); PA X 5 (e n c é ­
lu la s B m a d u ra s y p ro g e n ito re s te m p ra n o s )

Recuadro 10-5. Falta de equivalencia de los genomas materno y paterno

Además de la diferencia obvia de los cromosomas del sexo X/Y, la falta de
equivalencia (no equivalencia) entre autosomas que se heredan en forma
paterna y materna y los cromosomas X está indicada por las observacio­
nes que se listan en seguida:
DIPLOIDÍA UNIPARENTAL INDUCIDA POR MEDIOS EXPERIMENTALES
EN RATONES
Es posible extraer el pronúcleo masculino de un oocito de ratón fecunda­
do y reemplazarlo por un segundo pronúcleo femenino a fin de generar un
ginogenote (en ocasiones denominado parlenoqenote todos los 38 cro­
mosomas son de origen materno). Si, por el contrario, el pronúcleo feme­
nino se reemplazara por un segundo pronúcleo masculino se formaría un
androgenote. A pesar de tener cromosomas diploides normales, estos
embriones no se desarrollan y mueren antes de mediados de la gestación.
Los ginogenotes muestran varias deficiencias en estructuras extraembrio-
narias pero un embrión hasta cierto punto normal; en contraste, en andro-
genotes el embrión está afectado con mayor gravedad que las estructuras
extraembrionarias (véase Bestor, 1998 para referencias).
DIPLOIDÍA UNIPARENTAL QUE OCURRE DE MANERA NATURAL
EN HUMANOS (véase también sección 2.5.4)
normal del otro. El fenotipo es diferente según el padre que contribuye al
genoma diploide.
DISOMÍA UNIPARENTAL (véase también sección 2.5.4)
Algunos conceptus tienen un cariotipo normal 46,XX o 46,XY pero es po­
sible que hayan heredado dos copias del mism o cromosoma de sólo uno
de los dos padres. El resultado pueden ser fenotipos anormales que difie­
ren según el origen parental del cromosoma importante. Por ejemplo, in­
dividuos 46,XX o 46,XY que heredan ambas copias del cromosoma 15 de
su padre desarrollan el síndrome de Angelman; si ambas copias del cro­
mosoma 15 son de herencia materna, producen el síndrome de Prader-
Willi (véase recuadro 16-6).
LAS MUTACIONES SUBCROMOSÓMICAS CAUSAN FENOTIPOS
ANORMALES DIFERENCIALES SEGÚN EL PADRE DE ORIGEN
► La deleción de ciertas regiones cromosómicas produce un fenotipo
diferente cuando ocurre en el cromosoma materno o paterno. El me­
jor ejemplo es la deleción de 15q12, que en el cromosoma paterno
produce síndrome de Prader-Willi y en el cromosoma materno causa
síndrome de Angelman (véase recuadro 16-6).

Los conceptus uniparentales humanos no son raros. Los conceptus an-
drogenéticos se desarrollan como molas hida tidilo rm es que consisten
en masas de vellosidades coriónicas y otras estructuras de la placenta hi­
drópicas, pero carecen de tejidos embrionarios. Los conceptus ginogené-
ticos originan quistes dermoides que se desarrollan hacia teratom as d e l
ovario, consistentes en una masa de tejidos adultos bien diferenciados
pero desorganizados que suele incluir huesos, diente, cartílago, piel y
otros tejidos pero casi siempre carece de cualquier estructura extraem-
brionaria.
Puede considerarse que los abortos triploides representan una combina­
ción de un genoma diploide heredado de un padre y un genoma haploide
► Ciertos caracteres humanos son autosóm icos dominantes pero
sólo se m anifiestan cuando se heredan de un padre. Aunque en al­
gunas fam ilias los tum ores glóm icos se heredan con carácter au-
tosóm ico dominante, sólo se expresan en personas que heredan el
gen de su padre. El síndrome de Beckwíth-W iedemann (MIM
130650) a veces es dominante pero sólo lo expresan quienes lo
heredan de su madre. Las figuras 4-5D y 4-5E muestran ejemplos
de genealogías.
► La pérdida de alelos en muchos cánceres (cap. 17) incluye de prefe­
rencia el alelo paterno.
 10.5 | CONTROL DE LARGO ALCANCE DE LA EXPRESIÓN Y LA IMPRONTA GÉNICAS
El mismo patrón de expresión monoalélica puede transmitirse con
fidelidad a las células hijas después de la división celular. Sin em­
bargo, como la secuencia nucleótida del alelo cuya expresión está
reprimida puede ser compatible con la expresión génica (y aun ser
idéntica a la del alelo expresado), éste es un fenómeno epigenético
y no genético.
Prevalencia y evolución de la impronta
La mayor parte de los genes humanos no está sujeta a impronta; de
otra manera no se verían tantos caracteres mendelianos simples. Se
realizaron encuestas sistemáticas a fin de identificar las regiones
cromosómicas improntas en el ratón. A diferencia de los humanos,
todos los cromosomas del ratón son acrocéntricos y es posible que
translocaciones robertsonianas permitan que ocurran cruzamientos
que producen descendencia con ambas copias de un cromosoma
particular derivado de un solo padre (disom ía uniparental, DUP;
sección 2.5.4). Esto revela que la DUP de ciertos cromosomas no
tiene efecto fenotípico; en otros produce fenotipos anormales. En
ocasiones los fenotipos anormales son complementarios para dife­
rentes orígenes parentales, por ejemplo, con frecuencia se observa
crecimiento excesivo en la DUP materna y retraso del crecimiento
en la DUP paterna. Para algunos cromosomas la DUP es letal.
La disección más amplia a nivel cromosómico y genético mues­
tra que la impronta es una propiedad de un número limitado de
genes individuales o de regiones cromosómicas pequeñas. Ahora
se sabe que casi 60 genes son improntos en humanos y ratones,
inclusive genes que especifican polipéptidos y genes codificadores
de RNA no codificante funcional (véase Tycko y Morrison,
2002). Las funciones fisiológicas conocidas de estos genes pueden
mostrar una variación considerable, pero las evidencias indican
que un número considerable de genes controla el crecimiento y
los caracteres neuroconductuales. Se conocen dos grupos mayores
de genes improntos en el genoma humano: una región de 1 Mb
en 11 p 15.5 (que comprende la región del síndrome de Beckwith-
Wiedeman) que contiene cuando menos ocho genes improntos
véase Maher y Reik, 2002), y un grupo de 2.2 Mb en la región
15ql 1-ql3 (que abarca las regiones de los síndromes de Prader-
Willi y Angelman) que alberga más de 10 genes improntos (Me­
suro y col., 2001; fig. 10-24).
La gran mayoría de los genes improntos conocidos es autosó-
mica. No obstante, el gen XIST que tiene una función importan­
te en el establecimiento de la inactivación del cromosoma X (véase
sícción siguiente) puede considerarse un ejemplo de un gen im­
pronto ligado a X ya que la expresión del alelo de herencia mater­
na se reprime de manera preferencial en el trofoblasto. Asimismo
ratrones diferenciales de conducta en el síndrome de Turner sugie­
ren un gen impronto ligado a X que afecta la función cognosciti­
va. Las niñas con síndrome de Turner carecen de un cromosoma Y
z-ero tienen sólo un cromosoma X. Si este último se hereda de la
madre, es usual una conducta social disruptiva; si se hereda del pa­
ire, la niña muestra una conducta más cercana a la normal (Sku-
i í y cois., 1997).
Se sabe que ocurre impronta en plantas de semillas, algunos in­
sectos y mamíferos. A juzgar por el fenotipo, no se observa un
erecto mayor de la impronta en algunos organismos modelo como
Drosophila, C. elegans y el pez cebra, aunque puede existir la posi­
303
bilidad de impronta en Drosophila. Los mamíferos son raros en la
forma en que los embriones dependen por completo del flujo de
nutrimentos de la placenta materna. Ya que en la regulación del
crecimiento fetal participan muchos genes improntos, una expli­
cación considera un conflicto del genoma parental: el genoma pa­
terno se propaga por sí mismo mejor mediante la creación de un
embrión que extrae de modo agresivo nutrimentos de la madre; el
genoma materno suprime lo anterior para proteger a la madre y
guardar ciertos recursos para la descendencia futura. Como se ob­
serva en los casos de diploidía uniparental (véase recuadro 10-5),
los genes paternos se expresan de preferencia en el trofoblasto y las
membranas extraembrionarias, en tanto que los genes maternos lo
hacen en el embrión.
10.5.5 El mecanismo de la impronta genómica no está
claro pero la metilación del DNA parece ser un
componente fundamental
Para confirmar la impronta de un gen es necesario identificar a un
individuo que es heterocigoto para una secuencia variable presente
en el mRNA maduro; a continuación el mRNA de diferentes teji­
dos puede controlarse para expresión monoalélica o bialélica y de­
terminarse el origen de cada alelo al tipificar a los padres. En ciertos
genes este tipo de análisis demostró que la impronta se limita sólo
a ciertos tejidos o algunas etapas del desarrollo (véase cuadro 10-7).
Por consiguiente la impronta permite un nivel extra de control de
la expresión génica, pero su funcionamiento no puede reducirse a
una historia uniforme simple.
Suele encontrarse que los genes improntos están organizados en
grupos génicos, que alojan elementos de control de la impronta,
elementos reguladores de acción cis que actúan en distancias largas.
Dentro de uno de estos grupos aislados es usual encontrar ciertos
genes que muestran expresión preferencial paterna en estrecha pro­
ximidad con otros que muestran expresión preferencial materna
(véase fig. 10-24 para ejemplos). Los elementos mayores de control
de la impronta están restringidos a regiones de DNA pequeñas que
se conocen como centros de impronta. En el caso de la región del
síndrome de Prader-Willi (PWS)/síndrome de Angelman (AS) en
15ql 1-ql 3 se definió un centro de improntación corriente arriba
del extremo 5' del gen SNURF-SNRPN y extendiéndose hacia el
mismo. Posee dos elementos de control de la impronta: el elemen­
to PWS-SRO en el promotor y el extremo 5’ de SNURF-SNRPN,
que tiene a su cargo el establecimiento y la conservación de la im­
pronta paterna, y el elemento ylS-SiíO localizado cerca de 35 kb
corriente arriba de SNURF-SNRPN, que se encarga de la impron­
ta materna (véase Perk y cois., 2002).
Asimismo los grupos génicos improntos suelen contener genes
que especifican RNA no traducido cuya expresión a menudo se co­
rrelaciona con represión de genes cercanos codificadores de poli­
péptidos. El grupo PWS/AS proporciona muchos ejemplos, pero se
conocen otros, como el gen H19 en 1 1p 15.5. Aunque las funcio­
nes de genes RNA improntos cercanos a genes improntos codifica­
dores de polipéptidos se desconocen de manera general, se espera
que sean reguladoras y se cuenta con evidencias directas cuando
menos en un caso: se demostró que el gen del ratón Air regula el
Igf2r impronto (gen receptor del factor II de crecimiento tipo in­
sulina; véase Rougeulle y Heard, 2002; Sleutels y col., 2002).
304 CAPÍTULO DIEZ EXPRESIÓN GÈNICA HUMANA

|| G e n R N A e x p re s a d o
¿y * p a te rn a m e n te
11 E xpresado patern am ente
II E xpresado m aternam ente
■ E xpresado M é lic a m e n te
■ ■ ■ £ . mu il iil ■ à II P W S -S R O
Cl I I A S -S R O
I____

A U n id a d d e tr a n s c r ip c ió n S N U R F -S N R P N e x te n d id a

£ é>
HBII-52 $
$
$

um L
li ni i nu 111— r
a a
UBE3A I
Cl

Fig. 10-24. Grupo del gen impronto en 15q11-q13 relacionado con el síndrome de Prader-Willi/síndrome de Angelman.

Las flechas muestran la dirección de la transcripción. Los genes improntos que codifican polipéptidos incluyen UBE3A y ATP10C, que se expresan de
manera preferencial del cromosoma 15 materno, y MKRN3, NDN y MAGEL2, que se expresan de manera preferencial del cromosoma 15 paterno. Ade­
más la unidad de transcripción compleja SNURF/SNRPN (> 148 exones; y se extiende más de 460 kb para superponerse en el gen UBE3A y quizás en
el gen ATP10C) es impronta. Codifica dos proteínas (la proteína SNURF, codificada por los exones 1 a 3, y la proteína espliceosómica SNRPN codificada
por los exones 4-10) así com o ciertos transcritos de RNA (no se muestran aquí, pero en la bibliografía se conocen com o IPW, PAR5, UBE3AS, etc.) y
puede regular los genes UBE3A y ATP10C como un regulador RNA antisentido. Aunado a esta complejidad se localiza un total de 79 secuencias snoRNA
dentro de los intrones de la unidad de transcripción SNURF/SNRPN, que comprende una copia de cada uno de HBII-436, HBII-13, HBII-437 (un probable
seudogén), dos copias idénticas pero separadas de HBII-438, 27 copias de HBII-85 y 47 copias de HBII-52 (se muestran como líneas verticales gran­
des comparadas con las líneas verticales pequeñas para los exones SNURF/SNRPN; véase Runte y cois., 2001). Casi todas estas copias (excepto HBII-
437) se expresan paternamente, en especial en el cerebro, y pueden tener un efecto directo en el síndrome de Prader-Wiíli (Gallagher y cois., 2002). Cl,
centro de improntación. Adaptado de Runte y cois. (2001) Hum. Mol. Genet. 10 (23): 2687-2700, con autorización de Oxford Universíty Press.

Las observaciones anteriores sugieren que debe disponerse de
algún mecanismo para diferenciar entre alelos heredados de la ma­
dre y el padre: conforme los cromosomas pasan a través de las lí­
neas germinales masculina y femenina deben adquirir cierta
impronta para señalar una diferencia entre alelos paternos y mater­
nos en el organismo en desarrollo. Un componente fundamental,
cuando menos para conservar el estado impronto, es la mediación
del DNA específica de alelo: todos los genes improntos se caracte­
rizan por regiones con abundancia de CG de metilación diferencial
y está demostrado que la impronta de varios genes improntos está
alterada en el ratón mutante deficiente en el gen de metiltransfera-
sa de citosina D nm tl, la principal metilasa de sostén.

Cuadro 10-7. Ejemplos de la regulación de tejidos y la etapa del desarrollo de genes improntos en mamíferos.
Gen A lelo reprim ido D iferen cias en los patrones de expresión

IGF2 (factor de crecimiento 2 similar a insulina) Materno Impronto en muchos tejidos pero expresión bialélica en cerebro, hígado
adulto, condrocitos, etcétera
PEG1/MEST Materno Impronto en el tejido fetal pero expresado de manera bialélica en sangre
de adultos

UBE3A (ligasa 3 de proteína ubíquitina) Paterno Impronto sólo en cerebro; expresado bialélícamente en otros tejidos

KvLOTl (canal de potasio) Paterno Impronto en varios tejidos pero expresado en forma bialélica en el corazón

WT1 (gen de tumor de Wilms) Paterno Con frecuencia impronto en células de placenta y cerebro pero expresión
bialélica en riñón
 10.5 CONTROL DE LARGO ALCANCE DE LA EXPRESIÓN Y LA IMPRONTA GÉNICAS 305

Se sabe que, intrigantemente, D nm tl tiene exones específicos
z t sexo (sección 10.4.2; fig. 10-20). En oocitos esto da lugar a un
producto proteínico truncado de terminal N específico de oocito,
q _ie podría metilar de manera específica los alelos maternos de ge­
nes como el receptor del factor II de crecimiento similar a insulina.
El exón de D nm tl específico de espermatocito interfiere con la tra­
ducción del mRNA de D nm tl y la forma en que podrían adquirir­
se los patrones de metilación específicos paternos es menos clara.
Cabría esperar que durante el desarrollo la impronta se heredara de
manera estable cuando menos durante muchas rondas de duplica­
ción del DNA (pero véase más adelante). Es claro que debe existir
también un mecanismo para borrar las improntas durante la línea
jerminal, que se requieren cuando, por ejemplo, un varón transmi­
te un alelo que heredó de su madre (véase fig. 10-25). Una forma
en que lo anterior podría lograrse es la desmetilación que ocurre en
ei embrión temprano y que deja las células germinales primordia­
les en esencia desmetiladas (véase fig. 10-19).
10.5.6 La inactivación del cromosoma X en mamíferos
comprende la represión de la expresión génica
de acción c/s de muy largo alcance
Naturaleza de la inactivación del cromosoma X
La inactivación del cromosoma X es un proceso que ocurre en to­
dos los mamíferos y resulta de la inactivación selectiva de alelos en
uno de los dos cromosomas X en mujeres (Lyon, 1999). Constitu-
ve un mecanismo de compensación de dosis que supera diferencias
de sexo en la relación esperada de la dosis de genes autosómicos (A)
con la dosis de genes del cromosoma X Los varones con un cro­
mosoma X tienen un alelo sólo para genes ligados a X y por tanto
son constitucionalm ente hem icigotos para los genes ligados a X En
consecuencia hay una diferencia de sexo en la relación de la dosis
génica A:X (2:1 en varones pero 1:1 en mujeres). Las relaciones de
dosis son importantes porque los productos de los genes ligados a
X deben interactuar con los productos de genes autosómicos en
una diversidad de vías metabólicas y del desarrollo importantes, y
las cantidades de producto para gen es sensibles a dosis fundamenta­
les están bajo regulación estrecha.
Para contrarrestar la diferencia de sexo en la dosis génica A:X, las
células de la mayor parte de los mamíferos femeninos experimentan
un ajuste compensador: uno de los dos cromosomas X parentales se
inactiva. La inactivación de X comprende la modificación de la es­
tructura de la cromatina que produce una estructura heterocromati-
nizada, condensada, el corpúsculo d e B arr (que puede verse a lo largo
de la parte inferior de la envoltura nuclear en células femeninas). Ca­
si todos los genes del cromosoma X inactivado están sometidos a al­
gún mecanismo que conduce a que se tornen transcripcionalmente
inactivos. Por consiguiente, mediante la inactivación de uno de los
dos cromosomas X parentales, los mamíferos hembra se convierten
en hem icigotos fu n cion ales para la mayor parte de los genes ligados a
X. No todos los genes se inactivan en el cromosoma X inactivado; los
pocos que escapan a la inactivación de X abarcan los que tienen un
homólogo funcional en el cromosoma Y y algunos genes en los que
la dosis génica no parece importante (véase sección 12.2.8 para ejem­
plos de genes que escapan a la inactivación de X).

Células somáticas ! Gametos;

específica de sexo

Fig. 10-25. La ¡mprontación genomica (gamétíca) requiere el borramiento de la impronta en la línea germinal.

El diagrama ilustra el destino de un cromosoma que lleva dos genes, A y B, que se someten a ¡mprontación: A está im pronto en la línea germinal feme­
nina, B lo está en la línea germinal masculina, como se indica con asteriscos. Como resultado, en células somáticas diploides A se impronta cuando se
presenta en un cromosoma heredado de la madre y B se impronta cuando se encuentra en un cromosoma heredado del padre. Un cromosoma indivi­
dual puede pasar a través de las líneas germinales masculina y femenina en generaciones sucesivas: un varón puede transm itir un cromosoma hereda­
do de su madre y una mujer, un cromosoma heredado de su padre, como lo indican los gametos en el dibujo de la derecha. Como resultado, debe
haber un mecanismo por el que la impronta antigua se borra de la línea germinal antes de establecer una nueva ¡mprontación específica de sexo.
306 CAPÍTULO DIEZ EXPRESIÓN GÉNICA HUMANA
Programación de la inactivación del cromosoma X
Aunque en etapas muy tempranas del desarrollo ambos cromoso­
mas X son activos, la inactivación de X inicia conforme las células
comienzan a diferenciarse de los linajes totipotente y pluripotente,
lo que ocurre en la etapa tardía de blástula en ratones y con mucha
probabilidad también en humanos. En cada célula que da lugar al
feto femenino se elige para la inactivación uno de los dos cromoso­
mas X parentales, pero la decisión para inactivar el cromosoma X
de herencia paterna (XP) o el X materno (Xm) suele ser aleatoria y
por consiguiente varía de célula a célula [nota: las células trofoblás-
ticas y los mamíferos marsupiales son distintos: el cromosoma XP
se inactiva de manera preferencial, un ejemplo de impronta restrin­
gida a tejido, y en individuos con una translocación X:autosoma el
resultado final es que el cromosoma X normal se inactiva en forma
consistente]. Es necesario borrar el patrón de inactivación de X de
generación en generación y se sabe que, quizá como parte de este
mecanismo, el cromosoma X se inactiva de modo pasajero tanto en
varones como en mujeres durante la gametogénesis.
Una vez que una célula progenitora en el embrión temprano se
comprometió a inactivar el cromosoma XP o el Xm, el patrón de
inactivación muestra herencia clonal: todos los descendientes de la
célula dentro del linaje celular resultante llevan el mismo patrón de
inactivación de X que la célula progenitora (véase fig. 10-26A). Es­
to significa que todos los mamíferos hembra son mosaicos y compren­
den mezclas de líneas celulares en las que se inactiva X paterno y
líneas celulares en las que se inactiva X heredado de la madre. El pa­
trón de color del pelaje en mosaico del gato calicó (fig. 10-26B)
ilustra lo anterior.
Mecanismo de inactivación del cromosoma X
El proceso de inactivación del cromosoma X es complejo y en el
inicio de la inactivación y en el mantenimiento de la misma parti­
cipan mecanismos moleculares precisos (véase Avner y Heard,
2001; Brockdorff, 2002). Dos elementos de acción cis importantes
se definieron en términos genéticos:
► el centro de inactivación de X (Xic), que controla el inicio y la
propagación de la inactivación de X. La presencia de Xic es
esencial para la inactivación de X: un cromosoma X que lleva
Xic puede experimentar inactivación, pero no uno que carece
del mismo. Xic también es importante para “contar” cromoso­
mas. En individuos raros con un número anormal de cromo­
somas X (45,X; 47,XXX; 47.XXY, etc.), un cromosoma X
permanece activo sin importar qué tantos de ellos existan. En
contraste, en individuos triploides cualquiera de los cromoso­
mas X o ambos permanece activo y los dos cromosomas X si­
guen activos en tetraploides. Cierto tipo de mecanismo de
conteo asegura que un cromosoma X permanezca activo por ca­
da dos grupos de autosomas. La función de Xic depende de un
XIST, un gen que especifica un RNA funcional no codificante
(véase más adelante), pero si bien XIST (Xist) es esencial para
iniciar la inactivación del cromosoma X, no se requiere para
conservar A estado de inactivación;
► el elemento de control de X (Xce), que afecta la elección del
cromosoma X que permanece activo y del inactivo. Es posible
que ocurra un sesgo de inactivación de X (del 50:50 normal de
X inactivo con el activo) en mujeres heterocigotas para alelos
Xce (es más probable que un cromosoma X con un alelo Xce
potente sea activo que uno con un alelo Xce débil). Xce es dis­
tinto de Xic y de XIST y de mapas teloméricos a ellos, pero la
base molecular aún no se aclara.
Después que el centro de inactivación de X se mapeó en Xql3 hu­
mano, análisis de esta región descubrieron un gen extraordinario:
XIST (llamado Xist en roedores). XIST muestra expresión monoa­
lélica y se expresa de manera única del cromosoma X inactivo. Su
transcrito primario experimenta empalme y poliadenilación para
generar un RNA no codificante maduro de 17 kb. Al parecer es la
principal señal para diseminar el estado de inactividad transcripcio­
nal a lo largo del cromosoma X del que se sintetiza, y de alguna ma­
nera la diseminación de este producto RNA limitada por cis actúa
para cubrir el cromosoma X inactivado en distancias muy largas. Se
piensa que el RNA incorpora después algunos factores proteínicos
que organizan la cromatina en una conformación de inactividad
transcripcional cerrada (Brockdorff, 2002).
Otro gen extraordinario, TSIX (llamado TsiX en roedores) tie­
ne una unidad de transcripción que se superpone en la totalidad del
gen XIST, pero en la cadena antisentido. Este gen compañero se ex­
presa en células madre embrionarias no diferenciadas y en embrio­
nes tempranos, y se propuso que controla la expresión de XIST en
cis al inicio de la inactivación de X (véase Avner y Heard, 2001;
Brockdorff, 2002).
10.6 Organización y expresión únicas
de genes de Ig y RCT
Como se muestra en la figura 9-10, los receptores de inmunoglo-
bulinas (Ig) y los receptores de célula T (RCT) son heterodímeros.
Las células humanas contienen tres genes de Ig: uno, IGH, especi­
fica la cadena pesada y dos, IGK e IGL, codifican cadenas ligeras
alternativas kappa ( k ) y lambda (\) respectivamente. Los cuatro ge­
nes de RCT humanos codifican, de manera respectiva, las cuatro
variedades diferentes de cadena del RCT: a y |3 que forman el he-
terodímero común a(3, más "y y 5 que forman el heterodímero más
raro 7 8 .
La organización y la expresión de estos siete genes difieren en
muchas formas de las de otros genes. Ello se debe a que cada per­
sona necesita producir un número enorme (del orden de unos 2.5
X 10 variedades diferentes) de Ig y RCT elaborados por linfocitos
B y T respectivamente. Estas células son los principales agentes del
sistem a inm unitario d e adaptación y necesitan reconocer una mi-
riada de antígenos extraños y en consecuencia ser capaces de mon­
tar una defensa contra un gran número de patógenos distintos. Sin
embargo, una célula B o T individual es monoespecífica: sólo pro­
duce un tipo de heterodímero Ig o RCT con un sitio de unión de an-
tígeno único y por tanto es específica para un antígeno particular. La
población de diferentes células B y T en cualquier individuo posibi­
lita la síntesis de tantos tipos diferentes de estas moléculas. Al pro­
porcionar un repertorio grande de Ig y RCT, las posibilidades de
ser capaz de reconocer y enlazar muchos tipos diferentes de antíge­
no extraño aumentan de modo considerable.
Los genes de Ig y RCT en la mayor parte de las células son inac­
tivos pero ocurre una mezcla extraordinaria de estos genes en célu­
las B y T respectivamente a fin de activarlos. Cuando esto sucede,
se crean nuevas combinaciones codificantes que permiten que un
 10.6 i ORGANIZACIÓN Y EXPRESIÓN ÚNICAS DE GENES DE IG Y RCT 30"

A) Espermatogonia Oogonia

Cigoto
te m pra no

/ \
/\ /\
/ \ / \ / \ / \

(J )
B la sto cisto La inactivación aleatoria
tardío de X materno o paterno en
<X> diferentes células da por
Ejemplo de X resultado mosalcismo
Ejemplo de X
paterno inactivado
materno inactivado

/ \ / \
/\ /\ / \ / \
/\/\/\/\ /\/\/\/\
Todas las células Todas las células
descendientes tienen X descendientes tienen X
paterno inactivado materno inactivado
(inactivación estable) (inactivación estable)

Fig. 10-26. Inactivación del cromosoma X en mamíferos.

A) Proceso de inactivación de X. Los dos cromosomas X son activos
B) en el cigoto femenino XX temprano, pero alrededor de la última etapa
del blastocisto se realiza una elección aleatoria en cada célula a fin de
inactivar X paterno o materno. La elección que toma una célula se pre­
serva en todos sus descendientes. Una mujer XX adulta tiene poblacio­
nes clónales de células con X paterno o materno inactivados. X
inactivo se reactiva en oocitos un tiempo antes de la meiosis. Durante
la espermatogénesis se inactivan en forma pasajera tanto el crom oso­
ma X como el Y. Adaptado de Migeon (1994) Trends Genet. 10, 230-
235, con autorización de Elsevier Trends Journals. B) Gato calicó
(iconcha de tortuga y blanco). Este gato (que siempre es hembra) tie­
ne un cromosoma X con un gen para el color del pelaje negro y otro
cromosoma X con un gen que especifica el color del pelaje naranja.
Resultan placas de pelambre de diferentes colores a causa de la inacti­
vación clonal de X. Las placas de pelambre blanco se deben a un gen
separado.

individuo aislado produzca una variedad extraordinaria de Ig y
RCT. En vertebrados se aplican cuatro mecanismos de mezclado de
DNA principales:
► recom binación d e VDJ o V], un m ecanism o disem inado. Las
regiones variables tanto de Ig como de RCT son especificadas
por dos o tres tipos de segmentos génicos, siempre un segmen­
to génico V (región variable) y uno J (región de unión), y en
algunos casos también un segmento génico D (región de diver­
sidad). Cada uno de estos segmentos génicos se encuentra en
múltiples copias en el DNA de la línea germinal (véase cuadro
10-8 y sección 10.6.1). Sin embargo, el DNA de células B y cé­
lulas T maduras experimenta recombinación de DNA específi­
ca de células de manera que lleva consigo una combinación
específica de un segmento V, D y J, o de un segmento de V V
308 CAPÍTULO DIEZ EXPRESIÓN GÉNICA HUMANA

J, que crean un exón VDJ o un exón V] respectivamente (véa­
se sección 10 .6 . 1);
► h ip e rm u ta c ió n s o m á tic a , u n m ecan ism o m a y o r en h u m a n o s y
ratones. Se presenta una diversidad adicional de Ig cuando se
introducen mutaciones de punto en la región V o en los exo-
nes VJ y VDJ debido a una reparación de DNA propensa a error;
► conversión g é n ic a , u n m ecan ism o m a y o r en conejos y pollo s. La
diversidad de Ig también puede resultar cuando tiras de se­
cuencia nucleótida se copian de segmentos de seudogen (Vi/j) co­
rriente arriba dentro de la secuencia de segmentos del gen V en
exones VJ y VDJ;
► re c o m b in a c ió n d e c a m b io d e clase, u n m ecan ism o d is e m in a d o .
Unidades de transcripción que consisten en varios exones espe­
cifican la región constante de las Ig. En las cadenas pesadas de
la Ig, varias unidades de transcripción distintas especifican las
distintas clases de cadena pesada, como C|x (IgM), C 8 (IgD),
C 7 (IgG), etc. Durante la maduración de las células B la re­
combinación intracromátide dentro del gen de cadena pesada
acerca tipos específicos de unidad de transcripción de región
constante a los exones VDJ (sección 10.6.2).
En fecha muy reciente se demostró que los acontecimientos de hiper­
mutación somática, conversión génica y recombinación de cambio
de clase (todos los cuales pueden ocurrir en una sola especie, aunque
algunos mecanismos prevalecen en forma particular en especies par­
ticulares) son controlados en su totalidad por un gen único que co­
difica desaminasa de desoxicitidina inducida por activación (AID;
véase Petersen-Mahrt y cois., 2002).
10.6.1 Reordenamientos del DNA en células B y T
generan exones específicos de células que
codifican regiones variables de Ig y de RCT
Los genes que codifican las tres cadenas de Ig (una cadena pesada y
dos tipos de cadena ligera) y las cuatro cadenas de RCT (a, (3, 7 y 8 )
se localizan en diferentes cromosomas y muestran una organización
extraordinaria. En cada caso la región variable es especificada por
dos o tres diferentes segmentos génicos que se encuentran en nume­
rosas copias distintas que se repiten de manera secuencial en el
DNA de la línea germinal (véase cuadro 10-8 y fig. 10-27). Los seg­
mentos génicos comprenden:
► segmentos de gen V (región variable). Los segmentos de gen
V codifican la mayor parte de la región variable;
► segmentos del gen J (región de unión). Los segmentos del gen
J codifican la reg ión de u n ió n , una parte pequeña en el extre­
mo terminal C de la región variable;
► segmentos del gen D (región de diversidad). Los segmentos del
gen D codifican una región d e d iv e rs id a d pequeña cerca de los
extremos terminal C de la región variable de las cadenas pesa­
das de Ig, las cadenas (3 de RCT y las cadenas 8 de RCT.
El reordenamiento único de los segmentos génicos en los grupos de
genes de Ig y RCT indica la forma muy poco usual en que los lin-
focitos B y T se someten a recombinaciones somáticas a fin de ac­
tivar genes de Ig o RCT antes no funcionales y a continuación
expresar productos funcionales de ellos. Efectúan lo anterior reu­
niendo combinaciones específicas de segmentos génicos V + D +
J (en el caso de los genes que codifican la cadena pesada Ig, (JRCT
y 8 RCT) o de segmentos génicos V + J (en los otros cuatro genes).
Una vez que se ensamblan, las unidades V + J o V + D + Js e
comportan como exones funcionales (véase más adelante). Para cada
uno de los siete genes, la elección entre los múltiples segmentos gén i­
cos V, (D) o J que se juntan, varía d e linfocito en linfocito y por con­
siguiente los exones VJ y los exones VDJ recién creados son
específicos de célula (véase fig. 10-28). Como resultado, las células B
y T individuales producen diferentes Ig y RCT. En consecuencia,
en un sentido, cada individuo es un mosaico con respecto a la or­
ganización de los genes de Ig y RCT en linfocitos B y T, e inclusive
los gem elos idénticos diferirán genéticam ente.
Una vez que un exón VDJ o VJ se ensambla, se crea un gen fun­
cional Ig o RCT. A continuación el nuevo exón VDJ o VJ propor­
cionará el primer exón para este gen y los exones en la cercanía de
la unidad de transcripción C aportarán los exones corriente abajo.
En el caso del gen de cadena pesada de la Ig hay varias unidades de

Cuadro 10-8. Genes humanos de Ig y RCT.

Número de segmentos génicos V, D, J
Gen Localización V D J Número de unidades de transcripción C

IGH 14q32.3 123-19a 27 9 11

IGK 2p12 76 0 5 1

IGL 22q11 70-71a 0 7 -1 1a 7-11

TRA 14q11.2 4 9 (+ 5 )b 0 61 1

TRB 7q34 64-67a 2 14 2

TRG 7p15-p14 12-15a 0 5 2

TRD 14q11.2 1 (+ 5 )b 3 4 1

Nota: los números incluyen secuencias no funcionales (seudogen); véase la figura 10-27 para un ejemplo del gen IGH.
aEI número varía en diferentes haplotipos. bClnco segmentos del gen V se comparten entre los genes TRA y TRD vecinos. Para representaciones pictóricas véanse los
nombres del gen Individual en diversas bases de datos como Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology en www.intoblogen.fr/services/chromcancer/
Genes/Genellste.html
 10.6 ORGANIZACIÓN Y EXPRESIÓN ÚNICAS DE GENES DE IG Y RCT 309

Región V Región DJC

900 kb 350 kb

TEL CEN
*
í>
'C^Cs C^C y, ^^1^2 C74 CE c a2

123 a 129 segmentos VH 26 9 segm entos J H I 11 segm entos C H

(casi todos son no funcionales, segm entos + 1 D,H
pero se sabe que hasta 46 son funcionales) Du

Fig. 10-27. Múltiples segmentos génicos en el gen de cadena pesada de la Ig, IGH, en 14q32.

El gen se extiende 1 250 kb del extremo telom érico de 14q32.3 (izquierda) al extremo centromérico (derecha). Hay 123 a 129 segmentos génicos VH
(dependientes del haplotipo), de los que se sabe que casi todos son segmentos seudogénicos no funcionales, 27 segmentos génicos DH, nueve seg­
mentos génicos JH y 11 unidades de transcripción C (cada una de las cuales contiene varios exones). Para mayores detalles véase http://www.¡nfoblo-
gen.fr/services/chromcancer/Genes/lgHID40.html

transcripción C funcionales diferentes con propiedades biológicas
distintas. Sin embargo, al principio el empalme incluye el exón
VDJ y los exones de las unidades de transcripción Cp y C8 veci­
nas, y el empalme alternativo puede resultar en síntesis de la ca­
dena p, o 8 que se incorpora en las inmunoglobulinas IgM e IgD
(fig. 10-28). No obstante, conforme la célula C madura, recombi­
naciones somáticas subsecuentes originan la unión del exón VDJ
ensamblado con anterioridad a diferentes unidades de transcrip­
ción C a fin de producir cadenas pesadas y , a o e para incorpo­
rarse en IgG, IgA o IgE (cambio d e clase d e cadena pesada; véase
texto; fig. 10-29).
Los mecanismos genéticos que conducen a la producción de
exones VJ y VDJ funcionales suelen incluir deleciones a gran esca­
la de las secuencias que separan los segmentos génicos selecciona­
dos (muy probablemente por recombinación intracromátide en
una forma muy similar a la que se indica en la figura 10-29B) y en
algunos casos inversiones de la secuencia intermedia. Secuencias de
señal de recombinación conservadas flanquean los extremos 3' de
cada segmento V y J y los extremos 5' y 3' de cada segmento del
gen D. Permiten la unión de V a J, o D a J seguida por V a DJ pe­
ro nunca V a V o D a D, etcétera.
Los fenómenos de recombinación son dirigidos por una recom-
binasa V(D)J, un complejo que contiene dos proteínas específicas de
linfocitos RAG1 y RAG2, así como enzimas que ayudan a reparar el
DNA dañado en todas las células. RAG1 y RAG2 hacen roturas de
doble cadena en las secuencias de la señal de recombinación, y las ro­
turas se reparan juntando segmentos génicos V, D y J apropiados en
tanto se excluyen secuencias intermedias. Aunque por lo general la
recombinación específica de sitio es precisa, la recombinación que
ocurre en los genes de Ig y RCT en las células B y T, de manera res­
pectiva, no es precisa deliberadamente. En lugar de ello suele perder­
se un número variable de nucleótidos de los extremos de los
segmentos génicos recombinantes y también pueden insertarse uno
o más nucleótidos elegidos de manera aleatoria, lo que crea diversi­
ficación de unión. Esto incrementa muchísimo la diversidad de se­
cuencias de codificación de región variable.
10.6.2 El cambio de clase de cadena pesada comprende
la unión de un exón VDJ aislado a unidades de
transcripción de región constante alternativas
Aunque una célula B sólo produce un tipo de molécula Ig, la clase
(o isotipo) de la cadena pesada puede cambiar durante el desarro­
llo: dentro de un linaje aislado, los descendientes de una célula ori­
ginal pueden producir una Ig con el mismo sitio de unión de
antígeno que antes pero utilizando una clase diferente de cadena
pesada (cambio de clase o cam bio d e isotipo). Este cambio incluye
la unión diferencial del mismo exón VDJ que se enlazó por dos re­
combinaciones somáticas sucesivas (véase fig. 10-28) a unidades de
transcripción de región constante alternativas.
El cambio de clase abarca una recombinación intracromátide
cuyo resultado es la unión de un exón VDJ a una unidad de trans­
cripción de región constante más distal (unión VDJ-C). Incluye la
progresión siguiente:
► a) síntesis in icia l d e IgM sólo p o r células B vírgen es inm adu ­
ras. Esto ocurre temprano en el desarrollo de la célula B por­
que el empalme de RNA une la secuencia transcrita del exón
VDJ y los exones de la unidad de transcripción Cp vecina (fig.
10-29A);
► b) síntesis p osterior tanto d e IgM com o d e IgD p o r células B
vírgenes maduras. Más adelante en el desarrollo de la célula B,
pero en una etapa en que estas células aún son inm unológica-
m en te vírgen es (es decir, aún rio se expusieron a un antígeno
extraño), ocurre un cambio de clase parcial y las células B pro­
ducen ahora tanto IgD como IgM. Ello ocurre porque ahora el
empalme alternativo de RNA adicional también puede juntar
la secuencia transcrita del exón VDJ y los exones de la unidad
de transcripción C8 vecina (fig. 10-29A). Casi toda la produc­
ción de IgM e IgD está dedicada a elaborar receptores de unión
de membrana, pero la exposición a antígeno extraño estimula­
rá la secreción de anticuerpo IgM soluble en una respuesta in-
munitaria primaria débil;
310 CAPÍTULO DIEZ EXPRESIÓN GENICA HUMANA

Cadena pesada

Vi V2 V3 V4 V„ D., D 2 D 3 D . D„ Ji J 2 J 3 J 4 J„ C , Cg C y3 C y, Ca
DNA -

Unión D-J
i
Vi V2 V3 V4 Vn D ,D 2 D3J2J3 J4 J„ CL1 C5 Oß C., Ca2
DNA
Unión V-D-J
1
Vi
*1 VoDo
» 2 , j 3 jJo2 C5 Cy3 Cy, Ca2
DNA
'^ . ''- ''E m p a l m e de RNA
mRNA
! ] Traducción
I_I
Polipéptido V IC

Fig. 10-28. Recombinación de VDJ específico de células como preludio para la elaboración de una cadena pesada de Ig.

Dos recombinaciones somáticas secuenciales producen la primera unión D-J y luego un exón maduro VDJ. En este ejemplo, el segundo de 129 seg­
mentos V diferentes (V2) se fusiona con el tercer segmento de la reglón D (D3) y el segundo segmento de la región J (J2) para producir un exón V2D3J2
funcional, pero como la elección es específica de la célula, un llnfocito B vecino puede tener, por ejemplo, un exón V ^ D ^ J , funcional. Una vez que el
exón VDJ se ensambla, el gen puede transcribirse utilizando el exón VDJ com o primer exón, con los exones subsecuentes provistos por las unidades de
transcripción C más cercanas. A fin de iniciarlo, las unidades de transcripción ( V y C8 están más cercanas y los primeros tipos de cadena pesada Ig
que se elaboran son la cadena |x y después m- más 5, las cadenas pesadas características de IgM e IgD respectivamente. Sin embargo, conforme la cé­
lula B madura, recombinaclones somáticas subsecuentes ocasionan la unión del exón VDJ ensamblado con anterioridad a diferentes unidades de trans­
cripción C (cam bio de clase de cadena pesada, véase el texto y la fig. 10-29).

► c) síntesis ¿le IgG, IgE o IgA p o r células B maduras. Tras la ex­
posición a antígenos extraños, las células B desarrollan procesos
para refinar la afinidad de unión de Ig (maduración de afinidad)
de manera que puedan responder con mayor efectividad a un
antígeno extraño en una ocasión futura (cuando serán capaces de
secretar grandes cantidades de anticuerpo soluble con una afini­
dad muy alta por el antígeno extraño en una respuesta de inmu-
nitaria secundaria potente). Fenómenos de hipermutación
somática/conversión génica, etc. apoyan la maduración de afini­
dad. En la clase de célula B madura el cambio ahora ocurre por
un mecanismo diferente e incluye un fenómeno de recombina­
ción que permite la unión a nivel del DNA del mismo exón VDJ
a cualquiera de las unidades de transcripción Oy, Ce o C a. El
mecanismo abarca deleción de la secuencia intermedia median­
te recombinación intracromátide (fig. 10-29B). Las moléculas Ig
secretadas por células B maduras pueden enlazarse a diferentes
tipos de células que tienen receptores especializados para la por­
ción de la cola (Fe) del anticuerpo soluble. Estos receptores Fe
enlazan de manera selectiva diferentes tipos de Ig:
* IgG: además de activar el sistema de complemento, la IgG
puede ser enlazada específicamente por receptores Fe en
m acrófagos y neutrófilos, células fagocíticas potentes;
• IgA: un tipo de receptor Fe único para el epitelio secretorio
transporta anticuerpos IgA de modo que constituyen la
principal clase de anticuerpo en las secreciones, inclusive sa­
liva, lágrimas, leche y secreciones respiratorias e intestinales;
• IgE: receptores Fe en células cebadas y basófilos unen IgE
con afinidad muy alta. Las moléculas IgE unidas funcio­
nan después como receptores de antígenos adquiridos en
forma pasiva. El enlace subsecuente de antígeno estimula­
rá la células cebadas o los basófilos para que secreten una
diversidad de citocinas e histamina. Además las células ce­
badas secretarán factores que atraen y activan eosinófilos
que también tienen receptores Fe que unen moléculas IgE
y pueden destruir varios tipos de parásitos.
10.6.3 La monoespecificidad de las Ig y los RCT se debe
a exclusión alélica y de cadena ligera
Las células humanas poseen tres genes de Ig funcionales (IGH que
codifica la cadena pesada y dos genes, IG K e IGL, que codifican las
cadenas ligeras kappa y lambda intercambiables en términos fun­
cionales), y puesto que esto ocurre tanto en homólogos materno
como paterno, seis genes están potencialmente disponibles para
elaborar cadenas de Ig. Sin embargo, una célula B individual es
monoespecífica: sólo produce un tipo de molécula Ig con un tipo
aislado de cadena pesada y un tipo único de cadena ligera. Ello se
debe a dos razones:
 10.6 ORGANIZACIÓN Y EXPRESIÓN ÚNICAS DE GENES DE IG Y RCT 311

Y ¥
A) VDJ C u C s DNA de células

Transcritos
i B tempranas

primarios de ^ .
célula B 4
tempranos
Empalmado
alternativamente
para dar mRNA
I* o 5 — IgM o IgD

Cambio
de clase
(en este
Corte y reunión caso a
de cadenas diferentes
IgG)

VDJ e .« C.^4 CE C, DNA de células B maduras

que producen IgG

Transcritos primarios
de célula B madura

Empalmado para
dar 7 m RNA—►IgG

Fig. 10-29. El cambio de clase de la cadena pesada de la Ig es mediado por recombinación intracromátide.
A) Cambio tem prano (parcial) a IgD. La clase de cadena pesada inicial es IgM porque el empalme de RNA junta las secuencias transcritas del exón
VDJ y los exones de la unidad de transcripción C/x vecina. Sin embargo, a medida que las células B vírgenes maduran, el empalme alternativo de RNA
une las secuencias del exón VDJ y los exones de la unidad de transcripción C8, y conduce a la producción adicional de IgD. B) Cam bio tardío a IgA,
IgG e IgE. En este caso el cambio de clase ocurre por recombinación intracromátide, en la que el mismo exón VDJ es llevado cerca de las unidades de
transcripción de región constante inicialmente más distales: una unidad de transcripción Ca, C-y (como se ilustra aquí) o una unidad de transcripción
Ce. La nueva combinación VDJ-C se expresa para dar IgA, IgG o IgE.

► exclusión alélica. Puede sintetizarse una cadena ligera o una ca­
dena pesada a partir de un cromosoma materno o un cromoso­
ma paterno en cualquier célula B, pero no d e ambos homólogos
parentales. Como resultado, hay expresión m onoalélica en el lo-
cus del gen de cadena pesada en células B. Este fenómeno se
aplica también a grupos de genes de RCT;
► exclusión de cadena ligera. Una cadena ligera que se sintetiza
en una célula B aislada puede ser una cadena K o una cadena
\, pero nunca ambas. Como resultado de este requerimiento
aunado al de la exclusión alélica, hay una expresión monoalé­
lica en uno de los dos grupos génicos de cadena ligera funcio­
nales y no hay expresión en el otro.
Al parecer la decisión respecto a cuál de los dos alelos de cadena pesa­
da debe utilizarse para formar una cadena pesada y cuál de los cuatro
posibles genes de cadena ligera se empleará para formar una cadena li­
gera es aleatoria. Es muy probable que, en cada precursor de célula B,
se intenten reordenamientos de DNA productivos en todos los seis ge­
nes de Ig pero es factible que las posibilidades de ordenamientos pro­
ductivos en más de un gen de cadena ligera o más de un gen de cadena
pesada no sean altas. Sin embargo, al parecer hay cierto tipo de regu­
lación p o r retroalim entación negativa adicional; un reordenamiento
funcional en uno de los alelos de cadena pesada suprime los reordena­
mientos que ocurren en el otro alelo y un reordenamiento funcional
en cualquiera de los cuatro genes capaces de codificar una cadena li­
gera suprime los reordenamientos que ocurren en los otros tres.
CAPÍTULO ONCE

Inestabilidad del genoma humano:

mutación y reparación del DNA

Contenido del capítulo

11.1 Generalidades de mutación, polimorfismo y reparación del DNA
11.2 Mutaciones simples
11.3 Mecanismos genéticos que producen intercambios de secuencias
entre repeticiones
11.4 Mutaciones patógenas
11.5 Potencial patógeno de secuencias repetidas
11.6 Reparación del DNA

Recuadro 11-1 Clases de polimorfismo genético y variación de secuencias

Recuadro 11-2 Mecanismos que afectan la frecuencia de alelos en la población
Recuadro 11-3 Clases de sustitución de una base en el DNA que codifica polipéptidos
Recuadro 11-4 Diferencias de sexo en la tasa de mutación y el problema de la evolución
impulsada por varones
316 CAPÍTULO ONCE INESTABILIDAD DEL GENOMA HUMANO: MUTACIÓN Y REPARACIÓN DEL DNA
11.1 Generalidades de mutación, polimorfismo
y reparación del DNA
Como en otros genomas, el DNA del genoma humano no es una
entidad estática. Por el contrario, está sujeto a una variedad de cam­
bios hereditarios (mutación). Las anormalidades cromosómicas a
gran escala incluyen pérdida o ganancia de cromosomas o rotura y
nueva unión de cromátides (véase sección 2.5). Las mutaciones a
menor escala pueden agruparse en diferentes clases según el efecto
en la secuencia del DNA en la forma siguiente:
► sustituciones de bases: incluyen el reemplazo de por lo gene­
ral una base; en casos raros se reemplazan al mismo tiempo va­
rias bases agrupadas como resultado de una forma de
conversión génica (sección 11.3.3);
► deleciones: se eliminan uno o más nucleótidos de una secuencia;
► inserciones: se insertan uno o más nucleótidos en una secuencia.
Las mutaciones también pueden clasificarse con base en si com­
prenden una secuencia de DNA aislada (m utaciones simples; sección
11.2) o el intercambio entre dos secuencias alélicas o no alélicas
(sección 11.3). Cada una de las tres clases de mutación indicadas
pueden originarse por mutaciones simples o intercambios de se­
cuencias.
Surgen nuevas mutaciones en individuos aislados, sea en células
somáticas o en la línea germinal (sección 3.1.3). Si una mutación
en la línea germinal no deteriora de manera importante la capaci­
dad de un individuo para tener descendencia que transmita la mu­
tación, puede diseminarse a otros miembros de una población
(sexual). Por tradición la variación de la secuencia alélica suele des­
cribirse como un polimorfismo de DNA si más de una variante
(alelo) en un locus se observa en una población humana con una
frecuencia mayor de 0.01 (que es más alta de la que podría conser­
varse sólo por mutación recurrente). Sin embargo, existe una diver­
sidad de tipos de polimorfismo que varían desde cambios de
nucleótidos únicos a modificaciones a muy gran escala (recuadro
11- 1) .
En el DNA genómico humano la heterocigosidad media
(también denominada d iv ersid a d p r o m ed io d e n u cleó tid os) es del
orden de 0.08%; alrededor de 1 de cada 1 250 bases difiere en pro­
medio entre las secuencias alélicas. Esta cifra se estimó al inicio
promediando datos de un número limitado de estudios de secuen-
ciación de un locus (véase Przeworski y cois., 2000). Los valores de
heterocigosidad varían mucho en diferentes locus y ciertos genes
son excepcionalmente polimórficos, en especial algunos genes HLA
(véase fig. 12-29), pero el análisis de grupos de datos de polimor­
fismos de nucleótido único (PNU) humano global disponible en
fecha reciente confirma el valor medio de heterocigosidad de
0.08% (Reich y cois., 2002). No obstante, como los índices de mu­
tación son comparativamente bajos, la inmensa mayoría de las di­
ferencias entre secuencias alélicas dentro de un individuo es
hereditaria en lugar de resultado de mutaciones nuevas.
Aunque las mutaciones son el combustible crudo que impul­
sa la evolución, también pueden ser patógenas (secciones 11.4,
11.5). Es posible que sean la causa directa de una anormalidad
fenotípica o que ocasionen un incremento en la susceptibilidad
a una enfermedad. En consecuencia el valor casi siempre bajo de
las mutaciones puede considerarse como un equilibrio entre per­
mitir la novedad evolutiva ocasional a expensas de causar enfer­
medad o muerte en una proporción de los miembros de una
especie.
Con frecuencia las mutaciones surgen como errores de copiado
durante la replicación del DNA. Aunque la fidelidad de la replica-
ción del DNA in vivo es muy alta en condiciones normales, incor­
poraciones erróneas ocurren a una frecuencia baja y dependen de
las energías libres relativas del pareamiento de bases correcto e in­
correcto. Cambios muy pequeños en la geometría de la hélice pue­
den estabilizar pares de bases G-T (con dos enlaces de hidrógeno;
cabe señalar la ocurrencia frecu en te d el paream iento d e bases G-U en
e l RNA; véase fig. 1-7B). A fin de reducir el índice de error de in­
corporación errónea, muchas polimerasas de DNA contienen una
exonucleasa integral que puede desempeñar una a ctiv id a d
d e lectu ra d e p r u eb a s (véase cuadro 1-2). Cuando una base inco­
rrecta se inserta durante la síntesis de DNA, esta última no puede
proceder. En lugar de ello la actividad de exonucleasa 3 ,_>5' elimi­
na un nucleótido a la vez de la terminal hidroxilo 3' hasta obtener
una terminal con un pareamiento de bases correcto, lo que permi­
te que la síntesis de DNA prosiga de nuevo. Sin embargo, aun en­
tonces el tamaño del genoma humano origina demandas enormes
en la fidelidad de cualquier polimerasa de DNA: una secuencia de
seis mil millones de nucleótidos necesita replicarse con precisión
cada ocasión aislada en que célula humana se divide.
El DNA también está sujeto a un ataque químico espontáneo
importante en la célula y al daño causado por la exposición a radia­
ción ionizante natural y a metabolitos reactivos. Por tanto, con ob­
jeto de reducir al mínimo el índice de mutaciones, es necesario
contar con sistemas de rep a ra ción d e l DNA eficaces que identifi­
quen y corrijan muchas anormalidades en la secuencia del DNA
(sección 11.6). Además los errores que surgen en la secuencia del
mRNA durante la expresión génica se someten a mecanismos de
vigila n cia d e l RNA que aseguran la eliminación de los mRNA que
tienen codones de terminación inapropiados (sección 11.4.4).
11.2 M utaciones sim ples
11.2.1 Las mutaciones que se deben a errores
en la replicación y la reparación del DNA
son frecuentes
La exposición a una variedad de mutágenos que se encuentran en su
ambiente externo o que se generan en el medio intracelular puede
inducir mutaciones en el DNA de una persona. Por ejemplo, Du-
brova y colaboradores (1996, 2002) publicaron que en la mutación
inducida por radiación la tasa normal de mutación de la línea ger­
minal para locus minisatélite hipervariables se duplicó como conse­
cuencia de la exposición intensa a la lluvia radiactiva del accidente
de Chernobyl. Sin embargo, en circunstancias normales la mayor
fuente de mutaciones es con mucho la mutación endógena, que in­
cluye errores espontáneos en la replicación y la reparación del DNA.
Es posible estimar que durante un tiempo de vida humana prome­
dio se llevan a cabo divisiones celulares del orden de 1017: son necesa­
rias alrededor de 2 X 10 11 divisiones para generar las cerca de 1014
células del adulto y mitosis adicionales para permitir la renovación ce­
lular en ciertos tipos de células, en especial las epiteliales (véase Cairns,
1975). Ya que cada división celular requiere la incorporación de
6 X 10 "1nuevos nucleótidos, la replicación del DNA sin errores en un
tiempo de vida promedio demandaría un proceso de reparación de la
replicación del DNA cuya precisión fuera lo suficientemente conside­
rable para que el nucleótido correcto se insertara en la cadena de DNA
en crecimiento en cada una de las cerca de 6 X 1026 ocasiones.

R ecuadro 11-1. C lases de polimorfismo genético y variación de secuencias
Las diferencias en los fenotipos individuales se deben en gran parte a
variación genética y se conoce una diversidad de tipos de polim orfism os
genéticos y de variación de secuencias a gran escala. Sin embargo, por
ultimo el efecto en el fenotipo se expresa a nivel de proteínas o del RNA.
Los cambios en el DNA que codifica polipéptidos pueden dar lugar a cam ­
bios de aminoácidos que causan polimorfismos de proteínas Además
de los polim orfism os de DNA y de las proteínas que se estudiaron durante
muchos años existen diferencias cuantitativas mal comprendidas en la
expresión a nivel del transcrito. La variación de expresión de genes
humanos afólleos puede deberse a cambios en el DNA regulador, que
incluyen secuencias que gobiernan la transcripción y el empalme. Este
tipo de variación de secuencias puede sustentar la susceptibilidad a
enfermedades frecuentes pero sólo hasta fecha reciente se desarrollaron
métodos cuantitativos para valorar la variación alélica en la expresión
génica humana (Yan y cois., 2002). A continuación se describen las
clases usuales de polimorfismos de DNA y la variación de secuencias a
gran escala.
Polimorfismo de nucleótido único (PNU)
Como lo sugiere el nombre, incluye un nucleótido aislado. En la mayor
parte de los PNU se sustituye sólo un nucleótido por un nucleótido dife­
rente (sustitución de nucleótido), pero el término incluye también cam­
bios que com prenden inserciones o flgleciones de nucleótidos
(polimorfismos indel simples). Por lo general los PNU sólo tienen dos
alelos. Algunos PNU producen cambios en los sitios de restricción {po­
limorfismo de sitio de restricción, sección 7.1.3). Ya que el DNA de
codificación sólo constituye alrededor de 1.5% del genoma humano, ca­
si todos los PNU se encuentran en DNA no codificante, com o secuen­
cias dentro de intrones e intergénicas. No obstante, la localización
cromosómica de los PNU está muy lejos de ser uniforme: a menudo las
regiones crom osóm icas grandes con muy pocos PNU se encuentran ad­
yacentes a regiones grandes que contienen muchos PNU (véase sección
11.2.6). Para la tipificación de los PNU, véase la sección 7.1.3.
Polimorfismo simple de número variable de repetición tándem (NVRT)
Polimorfismo NVRT suele describir alelos en locus que contienen tiras
repetidas en forma tándem de una secuencia simple. Abarca las clases:
microsatélites = polimorfismo RSS (repetición de secuencia simple)
en los que la secuencia simple es de uno a varios nucleótidos de largo y
la longitud del arreglo varía de menos de 10 a más de 100 nucleótidos, y
polimorfismo minisatélite de DNA que incluye arreglos que con fre­
cuencia abarcan cientos de nucleótidos y consisten en repeticiones tán­
dem de una secuencia entre nueve y varias decenas de nucleótidos de
largo. Los locus NVRT suelen tener múltiples alelos y algunos minisatélite
hipervariables muestran una variación extraordinaria (p. ej., el locus
MS32 tiene un valor de heterocigosidad de 0.975).
Ambos tipos de polim orfism o se encuentran muy rara vez en DNA que
codifica polipéptidos. Las excepciones comprenden los polimorfismos
RSS sin cambio de marco, muy raros, y el polim orfism o minisatélite que
se expresa en contadas ocasiones, por ejemplo, se sabe que el locus
MUC1 en 1q21 codifica una glucoproteína altamente polimórfica que se
halla en varios tejidos epiteliales y líquidos corporales como resultado de
una variación extensa de repeticiones codificadas por minisatél'rtes
(Swallow y cois., 1987). Además algunos de estos polim orfism os pueden
localizarse muy cerca de genes y afectar su expresión. Un ejemplo notable
es el NVRT INS, un minisatélite polim órfico ubicado 596 pb corriente
Conservar este nivel de fidelidad de replicacíón del DNA resulta
imposible; de hecho la fidelidad de la replicación de polimerasas de
DNA observada es mucho menor que ésta y ocurren errores de repli­
cación no corregidos con una frecuencia cercana a 10 9 a 10 11 por
11.2 MUTACIONES SIMPLES 317
arriba del sitio de inicio de traducción del gen de insulina que consiste en
un número variable de repeticiones tándem basadas en la secuencia con­
senso ACAGGGGTGTGGGG. Al parecer diferentes alelos confieren una
susceptibilidad diferencial a la diabetes tipo I, tal vez por los efectos difer­
enciales en la expresión del gen de insulina (sección 15.6.4.)
Polimorfismo de repetición de transposón
Casi 45% del genoma humano está compuesto por repeticiones basadas
en transposón (sección 9.5.1). La inmensa mayoria ya no es activa, pero
algunos transposones LINE1, Alu y basados en LTR aún tienen actividad
de transposón. Como resultado de las transposiciones evolutivas
recientes, algunos locus son polim órficos. Por ejemplo, muchos miem­
bros de las subfamilias Alu Vb9, Yc1 y Yc2 se insertaron en el genoma
humano en fecha tan cercana que alrededor de un tercio de los elemen­
tos analizados es polim órfico para la presencia/ausencia de la repetición
Alu en diversas poblaciones humanas (Roy-Engel y cois., 2001).
Polimorfismo de número variable de repetición tándem (NVRT) a gran
escala
Las repeticiones tándem a gran escala son propensas a variación en el
número de coplas com o resultado de cruzamiento desigual o intercam­
bios desiguales de cromátides hermanas que producen un tipo de
polim orfism o de NVRT a gran escala. Los ejemplos incluyen repeticiones
satélite alfa en centrómeros y varios genes RNA de repetición tándem
como los genes rRNA y los snRNA U2 en el locus RNU2 en 17q21-q22
(de seis a más de 30 repeticiones de unidades de 6.1 kb casi idénticas).
Algunos grupos génicos que codifican polipéptidos comprenden repeti­
ciones tándem grandes que son propensas a este tipo de polim orfism o,
por ejemplo, el grupo de 21-hidroxilasa/complemento C4 (sección
11.5.3).
Polimorfismo de inversión
La secuenciación de la porción eucromática del genoma humano reveló
muchos ejemplos de secuencias con números de copias bajos a moder­
ados con homología secuencial muy alta (> 95 % ) entre las secuencias
relacionadas. En algunas repeticiones con número de copias bajo, la
homología secuencial muy alta se extiende decenas de cientos de kb
com o resultado de duplicación segmentaria (específica de primates)
evolutivamente reciente; véase sección 12.2.5. Estas secuencias pueden
predisponer a recombínación desigual y producir translocaciones y dele-
cíones, duplicaciones e inversiones a gran escala. Aunque las deleciones
y algunas duplicaciones suelen acompañarse de enfermedad y por lo
general se extienden a intervalos megabase (pero subcitogenétícas), tam ­
bién pueden ocurrir polim orfism os de inversión a gran escala que no con­
tribuyen en form a directa a enfermedades (sección 11.5.5).
Polimorfismos cromosómicos y variantes secuenciales a gran escala
Algunos polim orfism os comprenden cambios muy grandes del DNA no
codificante de manera que es posible distinguir los alelos mediante análi­
sis citogenéticos tradicionales. A menudo el bandeo C (que identifica het-
erocromatina, véase recuadro 2-2) revela variación del tamaño para
bloques específicos de heterocromatina com o se observa en los crom o­
somas 9 ,1 6 y Y. En la población normal con frecuencia se encuentra una
inversión pericentromérica grande en el cromosoma 9. Las inversiones
ocasionales con puntos de rotura aparentemente fuera de las secuencias
de heterocromatina también pueden ser muy frecuentes en la población
normal.
nucleótido incorporado (véase Cooper y cois., 2000). Como el DNA
codificante de un gen humano promedio tiene alrededor de 1.65 kb,
ocurrirán en forma espontánea mutaciones en el DNA de codifica­
ción con una frecuencia promedio cercana a 1.65 X 10 6 a 1.65 X
318 | CAPÍTULO ONCE INESTABILIDAD DEL GENOMA HUMANO: MUTACIÓN Y REPARACIÓN DEL DNA
10 8 por gen por división celular. En consecuencia durante las alre­
dedor de 1016 mitosis que se efectúan en un tiempo de vida huma­
no promedio, cada gen será un locus para unas 108 a 10lu mutaciones
(pero para cualquier gen, sólo una minoría muy pequeña de células
llevará una mutación). En muchos casos una mutación génica perju­
dicial en una célula somática no tendrá consecuencias: la mutación
puede causar letalidad en esa célula aislada, pero no tendrá conse­
cuencias para otras células. Sin embargo, en algunos casos la muta­
ción puede conducir a una continuación inapropiada de la división
celular y causar cáncer (véase cap. 17).
11.2.2 La frecuencia de sustituciones de bases
individuales es no aleatoria de acuerdo
con la clase de sustitución
Las sustituciones de bases son una de las mutaciones más frecuen­
tes y pueden agruparse en dos clases. Las transiciones son sustitu­
ciones de una pirimidina por una pirimidina (C*+T) o una purina
por una purina (A+*G). Las trajisversiones son sustituciones de
una pirimidina por una purina o de una purina por una pirimidi­
na. Cuando se sustituye una base por otra, siempre hay dos posi­
bles elecciones para la transversión, pero sólo una para transición
(véase fig. 11-1). Por tanto cabría esperar que las transversiones fue­
ran el doble de frecuentes que las transiciones.
Como la sustitución de alelos en una población requiere miles
y aun millones de años para completarse, no es posible observar en
forma directa las sustituciones de nucleótidos. Siempre se suponen
por comparaciones de pares de moléculas de DNA que comparten
un origen común, como ortólogos en diferentes especies. Cuando
lo anterior ocurre, se encuentra que el índice de transición en ge-
nomas de mamíferos es inesperadamente más alto que los índices
de transversión. Por ejemplo, Collins y Jukes (1994) compararon
337 pares de ortólogos de humanos y roedores, y encontraron que
la tasa de transición excedió la de transversión en una relación de
1.4:1 para sustituciones que no condujeron a un aminoácido alte­
rado y en una proporción mayor de 2:1 en las que dieron por re­
sultado un cambio de aminoácido.
Las transiciones pueden favorecerse sobre las transversiones en
el DNA de codificación porque por lo general producen una se­
cuencia polipéptida más conservada (véase más adelante). En el
DNA tanto codificante como no codificante de vertebrados, el ex­
ceso de transiciones contra las transversiones se debe cuando menos
en parte a la frecuencia comparativamente alta de transiciones C~>T,
que resultan de inestabilidad de residuos de citosina que ocurren en
el dinucleótido CpG. En estos dinucleótidos la citosina suele med­
iarse en el átomo de carbono 5 y las 5-metilcitosinas son suscepti-
Fig. 11-1. En teoría puede esperarse que las transversiones sean el
doble de (recuentes que las transiciones.
Flechas rojas, transversiones; flechas negras, transiciones.
bles a desaminación espontánea para dar timina (recuadro 9-3). Al
parecer, como resultado de lo anterior, el dinucleótido CpG es un
punto crítico para mutación en genomas de vertebrados: su índice
de mutación es cerca de 8.5 veces mayor que el del dinucleótido
promedio (véase Cooper y cois., 2000) y las transiciones CpG- ^►
TpG son el tipo más frecuente de mutaciones de punto patógenas.
Es probable que otros factores que favorecen las transiciones sobre
las transversiones incluyan reparación diferencial de bases con pa-
reamiento erróneo por actividades de lectura de pruebas depen­
diente de secuencia de las polimerasas de DNA relevantes.
11.2.3 La frecuencia y la gama de mutaciones en el
DNA codificante difieren de las del DNA no
codificante
En el DNA de los individuos muchas mutaciones se generan en
esencia de manera aleatoria. Como resultado el DNA de codifica­
ción y el DNA no codificante son casi igual de susceptibles a mu­
tación. Sin embargo, es claro que las principales consecuencias de
la mutación se restringen en gran parte a cerca de 1.5% del DNA
del genoma humano que se sabe que es DNA de codificación y el
otro 3% aproximado de secuencias muy conservadas (inclusive se­
cuencias reguladoras, etc.). Las mutaciones que ocurren dentro del
DNA de codificación pueden agruparse en dos clases:
► mutaciones sinónimas (silenciosas), que no cambian la se­
cuencia del producto génico. Esto sólo se aplica al DNA que co­
difica polipéptidos. Una mutación sinónima origina un cambio
en el codón pero no produce un aminoácido alterado por la de­
generación del código genético. N ota: algunas mutaciones que
parecen silenciosas tal vez no lo sean porque afectan el empal­
me (al activar un sitio de empalme críptico o modificar una se­
cuencia intensificadora de empalme exónica; sección 11.4.3);
► mutaciones no sinónimas que cambian la secuencia del pro­
ducto génico, que puede ser un polipéptido o un RNA no co­
dificante (= no traducido) funcional.
Se piensa que las mutaciones silenciosas verdaderas en genomas de
mamíferos son mutaciones neutrales (que no confieren ventaja o
desventaja al organismo en cuyo genoma se originan). En contras­
te, las mutaciones no sinónimas pueden agruparse en tres clases: las
que tienen un efecto perjudicial, las que carecen de algún efecto y
las que ejercen un efecto benéfico (p. ej„ mejoría de la función gé­
nica o interacción intergénica). Es probable que casi todas las mu­
taciones no sinónimas nuevas tengan un efecto perjudicial en la
expresión génica y por consiguiente ocasionen enfermedad o letali­
dad. Sin embargo, la frecuencia de este tipo de mutación en la po­
blación es mucho muy reducida gracias a la selecció n n a tu ra l (véase
recuadro 11-2). En consecuencia el total de mutaciones en el DNA
de codificación es mucho menor que el del DNA no codificante y
las secuencias del DNA de codificación (y las secuencias reguladoras
importantes, etc.) muestran un grado más o menos alto de conser­
vación evolutiva.
► La p r esió n d e selecció n (las selecciones impuestas por selección
natural) reduce tanto la frecuencia total de mutaciones sobre­
vivientes en el DNA de codificación como la gama de muta­
ciones que se observa. Por ejemplo, las deleciones/inserciones
de uno o varios nucleótidos son frecuentes en el DNA no co­
dificante pero destaca el hecho que no se encuentren en el
DNA de codificación. Esto a menudo se debe a que estas mu­
taciones ocasionarán un cambio en el marco de lectura traduc-
 11.2 MUTACIONES SIMPLES 319

Recuadro 11-2. Mecanismos que afectan la frecuencia de alelos en la población

Los individuos de una población difieren entre sí, sobre todo com o resul­ va genética aleatoria puede ocasionar cambios considerables en las fre­
tado de la variación genética hereditaria. La frecuencia de cualquier alelo cuencias de alelos (véase figura). En ausencia de una nueva mutación y
mutante en una población depende de varios factores, que abarcan selec­ otros factores que afectan la frecuencia de alelos, como la selección, los
ción natural, deriva genética aleatoria e intercambios secuenciales entre alelos que se someten a deriva genética aleatoria se fijarán por último (el
secuencias no alélicas. punto al que la frecuencia de alelo en la población es 0 o 100%).
SELECCIÓN NATURAL
Generación Frecuencia
Selección natural es el proceso por el que parte de la variación genética
de alelo
heredada dará por resultado diferencias entre individuos en cuanto a su ca­
pacidad para sobrevivir y reproducirse con éxito. La reproducción diferen­
0 .5 /0 .5
cial se debe a divergencias entre los individuos en cuanto a su capacidad
para efectuar la reproducción (que se afecta por parámetros como morta­
lidad, salud y éxito en el apareamiento) y producir una descendencia salu­
dable (diferencias en fertilidad, fecundidad y viabilidad de la descendencia).
La aptitud de un organismo es una medida de la capacidad de los indivi­
duos para sobrevivir y reproducirse de manera satisfactoria. En los mode­ 0 .5 /0 .5
los más simples se considera que la aptitud de un individuo está
determinada sólo por su constitución genética y se supone que todos los
locus contribuyen de modo independiente a la aptitud de un individuo, de
manera que es posible tratar por separado cada locus. En consecuencia
también puede hablarse de aptitud de un genotipo. 0 .4 /0 .6
La gran mayoría de las nuevas mutaciones no sinónimas en el DNA de co­
dificación reduce la aptitud de sus portadores. Por consiguiente se selec­
cionan contra la población y se eliminan de la misma (selección negativa
o purificante). En ocasiones una nueva mutación puede ser tan apta co­
mo el mejor alelo en la población; esta mutación es neutral desde el pun­ 0 .4 /0 .6
to de vista de la selección. Muy rara vez una nueva mutación confiere una
ventaja selectiva e incrementa la aptitud de su portador. Esta mutación se
someterá a selección positiva (o ventajosa), que cabria esperar que fo­
mentara su diseminación a través de una población. Si se consideran lo­
cus con dos alelos que poseen diferentes aptitudes, el heterocigoto puede 0 .7 /0 .3
tener una aptitud intermedia entre los dos tipos de homocigotos. En este
caso la modalidad de selección es codominante y la selección será direc-
cional, lo que resultará en un incremento del alelo ventajoso. Sin embargo,
en algunos casos es posible que una nueva mutación no sea ventajosa en
homocigotos sino sólo en heterocigotos (ventaja de heterocigoto). Esta
0 .7 /0 .3
situación, en la que el heterocigoto tiene una aptitud más alta que el ho-
mocigoto mutante y el homocigoto normal, es una forma de selección ba­
lanceada que se conoce como selección sobredominante (véase el
ejemplo de la fibrosis quística en el recuadro 4-8).
DERIVA GENÉTICA ALEATORIA
Los cambios en la frecuencia de alelos pueden ocurrir por simple azar El muestreo aleatorio de gametos en poblaciones pequeñas puede
(deriva genética aleatoria). Aun si todos los individuos de una población conducir a cambios considerables en las frecuencias de alelos.
tienen la misma aptitud de manera que la selección natural no pueda ope­
rar, las frecuencias de alelos cambiarán por un muestreo aleatorio de ga­ Modificado de Bodmer y Cavalli-Sforza (1976) Genetics, Evoiution and Man.
metos. El muestreo ocurre porque sólo una pequeña proporción de los INTERCAMBIO DE SECUENCIAS INTERLOCUS
gametos disponibles en cualquier generación se transmite alguna vez a la En algunas familias génicas, genes individuales codifican en esencia el
generación siguiente (no todos los individuos de una población se repro­ mism o producto, pero puede haber intercambios de secuencias que ocu­
ducirán por las circunstancias o elección). Inclusive si no hubiera un ex­ rren entre las diferentes copias génicas. Por ejemplo, rRNA 5.8S, 18S y
ceso de gametos (de modo que cada individuo aislado contribuye con 28S humanos son codificados por unidades de transcripción repetidas en
dos gametos a la generación siguiente), ocurriría muestreo porque los he­ form a tándem (véase fig. 10-2) y muestran una propensión particular a
terocigotos pueden producir dos tipos de gametos que portan diferentes intercambios de secuencias entre las diferentes repeticiones. La frecuen­
alelos pero los dos gametos que se transmiten a la generación siguiente cia de un tipo de repetición puede aumentar en la población como resul­
pueden llevar, por azar, el mism o alelo. tado de los intercambios de secuencias entre distintas repeticiones
La deriva genética tiene poco efecto en poblaciones grandes. Ello se debe (véase fig. 11-8 para una ilustración del principio general). En casos en
a que aunque sólo se transmite una fracción pequeña del total de game­ los que múltiples locus producen productos idénticos, todos los genes
tos, se transmiten los gametos suficientes para ser, con mucho, estadís­ pueden considerarse de manera efectiva como el equivalente de alelos.
ticamente representativos de todos los gametos en la población. Sin aunque no en el sentido mendeliano (que por lo general permite un máxi­
embargo, cuando los tamaños de la población son pequeños (p. e j„ como mo de dos alelos en la célula diploide). Por consiguiente la frecuencia de
resultado de aislamiento geográfico), el número de gametos que se trans­ una repetición específica (“ alelo” ) puede determinarse en parte por la fre­
mite a la generación siguiente será más pequeño en proporción y la deri­ cuencia con que participa en intercambios de secuencia.
320 CAPÍTULO ONCE INESTABILIDAD DEL GENOMA HUMANO: MUTACIÓN Y REPARACIÓN DEL DNA
cional (mutación de cambio de marco) mediante la introduc­
ción de un codón de terminación prematuro y causando pérdi­
da de la expresión gènica. Aun si las inserciones/deleciones no
originan una mutación de cambio de marco, con frecuencia
afectan la función genica, por ejemplo, como resultado de la
eliminación de una secuencia de codificación fundamental. Por
el contrario el DNA de codificación se caracteriza por una fre­
cuencia comparativamente alta de sustitución de bases no alea­
toria que ocurre en localizaciones que conducen a efectos
mínimos en la expresión genica (véase sección siguiente).
11.2.4 La localización de sustituciones de bases en el
DNA de codificación es no aleatoria
Las sustituciones de nucleótidos que ocurren en el DNA no codi­
ficante no suelen tener un efecto neto en la expresión gènica. Las
excepciones comprenden algunos cambios en los elementos pro­
motores o alguna otra secuencia de DNA que regula la expresión
gènica o que se requiere para el empalme (fig. 1-15). Las sustitucio­
nes que se observan en las secuencias del DNA de codificación que
especifica polipéptidos muestran un patrón de sustituciones no
aleatorio en exceso por la necesidad de conservar la secuencia poli-
péptida y la función biológica. En principio las sustituciones de ba­
ses pueden agruparse en tres clases según su efecto en el potencial
de codificación (véase recuadro 11-3).
Las diferentes clases de sustitución de bases que se presentan en
el recuadro 11-3 muestran tendencias diferenciales a localizarse en
la primera, segunda o tercera posiciones de bases de codones. A
causa del diseño del código genético, diferentes grados de degene­
ración caracterizan distintos sitios. Las posiciones de bases en co­
dones que especifican aminoácidos pueden agruparse en tres
clases:
► los sitios no degenerados son posiciones de bases en las que
las tres posibles sustituciones pertenecen a la variedad no si­
nónima. Abarcan la posición de la primera base de todos los
codones con excepción de ocho, la posición de la segunda ba­
se de todos los codones y la posición de la tercera base de dos
codones, AUG y UGG (véase fig. 11-2). Si se consideran las
frecuencias de codones observadas en genes humanos, com­
prenden alrededor de 65% de las posiciones de bases en co­
dones humanos. El índice de sustitución de bases en sitios no
degenerados es muy bajo y compatible con una presión de se­
lección conservadora potente para evitar cambios de aminoá­
cidos (véase más adelante);
► los sitios degenerados cuádruples son posiciones de bases en
las que las tres posibles sustituciones son sinónimas y se en­
cuentran en la posición de la tercera base de varios codones
(véase fig. 11-2). Comprenden alrededor de 16% de las posi­
ciones de bases en codones humanos. La tasa de sustitución en
sitios cuádruples es muy similar a la que ocurre dentro de in-
trones y seudogenes, compatible con la suposición de que las
sustituciones sinónimas son neutrales desde el punto de vista
de la selección (sección 11.2.5);
► los sidos degenerados dobles son posiciones de bases en las
que una de las tres posibles sustituciones es sinónima. Suelen
encontrarse en las posiciones de la tercera base de codones,
pero también en la posición de la primera base en ocho codo­
nes (véase fig. 11-2). Comprenden alrededor de 19% de las
posiciones de bases en codones humanos. Como cabría espe­
rar, la tasa de sustitución de los sitios degenerados dobles es
intermedia: sólo una de las tres posibles sustituciones, una
transición, conserva el mismo aminoácido. Las otras dos po­
sibles sustituciones son transversiones que, por la forma en
que el código genético evolucionó, suelen ser sustituciones
conservadoras. Por ejemplo, en la posición de la tercera base
del codón de glutamato GAA, una transición A- *C es silen­
ciosa, en tanto que las otras dos transversiones (A-*C; A—>T)
dan como resultado la sustitución por un aminoácido muy si­
milar, aspartato.
El diseño del código genético y el grado al que un aminoácido tie­
ne funciones similares a otro afectan las m u ta b ilid a d es d e a m i­
n o á cid o s relativas. Ciertos aminoácidos pueden desempeñar
acciones fundamentales que no es posible sustituir con facilidad
por otras. Por ejemplo, con frecuencia la cisterna participa en el en­
lace disulfuro que puede tener una función de importancia crucial
en el establecimiento de la conformación de un polipéptido (véase
fig. 1-25). Como ningún otro aminoácido tiene una cadena lateral
con un grupo sulfhidrilo, la presión de selección es potente para
conservar los residuos de cisterna en muchas localizaciones y la cis­
terna es uno de los aminoácidos menos mutables (cuadro 11-1). En
contraste, algunos otros aminoácidos, como serina y treonina, tie­
nen cadenas laterales muy similares y sustituciones tanto en la po­
sición de la primera base de codones (ACX—>UCX, en la que X =
cualquier nucléotido) como en las posiciones en la segunda base
(ACPy—>AGPy, en la que Py =pirimidina) que pueden originar sus­
tituciones en serina treonina. Quizá como resultado, la serina y
la treonina se encuentran entre los aminoácidos más mutables (cua­
dro 11-1).
11.2.5 Las tasas de sustitución varían de manera
considerable entre diferentes genes y entre
distintos componentes génicos
Tasa de sustitución neutral
La reciente disponibilidad de secuencias bosquejo de los genomas
humano y del ratón permitió analizar las tasas de divergencia y sus­
titución de secuencias en la extensión del genoma (Mouse Genome
Sequencing Consortium, 2002). Como punto de referencia se esti­
mó la tasa de sustitución neutral a partir de alineamientos de DNA
no funcional. Ello se logró al identificar secuencias repetidas ances­
trales (repeticiones no codificantes basadas en transposón que se
juzgó se habían insertado en el DNA genómico del ancestro común
y que se fijaron antes de la divergencia de humanos y ratones). Fue
factible identificar un total de 165 Mb de secuencias repetidas an­
cestrales (las secuencias ortólogas se determinaron mediante alinea­
ción de DNA no repetido adyacente).
La identidad de secuencias total en secuencias repetidas ances­
trales se estimó en 66.7%. La identidad de secuencias en sitios
degenerados cuatro veces (véase sección previa), otro grupo de se­
cuencias en potencia no funcionales, fue de 67%. Estos valores tan
similares condujeron a estimaciones de 0.46 a 0.47 sustituciones
por sitio para la tasa de sustitución neutral (Mouse Genome Sequen­
cing Consortium, 2002). Con base en las diferencias en la tasa de
mutación en los linajes que condujeron a los humanos y los rato­
nes modernos (sección 11.2.6), se estimó que esto refleja una tasa
de sustitución neutral aproximada de 2 X 10 ; por sitio por año
en el linaje humano.
 11.2 MUTACIONES SIMPLES 321

becuadro 11-3. C lases de sustitución de una base en el DNA que codifica poli

jí tiempo en tiempo la sustitución de un nucleótido aislado dentro de un
a o n de codificación altera el empalme de RNA y ocasiona una expresión
jr 'ic a defectuosa. Esto puede suceder en varias formas: mediante acti-
íáción de un sitio de empalme críptico dentro de un exón (fig. 1 1 - 1 2 ), por
r o ta c ió n de nucleótidos en las secuencias del donador y el aceptor de
í- p a lm e justo adyacentes a las señales GT y AG conservadas (fig.
1-15), o por alteración de secuencias internas que regulan el empalme,
en especial intensificadores de empalme exónico (sección 11.4.3). Otras
sustituciones de base única pueden clasificarse como sinónimas (silen-
:» sa s) o no sinónimas, en las que un codón está mutando para causar
un cambio de la secuencia de aminoácidos.
SUSTITUCIONES SINÓNIMAS (SILENCIOSAS)
El resultado de la sustitución es un nuevo codón pero especifica el mis-
Tio aminoácido. Constituyen el cambio que se observa con mayor fre­
cuencia en el DNA de codificación (porque casi siempre son mutaciones
neutrales y no están sujetas a presión de selección). Las sustituciones
silenciosas se presentan sobre todo en la posición de la tercera base de
un codón porque la tercera base bamboleante significa que el codón al­
terado a menudo especifica el m ism o aminoácido que antes. Sin embar­
go, a veces la sustitución incluye la posición de la primera base, como
se observa en algunos codones de leucina (C UA«U UA, £U G oU U G ) y
arginina (AGA<=>£GA, AGG<=>£GG).
MUTACIONES SIN SENTIDO
Representan una forma de sustitución no sinónima en la que un codón
que especifica un aminoácido se reemplaza por un codón de detención.
Puesto que estas mutaciones casi siempre se acompañan de una dis­
minución notable de la función génica, la presión de selección asegura
que en condiciones normales sean raras. El polipéptido humano prome­
dio es especificado por alrededor de 500 a 550 codones, un tamaño que
cabría esperar que incluyera más de 20 codones de terminacio:: si nc
hubiera restricciones funcionales.
MUTACIONES EN SENTIDO ERRÓNEO
Son sustituciones no sinónimas en las que el codón alterado especifica
un aminoácido distinto. Pueden clasificarse en dos subgrupos:
► sustituciones conservadoras, cuyo resultado es el reemplazo de un
aminoácido por otro químicamente similar a él. Con frecuencia el
efecto de estas sustituciones en la función de la proteina es mínimo
porque la cadena lateral del nuevo aminoácido puede tener funciones
similares a la del aminoácido que reemplaza (véase nota de pie mas
adelante). Para reducir al mínimo el efecto de la sustitución del nu­
cleótido, al parecer el código genético evolucionó de tal manera que
los codones que especifican aminoácidos relacionados se vinculan
en sí mism os. Por ejemplo, los pares de codón Asp (GAC, GAT) y Glu
(GAA, GAG) aseguran que la tercera base bamboleante en el codón
GAX (en la que X es cualquier nucleótido) tenga un efecto mínimo. Sin
embargo, algunos cambios en la posición del primer codón también
pueden ser conservadores, por ejemplo £UX (Leu)»G U X (Val):
► sustituciones no conservadoras dan por resultado el reemplazo de
un aminoácido por otro con una cadena lateral distinta (véase cua­
dro). En ocasiones se introduce una diferencia de carga; otros cam ­
bios pueden incluir reemplazo de cadenas laterales polares por otras
no polares y viceversa. Las sustituciones de bases en las posiciones
del primero y el segundo codones pueden producir sustituciones no
conservadoras, por ejemplo, £GX (Arg)-*£G X (Gli), CQX (Pro), CjJX
(Leu) o CAX (Gln/His), etc. (donde X = cualquier nucleótido).

D istancias fisicoquím icas entre pares de am inoácidos.

Arg Leu Pro Tre Ala Val Gli lie Fen Tir Cis His Gln Asn Lis Asp Glu Met Trp
110 145 74 58 99 124 56 142 155 144 112 89 68 46 121 65 80 135 177 Ser
102 103 71 112 96 125 97 97 77 180 29 43 86 26 96 54 91 101 Arg
98 92 96 32 138 5 22 36 198 99 113 153 107 172 138 15 61 Leu
38 27 68 42 95 114 110 169 77 76 91 103 108 93 87 147 Pro
58 69 59 89 103 92 149 47 42 65 78 85 65 81 128 Tre
64 60 94 113 112 195 86 91 111 106 126 107 84 148 Ala
109 29 50 55 192 84 96 133 97 152 121 21 88 Val
135 153 147 159 98 87 80 127 94 98 127 184 Gli
21 33 198 94 109 149 102 168 134 10 61 lie
22 205 10 116 158 102 177 140 28 40 Fen
194 83 99 143 85 160 122 36 37 Tir
174 154 139 202 154 170 196 215 Cis
24 68 32 81 40 87 115 His
46 53 61 29 101 130 Gln
94 23 42 142 174 Asn
101 56 95 110 Lis
45 160 181 Asp
126 152 Glu
67 Met

La cuantificación del grado de similitud entre dos aminoácidos se basa en propiedades como polaridad, volumen molecular y composición química, y ios números granass ¡
significan mayor disimilitud. En el cuadro anterior, tomado de Grantham (1974), los pares más similares son: Leu o lie (5), Met » lie (10) y Met » Leu (15): .os pares ~ás ,
disimiles son Cis « Trp (215), Cis » Fen (205) y Cis « Lis (202).
322 CAPÍTULO ONCE INESTABILIDAD DEL GENOMA HUMANO: MUTACIÓN Y REPARACIÓN DEL DNA

UUU Fen 17.1 UCU Ser 14.7 UAU T ir 1 2 . 1 UGU C ls 1 0 . 1

uuc Fen 20.4 UCC Ser 17.5 UAC T ir 15.5 UGC C is 12.4
UUA Leu 7.3 UCA Ser 11.9 (UAA DETENCIÓN) (UG A DETENCIÓN)
UUG Leu 12.7 UCG Ser 4.5 (UAG DETENCIÓN) UGG Trp 13.0

CUU Leu 12.9 CCU Pro 17.3 CAU His 1 0 . 6 CGU Arg 4.7
CUC Leu 19.5 CCC Pro 2 0 . 0 CAC His 15.0 CGC Arg 1 0 . 8

CUA Leu 7.0 CCA Pro 16.7 CAA Gin 11.9 CGA Arg 6.3
CUG Leu 40.1 CCG Pro 7.0 CAG Gin 34.4 CGG Arg 1 1 . 8

AUU lie 15.8 ACU Tre 12.9 AAU Asn 16.7 AGU Ser 1 2 . 0

AUC lie 21.3 ACC Tre 19.1 AAC Asn 19.3 AGC Ser 19.4
AUA lie 7.2 ACA Tre 14.9 AA L is 24.0 AGA Arg 11.7
AUG M et 22.3 ACG Tre 6 . 2 AAG Lis 32.5 AGG Arg 1 1 . 6

GUU Val 10.9 GCU Ala 18.6 GAU Asp 2 2 . 1 GGU G li 1 0 . 8

GUC Val 14.6 GCC Ala 28.4 GAC Asp 25.7 GGC G li 2 2 . 6

GUA Val 7.0 GCA A la 16.0 GAA Glu 29.0 GGA G li 16.4
GUG Val 28.7 GCG Ala 7.6 GAG Glu 40.3 GGG G li 16.4

C la v e
N S itio n o d e g e n e ra d o
N S itio d e g e n e ra d o d o b le
N S itio d e g e n e ra d o c u á d ru p le

Fig. 11-2. Frecuencias de codón en genes humanos y localizaciones de sitios degenerados dobles y cuádruples.

Las frecuencias de codón observadas se presentan como valores de cada 1 000 (p. e j„ UUU = 17.1/1 000 o 0.0171). Se derivaron de la base de
datos Codon Usage (http://www.kazusa.or.ip/codon/) e incluyeron el muestreo de 21 930 294 codones del GenBank Release 131.0 (15 de agosto de
2002). Nota: aunque ocho de las 61 posiciones de primera base son degeneradas dobles, alrededor de 96% de todas las posibles sustituciones en la
posición de primera base no es sinónimo. De las sustituciones en la posición de segunda base, 100% no es sinónimo y en la posición de la tercera
base, cerca de 33%.

Cuadro 11-1. Mutabilidad relativa de aminoácidos. (85% de identidad de secuencia o 0.165 sustituciones por sitio de
nucleótido) pero las secuencias de intrón están mucho menos con­
(Ala = 100; datos obtenidos de Collins y Jukes, 1994) servadas (68.6% de identidad secuencial, que se acerca al total de
69.1% de identidad de secuencias en las comparaciones de secuen­
Tre 116 Asp 84 cias en toda la extensión del genoma). Las regiones no traducidas
Ser 114 Lis 77
muestran una conservación intermedia (5’UTR, 75.9%; 3' UTR,
74.7%) igual que los 200 pb de flanqueo corriente arriba (región
His 107 Glu 76 promotora, 73.9%) y 200 pb corriente abajo (70.9%).
Asn 107 Pro 67
Tasa de sustitución en diferentes genes y dominios
Met 102 Leu 58
Los diferentes genes están conservados en distintas extensiones. Aun­
Ala 100 Gli 57 que por lo general la tasa de sustitución en sitios sinónimos está has­
Gln 99 Fen 55 ta cierto punto preservada, la tasa de sustitución no sinónima puede
variar mucho. Si se utiliza K s para indicar el número de sustituciones
Val 98 Tir 53 por sitio sinónimo y KÁpara el de sustituciones por sitio no sinóni­
Arg 94 Trp 31 mo, los genes que se someten a selección negativa (purificación) ten­
drán Ka « Ks . Los genes sometidos a selección positiva para
lie 92 Cis 29
reemplazo de aminoácidos también pueden mostrar KA< Ks porque
es posible que la selección positiva sólo opere en unos cuantos sitios
cruciales y es compensada por la selección de purificación en un gran
Tasa de sustitución en diferentes componentes génicos
número de otros sitios. Cuando el Mouse Genome Sequencing Consor­
Las comparaciones de más de 14 000 pares de secuencias génicas tium (2002) examinó más de 12 000 pares de genes ortólogos huma­
ortólogas en humanos y ratones también enfatizaron las diferencias nos y de ratón encontró que el valor mediano de KA/KS es de 0.115.
en la tasa de sustitución dentro de diferentes componentes génicos En un extremo se encuentran proteínas cuyas secuencias están
(Mouse Genome Sequencing Consortium, 2002; véase fig. 11-3 para en extremo bien conservadas porque se requieren para funciones
una representación visual basada en un subgrupo de los datos). Co­ cruciales de la célula y especifican proteínas como actinas, calmo-
mo cabría esperar, las regiones codificantes son las más conservadas dulina, histonas, proteínas ribosómicas, ubiquitinas, etc. Por ejem-

Primer exón
100
95
90 -
85
80
75
70
65
60
55
50
200 pb UTR 5' Intrón
Corriente arriba
Posición dentro del genoma
Fig. 11-3. Variación en la conservación de secuencia en humanos y ratones a través de un gen típico.
La tasa de sustitución de nucleótidos varía en diferentes componentes de un gen, como lo muestra la alineación de más de 3 000 RefSeq de mRNA
humanos y secuencias genómicas corriente arriba/corriente abajo contra secuencias ortólogas de ratón. Adaptado de Mouse Genome Sequence
Consortium (2002). Nature 420, 520-562, figura 25A con autorización de Nature Publishing Group.
pío, las proteínas ubiquitinas de humanos, ratones y Drosophila
muestran una identidad de secuencias de 100% y la comparación
con la ubiquitina de la levadura revela una identidad de secuencias
de 96.1%. Estos genes no están protegidos de manera especial de
mutaciones porque la tasa de sustitución sinónima de codón es tí­
pica de la de muchos genes que codifican proteínas. Lo que los dis­
tingue es la tasa en extremo baja de sustitución no sinónima de
codones en comparación con otros genes (véase cuadro 11-2 para
algunos ejemplos).
Los genes que muestran las tasas más altas de sustitución no si­
nónima de codones incluyen muchos relacionados con los sistemas
de defensa y respuesta inmunitaria de mamíferos (cuadro 11-2),
igual que seis de ocho dominios proteínicos comunes relacionados
con los valores KA/Ks m is altos (Mouse Genome Sequencing Consor­
tium, 2002, cuadro 13). La relación KA/KS alta en estos casos indi­
ca que se encuentran bajo una selección de purificación reducida,
un incremento de selección positiva o ambos. El incremento de la
selección positiva podría indicar una lucha competitiva entre un
huésped mamífero y sus patógenos, en la que cada uno está bajo
una presión potente para responder a innovaciones en el otro geno­
ma. Los mismos seis de ocho dominios con los valores Ky¡/K¡ más
altos se encuentran en proteínas secretadas y los dominios secreta­
dos tienen relaciones KA/K¡ mucho más altas que los dominios nu­
cleares y citoplásmicos (cuadro 11-3). Al parecer los dominios
catalíticos tienen relaciones KA/KS comparativamente bajas.
11.2.6 La tasa de sustitución puede variar
en las diferentes regiones cromosómicas
y en distintos linajes
Tasa de sustitución y heterocigosidad en diferentes regiones
cromosómicas
Por diversas razones, la tasa de sustitución en el genoma mitocon-
drial es mucho más alta que en el DNA del genoma nuclear (sec­
ción 11.4.2), pero la última muestra una variación regional muy
11.2 MUTACIONES SIMPLES 323
Exones medios Último exón
U - > i
Intrón UTR 3' 200 pb
Corriente abajo
considerable. El bosquejo de secuencias del genoma humano y del
ratón brindó una oportunidad ideal para estimar lo anterior. Me­
diante el uso de secuencias de repetición ancestrales alineadas (véa­
se sección previa) y sitios degenerados cuatro veces alineados, el
Mouse Genome Sequencing Consortium (2002) calculó la tasa apa­
rente de sustitución neutral para unas 2 500 ventanas de 5 Mb su­
perpuestas a través del genoma humano. La variación regional fue
evidente cuando se compararon las tasas promedio en diferentes
cromosomas. La tasa de sustitución es más baja en el cromosoma X
y se observan diferencias importantes entre los autosomas (fig. 11-
4A). Ya que el cromosoma X transcurre dos tercios de su vida en
mujeres, la tasa de sustitución baja puede reflejar diferencias en el
número de divisiones de las células germinales en varones y muje­
res (recuadro 11-4).
También la variación subcromosómica en la tasa de sustitución
(lo mismo que en los índices de deleciones e inserciones) es muy
obvia, como en el caso del cromosoma 22 humano (fig. 11-4B). Es­
to refleja en parte la composición de bases: aunque al parecer la ta­
sa de sustitución es más alta en regiones de contenido muy alto o
bajo de G + C, la relación es compleja. Con el mapa de recombi­
nación de alta resolución deCode Genetics del genoma humano
(Kong y cois., 2002) como referencia se identificó asimismo una
correlación entre la tasa de sustitución y la de recombinación, y una
densidad de polimorfismo de nucleótido único (PNU) (véase fig.
11-4C). Si bien la heterocigosidad promedio en el genoma huma­
no es del orden de 1 de cada 1 250 bases (Reich y cois., 2002), la
densidad de PNU puede variar de modo considerable en diferentes
partes del genoma y cuando se promedia a través de ventanas de
200 kb, las tasas de heterocigosidad muestran una variación hasta
de 10 veces (International SNP Map Working Group, 2001). En una
resolución más fina las regiones mesurables del genoma humano
que abarcan más de decenas de miles de pares de bases al parecer
tienen tasas intrínsecamente altas y bajas de variación de secuen­
cias. En estas regiones sólo una proporción pequeña (hasta 25%) de
la variación parece deberse a la tasa de mutación local; el contribu­
yente mayor es la historia genealógica compartida (Reich y cois.
2002).
324 CAPITULO ONCE INESTABILIDAD DEL GENOMA HUMANO: MUTACIÓN Y REPARACIÓN DEL DNA

Cuadro 11-2. Tasas de sustituciones sinónimas y no sinónimas en genes que codifican proteínas en mamíferos.
Gen Número de codones comparados Tasa no sinónima ( x 109) Tasa sinónima ( x 109)

Actina a 376 0.01 2.92

Proteina ribosómica S14 150 0.02 2.16

Proteina ribosómica S17 134 0.06 2.69

Aldolasa A 363 0.09 2.78

HPRT 217 0.12 1.57

Insulina 51 0.20 3.03

G lob in aa 141 0.56 4.38

Globina p 146 0.78 2.58

Albúmina 590 0.92 5.16

ig v H 100 1.10 4.76

Hormona del crecimiento 189 1.34 3.79

Ig k 106 2.03 5.56

Interferón p, 159 2.38 5.33

Interferón y 136 3.06 5.50

Datos de comparaciones de humanos y roedores extraídos del cuadro 4-1 de Grauer y Li (2000).

Tasas de sustitución en humanos comparadas con ratones
El bosquejo de las secuencias humana y de ratón también hizo po­
sible analizar la forma en que las tasas de sustitución pueden variar
en diferentes linajes. Como se consideró que las sustituciones sinó­
nimas eran efectivamente neutrales desde el punto de vista de res­
tricciones de selectividad, hace más de 30 años se sugirió el concepto
del reloj molecular constante (por el que un determinado gen o un
producto del mismo se somete a una tasa constante de evolución
molecular). Sin embargo, desde entonces varias líneas de evidencia
argumentaron contra un reloj molecular constante (véase Ayala,
1999, y el cuadro 11-2 que muestra diferencias aparentes en la tasa
de sustituciones sinónimas de codón y también en el caso de susti­
tuciones no sinónimas de codón).
Para valorar las tasas relativas de sustituciones de nucleótidos en
dos linajes que conducen a las especies A y B actuales, muchos es­
tudios utilizan una prueba de tasa relativa con una especie C de
referencia relacionada en forma distante (que se sabe que se ramifi­
có temprano en la evolución, antes de la división A-B). A fin de cal­
cular el valor K, la frecuencia de sustituciones sinónimas, se
emplean comparaciones de pares de bases de ortólogos en A y C, y
en B y C. Los valores KAc y Kbq proporcionan entonces una medida

Cuadro 11-3. Conservación de secuencias y tasas de sustitución de genes ortólogos y DNA que codifica dominios en humanos
y ratones.
Regiones ortólogas Identidad de aminoácidos (%) Ka Ks Ka/Ks

Proteína de longitud completa 78.5 0.071 0.602 0.115

Regiones proteínicas que contienen dominio 93.5 0.032 0.601 0.061

Regiones proteínicas sin dominio 71.1 0.090 0.586 0.155

Todos los dominios predichos 95.1 0.024 0.627 0.062

Dominios catalíticos 96.6 0.015 0.578 0.033

Dominios no catalíticos 94.9 0.026 0.635 0.068

Dominios nucleares 98.6 0.008 0.655 0.050

Dominios secretados 88.9 0.058 0.694 0.091

Dominios citoplásmicos 96.7 0.015 0.587 0.041

KA, tasa de sustitución no sinónima; Ks, tasa de sustitución sinónima. Datos resumidos del cuadro 12 del Mouse Genome Sequencing Consortium
(2002) Nature 420, 520-562, con autorización de Nature Publishing Group.
 11.2 MUTACIONES SIMPLES 325

A)
0.60

0.55

o
Cl 0.50
v>
<D
C
o
'ü
0.45
V)
D
0.40

0.35
7 8 9 10111213141516171819202122 X
Cromosoma humano

B) -------Densidad de PNU
-------Tasa de recombinación

o
a
9
c
O
o
.■s
M
3
w

0.4 01__ _______ ___ ___________

0______ 15 20 25 30 35 40 45 50 0 15 20 25 30 35 40 45 50
Posición en el cromosoma humano 22 (Mb) Posición en el cromosoma humano 22 (Mb)

Fig. 11-4. Variación en las tasas de sustitución entre cromosomas humanos y regiones subcromosómicas.
Se muestra la variación en el número estimado de sustituciones por sitio dentro de sitios degenerados cuádruples (azul; t® ) y en sitios de repetición
ancestrales (rojo; tAR) para diferentes cromosomas humanos A) y el cromosoma 22 humano largo B). Las lineas de guiones en A) Indican promedios
de la extensión del genoma (obsérvese el número de sustituciones claramente alto en sitios degenerados cuádruples en el cromosoma 19 humano pero
tasas de sustitución bajas en el cromosoma X) C). Correlación de la tasa de sustitución en repeticiones ancestrales (tAR) a través del cromosoma 22 con
densidad de PNU y tasa de recombinación. Adaptado de Mouse Genome Sequence Consortium (2002) Nature 4 2 0 ,520-562, figuras 29A y 30A con
autorización de Nature Publishing Group.

de las tasas relativas de mutación en los linajes que conducen a es­
pecies A y especies B. Pruebas de este tipo sugieren que la tasa de
mutación en linajes que conducen a los primates es más baja que
la de linajes de roedores, y más baja aún en el linaje que lleva a los
humanos de los días modernos (p. ej., Wu y Li, 1985; Li y Tani-
mura, 1987). Sin embargo, estudios más recientes (p. ej., Kumar
y Subramanian, 2002) refutaron este concepto, a menudo con ba­
se en imprecisiones percibidas en la filogenia de mamíferos.
Con objeto de buscar posibles diferencias en las tasas de muta­
ción en los linajes humano y del ratón, el Mouse Genome Sequencing
Consortium (2002) investigó la divergencia de 18 subfamilias de re­
peticiones ancestrales humanas y de ratón que fueron activas poco
antes de la divergencia entre el humano y el ratón. Miles de copias
distribuidas de modo ubicuo en cada una de las subfamilias se com­
pararon dentro de cada genoma para valorar la divergencia de una se­
cuencia consenso y de esa manera fue posible reducir al mínimo la
variación regional en las tasas de sustitución. Como se observa en los
ejemplos representativos del cuadro 11-4, las repeticiones ancestrales
con menor divergencia en las subfamilias humanas muestran alrede­
dor de 16% de divergencia de una secuencia consenso (o unas 0.17
sustituciones por sitio), en tanto que las repeticiones en cada una de
las subfamilias del ratón variaron cuando menos 26 a 27% (alrede­
dor de 0.34 sustituciones por sitio). Si se asume que la divergencia
entre el humano y el ratón ocurrió hace cerca de 75 millones de años,
tal vez las tasas promedio de sustitución fueron de 2.2 X 10 ' en el
linaje humano y 4.5 X 10 en el linaje de ratón. Estas cifras son las
326 I CAPÍTULO ONCE INESTABILIDAD DEL GENOMA HUMANO: MUTACIÓN Y REPARACIÓN DEL DNA
Recuadro 11-4. Diferencias de sexo en la tasa de mutación y el problema de la evolución impulsada por varones
Desde que Haldane observó por primera vez que casi todas las muta­
ciones que ocasionan hemofilia se originaban en la línea germinal mas­
culina, se asumió que las mutaciones humanas se heredan de manera
preferencial a través de la línea paterna, lo que condujo al concepto de
evolución impulsada por el varón (véase Li y cois., 2002). Se adoptaron
dos enfoques principales para estimar las tasas relativas de mutación en
las líneas germinales masculina y femenina: métodos moleculares evolu­
tivos y observación directa de mutaciones que causan enfermedad.
Métodos moleculares evolutivos
Por lo general incluyen una comparación de genes homólogos ligados
a X y ligados a Y con ortólogos en otra especie a fin de estim ar el índi­
ce de mutaciones sinónim as para el gen del crom osom a X (Ksx) y el gen
del crom osom a Y (Ksy). A diferencia de los autosomas, los crom oso­
mas del sexo pasan diferentes cantidades de tiempo en los dos sexos.
Las secuencias del crom osom a Y que se localizan fuera de la región
seudoautosómica pasan todo su tiempo en varones; las secuencias del
crom osom a X pasan en promedio dos tercios del tiempo en mujeres y
un tercio en varones (las mujeres tienen dos cromosomas X; los varo­
nes sólo uno). Si se utiliza a para representar la relación de la tasa de
mutación de varones con la tasa de mutación en mujeres, esto equiva­
le a establecer la tasa de mutación de varones en alfa en relación con
una tasa de mutación en mujeres de uno. Por consiguiente en la mayor
parte de las secuencias del cromosoma Y el índice de mutación es a.
En las secuencias del crom osom a X es 2/3 x 1 (la tasa de mutaciones
en mujeres) más 1/3 x a (la tasa de mutación en varones) = 2/3 +
a/3 . Por consiguiente la relación observada KSX/KSY = (2/3 + a /3 )/a y
por tanto puede utilizarse para estim ar a. A menudo esto resulta en es­
timados de alrededor de 4 a 6 para alfa en comparaciones que incluyen
primates (véase LI y cois., 2002; Makova y LI, 2002), aunque algunos
estudios proporcionan valores cercanos a dos, un valor no tan distinto
de las comparaciones equivalentes en roedores en los que hay menos
divisiones de las células germinales. En consecuencia es posible que
las mutaciones no dependan tanto de los errores de replicación com o
se pensaba.
Observación directa de mutaciones que causan enfermedad
Resulta claro que las mutaciones estimadas en este caso son un sub-
grupo especial. Se analizan muestras de un paciente con una mutación
nueva y los dos padres (por lo general el padre que pasó el cromosoma
deficiente se identifica mediante tipificación para marcadores que flan­
quean de cerca el gen de la enfermedad). En casi todos los casos la
mutación se transmitió a través de la línea germinal, pero si sólo se tipi­
fica una muestra de sangre, las mutaciones pueden incluir algunas muta­
ciones poscigóticas (que no se encuentran en el espermatozoo o el
óvulo sino que surgen tras la formación del cigoto).
Los datos disponibles apuntan hacia una predisposición por lo general
grande a favor de mutaciones paternas, cuando menos en mutaciones de
punto simple (véase Crow, 2000; Li y cois., 2002 y cuadro 11-5). Sin
embargo, las predisposiciones de sexo más notables en las tasas de
tasas prom edio desde la divergencia humano-ratón y se piensa que la
tasa actual de sustitución por año en el genoma del ratón es mucho
más alta (véase Mouse Genome Sequencing Consortium, 2002). Las
mismas comparaciones permitieron estimar la tasa de ocurrencia de
inserciones y deleciones pequeñas (<50 pb). Ambas especies mostra­
ron una pérdida neta de nucleótidos (las proporciones de bases elimi-
nadas:bases insertadas estuvieron en los límites de 2:1 a 3:1), pero la
pérdida total fue cuando menos el doble de alta en el ratón.
mutación son poco frecuentes, porque incluye mutaciones de ganancia
de función en genes (FGFR2, FGFR3 y RET) que codifican proteínas que
pertenecen a la misma familia proteínica. Además algunos tipos de
mutación no muestran esta predisposición paterna. Por ejemplo, la gran
mayoría de las deleciones nuevas a gran escala en el gen de distrofina al
parecer surge en la oogénesis (Grimm y cois., 1994; véase también más
adelante) y las deleciones grandes que incluyen el gen de neurofibromina
suelen presentarse en la oogénesis (López Correa y cois., 2000).
Las diferencias de sexo en la tasa de mutaciones pueden deberse a dis­
tintos factores (véase Hurst y Ellegren, 1998; Li y cois., 2002). En muta­
ciones premeióticas (mutaciones hereditarias que ocurren en una de las
divisiones de la célula germinal anterior a la meiosis) es probable que
un factor contribuyente de importancia sea la gran diferencia de sexo en
el número de divisiones de la célula germinal humana. En mujeres, el
número de divisiones celulares desde el cigoto hasta el ooclto fecundado
es constante porque todos los oocítos se formaron alrededor del quinto
mes del desarrollo y sólo se requieren dos divisiones celulares adi­
cionales para formar el cigoto (véase figura, panel A). Se piensa que el
número de divisiones sucesivas de las células femeninas desde el cigoto
hasta el óvulo maduro se aproxima a 24, una cifra cercana a la división
estimada de la célula masculina de 30 a 31 necesaria desde el cigoto
hasta la espermatogonia madre en la pubertad. Se requieren seis divi­
siones celulares subsecuentes para la espermatogénesis pero más ade­
lante el ciclo de esta última ocurre aproximadamente cada 16 días o 23
ciclos por año (figura, panel B). Como se ilustra en la figura, el número
de subdivisiones celulares necesarias para producir el espermatozoo
depende de la edad. Hacia la pubertad, las células germinales masculinas
habrán experimentado 30 divisiones mitóticas y el espermatozoo puede
producirse después de seis divisiones más. El espermatozoo puede pro­
ducirse luego de manera continua porque las células madre se dividen
cada 16 días ( = 23 divisiones por año). Por tanto sí la pubertad se pre­
senta, por ejemplo, a los 15 años, el número de divisiones de la célula
germinal necesario para producir espermatozoos en un varón de n años
= 36 + [23 x ( n - 1 5 ) ] , o alrededor de 265 divisiones para un varón de
25 años de edad y casi 840 divisiones en un varón de 50 años de edad.
Cabe esperar que los errores en la replicación/reparación del DNA durante
las divisiones de la célula germinal proporcionen casi todas las muta­
ciones de punto simples y por tanto puede esperarse que la tasa de
mutación en un varón sea sustancialmente mayor que la de mujeres y que
resulte notable un efecto de la edad paterna (véase, p. e j„ Crow, 2000).
Sin embargo, es posible que haya mayor disposición para que ciertas
clases de mutaciones hereditarias más complejas ocurran durante la
meiosis (mutaciones meióticas) y no durante las muchas divisiones de
las células germinales anteriores a la meiosis. Por ejemplo, con frecuen­
cia grandes deleciones por cruzamiento desigual ocurren en la meiosis
(sección 11.3.2.). En el caso de las deleciones a gran escala en genes
ligados a X, como la distrofina que no tiene un homólogo del cromosoma
Y, una predisposición importante hacia la mutación meiótica significaría
que la mayor parte de las deleciones surgiría en la oogénesis.
11.3 M ecanism os genéticos que
producen intercam bios de
secuencias entre repeticiones
Aunadas a las mutaciones simples muy frecuentes, hay varias clases de
mutaciones que incluyen el intercambio de secuencias entre secuencias
alélicas o no alélicas, que a menudo comprenden secuencias repetidas.
 11.3 | MECANISMOS GENÉTICOS QUE PRODUCEN INTERCAMBIOS DE SECUENCIAS. 32"

Recuadro 11-4. (C o n tin u ac ió n )

A> Î 5 meses
in útero 22 divisiones
mit óticas

Nacimiento

Madurez
sexual 2 divisiones
meióticas
Fecundación
ión
Segundo cuerpo polar
Cigoto

B) Célula germinal primordial

asculina

15 años 30 divisiones
mitóticas

Pubertad

Una división de
células madre
cada 16 días

>. 4 divisiones
mitóticas

Clave
2 divisiones
S Célula madre meióticas
Espermatides
Q Célula gonial

M Célula meiótica
Espermatozoos
Muerte celular
i por apoptosis

Diferencia de sexo en las divisiones de la célula germinal.

A) La oogénesis humana sólo ocurre durante la vida fetal y cesa al momento del nacimiento. Se piensa que el número total de divisiones celulares se
aproxima a 24. B) La espermatogénesis humana continúa durante toda la vida adulta y los espermatozoos se originan de células madre que se autorre-
nuevan por la vía de la espermatogonia. Por consiguiente el número de divisiones de la célula germinal depende mucho de la edad. Modificado de Vogel
y Motulsky (1996) Human Genetics. Probiems and Approaches, 3rd ed, con autorización de Springer Verlag. © 1996, Springer-Verlag.
328 CAPÍTULO ONCE INESTABILIDAD DEL GENOMA HUMANO: MUTACIÓN Y REPARACIÓN DEL DNA

Por ejemplo, el DNA de repetición tándem es propenso a polimorfis­ ocurrir en el caso de unidades repetidas que son muy cortas (microsa-
mos de deleción/inserción en los que los diferentes alelos varían en el télites), intermedias (minisatélites) o grandes. Diferentes mecanismos
número de copias integrales de la repetición tándem. Estos p olim orfis­ genéticos explican el polimorfismo de NVRT que depende del tama­
m os d e n ú m ero va ria b le d e rep etició n tá n d em (NVRT) pueden ño de la unidad de repetición (véase las dos secciones siguientes).

Cuadro 11-4. Repeticiones ancestrales que variaron con mayor rapidez en el linaje del ratón que en el linaje humano.

Ratón Humano

Subfamilia Clase de Tasa de Tasa de Tasa de Tasa de Relación

sustitución divergencia sustitución divergencia sustitución ajustada

L1MA6 LINE1 0.28 0.35 0.16 0.184 1.98

L1MA7 LINE1 0.28 0.35 0.16 0.181 1.98

L1MA8 LINE1 0.27 0.34 0.15 0.172 1.96

L1MA9 LINE1 0.28 0.35 0.18 0.201 1.86

MLT1A MaLR 0.31 0.39 0.21 0.242 1.73

MLT1A0 MaLR 0.30 0.38 0.19 0.219 1.80

MLT1A1 MaLR 0.29 0.37 0.19 0.214 1.78

MER20 DNA 0.29 0.37 0.19 0.222 1.76

MER33 DNA 0.27 0.33 0.18 0.211 1.63

Tigger6a DNA 0.29 0.37 0.18 0.211 1.85

Resumido del Mouse Genome Sequencing Consortium (2002) Nature 420, 520-562. Los datos que se muestran son representativos de 10 de 18
subfamilias de repeticiones ancestrales del cuadro 6 del artículo de Nature.

Cuadro 11-5. Sesgo hacia mutaciones heredadas del padre que causan enfermedades humanas.
Enfermedad Gen Número de mutaciones Número de mutaciones Relación de mutaciones
paternas maternas paternas/maternas ( a )

Ligada a X dominante

Enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher PLP 4 1 4

Síndrome de Rett MECP2 27 2 13.5

Autosomica dominante

Acondroplasia FGFR3 40 0 Inf.

Síndrome de Apert FGFR2 57 0 Inf.

Síndromes de Crouzon y Pfeiffer FGFR2 22 0 Inf.

Síndrome de Denys-Drash WT1 2 0 Inf.

Enfermedad de Hirschsprung RET 0 3 0

Neoplasia endocrina múltiple 2A RET 10 0 Inf.

Neoplasia endocrina múltiple 2B RET 25 0 Inf.

Neurofibromatosis tipo 2 NF2 13 10 1.3

Enfermedad de Von Hippel-Lindau VHL 4 3 1.3

Total 204 19 10

Datos resumidos de Li y cois. (2002). Curr. Opin. Genet. Dev. 12, 650-656, con autorización de Elsevier.
 11.3 1 MECANISMOS GENÉTICOS QUE PRODUCEN INTERCAMBIOS DE SECUENCIAS.
iOímás las repeticiones dispersas también pueden predisponer a
jeiedones/duplicaciones por una variedad de mecanismos genéticos.
Eaos temas se estudian en particular en el contexto de mutaciones de
^-crmedad y por consiguiente se presentan en la sección 11.4.
11.3.1 El deslizamiento de la replicación puede causar
polimorfismo de número variable de repetición
tándem (NVRT) en repeticiones tándem cortas
(microsatélites)
--:inque las tasas de mutación de la línea germinal en locus micro-
ütélites varían, suelen ser de 10 3 a 10 4 por locus por generación
véase Ellegreen, 2000). Se sabe que los alelos de nueva longitud en
— ucrosatélites (CA)/(TG) y en locus marcadores tetranucleótidos se
mimaron sin intercambio de marcadores de flanqueo. Lo anterior
significa que no se generaron por cruzamiento desigual (véase más
¿delante). En lugar de ello, ya que se observó que nuevos alelos mu-
untes difieren del alelo parental original en una unidad de repeti­
ción aislada, el mecanismo más probable para explicar la variación
ele longitud es una forma de intercambio de información de secuen­
cias que comienza por p a rea m ien to erró n eo d e ca d en a deslizada.
Esto ocurre cuando el pareamiento normal entre las dos cadenas com­
plementarias de una hélice doble se altera por la vacilación de las re­
peticiones en las dos cadenas, que conduce al pareamiento incorrecto
de repeticiones. Aunque puede considerarse que el pareamiento erró­
neo de cadena deslizada se observa en DNA no replicante, el DNA de
replicación puede ofrecer más oportunidades para deslizamiento y en
consecuencia el mecanismo suele denominarse deslizamiento de re­
plicación o deslizamiento de polimerasa (véase fig. 11-5). Además
del pareamiento erróneo entre repeticiones tándem, se cree que la re­
plicación por deslizamiento genera deleciones y duplicaciones grandes
por pareamiento erróneo entre repeticiones no contiguas y se sugirió
que es un mecanismo mayor para la evolución de la secuencia del
DNA y el genoma (Levinson y Gutman, 1987; véase también Dover,
1995). El potencial patógeno de las repeticiones tándem cortas es con­
siderable (secciones 11.5.1, 11.5.2).
11.3.2 Las unidades grandes de DNA de repetición
tándem son propensas a inserción/deleción
como resultado de cruzamiento desigual o de
intercambios desiguales de cromátides hermanas
Recombinación homologa describe la recombinación (cru z am ien ­
to) que ocurre en la meiosis o, rara vez, la mitosis entre secuencias de
DNA idénticas o muy similares y suele incluir la rotura de cromáti­
des no hermanas de un par de homólogos y la reunión de fragmen­
tos para generar nuevas cadenas recombinantes. El intercambio de
cromátides hermanas es un tipo análogo de intercambio de secuen­
cia que comprende la rotura de cromátides hermanas individuales y
la reunión de fragmentos que al inicio se encontraban en diferentes
cromátides del mismo cromosoma. En condiciones normales tanto la
recombinación homologa como el intercambio de cromátides her­
manas abarca intercambios iguales -el corte y la reunión de las cro­
mátides se presentan en la misma posición en cada cromátide-.
Como resultado los intercambios se efectúan entre secuencias aléli-
cas y en posiciones correspondientes dentro de los alelos. En el cru­
zamiento igual intragénico entre dos alelos puede resultar un nuevo
alelo que es un gen de fusión (o gen híbrido) que comprende un
fragmento terminal de un alelo y la secuencia restante del segundo
329
alelo (fig. 11-6). Sin embargo, por lo general los intercambios de
cromátides hermanas iguales no pueden producir variación gené­
tica porque las cromátides hermanas tienen secuencias de DNA
idénticas.
El cruzamiento desigual (CDI) es una forma de recombinación
homóloga no alélica en la que el cruzamiento tiene lugar entre secuen­
cias no alélicas en cromátides no hermanas de un par de homólogos
(fig. 11-7). A menudo las secuencias en las que el cruzamiento se lle­
va a cabo muestran una homología de secuencia muy considerable
que quizás estabiliza el pareamiento erróneo de los cromosomas. El in­
tercambio análogo entre cromátides hermanas se denomina inter­
cambio desigual de cromátide hermana (IDCH; véase fig. 11-7).
Tanto el CDI como el IDCH ocurren de manera predominante
en regiones del genoma que muestran repeticiones tándem de una
secuencia de tamaño moderado a grande con gran homología entre
las repeticiones (p. ej., en grupos de rDNA, DNA satélite comple­
jo, etc.). En estos casos el muy alto grado de homología de secuen­
cia entre las diferentes repeticiones puede facilitar el pareamiento
anormal de repeticiones no alélicas en cromátides no hermanas o
cromátides hermanas -el pareamiento erróneo de cromátides con
una cromátide fuera de registro con la otra mediante un número in­
tegral de unidades repetidas-. Si la rotura y la reunión del cromoso­
ma se producen en tanto el pareamiento erróneo de cromátides se
realiza en esta forma, habrá un intercambio recíproco de secuencias
que causa inserción en una cromátide y una deleción de igual tama­
ño en la otra (que puede ser patógena). Estos intercambios también
pueden conducir a ev o lu ció n co n certa d a al ocasionar que una va­
riante de secuencia particular se disemine en la totalidad de un arre­
glo de repeticiones tándem, lo que conduce a la homogenización de
las unidades repetidas (véase fig. 11-8).
Si bien el CDI y el IDCH son en particular frecuentes en DNA
de repetición tándem, también pueden iniciarse por pareamiento
erróneo entre repeticiones que están separadas por una cantidad
considerable de secuencias intermedias. Por ejemplo, el pareamien­
to erróneo de repeticiones Alu no alélicas o de otras repeticiones
dispersas puede ocurrir ocasionalmente y dar lugar a la formación
de un locus duplicado en forma tándem de un locus original de co­
pia única (fig. 11-9).
11.3.3 Los acontecimientos de conversión génica
pueden ser más o menos frecuentes en DNA
de repetición tándem
Conversión génica describe una transferencia no recíproca de infor­
mación de secuencias entre un par de secuencias de DNA no aléli­
cas (conversión génica interlocus) o de secuencias alélicas (conversión
génica interalélicd). Una del par de secuencias que interactúan, el
d on a d or, permanece sin cambio alguno. La otra secuencia de
DNA, el acep tor, cambia por el reemplazo de alguna de sus secuen­
cias o la totalidad de ellas por una secuencia copiada de la secuen­
cia donadora (fig. 11-10). Por consiguiente el intercambio de
secuencias es direccional; la secuencia donadora modifica la secuen­
cia aceptora, pero lo contrario no pasa.
Un posible mecanismo de conversión génica considera la for­
mación de un heterodúplex entre una cadena de DNA del gen do­
nador y una cadena complementaria del gen aceptor. Tras la
formación del heterodúplex, la conversión de un segmento del gen
aceptor puede ocurrir mediante reparación incompatible -enzi­
mas de reparación del DNA reconocen que las dos cadenas de los
heterodúplex no son compatibles a la perfección y “corrigen” la se-
330 CAPÍTULO ONCE INESTABILIDAD DEL GENOMA HUMANO: MUTACIÓN Y REPARACIÓN DEL DNA

Replicación normal
1 2 3
5' CAG CAG CAG ► 3'
• • • • • i • • •
3' G TC G TC GTC GTC GTC G TC

l
CAG CAG CAG CAG CAG CAG

El deslizamiento retrógrado causa inserción

5' CAG CAG -> 3'

• • • » « «
3' GTC GTC GTC GTC - G TC - GTC
3 4 5 6

2
iÛ 3 4 5
CAG — CAG CAG CAG - CAG - CAG

El deslizamiento anterógrado causa deleción

I
5' CAG CAG CAG CAG CAG

Fig. 11-5. El pareamiento erróneo de cadena deslizada durante la replicación del DNA puede causar inserciones o deleciones.

Se piensa que las repeticiones tándem cortas son en particular propensas a pareamiento erróneo de cadena deslizada ( = pareamiento erróneo de las
cadenas de DNA complementarias de una doble hélice de DNA de cadena única). Los ejemplos muestran la form a en que el pareamiento erróneo de
cadena deslizada puede ocurrir durante la replicación; la cadena inferior representa una cadena de DNA parental y la superior indica la cadena comple­
mentaria recién sintetizada. En estos casos el deslizamiento incluye una reglón sin pareamiento (se muestra com o una burbuja) que contiene una o más
repeticiones de la cadena recién sintetizada (deslizamiento retrógrado) o de la cadena parental (deslizamiento anterógrado), que causan, respectiva­
mente, una inserción o una deleción en la cadena recién sintetizada. N ota: es concebible que el pareamiento erróneo de la cadena deslizada también
produzca inserciones/deleciones en el DNA no replicante. En estos casos se requieren dos reglones sin pareamiento, una que contienen repeticiones de
una cadena de DNA y la otra que incluye repeticiones de la cadena complementaria (véase Levinson y Gutman, 1987). Una enzima de reparación
incompatible podría introducir entonces una inserción o deleción para “ corregir” la falta de pareamiento.

cuencia del DNA de la cadena aceptora para que sea perfectamen­
te complementaria en la región convertida con la secuencia de la
cadena del gen donador (véase fig. 11-10).
La conversión génica está bien descrita en hongos en los que es
posible recuperar y estudiar los cuatro productos de la meiosis (aná­
lisis de tétrada). Esto no puede realizarse en humanos y mamíferos.
No es factible demostrar sin ambigüedad la conversión génica en or­
ganismos superiores porque nunca puede distinguirse de aconteci­
mientos de cruzamiento doble, por ejemplo (aunque cabría esperar
que los cruzamientos dobles que ocurren en proximidad muy cerca­
na fueran en extremo improbables). No obstante, existen numero­
sos casos en genomas de mamíferos en los que un alelo en un locus
 11.4 j MUTACIONES PATÓGENAS 331

X
CEN
X
A-

B-

GDI X
TT XX
X K = C
D- i “?®?_____ X X
Cruzamiento homólogo
igual en ) (
Intercam bio desigual
Gen de fusión Cruzamiento
de crom átides
desigual
— n m — hermanas
(CDI)
(IDCH)

r t +1 l o i r t n
Gen de fusión # ' ----■‘
c -M ! I 1— ( > D

Fig. 11-6. El cruzamiento homólogo igual puede originar genes de
fusión.
El ejemplo muestra la form a en que un cruzamiento intragénico igual
que ocurre entre alelos en cromátides no hermanas puede originar
genes de fusión nuevos compuestos de segmentos adyacentes de los
dos alelos. Obsérvese que los intercambios similares entre genes en
cromátides hermanas producen novedad genética porque cabria espe­
rar que las secuencias génicas en las cromátides hermanas que inte-
ractúan sean idénticas.
muestra un patrón de mutaciones que semeja con firmeza las que se
encuentran en alelos en otro locus de la misma especie, lo que su­
giere intercambios similares a la conversión génica entre locus.
Aunque las comparaciones simples de dos secuencias pueden ser
sugestivas, la prueba de conversión génica es más abrumadora
cuando un nuevo alelo mutante puede compararse directamente
con su secuencia progenitora. Ciertos locus muy mutables condu­
cen por sí mismos a este tipo de análisis. En particular algunos lo­
cus minisatélite hipervariables tienen tasas de mutación de línea
germinal altas (a menudo de 1% o mayores por gameto) y con fre­
cuencia las repeticiones individuales muestran diferencias de nu-
cleótido que permiten reconocer subclases de repetición. Las
mutaciones de línea germinal pueden estudiarse mediante la detec­
ción y la caracterización de alelos minisatélite mutantes en gametos
individuales. Para hacerlo se condujeron análisis por PCR de múl­
tiples alícuotas diluidas de DNA aislado del espermatozoo de un
individuo (PRC de fondo común pequeño,), en los que cada alí­
cuota se calibró para que contuviera unas cuantas, tal vez 100, mo­
léculas informativas (Jeffreys y cois., 1994).
Los productos de la PCR recuperados de fondos comunes indi­
viduales se tipifican para identificar cualquier nueva mutación que
dé como resultado un alelo nuevo cuya longitud muestra una dife­
rencia suficiente para distinguirlo del alelo progenitor. Los análisis
de los patrones de mutación de la línea germinal en tres de estos lo­
cus no reconocieron intercambios identificadores de flanqueo y
mostraron que la mayor parte de las mutaciones que ocurren en es­
tos locus es polar, e incluye la ganancia preferencial de unas cuan­
tas repeticiones en un extremo de un arreglo de repetición tándem.
Se observa una predisposición a la ganancia de repeticiones y la
prueba se obtuvo del intercambio no recíproco de secuencias entre
i +
CH j I I > - Q - e D— c b ----- ( V e
Fig. 11-7. El cruzamiento desigual y el intercambio desigual de
cromátides hermanas causan inserciones y deleciones.
Los ejemplos ilustran el pareamiento desigual de cromátides dentro de
una disposición de repetición tándem. El cruzamiento desigual com ­
prende pareamiento desigual de cromátides no hermanas seguido de
rotura y nueva unión de cromátides. El intercambio desigual de
cromátides hermanas incluye pareamiento desigual de cromátides her­
manas seguido de rotura y nueva unión de la cromátide. Para mayor
simplicidad, se muestra que las roturas de las cromátides ocurren
entre repeticiones, pero por supuesto pueden presentarse dentro de
repeticiones. Nota: ambos tipos de intercambios son recíprocos: una
de las cromátides participantes pierde parte del DNA, en tanto que la
otra gana un poco.
alelos, que sugirió conversión génica interalélica (Jeffrey y cois.,
1994). También se encontraron evidencias de conversión génica in-
terlocus en genes humanos, en especial en el gen de 21 -hidroxilasa
de esteroide (véase sección 11.5.3).
11.4 M utaciones patógenas
Por lo general las mutaciones perjudiciales afectan la expresión gé­
nica, ya sea por alteración directa de una secuencia de codificación
o mediante la modificación de secuencias intragénicas o extragéni-
cas importantes para la expresión génica (véase cuadro 16-1 para
las diferentes formas en que la expresión génica puede alterarse por
mutación). Casi todas las mutaciones patógenas registradas se
identifican en secuencias de codificación (sobre todo sustituciones
no sinónimas, mutaciones antisentido e inserciones/deleciones de
cambio de marco). A causa de esta mutabilidad más o menos alta,
el dinucleótido CpG suele localizarse en puntos críticos para mu­
tación patógena en el DNA de codificación (véase Cooper y cois.,
2000). Otros puntos críticos comprenden repeticiones tándem
dentro del DNA de codificación (véase más adelante). Entre las
332 j CAPITULO ONCE | INESTABILIDAD DEL GENOMA HUMANO: MUTACIÓN Y REPARACIÓN DEL DNA

v i......r (1 /4 ) R,
“ 3 “ CDI
Mutación ( •) »I I I—
I Ganancia de
~1 «T~
Í repetición mutante
i i — ( 2/5 )
X
I »1 I I—
Pérdida de
Í repetición normal

Diseminación de la ~ í «I ~«T I----- (2/4)

mutación a muchos X CDI
miembros de la «t I I-----
población de manera Ganancia de
que en este locus casi
todas las células tienen
Í repetición mutante
Fig. 11-9. La duplicación génica tándem puede deberse al cruza­

una repetición mutante
de cada cuatro
repeticiones (= 1/4)
i .
T . r . r . i i— (3/5) miento desigual o al intercambio desigual de cromátides hermanas
facilitados por repeticiones dispersas cortas.
~i r
La flecha doble de la parte inferior indica la extensión de la duplicación
Pérdida de
Í repetición normal génica tándem de un segmento que contiene secuencias del gen A y
de flanqueo. Un grado alto de homología secuencial e n te repeticiones
..■ .»t ~«t....a — (3'4)
no alélicas cortas (R1R2) podria facilitar el pareamiento erróneo original
de cromátides. Nótese que el mismo mecanismo puede producir dele-
etcétera

i
»1................ >1------ (4/4)
ciones a gran escala (véase fig. 16-3).

difícil medir la tasa de mutación perjudicial y no se contaba con

Fig. 11-8. El cruzam iento desigual en una disposición de repetición
tándem puede dar por resultado homogenización de secuencia.
Obsérvese que la diseminación inicial de la variante de secuencia nue­
va a la misma posición en los cromosomas de otros miembros de una
población sexual puede ocasionar deriva genética aleatoria (véase
recuadro 11-2). Una vez que la mutación alcanza una frecuencia de
población razonable (panel izquierdo) puede diseminarse a otras posi­
ciones dentro del arreglo (panel derecho). Esto puede ocurrir por
ganancia sucesiva de repeticiones mutantes com o resultado del cruza­
miento desigual (o intercambios desiguales de cromátides hermanas) y
la pérdida ocasional de repeticiones normales. Por últim o la repetición
mutante puede reemplazar la secuencia de repetición original en todas
las posiciones dentro del arreglo y dar lugar a homogenización de
secuencia para la repetición mutante. Se piensa que el resultado de
esta homogenización de secuencia es la evolución concertada especí­
fica de especie para secuencias de DNA repetidas. CDI, cruzamiento
desigual.
mutaciones intragénicas no codificantes son importantes las muta­
ciones en sitios de empalme y las que se efectúan en elementos con­
servados de las secuencias no traducidas. Las mutaciones de
secuencias no codificantes extragénicas incluyen mutaciones en los
elementos promotor y otros de control.
11.4.1 La tasa de mutación perjudicial es alta en
homínidos
La tasa mutacional de mutaciones neutrales (las que no son perju­
diciales ni ventajosas para el organismo que las porta) es fácil de
estimar si se deriva primero la tasa de cambio de alguna secuencia
que se supone neutral (sección 11.2.5). En contraste, suele ser más
estimaciones convincentes para ningún vertebrado hasta un estu­
dio publicado por Eyre-Walker y Keightley (1999). Ellos investi­
garon cambios de aminoácidos en 46 proteínas que ocurrieron en
la línea ancestral humana tras su divergencia de la del chimpancé.
Si todas las sustituciones no sinónimas eran neutrales, cabría espe­
rar 231 nuevas sustituciones en su muestra de 46 genes (con base
en una tasa promedio de mutación neutral de 0.0056 sustitucio­
nes no sinónimas por nucleótido y un total de 41 471 nucleótidos
investigados). Por el contrario, sólo se observaron 143 sustitucio­
nes no sinónimas; se supuso que las restantes 88 de estas sustitu­
ciones esperadas se eliminaron por selección natural porque eran
perjudiciales.
Eyre-Walker y Keightley (1999) estimaron una tasa perjudicial
de 1.6 mutaciones por persona por generación bajo el supuesto de
60 000 genes humanos. El nuevo cálculo basado en la estimación
más reciente de 30 000 genes con una secuencia de codificación
promedio de 1.6 kb proporciona una tasa perjudicial cercana a
0.84 de cada 2.2 mutaciones de DNA de codificación por persona
por generación. El DNA de codificación constituye menos de
I.5% del genoma humano y a partir de una tasa de mutación pro­
medio estimada de alrededor de 2.5 X 10 8 mutaciones por sitio
nucleótido, se calculó que la cifra total de mutaciones que ocurre
en el genoma diploide humano se aproxima a 175 por generación
(Nachman y Crowell, 2000).
II.4 .2 El genoma mitocondrial es un punto crítico para
mutaciones patógenas
A causa del tamaño muy grande del genoma humano, casi todas las
mutaciones tienen lugar en secuencias de DNA nuclear. En com­
paración, el genoma mitocondrial es un blanco pequeño de muta­
ción (alrededor de 1/200 000 del tamaño del genoma nuclear). A
diferencia de los genes nucleares, los mitocondriales se encuentran

en miles de copias en cada célula somática humana. Algunas célu-
-is. como las cerebrales y las musculares, tienen requerimientos de
■jsforilación oxidativa muy altos y por consiguiente más mitocon-
.irías. El oocito es excepcional, ya que posee alrededor de 100 000
moléculas de mtDNA, mucho más que las células somáticas.
En individuos normales alrededor de ~99.9% de las moléculas
¿e mtDNA es idéntico (homoplasmia). Sin embargo, si una nueva
mutación surge y se disemina en la población de mtDNA, habrá dos
genotipos de mtDNA muy frecuentes (heteroplasmia). Sí se consi­
dera que una mutación en el DNA mitocondrial debe surgir en una
molécula aislada de mtDNA, la intuición indica que cabría antici­
par que las posibilidades de que una mutación aislada de mtDNA se
fijara serían muy bajas y la tasa de mutación también baja de mane­
ra correspondiente. A partir de lo anterior puede esperarse que la
proporción de enfermedad clínica por una mutación patógena en el
genoma mitocondrial debe ser en extremo baja. Por el contrario, la
frecuencia de “trastornos mitocondriales” es bastante alta (sección
16.6.6) y el genoma mitocondrial puede considerarse como un pun­
to crítico (“punto caliente”) de mutación. Esto también es cierto pa­
ra el DNA mitocondrial animal en genera], en el que se informa que
las mutaciones se fijan a un índice casi 10 veces mayor que en se­
cuencias equivalentes en el genoma nuclear (Brown y cois., 1979).
Las explicaciones para el impacto patógeno y la mutabilidad al­
tos del mtDNA son varias. Noventa y tres por ciento del mtDNA
es DNA codificante (pero sólo 1.6% del DNA nuclear). Se piensa
que los intermediarios de oxígeno reactivo formados por la cadena
respiratoria causan un daño oxidativo sustancial al mtDNA (que, a
diferencia del DNA nuclear, no está protegido por histonas). Tam­
bién es necesario que el mtDNA efectúe muchas más rondas de re­
plicación que el DNA cromosómico. Las mitocondrias carecen de
un mecanismo adecuado de reparación del DNA y aunque en la ac­
tualidad se conocen varios sistemas de reparación del mtDNA bien
caracterizados, algunas mutaciones frecuentes no pueden repararse,
inclusive los dímeros de timidina (sección 11.6).
El problema de la forma en que las mutaciones del mtDNA se
fija n requirió la explicación de un cuello de botella de mtDNA en
el desarrollo. Tanto el número de células germinales como el de mi­
tocondrias por células fluctúan mucho durante la oogénesis. Por
consiguiente el feto femenino de tres semanas contiene el orden de
50 células germinales primordiales, cada una con unas 10 mitocon­
drias por célula, pero después el número de células se expande con
rapidez, de modo que alrededor de la novena semana el feto tendrá
más de medio millón de oogonias con 200 mitocondrias cada una.
Se piensa que el cuello de botella ocurre en una fase muy tempra­
na entre la etapa de la célula germinal primordial y la etapa de oo-
gonia cuando un número muy pequeño de células germinales
primordiales migra a la gónada y moléculas mutantes de mtDNA
pueden fijarse por derivación aleatoria y tal vez mediante selección
(véase p. ej., Jenuth y cois., 1996; Chinnery y cois., 2000).
11.4.3 Casi todas las mutaciones por empalme
[splicing) alteran una secuencia conservadora
necesaria para el empalme normal, pero algunas
ocurren en secuencias que no suelen requerirse
para empalme
Muchos genes se someten de manera natural a formas alternativas
de empalme (corte y unión) de RNA. Además las mutaciones pue­
den producir una forma aberrante de empalme de DNA que es pa­
11.4 MUTACIONES PATÓGENAS 333
tógena. En ocasiones esto conduce a la exclusión de secuencias de
exones completos del RNA maduro (omisión d e exón; véase más
adelante) o la retención de intrones completos. En otros casos el pa­
trón de empalme anormal excluye parte de un exón normal o pro­
duce nuevas secuencias exónicas. Las mutaciones de punto que
alteran una secuencia conservada que en condiciones normales se re­
quiere para el empalme de RNA son comparativamente frecuentes.
Sin embargo, en ocasiones es posible inducir el empalme aberrante
de un gen mediante la mutación de otros elementos secuenciales
que semejan secuencias d e donador d e em palme (= sitio de empalme
5') o aceptor d e em palm e (= sitio de empalme 3’) pero que no sue­
len participar en el empalme.
Las mutaciones que alteran secuencias son importantes
para el empalme
Las secuencias conservadas importantes para el empalme incluyen:
los dinucleótidos G Ty AG en esencia invariables, que se localizan
en el inicio (5') y el final (3') de un intrón respectivamente; las se­
cuencias intrónicas y exónicas justo adyacentes a las secuencias en
el donador de em palm e y el aceptor d e empalme, inclusive la vía d e
polipirim idina que precede al final de un intrón, y el sitio d e rami­
fica ción d e em palm e (fig. 1-15). Además se sabe que el empalme se
regula a través de secuencias intensificadoras d e em palm e (regulación
positiva) y secuencias silenciadoras d e em palm e (regulación negati­
va), que se encuentran tanto dentro de exones como de intrones.
Las secuencias intensificadoras de empalme exónico (LEE)
son secuencias discretas pero degeneradas de unos 6 a 8 nudeóti-
dos de largo que enlazan proteínas reguladoras de empalme
(Blencowe, 2000; sección 10.3.2). Están presentes en casi todos,
sí no es que la totalidad, de los exones (tanto de manera constitu­
tiva como empalmadas en forma alternativa) y en fecha reciente
se predijo un grupo de 10 secuencias típicas IEE para exones hu­
manos, algunas importantes para regular el reconocimiento del
donador o el aceptor de empalme (Fairbrother y cois., 2002). Las
secuencias silenciadoras de empalme exónico (SSE) y otros si­
lenciadores de empalme se comprenden mucho menos bien (Fair­
brother y Chasín, 2000).
Las mutaciones que alteran secuencias importantes para el em­
palme pueden tener las distintas consecuencias siguientes:
► reten ció n d e in tró n : que se debe a falla completa del empal­
me. Es más probable cuando el intrón es pequeño y la secuen­
cia vecina carece de sitios de empalme legítimos alternativos o
sitio s d e em p a lm e críp tico s (secuencias que semejan las se­
cuencias del sitio de empalme de consenso pero que el apara­
to de empalme no suele utilizar; véase fig. 11-11A). Se
requiere empalme para la salida eficiente de mRNA de los ge­
nes que contienen intrones (Lou y Reed, 1999) y por tanto la
retención de secuencias intrónicas en mRNA suele significar
que se retuvo mRNA en el núcleo para evitar el contacto con
la maquinaria de traducción (si se traduce, habría la posibili­
dad de aminoácidos inapropiados o de un cambio del marco
de lectura traduccional);
► o m isió n d e ex ón : el aparato de empalme emplea un sitio de
empalme legítimo alternativo. El resultado de las mutaciones
de una secuencia donadora de empalme suele ser la omisión
del exón corriente arriba; con frecuencia la mutación del
aceptor de empalme conduce a la omisión de exón corriente
abajo (fig. 11 -11A). Sin embargo, cabe señalar que también
son posibles otros resultados finales, inclusive el uso de sitios
334 CAPÍTULO ONCE INESTABILIDAD DEL GENOMA HUMANO: MUTACIÓN Y REPARACIÓN DEL DNA

A) A1 C)
Donador
la! Donador

I . . . T — £ ............... .. \ Aceptor
A X íHHHBHBHi I
Aceptor
In v a s ió n d e c a d e n a y
C o n v e rs ió n | a lé lic a
A1
Í fo rm a c ió n d e h e te ro d ú p le x

• G*

A2/A1/A2

B)

C o n v e rs ió n
i in te rlo c u s

B/A/B

* * * ’ * T Ksmk G mmm C * * * * * * *

a ■A mammC mm a G ■mh

Fig. 11-10. La conversión génica comprende intercambios de secuencias no recíprocos.

A) Conversión génica interalélica. Obsérvese la naturaleza no recíproca del intercambio de secuencias: la secuencia donadora no se altera pero la
secuencia aceptora se modifica por incorporación de la secuencia copiada de la secuencia donadora. B) Conversión génica interlocus. Se facilita por
un grado alto de homología secuencial entre secuencias no alélicas, como en las repeticiones tándem. C) Reparación incompatible de un heterodúplex.
Es uno de los varios posibles modelos para explicar la conversión génica. El modelo considera invasión por una cadena de ia secuencia donadora para
form ar un heterodúplex con la cadena complementaria de la secuencia aceptora, desplazando por consiguiente la otra cadena del aceptor. Las enzimas
de reparación incompatible reconocen las bases pareadas de modo erróneo en el heterodúplex y “corrigen” las incompatibilidades, de manera que la
secuencia aceptora se “convierte’’ para ser perfectamente complementaria en secuencias a la cadena donadora. La replicación subsecuente de la
cadena aceptora y el sellamiento de las muescas termina la conversión.

de empalme crípticos exónicos o intrónicos alternativos
(véase más adelante), y por tanto no siempre es fácil prede­
cir el resultado final -por ejemplo, véase Takahara y cois.,
(2002)-. Son factibles varios resultados finales cuando el
exón se omite. Si el número de nucleótidos en el exón no
puede dividirse por tres, un cambio de marco introducirá un
codón de terminación prematura, que a menudo resulta en
un transcrito de RNA inestable y no en un polipéptido. Si la
omisión del exón no causa un cambio de marco, la ausencia
de los aminoácidos que normalmente se codifican suele pro­
ducir un polipétpido no funcional anormal según la impor­
tancia de estos aminoácidos para la función, la estructura, o
ambos, de la proteína.
Las mutaciones de secuencias no suelen ser importantes
para el empalme de RNA
Los sitios de empalme crípticos (o latentes) semejan de manera
coincidental las secuencias de sirios de empalme auténticos pero
no suelen emplearse en el empalme a menos que: a) una mutación
altere de manera directa la secuencia de modo que el aparato de
empalme la reconoce ahora como un sitio de empalme (activación
directa), y b) ocurra una mutación en un sitio de empalme autén­
tico y dé lugar a falla de un donador o aceptor de empalme, en cu­
yo caso el aparato de empalme busca otras posibles alternativas y
selecciona un sitio de empalme crítico (activación indirecta, véase
la sección respecto a omisión d e exón antes). Como las secuencias
 11.4 MUTACIONES PATÓGENAS 335

(A)

Empalme normal

p *i

co
1 SD SA 2 SD -

Retención de intrón

i
i

co
1 u n m H á ISAl

I< I
cn
1 n ä [SA] 3
m

2 + intrón 2 + 3

(B)
Activación del sitio de empalme críptico

Activación del aceptor de empalme críptíco en el intrón 1

1 — sa

Exón 2 extendido
Activación del donador de empalme críptico en el exón 2

Exón 2 acortado

Fig. 11-11. Las mutaciones de empalme surgen por alteración de señales de empalme conservadas o por activación de sitios de empalme crípticos.
A) Alteración de señales de empalme conservadas. La mutación en secuencias del donador o el aceptor de empalme (véase fig. 1-15 para secuen­
cias consenso) puede dar por resultado: a) retención del intrón en la que hay una falla de empalme y no se extirpa una secuencia de intrón intermedia;
b) omisión de exón en la que el espliceosoma une entre sí los sitios donador y aceptor de empalme de exones no vecinos. Nota: en ocasiones una
mutación de sitio de empalme causa activación indirecta de un sitio de empalme críptico alternativo (que por lo general no se utiliza en el empalme), de
preferencia al emplear otro sitio de empalme legítimo; véase, p. e j„ Takahara y cois. (2002). B) Activación directa de sitios de empalme crípticos.
Una mutación puede activar en forma directa un sitio de empalme críptico al cambiar su secuencia para que se tom e más parecida a la secuencia con­
senso del donador o el aceptor de empalme. El sitio de empalme críptico alterado puede ahora ser reconocido y utilizado por el espliceosoma. Véase las
figuras 1 1 - 1 2 y 11-13 para ejemplos de activación de un sitio de empalme críptico exónico y uno intrónico respectivamente.
336 CAPÍTULO ONCE INESTABILIDAD DEL GENOMA HUMANO: MUTACIÓN Y REPARACIÓN DEL DNA

donadora y aceptora de empalme individuales a menudo muestran
cierta variación en las secuencias consenso que se muestran en la
figura 1-15, suelen observarse sitios de empalme crípticos dentro
de los genes. Si el mRNA alterado no se traduce, el uso de un si­
tio de empalme críptico ítitróníco introducirá nuevos aminoácidos;
el empleo de un sitio de empalme críptico exónico ocasionará una
delecíón de DNA de codificación (fig. 11-1 IB).
Para ejemplos elaborados de la activación de un donador de em­
palme críptico dentro de un exón y un aceptor de empalme críptico
dentro de un intrón véase las figuras 11-12 y 11-13 respectivamente.
El primero es un recordatorio que advierte que las mutaciones al pa­
recer silenciosas pueden ser patógenas. Cabe señalar que en algunos
casos las mutaciones que ocurren dentro de exones pero no en sitios
de empalme crípticos también pueden inducir omisión de dicho
exón (véase sección siguiente).
11.4.4 Las mutaciones que introducen un codón
de terminación prematuro a menudo dan
por resultado un mRNA inestable, pero otros
resultados finales son posibles
Varias clases de mutaciones pueden introducir un codón de termi­
nación prematuro (mutaciones de term inación d e cadena). Las mu­
taciones sin sentido producen un codón de terminación prematuro
mediante la simple sustitución de un codón normal con un codón
de detención. Las inserciones y deleciones en el cambio de marco
también suelen introducir un codón de terminación prematuro no
muy lejos corriente abajo del sitio de mutación. Esto se debe a que
no existe una presión de selección para evitar codones de detención
en los otros marcos de lectura traduccionales y por consiguiente,
con base en las frecuencias de nucleótidos establecidas, suele encon­
trarse cuando menos un codón de detención dentro de una tira de
100 nucleótidos corriente abajo del sitio de mutación. Una varie­
dad de mutaciones en el sitio de empalme también puede introdu­
cir un codón de terminación prematuro, por ejemplo, por omisión
de un exón aislado que contiene varios nucleótidos que no pueden
dividirse por tres. Las mutaciones de terminación de la cadena tie­
nen diversas consecuencias potenciales para la expresión génica:
► mRNA inestable. Es con mucho la consecuencia más frecuen­
te. Un mRNA que lleva un codón de terminación prematuro
cuando menos 50 nucleótidos corriente arriba de la última
unión de empalme suele degradarse con rapidez in vivo por una
forma de vigilancia d el RNA que se conoce como decaimiento
de mRNA mediado sin sentido (DMSS); véase Lykke-Ander-
sen y colaboradores (2001); Maquat (2002). Ello puede evitar
las posibles consecuencias letales de la formación de un polipép-
tido truncado que podría interferir con funciones vitales de la
célula;
► p o lip ép tid o tru n ca d o. El DMSS asegura que rara vez ocurran
in vivo polipéptidos truncados, pero depende del empalme. Por
consiguiente es posible que las mutaciones sin sentido en 1 de
alrededor de 5% de los genes humanos que carecen de intrones
(cuadro 9-5) produzcan polipéptidos truncados. Puede ser di­
fícil predecir el efecto de los polipéptidos truncados y depen­
derá, entre otras cosas, de la extensión del truncamiento, la
estabilidad del producto polipéptido y su capacidad para inter­
ferir con la expresión de alelos normales;
► om isión d e exón. En un pequeño subgrupo de mutaciones sin
sentido los posibles efectos perjudiciales en la expresión génica
pueden mitigarse por un proceso denominado empalme alte­
rado asociado sin sentido (EASS); véase Wang y colaborado­
res (2002). En este caso el patrón de empalme normal se altera,
por ejemplo, por omisión de exón, de manera que el codón de
detención se “brinca” y se produce un mRNA estable que ca­
rece de mutación. Algunos autores piensan que la existencia de
EASS implica que debe haber cierto mecanismo de traducción
nuclear que permite que los codones se lean antes de exportar­
se el mRNA al citoplasma. Sin embargo, una explicación alter-

Exón 16 \ Exón 17
G lu Gl¡ Lis Gli Lis Tre S e r P ro A s p Lis G ln Lis G ln S e r P ro G ln |nt ró n 1 6 P ro G ln P ro ®e r S e r A sp
L . GAG GGC AAA GGC AAA ACA AG C C C T GAT AAG CAA AAG CAG TC C CCA CAG gt---------- ag C( C A C A G C C T G G C A G C T C T G A T .......

\ \ \ l \' ' 1 1 1 /
AGGGTAAAG Nuevo sitio donador de empalme

" '¡ i '"

Exón 16 ♦ Intrón 16 Exón 17
... G A G G g ta a a g - -a g C C A C A G C C T G G C A G C T C T G A ... .
G lu A ; la Tre A la T rp G ln Leu D E T E N C IÓ N

Fig. 11-12. Cuando una mutación silenciosa no es silenciosa.

Este ejemplo muestra una mutación que se identificó en un paciente con distrofia muscular de la cintura de los miembros LGMD2A. La mutación se
encontró en el gen 3 de calpaína, un locus conocido por esta forma de distrofia muscular, pero ocurrió en la posición de la tercera base de un codón y al
parecer era una mutación silenciosa. Conduciría al reemplazo de un codón de glicina (GGC) por otro codón de glicina (GGT). Sin embargo, se piensa que
la mutación es patógena. La sustitución causa la activación de una secuencia donadora de empalme críptico (AGGG£AAAAG) dentro del exón 16 que
origina un empalme aberrante con pérdida de la secuencia de codificación del exón 16 y la introducción de un cambio de marco. Véase Richard y
Beckman (1995). Nota: otra posibilidad de mutaciones sinónimas patógenas son las que ejercen su efecto mutando una secuencia intensificadora de
empalme exónico (sección 11.4.3).
 11.5 | POTENCIAL PATÓGENO DE SECUENCIAS REPETIDAS 33“

Exón 1 Exón 2 Exón 3

gt -CCCTTCCCACG-
Sitio de

¡
empalme críptico

_\ \ \ \ 1 1 1 / ^
IÜL - CCCTTCCCAGG -
' i I I I I \\ \
Sitio de empalme
críptico activado

Exón 2A
g t --------------- CCCTTCCCA G ag

Fig. 11-13. Las mutaciones pueden causar empalme anormal de RNA por activación de sitios de empalme crípticos.

Activación de una secuencia aceptara de empalme críptico localizada dentro de un intrón (compárese la fig. 11-12 que ilustra la activación de un sitio
donador de empalme críptico dentro de un exón). Una mutación puede ocasionar la alteración de una secuencia que no es importante para el empalme
de RNA de manera que crea un nuevo sitio de empalme alternativo. En el ejemplo que se ilustra, se considera que la mutación cambia un nucleótido ais­
lado en el intrón 1. El nucleótido se presenta dentro de una secuencia de sitio de empalme críptico que está estrechamente relacionada con la secuencia
consenso aceptora de empalme (véase fíg. 1-15), pero no tiene el dinucleótido AG conservado. La mutación supera esta diferencia, mediante la acti­
vación del sitio de empalme críptico para que compita con el sitio aceptor de empalme natural. Si lo utiliza el aparato de empalme, resulta un exón nue­
vo, exón 2A, que contiene la secuencia adicional que puede o no producir un cambio de marco.

nativa para la mayor parte, si no es que la totalidad, de los ca­
sos de EASS es que la mutación sin sentido altera un in ten si-
fi c a d o r d e em p a lm e ex ón ico (véase sección 11.4.3; y Maquat,
2002 para conceptos alternativos respecto a la forma en que el
EASS se activa).
11.5 Potencial patógeno de secuencias
repetidas
El genoma humano tiene una proporción muy alta de secuencias de
DNA repetidas (secciones 9.5 y 9.6), que son propensas a variación
en el número de copias y el intercambio de secuencias (cuadro 11-6).
Una disminución del número de repeticiones suele causar una dele-
ción patógena, pero la expansión por duplicación de secuencias
también puede ser patógena (véase Mazzarella y Schlessinger, 1998).
Ciertas regiones cromosómicas, en especial las subteloméricas y pe-
ricentroméricas, alojan grandes tramos de DNA duplicado y la ines­
tabilidad de estas regiones puede predisponer a enfermedad (véase
Eichler, 1998). También es posible que las repeticiones dispersas
produzcan mutaciones patógenas por una diversidad de mecanis­
mos (cuadro 11-6).
11.5.1 El pareamiento erróneo de cadena deslizada
de repeticiones tándem cortas predispone
a deleciones patógenas e inserciones
de cambio de marco
Las inserciones y deleciones en el DNA de codificación son raras
porque suelen introducir un cambio de marco traduccional. Sin
embargo, en ocasiones ocurre por azar una serie de repeticiones
tándem de un número pequeño de nucleótidos en la secuencia de
codificación para un polipéptido. Como los locus microsatélite, es­
tas repeticiones son propensas a mutación por pareamiento erróneo
de cadena deslizada. En consecuencia el número de copias de repe­
ticiones tándem está sujeto a fluctuaciones, introduciendo una de-
leción o una inserción de una o más unidades repetidas. Si la
mutación se presenta en el DNA que codifica un polipéptido, con
frecuencia la deleción resultante tendrá un efecto profundo en la
expresión génica. En condiciones normales las deleciones de cam­
bio de marco suprimen la expresión génica y pueden ser frecuentes.
Aun si la deleción no produce un cambio de marco, las deleciones
de uno o más aminoácidos pueden ser patógenas (fig. 11-14). Tam­
bién cabrá esperar que las inserciones pequeñas de cambio de marco
conduzcan a la pérdida de expresión génica y a menudo la inserción
es una repetición tándem de las secuencias que la flanquean. Sin em­
bargo, con frecuencia no cabría anticipar que las inserciones sin cam­
bio de marco sean patógenas, a menos que la inserción ocurra en una
región de importancia crítica y desestabilice una estructura esencial o
impida de alguna manera la función génica.
11.5.2 La expansión inestable de repeticiones tándem
cortas puede causar una diversidad de
enfermedades, pero el mecanismo mutacional
no se comprende bien
Ciertas repeticiones tándem cortas dentro de un gen o en la cerca­
nía inmediata del mismo pueden expandirse a longitudes conside­
rables y afectar la expresión génica, lo que causa enfermedades. A
veces una repetición expandida en forma moderada que origina
338 i CAPÍTULO ONCE | INESTABILIDAD DEL GENOMA HUMANO: MUTACIÓN Y REPARACIÓN DEL DNA
Cuadro 11-6. Las secuencias de DNA repetidas a menudo contribuyen a la patogénesis.
Tipo de DNA repetido Tipo de mutación
R epeticiones tándem
Repeticiones muy cortas entre los genes Deleción
Inserción de cambio de marco
Expansión de tripleto repetido
Repeticiones intragénicas de tamaño moderado Deleción intragénica
Deleción génica parcial o total
CDI/lDCHa (fig. 11-7)
Repeticiones tándem grandes que contienen Alteración de la secuencia génica
genes completos Conversión génica (fig. 11-10)
Repeticiones dispersas
Repeticiones directas cortas Deleción
Elementos repetidos dispersos (p. ej., Deleción/replicación
repeticiones Alu)
Repeticiones invertidas Inversión
Repeticiones largas con número de copias bajo Deleción/duplicación a gran escala
Elementos transposables activos Inserción intragénica por retrotransposones
aCDI, cruzamiento desigual; IDCH, intercambio desigual de cromátide hermana.
una enfermedad puede ser del todo estable y propagarse a través de
varias generaciones sin cambiar de tamaño. Sin embargo, en otros
casos la repetición expandida es inestable. El descubrimiento de que
las enfermedades humanas pueden ser ocasionadas por una expan­
sión a larga escala de repeticiones de trinucleótidos muy inestables
resultó un hecho muy inesperado (los estudios en otros organismos
no revelaron precedentes de este fenómeno), pero en la actualidad la
lista de ejemplos en humanos es considerable (véase cuadro 16-6).
Aunque son factibles 64 posibles secuencias de trinucleótidos,
cuando se toleran permutaciones cíclicas (CAG)„ = (AGC)„ =
(GCA)„ y se leen de cualquier cadena [S’fCAG), en una cadena
= 5'(CTG)n en la otra], sólo hay 10 repeticiones de trinucleótidos
diferentes a nivel del DNA genómico (fig. 11-15). Además de la ex­
pansión inestable de la repetición de tripletos, la mayor parte de los
alelos de enfermedades en el gen B de cistatina que causa epilepsia
mioclónica progresiva incluye la expansión de una repetición de 12
nucleótidos (C)4G(C)4GCG (Lalioti y cois., 1997). Como se deta­
lla en el cuadro 16-6, los genes que contienen repeticiones tándem
cortas en expansión inestables corresponden a las dos clases mayo­
res siguientes según el tamaño de la expansión y su localización:
► ex p an sion es m od era d a s (CAG)n q u e resu ltan en tra yectos
d e p oliglu ta m in a . El codón CAG especifica glutamato. Los lí­
mites no patógenos, estables, son de 10 a 30 repeticiones; los
alelos patógenos inestables suelen tener entre 40 y 200 repeti­
ciones. El trayecto de poliglutamina expandido da lugar a que
la proteína se agregue dentro de ciertas células y las destruya;
Mecanismos y ejemplos
Pareamiento erróneo de cadena deslizada (véase fig.
11-5). Ejemplos en la figura 11-14
Pareamiento erróneo de cadena deslizada
¿Inicialmente por pareamiento erróneo de cadena
deslizada?; expansión subsecuente a gran escala por
un mecanismo desconocido
CDI/IDCHa (véase fig. 11-7)
Ejemplos en la figura 11-16
Ejemplos en las figuras 11 -16 y 11 -17
¿Pareamiento erróneo de cadena deslizada o
recombinación intracromátide?
CDI/IDCH3 (véase sección 11.5.4)
Intercambio intracromátide, p. ej., factor VIII (véase fig.
1 1 -20)
CDI/IDCH3 (véase cuadro 11-7 y fig. 11-19)
Retrotransposición. Para ejemplos véase sección 11.5.6
► ex pansiones d e rep etició n no co d ifica n tes m u y gra n d es. Va­
rios tipos de repeticiones (p. ej., CGG, CCG, CTG, GAA) que
se encuentran en secuencias no codificantes (el promotor o las
regiones no traducidas o secuencias intrónicas) sufren expan­
siones muy grandes. Las expansiones inhiben la expresión de
genes muy cercanos y originan pérdida de la función. Por lo ge­
neral los alelos no patógenos, estables, tienen 5 a 50 repeticio­
nes; los alelos patógenos inestables poseen varios cientos a miles
de copias (véase cuadro 16-6). N ota: algunas expansiones muy
grandes de repeticiones tándem no codificantes cortas sólo afec­
tan la estructura del cromosoma, y originan sitios frá giles, pe­
ro no producen enfermedad (tal vez porque no se localizan cerca
un gen importante). Los ejemplos incluyen FRAXF y FRA16A
(ambas debidas a expansión de CCG).
En cada caso las repeticiones por debajo de una cierta longitud um­
bral son estables en la mitosis y la meiosis, pero se tornan en extre­
mo inestables arriba de la longitud umbral. Las repeticiones
inestables casi nunca se transmiten sin cambio del padre al hijo.
Aunque pueden ocurrir tanto expansiones como contracciones, se
observa una predisposición a las primeras. A menudo el cambio
promedio de tamaño depende del sexo del padre transmisor y tam­
bién de la longitud de la repetición.
La naturaleza del mecanismo de expansión aún no se compren­
de con claridad (véase Djian, 1998; Sinder y cois., 2002). Se consi­
dera que el pareamiento erróneo de cadena deslizada (véase fig.
11-5) es un probable componente del mecanismo de expansión,
 11.5 POTENCIAL PATÓGENO DE SECUENCIAS REPETIDAS 339

141 142 143 144 145 35 36 37 38 39

I I I""". I i i I I I I f" I
GCC ATT TTT GGC C T T .......... TCA GAC ATA TAC C A A ......
AT AAT
j3
{CFTR) 'jjjl {CFTR)
I
141
I I
142
II
143
II
144
II
145
I
35 |._36 j
I
37
II
38 39
II''
GCC A T T T T * G G C C T T ______ TCA GAC A T **A C CAA

I
329
I
330 331 332
i
333
i
168
I
169
I I I i i
170 171 172 (
CCA CTT G TT GAC CGA GAA ATA G A T AGT C T T .......
ATTG AATAG
{FIX)
329 330 331
{APC) #
332 168 169 170 171
I I I
CCA CTT G * * *A C CGA GAA ATA G ** ❖* T C TT

114 115 116 117 118 119 16 17 18 19 20 21

I I II I I r "" i l
GAT T C T TA T C T T ATG AAC G G C AAG G TG AAC G TG AAC
A CTTAT AAAGGTG
{XPAC) EL
114 115 116 117 118 {HBB) 16 17 18 19
I I ll I i i ...... I
GAT T C T TA T ❖ ❖ ❖ AA C GGC * * * * * * AAC GTG AAC

Fig. 11-14. Las repeticiones tándem cortas son puntos críticos de deleción/inserción.

Las seis deleciones que se ¡lustran son ejemplos de deleciones patógenas que se observan en unidades de repetición tándem de 1 a 6 pb. Las dele-
ciones de 3 y 6 pd no causan cambios de marco y se piensa que la patogénesis se debe a eliminación de uno o dos aminoácidos que tienen importan­
cia crítica para la función polipéptida. Nota: en ia deleción de 6 pb, la repetición tándem original no es perfecta. Los genes (y las enfermedades
relacionadas) son: CFTR, regulador transmembrana de fibrosis quística; FIX, factor IX (hemofilia B); APC, poliposis adenomatosa dei colon; XPAC, grupo
de complementación de xerodermia pigmentosa C; HBB, globina 0 (talasemia p ). Aunque no se ilustra aquí, a menudo las inserciones pequeñas son
repeticiones tándem de secuencias que las flanquean.

puesto que se observó que al parecer las repeticiones interrumpidas
son estables y sólo las repeticiones homogéneas son inestables. Por
ejemplo, en la ataxia espinocerebelosa tipo 1, uno o dos tripletos
CAT interrumpieron 123/126 repeticiones CAG de tamaño nor­
mal, en tanto que 30/30 alelos expandidos (CAG)„ no contenían
alguna interrupción (Chung y cois., 1993). No obstante, aún no se
aclara por qué los cambios en la longitud están predispuestos a ex­
pansión. El conocimiento de la expansión de repeticiones inesta­
bles progresa con rapidez; para mayor información se aconseja al
lector consultar una revisión reciente.
mátides hermanas) entre un gen funcional y un seudogén rela­
cionado puede dar por resultado la deleción del gen funcional o
la formación de genes de fusión que contienen un segmento de­
rivado del seudogén. De manera alternativa el seudogén puede
actuar como una secuencia donadora en acontecimientos de con­
versión génica e introducir mutaciones perjudiciales en el gen
funcional.
El ejemplo clásico de patogénesis por intercambios entre gen y
seudogén es la deficiencia de 21-hidroxilasa de esteroides en la que
más de 95% de las mutaciones patógenas se origina como resultado

A A C /G T T A G G /C C T
11.5.3 Las familias de repetición tándem y de genes A A G /C T T A T C /G A T
agrupados pueden ser propensas a cruzamiento A A T /A T T
desigual patógeno y a acontecimientos
A C C /G G T C A G / C T G
semejantes a la conversión gánica A C G /C G T C C G /C G G
A C T /A G T
Muchos grupos génicos de humanos y mamíferos contienen seu-
dogenes no funcionales que pueden relacionarse en forma cerca­
na con miembros de genes funcionales. Los intercambios de Fig. 11-15. Las 10 posibles repeticiones de trinucieótidos.
secuencia interlocus entre seudogenes y genes funcionales pue­
Se muestran ambas cadenas de DNA. Todas las otras repeticiones de
den ocasionar una enfermedad por eliminación o alteración de
trinucieótidos son permutaciones cíclicas de una u otra de éstas
algunas o la totalidad de las secuencias de un gen funcional. Por
(véase texto).
ejemplo, el cruzamiento desigual (o intercambio desigual de cro-
340 CAPITULO ONCE | INESTABILIDAD DEL GENOMA HUMANO: MUTACIÓN Y REPARACIÓN DEL DNA

— 30 kb -3 0 kb------*■
C4A 21A C4B 21B,

\|/21 -OH

I
C4A
Pareamiento desigual de cromátides
hermanas o no hermanas

21A C4B 21B

i— ■
C4A 21A C4B 21B
CDI/IDCH ¡Conversión génica|

~ 25% de mutaciones ~ 75% de mutaciones

patológicas en el gen 21-OH patológicas en el gen 21-OH
21A

1 XX2 “Micro”
conversión
■ 27B

l
Rotura y nueva
unión (1 o 2)

C4A 21A/21B
Gen 21-OH mutante
Gen de fusión 21-OH (inactivo)
que contiene mutaciones
C4A 21A inactivadoras del seudogen

Deleción del gen 21-OH

Clave:
....... Mutaciones inactivadoras (véase fig. 11-17)

Fig. 11-16. Casi todas las mutaciones del gen de 21-hidroxilasa se deben a intercambio de secuencias con un seudogén relacionado de manera
cercana.
Los genes duplicados del complemento C4 y los genes de 21-hidroxilasa de esferoides se localizan en repeticiones tándem de 30 kb que muestran
alrededor de 97% de identidad de secuencia. Tanto los genes C4A como C4B se expresan para dar productos del complemento C4; el gen CYP21B
(21B) codifica un producto 21-hidroxilasa, pero el gen CYP21A (21A) es un seudogén. Alrededor de 25% de las mutaciones patológicas en el locus de
21-hidroxilasa incluye una deleción de 30 kb que resulta de cruzamiento desigual (CDI) o intercambio desigual de cromátides hermanas (IDCH). Las
mutaciones restantes son mutaciones de punto en las que ocurre conversión génica a pequeña escala del gen CYP21B -u n segmento pequeño del gen
CYP21A que contiene mutaciones perjudiciales se copia e inserta en el gen CYP21B- reemplazando un segmento corto de la secuencia original (véase
fig. 11-10C para un posible mecanismo). Los posibles acontecimientos de conversión génica son, como CDI e IDCH, cebados por pareamiento desigual
de las repeticiones tándem en cromátides hermanas o no hermanas.

de intercambios de secuencias entre el gen de 21-hidroxilasa fun­
cional, CYP21B, y un seudogén relacionado de modo muy cerca­
no, CYP21A. Los dos genes se encuentran en segmentos de DNA
de repetición tándem de unas 30 kb de largo que también contie­
nen otros genes duplicados, en especial los genes del complemento
C4, C4A y C4B. Las deleciones patógenas grandes siempre ocasio­
nan la eliminación de alrededor de 30 kb de DNA (que correspon­
den a la longitud de una unidad de repetición) que contienen la
secuencia génica CYP21B (véase fig. 11-16). También se observan
deleciones no patógenas de la misma longitud porque algunas ve­
ces la unidad de repetición C4A + CYP21A está eliminada (y por
tanto el gen funcional CYP21B se conservó), y los genes C4/21-
OH muestran una forma de polimorfismo de locus NVRT a gran
escala con diferentes alelos que contienen una, dos, tres o cuatro de
las unidades de 30 kb (Collier y cois., 1989).
Casi la totalidad de 75% de las mutaciones de punto patógenas
se copia de mutaciones perjudiciales en el seudogen, lo que sugiere
un mecanismo de conversión génica (véase figs. 11-16 y 11-17). El
análisis de una de estas mutaciones que surgió de novo sugiere que
el trayecto de conversión tiene un máximo de 390 pb (Collier y cois.,
1993). Asimismo se encuentran acontecimientos de conversión gé­
nica en los genes C4 duplicados y ambos se expresan en forma nor­
mal. Un acontecimiento que tal vez prepara las conversiones en el
grupo génico CYP21-C4 es el pareamiento desigual de cromátides
de manera que una unidad CYP21A-C4A se parea con una unidad
CYP21B-C4B (véase fig. 11-17).
 11.5 POTENCIAL PATÓGENO DE SECUENCIAS REPETIDAS 541

Localización de Secuencia gènica Secuencia del Secuencia del

la mutación normal 21 -OH seudogen 21 -OH gen mutante 21 -OH
(CYP21B ) (CYP21A)

Intrón 2 CCCA©CTCC CCCAGCTCC CCCAGCTCC

Exón 3 GGA GAC TAC TC G (..... ...,)TC G(...........)TC
(codones 110-112) Gli Asp Tir Ser
Val
Exón 4 ATO ATC TGT ATC AAC TGT ATC AAC TGT
(codón 172) lie lie Cis lie Asn Cis

Exón 6 A«C GTG GAG ATG AAC GAG GAG AAG AAC GAG GAG
(codones 235-238) lie Val Glu Met Asn Glu Glu Lis

Exón 7 CAC GTG CAC CAC TTG CAC CAC TTG CAC
(codón 281) His Val His His Leu His

Exón 8 CAC CAG GAG CTG TAG GAG CTG TAG GAG
(codón 318) His Gin Glu Leu DETENCIÓN

Exón 8 CTG CGG CCC CTG TGG CCC CTG TGG CCC
(codón 356) Leu Arg Pro Leu Tri Pro

Fig. 11-17. Las mutaciones de punto patógenas en el gen de 21-hidroxilasa de esteroides se originan por copiado de secuencias del seudogen de
21-hidroxilasa.

Se piensa que el copiado incluye un mecanismo similar a la conversión génica (véase figs. 11-16 y 11-10C).

11.5.4 A menudo las repeticiones dispersas
predisponen a deleciones y duplicaciones
grandes
Repeticiones directas cortas
En varios casos los puntos finales de deleciones están marcados por
repeticiones directas muy cortas. Por ejemplo, los puntos de rotura
en numerosas deleciones patógenas en mtDNA ocurren en repeticio­
nes directas cortas perfectas o casi. La más frecuente de éstas es una
deleción de 4 977 pb que se identificó en múltiples pacientes con sín­
drome de Kearns-Sayre, una encefalopatía que se caracteriza por of-
talmoplejía externa, ptosis, ataxia y cataratas. La deleción ocasiona la
eliminación de las secuencias intermedias entre dos repeticiones de
13 pb perfectas y la pérdida de secuencias de una de las repeticiones
(fig. 11-18). El genoma mitocondrial es deficiente en recombinacio­
nes y Shoffner y colaboradores (1989) postularon que estas delecio­
nes surgen por un mecanismo de deslizamiento de replicación similar
al que se observa en repeticiones tándem cortas (fig. 11-5). Las du­
plicaciones parciales del genoma mitocondrial también son caracte­
rísticas distintivas de ciertas enfermedades, en especial el síndrome de
Kearns-Sayre. Los extremos de las secuencias duplicadas, como los de
las deleciones comunes, suelen estar marcados por repeticiones direc­
tas cortas y al parecer los mecanismos de duplicación y deleción se re­
lacionan muy de cerca (véase Poulton y Holt, 1994).
La repetición Alu como un punto critico de recombinación
Algunas deleciones e inserciones a gran escala pueden generarse por
pareamiento de repeticiones dispersas no alélicas, seguido de rotura y
nueva unión de fragmentos de cromátides. Por ejemplo, la repetición
Alu ocurre alrededor de una vez cada 3 kb y se sugiere que el parea­
miento erróneo entre esas repeticiones es una causa frecuente de de­
leciones y duplicaciones. Ciertos genes grandes tienen muchas
secuencias Alu internas en sus intrones o secuencias no traducidas,
lo que los expone a deleciones y duplicaciones internas frecuentes.
Por ejemplo, la repetición Alu ocurre una vez cada 1.5 kb en el gen
del receptor de lipoproteína de densidad baja de 45 kb. Es probable
que una frecuencia muy alta de deleciones patógenas en este gen in­
cluya una repetición Alu, por lo general en ambos puntos finales, y
duplicaciones intragénicas patógenas ocasionales comprenden tam­
bién repeticiones Alu (véase Hobbs y cois., 1990). Tales observaciones
sugieren una función general para las secuencias Alu en la promoción
de recombinación y acontecimientos similares a esta última. Es pro­
bable que las duplicaciones génicas iniciales en la evolución de fami­
lias multigénicas agrupadas hayan incluido un acontecimiento de
cruzamiento desigual entre repeticiones Alu u otros elementos de re­
petición dispersos. Sin embargo, cabe señalar que algunos genes con
abundancia de Alu no parecen ser locus para las recombinaciones
mediadas por Alu frecuentes.
Repeticiones largas con número de copias bajo
La secuenciación de la porción eucromática del genoma humano
reveló múltiples ejemplos de secuencias con un bajo número de co­
pia dispersas que mostraban homología de secuencia muy alta (con
frecuencia >95% de identidad secuencial) que a menudo se exten­
día en decenas a cientos de kilobases. Por lo general las secuencias
repetidas de este tipo experimentaron duplicaciones evolutivamen­
te recientes, específicas de primates denominadas d u p lica cion es
segm en ta ria s (sección 12.2.5). La homología secuencial muy alta
en estas regiones largas predispone a una recombinación desigual
entre las repeticiones (también llamadas d u p licon es). Cuando estas
repeticiones relacionadas de manera cercana se encuentran en dife­
rentes cromosomas, es posible que predispongan a translocación. Si
se presentan en el mismo cromosoma a menudo predisponen a re­
combinación homologa desigual (= no alélica) que puede causar
deleciones y duplicaciones a gran escala.
342 CAPÍTULO ONCE INESTABILIDAD DEL GENOMA HUMANO: MUTACIÓN Y REPARACIÓN DEL DNA

C C T C C G T A G A C C T A A C C A -------------A = 7 6 6 4 p b --------------C C T C C T A G A C C T A A C C T
* ♦
TCACAGCCC -A = 7 7 2 3 p b - TCACAGCCC
♦ f !
A A C A A C C C C C ------ A = 4 4 2 0 p b A A C A A C C C C C

AGGCGACC A = 7 521 p b

CCTCCAT- - A = 7 565 pb

A C C T C C C T C A C C A ------- A = 4 9 7 7 p b

_L _L _L _L
6 000 7 000 8 000 9 000 10 000 11 000 12 000 13 000 14 000 15 000 16 000 17 000

Fig. 11-18. Las repeticiones directas cortas marcan los puntos finales de muchas deleciones patógenas en el genoma mitocondrial.
Nota: como las mitocondrias son deficientes en recombinación, un posible mecanismo para explicar las deleciones es el pareamiento erróneo de cadena
deslizada (véase texto).

Las deleciones mediadas por duplicón, y en menor grado las du­
plicaciones, que se extienden en intervalos de megabases suelen ser pa­
tógenas (Stankiewcz y Lupski, 2002; véase cuadro 11-7 y fig. 11-19)
y ocasionan pérdida de la función génica o una dosis génica alta
inapropiada para los genes sensibles a dosis contenidos en los inter­
valos. Estos reordenamientos no suelen resolverse mediante análisis
citógenos estándar y con frecuencia se clasifican (desde un punto de
vista cromosómico) como microdeleciones y microduplicaciones. A
causa de la prevalencia ampliamente diseminada de las duplicacio­
nes segmentarias en el genoma humano, es posible que la contribu­
ción de los duplicones a la patogénesis sea muy considerable
(Stankiewicz y Lupski, 2002).
11.5.5 Las inversiones patógenas pueden producirse
mediante recombinación intracromátide entre
repeticiones invertidas
En ocasiones se localizan repeticiones invertidas apretadas con una
gran identidad de secuencias dentro de un gen o cerca del mismo.
El alto grado de similitud secuencial entre repeticiones invertidas
puede predisponer al pareamiento de las repeticiones por un meca­
nismo que incluye el retrodoblamiento de una cromátide sobre sí
misma. La rotura subsecuente de la cromátide en las repeticiones de
pareamiento erróneo y la reunión pueden resultar después en una
inversión, en gran parte de la misma manera que los mecanismos

Cuadro 11-7. Las repeticiones con número de copias bajo pueden predisponer a deleciones y duplicaciones patógenas a gran escala
Carácter/síndrome Gen(es) Localización Tipo de Tamaño Tamaño de
cromosomica reordenamiento (kb) duplicón (kb)

Infertilidad masculina (AZFa) DBY, USP9Y Yq11.2 Del 800 10

Infertilidad masculina (AZFc) RBMY, DAT? Yq11.2 Del 3 500 229

Síndrome de Williams Beuren ELN, GTF2I 7q11.23 Del 1 600 320

Síndrome de Prader-Willi ? 15q12pat Del 3 500 500

Síndrome de Angelman UBE3A 15q12mat Del 3 500 500

Síndrome de Smith Magenis ? 17p11.2 Del 3 700 200

Síndrome de DiGeorge/VCF TBX1,? 22q1 1.2 Del 3 000/1 50CI 225-400

Neuropatía periférica (CMT1A) PMP22 17p12 Dup 1 400 24

Neuropatía periférica (HNPP) PMP22 17p12 Del 1 400 24

Resumido de Stankiewicz y Lupski (2002). Curr. Opin. Genet. Dev. 1 2 ,312-319, con autorización de Elsevier.
 11.5 | POTENCIAL PATÓGENO DE SECUENCIAS REPETIDAS 543

Centròmero Telómero

Deleciones -29 0 kb NPHP1

Inversiones

Deleciones comunes ~1.6 Mb WBS

BP1 BP2 BP3A BP3B BP4

Deleciones clase I - 4 Mb PWS/AS

Deleciones clase II - 4 Mb

SMS-REP SMS-REP SMS-REP

proximal medio distal

Deleciones raras SMS

Deleciones comunes ~4 Mb

LCR22-A LCR22-B LCR22-C LCR22-D

■■■ *
DGS/
Deleciones raras -1 .5 Mb
VCFS
Deleciones comunes ~3 Mb

Fig. 11-19. Estructura compleja de repeticiones de copia baja (RCB) seleccionadas relacionadas con enfermedad en humanos.

Obsérvese la estructura compleja de las RCB que consiste tanto en repeticiones directas (puntas de flecha en la misma dirección) como repeticiones
invertidas (puntas de flecha en direcciones opuestas). Las abreviaturas de enfermedad son: NPHP1, nefronoftisis juvenil familiar 1; WBS, síndrome de
Williams-Beuren; PWS/AS, síndrome de Prader-Willi/síndrome de Angelman; SMS, síndrome de Smith-Magenis; DGS/VFCS, síndrome de DiGeorge/sín-
drome velocardiofaclal. Reproducido de Stankiewicz y Lupski (2002) Trends Genet. 18, 74-82, con autorización de Elsevier.

naturales que se utilizan para la producción de algunas cadenas li­
geras K de inmunoglobulina.
El ejemplo clásico de inversiones patógenas es una mutación que
explica más de 40% de los casos de hemofilia grave/A. El intrón 22
del gen del factor VIII, F8, contiene un islote CpG a partir del cual
se transcriben dos genes internos: F8A en la dirección opuesta a la
del gen huésped F8, y F8B en la misma dirección que F8 (véase fig.
11-20). F8A pertenece a una familia génica con otros dos miembros
cercanamente relacionados que se localizan varios cientos de kiloba-
ses corriente arriba del gen F8 y se transcriben en la dirección opues­
ta a F8A. En consecuencia la región entre el gen F8A y los otros dos
miembros es susceptible a inversiones -el gen F8A puede parearse
con cualquiera de los otros dos miembros de la misma cromátide, y
la rotura y la reunión subsecuentes de la cromátide en la región de
las repeticiones pareadas producen una inversión que altera el gen
del factor VIII (Lakich y cois., 1993, véase fig. 11-20).
Varios ejemplos de duplicaciones que surgen a través de una du­
plicación segmentaria (sección 12.2.5) y otras repeticiones con núme­
ro de copias bajo a moderado predisponen, asimismo, a inversiones,
pero estas últimas no son directamente patógenas porque el resultado
de los puntos de rotura no es una expresión génica aberrante (a dife­
rencia del ejemplo en los genes del factor VIII). En lugar de ello pue­
den generarse polim orfism os d e in versión a gran escala como en el
caso de los duplicones en el locus de Williams-Beuren (Osborne y
cois., 2001) y repeticiones del receptor olfatorio muy homologas (Gi-
glio y cois., 2001).
11.5.6 La transposición de secuencias del DNA no es
rara y puede causar enfermedad
Una proporción de elementos dispersos repetidos de maneras mode­
rada y alta son capaces de transponerse a través de un RNA interme-
344 CAPÍTULO ONCE INESTABILIDAD DEL GENOMA HUMANO: MUTACIÓN Y REPARACIÓN DEL DNA

F8
F8B

F 8 A * F 8 A ** 1 2 3 .......................................................................... 22 23 26
TEL—^ -----•+ ------------ ^ ------ I l M I I I I I I I I I I I I I I I I I I • l i l i-----------CEN
Islote CpG
«-1
F8A
Pareamiento erróneo
de repeticiones F8A -áfc'

1 2 3 ......................................................................... 2 2 ■ 2 3 ....... 26
H I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I * r » 1 1 »— CEN
X
---------------------------------------------------------------- «i------- <-------------- TEL
Rotura ( ¡ )
y nueva unión
de cromátide

TEL ---- -►— -►------- 1 I I I I I I I I I 1-1 I I I I I I I I I I------------------------- « ------- M i l -------- CEN

5' de F8 3' de F8
invertido

Fig. 11-20. Las inversiones que alteran el gen del factor VIII resultan de la recombinación intracromátide entre repeticiones invertidas.
El intrón 22 del gen del factor VIII (F8) contiene un islote CpG a partir del cual se transcriben dos genes internos: F8B en la mism a dirección (un exón
nuevo se empalma en los exones 23-26 de F8) y el gen F8A que se transcribe de la cadena opuesta. F8A* y F8A** son secuencias relacionadas en
forma muy cercana con F8A pero localizadas alrededor de 500 kb corriente arriba y transcritas de la cadena opuesta. El grado a to de identidad secuencial
entre los tres miembros de la familia génica F8A significa que el pareamiento del gen F8A con uno de los otros dos miembros en la mism a cromátide
puede ocurrir por formación de una retroasa de la cromátide. La rotura y reunión subsecuente de la cromátide puede ocasionar una inversión de la
región entre el gen F8A y el otro miembro pareado de la familia, lo que produce una alteración del gen del factor VIII (véase Lakich y cois., 1993).

dio (sección 9.5). La expresión del gen defectuoso por transposición
del DNA es comparativamente rara y sólo representa un pequeño
componente de la patología molecular. Sin embargo, se registran va­
rios ejemplos de deficiencia genética debida a inactivación insercio-
nal mediante retrotransposones. Por ejemplo, en un estudio se
encontró que la hemofilia A surge en dos de cada 140 pacientes no
relacionados como resultado de la inserción nueva de una repetición
LINE-1 (Kpn) dentro de un exón del gen del factor VIII. Se cono­
cen otros ejemplos de inactivación insercional por un elemento Alu
que se transpone en forma activa. Además se registran varios otros
ejemplos de patogénesis a causa de la inserción intragénica de secuen­
cias de DNA no definidas. Véase Kazazian para referencias (1998).
longitud de onda más larga que penetran la cubierta de ozono.
La UV produce enlace cruzado entre timinas adyacentes en una
cadena de DNA para formar un dímero químico estable (fig.
11-21C);
► su sta n cia s q u ím ica s a m b ien ta les: comprenden hidrocarburos
(p. ej., algunos de los que se encuentran en el humo del ciga­
rrillo), ciertos productos de plantas y microbianos (como las
aflatoxinas que se producen en cacahuates con moho) y sustan­
cias químicas que se utilizan en la quimioterapia del cáncer.
Los a gen tes a lq u ila n tes pueden transferir un grupo alquilo (un
hidrocarburo alifático como un grupo metilo) a bases y ocasio­
nar enlace cruzado entre bases en diferentes cadenas de DNA
o dentro de una cadena.

11.6 R eparación del DNA
El DNA de las células sufre una gran variedad de daños, en parte
en respuesta a agentes extracelulares, pero en mayor extensión co­
mo resultado de mecanismos endógenos, inclusive hidrólisis quí­
mica espontánea, interacción intracelular con grupos de oxígeno
reactivo y errores en la replicación y la recombinación.
Agentes extracelulares que causan daño al DNA
► R ad ia ción ion iz a n te: los rayos gamma y X pueden ocasionar
roturas de cadena única o doble en el DNA;
► luz u ltra v io leta : en especial los rayos UV-C (~260 nm), que
el DNA absorbe con firmeza, pero también los rayos UV-B de
Mecanismos endógenos que causan daño al DNA
► D ep u rin a ción (fig. 11-21 A). Todos los día se pierden alrede­
dor de 5 000 adeninas o guaninas de cada célula humana nu-
cleada por fisión espontánea del enlace base con azúcar.
► D esanim ación (fig. 11-21A). Cada día se desaminan de mane­
ra espontánea cerca de 100 citosinas en cada célula humana nu-
cleada para producir uracilo (que forma de preferencia pares de
bases con adenina y conduce a que la maquinaria de replicación
de DNA inserte una A cuando encuentra U en la cadena plan­
tilla). Con menor frecuencia se desaminan espontáneamente
adeninas para dar hipoxantinas.
► Especies de ox ígeno rea ctivo. Las especies de oxígeno reactivo
incluyen el anión superóxido, 0 2~, que es tanto un ion como

un ra d ica l lib re (un grupo de átomos de los que uno contie­
ne un electrón non en su cubierta de electrones más externa;
ésta es una configuración en extremo inestable y los radicales
reaccionan rápidamente con otras moléculas o radicales a fin
de lograr la configuración estable de cuatro pares de electrones
en su cubierta más externa). Las especies de oxígeno reactivo
pueden formarse por efecto de la radiación ionizante en algu­
nas moléculas celulares pero también como un producto acce­
sorio inevitable de la respiración celular (algunos electrones
que pasan “a través” de la cadena respiratoria se apartan de la
vía principal y reducen de modo directo moléculas de oxígeno
en el anión superóxido). Las especies de oxígeno reactivo ata­
can anillos de purina y pirimidina en la célula.
► E rrores en la rep lica ció n d e l DNA. La lectura de pruebas in­
correcta ocasiona la incorporación de bases no compatibles;
por ejemplo, a menudo se inserta uracilo en forma incorrecta
en el DNA en lugar de timina.
► E rrores en la rep lica ció n y la recom b in a ció n producen rotu­
ras de cadena que quedan en el DNA.
Todas estas lesiones deben repararse para que las células sobrevivan.
La reparación del DNA rara vez comprende sólo contrarrestar el
cambio que causó el daño (rep a ra ción d irecta ). Casi siempre se
extirpa una tira del DNA que incluye el(los) nucleótido(s) daña-
do(s) y la brecha se llena con nueva síntesis (rep a ra ción d e ex ci­
sión). Los cerca de 130 genes humanos que participan en la
reparación del DNA (véase Wood y cois., 2001 y suplemento en
http://www.cgal.icnet.uk/DNA Repair Genes.html#DR) y las en­
fermedades graves que afectan a personas con sistemas de repara­
ción deficientes (véase más adelante) enfatizan la importancia de
los sistemas de reparación del DNA eficaces.
11.6.1 La reparación del DNA suele incluir cortar y
eliminar, y sintetizar de nuevo un área completa
de DNA que rodea el daño
Para afrontar estas tres formas de daño, las células humanas son ca­
paces de efectuar cuando menos cinco tipos de reparación del
DNA (para revisiones, véase el número de octubre de 1995 de
Trends in Biochem ical Sciences y Lindahl y Wood, 1999).
Reparación directa: revierte el daño del DNA
Este mecanismo, que rara vez se utiliza, suele relacionarse con tres
genes. El mejor caracterizado de ellos codifica la metiltransferasa de
0 6-metilguanina-DNA, que puede eliminar grupos metilo de gua­
ninas que se metilaron de manera incorrecta. (Nota: en las bacte­
rias pueden eliminarse dímeros de timina en una reacción de
fotorreactivación que depende de luz visible y una enzima, fotolia-
sa, pero aunque los mamíferos poseen enzimas relacionadas con la
fotoliasa, las emplean para un propósito muy diferente: controlar el
reloj circadiano; Van der Horst y cois., 1999.)
Reparación de excisión de bases (REB): utiliza enzimas
glucosidasa para eliminar bases anormales (fig. 11-22A)
La REB corrige gran parte del tipo más frecuente de daño del
DNA (del orden de 20 000 bases alteradas en cada célula n u clea -
da del cuerpo humano cada día). Los humanos tienen cuando
menos ocho genes codificadores de diferentes glucosilasas de
11.6 REPARACIÓN DEL DNA 545
DNA, cada una de las cuales tiene a su cargo la identificación y :a
eliminación de un tipo específico de daño de bases (véase cuadro
11-8). Después de eliminar la base, una endonucleasa, endonu-
cleasa AP, y una fosfodiesterasa cortan la estructura básica azú-
car-fosfato en la posición de la base faltante y eliminan el residuo
azúcar-fosfato. La brecha se llena con nueva síntesis mediante una
polimerasa de DNA y la muesca restante se sella con ligasa de
DNA III. El mismo proceso se usa para reparar la despurinación
espontánea.
Reparación de la excisión de nucleótidos (REN): elimina
dímeros de timina y productos químicos grandes
(fig. 11-22B)
La REN difiere de la REB porque emplea diferentes enzimas e in­
clusive, donde sólo hay una base anormal aislada por corregir, su
nucleótido se elimina junto con muchos otros nucleótidos adya­
centes; es decir, la REN elimina un “parche” grande alrededor del
daño. La figura 11-22 ilustra el proceso. Los defectos en la repa­
ración de la excisión de nucleótidos ocasionan la enfermedad au-
tosómica recesiva xerodermia pigmentosa (XP; Lambert y cois.,
1998). Mediante estudios de fusión celular se definieron siete
grupos complementarios, XPA a XPG. Los pacientes con XP son
hipersensibles a la luz ultravioleta. La piel expuesta al sol desarro­
lla miles de pecas, muchas de las cuales progresan a cáncer de la
piel.
La reparación posreplicación (recombinación homologa) se
requiere para roturas de doble cadena (Haber, 1999)
El mecanismo usual es un proceso similar a la conversión génica
(reparación recom binacional), en la que una cadena única del cro­
mosoma homólogo invade el DNA dañado. De manera alternativa
los extremos rotos se reúnen sin considerar su secuencia, una me­
dida desesperada que quizá cause mutaciones. La maquinaria euca-
riota para reparación mediante recombinación está menos bien
definida que los sistemas de reparación por excisión. Los genes hu­
manos que participan en esta vía incluyen NBS (mutado en el sín­
drome de rotura de Nijmegen; véase sección 13.5.2), BML
(mutado en el síndrome de Bloom; MIM 210 900) y los genes de
susceptibilidad a cáncer de mama BRCA2 y BRCA1 (sección
17.5.1).
Reparación incompatible: corrige pares de bases
incompatibles causados por errores en la replicación del DNA
Las células deficientes en la reparación incompatible tienen tasas
de mutación 100 a 1 000 veces más altas que las normales, con
una tendencia particular al deslizamiento de replicación en carre­
ras homopoliméricas (fig. 11-5). En humanos, los mecanismos
incluyen cuando menos cinco proteínas y los defectos causan
cáncer de colon no polipósico hereditario (sección 17.5.3 y fig.
17-12).
Con excepción de la reparación directa, todos estos sistemas
requieren exonucleasas y endonucleasas, helicasas, polimerasas y li-
gasas, que suelen actuar en complejos multiproteínicos que com­
parten algunos componentes. La selección de las vías individuales
se apoya en gran m edida en la con servación m u y p o ten te de los me­
canismos de reparación a través de toda la vida. No sólo los meca­
nismos de reparación sino también las estructuras proteínicas y las
346 CAPÍTULO ONCE INESTABILIDAD DEL GENOMA HUMANO: MUTACIÓN Y REPARACIÓN DEL DNA

A) B) A A
D E 4
0i ^ • C Replicación C« ■ G l
Guanina H 0 Guanina o 1
1 O G --------------► * A* B G
0 = p -0 - : %

B
0 = P -0 -
I T T
\ T
O No base
o
CHo OH Mutante
-H , N .... NH, Nuevas
cadenas

Citosina 0
1
o = p -o - h ^ n /N 0 = P -0 ' O Uracilo C) O
NH,
H ,0
O H 0 NH
1
ch2 ch2
0^ N "4^ 0
P ° ^ N

Fig. 11-21. Daño del DNA por modificaciones químicas de nucleótidos.

A) Ejemplos de despurinaclón (arriba) y desaminación (abajo). B) Forma en que la modificación quimica causa una mutación. En este ejemplo se
produjo un uracilo por desaminación de un residuo de citosina. Si no se repara, la replicación del DNA insertará una adenina en la cadena complementaria
y por consiguiente el efecto neto es el de una transición C-+T. La reparación es posible por la vía de la reparación de excisión de base (fig. 11 -21 A). El
efecto neto de una despurinación es una deleción de nucleótido único cuya base se eliminó. C) Un dimero de timidina: enlaces covalentes (rojo) unen
carbonos de bases timina vecinas. Los dímeros de timidina pueden repararse por la vía de la reparación de excisión de nucleótido (fig. 11-21B).

Cuadro 1 1 -8 . Glucosilasas de D N A humanas (véase Wood y cois., 2 0 0 1 ).

Gen Enzim a Base m ayor alte ra d a lib erad a

UNG N-glucosilasa de uracilo u

SMUG1 Glucosiiasa de uracil-DNA monofuncional selectiva de cadena única ü

MBD4 Proteína 4 de dominio de enlace metil-CpG G opuesta a U o T en secuencias CpG

TDG Glucosiiasa de tímina-DNA G opuesta a U, T o etenoC

0GG1 Glucosiiasa 1 de 8-oxoguanina-DNA C opuesta a 8-oxoG

MYH Homólogo MutY Una 8-oxoG opuesta

NTHL1 (NTH1) 9a. endonucleasa 1 similar a III Pirimidinas con anillo saturado o fragmentado

MPG Glucosiiasa de N-metilpurina-DNA 3-meA, etenoA, hipoxantina

secuencias génicas suelen conservarse desde E. coli hasta el hombre.
Un inconveniente de la conservación es la nomenclatura génica
confusa, que en ocasiones se refiere a enfermedades humanas (XPA,
etc.), a veces a mutantes de levadura (genes RAD) y en otros casos a
sistemas de complementación de células de mamíferos (ERCC,
complementación cruzada de reparación de excisión): por ejemplo,
XPD, ERCC2 y RAD3 son el mismo gen en el hombre, el ratón
y la levadura. Por lo general los eucariotas tienen sistemas múlti­
ples que corresponden a cada sistema único en E. coli, de mane­
ra que, por ejemplo, la reparación de la excisión de nucleótido
requiere seis proteínas en E. coli pero cuando menos 30 en ma­
míferos.
 11.6 REPARACIÓN DEL DNA 5*~

=G G
T =T
C C
A N u c le a s a A H e lic a s a d e D N A
G G
(c o r ta a c ie r ta d is ta n c ia T + iig a s a d e D N A
t í e n c u a lq u ie r la d o d e T
A la s b a s e s m u ta d a s ) A
T T
C C
C C
°<>

Fig. 11-22. Vías de reparación por excisión de base y de nucleótido.

Las estructuras básicas de azúcar y fosfato se muestran en forma de hileras verticales sombreadas y el enlace de hidrógeno mediante lineas rojas.
A) Reparación por excisión de base. En este caso una glucosllasa de DNA especifica elimina un uracilo después de la desaminación de una citosina
(fig. 11-21 A) y a continuación la molécula de azúcar y fosfato residual se elimina por la acción secuencial de endonucleasa AP y una fosfodiesterasa.
La polimerasa de DNA inserta una desoxicitidina (dCMP) y la Iigasa de DNA sella la hendidura. B) Reparación por excisión de nucleótido En este caso
el dímero de pirímidina se reconoce como una lesión voluminosa; una nucleasa dentro de un complejo multienzimático hace cortes alejados a cierta
distancia en ambos lados de la cadena que contiene la mutación y una helicasa elimina el segmento intermedio para dejar una hendidura grande (que en
realidad puede ser de 20 nucleótidos o más en lugar de la hendidura pequeña que se muestra aquí). La hendidura se repara mediante la inserción
secuencial de residuos de dNMP mediante polimerasa de DNA seguida de sellado por Iigasa de DNA.

11.6.2 Los sistemas de reparación del DNA comparten
componentes y procesos con la maquinaria de
transcripción y recombinación
Del mismo modo que comparten componentes entre sí, muchos
sistemas de reparación comparten componentes con la maquina­
ria de replicación, transcripción y recombinación del DNA. Se
requieren polimerasas y ligasas de DNA tanto para la replicación
como para la nueva síntesis de DNA después de extirpar (exci­
sión) un defecto. La maquinaria de recombinación participa en
la reparación de roturas de doble cadena. El vínculo con la trans­
cripción es en particular intrigante (Lehmann, 1995). El factor
de transcripción general TFIIH es un complejo multiproteínico
que incluye las proteínas XPB y XPD. El TFIIH existe en dos
formas. Una de ellas se relaciona con la transcripción general y la
otra con la reparación, tal vez la reparación de DNA con activi­
dad transcripcional. Este sistema es deficiente en dos enfermeda­
des raras, el síndrome de Cockayne (CS; MIM 216 400) y la
tricotiodistrofia (TTD; MIM 601 675). En clínica, y en biolo­
gía celular, tanto el CS como la TTD superponen el XP, y en al­
gunos casos dependen de los mismos genes, pero los pacientes
con CS y TTD poseen defectos del desarrollo que quizás indi­
quen una transcripción defectuosa y no tienen la susceptibilidad
a cáncer de los pacientes con xerodermia pigmentosa (XP).
11.6.3 A menudo la hipersensibilidad a agentes que
dañan el DNA produce un deterioro de la
respuesta celular al daño del DNA en lugar de
una reparación defectuosa del DNA
Muchas enfermedades humanas que comprenden hipersensibilidad
a agentes que dañan el DNA, o un nivel muy alto de daño del DNA
celular, no se deben a defectos en los sistemas de reparación del
DNA en sí mismos, sino a una respuesta celular defectuosa al daño
del DNA. Las células normales reaccionan al daño del DNA dete­
niendo el progreso a través del ciclo celular en un punto de control
hasta que el daño se repara, o desencadenando apoptosis si el daño
es irreparable. Parte de la maquinaria para efectuar lo anterior incluye
la proteína ATM. La función de la ATM se describe en la sección
17.5.1. De manera breve, detecta el daño del DNA y libera la señal a
la proteína p53, el “guardián del genoma”. Las personas con ATM no
funcional tienen ataxia telangiectasia (MIM 208 900; Lambert y cois.,
1998). Sus células son hipersensibles a la radiación, manifiestan inesta­
bilidad cromosómica y un riesgo alto de afección maligna, pero la ma­
quinaria de reparación del DNA en sí misma está intacta. La anemia
de Fanconi (véase MIM 227 650) es otro grupo heterogéneo de enfer­
medades (cuando menos cinco grupos complementarios) que produ­
cen respuestas defectuosas al daño del DNA sin defectos específicos en
la reparación de este último.
348 CAPÍTULO ONCE INESTABILIDAD DEL GENOMA HUMANO: MUTACIÓN Y REPARACIÓN DEL DNA
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Human DNA Repair Gene List (lista de genes de reparación
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HGV base (human genome variation database) (base de datos
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Bibliografía
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CAPÍTULO DOCE

Lugar del hombre

en el árbol de la vida

Contenido del capítulo

352 CAPÍTULO DOCE I LUGAR DEL HOMBRE EN EL ÁRBOL DE LA VIDA
Quienes apoyan el punto de vista de Theodosius Dobzhansky, se­
gún el cual “nada en biología tiene sentido sí no es a la luz de la
evolución”, se apoyan en los torrentes de datos que fluyen de los di­
ferentes proyectos del genoma. Las comparaciones de secuencias a
través de genomas completos son en la actualidad el soporte prin­
cipal de una nueva disciplina, la gen ó m ica com parativa, y han co­
menzado a proporcionar nuevas informaciones poderosas sobre el
lugar del hombre en el árbol de la vida.
Por supuesto, los orígenes evolucionistas del genoma humano
(y de todos los genomas) son tan antiguos como la vida misma, pe­
ro este capítulo no tiene el propósito de suministrar una revisión
general de la genética molecular evolucionista. Por esta razón no se
incluyen muchas áreas fascinantes, como la evolución temprana del
código genético (p. ej., Knight y Landweber, 2000) o la idea de que
el RNA era la molécula de información primaria antes de que la su­
perara el DNA (como Joyce, 2002).
Por el contrario, este capítulo tiene como fin enfocarse en la for­
ma en que los análisis comparativos de los genomas actuales pro­
porcionaron luz en el origen evolucionista del DNA y los genes
humanos. Gran parte de los datos procede de comparaciones de ge­
nomas de mamíferos y otros animales, aunque en ocasiones se uti­
liza la comparación con genomas más distantes con objeto de
explicar ciertas huellas d e la evolución, como el origen de los intro-
nes y el DNA mitocondrial. Los datos comparativos suministran
información sobre el carácter único del hombre comparado con
modelos de mamíferos, en especial el ratón (un modelo importan­
te para comprender el desarrollo humano temprano y asimismo en­
fermedades del hombre) y los primates, los relacionados vivos más
cercanos. En una sección final se consideran los orígenes recientes
y las relaciones de las poblaciones humanas.
12.1 Evolución de la estru ctu ra génica
y genes duplicados
De manera característica, los genes y las proteínas eucariotas son
más grandes y complejos que los de organismos simples. El tama­
ño más grande de los genes en eucariotas se debe sobre todo a la
presencia de intrones grandes y el tamaño promedio del intrón sue­
le reflejar la complejidad genómica (y biológica). Asimismo, de for­
ma típica, como resultado de diferentes mecanismos, las secuencias
de codificación eucariotas son más largas que las de procariotas. La
duplicación intragénica permite que se expandan y con frecuencia se
diversifiquen las longitudes de las secuencias de codificación. La re­
com binación intergénica reúne diferentes combinaciones de domi­
nios proteínicos (módulos estructurales o funcionales discretos). Se
piensa que la ubicación cercana de intrones en los genes de geno-
mas complejos representa la relevancia de permitir que se expandan
y modifiquen las secuencias de codificación durante la evolución.
12.1.1 Es probable que los intrones espliceosómicos se
originaran de intrones del grupo II y aparecieran
por primera vez en las células eucariotas iniciales
Después del descubrimiento de genes divididos en 1977 se discu­
tió con gran intensidad la importancia de los intrones espliceosómi­
cos (véase recuadro 12-1). Los intrones que se hallan en genomas
complejos suelen ser grandes comparados con los de otras especies
y no están tan bien conservadas las secuencias del intrón. No obs­
tante, los intrones contienen secuencias esenciales desde el punto
de vista funcional que participan en la regulación génica y durante
la evolución se conservaron de manera considerable algunos intro­
nes cortos. Los genes que se expresan en alto grado tienen intrones
muy cortos (tal vez por la selección para el procesamiento rápido
de mRNA). Cualquiera que sea la función propuesta de los intro­
nes (p. ej., tolerar la recombinación a fin de permitir la novedad
evolucionista como se comenta en la sección 12.1.3), no puede ser
general: una pequeña minoría de genes en organismos complejos
carece de intrones (véase cuadro 9-5).
La evolución de intrones espYiceosómicos es \m i t m At OTi-
troversia (véase Logsdon, 1998; Lynch y Richardson, 2002). Hoy
en día se acepta en gran parte que los intrones espliceosómicos no
se originaron antes que aparecieran las células eucariotas (ningu­
no de los cientos de genomas procariotas secuenciados contiene
la característica de los intrones actuales o pasados en los genes que
codifican proteína). Por el contrario, es muy probable que aparecie­
ran por primera vez muy temprano en la evolución de las células
eucariotas: el único grupo eucariota temprano diferente en el que no
se encontraron son los parabasálidos como las tricomonas que, pese
a ello, tienen parte de la estructura de empalme (corte y unión)
necesaria.
Es probable que los intrones espliceosómicos se originaran de
intrones del grupo II de autoempalme, que se procesan por meca­
nismos similares (véase recuadro 12-1; Lynch y Richardson,
2002). Los intrones espliceosómicos no pueden llevar a cabo em­
palme por sí mismos y requieren cinco moléculas separadas de
snRNA y muchas proteínas, pero los del grupo II son intrones co­
hesivos que se autoempalman. No obstante, se sabe que algunos in­
trones funcionales del grupo II se fragmentaron en diferentes
componentes, lo que semeja un poco el sistema de procesamiento
espliceosómico disperso. Algunos intrones del grupo II también
pueden codificar su transcriptasa inversa y actuar como elementos
móviles. Por consiguiente, es posible que los espliceosomas se ori­
ginaran de un intrón del grupo II dentro de un organelo tempra­
no (ya se estableció bien la transferencia de secuencias del DNA de
organelos al DNA nuclear; véase recuadro 12-4). Quizá la frag­
mentación subsecuente en diferentes componentes se llevó a cabo
durante un extenso periodo.
Desde que aparecieron por primera vez los intrones espliceo­
sómicos se integraron de forma periódica en genes (y en algunos
casos se eliminaron) durante la evolución. Algunos tienen con
claridad orígenes antiguos. Por ejemplo, se conservó muy bien la
colocación de los dos intrones principales en la superfamilia de
la globina, lo que sugiere que los dos intrones se integraron en
estas posiciones en un gen de globina antiguo tal vez hace más
de 800 millones de años (fig. 12-1). También es posible encon­
trar posiciones de intrones excepcionalmente bien conservadas
en ortólogos relacionados de manera distante. Por ejemplo, el
gen de la enfermedad de Huntington humana tiene 67 exones
que abarcan 170 kb. El gen equivalente en el pez globo (que se
diferenció de los seres humanos hace más de 400 millones de
años) sólo tiene 23 kb de largo, pero también posee 67 exones
con una conservación casi perfecta de las posiciones de intrones
 12.1 EVOLUCIÓN DE LA ESTRUCTURA GENICA Y GENES DUPLICADOS
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Recuadro 12-1. Grupos de intrones
____ :_______ ,_________________ __... ' i
Los intrones son entidades heterogéneas con distintas capacidades fun­
cionales y diferencias estructurales notables, que incluyen enormes varia­
ciones de longitud (en contraste con los exones que al parecer tienen una
longitud mucho más homogénea; véase cuadro 9 -6 ). Según sea la exten­
sión de la que dependen de factores extrínsecos para comprometerse en
el empalme de RNA y la naturaleza de la reacción de empalme, pueden
clasificarse en diferentes grupos de intrones como sigue:
► Intrones esplíceosómicos: son los intrones convencionales de célu­
las eucariotas. Se transcriben en RNA en el transcrito primario y du­
rante el procesamiento de RNA los cortan a nivel del RNA los
espliceosomas. Al parecer, para la función génica sólo son importan­
tes unas cuantas secuencias cortas [las que se encuentran en unio­
nes de empalme y el sitio de ramificación o en su proximidad (fig.
1 -1 5 ), aunadas a intensificadores y silenciadores de empalme (sec­
ción 1 1 .4.3 )]. Como resultado, los intrones espliceosómicos pueden
tolerar grandes inserciones y ser muy largos (en ocasiones más de
un 1 M b). Es probable que los intrones espliceosómicos surgieran en
una época comparativamente reciente en la evolución y tal vez evolu­
cionaron de intrones de grupo II (véase sección 1 2 .1.1 ). Al tolerar la
inserción de elementos movibles, facilitaron la mezcla de exones.
(Baxendale y cois., 1995). Sin embargo, algunos otros intrones es­
pliceosómicos tienen al parecer un origen evolucionista más re­
ciente. Por ejemplo, la localización de intrones en numerosas
familias génicas individuales (p. ej., actinas, miosinas, tubulinas)
no está bien conservada.
12.1.2 Los genes complejos pueden evolucionar
mediante duplicación intragénica, muchas
veces como resultado de duplicación exónica
Al igual que otros genes de eucariotas, los genes humanos suelen
mostrar pruebas de duplicación intragénica de DNA que puede ser
importante. Por ejemplo, se sabe que muchos genes codifican poli-
péptidos cuyas secuencias están compuestas por completo o en gran
parte de repeticiones grandes, con una homología de secuencia en­
tre las repeticiones muy alta en algunos casos (véase cuadro 9-7).
Mediante la repetición de un dominio designado con anterioridad
es posible elaborar polipéptidos más grandes con una variedad de
ventajas evolucionistas. Los genes humanos que codifican la ubi-
quitina, UBB y UBC, codifican proteínas multiméricas largas que
consisten en repeticiones tándem de una unidad proteínica de ubi-
quitina completa que se cortan para generar múltiples copias de
ubiquitina (tres en el caso de UBB; nueve en el de UBC).
Aparte del caso poco común de los genes de ubiquitina, la du­
plicación intragénica incluye con frecuencia cierta forma de
duplicación de exón, de tal manera que se duplica un dominio
proteínico particular (fig. 12-2). Alrededor del 10% de los genes de
seres humanos, Drosophila melanogaster y Caenorhabditis elegans
353
. . >.
► Intrones de grupos I y li: tienen una estructura secundaria im portar­
te y son intrones de autoempalme (pueden catalizar su autoexcision
sin necesidad de un espliceosoma). Se encuentran en bacterias y eu­
cariotas, pero están muy restringidos en su distribución y se hallan
sobre todo en genes rRNA y tRNA y en unos cuantos genes que co­
difican proteínas situados en ciertos tipos de mitocondrias, cloroplas-
tos y bacteriófagos. Ambos grupos también pueden actuar como
elementos movibles y los intrones movibles de grupos II codifican
una actividad parecida a la transcriptasa inversa, que es muy similar
a la de los elementos LINE-1. Los intrones del grupos I y II difieren en
la identidad de señales de empalme conservadas y la naturaleza de la
reacción de empalme (p. ej., los intrones grupo I son la única clase
de intrón que requiere un nucleósido de guanina libre; véase Bonen y
Vogel, 2001).
► Intrones de tipo archaea: sólo se encontraron en genes tRNA y rR­
NA en archaea. Carecen de una estructura interna conservada y, a di­
ferencia de los intrones grupos I y II, no se autoempalman. Aunque
requieren proteínas para el mecanismo de empalme, en comparación
con los intrones espliceosómicos, no necesitan moléculas de RNA de
acción trans para la reacción de empalme (corte y unión).
tiene exones duplicados (Letunic y cois., 2002) y pueden asumirse
varias ventajas:
► extensión estructural. La repetición de dominios puede ser en
particular ventajosa dado que se trata de proteínas que poseen
una función estructural mayor. Un ejemplo ilustrativo lo pro­
porcionan los 41 exones del gen COL1A1, que codifica la par­
te de la colágena a 1(1) que forma una triple hélice; cada exón
codifica en esencia un número integral de copias (una a tres)
de una secuencia típica de 18 aminoácidos que está compues­
ta de seis repeticiones tándem de la estructura Gli-X-Y en la
que X y Y son aminoácidos variables.
► diversidad a través d e la divergen cia d e dom inio. En casi todos
los casos, los fenómenos de duplicación intragénica fueron se­
guidos de una divergencia sustancial de las secuencias de nucleó-
tidos entre las diferentes unidades de repetición. Es probable que
esta divergencia proporcione la oportunidad de adquirir diferen­
tes funciones, aunque relacionadas. En ocasiones, el grado de di­
vergencia de secuencias entre las repeticiones es de tal índole que
es posible que la estructura repetida no sea obvia a nivel de la se­
cuencia, como se observa en los dominios de la inmunoglobuli-
na (fig. 9-10).
► d iversid a d a través d e em palm e altern a tivo (véase p. ej., Letu­
nic y cois., 2002). Un tipo de empalme alternativo produce di­
ferentes isoformas al seleccionar una secuencia exónica de un
grupo de exones duplicados que se incluyen en el producto del
empalme. Puesto que las secuencias de los exones duplicados
pueden mostrar diferencias pequeñas, este tipo de empalme
alternativo produce una serie de isoformas relacionadas. Mu-
354 CAPÍTULO DOCE LUGAR DEL HOMBRE EN EL ÁRBOL DE LA VIDA

la finalidad de evitar cambios de marco en el marco de lectura tra-

0.11 kb 0.14 kb
duccional, la duplicación se limita a exones sim étricos o grupos de
exones simétricos (recuadro 12-2).

12.1.3 La mezcla de exones puede traer consigo nuevas

combinaciones de dominios proteínicos

En toda la naturaleza sólo se conocen unos cuantos miles de do­

minios proteínicos conservados, pero en especies metozoáricas
muchas proteínas contienen dominios que se encuentran en otras
proteínas (Li y cois., 2001). La fibronectina, una proteína de ma­
triz extracelular grande, contiene múltiples dominios repetidos co­
dificados por exones individuales o pares de exones y es un buen
ejemplo de la duplicación típica de exón. Uno de los dominios re­
petidos, que hoy en día se conoce como dominio de fibronectina
tipo I, se encontró con posterioridad en el activador del plasminó-
geno tisular. Del mismo modo que la fibronectina, el activador del
plasminógeno tisular también contiene otros dominios que inclu­
yen uno parecido al factor de crecimiento epidérmico (EGF) ca­
racterístico del precursor EGF y dos dominios kringle que se
encontraron en otros polipéptidos, como prourocinasa y plasmi­
nógeno (fig. 12-2).
No es raro que los exones sim étricos individuales o grupos de
exones sim étricos codifiquen a los dominios proteínicos (recuadro
1.5 kb 0.63 kb 1.8 kb 12-2). Algunas observaciones sugieren la posibilidad de mezclado
T T T de exones entre genes: los exones o grupos de exones que codifi­
1 30 6 7 6 8 1 0 7 108 151 N e u ro g lo b in a can dominios completos se copian e insertan en otros genes (véa­
se Patthy, 1999; Kaessmann y cois., 2002). Es muy probable que
5.7 kb 0.32 kb 2.4 kb
▼ el mecanismo de mezclado de exones incluya retrotransposición
▼ — ▼
48 1 2!5[126
5126 118C
80190 C ito g lo b in a asistida por el elemento LINE (véase sección 12.1.6).

12.1.4 La duplicación génica tuvo un papel crucial en

Fig. 12-1. La inserción de un intrón antiguo se sugiere por la conser­
vación de la posición del intrón en la superfamilia de globina.
Los cuadros representan polipéptidos maduros. Los números incluidos
en los cuadros son las posiciones de aminoácidos. Obsérvese la
conservación casi siempre potente de las posiciones del intrón que
indica que un gen de globina ancestral tuvo dos intrones (se muestra
en azul), tal vez hace más de 8 0 0 millones de años (véase fig. 1 2 -4 ).
Los intrones adicionales en la secuencia de neuroglobina recién
identificada (roja) y las secuencias de citoglobina (púrpura) tal vez se
insertaron hace muchísimo tiempo. Nótese que la expansión de la
proteína de citoglobina incluyó una expansión de la región terminal N
de unos 17 aminoácidos y de la región terminal C de casi 23
aminoácidos (véase Pesce y cois., 2 002).
chos genes humanos experimentan este tipo de empalme pero
el gen de Drosophila Dscam es el ejemplo más notable (véase
fig. 10-16).
La duplicación intragénica de exones puede explicarse por una di­
versidad de mecanismos que incluyen cruzamiento desigual, o in­
tercambio desigual de cromdtides hermanas (véase Long, 2001). Con
la evolución de organismos multicelulares
La mutación es el motor de la evolución. En procariotas, los tiem­
pos de duplicación cortos y las poblaciones grandes permiten que
se establezcan con rapidez mutaciones que confieren una ventaja en
la supervivencia (en respuesta a cambios del ambiente). Sin embar­
go, en animales multicelulares los cambios en genes importantes
con frecuencia son perjudiciales y por lo general hay una presión de
selección conservadora potente para mantener la secuencia de un
gen. Por consiguiente, a fin de propagar mutaciones en organismos
complejos se requiere duplicación génica.
En cada duplicación génica, una de las dos copias del gen es un
excedente del requerimiento y por consiguiente puede divergir en
poco tiempo (debido a la ausencia de presión de selección para con­
servar la función). Incluso si no existen problemas con los efectos
de la dosis génica, una copia adicional de un gen suele adquirir mu­
taciones perjudiciales y se degenera en un seudogen no funcional, o
se pierde por procesos de recambio del DNA (que pueden suceder
durante las escalas de tiempo evolucionistas cuando no es impor­
tante una secuencia de DNA). No obstante, en algunos casos mu­
ta la copia del gen divergida para producir un producto funcional
con propiedades alteradas que puede ser selectivamente ventajoso y
conservado (fig. 12-3). Las alteraciones en las secuencias de codifi-
 12.1 ¡ EVOLUCIÓN DE LA ESTRUCTURA GENICA Y GENES DUPLICADOS I 355

Fibronectina Posible código

C lav e p a ra los exones:
Dominio d e fibronectina tipo I
Precursor del factor
de crecim iento epidérm ico Dominio de fibronectina tipo III que se
11 encuentra en muchos receptores de
superficie celular y otras proteínas de
matriz extracelular
A ctivador del
plasm inógeno tisular I coDominio Kringle; 38
p ias en proteína ApoA

Prourocinasa
I EItamdom inio d e fibronectina tipo I
bién s e encu en tra en factores
d e coagulación san guínea
Dominio del factor d e
crecim iento epidérm ico
Dominio desco nocid o
□

Fig. 12-2. Duplicación de exones y mezcla de exones.

Se encuentra una duplicación conspicua de exones en los genes humanos de fibronectina (FN1) y del factor del crecimiento epidérmico (EGF). El gen
FN1 tiene 12 copias de un exón que codifica el dominio tipo I de fibronectina y 15 copias de un par de exones, que especifican juntos el dominio tipo III
de fibronectina; el gen EGF tiene nueve copias de un exón que especifica un dominio EGF. La mezcla de exón significa que los exones que codifican
estos dominios se encuentran en muchos otros genes como los que codifican el activador del plasminógeno tisular y prourocinasa. Véase la figura 12-7
para un posible mecanismo de la mezcla de exones.

Recuadro 12-2. Fases sim étricas de exones e intrones

No todos los exones contienen DNA de codificación. Hay exones no co­
dificantes porque en ocasiones los intrones se localizan dentro de se­
cuencias no traducidas, como las secuencias UTR 5 ' y UTR 3 ' de genes
que codifican poiipéptidos. Los intrones, que cortan DNA de codificación
en diferentes exones codificantes, permiten la diversificación mediante
duplicación exónica y mezcla de exones. Es posible distinguir tres fases
de intrón según sea el punto de inserción en el DNA de codificación (véa­
se figura): fase 0 (entre la tercera base de un codón y la primera base del
codón siguiente); fase 1 (entre la primera y segunda bases de un codón);
fase 2 (entre la segunda y tercera bases del codón).
Los exones de codificación pueden clasificarse de acuerdo con las fases
de los intrones que los flanquean. Los exones simétricos (con un núme­
ro total de nucleótidos divisible exactamente por tres) están flanqueados
por intrones de la misma fase y por consiguiente pueden clasificarse co­
mo: 0 -0 ,1 -1 o 2-2 , según sea la fase de los intrones de flanqueo. Los
exones no simétricos (en los que el número de nucleótidos no es divisi­
ble exactamente por tres) pueden clasificarse como 0 - 1 ,0 - 2 ,1 - 0 , etc. La
elaboración de una copia de un exón por duplicación exónica y mezcla de
exones suele limitarse a exones simétricos o a grupos de exones no si­
métricos vecinos que no ocasionan un cambio de marco si se duplicaran
o copiaran dentro de otro gen, por ejemplo exones contiguos 0 - 1 y 1 - 0 .

1 29 30 31 104 105 146

A
( \
5' UTS Vai Gli Ar 2 2. Leu Arg 0 Ot Leu His 3 ' UTS
HBB ATG G T G -- G G C --A G L — - ag |G- C T G - --A G G g t ------ a g C C C -- ---C A C ít a a I

Fase 2 Fase 0

81
5' UTS 80 110
1 al 3 ' UTS

INS Jgt agj ATG CAG G |g t--a g |T G A A C TAG

Fase 1

Ejemplos de fases de intrón en los genes de globina ¡i e insulina.

Los números arriba de los genes se refieren a posiciones codón/aminoácido. HESB, gen de la globina p humana. INS, gen de la insulina en seres huma­
nos. Nota: el exón 2 del gen de la globina p podría clasificarse como un exón 2 -0 no simétrico que está flanqueado por intrones de diferentes fases, en
este caso un intrón de fase 2 corriente arriba y un intrón de fase 0 corriente abajo.
356 CAPITULO DOCE LUGAR DEL HOMBRE EN EL ÁRBOL DE LA VIDA

Presión de
selección

Lenta 1
!— --------- Función
A ' original

/
Duplicación Divergencia
génicaV de secuencia
I » ila » » '* - Función
relacionada
A2
Rápida
Sin
función
\|/A

Fig. 12-3. La duplicación génica puede generar diferentes variedades de genes funcionales pero con gran frecuencia el resultado es la formación
de un seudogen.

La duplicación del gen A crea dos copias génicas equivalentes. Es necesario aplicar presión de selección sólo a una copia del gen (arriba) a fin de
conservar la presencia del producto del gen funcional original. La otra copia (abajo) continúa su expresión pero, en ausencia de presión de selección
para conservar su secuencia, acumula mutaciones (asteriscos rojos) relativamente pronto. Puede adquirir mutaciones perjudiciales y tornarse en un
seudogén no funcional (v|»A) que al final se elimina del genoma. Sin embargo, en algunos casos, las diferencias mutacionales pueden conducir a
un patrón de expresión distinto u otra propiedad que es ventajosa en términos selectivos (A2).

Cuadro 12-1. Clases de globina y genes de globina humana.

Proteína Función Estructura Polipéptido(s) Gen(es) Localización génica

Hemoglobina* (Hb) Transporte de 0 2 en la Heterotetrámero Globina alfa HBA1 ,HBA2 16p13.3, grupo de globina a
sangre. Portland, Gower Portland (J 2 -y2) Globina zeta (£) HBZ 16p13.3, grupo de globina a
1 y Gower 2 son formas Gower 7(£ 2 e2)
embrionarias tempranas. Gower 2( a 2 e2) Globina beta HBB 11 p15.5, grupo de globina p
Alrededor de las ocho se­ HbF = Hb fetal ( a 27 2) Globina gamma HBG1.HBG2 11 p15.5, grupo de globina (3
manas de gestación, el HbA = Hb del adulto (a 2 p 2) Globina delta HBD 11 p15.5, grupo de globina p
hígado fetal sintetiza de HbA Hb del adulto ( a 2 p 2) Globina épsilon (e) HBE1 11 p15.5, grupo de globina p
manera predominante HbA2(a 2 S2)
HbF y un poco de HbA.
El 70% de la Hb en recién
nacidos es HbF, pero ha­
cia el final del primer año
disminuye a 1 % a medida
que predomina la HbA.
HbA2 es una Hb minorita­
ria en niños y constituye
< 3% de la Hb del adulto

Mioglobina Transporte y alm acena­ Monómero Mioglobina MB 22q13.1

miento de 0 2 en músculo

Neuroglobina Se expresa de modo pre­ Monómero Neuroglobina NGB 14q24

dominante en el sistema
nervioso en el que sumi­
nistra oxígeno; puede ser
multifuncional

Citoglobina Se expresa en casi todos Monómero Citoglobina CYGB 17q25.3

los tejidos; se desconoce
la función exacta

*Nola: el polipéptido globina theta sintetizado por el gen HBQ1 en el grupo de globina a (véase fig. 9-11) no se incorpora en la molécula de Hb y se desconoce su función, si
acaso tiene alguna.
 12.1 EVOLUCIÓN DE LA ESTRUCTURA GENICA Y GENES DUPLICADOS
nación podrían requerir cierto tiempo para establecerse, pero las
modificaciones en las secuencias reguladoras suelen proporcionar
?ronto características de expresión nuevas. El producto génico re­
saltante podría expresarse en diferentes tejidos o distintas etapas del
desarrollo y adaptarse después al nuevo ambiente (véase el ejemplo
cíe los genes de globina; sección 12.1.5).
En los genomas complejos son comunes genes duplicados y
pueden surgir con suma rapidez en una escala del tiempo evolucio­
R ecuadro 12-3. M ecanismos y paralogia de la duplicación gènica
La duplicación gènica en genomas de metazoarios significa que los ge­
nes homólogos (genes con identidad de secuencia importante que sugie­
re una relación evolucionista cercana) pueden ser de uno de dos tipos
(véase figura). Los ortólogos son genes que se encuentran en diferentes
genomas y que se relacionan de forma directa por la descendencia de un
ancestro común. Los parálogos son genes que se encuentran en un mis­
mo genoma como resultado de duplicación genica. Diversos mecanis­
mos pueden provocar duplicación gènica.
► Duplicación gènica tándem. Genes únicos pueden sufrir duplicación
tándem como resultado de acontecimientos de cruzamiento desigual
o intercambios desiguales de cromátides hermanas (fig. 1 1 -9 ). Las
familias génicas humanas agrupadas se originan de manera caracte­
rística por duplicaciones tándem secuenciales (p. ej„ los grupos de
los genes de las globinas a y 0 ; véase sección 12.1.5). Los mismos
mecanismos pueden dar lugar a duplicaciones a gran escala, que In­
cluyen segmentos que contienen varios genes, pero las duplicaciones
a muy grande escala son relativamente raras, en parte por la posibi­
lidad más alta de efectos de dosis gènica, etcétera.
► Duplicación gènica mediada por retrotransposición (es decir, trans­
posición duplicativa). Es posible que contribuya en buena medida.
Aunque con frecuencia tiene como consecuencia copias sin intrones
de un gen que contenía un intrón, en ocasiones también puede copiar
secuencias de intrón (sección 1 2 . 1 .6 ).
G lo b in a
D u p lic a c ió n g é n ic a
-— - M io g lo b in a -------- C ítoglobina
P a rá lo g o s
E s p e c ia c ló n
S e r h u m an o
M io g lo b in a --------i C ítoglo bina —
O rtó lo g o s
Homólogos, ortólogos y parálogos.
Se piensa que la mioglobina y la cítoglobina se originaron a partir de una duplicación génica que ocurrió hace unos 500 millones de años. Véase la fi­
gura 12 -4 para las relaciones con los otros genes de globina.
35“
nista: un gen promedio se duplica alrededor de una vez cada 100
millones de años (Lynch y Conery, 2000). Se originan por una va­
riedad de mecanismos diferentes. Algunos causan duplicaciones li­
mitadas, que incluyen con frecuencia genes únicos y se consideran
en las secciones 12.1.5 y 12.1.6. Otros crean duplicaciones a gran
escala y del genoma completo y se comentan en el contexto de la
evolución del cromosoma y el genoma (sección 12.2). En el recua­
dro 12-3 se describen los principales mecanismos.
► Transferencia génica horizontal (esto es, lateral). Esto significa
transferencias génicas antiguas entre diferentes genomas (Brown,
2 003). El International Human Gene Sequencing Consortium (2001)
sugirió que cientos de genes humanos se originaron quizá por trans­
ferencia génica horizontal de bacterias en algún punto del linaje de
vertebrados. Aunque en la actualidad se sabe que no es correcto
(véase recuadro 1 2 -4 ), al parecer cuando menos parte de los genes
nucleares humanos se originó por transferencia génica horizontal an­
tigua después de la adquisición de un genoma protomitocondrial
(sección 1 2 .2 . 1 ).
► Duplicación segmentaria. Una proporción notable del genoma huma­
no consiste en bloques de secuencias relacionados de modo cerca­
no en diferentes localizaciones genómicas que muestran > 90% de
identidad secuencial en segmentos que abarcan longitudes de cientos
de kilobases. En apariencia, este tipo de duplicación sucedió en una
fase reciente durante la evolución. Véase la sección 12.2.5.
► Poliploidía. La duplicación del genoma completo tiene la atracción de
ofrecer de inmediato copias génicas para mutación a fin de trabajar
sin incurrir en problemas debido a diferencias en la dosis génica. Los
genomas de varias especies sufrieron con claridad poliploidía, pero
existen controversias acerca de la extensión a la que ello modeló la
evolución de los genes humanos (sección 12.2.3).
G en a n ces tral
(/
0C ) cCc/D>
O o
o o
(O
3 3 B
E E
O3 <1>
< *o
R ató n
M io g lo b in a -------- C ítoglobina
358 CAPÍTULO DOCE LUGAR DEL HOMBRE EN EL ARBOL DE LA VIDA
12.1.5 La superfamilia de la globina evolucionó por un
proceso de duplicaciones génicas, conversiones
de genes y pérdida/inactivación génica
Evolución de las cinco clases de gen de globina
Las globinas son proteínas que contienen porfirina y enlazan oxí­
geno de manera reversible y por consiguiente son importantes en
el sistema respiratorio. Corresponden a cuatro clases funcionales
(véase cuadro 12-1): la hemoglobina y mioglobina bien estudia­
das y la neuroglobina y las citoglobinas identificadas en fecha
más reciente (véase Pesce y cois., 2002). Las hemoglobinas trans­
portan oxígeno en la sangre y son heterotetrámeros que consisten
en dos cadenas de globina idénticas codificadas por miembros de
la fa m ilia d el gen d e globina a en el cromosoma 16 y dos codifi­
cadas por miembros de la fa m ilia gén ica d e globina ¡i en el cro­
mosoma 11. Un gen en el cromosoma 22 codifica la mioglobina.
Es monomérica y se halla en células musculares en las que facilita
la difusión de oxígeno a las mitocondrias. El gen de neuroglobi­
na en el cromosoma 14 codifica un monómero y se expresa en el
cerebro en donde aumenta la disponibilidad de oxígeno a los te­
jidos cerebrales (Burmester y cois., 2000). El gen de citoglobina
recién identificado se expresa de modo ubicuo; se desconoce su
función.
La homología secuencial entre los polipéptidos de globina su­
giere que esta familia se formó por una serie de fenómenos de
duplicación génica, algunos antiguos y otros más recientes. Por
consiguiente, los polipéptidos de la globina de las diferentes loca­
lizaciones cromosómicas suelen relacionarse en grado distante en­
tre sí, lo que sugiere duplicaciones génicas antiguas (aunque las
familias de las globinas a y P están relacionadas con claridad más
de cerca entre sí respecto de la mioglobina, neuroglobina o cito­
globina). El grado de homología secuencial entre las diferentes
globinas, aunado a la observación de las posiciones de los intrones
casi siempre conservadas (fig. 12-1), sugiere que las cuatro fami­
lias proceden de un gen de globina ancestral único por una serie
de duplicaciones desde hace alrededor de 800 a 450 millones de
años (fig. 12-4).
Con posterioridad, los genes ancestrales de las globinas oí y (3
sufrieron una serie de duplicaciones adicionales; algunas de ellas
sucedieron en época muy reciente (véase fig. 12-4). Por ejemplo,
los dos genes de la globina a humana HBA1 y HBA2 codifican
productos idénticos y los productos de los dos genes de la globi­
na y , HBG1 y HBG2, difieren sólo por un aminoácido. En otros
casos, los genes duplicados dentro de un grupo divergen más en
la secuencia, tal vez porque los fenómenos de duplicación rele­
vantes ocurrieron hace algún tiempo. Algunas duplicaciones origi­
naron los seudogenes convencionales. Es posible que en el futuro
se degeneren en seudogenes cada uno de los dos genes humanos
de la globina a y los dos genes de la globina "y.
Evolución de los grupos génicos de la globina £
de mamíferos
Análisis comparativos de secuencias de los grupos del gen de la
globina p en diferentes mamíferos revelan organizaciones géni­
cas un poco diferentes. Los distintos tipos de duplicación de un
gen aislado tuvieron lugar en diversos linajes y asimismo existen
pruebas de pérdida génica, fusión de genes y conversión génica (in­
tercambios de secuencias no recíprocos en los que se utiliza una
secuencia copiada de un gen donador para reemplazar alguna se­
cuencia de un gen aceptor; véase el mecanismo en la fig. 11-10).
Por ejemplo, los seres humanos tienen un gen de la globina P y
uno de globina 6 pero dos genes de globina y ; el ratón tiene dos
genes de globina (3, dos genes de globina parecidos a la e, pero
sólo un gen de la globina y (fig. 12-5). En el linaje que condu­
jo a las cabras actuales, la pérdida temprana de un gen de la glo­
bina y fue seguida de una triplicación a gran escala (tal vez como
resultado de dos fenómenos sucesivos de recombinación desiguales,
el primero de los cuales produjo una duplicación). Al parecer, la
conversión génica ha sido frecuente. Por ejemplo, es aparente la con­
versión de la globina 8 por la globina (3, sea en linajes humanos o
en los de la cabra (fig. 12-6).
Los tipos anteriores de acontecimientos pueden explicarse
por intercambios de secuencia simples que ocurrieron en este
grupo.
Si se toma en cuenta que los marsupiales como la zarigüeya só­
lo tienen dos genes en este grupo, un gen de globina (3 y un gen
de globina 6, existe la posibilidad de que el grupo génico de glo­
bina P actual surgiera de un gen de globina único que sufrió una
duplicación inicial que generó un protogén de globina parecido a
P y un protogén de globina parecido a e y a continuación se du­
plicó de manera adicional para generar los cinco tipos de genes en
este grupo (fig. 12-6). La identidad de secuencia perfecta inicial de
secuencias duplicadas en tándem las hace propensas a intercam­
bios de secuencia adicionales por cruzamiento desigual (que pue­
de dar lugar a más duplicación génica, pérdida de genes y genes de
fusión) y conversión génica. Sin embargo, al final las secuencias
duplicadas varían, a menos que la presión de selección conserva­
dora mantenga la secuencia y, aunque hay una homología de se­
cuencias considerable entre las secuencias individuales del gen de
1.6 kb, existe mucho menos entre las secuencias de flanqueo más
largas.
Evolución de la expresión diferencial del gen de globina
En condiciones normales, la duplicación génica tándem significa
que se duplican las secuencias reguladoras y las de codificación. La
divergencia de secuencias subsecuente en regiones reguladoras de
acción cis puede conducir a una expresión alterada, desde los pun­
tos de vista espacial (p. ej., en diferentes tejidos) y temporal (co­
mo en distintas etapas del desarrollo). Esto puede ser una ventaja
evolucionista muy potente de duplicación génica. Debido a que las
secuencias reguladoras con frecuencia están constituidas por ele­
mentos de secuencia muy pequeños, la mutación puede dar por re­
sultado una rápida expresión divergente. Al expresar las mismas
copias esencialmente del mismo gen en diferentes compartimientos
espaciales o temporales es posible que las copias génicas adquieran
distintas funciones: los diversos ambientes proporcionan una pre­
sión de selección diferencial que origina que varíen las secuencias
de codificación como esfuerzo para adaptarse de manera óptima a
los distintos ambientes.
 12.1 | EVOLUCIÓN DE LA ESTRUCTURA GENICA Y GENES DUPLICADOS 359

G lobina an cestral

14q ■17q •22q 16p -D - H----- 11p

I I
Neuroglobína Citoglobina Mloglobina
-I- -H H
64 .1 % 7 9 .5 % 9 9 .3 % 7 1 .2 % 9 3 .2 %

H
4 3 .2 %

Fig. 12-4. Evolución de la supertamilia de la globina.

Las globinas que se codificaron dentro de un grupo génico muestran mayor grado de identidad secuencial que las codificadas en los diferentes cromosomas
(en las que los valores de identidad secuencial son menores del 30%, excepto para las comparaciones entre los grupos génicos de las globinas ay p).
Los grupos génicos de las globinas a y p se diversificaron después por duplicaciones génicas en tándem. Algunas de las duplicaciones fueron muy
recientes: los genes HBA1 y HBA2 codifican globinas a idénticas; HBG1 y HBG2 codifican globinas -y que difieren sólo por un aminoácido.

20 40 60 80 100 120 1 4 0 kb
I
e e11 \|/(3X pc e111 elv \jfpz pA ev evl \)/pY pF

G rupo d e la g lo b ín a -p C a b ra I I— | - { F l - h ^
e y \|/r| 8 p

G a la g o
-HO—H-
e Gy \|ni 5 p
Ser
hum ano I -------------- 0 — H —
e y \j/5 P
C o n e jo
■ ID ■
y v|/bh1 v|/bh3 b1 b2

R ató n
■ IÍH O O -1— I-
ybhO \|fbh2

Fig. 12-5. El grupo del gen de la globina p muestra considerables diferencias en la organización de familias génicas ortólogas de mamíferos.

El gran número de genes en el grupo de la globina p de la cabra refleja un acontecimiento de triplicación en tándem. Los cuadros en blanco indican
seudogenes. Redibujado a partir de Hardison y Miller (1993), Mol.Biol.Evol. 10:73-1 02, © 1993, Oxford University Press.
360 CAPÍTULO DOCE | LUGAR DEL HOMBRE EN EL ÁRBOL DE LA VIDA

ey vfiho ph¡ vph2 yph3 (31 ¡32

R atón

Fig. 12-6. La evolución del grupo génico de la globina p de mamíferos incluyó duplicaciones génicas frecuentes, conversiones y pérdida o inactiva­
ción génica.

Obsérvese que además de la duplicación y pérdida génicas, hay frecuentes ejemplos en los que la secuencia de un gen muestra pruebas de que se
copió de la secuencia de otro gen. Esto se describe en términos generales como conversión en esta figura, pero es posible que en algunos casos se
incluyan otros mecanismos aparte de la conversión génica. Por ejemplo, la conversión de 8 en (3 en el linaje que conduce a conejos pudo Incluir un
fenómeno de cruzamiento desigual del tipo que con mayor probabilidad dio lugar a la producción del gen 4<h3 en el linaje del ratón. Redibujado a
partir de Tagle y cois. (1992), Genomics 1 3 :7 4 1-7 60 , con autorización de Elsevier.

La superfamilia de la globina proporciona algunos ejemplos.
Las duplicaciones génicas antiguas de un gen de globina ances­
tral generaron copias que se sometieron a divergencia en secuen­
cias reguladoras, lo que suscitó que se expresaran en diferentes
tejidos (p. ej., sangre, músculo, sistema nervioso). Las copias gé­
nicas se adaptaron a sus ambientes y condujeron a una gran di­
vergencia de secuencias de los productos y formaron, de manera
respectiva, hemoglobina, mioglobina y neuroglobina, cada una
de las cuales tiene una función central de enlace de oxígeno. De­
puraciones subsecuentes en las globinas determinaron que la he­
moglobina introdujera diferentes variedades de globina, que se
expresaron en etapas particulares del desarrollo y tal vez se tor­
naron más especializadas. Por ejemplo, es posible que las cade­
nas de globina e, £ y 7 sean en especial adecuadas para enlazar
oxígeno en el ambiente comparativamente malo en oxígeno del
desarrollo temprano, en tanto que las cadenas de globina a y (3
tal vez sean los polipéptidos preferidos en el ambiente de tejidos
adultos.
12.1.6 La retrotransposición puede permitir la mezcla
de exones y contribuye de manera considerable
a la evolución génica
La retrotransposición, el proceso por el cual se elabora una copia de
cDNA natural a partir de un transcrito de RNA y a continuación se
inserta en una nueva localización cromosómica, ha sido un medio
 12.1 EVOLUCIÓN DE LA ESTRUCTURA GENICA Y GENES DUPLICADOS 361

muy potente en la modelación del genoma humano. Más de 40% de Tran scrip ció n L1
este último consiste en repeticiones derivadas de retrotransposones y l— ►
pA pA
un porcentaje pequeño de estas repeticiones se transpone de forma
activa (sección 9.5.1). Los dispositivos de retrotransposición contri­ E1 E2 L1 E3
buyeron de manera notoria a la evolución génica al elaborar copias 1 i ■ 1 1— G en A
de exones, traspasarlas de una localización en el genoma a otra y pro­
porcionar un mecanismo para que se duplicaran ciertos genes. 7 "
T L1 E3
'A A A A A A A R N A

Mezcla de exones por transducción mediada por LINE

Los elementos LINE-1 (L-l) no pertenecen a la clase RTL de re­ T ra n s c rip ta s a in v ersa L1
trotransposones y pueden sufrir transposición de modo autónomo + e n d o n u c le a s a
(sección 9.5.2). En condiciones experimentales se demostró que los
elementos LINE-1 se insertan en el intrón del gen, hacen una co­
pia del exón corriente abajo y a continuación transponen esta co­
pia del exón dentro de otro gen (Moran y cois., 1999). Esto se debe l
quizá a que la estructura de retrotransposición LINE-1 tiene una
especificidad débil para su extremo 3', lo que determina que pase
L 1 /E 3 c D N A híbrido
por alto las señales reguladoras en ese extremo. Una vez que inser­
ta un elemento LINE-1 en un gen, la transcripción de la repetición In s erto en
LINE-1 deriva con frecuencia su secuencia poli (A) propia débil y d ife re n te
utiliza en lugar de ello una señal poli(A) corriente abajo del gen lo c a liza c ió n (gen B)
huésped. Al llevarlo a cabo, puede hacer una copia de un exón que
E1 L1 E3 E2
suele fijarse dentro de otro gen después de otro fenómeno de retro- G en B — | i i m
transposición (transducción de 3 ' mediada por LINE-1; véase fig.
12-7). Por consiguiente, es posible que este mecanismo sea la base
de la mezcla de exones que al parecer ha sido importante en la evo­
Fig. 12 -7 . Elementos de transposición pueden mediar la mezcla de
lución génica (sección 12.1.3).
exones entre genes. La familia de la secuencia LINE-1 (L-1) contiene
miembros que se transponen de forma activa en el genoma humano.

Duplicación génica mediante retrotransposición
La retrotransposición de secuencias génicas es un acontecimiento
común en la modelación de genomas complejos. El copiado de
un RNA empalmado (cortado y unido) de un gen que contiene un
intrón significa que se eliminan las secuencias que contienen el in­
trón y cuando el RNA que se copia es un mRNA, la secuencia co­
piada carece de cualquier secuencia promotora. Como resultado,
la retrotransposición de secuencias mRNA copiadas tiene como
resultado típico la formación de seu d ogen es procesa dos inactivos
(fig. 9-14). Sin embargo, en ocasiones esta copia de cDNA se in­
tegra cerca de un promotor funcional y puede someterse a presión
de selección a fin de conservar la función génica para transfor­
marse en un retrogen. Los ejemplos comunes son las copias auto-
sómicas procesadas ligadas a X que producen proteínas requeridas
en sentido funcional durante la espermatogénesis. En el transcur­
so de esta última, se condensan los cromosomas X y Y para formar
el corpúscido XY inactivo desde el punto de vista transcripcional,
pero la copia de un gen autosómico puede proporcionar el pro­
ducto génico necesario. Se conocen asimismo retrogenes derivados
de genes no enlazados a X; véase sección 9.3.6 y cuadro 9-11.
Hasta fecha muy reciente se pensaba que la duplicación géni­
ca por retrotransposición se limitaba tan sólo a copiar secuencias
Los elementos de LINE-1 poseen señales poli(A) débiles y por
consiguiente la transcripción puede continuar después de esta señal
hasta que se alcanza otra señal poli(A) cercana, como en el caso del
gen A en la parte superior. La copia de RNA resultante puede contener
un transcrito no tan sólo de las secuencias LINE-1, sino asimismo de un
exón corriente abajo (en este caso E3). El complejo LINE-1 de la
transcriptasa inversa puede actuar a continuación en la secuencia
poli(A) extendida para producir una copia de cDNA que contiene
secuencias LINE-1 y E3. La transposición subsecuente hacia una
nueva localización cromosómica puede propiciar la inserción del exón
3 en un gen diferente (gen B). Véase Moran y colaboradores (1999).
exónicas. Sin embargo, los análisis de un nuevo gen quimérico
(Courseaux y Nahon, 2001) demostraron que en ciertas situacio­
nes pueden copiarse secuencias intrónicas por una vía indirecta.
Lo anterior es posible cuando la cadena antisentido de un gen que
contiene un intrón produce un transcrito de RNA maduro que in­
cluye la secuencia complementaria a las secuencias del intrón del
gen transcrito de la otra cadena. Como hoy en día se sabe que los
transcritos de RNA antisentido son muy frecuentes en el genoma
humano, algunas veces las copias retrotranspuestas pueden condu­
cir a la duplicación de genes que contienen el intrón.
362 CAPÍTULO DOCE LUGAR DEL HOMBRE EN EL ARBOL DE LA VIDA
E n d o c ito s is
G e n o m a n u c le a r G enom a
a n c e s tr a l en m ito c o n d ria l
p r o to e u c a rio ta a n c e s tra l e n
c é lu la p ro c a r io ta
Fig. 12-8. Es probable que el genoma mitocondrial humano se originara después de la endocitosis de una célula procariota por una célula eucario-
ta precursora.
En este ejemplo particular, la célula endocitante no tiene un núcleo, pero algunos modelos representan la endocitosis por una célula protoeucariota
con un núcleo. Se presupone que después de la endocitosis los genes del genoma de la procariota se transfirieron al precursor del genoma nuclear y
dejaron un genoma mitocondrial muy reducido. Véase Doolittle (1 9 9 8 ) para la descripción de un posible mecanismo de transferencia gènica.
12.2 Evolución de crom osom as
y genom as
12.2.1 Es posible que el genoma mitocondrial se
originara después de la endocitosis de
una célula procariota por un precursor
de la célula eucariota
Además del núcleo, las mitocondrias tienen un genoma, al igual
que los cloroplastos de las células de plantas. La organización y
expresión de los genomas mitocondrial y de cloroplastos mues­
tran grandes similitudes con los de células procariotas (véase más
adelante), lo que sugiere que las células eucariotas se originaron
después que un precursor de la célula eucariota (p rotoeu cariota)
englobó algún tipo de célula procariota (el sim b ion te). Se piensa
que este proceso confirió una ventaja selectiva a la nueva célula
resultante y se denominó endosimbiosis (fig. 12-8).
En la hipótesis del endosimbionte se presupone que el genoma
de la célula procariota englobada dio lugar al genoma mitocon­
drial de la actualidad. Las células procariotas actuales (bacteria y
archaed) contienen de manera característica una o unas cuantas
megabases de DNA e incluyen varios cientos o miles de genes, pero
los genomas mitocondriales son mucho más pequeños. Por ejemplo,
el genoma mitocondrial humano posee alrededor de 16 kb con
sólo 37 genes y la inmensa mayoría de las proteínas y funciones mi­
tocondriales la especifican genes nucleares (véase sección 9-1.2).
Por consiguiente, es probable que muchos de los genes que existían
de modo original en la célula englobada se transfirieran al genoma
de la célula huésped por tra n sferen cia g é n ica h o riz o n ta l o la tera l
(Doolittle, 1998). Es posible que las transferencias génicas hori­
zontales fueran extensas durante las etapas tempranas de la evolu­
ción celular.
Las identidades de las células que participaron en la endocito­
sis que dio lugar a las mitocondrias son aún un tema de cierta dis­
cusión. En la hipótesis inicial se presupuso que la célula huésped
Transferencia
g è n ic a
tenía algunas características eucariotas, pero hipótesis más recien­
tes consideran como huésped a una célula archaea. La hipótesis
del hidrógeno propone que los eucariotas surgieron por el englo-
bamiento de una proteobacteria alfa que producía hidrógeno por
un huésped anaerobio, dependiente de hidrógeno, de tipo archaea.
Una variante, la h ip ó tesis sin trófica , sugiere que el simbionte pro­
ductor de hidrógeno fue una proteobacteria 8. Se consideró que
el huésped de tipo archaea había sido estrictamente autotrófico
(capaz de sintetizar sus compuestos orgánicos a partir de moléculas
simples del ambiente, en lugar de confiar, como los heterótrofos, en
la ingestión de compuestos orgánicos sintetizados por otros orga­
nismos). Pese a ello, a fin de evitar ciclos insustanciales de meta-
bolitos en su citoplasma, el huésped perdió más adelante su vía
autotrófica y surgió un heterótrofo irreversible que contenía mito­
condrias ancestrales pero ya no dependía más del hidrógeno. A con­
tinuación, muchos de estos organismos adoptaron una respiración
basada en oxígeno más eficiente y evolucionaron las mitocondrias
aerobias.
Las hipótesis de hidrógeno/sintrofismo se basaron en observa­
ciones de ciertos eucariotas que carecen de mitocondrias: Giardia,
parabasálidos como Trichomonas, Entamoeba y unos cuantos cilia­
dos y hongos. La clasificación filogenética más aceptada coloca a
Giardia y Trichomonas como los microorganismos que divergieron
más temprano del linaje eucariota (recuadro 12-4; fig. 12-22). Los
parabasálidos, y asimismo algunos cilados y hongos amitocondria-
les, tienen organelos especializados llamados h id rogen osom a s, que
fermentan el piruvato y producen hidrógeno. El hidrogenosoma
carece de cualquier genoma que pueda ayudar a rastrear sus oríge­
nes; empero, el análisis filogenético de proteínas dirigidas a hidro­
genosomas indica una posible vía evolucionista compartida con las
mitocondrias y el hidrogenosoma en sí mismo puede ser un mito-
condrión derivado. Los eucariotas que carecen de mitocondrias
poseen también enzimas metabólicas parecidas a las bacterianas
(además de otros genes tipo bacteriano conocidos). De igual mo­
do, tal vez es importante que en tanto que la mayor parte de los
 12.2 EVOLUCIÓN DE CROMOSOMAS Y GENOMAS 363

Recuadro 1 2-4. Árbol universal de la vida y transferencia génica horizontal

La filogenética molecular (clasificación de organismos de acuerdo con
la relación de proteínas o ácidos nucleicos) produjo un choque importan­
te a finales de la década de 1970: análisis de rRNA revelaron que un gru­
po de bacterias que producen metano era muy diferente respecto de otras
bacterias. Las archaebacteria -c o m o se las denominó prim ero-tam bién
tenían al parecer características celulares poco comunes y mostraban
una relación cercana con eucariotas en muchos aspectos de la transfe­
rencia de información (replicación de DNA, reparación de DNA, transcrip­
ción, traducción, etc.). Como resultado, cada vez se aceptó más la
necesidad de reemplazar la división previa de vida en procariotas y euca­
riotas por una división alternativa en tres dominios.
► Bacterias: son los procariotas que se encuentran con frecuencia, que
habitualmente se han estudiado bien (p. ej., bacterias gramnegativas
y grampositlvas, cianobacterlas, etc.).
► Archaea: procariotas similares a eucariotas en sus procesos de trans­
ferencia de información. Muchas veces se aislan de ambientes extre­
mos (p. ej., manantiales termales, concentración salina muy alta, pH
extremo, y otros), pero también se sabe que ocurren en hábitats más
usuales, entre ellos suelos y lagos, y se han encontrado en abundan­
cia en el tubo digestivo de vacas, termitas y vida marina, en los que
producen metano.
► Eucariotas: de ellos se imaginó que las bacterias divergieron primero
del último ancestro común universal (véase figura). Se piensa que las
mitocondrias y los cloroplastos se originaron por endocitosis de cier­
tas células procariotas por precursores de células eucariotas y la
transferencia subsecuente de muchos de los genes del genoma en-
docitado al genoma huésped, una form a de transferencia génica ho­
rizontal (TGH).
Si bien, al parecer la TGH tuvo un papel crucial en la evolución del ge­
noma en el pasado, se conocen varios ejemplos recientes de TGH de
ocurrencia natural, en especial entre diferentes especies bacterianas ¡p
ej., plásmidos y transferencia de genes patogénicos y de resistencia a
los antibióticos mediada por fago). Puede ocurrir asimismo TGH entre ge-
nomas eucariotas (p. ej., entre diferentes especies Drosophila a través de
transposones de DNA). El International Human Genome Sequencing Con­
sortium ( 2 0 0 1 ) llegó asimismo a la conclusión asombrosa de que algunos
cientos de genes humanos evolucionaron por TGH de bacterias en algún
punto del linaje de vertebrados. Los genes humanos muestran homologías
claras con genes bacterianos sin encontrarse en apariencia en algunos ge-
nomas de invertebrados (D. melanogaster, C. elegans). Sin embargo, en
la actualidad se sabe que la conclusión es incorrecta porque análisis filo-
genéticos extensos identificaron homólogos en otros invertebrados y, por
consiguiente, los genes humanos pueden explicarse en términos de des­
cendencia a través de ancestros comunes -la ausencia de homólogos en
varias especies puede atribuirse a pérdida de genes en algunos linajes
(véase Brown, 2003 para consultar más referencias).
El árbol universal de vida que se muestra en esta figura está muy lejos de
aceptarse de forma unánime y lo han objetado estudios de varios otros
grupos de datos de secuencias de proteínas. De manera inevitable, es di­
fícil la clasificación filogenética si es necesario tomar en cuenta la trans­
ferencia génica horizontal común, ya que diferentes grupos génicos
pueden dar resultados filogenéticos contradictorios. En consecuencia,
hoy en día se aplican los métodos del genoma completo para la elabo­
ración del árbol. Este campo es dinámico y se aconseja a los lectores
consultar las revisiones recientes.

E u c a rio ta s
A nim ales
Plantas Hongos
M ohos de limo M icro sp o rid io s
A rc h a e a
Entam oeba
E u rya rch a eo ta A p ic o m p le x a (co m o Plasm odium)
Grampositivos Korarchaeota C re n a rc h a e o ta /' Eugiena
Grampositivos G + C \ ' C in e to p las to (co m o Trypanosoma)
B a c te ria s G+ C bajo _______-— V----------

5/e Purpurios P ara b a s a lia (co m o Trichomonas)

a Purpurios^
y/|3 Purpurios M e ta m o n d a (co m o Giardia)
Esp iro q u etas -
a
F u s o b ac teria s ■
F le x ib a c te r/b a c te ro id e s - T e rm otogalos
C ia n o b a c te ria - c.
P érd id a m ito condrial
Therm us-
Aquifex - Clave:
Posibles orígenes d e organelos
------- C lo ro p lasto s
-------M ito c o n d ria s
U ltim o a n c e s tro
c o m ú n u n iv ers al

Árbol universal de vida basado en la filogenia de rRNA.

Además de participar en la formación de los genomas mitocondriales y de cloroplastos, se observa transferencia génica horizontal en otros casos, por
ejemplo, entre espiroquetas y archaea (flecha a); bacterias grampositlvas bajas en G + C y archaea (flecha b); y entre bacterias termofílicas y archaea
(flecha c). Reproducido a partir de Brown (2 0 0 3 ), Nature Rev. Genet.4 :1 2 1 -1 3 2, con autorización del Nature Publishing Group.
364 CAPÍTULO DOCE LUGAR DEL HOMBRE EN EL ÁRBOL DE LA VIDA
eucariotas utiliza histonas para compactar su DNA nuclear, los
únicos procariotas que tienen histonas y nucleosomas son las Eur-
yarchaeota, la división de Archaea que incluye los metanógenos que
consumen hidrógeno. Véase Brown (2003) para detalles más am­
plios y una hipótesis adicional.
12.2.2 La presión de selección reducida causó
la divergencia del código genético mitocondrial
El código genético mitocondrial humano es apenas diferente del
código genético “universal” que se utiliza en genomas celulares y
mitocondriales de plantas (fig. 1-22). Aunque es idéntico a los
códigos genéticos de otros genomas mitocondriales de mamífe­
ros, muestra asimismo algunas diferencias con el código genéti­
co no universal en las mitocondrias de otros eucariotas, como
Drosophila y las células de levadura.
Se piensa que el código genético mitocondrial divergió como
resultado de una presión de selección reducida. El genoma, del
genoma procariota endocitado, que dio lugar al genoma mito­
condrial, pudo contener de manera original cuando menos varios
cientos y tal vez miles de genes. Al igual que todos los genomas
grandes, debió someterse a una presión de selección conservado­
ra potente a fin de conservar el código genético universal (altera­
ciones ligeras en el código pudieron propiciar la falta de función
génica).
Con posterioridad, se transfirieron genes del genoma mito­
condrial precursor al genoma nuclear, tal vez por procesos sucesi­
vos de lisis de organelos, incorporación del DNA en el genoma
nuclear, pérdida de copias de organelos y fijación de la pérdida
génica por derivación genética (véase Doolittle, 1998). A medida
que disminuyó de forma constante el potencial de codificación
por la transferencia de genes al genoma nuclear, debió observarse
una presión de selección cada vez menor para conservar el código
genético original.
Por último, resultó un genoma sumamente agotado (sólo 13
genes en el genoma mitocondrial humano codifican polipépti-
dos). Debido a que sólo debió participar un número muy peque­
ño de polipétidos, la presión de selección para conservar el
código genético universal debió relajarse y pudo tolerarse un cierto
grado de derivación del codón normal sin provocar consecuen­
cias desastrosas. Asimismo, es probable que los codones que se
alteraron (véase fig. 1-22) se utilizaran de modo extenso en si­
tios en los que pudieron ser perjudiciales las sustituciones de
aminoácidos.
Por supuesto, el proceso de agotamiento del genoma mitocon­
drial fue lento y continuó durante toda la evolución metazoárica.
Como resultado, los distintos organismos muestran diferencias
en los genes conservados por el genoma mitocondrial (por esta
razón en algunas especies difiere el código genético mitocon­
drial). Sin embargo, en términos comparativos, los genomas mi­
tocondriales de las plantas conservaron muchos genes y por
consiguiente en este caso no fue posible la derivación del código
genético universal.
12.2.3 Es posible que la evolución de los genomas de
vertebrados incluyera duplicación del genoma
completo
La duplicación del genoma que tiene como resultado polip loidía
es un medio eficaz para incrementar el tamaño y versatilidad del ge­
noma. Se dispone de manera simultánea de copias para todos los
genes, lo cual evita problemas de dosis génica diferencial. Varias es­
pecies son poliploides de modo natural o se sabe que son poliploi-
des degenerados, incluida la mayor parte de las plantas de
floración, muchos peces, la levadura Saccharomyces cerevisiae, Xeno-
pus la evisy cuando menos un mamífero, la rata vizcacha roja tetra-
ploide (véase Otto y Whitton, 2000; Wolfe, 2001). La tetraploidía
constitucional es rara y letal en seres humamos, pero estos últimos y
otros organismos diploides tienen algunas células poliploides natu­
rales como resultado de duplicaciones cromosómicas secuenciales
por mitosis sin división celular intermedia o por fusiones celulares
(sección 3.1.4).
Debido a que varias especies sufrieron con claridad duplicación
del genoma, es obvio que no son raros los fenómenos de poliploi-
dización. Esta observación, aunada a las comparaciones de las ca­
racterísticas génicas en vertebrados e invertebrados, sugiere la
posibilidad de que todos los vertebrados se sometieran cuando me­
nos a una ronda de duplicación del genoma durante la evolución.
Después de la duplicación del genoma, y de un estado tetraploide
transitorio, cabría esperar que reordenamientos cromosómicos a
gran escala subsecuentes causaran divergencia de cromosomas y
restablecieran la diploidía, pero ahora con el doble del número de
cromosomas.
La relajación de la presión de selección en muchas de las copias
génicas después de la duplicación del genoma daría por resultado
que la gran mayoría adquiriera mutaciones perjudiciales y se torna­
ra seudogenes. Más adelante, debido a la falta de cualquier presión
de selección para conservarlos, podría esperarse que las copias géni­
cas defectuosas se eliminaran del genoma por varios mecanismos de
recambio de DNA (véase Lynch y Conery, 2000). Por esta razón,
es posible que algún tiempo considerable después del aconteci­
miento de duplicación del genoma, la prueba de duplicación pre­
via de toda la extensión del genoma fuera escasa; cabría esperar que
se conservaran sólo los muy pocos genes duplicados que continua­
ron con actividad funcional.
Las proposiciones iniciales de acontecimientos de tetraploidiza-
ción antiguos durante la evolución de los vertebrados consideraron
dos rondas de duplicación del genoma, la hipótesis 2R (véase Wolfe,
2001). Gran parte de las pruebas que apoyan la hipótesis 2R se basa
en la observación de que genes esenciales y grupos génicos en inver­
tebrados como Drosophila tienen tres a cuatro equivalentes en verte­
brados. Los ejemplos importantes incluyen los cuatro grupos génicos
Hox comunes (fig. 12-9), los cuatro grupos génicos paraHox (cromo­
somas humanos 13ql3-14, Xql3-q22, 4ql 1-12, 5q31-33) y los gru­
pos de MHC (los cromosomas humanos Iq21-q25, 6p21.3-p22.2,
9q33-q34, 19pl3.1-pl3.4; véase Abi-Rached y cois., 2002). En cada
uno de estos casos, hay un grupo génico único en Amphioxus, el in­
vertebrado más cercano relacionado con los vertebrados.
 12.2 EVOLUCIÓN DE CROMOSOMAS Y GENOMAS 365

AbdB A bdA Ubx

Drosophila

14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Am phioxus

A -1 3 A -11 A -1 0 A -9 A -7 A -6 A -5 A -4 A -3 A -2 A-1
HO XA

B -9 B -8 B -7 B -6 B -5 B -4 B -3 B -2 B-1
HOXB

C -1 3 C -1 2 C -11 C -1 0 C -9 C -8 C -6 C -5 C -4
HOXC

D -1 3 D -1 2 D -11 D -1 0 D -9 D -8 D -4 D -3 D-1
HOXD

Fig. 12-9. La organización de los grupos génicos Hox en mamíferos y Amphioxus sugiere la posibilidad de una o dos rondas de duplicación ances­
tral del genoma.
Los seres humanos y otros mamíferos poseen cuatro grupos que contienen nueve a 11 genes Hox típicos, pero Amphioxus, el invertebrado que se considera
el relacionado más de cerca con los vertebrados tiene 14 de esos genes. Se piensa que el orden lineal de los genes en un grupo rige el orden temporal en que
se expresaron durante el desarrollo y asimismo sus límites de expresión anteriores a lo largo del eje anteroposterior (véase fig. 3-10). Los cuadros sombreados
indican grupos de paralogía que consisten en genes con patrones de expresión muy similares y tal vez funciones parecidas. Aunque los cuatro grupos
comunes Hox de mamíferos muestran conservación general potente del orden génico, los grupos de paralogía indican quizá que hubo pérdida génica de
lo que pudo ser un grupo ancestral con 13 o 14 genes. Un reordenamiento en el linaje de Drosophila condujo a la separación de los genes en dos subgrupos.

Después de los proyectos del genoma, fue evidente que los ver­
tebrados tienen alrededor de 30 000 a 35 000 genes, cerca del do­
ble del número de genes que se encuentra en invertebrados en lugar
de la diferencia cuádruple muy esperada. Un amplio análisis recien­
te del esquema de la secuencia del genoma humano que efectuaron
McLysaght y colaboradores (2002) sugirió que tiene muchos más
genes duplicados de los que cabría esperar por el azar. Casi 25% de
los genes humanos tiene parálogos claramente relacionados y las
comparaciones con ortólogos en D. melanogaster y C. elegans indi­
can que hace alrededor de 350 a 600 millones de años se llevó a ca­
bo un brote de actividad de duplicación génica, consistente cuando
menos con una ronda de duplicación del genoma completo.
12.2.4 Durante la evolución de los genomas de
mamíferos hubo numerosos reordenamientos
cromosómicos mayores
Durante la evolución del genoma de mamíferos se observaron reor­
denamientos cromosómicos a gran escala frecuentes y es posible se­
parar la evolución de los cromosomas de la del fenotipo. Un
ejemplo típico lo proporcionan dos especies de muntjac (un tipo de
venado pequeño). El muntjac chino y el indio (fig. 12-10) se rela­
cionan de modo tan estrecho que pueden aparearse y producir des­
cendencia que, empero, no es viable. El muntjac chino tiene 46
cromosomas pero, como resultado de varios acontecimientos de fu­
sión cromosómica, el muntjac indio sólo posee seis cromosomas en
hembras y siete en machos.
Si bien el ejemplo anterior es extraordinario, durante la evolución
de los mamíferos ocurrieron con regularidad reordenamientos cro­
mosómicos de importancia. Al parecer, son en particular frecuentes
las inversiones; un poco menos las translocaciones. Los centrómeros
(que están compuestos de secuencias en evolución rápida) pueden
cambiar posiciones. Cuando se comparan los cromosomas humanos
con los de los relacionados vivos más cercanos, los grandes monos,
hay similitudes muy notorias en los patrones de bandeo cromosómi-
co (Yunis y Prakash, 1982). Los reordenamientos más frecuentes han
sido inversiones (incluidas inversiones pericéntricas y paracéntricas!
y además hubo ciertas translocaciones (véase sección 12.4.2 y figuras
12-27, 12-28).
Si bien es sencillo identificar cromosomas ortólogos en especies
relacionadas muy de cerca, las comparaciones cromosómicas entre
especies relacionadas de forma más distante suelen mostrar que sólo
366 CAPÍTULO DOCE LUGAR DEL HOMBRE EN EL ÁRBOL DE LA VIDA

Fig. 12-10. Muntjac chino e indio.

El primero (Muntiacus reevesi; fotografía de la izquierda) y el segundo (Muntiacus muntjak\ fotografía de la derecha) se relacionan de forma muy estrecha,
pero tienen cariotipos muy diferentes (véase texto).

se conservan segmentos cromosómicos pequeños. La conservación
del orden lineal de los genes (conservación de sintenia) suele limi­
tarse por consiguiente a segmentos cromosómicos pequeños. Con
objeto de estimar la conservación de la sintenia, métodos previos
mapearon genes ortólogos a cromosomas en las dos especies, pero
los proyectos genómicos proporcionaron mapas más detallados de
la conservación de la sintenia. Véase en la figura 12-11 la conserva­
ción de la sintenia humana y del ratón.
Los 342 segmentos cromosómicos que comparten seres huma­
nos y ratones significan que en prom edio la conservación de la sin-

I— 5 5 ¡ b ¡j¡
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Fig. 12-11. La conservación de sintenia en seres humanos y el ratón suele limitarse a segmentos cromosómicos pequeños.

Los segmentos y bloques > 300 kb de tamaño con sintenia conservada en cromosomas humanos están superpuestos en los 20 cromosomas del ratón
(arriba). Cada color corresponde a un cromosoma humano particular. Los 3 4 2 segmentos están separados entre sí por líneas blancas muy delgadas
dentro de los 217 bloques de color consistente. Los cromosomas X están representados como bloques sintónicos recíprocos y únicos y los cromosomas
17 y 20 humanos corresponden por completo a una porción de los cromosomas 11 y 2 del ratón (pero con reordenamlentos extensos hacia 16
segmentos cuando menos en el primer caso). Otros cromosomas muestran pruebas de reordenamiento intercromosómico mucho más extenso. Figura
reproducida del Mouse Genome Sequencíng Consortium (2002), Nature 4 2 0 :5 2 0 -5 6 2 , con autorización del Nature Publishing Group.
 12.2 EVOLUCIÓN DE CROMOSOMAS Y GENOMAS 36"

A) C e n tro m é ric a s

T e lo m é rica s

Fig. 12-12. Ejemplos de duplicaciones segmentarias recientes en el genoma humano.

A) Duplicaciones segmentarias en 22q. Las líneas horizontales representan secuencias sucesivas de 1 Mb del extremo centromérico (arriba a la
izquierda) al extremo telomérico (abajo a la derecha). Las barras negras indican brechas de secuencia. Las secuencias que participan en duplicaciones
intercromosómicas (rojo) se limitan sobre todo a las regiones más centroméricas y teloméricas. Las duplicaciones intracromosómicas se muestran en
azul. Adaptado de Eichler (20 0 1 ), Trends Genet 11:661-669, con autorización de Elsevier. B) homologías intercromosómicas para secuencias del
cromosoma 2 humano. Ei cromosoma 2 se muestra como una barra horizontal roja en la parte media. Los otros 11 cromosomas (barra horizontal
verde) contienen segmentos que son muy homólogos de las secuencias del cromosoma 2 (enlazados por líneas verticales de colores). Reproducido
de Venter y cois. (2 0 0 1 ), Science 2 9 1 :1 3 0 4 -1 3 5 1 , con autorización de la American Association fo rth e Advancement of Science.

tenia se extiende a un poco menos de 10 Mb y que las secuencias
de la mayor parte de cromosomas individuales humanos y del ra­
tón tiene ortólogos en una variedad de diferentes cromosomas en
la otra especie. Una excepción notable es el cromosoma X: la in­
mensa mayoría de secuencias en el cromosoma X humano posee
ortólogos en el cromosoma X del ratón (porque la inactivación de
X en mamíferos evolucionó para asegurar una relación de dosis gé-
nica 2:1 eficaz para genes autosómicos:enlazados a X; véase sec­
ción 12.2.8). Sin embargo, incluso en el caso del cromosoma X ha
habido numerosas inversiones que revolvieron el orden génico en­
tre seres humanos y ratones y el análisis de las longitudes y el nú­
mero de segmentos de sintenia conservados en los autosomas
corresponde a un proceso de rotura cromosómica aleatoria (Mou-
se Genome Sequencing Consortium, 2002).
12.2.5. Duplicación segmentaria en linajes de primates
e inestabilidad evolucionista de secuencias
pericentroméricas y subteloméricas
Una de las mayores sorpresas que surgieron de la secuenciación del
genoma humano fue la extensión de duplicaciones segmentarias
recientes en términos evolucionistas, una forma importante de du­
plicación subgenómica que puede conducir a reordenamientos ero-
mosómicos. En la actualidad se piensa que alrededor de 5% de las
secuencias del genoma humano está representado en copias dupli­
cadas dispersas con > 90% de identidad secuencial que se extien­
de en segmentos de 1 kb hasta varios cientos de kb de longitud
(Bailey y cois., 2002; Samonte y Eichler, 2002; véase fig. 12-12).
Pueden mencionarse las siguientes:
368 CAPÍTULO DOCE LUGAR DEL HOMBRE EN EL ÁRBOL DE LA VIDA

► d u p lica cion es in tracrom osóm ica s que tienden a ocurrir en regio­
nes eucromáticas. Cuando la identidad secuencial excede 95%
y se extiende 10 kb o más, estos elementos de secuencias suelen
predisponer a deleciones, duplicaciones e inversiones a gran es­
cala, muchas de las cuales se acompañan de enfermedades (sec­
ciones 11.5.4, 11.5.5).
► d u p lica cion es in tercrom osóm ica s que tienden a estar localizadas
en regiones pericentroméricas o subteloméricas. Las duplica­
ciones pueden incluir genes o porciones de ellos, que suelen
dar lugar a copias génicas no funcionales esparcidas (fig. 9-13),
transcritos quiméricos y quizá nuevos genes. Al parecer, las du­
plicaciones intercromosómicas de primates son un poco menos
frecuentes que las intracromosómicas (Samonte y Eichler,
2002).
La selección del genoma del ratón para secuencias relacionadas
muy de cerca con las secuencias humanas duplicadas de modo seg­
mentario revela de manera característica secuencias de copia única.
Por consiguiente, las duplicaciones segmentarias humanas se origi­
naron en época comparativamente reciente: en apariencia, los
acontecimientos de duplicación segmentaria han sido constantes
en el linaje de primates durante los últimos 40 millones de años y
es posible que casi todos sucedieran en los últimos 12 millones de
años (Samonte y Eichler, 2002). Sin embargo, la duplicación seg­
mentaria no es específica de primates: en el ratón tuvieron lugar
duplicaciones pericentroméricas recientes no relacionadas (Thomas
y cois., 2003). No se comprende bien el mecanismo de la duplica­
ción segmentaria, pero casi siempre da lugar a estructuras en mo­
saico que combinan módulos de secuencias de una variedad dife­
rente de localizaciones cromosómicas. Al parecer, ciertas regiones
del genoma, en especial las pericentroméricas, aceptan con facili­
dad copias de secuencias de otras regiones del genoma y las inter­
cambian con otras de estas regiones (véase fig. 12-13).
12.2.6 Los cromosomas X y Y humanos muestran
regiones importantes de homología secuencial,
incluidas las regiones seudoautosómicas comunes
En mamíferos, pares de cromosomas autosómicos homólogos son
idénticos desde el punto de vista estructural (homomórfico); se pre­
supone que el pareamiento de cromosomas en la meiosis se facilita
por el grado alto de identidad secuencial entre homólogos, aunque
por un mecanismo que no se comprende. En contraste, los cromo­
somas X y Y de seres humanos y otras especies de mamíferos son he-
teromórficos. El cromosoma X humano es submetacéntrico y
contiene más de 160 Mb de DNA, en tanto que el Y es acrocéntri­
co y mucho más pequeño (incluye alrededor de 50 Mb de DNA).
El cromosoma X humano contiene numerosos genes de importan­
cia; en notable contraste, el cromosoma Y sólo posee alrededor de
50 genes (cuadro 12-2) y la mayor parte del cromosoma Y se com­
pone de heterocromatina constitutiva, inerte desde el punto de vis­
ta genético. Sin embargo, cabe señalar que muchos de los genes en
la porción no recombinante del cromosoma Y participan en la es­
permatogénesis y la determinación del sexo (cuadro 12-2) y que el
cromosoma X al parecer también contiene en abundancia genes re­
lacionados con el sexo y la reproducción (p. ej., Wangy cois., 2001).

Locus donadores

Distribución de transposición

Locus aceptor

Duplicación
com pleta

Fig. 12-13. Modelo de duplicación segmentaria.

Las copias de secuencias moderadamente largas a grandes (segmentos de 1 a 2 0 0 kb) se originan por duplicación de secuencias a partir de ciertas
regiones en el genoma (locus donador) y se transponen al Integrarse en cualquier otra parte del genoma (transposición duplicativa). Como se muestra,
pueden insertarse en regiones receptoras comunes diferentes secuencias donadoras de regiones muy distintas. Los diferentes acontecimientos de
transposición duplicativa ocurren de manera independiente con el tiempo y dan lugar a bloques más grandes de secuencias duplicadas que tienen
una estructura en mosaico. Las porciones de esta estructura en mosaico pueden a su vez duplicarse y copiarse a otras regiones del genoma. Los
reordenamlentos (deleciones e Inversiones) alteran de forma subsecuente la estructura de estas regiones. Reproducido de Samonte y Eichler (2 0 0 2 ),
Nature Rev. Genet. 3:6 5 -7 2 , con autorización de Nature Publishing Group.
 12.2 EVOLUCIÓN DE CROMOSOMAS Y GENOMAS 369

Cuadro 12-2. Clasificación funcional de genes del cromosoma Y humano.

Categoría génica Genes Función(es) Especificidad ¿Múltiples copias ¿Tiene homólogo ¿Homólogo X
conocida/posible de expresión en Y? X activo? inactivado en
mujeres?

Seudoautosómica M uchos* Tan diversa como genes Diversa No Sí Sí (excepto

autosómicos haya SYBL1, HSPRY3
Clase 1 RNY RPSRY, ZFY, Cuidadores Amplia No Si- No
USP9Y, DBY,
UTY, TB4Y,
SMCY, EIF1AY
Clase 2 RNY TÍY1, TSPY, Espermatogénesis Testículo Si- No N/A
PRY TTY2,
CDY, XKRY,
DAZ, BPY2
Clase 3 RNY SRY Determinación masculina Testículo No Sí Sí
RBMY Espermatogénesis Testículo Sí Si- Sí
AMELY Desarrollo dental Yema dental No Sí Tal vez
VCY Desconocida Testículo Si Sí N/A
PCDHY Desconocida Cerebro No Sí No

(RNY, región no recomblnante del cromosoma Y; N/A, no aplicable).

‘ Cuando menos 17, de los cuales 13 se encuentran en la región seudoautosómica mayor (véase fig . 12-15).

A pesar de ser distintos a nivel morfológico, los cromosomas
X y Y muestran regiones sustanciales de homología, incluida una
diversidad de homologías Xp-Yq y Xq-Yp, y también homologías
Xp-Yp y Xq-Yq. Estas homologías permitieron identificar una di­
versidad de pares de genes X-Y (véase fig. 12-14). La existencia de
estas homologías sugiere que los dos cromosomas evolucionaron
a partir de un par de cromosomas homomórficos ancestrales. Es
evidente que los dos cromosomas sufrieron con posterioridad una
divergencia notoria y las secuencias que están cerca en un cromo­
soma pueden tener equivalentes muy espaciados en el otro. Los
cromosomas X y Y también son capaces de parearse durante la
meiosis masculina y en consecuencia pueden intercambiar se­
cuencias en la misma forma en que lo llevan a cabo los homólo­
gos autosómicos. No obstante, los intercambios meióticos son de
extensión muy reducida y se limitan a regiones seudoautosómi-
cas pequeñas en las puntas del cromosoma (por consiguiente, es­
tas secuencias no están ligadas a X o Y y de ahí el término
seudoautosómica). En los seres humanos existen dos regiones seu-
doautosómicas.
► La región seudoautosómica mayor (PAR-1) se extiende 2.6 Mb
en las puntas extremas de los brazos cortos de X y Y y se sabe
que contiene cuando menos 13 genes (Ried y cois., 1998; Gian-
francesco y cois., 2001). Es el sitio de un cruzamiento obligado
durante la meiosis masculina que se piensa que es necesario pa­
ra la segregación meiótica correcta. Esta región muy pequeña es
inestable en cuanto a la evolución (véase más adelante) y con­
tiene secuencias muy recombinógenas (la frecuencia promedio
de recombinación del sexo es de 28%, una cifra que, para una
región de sólo 2.6 Mb, es alrededor de 10 veces la frecuencia de
recombinación normal). Por supuesto, la elevada cifra se debe
sobre todo al cruzamiento obligatorio en la meiosis masculina
que tiene como resultado una frecuencia de cruzamiento que se
aproxima al 50%. Se ha demostrado que el límite entre la re­
gión seudoautosómica mayor y la región específica del sexo se
mapea dentro del gen del grupo sanguíneo XG y el gen deter­
minante del varón SRYsólo ocurre a unos 5 kb del límite PAR-
1 en el cromosoma Y (fig. 12-15).
► La región seudoautosómica menor (PAR2) abarca 330 kb en
las puntas extremas de los brazos largos de X y Y y sólo contie­
ne cuatro genes (Ciccodicola y cois., 2000; Charchar y cois.,
2003). El cruzamiento entre X y Y en esta región no es tan co­
mún como en PAR-1 y no es necesario ni suficiente para el éxi­
to en la meiosis masculina.
12.2.7 Los cromosomas del sexo humanos evolucionaron
de autosomas y divergieron debido a la supre­
sión regional periódica de recombinación
En muchos animales se desarrollaron de manera independiente
cromosomas del sexo precisos con linajes evolucionistas desiguales,
incluidos no sólo los mamíferos sino las aves (en las que las hem­
bras son ZW, el sexo heterogamético, y los machos ZZ, el sexo homo-
gam éticó) y ciertas especies de peces, reptiles e insectos. Se piensa
que en cada caso los diferentes cromosomas del sexo se iniciaron
como autosomas virtualmente idénticos, excepto que uno de ellos
evolucionó a un locus mayor determinante del sexo (el locus SRYen
seres humanos, localizado a 5 kb del límite PAR-1 en el Y). La evo­
lución subsecuente dio por resultado que los dos cromosomas se
tornaran cada vez más diferentes hasta que, en muchas especies, se
redujo un cromosoma del sexo (el Y en mamíferos, el W en aves) a
370 CAPITOLO DOCE LUGAR DEL HOMBRE EN EL ÁRBOL DE LA VIDA

r G YG 2
r ARSD
ARSE J
PRKX
STS
KAL1 >
AM ELX SRY
TB 4X RPS4Y
E IF1A X
ZFX ZFY
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U B E 1X

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AM ELY

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a A R S D P -A
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SMCY

RPS4X EIF1A Y

RBMY

C la v e :

R eg ió n s e u d o a u to s ó m ic a
C e n tro m e ro
Parte del crom osom a X específica de sexo
RBMX
S O X3 P orción del c ro m o s o m a Y e u c ro m á tic a
no re c o m b in a n te

Porción del cromosoma Y heterocromática

no re c o m b in a n te

Fig. 12-14. Los cromosomas X y Y humanos muestran varias regiones de homología que indican un origen evolucionista común.

Las reglones seudoautosómicas en las puntas de Xp 7 Yp son idénticas (véase la fig. 1 2 -1 5 ), al igual que las de las puntas Xq 7 Yq. Las reglones no
recombinantes restantes muestran varios pares de genes XY claramente homólogos aunados al par S0X3-SRY (que tiene un dominio HMG común). Los
números uno a cuatro en el cromosoma X corresponden a diferentes “estratos evolucionistas” (véase el texto). Algunos de los homólogos del cromosoma
Y degeneraron a seudogenes (el símbolo termina en una R por ej„ ARSEP ARSDP, etc.). Reproducido a partir de Lahn y Page (1999), Science 286:964-967,
con autorización de la American Association for the Advancement of Science.
 12.2 EVOLUCIÓN DE CROMOSOMAS Y GENOMAS 371

P A R -1 , región s e u d o a u to s ó m ic a m a y o r Lim ite Cromosoma de sexo específico

ANT3
PPP2R3B CSF2RA I DHRSXY ARSE ARSF
TEL PGPL SHOX XE7 \IL3RA¡ASMTL ¡ A SM T Tramp M IC2 5' XG !3 ' XG ARSD^
I_____■ ■ ■ J lÍ ué J l

O rtó lo g o s O rtó lo g o s
d e rató n + divdiv - ■ div div
d e ratón

ANT3 J div div O rtó lo g o s

PPP2R3B CSF2RA d e ratón
TEL PGPL I SHOX XE7 \IL3RAIASMTL A S M T Tramp M IC2 5 ' x d SRY RPS4Y
i___ ■ ■ ■__ -MJftJÉLÉ____ m ___ M_ _■ .JHt_■__

Fig. 12-15. Organización e inestabilidad evolucionistas de la principal región seudoautosómica humana (PAR-1).

La región PAR-1 de 2.6 Mb es común en las puntas de Xp (arriba a la izquierda) -y Yp (abajo a la izquierda; TEL, telómero) y contiene cuando menos 13
genes. Adyacentes a PAR-1 se encuentran las partes largas específicas del sexo de X y Y de las cuales se muestran los genes inmediatamente adyacentes
a PAR-1 a la derecha de la línea limítrofe. El límite PAR-1 ocurre dentro del gen del grupo sanguíneo XG en el cromosoma X. En el cromosoma Y hay
un homólogo del gen XG truncado: el promotor y los escasos primeros exones se presentan en la región seudoautosómica, pero con posterioridad son
secuencias específicas del cromosoma Y no relacionadas, por ejemplo SRY, RPS4Y. Los genes incluidos en PAR-1 y en las regiones vecinas específicas
de sexo (que fueron parte de una región seudoautosómica anterior) se conservaron mal durante la evolución y con frecuencia no se detectan ortólogos
en el ratón ( - ) o con una divergencia muy alta (div).

un cromosoma pequeño, con abundancia de secuencias repetidas
pero sólo con muy pocos genes funcionales. Al parecer existe una
presión evolucionista para adoptar la medida de tener dos cromo­
somas del sexo diferentes desde los puntos de vista estructural y
funcional.
Orígenes autosómicos y plasticidad de regiones
seudoautosómicas
Durante la evolución no se conservaron bien las regiones seudoau­
tosómicas. En el ratón no hay un equivalente de PAR2, e incluso
en algunos primates, y los ortólogos de los genes PAR2 del ratón
conocidos son autosomas o se mapean cerca del centròmero del
cromosoma X. También existen diferencias de especies muy impor­
tantes en PAR-1. En los seres humanos el límite de PAR-1 ocurre
dentro del gen XG, que al parecer no tiene un ortólogo en el ratón
(fig. 12-5). La región seudoautosómica equivalente del ratón (PAR)
de sólo 0.7 Mb de largo, y localizada en la punta del brazo largo del
X, muestra una homología secuencial muy pequeña con PAR-1 hu­
mano (Perry y cois., 2001). El límite de PAR en el ratón se encuen­
tra dentro del gen M idi (antes Fxy), cuyo ortólogo humano MIDI
se ubica de manera más proximal dentro de la región específica del
cromosoma X. El gen de sulfatasa de esteroides, Sts, es el único otro
gen que se halla en el PAR del ratón, pero el homólogo humano se
sitúa alrededor de 3.5 Mb proximal a PAR-1 en el cromosoma X.
Tres de los genes PAR-1 humanos tienen ortólogos autosómicos en
el ratón y otros genes PAR-1 humanos poseen ortólogos autosómi­
cos en algunos otros mamíferos. Por consiguiente, se asume que la
región PAR-1 evolucionó mediante la adición repetida de segmen­
tos autosómicos en la región seudoautosómica de uno de los cro­
mosomas del sexo, antes de recombinarse con el otro cromosoma
del sexo (Graves y cois., 1998).
Se piensa que PAR-1 y áreas contiguas son regiones inestables
en términos comparativos. Los intercambios frecuentes de DNA
dan por resultado una alta incidencia de fusiones génicas, dupli­
caciones de exones y mezcla de exones (véase Ried y cois., 1998).
Muchos de los genes PAR-1 y genes en regiones específicas de se­
xo cercanas (que antes fueron regiones seudoautosómicas; véase
más adelante) no parecen tener ortólogos detectables en el ratón
(mediante el análisis de la secuencia del genoma del ratón dispo­
nible o por valoración de hibridación). Los que tienen ortólogos
se someten a menudo a divergencia secuencial en extremo rápida
como se observa en el determinante mayor del varón SRY, que se
localiza a sólo 5 kb del límite de PAR-1 y el gen de la sulfatasa de
esteroides, STS.
Orígenes autosómicos para Xp humano y estratos
evolucionistas en el cromosoma X
La comparación de genes en mamíferos relacionados en grado dis­
tante indica que gran parte del brazo corto del cromosoma X huma­
no se adquirió en época reciente por translocación de un autosoma
X. Los mamíferos suelen dividirse en dos subclases: prototeria (los
mamíferos monotremos o que ponen huevos) y teria, que a su vez
se subdivide en dos subclases: metateria (marsupiales) y euteria, un
grupo que incluye mamíferos placentarios. Se ha encontrado que
372 CAPÍTULO DOCE LUGAR DEL HOMBRE EN EL ÁRBOL DE LA VIDA

muchos genes euterianos ligados a X están ligados a X en marsupia­
les. Sin embargo, los genes que se mapean a una parte grande de Xp
humano (distal a Xp 11.3) tienen ortólogos en autosomas de marsu­
piales y monotremos. Debido a que la divergencia prototeriana fue
anterior a la división metateriana-euteriana (véase fig. 12-24), la ex­
plicación más sencilla es que se translocó cuando menos una región
autosómica grande al cromosoma X en un momento temprano del
linaje euteriano.
Aparte de las regiones PAR-1 y PAR2 compartidas, hay todavía
alrededor de 20 pares de genes X-Y que son reliquias de la identi­
dad de secuencia extensa que existió alguna vez entre los cromoso­
mas X y Y ancestrales. En los pares X-Y, casi todos los genes en X
se localizan en Xp pero las secuencias equivalentes se encuentran al
parecer en la totalidad de la porción eucromática de Y (fig. 12-14).
Sin embargo, hay una diferencia regional clara en la divergencia se-
cuencial de los pares X-Y. Al tomar a (el número medio de sus­
tituciones sinónimas por sitio sinónimo; véase sección 11.2.5)
como una medida de la divergencia secuencial, pueden agruparse
los pares X-Y en cuatro clases de divergencias de secuencias (y por
consiguiente de edad) que corresponden a regiones lineales a lo lar­
go del cromosoma X (Lahn y Page, 1999; véase cuadro 12-3).
Los datos del cuadro 12-3 indican que las edades de los pares de
genes X-Y disminuyen en forma gradual a medida que se prosigue
a lo largo de la porción no recombinante de X, desde el extremo del
brazo largo (Xq distal) hasta el extremo del brazo corto (Xp distal).
Son obvios cuando menos cuatro estratos evolucionistas, que corres­
ponden a los cuatro juegos de genes en la figura 12-14 y se piensa
que la recombinación entre X y Y se suprimió a nivel regional, pri­
mero en el estrato uno, hace alrededor de 240 a 320 millones de
años (poco después de la divergencia de los linajes que condujeron
a los mamíferos y las aves; véase fig. 12-24 para información filo-
génica). Con posterioridad, la supresión de la recombinación se
dispersó en pasos discretos hasta el estrato dos, a continuación al
tres y por último al cuatro. La forma más probable en que se supri­
mió la recombinación fue tal vez por inversiones (que se sabe que
son capaces de suprimir recombinación en regiones amplias en ma­
míferos) y que tal vez ocurrieron en el cromosoma Y (p. ej., una in­
versión específica de Y explicaría por qué el límite PAR-1 cruza un
gen que está intacto en el cromosoma X pero alterado en Y; véase
fig. 12-5). En la figura 12-16 se ilustra una secuencia de los proba­
bles acontecimientos que explican la forma en que evolucionaron
los cromosomas del sexo.
12.2.8 La diferenciación del cromosoma del sexo
dio por resultado degeneración progresiva del
cromosoma Y e inactivación del cromosoma X
¡Es posible que el cromosoma Y humano esté en camino
de extinguirse pero aún hay un futuro para los varones!
La evolución de los sistemas de determinación del sexo fue crucial
para el desarrollo de organismos multicelulares complejos por la
novedad genética proporcionada por recombinación. Después de
establecerse un locus determinante del sexo mayor durante la evo­
lución es esencial suprimir la recombinación en la región que contie­
ne ese locus (a fin de conservar las diferencias de sexo). En contraste
con el cromosoma X humano que puede recombinarse en toda su
longitud con un cromosoma X compañero en la meiosis femenina, el
cromosoma Y humano suele considerarse como un cromosoma en
esencia asexual (no recombinante).
La genética de población predice que un cromosoma no recom­
binante debe degenerarse por un proceso conocido como depura­

Cuadro 12-3. Los genes homólogos ligados a X y Y pueden agruparse en cuatro categorías de divergencia de secuencias que
corresponden a la localización del gen enlazado a X en el cromosoma X (véase fig. 12-14).
Par gènico X-Y D ivergencia de DNA Par gènico X-Y Dive
(*se u d o g é n ) Ks (% ) (*se u d o g é n ) Ks (% )

Grupo 1 Grupo 2
RPS4X/Y 0.97 18 UBE1X/Y 0.58 16

RBMX/Y 0.94 29 SMCX/Y 0.52 17

S0X3/SRY 1.25 28

Grupo 3 Grupo 4
TB4X/Y 0.29 7 GYG2/GYG2P* 0 .1 1 7

EIF1AX/Y 0.32 9 ARSD/ARSDP* 0.09 7

ZFX/Y 0.23 7 ASRE/ARSEP* 0.05 4

DFFRX/Y 0 .33 11 PRKX/Y 0.07 5

DBX/Y 0.36 12 STS/STSP* 0 .1 2 11

CASK/CASKP* 0.24 15 KALI/KALP* 0.07 6

UIXIY 0.26 12 AMELX/Y 0.07 7

 12.2 EVOLUCIÓN DE CROMOSOMAS Y GENOMAS 3"3

ción de Muller. Si la tasa de mutación es razonablemente alta, la
ausencia de recombinación significa que pueden acumularse de
manera gradual mutaciones perjudiciales en genes de ese cromoso­
ma durante las escalas de tiempo evolucionistas largas (no existe la
posibilidad de restablecer el cruzamiento en lugar de una secuencia
alela que carece de la mutación perjudicial). Los alelos mutantes
pueden derivar a una fijación como cromosomas Y con la pérdida
de pocos mutantes por azar, o pueden “transportarse de forma ca­
sual” junto con un alelo favorable en una región protegida de re­
combinación.
Una vez que se acumulan mutaciones en el cromosoma Y no re-
combinante y causan pérdida de función génica, no hay una pre­
sión selectiva para conservar el segmento de DNA importante. Los
mecanismos de recambio de DNA aseguran que el cromosoma se
contraiga de manera gradual, pero inexorable, por una serie de de­
leciones. Como resultado, es posible que el cromosoma Y humano
se encamine a la extinción. Sin embargo, continuará la masculini-
dad por el cambio a un sistema de determinación del sexo alterna­
tivo. Es muy probable que sea conferido tan sólo por una relación
de dosis génica X:autosoma y los individuos XO serán varones (co­
mo en el caso de Drosophilá).
Desarrollo necesario de la Inactivación del cromosoma X
La evolución del sistema de determinación del sexo en mamíferos
también está entremezclada de manera inextricable con la evolu­
ción del mecanismo de inactivación de X para compensación de
dosis (sección 10.5.6; véase Ellis, 1998). En respuesta a una des­
trucción a gran escala de las secuencias del cromosoma Y, tal vez
hubo presiones para incrementar la expresión génica en el cromo­
soma X. Sin embargo, ello conduciría a una expresión génica exce­
siva en el cromosoma X en mujeres que podría causar una aptitud
reducida. Como resultado, evolucionó una forma de compensación
de dosis génica por la cual se eligió un cromosoma X aislado para
ser inactivado en células femeninas (inactivación d eX ).
La explicación de la inactivación del cromosoma X es actuar
como un mecanismo de compensación de dosis para los genes del
cromosoma X que no tienen homólogos en el cromosoma Y. No
obstante, una pequeña minoría de genes humanos ligados a X tie­
ne homólogos fu n cionales en el cromosoma Y. Debido a que estos
genes no muestran diferencias de sexo en la dosis génica, cabría
esperar que escaparan a la inactivación de X. Todos los genes
PAR-1 estudiados escapan a la inactivación de X. Los genes PAR2
son diferentes. Los dos genes más teloméricos, IL9R y CXYorfl,
escapan a la inactivación, pero los dos genes proximales, SYBL1 y
HSPRY3, los inactiva X. La discrepancia aparente se debe a un
mecanismo compensador de inactivación de Y para estos genes:
cuando se presentan en el cromosoma Y, SYBL1 y HSPRY3 se
metilan y no se expresan.
Además de los genes en las regiones seudoautosómicas, tal vez
una quinta parte del total de genes en el cromosoma X elude la
inactivación (véase Carrel y cois., 1999). Los genes que la eluden
tienden a concentrarse en grupos, sobre todo en Xp, y muchos
de ellos al parecer derivan de adiciones autosómicas recientes a
los cromosomas del sexo. Los genes que no tienen un homólogo
funcional en el cromosoma Y, pero que escapan a la inactivación,
suelen ser aquellos en los que no son un problema las diferencias
de dosis 2:1. Pueden ocurrir asimismo diferencias de especie pa­
ra los patrones de expresión no seudoautosómicos. Por ejemplo,
los genes no seudoautosómicos humanos ZFX, RPS4X y UBE1

Quinta expansión
Cromosomas del sexo, Cuarta expansión La translocación
Segunda expansión Tercera expansión principal de RNY
surgimiento de RNY La translocación principal de RNY X a Y establece
principal de RNY principal de RNY (AMELY, ARSDP,
(la región SRY detiene la ,D « v w , expande PARp hace (CASKP, DBY, EIF1AY, ' p qyqop PCDHY
(RBMY, RPS4Y) hace (SMCY,, iUBE1Y) hace = ^ 1 3 0 M a ñ o s TB4Y,, UTY, ZFY)
TB4Y t i ? ? £ ™ 2P’ hace -3 -4 M años
recombinación) hace -2 30-300 M años KALP, PRKY)
-1 30-170 M años hace -8 0 -1 3 0 M años
-290-350 M años hace -3 0 -5 0 M años

XY XY XY XY XY
P ar de XY
au to so m as S er hum ano
I i
i i
A utoso m as X Y en X Y en X Y en no X Y en
en aves m o n otrem os m arsupiales a n trop oides antrop oides
p lacentarios no hom ínidos

Fig. 12-16. Evolución del cromosoma del sexo humano.

La figura muestra el encogimiento total del cromosoma Y y la expansión en forma de bloques de su región no recombinante (RNY), tal vez como resultado
de inversiones sucesivas a gran escala. En términos evolucionistas, se colocan entre paréntesis los nuevos genes RNY y las ramas filogenéticas se indican
con flechas. Las regiones verdes son recombinantes con libertad; las rojas son especificas del cromosoma X y las azules específicas de Y (RNY). La región
amarilla representa la secuencia que contiene PCDHX/Y (protocaderina X/Y) que se translocó de X a RNY (para mayor sencillez se omitieron otras posibles
translocaciones). El diagrama no es un dibujo a escala y se suprimieron los centrómeros, ya que sus localizaciones son inciertas en muchas etapas de la
evolución. PAR-1, región seudoautosómica mayor. Adaptado de Lahn y cois. (2001), Nature Rev. Genet. 2:207-216, con autorización de Nature Publishing Group.
374 CAPÍTULO DOCE LUGAR DEL HOMBRE EN EL ÁRBOL DE LA VIDA
escapan a la inactivación, pero los homólogos murinos Zfic, Rps4
y UbelX (que a diferencia del gen humano UBE1 tiene un ho­
mólogo en Y) se someten a inactivación de X. En genes ligados
a X en los que la dosis génica debe en apariencia controlarse de
modo estrecho, la inactivación de X evolucionó como una adap­
tación para la decadencia de un gen homólogo ligado a Y (Jega-
lian y Page, 1998).
12.3 Filogenética m olecular y
genóm ica com parativa
La filogenética molecular describe el uso de comparaciones de áci­
do nucleico o proteínas a fin de establecer las relaciones evolucio­
nistas entre organismos o poblaciones. Por supuesto, lo anterior
complementa los métodos filogenéticos habituales basados en ca­
racterísticas anatómicas y morfológicas de organismos vivos e infor­
mación reunida del registro de fósiles.
Hasta fecha reciente, cuando los biólogos moleculares evolu­
cionistas compararon secuencias de DNA (o las secuencias proteí-
nicas deducidas), utilizaban de ordinario las secuencias cuando
mucho de unos cuantos sitios genómicos. Sin embargo, la filoge­
nia basada en grupos de datos de secuencias muy pequeñas pue­
de ser errónea y suministrar resultados diferentes. Por ejemplo, las
comparaciones de proteínas relacionadas con la transcripción,
traducción, replicación y reparación del DNA resaltan las simili­
tudes entre archaea y eucariotas, en tanto que las comparaciones
de proteínas que participan en el metabolismo celular agrupan a
archaea con bacterias. Cuando se llevaron a cabo esfuerzos para
obtener una perspectiva más amplia, se basaron en mapas genéti­
cos comparativos (O'Brien y cois., 1999) o cariotipificación com­
parativa. Por supuesto, los proyectos de genomas cambiaron todo
lo anterior y permitieron examinar la perspectiva completa de las
secuencias del genoma total y nació una nueva ciencia: la genó­
mica comparativa.
La información sobre secuencias que ha surgido de los proyec­
tos de genomas proporciona perfiles de DNA mucho más defini­
tivos y representativos en los que puede deducirse la filogenia. Al
determinar las secuencias de una serie completa de genomas (cap.
8) se obtienen informaciones mucho más profundas sobre la for­
ma en que se modelaron los genomas durante la evolución. Por su­
puesto, los datos ayudan asimismo a comprender la forma en que
se relacionan entre sí los genomas actuales e identificar secuencias
relevantes conservadas.
12.3.1 La filogenética molecular utiliza alineamientos de
secuencias para elaborar árboles evolucionistas
Con la finalidad de elaborar un árbol evolucionista es necesario
comparar secuencias de ácido nucleico (o en ocasiones las secuen­
cias proteínicas supuestas; las secuencias del ácido nucleico son más
informativas, pero en comparaciones de genes relacionados de for­
ma muy distante suelen usarse secuencias de proteínas). Si dos o
más secuencias muestran un grado suficiente de similitud (hom olo­
gía d e secuencia) puede asumirse que derivan de una secuencia an­
cestral común. A continuación es posible utilizar los alineamientos
de secuencias para derivar calificaciones cuantitativas que describen
la extensión de la relación entre las secuencias.
La comparación de secuencias de igual longitud fija casi
siempre es directa si hay una homología de secuencias razonable­
mente alta. Sin embargo, muchas veces las secuencias del ácido
nucleico que se comparan habrán sufrido antes deleciones o in­
serciones y en consecuencia se requieren métodos matemáticos
rígidos para el alineamiento de las secuencias. Se han diseñado
algoritmos complementarios. El método de similaridad de Needle-
man y Wunsch (1970) busca llevar al máximo el número de nu-
cleótidos compatibles; el método de distancia de Waterman y
colaboradores (1976) se dirige a reducir al mínimo el número de
incompatibilidades. Programas de computadora como Clustal lle­
van a cabo múltiples alineamientos de secuencias (Jeanmougin y
cois., 1998).
Una vez que se alinean las secuencias, es posible elaborar ár­
boles evolucionistas. Con mayor frecuencia se representan como
diagramas en los que se emplean combinaciones de líneas (ramas)
y nudos. Los diferentes organismos (secuencias) que se comparan
se localizan en nudos externos pero se unen a través de ramas a
nudos in teriores (intersecciones entre las ramas) que representan
formas ancestrales para dos o más organismos. Un árbol con raíz
(o cladograma) supone la existencia de un ancestro común (re­
presentado por el tronco o la raíz del árbol) e indica la dirección
del proceso evolucionista (fig. 12-17). La raíz del árbol puede de­
terminarse al comparar las secuencias con una secuencia fu e r a d el
gru p o (alguna que se relaciona de modo obvio en la evolución pe­
ro de manera distante con la secuencia en estudio). Un árbol sin raíz
presupone que no hay un ancestro común y sólo muestra las rela­
ciones evolucionistas entre los organismos. Cabe señalar que el nú­
mero de posibles árboles con raíz suele ser mucho mayor que el de
árboles sin raíz.
B) Nudos
N udos
e x te rn o s
Fig. 12-17. Árboles evolucionistas sin raíz y con ella.
A) Árbol sin raíz. El árbol tiene cinco nudos externos (A, B, C, D y E)
unidos por líneas (ramas) que se intersectan ennudos internos. Este
árbol especifica sólo las relaciones entre los organismos en estudio,
pero no define la vía evolucionista. B) Árbol con raiz. Desde un nudo
Interno particular, la raíz (se muestra con R en rojo), hay una vía
evolucionista única que conduce a cualquier otro nudo, como la vía
a D (línea roja punteada).
 12.3 FILOGENÉTICA MOLECULAR Y GENÓMICA COMPARATIVA 3"5

Elaboración de árboles evolucionistas
Para elaborar árboles evolucionistas se recurre a una variedad de
métodos diferentes, pero muchos utilizan un método de distancia
de matriz. En el primer paso se calcula la distancia evolucionista
entre todos los pares de secuencias en el grupo de datos y se los dis­
pone en un cuadro (matriz). Éste puede expresarse como el núme­
ro de diferencias de nucleótidos o sustituciones de aminoácidos
entre las dos secuencias o el número de diferencias de nucleótidos
(aminoácidos) por sitio de nucleótido (aminoácido) (véase fig. 12-
18A para observar un ejemplo).
Una vez que se calcula la matriz de diferencias de pares, el si­
guiente paso consiste en enlazar las secuencias de acuerdo con la dis­
tancia evolucionista entre ellas. Por ejemplo, en un método se
conectan con una raíz entre ellas dos miembros del par de secuen­
cias que tienen la calificación de distancia más pequeña. Para el pa­
so siguiente de la matriz de distancia se emplea la media de las
distancias de cada miembro de este par a un tercer nudo y se repite
el proceso hasta que se colocan todas las secuencias en el árbol. Es­
to siempre tiene como resultado un árbol con raíz, pero métodos va­
riables, como el de relación d e vecino, pueden crear árboles sin raíz.
La suposición crítica es de un reloj m olecular constante (la tasa de

A) S e c u e n c ia 1 G TATAGG G GATATACTG AG AG CTATTTACA

S e c u e n c ia 2 G TATTG GCG ATATTCCG AG ACCTATTTACT
S e c u e n c ia 3 G TATTG GCCATATTCCG AG ACCTATTTACT
S e c u e n c ia 4 G TATAGGCGATATACCGAGACCTATTTACT

Distancia de matriz
0.20 0 .2 3 3 0 .1 3 3
0 .2 0 0 .0 6 7
-------- 0.10

B) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213141516 1718 19 20 21 22 2324 2526 2728 29 30

GTATAGGGGATATACTGAGAGCTATTTACA
GTATTGGCGATATTCCGAGACCTATTTACT
GTATTGGCCATATTCCGAGACCTATTTACT
GTATAGGCGATATACC GAG ACCTATTTACT
x
; j_v

i
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314 1516 2 9 29 20 5 251411 21 8 16 7 3018
GTATAGGGGATATACTTGCAACATGCTGAA
GTATTGGCGATATTCCTGCATCTTCCCGTA
GTATTGGCCATATTCCTCCATCTTCCCGTA
GTATAGGCGATATACCTGCAACATCCCGTA

Fig. 12-18. Elaboración de un árbol evolucionista por el método de matriz de distancia y verificado mediante bootstrapping.
A) Elaboración del árbol. Se utilizan múltiples alineamientos de secuencias para calcular las distancias evolucionistas entre pares de secuencias.
Las secuencias uno y dos difieren en 6 /3 0 (= 0 .2 0 ) posiciones de nucleótidos; tres y cuatro varían en 3 /3 0 (= 0 .1 0 ) posiciones. Estos y otros valores
de diferencia a nivel de pares se incluyen en una matriz de distancia y los programas de computadora utilizan los datos para valorar las relaciones de
secuencias y elaborar un árbol evolucionista. Los métodos de matriz de distancia necesitan incluir estimaciones estadísticas de la cantidad de sustituciones
múltiples que pudieron ocurrir (una sustitución simple A - * T pudo resultar en realidad de una sustitución sucesiva A -> C - * T). B) Análisis bootslrap.
Del grupo de datos original se selecciona un subgrupo (aqui los sitios 17 a 3 0 ) para descartarse, pero se conserva el resto (sitios 1 a 16). Los sitios
originales 17 a 30 se reemplazan por un grupo de datos del mismo tamaño de sitios elegidos al azar de los 30 sitios originales, con lo cual se crea un
nuevo alineamiento de seudosecuencia en el que algunos de los sitios originales son repetidos ( 2 , 9 , 5 , 1 4 , 1 1 , etc.) y otros faltan (17, 21, 23, etc.).
El proceso se repite unas 1 000 veces para generar 1 000 alineamientos de seudosecuencia y en cada caso se elaboran árboles evolucionistas y se
comparan (referencia) con el original para proporcionar un valor bootstrap (véase el texto).
376 CAPÍTULO DOCE LUGAR DEL HOMBRE EN EL ÁRBOL DE LA VIDA

mutaciones es constante en diferentes linajes) que a menudo tal vez
no es correcta (sección 11.2.6). El método de unión de vecino es
una variante que no requiere que todos los linajes divergieran en can­
tidades iguales por unidad de tiempo. Por consiguiente, es en espe­
cial adecuado para grupos de datos que comprenden linajes con tasas
de evolución muy variables (véase fig. 12-31 para un ejemplo de un
árbol elaborado con este método).
Las alternativas de los métodos de distancia de matriz incluyen
los métodos de parsimonia máxima y probabilidad máxima. El
método de parsimonia máxima busca emplear el número mínimo
de pasos evolucionistas. Considera todos los posibles árboles evo­
lucionistas que expliquen las relaciones de secuencias observadas,
pero a continuación elige los que requieren menos cambios. Los
métodos de posibilidad máxima crean todos los posibles árboles y
a continuación recurren a estadísticas para valorar cuál es el árbol
probable. Lo anterior puede ser posible para un número pequeño
de secuencias, aunque en grandes números de secuencias la canti­
dad de árboles generados se torna tan considerable que se utilizan
métodos heurísticos (métodos que proporcionan una respuesta en
una longitud de tiempo computable, si bien por el cual tal vez no
sea óptima la respuesta) a fin de seleccionar un subgrupo de árbo­
les por crear.
Valoración de la precisión de un árbol evolucionista
Una vez que se derivó un árbol evolucionista, pueden usarse mé­
todos estadísticos para obtener una medición de su confiabilidad.
Un método difundido es el de bootstrapping, una forma de simu­
lación de Monte-Cario. De manera característica, se elimina una
submuestra de los datos y se reemplaza por un grupo equivalente
de datos generados de modo aleatorio y se analiza la seudosecuen-
cia resultante para observar si aún es válido el patrón evolucionis­
ta sugerido (fig. 12-18B). El nuevo muestreo aleatoriza los datos,
pero si hay una relación clara entre dos secuencias la aleatorización
no la borra. Por otra parte, si es falso un nudo que conecta las dos
secuencias en el árbol original, puede desaparecer en la aleatoriza­
ción porque el proceso de aleatorización cambia las frecuencias de los
sitios individuales. El bootstrapping incluye con frecuencia nuevo
muestreo de subgrupos de datos 1 000 veces. El valor bootstrap
más alto suele proporcionarse como porcentaje, de tal manera que
un valor de 100 significa que las simulaciones apoyan por comple­
to la interpretación original. Valores de 95 a 100 indican un nivel
alto de seguridad en un nudo predicho. Valores bootstrap menores
de 95% no significan que sea erróneo el agrupamiento original de
secuencias, sino que los datos disponibles no proporcionan un
apoyo convincente. Véase la figura 12-31 para cotejar algunos
ejemplos.
12.3.2 Los nuevos programas de computadora alinean
secuencias a gran escala y del genoma completo
para asistir el análisis y la identificación
evolucionistas de secuencias conservadas
Los datos sobre secuencias que surgen de los proyectos del genoma
son, por supuesto, sólo el inicio de una larga campaña para estudiar
lo que significan. Debido al enorme tamaño de los grupos de datos,
se requirieron nuevos programas de computación para hacer posi­
bles alineamientos de secuencias a gran escala y del genoma com­
pleto. Los nuevos programas han sido inestimables para ayudar a
identificar secuencias bien conservadas y comprender relaciones
evolucionistas.
Análisis comparativo de secuencias a gran escala para
Identificar secuencias conservadas
Un desafío importante en los proyectos del genoma es identificar
genes RNA, secuencias reguladoras y otras secuencias importan­
tes funcionalmente que no elaboran proteínas. No es fácil anali­
zar las secuencias de un genoma completo (porcentaje bajo de
DNA de codificación) porque los programas de computadoras no
predicen con facilidad genes RNA y secuencias reguladoras (son
más fáciles los genes que codifican polipéptidos; hay marcos de
lectura abiertos largos y grandes cantidades de datos de secuencias

K IF3 IL -4

S e r h u m a n o /p e rro i AL 4 ú J
IJIn mu’ IV\ ru nS i l i l i 1 ill III* ^\ .1M 111
h Í JlJU n m .m V W .y r n P i n 1 m i L
S e r h u m a n o /ra tó n — 11nA------- tíJ' . In I i — IIi ü M ¿AiblUs I----------&i
. JU fin í «Aív» ¡i is. »»MM/* ira a A
n i. - IL
h »/i (M
1 1 iA li A u
R a tó n /p e rro
^ - 1 ..!.... aftll J ...., u J : 11 , , it 1 Kk tÁí\. L kA^ti 1

Fig. 12-19. Alineamiento de la secuencia VISTA de una secuencia genómica de 50 kb que contiene las secuencias génicas humanas KIF3 e IL4
con secuencias ortólogas en el perro (D) y el ratón (M).

Se muestran secuencias conservadas en relación con sus posiciones en el genoma humano (ejes horizontales) y sus identidades porcentuales (50 a
100% ) se indican en los ejes verticales. Las localizaciones de los exones de codificación (rectángulos azules en la parte superior) y la UTR 3 ' de KIF3
(rectángulo turquesa) se muestran arriba del perfil. Las flechas horizontales indican la dirección de la transcripción para cada gen. Los picos de secuencias
muy conservadas incluyen secuencias de codificación (azul) y asimismo secuencias no codificantes (rojo) de función desconocida. Adaptado de
Dubchak y cois. (2000), Genome Res. 10:1 3 04 -13 0 6 , con autorización de Coid Spring Harbor Laboratory Press.
 12.3 FILOGENÉTICA MOLECULAR Y GENÓMICA COMPARATIVA
en genes y sus productos de expresión para compararlos con
ellos). Una alternativa consiste en buscar secuencias muy conser­
vadas y contrastar diferentes secuencias genómicas en intervalos
grandes. Diferentes programas de computadora, como VISTA
(http://www-gsd.lbl.gov/vista) y Pipmaker (http://bio.cse.psu.e-
du/pipmaker/) permiten alineaciones de secuencias a gran escala
y expresan los resultados en un formato gráfico (véase fig. 12-19
para observar un ejemplo).
Como resultado de análisis comparativos de mamíferos (sobre
todo seres humanos y ratones) en la actualidad se piensa que la can­
tidad de secuencias muy conservadas en el genoma humano es de
alrededor de 5%, del cual se cree que sólo 30% (-1.5% del geno­
ma total) es DNA que codifica polipéptidos. Muchos análisis com­
pararon secuencias humanas y de ratón pero quizá sea necesario
comparar algunas secuencias reguladoras que participan en la ex­
presión génica específica de primates con una gama de frecuencias
de primates.
Se han comparado asimismo los genomas de organismos mode­
los con secuencias genómicas de especies del mismo género relacio­
nadas en grado distante. Por ejemplo, los nematodos C. elegansy C.
briggsae derivaron de un ancestro común hace 100 millones de años
y en la actualidad es posible interrogar ambas secuencias genómicas
mediante ENSEMBL (en http://www.ensembl.org/). Un proyecto
de genoma de Drosophila pseudoobscura (http://www.hgsc.bcm.tm-
c.edu/projects/drosophila/) permitirá compararlo con las secuencias
del genoma de D. melanogaster.
Alineamientos de secuencias del genoma completo
de mamíferos
Los genomas complejos contienen una proporción amplia de se­
cuencias que evolucionaron de modo neutral. Debido a la falta de
presión de selección, estas secuencias divergieron en poco tiempo.
A fin de obtener mayor información sobre la evolución de geno-
mas, los programas de computadoras deben ser capaces de alinear
secuencias que evolucionaron de manera neutral cuando menos en
una gran proporción de los genomas que se comparan. Esto se lo­
gró para los genomas humano y del ratón mediante una modifica­
ción del programa BLASTZ (Schwartz y cois., 2003) y se dispone
de alineaciones d e secu en cias d e l gen om a com pleto hum ano y d el
ratón junto con ilustraciones de su utilidad en http://bio.cse.psu.
edu/genome/hummus/
Las alineaciones del genoma completo mostraron que alrededor
del 40% de las secuencias del genoma humano se alinean con las del
ratón y que las secuencias de DNA muy repetidas pueden dividirse
en dos clases. Las repeticiones especificas d e lin a je se introdujeron
por transposición después de la divergencia de los seres humanos y
los ratones de un ancestro común (dentro de los últimos 80 a 100
millones de años aproximadamente). Las repeticiones antiguas con ­
servadas se retuvieron del ancestro común y es posible identificar y
alinear repeticiones ortólogas humanas y del ratón aunque tienen >
80 a 100 millones de años. Los datos también revelan diferencias
en la relación de dos clases de repeticiones. En seres humanos,
24.4% del genoma (o alrededor del 53% de las repeticiones disper­
sas) es específico de linaje pero en el ratón constituye el 32.4% del
3~
genoma o casi 85% de las repeticiones dispersas (alrededor de 39%
del genoma del ratón). Las repeticiones ancestrales se reemplazaron
en gran parte en el genoma del ratón y constituyen sólo alrededor
del 5% del genoma; en personas, 22% del genoma está compuesto
de repeticiones ancestrales. La diferencia indica las variaciones en
las tasas de sustitución de nucleótidos en los dos genomas (sección
11.2 .6).
12.3.3 El número de genes suele ser proporcional a
la complejidad biológica
La secuenciación del genoma reveló algunas sorpresas y a primera
vista es posible que el número de genes tal vez no sea paralelo a la
complejidad biológica tanto como se esperaba. ¿Quién hubiera an­
ticipado que el hombre sólo tiene alrededor de 1.5 veces el núme­
ro de genes que se encuentran en un gusano nematodo de 1 mm
de largo que sólo contiene alrededor de 1 000 células o que este gu­
sano pequeño posee al parecer miles de genes más que la mosca de
la fruta mucho más compleja? No obstante, si se consideran los ge­
nomas secuenciados se reconoce una tendencia clara: los genomas
de vertebrados tienen en general el doble del número de genes que
se encuentran en genomas de invertebrados, que a su vez tienen
muchos más genes que los organismos unicelulares (cuadro 12-4).
Por lo general, el número de genes de metazoarios aumenta se­
gún sea la especialización, pero en tanto que la duplicación génica
proporcionó un refuerzo importante al desarrollo de metazoarios
complejos, algunas especies, por ejemplo D. melanogaster, tienen
un número sorprendentemente bajo de genes duplicados. Es im­
portante considerar que los genes también pueden perderse del li­
naje durante la evolución.
Como se observa en el cuadro 12-4, la densidad génica dismi­
nuye a medida que se pasa de genomas simples a genomas meta-
zoáricos complejos. Eso apunta hacia el surgimiento de intrones en
eucariotas tempranos y una tendencia creciente a acumular DNA
repetido dentro de intrones y regiones intergénicas a medida que se
tornan más complejos los genomas. Por consiguiente, por ejemplo,
alrededor de 45% del genoma humano está compuesto de repeti­
ciones basadas en transposones, pero el valor correspondiente para
el ratón es de 37% y los valores equivalentes en D. melanogaster y
C. elegans son más bajos en proporción considerable.
12.3.4 Las comparaciones de proteomas revelan
la extensión de la especialización progresiva
de proteínas
Cuando se determinaron por vez primera las secuencias genómicas
de organismos modelos estudiados en extenso, como E. coli y la le­
vadura S. cerevisiae, fue una sorpresa encontrar que se identificó un
número notable de genes cuyas funciones se desconocían. En el es­
quema de secuencias del genoma humano casi la mitad carecía de
una función conocida, un recordatorio importante de que aún exis­
te un camino largo antes de comenzar a comprender en verdad el
genoma humano. De los restantes, alrededor de la mitad participa
en transducción de señales o enlace de ácido nucleico (fig. 12-20).
 Cuadro 12-4. Número y densidad génicos en genomas simples y complejos.
Genomas unicelulares Genomas multicelulares

Genoma Tamaño Número Densidad Genoma Tamaño del genoma Número Densidad
del genoma génico gènica (o número de génico genica
(límites) Mb secuenciado*)

PROCARIOTAS
Bacterianos 3 .10 Mb Promedio 1 por 1.09 kb Invertebrados
(n = 97) [0 .5 8 -9 .1 1 Mb] = 2 840 Ascidiano (C. intestinalis) 117 M b* 16 0 0 0 ~ 1 por 7 kb
Nematodo (C. elegans) 97 Mb 19 000 - 1 por 5 kb
Archaea 2 .2 3 Mb Promedio 1 por 1 .0 2 kb Mosca de la fruta
(D. melanogaster) 123 M b* 14 000 - 1 por 9 kb
(n = 16) [ 1 .6 6 - 5 .7 Mb] = 2 200 Mosquito (A. gambiae) 278 Mb 14 000 - 1 por 2 0 kb

EUCARIOTAS UNICELULARES
Microsporidianos Planta
E. cuniculi 2 .9 M b ** 2 000 ** 1 por 1.45 kb Mastuerzo (A thaliana) 115 M b* 25 500 - 1 por 4 .5 kb

Hongos unicelulares
S. cerevisiae 14 Mb 6 300 1 por 2 . 2 kb

S. pombe 14 Mb 4 800 1 por 2.9 kb

Vertebrados
Protozoarios Pez soplador (T. rubripes) 365 Mb 31 000 - 1 por 12 kb
P. falciparum 23 Mb 5 300 1 por 4.3 kb Ratón (M. musculus) 2500 M b* ¿—30 000? - 1 por 80 kb
P. Y. yoeli 23 Mb 5 900 1 por 3 .9 kb Ser humano 2900 M b * - 3 0 000 - 1 por 1 0 0 kb

*N o representa el tamaño del genoma completo porque excluye repeticiones tándem muy repetidas que es difícil clonar y secuenciar, pero sí el número
total de genes.

* *E I tamaño pequeño del genoma y el número escaso de genes reflejan el estado intracelular obligado de los microsporidios.

Las comparaciones de las proteínas predichas a partir de la se­
cuencia del genoma humano contra las predichas de los genomas
secuenciados de varios organismos modelo proporcionó cierta in­
formación sobre el despliegue génico durante la evolución (fig.
12-21 y cuadro 12-5). Alrededor de 20% de las proteínas huma­
nas muestra homología de secuencia con proteínas distribuidas
con amplitud que se encuentran en eucariotas y procariotas. Ca­
si 1% de las proteínas carece de un homólogo en otros genomas
animales estudiados. Sin embargo, en esa época había pocas en­
tradas de bases de datos de primates no humanos y por consi­
guiente es posible que el 1% resulte ser específico de primates en
lugar de específico de seres humanos (cuando mucho, se espera
que sólo un número muy pequeño de genes humanos sea especí­
fico de personas).
La disponibilidad de genomas completos de diferentes especies
también permite una forma de proteómica comparativa en la cual
se interrogan todas las secuencias de proteínas conocidas o predichas
codificadas por los diferentes genomas para la presencia de domi­
nios, secuencias típicas u otros componentes de subsecuencias de
proteínas específicas. El principal recurso es InterPro (recurso inte­
grado de familias, dominios y sitios de proteínas), una amalgama de
varias bases de datos de secuencias de proteínas conservada por el
European Bioinformatics Institute (http://www.ebi.ac.uk/interpro/).
Los datos de InterPro se proporcionan en diversas formas, que in­
cluyen listas que catalogan las frecuencias de familias de proteínas
específicas, dominios proteínicos y repeticiones de proteínas dentro
de los proteomas de genomas secuenciados (véase http://www.ebi.
ac.uk/proteome/).
Cuando se comparan las 25 principales entradas InterPro hu­
manas (basadas en prevalencia) a través de diferentes tipos de geno-
mas eucariotas, no existen varias categorías, no sólo para la levadura
unicelular S. cerevisiae (11/25) sino también para la planta A. tha-
liana (6/25) y en menor extensión para animales invertebrados
(3/25 de C. elega nsy 2/25 de D. melanogaster, véase cuadro 12-5).
Esto depende en parte de la especialización del vertebrado, como
los genes del sistema inmunitario. Los genes del receptor olfatorio
son con claridad importantes en ratones y seres humanos y aunque
no existen contrapartes directas en los otros organismos, la princi­
pal entrada InterPro para C. elegans es el quimiorreceptor 7TM de
nematodos que puede funcionar como un receptor olfatorio. Tam­
bién hay diferencias de especies mayores en las categorías de fre­
cuencias de entradas InterPro, incluso en personas y ratones, al
igual que en la prevalencia de receptores olfatorios, dedos de cinc
tipo C2H2 y cajas KRAB (dominios que se hallan en proteínas de
dedos de cinc tipo C2H2) y receptores acoplados a proteína G ti­
po rodopsina (cuadro 12-5).
 12.4 j ¿QUÉ CONVIERTE AL HOMBRE EN SER HUMANO? 3~9

Adherencia celular (577,1.9% )

D iversos (1 3 1 8 ,4 .3 % ) \ Acompañante (159, 0.5%)
Proteína viral (100, 0.3%) I \ Proteina estructural citoesquelética (876, 2.;
\ \ Matriz extracelular (437,1.4% )
Proteína de transferencia/portador (203, 0.7%) \ \ Inmunoglobulina (264, 0.9%)
Factor de transcripción (1 850, 6.0%) \ ' L— 1 / / Canal iónico (406,1.3% )
M o to ra (3 7 6 ,1 .2 % )
Proteína estructural del músculo (296,1.0% )
P rotooncogen (902, 2 .9 % )
Enzima de ácido nucleico (2 308, 7.5%) Proteína selecta de unión de calcio (34,1.0% )
Transportador intracelular (350,1.1% )
Transportador (533,1.7% )
Molécula de señalamiento (376,1.2% )

R ec ep to r (1 543, 5 .0 % )

C inasa (868, 2 .8 % )

Molécula reguladora selecta (988, 3.2%)

Transferasa (610, 2.0%)

C ateg o rías GO
Sintasa y sintetasa (313,1
Oxídorreductasa (656, 2.1 %)
Liasa (117, 0.4%)
Ligasa (56, 0.2%)
Isomerasa (163, 0.5%)

Hidrolasa (1 227, 4.0%) Función molecular desconocida (12 809, 41.7%)

C ateg o rías phanter

Fig. 12-20. Clasificación funcional preliminar de genes humanos que codifican polipéptidos.

Funciones conocidas o predichas de 26 383 genes humanos que codifican polipéptidos humanos. La clasificación se basa en las categorías de función
molecular G0, como se muestra en los círculos externos (clasificación Gene Ontology; véase sección 8 .3 .6), o las categorías de función molecular
Celera 's Panther (círculo interno). Reproducido a partir de Venter y cois. (2 0 0 1 ), Science 29 1 :13 0 4 -1 3 5 1 , con autorización de la American Association
for the Advancement of Science.

12.4 ¿Qué convierte al hom bre en ser
humano?
¿De dónde proviene el hombre?, ¿qué hace al hombre un ser humano?
Preguntas fundamentales como las anteriores son algunas que se res­
ponderán mejor una vez que se tengan inventarios de genomas com­
pletos, listas de genes y productos génicos de seres vivientes. Los
proyectos del genoma se iniciaron en 1995 para obtener secuencias
genómicas y los 10 a 20 primeros años del nuevo milenio deben ser
testigos de un surgimiento enorme de genomas secuenciados, anota­
ciones detalladas sobre genes e información amplia de proteomas y
productos de RNA. Análisis comparativos de los datos disponibles co­
menzaron a proporcionar un cúmulo de detalles moleculares sobre las
secuencias del ácido nucleico y las proteínas inferidas que comparte el
hombre con otras especies y la forma en que difiere de ellas.
Por supuesto, es posible llevar a cabo comparaciones a diferen­
tes niveles y los seres humanos pueden colocarse en una diversidad
de grupos filogenéticos. En una serie evolucionista de grupos más
especializados en grado progresivo, el hombre es eucariota, metazoa-
rio, bilateriano, celomato, deuterostoma, cordado, craneado, verte­
brado, gnatostoma, amniota, mamífero euteriano, primate cararrino,
hominoide y homínido, etc. (véase fig. 12-22 a 12-24 y asimismo el
recuadro 12-5 para cotejar glosario).
La universalidad del código genético, la enorme conservación
evolucionista de las reacciones bioquímicas elementales y los proce­
sos esenciales para la función celular y el grado alto de conservación
de algunos procesos del desarrollo fundamentales en células de me-
tazoarios son características que resaltan la relación cercana de los se­
res humanos con especies que son muy distintas desde el punto de
vista morfológico y relacionadas apenas en sentido evolucionista.
Por supuesto, también existen diferencias. Los metazoarios más
complejos tienden a mostrar genomas más complejos con más ge­
nes y dominios proteínicos y más DNA repetido. También puede
haber diferencias considerables entre distintas especies en varias ca­
racterísticas vinculadas con la expresión génica. Los ejemplos inclu­
yen los siguientes:
380 CAPÍTULO DOCE LUGAR DEL HOMBRE EN EL ÁRBOL DE LA VIDA

► operones'. la transcripción de genes eucarióticos tiende a regular­
se de manera independiente, a diferencia del control coordina­
do en operones bacterianos, pero una fracción grande de genes
de C. elegans está organizada en operones que semejan operones
bacterianos (pero son distintos de modo operacional).
► m etilación d el DNA (que está muy lejos de ser universal en me-
tazoarios; véase recuadro 9-3).
► impronta genóm ica (una característica importante de la expre­
sión génica en mamíferos pero que al parecer no ocurre en or­
ganismos como Drosophila, C. elegans, etc.).
► adaptaciones d e vertebrados, por ejemplo genes vinculados con
sistemas inmunitarios, hormonas, etcétera.
► adaptaciones d e mamíferos, como genes relacionados con el sis­
tema XY de determinación del sexo, inactivación del cromoso­
ma X, placentación, etcétera.
Desde luego, los seres humanos también se diferencian de otros
mamíferos y sus primos, los grandes monos. La secuenciación re­
ciente de los genomas del ratón y la rata y la secuenciación en cur­
so de los genomas del chimpancé (Olson y Varki, 2003), y otros
primates, proporcionarán información relevante sobre la constitu­
ción y la forma en que difieren del hombre.
CpG (-27 000 en DNA humano de repetición libre) que en el ra­
tón (15 000). Las regiones de sintenia ser humano-ratón conserva­
da tienen en promedio cerca de 10 Mb de largo (véase fig. 12-21).
Repeticiones dispersas
Gran parte de la diferencia en el tamaño del genoma humano-ra-
tón se debe a la cantidad más alta de DNA repetido en el genoma
humano: las repeticiones basadas en transposones constituyen alre­
dedor de -45% del genoma humano, pero sólo -37% del ratón. La
cantidad de secuencias LINE humana excede un poco la de secuen­
cias LINE del ratón. Aunque las secuencias LINE se heredaron del
ancestro común de seres humanos y ratones, hubo un recambio
más alto de secuencias LINE en el genoma del ratón. En ambos ge­
nomas sólo se transpuso de manera activa el elemento LINE-1; pe­
se a ello, si bien la clara mayoría de las secuencias LINE-1 actuales
del ratón sufrió transposición después de la divergencia del ser hu­
mano y el ratón, se retuvo la mayor parte de las secuencias huma­
nas LINE-1 del ancestro común. Las repeticiones LINE-1 están
conservadas en personas y ratones (y en todos los mamíferos), en

12.4.1 ¿Qué diferencia a los seres humanos Sin homología

de los ratones? animal

Un comentario reciente sobre la secuenciación del genoma del ra­

tón sugirió que el mejor amigo del hombre ya no es el perro sino
el ratón. Sin duda, el ratón es el modelo de mamífero más impor­
tante (para sus ventajas, véase el recuadro 8-8) y en algunas áreas
suele confiarse en la extrapolación de estudios en ratones (p. ej.,
el estudio de la expresión génica durante el desarrollo). Empero,
por supuesto, el ratón es aún un m odelo y cada vez se reconocen
más las diferencias entre seres humanos y ratones. Casi todas las
observaciones siguientes derivaron del Mouse Genome Sequencing
Consortium (2002), que se abrevia MGSC en las referencias cru­
zadas posteriores.

Aspectos generales de la organización del genoma

El tamaño del genoma eucromático del ratón es de 2 500 Mb, un

poco más pequeño que el de 2 900 Mb del genoma eucromático hu­
mano. La diferencia se debe sobre todo a la mayor cantidad de DNA
repetido (véase más adelante). Como resultado, los tamaños de in-
trones son alrededor de 16% más cortos en los genes del ratón en Fig. 12-21. Distribución taxonómica de homólogos de proteínas
promedio. Las distancias intergénicas son casi siempre más peque­ humanas y de ratón predichas.
ñas pero hay una gran variación regional. Los tamaños del exón y el
Muchas de las proteínas del hombre son de origen evolucionista antiguo
DNA de codificación (del orden de 500 a 550 codones en prome­
y sólo menos de una cuarta parte se originó desde que aparecieron
dio) son muy similares en personas y ratones y asimismo el número
los vertebrados. Obsérvese que las bases de datos de secuencias aún
de exones en genes ortólogos. El contenido total (G + C) del geno­ se llenan con nuevas secuencias y se espera que haya un número muy
ma del ratón es 42%, apenas mayor que el contenido de 41% (G + pequeño de genes específicos en verdad humanos. Adaptados del
C) del genoma humano. No obstante, este último tiene una frac­ International Human Genome Sequencing Consortium (2001), con
ción mayor en grado significativo de contenido de DNA (G + C) autorización del Nature Publishing Group.
(MGSC, 2002; fig. 7) y, por consiguiente, muchos más islotes de
 12.4 1 ¿QUÉ CONVIERTE AL HOMBRE EN SER HUMANO? 381

Cuadro 12-5. Ocurrencia comparativa en metazoarios de familias proteínicas, dominios y repeticiones seleccionados.
H. sapiens M. musculus D. melanogaster C. elegans A. thaliana S. cerevisiae
(28 525 proteínas) (20 804 proteínas) (13 446 proteínas) (20 377 proteínas) (25 936 proteínas) (6 202 proteínas)

Familia proteínica, Proteínas Lugar Proteínas Lugar Proteínas Lugar Proteínas Lugar Proteínas Lugar Proteínas Lugar
dominio o repetición compatibles compatibles compatibles compatibles compatibles compatibles

Dedo de Zn, tipo C2H2 946 1 482 6 360 1 246 11 191 20 54 10

Inmunoglobulina/ 883 2 674 3 160 8 120 26 51 110 Ninguno N/A

complejo mayor de
histocompatibilidad

Superfamilia GPCR 826 3 1 375 1 86 26 403 4 6 836 Ninguno N/A

parecida a rodopsina

Parecida a 804 4 655 4 144 10 100 35 1 1 920 Ninguno N/A

inmunoglobulina

Cinasa de proteína 687 5 486 5 263 2 507 2 1 047 1 118 1

Receptor olfatorio 477 6 980 2 Ninguno N/A Ninguno N/A Ninguno N/A Ninguno N/A
Cinasa de proteína 472 7 319 7 205 4 286 7 816 2 113 2
serina/treonina

Repetición W D -40 de 386 8 243 10 188 5 166 17 267 12 101 3

proteina G beta

Dedo de Zn, RING 367 9 222 13 121 15 173 16 466 5 39 16

Dominio parecido a EGF 357 10 286 8 101 21 202 13 34 175 Ninguno N/A
Región de enlace 342 11 234 12 166 7 160 18 299 10 58 8
de RNA RNP-1 (secuencia
típica de reconocimiento
de RNA)

Parecido a plaquestrina 331 12 188 18 79 35 90 46 31 197 29 25

Subtipo de 327 13 191 16 79 35 28 161 Ninguno N/A Ninguno N/A
inmunoglobulina

Extensión abundante 324 14 185 19 147 9 150 19 186 21 N/A

en prolina

Cinasa de proteína 314 15 216 15 132 12 192 14 360 7 26 28

tirosina

Caja KRAB 314 15 119 32 Ninguno N/A Ninguno N/A Ninguno N/A Ninguno N/A
Mano-EF de enlace 298 17 220 14 128 13 134 23 220 16 17 46
de calcio

Dedo de Zn, subtipo 286 189 91 48 2 1 116 2 1161 Ninguno N/A Ninguno N/A
C2H2

Dominio SH3 280 19 189 17 80 33 70 64 4 1 075 25 29

Andrina 259 20 162 20 94 23 110 27 114 38 19 42
Inmunoglobulina tipo C-2 259 20 145 26 111 17 67 67 Ninguno N/A Ninguno N/A
Homeobox 254 22 238 11 107 19 106 30 95 53 8 125
Fibronectina tipo III 232 23 157 22 71 42 54 78 4 1 075 2 584
Inmunoglobulina tipo V 223 24 249 9 4 713 N/A Ninguno N/A Ninguno N/A
Repetición abundante 212 25 146 25 108 18 69 65 509 4 6 183
en leucina

El número de diferentes proteínas bajo los nombres de las especies se basa en juegos de proteoma no redundantes de entradas SWISS-PROT, TrEMBL y En-
sembl. La columna de la izquierda indica las 25 principales entradas humanas (de acuerdo con el número de proteínas compatibles) en la base de datos Inter-
Pro. Bajo los nombres de las especies se encuentran un número de diferentes proteínas compatibles y el lugar que ocupan. Datos obtenidos (marzo, 2003)
del European Bioinformatics Institute a través de http://www.ebi.ac.uk/proteome
382 CAPÍTULO DOCE ¡ LUGAR DEL HOMBRE EN EL ÁRBOL DE LA VIDA

B acterias

____4 0 0 0 r A rch a ea
m illones d e años

L 38 0 0
m illones d e años
E ucariotas Taxa, e tc é te ra
M e ta m o n a d a s
E je m p lo s
G iardia lam blia

Parabasilido s Trichom on as

_2200 Euglenozoarios Euglénidos E uglena gracilis

m illones d e años
I__2Ó00 C in e to p lás tid o s Leishm ania m a jo r
m illones d e años T ryp anosom a b ru c e i
18 0 0 T ryp anosom a cru z
m illones d e años
C iliados P a ra m e c u im tetraurelia
Alveolados T e tra h ym en a therm o p h ila
A p ic o m p le xa P la sm o d iu m falciparum

A lgas rojas
A lgas y
p lantas A lgas verdes

P lantas A rab id o p sis thaliana

_ 1600
Entai
E n ta m o eb id ae E n ta m o e b a histolytica

□
m illones d e añ os Am oebozoarios
H
D in ti
ictiostelida D ictyostelium disco id eu m

M icrosp oridianos

.1 5 0 0 Tafrinom icotina S c h izo s ac ch a ro m yc es p o m b e

m illones d e años Hongos
S ac aro m ico tin a S ac c h a ro m y a s cerevisiae
C an d id a albicans
S o rd iaro m iceto s N eu ro s p o ra crossa

E urotiom icetos Aspergillus nidulans

C o an o flag e lad o s

M e ta zo a rio s (véase fig. 12-23)

Fig. 12-22. Filogenia eucariota simplificada.

Nota: los coanoflagelados (o flagelados con collar) se consideran los relacionados protistas vivientes más cercanos de las esponjas, los metazoarios
más primitivos (los coanoflagelados son casi idénticos en forma y función a los coanocitos, o células en collar, de esponjas).

gran parte debido a la presión de selección conservadora para
mantener la secuencia de la secuencia ORF-2 grande que especi­
fica la transcriptasa inversa.
Muchas de las diferencias entre el hombre y el ratón en el con­
tenido de repeticiones entremezcladas se deben a la cantidad más
alta de DNA SINE en el genoma humano. Ninguno de los elemen­
tos SINE se heredó de un ancestro común (a diferencia de los ele­
mentos LINE, los elementos LTR y los transposones DNA; véase
MGSC, 2002, cuadros 5 y 6). En tanto que sólo un SINE aislado,
la repetición Alu, es activo en el genoma humano, se desarrollaron
cuatro familias SINE en el ratón, con base cada una en la retro-
transposición LINE-1. De ellas, las repeticiones B2, ID y B4 deri­
varon como copias de cDNA de genes tRNA pero la repetición B1,
al igual que la Alu, procedió de RNA 7SL (fig. 12-25). Sin embar­
go, las repeticiones B1 y Alu tienen una divergencia significativa en
la secuencia.
Divergencia en las secuencias génica y proteínica
Al parecer, alrededor de 80% de las proteínas de ratón tiene ortó­
logos 1:1 en el genoma humano y las identidades secuenciales sue­
len encontrarse entre el 70 a 100%. No obstante, tal vez alrededor
de 10% de las proteínas ortólogas humanas y de ratón muestra di­
vergencia de secuencias más extremas (fig. 12-26). Se sabe que
muchas de las proteínas que evolucionaron en menos tiempo fun­
cionan en la defensa/inmunidad del huésped, por ejemplo los ge­
nes MHC, o en los procesos de reproducción. Las proteínas de
reproducción que evolucionan con rapidez incluyen la proteína 2
 12.4 I ¿QUÉ CONVIERTE AL HOMBRE EN SER HUMANO: 583

Taxón o E je m p lo s /
filo , e tc é te ra e s p e c ie s

• Poriféranos Esponjas

Diploblastos (dos capas germinales)

■C n id a ria n o s M e d u s a , co ra les ,
aném onas de m ar
P
R L o fo tro c o zo a n o s
■P la te lm in to s G u s a n o s p la n o s (tenias)
T O
T ■M o lu s c o s P u lp o
R O ■A n é lid o s G u s a n o s d e tie rra
s
T E c d is o z o a n o s
1 ■A rtró p o d o s D. m elanogaster
0
M A nopheles gam biae
P A
Tres ca p as L 1 0 00 • N e m a to d o s C. elegans
O C. briggsae
germ inales, 1 m illo n e s
bilaterales y d e añ os
■H e m ic o rd a d o s
sim étricas O D
(BILATERA) F
H ■E q u in o d e rm o s Erizo d e m ar, e s trella
U
d e m ar, p la n ta s m a rin as
L T
E
A R
O U ro c o rd a d o s
■T u n icad o s Ciona Intestinalis
S S (u ro co rd ad o s )
T
T C e fa lo c o rd a d o s
U ■C e fa lo c o rd a d o s Am phioxus
0 M
A ■H ip e ro tre ta s P e z cic ló s to m o
C ra n e a d os
s S
■V e rte b ra d o s V é a s e fig. 1 2 -2 4

Fig. 12-23. Filogenia metazoárica simplificada.

Nota: la división profostoma-deuterostoma fundamental que ocurrió hace alrededor de 1 000 millones de años significa que C. elegans y D. melanogaster
están relacionadas de modo más distante con los seres humanos que algunos otros invertebrados como el erizo de mar Strongylocentrotus purpuratus,
el tunicado Ciona intestinalis y el cefalocordado Amphioxus.

de transición (divergencia de secuencias de aminoácidos de 68%
entre seres humanos y ratones), glucoproteínas 2 y 3 de la zona pe­
lúcida (divergencia de 43 y 33%, respectivamente), acrosina (diver­
gencia de 38%) y protaminas P15 y P2 específicas de espermatozoo
(divergencia de 41 y 36%, respectivamente). Se ha identificado se­
lección positiva, (darwiniana) (selección para sustitución de ami­
noácidos a fin de promover la diversidad) para varios de estos tipos
de proteínas (véase p. ej., Swanson y cois., 2001).
Divergencia en el número génico
Aún es necesario establecer el número total de genes humanos y el
ratón, pero se espera que sean muy similares. Sin embargo, mu­
chas proteínas humanas y del ratón pertenecen a familias génicas
que se sometieron a expansión diferencial cuando menos en uno
de los dos genomas, con una falta de relación 1:1 rígida resultan­
te. Por supuesto, cuando varía el número de genes en una familia
génica puede ser difícil identificar ortólogos verdaderos, en espe­
cial si hay una divergencia de secuencias considerable. Un ejemplo
establecido desde hace mucho tiempo es el complejo mayor de his-
tocompatibilidad (MHC) en el que no es fácil identificar ortólo­
gos entre los locus MHC típicos (HLA en personas, H-2 en rato­
nes) y en los que existen diferencias notorias en el número de locus
MHC no comunes.
Un caso extremo es la familia génica del receptor olfatorio. El
ratón tiene alrededor de 1 200 genes funcionales, más de tres veces
el número de genes humanos funcionales (Young y cois., 2002); es­
to representa diferentes grados y repertorios de detección olfatoria
entre ratones y seres humanos. Se conoce un grupo adicional de 25
genes específicos del ratón; 14 contienen genes que participan en la
reproducción del roedor (MGSC, 2002; cuadro 16) y cinco inclu­
yen genes relacionados con la defensa e inmunidad del huésped.
Como los roedores y primates muestran algunas diferencias nota­
bles en la fisiología de la reproducción, es posible que los caracte­
res reproductivos sean la causa de las presiones evolucionistas
potentes y que la exigencia de innovación estimulara expansiones
diferenciadas de la familia génica.
La pérdida génica durante la evolución también puede condu­
cir a diferencias en el número de genes, no sólo en familias génicas
agrupadas sino asimismo en genes esparcidos. Por consiguiente, al­
384 CAPITULO DOCE ¡ LUGAR DEL HOMBRE EN EL ARBOL DE LA VIDA

gunos genes humanos no parecen tener un ortólogo en linajes de
roedores, en especial los genes de la región seudoautosóraica mayor
y la región próxima específica del cromosoma del sexo (fig. 12-15).
La mutación en algunos de estos genes causa enfermedad, como el
gen seudoautosómico SHOX (síndrome de Leri-Weill, displasia
mesomélica de Langer) y el gen del síndrome de Kallman, KAL1,
localizado en Xp (se han identificado homólogos en C. elega nsy D.
melanogaster, pero al parecer se eliminaron genes equivalentes de li­
najes de los roedores).
Divergencia en la expresión génica
Las diferencias en la expresión de genes ortólogos entre el hombre
y el ratón incluyen muchos ejemplos de variaciones en el procesa­
miento del RNA y el uso alternativo de promotores, diferencias en
el patrón de inactivación del cromosoma X y variaciones en la im-
prontación. Además, incluso cuando se conservan de forma nota­
ble genes ortólogos a nivel proteínico, no es raro que los patrones
de expresión espaciotemporal muestren diferencias notorias (Fou-
gerousse y cois., 2000).
12.4.2 ¿Qué diferencia al ser humano de sus
relacionados más cercanos, los grandes monos?
Hace casi siglo y medio, Thomas Huxley identificó de forma co­
rrecta al chimpancé y el gorila como los relacionados más cercanos
del hombre. Desde entonces, los genetistas evolucionistas se con­
centraron en el problema de la tricotomía: ¿cuál de las dos especies
es la que se relaciona de modo más cercano con el hombre? o ¿ha
habido una divergencia simultánea de los linajes humano, del
chimpancé y el gorila (tricotomía)? Casi todos los datos sobre se­
cuencias de nucleótidos (p. ej., Satta y cois., 2000) apoyan una re­
lación más cercana entre seres humanos y chimpancés (incluidos
Pan troglodytes, el chimpancé común, y Pan paniscus, el chimpancé

G ru p o s y
e je m p lo s
Vertebrados no
~m andibulados L a m p re a s
P e c e s ca rtila g in o s o s
Tiburones, mantarrayas,
Vertebrados rayas
"m andíbulados- P e z te le o s to
P e z lo b o , p e z c e b ra ,
m edaka
l 450 A n fib io s
Xenopus
R ep tiles y av es
-360 Pollo
M a m ífe ro s p ro to te ria n o s (m o n o trem o s )
-310 M a m ífe ro s m e ta te ria n o s P la tip u s , e c h id n a
(m a rsu p iales )
-170 C an g u ro

130 O v e ja , c a b ra s
-20

r85
r ■65 G anado

C e rd o s

-95 ' C a b a llo s

■75 P erros
-45
i_ G a to s

C o n ejo s

R a ta s
40
I__
R ato n e s
90
Monos del Nuevo Mundo
(p. ej., marmosetas)

~3|5 i-------- Mono!

Monos del Viejo Mundo
(p. ej., macacos)
C lave: Lor
O ra n g u tá n
M a m ífe ro s eu te rian o s
G o rila
P rim a tes ca tarrin o s
C h im p a n c é , b o n o b o
H om ín idos
S e r h u m an o

Fig. 12-24. Filogenia de vertebrados simplificada.

Los números en los nudos muestran los tiempos estimados de divergencia en millones de años.
 12.4 | ¿QUÉ CONVIERTE AL HOMBRE EN SER HUMANO? 385

D u p lic a c ió n
o ,

a b a b
AAAAAAA
B1
TTTTTTT

d V b
R NA7SL

M o n ó m e ro iz q u ie rd o D e re c h o / M onóm ero
| m
D ím e ro A lu
AAAAAAA AAAAAAA
TTTTTTT I ■ ■ TTTTTTT
a b a v c dy b

3 2 pb
E xcisión <- _ y

Fig. 12-25. Las repeticiones Alu y B1 evolucionaron de copias procesadas del gen RNA 7SL.

La homología extensa de las secuencias de repetición Alu hasta los extremos de la secuencia RNA 7SL sugiere que se integró una copia poliadenilada
del gen RNA 7SL en alguna parte del genoma mediante un acontecimiento de retrotransposlción (véase fig. 9-14 para el tipo general de mecanismo). En
algunos casos, las copias integradas fueron capaces de producir transcritos de RNA propios. En una etapa muy temprana se perdió un segmento interno
(entre c y d). De manera subsecuente se eliminó (deleción) un segmento central de 32 pb que contenía las regiones que flanqueaban la deleción original
(c + d) para proporcionar una unidad de repetición relacionada. La fusión de los dos tipos de unidad dieron como resultado la repetición dimérlca típica
Alu, con el monómero de la izquierda (5 ') sin una secuencia de 32 pb y el monómero de la derecha (3 ') con la secuencia de 32 pb. Obsérvese que en
el genoma humano también se encuentran múltiples copias de monómeros Alu. En el ratón sucedió al parecer un proceso similar de copiado del gen
RNA 7SL con deleción subsecuente de una unidad interna grande (entre a y b), seguida de duplicación tándem de las regiones de flanqueo (a + b).

60

5 0 .4
50

40
<0
O
O)
O
■O 3 0
■c.
o 2 5 .7
m
£ Fig. 1 2 -2 6 . Divergencia proteinica entre seres humanos y roedores.
<0
ÜL
20
Se ha clasificado una muestra de 1 880 ortólogos de humanos y

1 2 .7 roedores (publicada primero por Makalowski y Boguski, Proc Nati Acad

Sci USA 95: 9 4 0 7-94 1 2 ; 1998) en grupos de acuerdo con el nivel
10 7 .3 de divergencia de la secuencia de aminoácidos entre ortólogos. Las
proteínas más conservadas (p. ej., calmodulina, proteínas ribosómicas,
3.1
histonas, y otras) participan en procesos celulares críticos.
0 -5 , 0 .0 8
Las proteínas de evolución más rápida se relacionan con la defensa
O 10 20 30 40 50 60 70 del huésped/inmunidad o la reproducción (véase el texto).
D iv e r g e n c ia d e s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s (% )
386 CAPÍTULO DOCE LUGAR DEL HOMBRE EN EL ÁRBOL DE LA VIDA
Recuadro 1 2 - 5 . G lo s a r io de grupos y conceptos filogenéticos m etazoáricos com unes
......... ....................................................................
Para mayor información, véase la página de la red Tree of Ufe (http://tol-
web.org/tree/phylogeny.html) y otras fuentes filogenéticas en las lecturas
adicionales. Véase las figuras 1 2-22 a 12-24 para las filogenias simplifi­
cadas de eucariotas, metazoáricas y de vertebrados.
Amniotas: vertebrados que forman un amnios; incluyen reptiles, aves y
mamíferos, pero no peces ni anfibios.
Antropoides: hominoides (q.v.) y monos.
Ascidianos: véase ascidios (p. ej., Ciona intestinalis), un tipo de tunica­
do (q.v.).
Bílaterianos: metazoarios simétricos bilaterales, incluidos los equinoder­
mos, que tienen larvas simétricas bilaterales; poseen tres capas germina­
les y en la actualidad son sinónimos de triploblastos (q.v.).
Catarrhine, primates: hominoides (q.v.) más monos del Viejo Mundo.
Cefalocordados (es decir, branquiostomas o lancetas), cordados, que
carecen de cráneo o columna vertebral (p. ej., Amphioxus).
Cordados: animales que tienen una etapa embrionaria en la cual poseen un
notocordlo, un cordón neural tubular dorsal y bolsas de agallas faríngeas;
Incluyen urocordados (q.v.), cefalocordados (q.v.) y craneados (q.v.).
Cnidarianos (celenterados): medusa, corales, anémonas de mar (todas
simétricas y radiales con dos capas germinales).
Celomados: organismos con un celoma o cavidad corporal interna llena
con liquido que está recubierta por completo con mesodermo, en com­
paración con los acelomatos (p. ej„ tenias) y seudocelomatos (p. ej., ne-
matodos que tienen una cavidad corporal llena con líquido pero que no
está recubierta del todo con mesodermo); se dividen en dos grupos, pro-
tostomas (q.v.) y deuterostomas (q.v.).
Clade: un grupo de organismos que incluye todos los descendientes de
un ancestro común último (es decir, taxón monofiiético).
Craneados: animales con cráneo, esto es, vertebrados más el pez ciclóstomo.
Deuterostomas: de palabras griegas que significan segunda boca, como
los cordados (q.v.) y equinodermos (q.v.); son animales en los que el
biastoporo (la abertura de la cavidad digestiva primitiva hacia el exterior
del embrión) se localiza en la parte posterior del embrión y se constituye
en el ano; con posterioridad se abre la boca opuesta al ano; compárese
con protostomas (q.v.).
Diploblastos: metazoarios sólo con dos capas germinales: ectodermo y
endodermo, como cnidarianos (q.v.) y ctenofora (medusas cardadas);
son simétricos y radiales y por consiguiente este grupo se clasifica con
frecuencia con el término de radiados (q.v.).
Equinodermos (p. ej., erizo de mar, estrella marina): son animales marinos
simétricos y radiales pero, debido a que tienen tres capas germinales, son
triploblastos y por lo tanto se clasifican como bílaterianos (q.v.).
pigmeo o bonobo). El clade (es decir, agrupamiento) Homo-Pan es­
tá apoyado asimismo por análisis de punto de rotura cromosómica
que muestran que en el ancestro de humanos, chimpancés y bono-
bos comunes debió transponerse 0.1 Mb de fragmento autosómi-
co dentro del cromosoma Y.
La divergencia de los linajes ser humano-chimpancé y ser hu-
mano-gorila ocurrió hace alrededor de cinco a seis millones de arios
y siete millones de años, respectivamente, y condujo a una diversi­
dad de diferencias genéticas (véase Gagneux y Varki, 2001; Olson
y Varki, 2003). La divergencia hacia especies separadas (especiación)
debió recibir el impulso inicial de diferencias citogenéticas peque-
«
I
Mamíferos euterianos: mamíferos placentarios, en oposición a mamífe­
ros monotremos (q.v.) y metaterianos (q.v.).
Gnatostomas: vertebrados mandibulares que constituyen la mayor parte
de los vertebrados, aunque las lampreas son vertebrados sin mandíbulas.
Peces ciclóstomos: se relacionan de cerca con vertebrados, pero son in­
vertebrados porque el notocordio no se convierte en una columna vertebral.
Homínidos: seres humanos y ancestros parecidos al hombre.
Hominoides: seres humanos, grandes monos (chimpancé común, bono-
bo, gorila, orangután) y simios menores (gibones); compárese con antro­
poides (q.v).
Mamíferos metaterianos: marsupiales.
Monotremos: mamíferos que ponen huevos.
Monos del Nuevo Mundo (Platyrrhini): monos que están limitados a am ­
bientes de bosques tropicales en el sur de México, Centroamérica y Su-
damérica.
Monos del Viejo Mundo (Cercopithecidae ): monos que se encuentran
en una gran variedad de ambientes en el sur de Asia y Asia occidental,
Medio Oriente y África.
Phylum: un grupo de especies que comparte una organización corporal
común.
Primates platirrinos: monos del Nuevo Mundo (q.v.).
Mamíferos prototerianos: monotremos (q.v).
Protostomas: de palabras griegas que significan primera boca\ son orga­
nismos en los que la boca se origina a partir del biastoporo (abertura de
la cavidad digestiva primitiva hacia el exterior del embrión); con posterio­
ridad se abre el ano opuesto a la boca; incluye moluscos, anélidos y ar­
trópodos; compárese con deuterostomas (q.v.).
Radiados: animales simétricos y radiales con sólo dos capas germinales;
diploblastos (q .v).
Taxón: grupo de organismos que se reconoce a cualquier nivel de la cla­
sificación.
Peces teleostos: un grupo mayor de peces óseos (en oposición a los pe­
ces con un esqueleto cartilaginoso, como tiburones, mantarrayas y ra­
yas); se caracterizan poruña mandíbula superior del todo movible, aletas
rayadas y una vejiga natatoria.
Triploblastos: metazoarios con tres capas germinales; son simétricos bi­
laterales y de ahí el sinónimo bilaterianos (q.v.).
Tunicados: incluyen erizo de mar y salpas (p. ej., Ciona ¡ntestinalis, el eri­
zo de mar).
Urocordados: cordados (q.v.) que tienen un notocordio limitado a la re­
gión caudal (es decir, tunicados).
ñas, por ejemplo inversiones (que suprimen la recombinación en
mamíferos), mutaciones en genes fundamentales que regulan la
formación de gametos o la regulación del desarrollo embrionario
temprano, o ambas cosas.
Organización del genoma
Las comparaciones citogenéticas comunes resaltan la conservación
muy potente de patrones de bandeo cromosomico homínidos (ser
humano y grandes monos) (Yunis y Prakash, 1982). Al parecer, las
principales diferencias estructurales parecen limitadas, incluidas
 12.5
varias inversiones pericéntricas y paracéntricas, la fusión reciente
de dos cromosomas para formar el cromosoma 2 humano y una
translocación recíproca entre los cromosomas del gorila que co­
rresponde a los cromosomas humanos 5 y 17 (véase fig. 12-27).
Las secuencias centroméricas muestran una evolución muy rápida
y aunque se conserva una secuencia satélite alfa en todos los cro­
mosomas humanos y de los grandes monos, hay una divergencia
muy notable de secuencias, muy probablemente como resultado
de evolución concertada de las repeticiones en linajes individuales.
Estudios de mapeo comparativos más recientes con HFIS multi­
color (véase fig. 12-28) confirmaron la conservación potente de
sintenia y permitieron proponer un cariotipo ancestral para homi-
noides (Muller y Wienberg, 2001).
El muestreo de secuencias sugiere que alrededor de 95% del ge-
noma del chimpancé puede alinearse de manera directa con las se­
cuencias humanas correspondientes y que en estas regiones
alineadas la divergencia de secuencias es en promedio de 1.2%; el
5% no alineado se debe a deleciones/inserciones (véase Olson y
Varki, 2003, para las diferencias). A pesar de la identidad de se­
cuencias muy alta (de DNA no codificante y DNA de codifica­
ción), es posible reconocer algunas subfamilias Alu (Sbl, Sb2) y
retrotransposones LTR específicos de seres humanos.
Diferencias génicas
Cuando se comparan las secuencias ortólogas humanas y de chim­
pancés, el DNA de codificación muestra de forma característica
99% o más de identidad secuencial. En algunos casos, alelos espe­
cíficos de ciertos genes humanos están relacionados más de cerca
con ortólogos en chimpancés en comparación con otros alelos hu­
manos. Por ejemplo, en el locus humano HLA-DR(3, la secuencia
de los alelos HLA-DRB1 *0302 y HLA-DRB1 *0701 es claramente
más cercana a ciertos alelos del gen ortólogo del chimpancé Patr-
DRB de lo que están entre sí (fig. 12-29). Estas observaciones son
consistentes con un origen antiguo de esos alelos divergentes, en
términos comparativos, anterior a la divergencia entre el hombre y
el chimpancé.
Se conocen genes específicos de primates, incluidos algunos de
origen evolucionista reciente y otros que al parecer se sometieron a
selección positiva para sustitución de aminoácido (Courseaux y
Nahon, 2001; Johnson y cois., 2001). Es probable que los genes es­
pecíficos humanos sean muy raros, aunque la duplicación y la pér­
dida génicas -en especial en familias génicas agrupadas- tienen
como resultado diferencias en el número de genes entre personas y
los grandes monos. Sin embargo, en la actualidad existen pocas
pruebas de diferencias funcionales entre genes humanos y de chim­
pancés: la única distinción bioquímica conocida es el agotamiento
global en seres humanos de un ácido siálico específico, el ácido N-
glucolilneuramínico que se expresa (en una forma regulada por el
desarrollo y específica de tejido) en chimpancés, bonobos y los
otros grandes monos. La diferencia se debe a una deleción de cam­
bio de marco en el gen del ácido ,/V-acetilneuramínico CMP, que
ocurrió en el linaje humano hace alrededor de dos millones de
años, justo antes del inicio de la expansión rápida del cerebro
(Chou y cois., 2002).
EVOLUCIÓN DE LAS POBLACIONES HUMANAS 38"
El gen FOXP2 del dominio en horquilla es el primer gen que se
relacionó con las características humanas sólo del habla y el lengua­
je. Se conservó muy bien durante la evolución y únicamente mues­
tra tres sustituciones de aminoácidos entre personas y ratones. No
obstante, dos de estas sustituciones se observan sólo en humanos
(los grandes monos tienen los mismos aminoácidos que el ratón) y
se ha sugerido que se seleccionaron de modo positivo durante la
evolución humana reciente (Enard y cois., 2002a). Es posible que
afectaran la capacidad de una persona para controlar los movimien­
tos bucofaciales necesarios para el habla.
En fecha reciente se propusieron dos métodos sistemáticos pa­
ra identificar la base molecular de las características únicas de los
seres humanos. El primero compara la expresión génica de huma­
nos y primates a escala de toda la extensión del genoma median­
te perfiles de RNA basados en microordenamientos y perfiles
bidimensionales de proteínas basados en electroforesis. Los datos
preliminares muestran que los patrones de expresión específicos
de especie son intensos en el caso del cerebro (Enard y cois.,
2002b). El segundo método consiste en seleccionar las secuen­
cias del genoma humano para regiones que experimentaron una
selección potente en la línea humana. La selección potente para
un nuevo alelo favorable puede causar un ba rrid o selectivo (a
medida que aumenta la frecuencia del nuevo mutante, también
se barren regiones cromosómicas adyacentes para fijación); el re­
sultado incluye regiones de diversidad de nucleótidos muy baja.
En estas regiones se identificó una variedad de genes humanos y
son blancos para la identificación de diferencias genéticas entre
los seres humanos modernos y los chimpancés (Diller y cois.,
2002).
12.5 Evolución de las poblaciones
hum anas
La investigación acerca de la forma en que evolucionaron las po­
blaciones humanas va más allá de una simple curiosidad sobre el
pasado del hombre. También puede exhumar pruebas de la adap­
tación a nivel molecular y ayudar a interpretar y predecir desequili­
brios de enlace, con las consecuencias para estudios de asociación de
enfermedades.
Hasta que tuvieron éxito los análisis del DNA, la investigación
de la evolución de la población humana dependió de estudios ar­
queológicos y paleontológicos. El fósil homínido registrado en Áfri­
ca apareció hace alrededor de cuatro millones de años en el Plioceno
temprano (época geológica de 5.3 a 1.8 millones de años), con re­
presentantes del género Australopithecus de Etiopía y Tanzania. El
Homo erectus surgió hace más de un millón de años en el Pleistoce-
no (la época comprendida entre 1.8 y 0.8 millones de años) y dio
lugar al género humano. Algunos autores apoyan la posibilidad de
que otra especie, Homo heidelbergensis, descendiera del Homo erec­
tus y diera origen a su vez al Homo sapiens y Homo neanderthalensis
(véase Stringer, 2002). Desde el punto de vista anatómico, los hu­
manos modernos (Homo sapiens sapiens) comenzaron a aparecer ha­
ce 120 000 a 100 000 años y coexistieron con los hombres de
Neanderthal hasta que este último se extinguió hace unos 30 000
años.
388 CAPITULO DOCE LUGAR DEL HOMBRE EN EL ÁRBOL DE LA VIDA

C G O

Fig. 12-27. Los patrones de bandeo cromosómico humanos son muy similares a los de otros grandes simios.

Los ideogramas son de preparaciones en profase tardía de 1 000 bandas de ser humano (H), chimpancé (C), gorila (G) y orangután (0 ). El cromosoma 2
humano surgió por fusión de dos cromosomas de primates. El cromosoma humano 6 es en extremo similar a sus ortólogos -la s únicas diferencias visibles
con facilidad son heterocromatina telomérica adicional en el brazo corto del ortólogo del chimpancé y en ambos brazos del ortólogo del gorila-. Los ortólogos
del cromosoma 5 humano muestran diferencias notorias. El ortólogo del chimpancé sufrió una inversión pericéntrica (puntos de rotura correspondientes a
5p13 y 5q13) y el ortólogo de gorila se sometió a translocación recíproca con un cromosoma correspondiente al cromosoma humano 17. Reimpreso con
autorización de Yunís y Prakash (1982), Science 2 1 5 :1 52 5 -1 5 3 0 . © 1982, American Association forthe Advancement of Science.

La variación del DNA proporciona un método alternativo pa­
ra reconstruir la historia reciente de las poblaciones humanas. Pue­
den utilizarse diferentes marcadores de DNA. Por lo general se
emplean el DNA mitocondrial y secuencias del cromosoma Y no
recombinantes porque, a diferencia de otros marcadores, no son
propensos a recombinación y es posible seguir linajes de manera
directa a través de las líneas materna (mtDNA) o paterna (cromo­
soma Y). Por supuesto, es difícil que sean representativos del ge-
noma y por consiguiente también se han estudiado secuencias
autosómicas y ligadas a X.
Además de la variación en el muestreo de DNA en diferentes
poblaciones de seres humanos modernos, es posible recuperar
DNA de huesos de especímenes arqueológicos. Aunque las se­
cuencias de DNA recuperadas tienen longitudes cortas, pueden
amplificarse mediante PCR y analizarse con secuenciación o geno-
tipificación. El proceso de degradación establece límites de tiem­
po, pero con un gran cuidado es posible extraer DNA an tiguo de
especímenes hasta de unos 50 000 años de edad o más. El DNA
recuperado de un espécimen de Neanderthal de 30 000 a 100 00C
años de edad tuvo una secuencia mtDNA claramente diferente en
comparación con la de los hombres modernos: alrededor de tres
veces la variación promedio que se encontró entre distintos seres
humanos, pero casi la mitad de la diferencia promedio entre per­
sonas y chimpancés (Krings y cois., 1997). Aunque los datos son
 12.5 EVOLUCIÓN DE LAS POBLACIONES HUMANAS 389

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Fig. 12-28. Codificación por barras de cromosomas de primates como un medio para revelar diferencias estructurales.

Los perfiles de bandeo a color de especies cruzadas (Rx-HFIS) muestran alineamiento de cromosomas ortólogos de primates con los cromosomas
humanos 1 -22 y X. Los juegos de cromosomas (con la numeración según el homólogo humano) se muestran de izquierda a derecha: humano,
chimpancé, gorila, orangután y macaco. A fin de mejorar las comparaciones se muestran los cromosomas 2p/2q, 7 /2 1 ,1 4 /1 5 y 20 /22 , que son
cromosomas únicos en seres humanos o el macaco junto con los homólogos de los grandes simios. Este tipo de análisis sugirió un cariotipo preliminar
ancestral para hombres y grandes simios. Reproducido a partir de Muller y Wienberg (2002), Hum. Genet. 109:85-94, con autorización de Springer-Verlag.

por fuerza limitados, sugieren que los hombres de Neanderthal se
extinguieron sin contribuir con ningún mtDNA a los seres huma­
nos modernos y al parecer los linajes que condujeron a los Nean­
derthal y los humanos modernos divergieron hace alrededor de
500 000 años.
12.5.1 Las pruebas genéticas sugieren un origen
reciente de los seres humanos modernos
en poblaciones africanas
Cuando se aplicaron los estudios de variación del DNA a poblacio­
nes modernas, se advirtió con claridad un origen reciente de los
hombres modernos en poblaciones africanas (véase Excoffier, 2002;
Templeton, 2002) y ello se ajusta a la mayor diversidad genética
observada en poblaciones africanas (véase sección siguiente). Una
proposición inicial, el modelo del origen africano reciente (OAR)
(también conocida como hipótesis unirregional), sugirió que la es­
pecie humana evolucionó a partir de una población africana peque­
ña que de modo subsecuente colonizó todo el mundo, tras
suplantar a los primeros homínidos hace unos 100 000 a 150 000
años (alrededor de la época en la que surgieron los hombres anató­
micamente modernos; véase fig. 12-30).
El modelo OAR se basó al principio en estimaciones de la va­
riación del haplotipo en mtDNA humano. La transmisión mater­
na de mtDNA y la ausencia de recombinación significa que es po­
sible aplicar con facilidad análisis de coalescencia (recuadro 12-6)
a fin de estimar la fecha del ancestro común que transmitió, la se­
cuencia de DNA en estudio a todos los individuos de la muestra.
Con este tipo de conducta pueden seguirse las secuencias de mtDNA
de todos los seres humanos modernos hasta un solo individuo, la
“Eva mitocondrial”. Los análisis muestran que este individuo exis­
tió hace unos 100 000 a 150 000 años (5 000 a 7 000 generacio­
nes más o menos) y los datos sugieren con firmeza que ella vivió en
el este de África (véase más adelante). Por supuesto, la Eva mito­
condrial no fue la única persona que vivía en el planeta en esa épo­
ca: había tal vez 10 000 individuos que vivieron en esa época pero,
a diferencia de Eva, sus secuencias de mtDNA no se transmitieron a la
población humana actual (véase recuadro 12-6).
El modelo del OAR fue motivo de controversias porque se sabe
que el precursor inmediato del hombre, Homo erectus, se dispersó
fuera de África hace más de un millón de años. Por consiguiente, el
modelo exige que sólo un subgrupo africano de Homo erectus dé lu­
gar a los seres humanos modernos. Aunque basado al principio en
estimaciones incorrectas, el modelo del OAR se apoya por datos re­
cientes más seguros. La filogenia basada en mtDNA que se muestra
en la figura 12-31 proporciona un ejemplo del método general. El
punto crucial es que las ramas más profundas (las que divergieron
más temprano de la raíz y, en consecuencia, las más antiguas en tér­
minos evolucionistas) conducen de forma exclusiva a variantes que
390 CAPÍTULO DOCE LUGAR DEL HOMBRE EN EL ÁRBOL DE LA VIDA

1 100 200 270

H L A -D R B 1 *0 3 0 2 I _ ~ ............................... .. Zl
H L A -D R B 1 *0 7 0 1 I III lili I I I I i I II I II I I I I III I IIII I

H L A -D R B 1 *0 3 0 2 I - Z l
P a tr-D R B 1 * 0 3 0 5 I ..................... I l ............. I ................. l.l...................... III I.. I III ....-J

H L A -D R B 1 *0 7 0 1 [
P a tr-D R B 1 *0 7 0 2 [

Fig. 12-29. Algunos alelos humanos muestran mayor divergencia secuencial respecto de cuando se comparan de forma individual con genes
ortólogos de chimpancé.
HLA-DRB1*0302 y HLA-DRB1*0701 muestran un total de 31 diferencias (13%). La comparación
De un total de 270 posiciones de aminoácidos, los alelos
de cualquiera de los alelos con los alelos en el locus ortólogo del chimpancé (Patr-DRB1) identifica pares de humanos y de chimpancés relacionados
muy de cerca, como HLA-DRB1*0701 y Patr-DRB1*0702 (sólo dos diferencias de aminoácidos de 270). Esto sugiere que algunos alelos HLA actuales
fueron anteriores a la división ser humano-chimpancé. Redibujado a partir de Klein y cois. (1993), Scientific American 269 :6 75 -68 0 , con autorización de
Scientiflc American Inc.

se encuentran en la población africana que sugieren con solidez que
la Eva mitocondrial vivió en África. Los tres métodos de reconstruc­
ción (p. ej., la unión del vecino más cercano que se muestra en la
fig. 12-31) permiten estimar en términos estadísticos el tiempo que
se requirió para que todas las secuencias de mtDNA que existen en
la actualidad coalescieran en la secuencia mtDNA ancestral única.
Algunos paleontólogos apoyan un modelo alternativo de evolu­
ción multirregional. En éste se considera que los humanos moder­
nos surgieron de manera gradual y simultánea de poblaciones de
Homo erectus dispersadas en diferentes continentes con un flujo gé-
nico importante entre los distintos grupos. Análisis estadísticos más
recientes de árboles de haplotipo objetan asimismo un modelo de

Fig. 12-30. Diseminación del Homo sapiens fuera de África oriental postulada por el modelo recent alrican origin (origen africano reciente) (hipótesis
unirregional).

Las fechas (en años antes del presente) Indican las fechas estimadas del arribo de seres humanos modernos a los sitios indicados apoyados por registros
paleontológicos y arqueológicos. Las fechas de migración fuera de África sugeridas por estudios genéticos apoyan que el modelo recent african origin
varía entre 50 000 y 2 0 0 000 años. Figura adaptada a partir de Klein y Takahata (2 0 0 2 ), Where do we come from? The molecular evidence for human
descent, con autorización de Springer-Verlag, Berlín.
 12.5 EVOLUCIÓN DE LAS POBLACIONES HUMANAS 391

Recuadro 12-6. Análisis de coalescencia

En genética evolucionista, coalescencia es lo opuesto a divergencia. Du­

rante la dirección evolucionista normal, del pasado al presente, los genes
y las secuencias de DNA divergen a partir de una secuencia ancestral co­
mún. El objeto del análisis de coalescencia es comenzar desde la diversi­
dad genética que existe en la actualidad en algún locus y regresar a través
de la evolución. Por supuesto, es mucho más fácil trabajar en retrospec­
tiva si sólo se siguen las líneas materna o paterna y por consiguiente los
análisis de coalescencia son comparativamente directos para mtDNA (lí­
nea materna) y secuencias del cromosoma Y no recombinantes (línea pa­
terna), ya que no hay recombinación que cause confusión.
Después de reunirse muestras de diversas poblaciones, los análisis de coa­
lescencia buscan establecer el punto en que todas las diferentes variedades
de secuencias modernas de DNA que se hallan en las muestras reunidas
coalescen hacia una secuencia ancestral única que se encuentra en el an­
cestro común más reciente (ACMR). Implícita en el concepto de coales­
cencia está la desigualdad de la descendencia: todos los seres humanos
modernos y sus genes descienden de individuos ancestros que contienen
genes ancestrales, pero no todas las personas que vivieron en el pasado tu­
vieron descendientes. Por consiguiente, es posible conectar diferentes lina­
jes a distintos ACMR (véase figura). Por último, toda la variación genética
que se halla en un locus en los humanos modernos debe rastrearse hasta
un Individuo aislado, como la Eva mitocondrial en el caso del mtDNA.
Es importante advertir que los distintos locus coalescen en distintos ances­
tros comunes más recientes (ACMR). Los cerca de tres mil millones de cro­
mosomas Y humanos en el planeta coalescen en la actualidad hacia un
cromosoma Y único de un individuo aislado que vivió en el pasado, el “cro­
mosoma Y de Adán”. Es posible que no viviera al mismo tiempo que la Eva A B C D E F G H I J
mitocondrial porque la via evolucionista que tomó este cromosoma V fue
diferente de la que tomó el DNA mitocondrial de Eva. La recombinación A n c e s tro c o m ú n
presenta problemas para análisis de coalescencia de secuencias autosóml- m á s re c ie n te
cas, a menos que se consideren locus específicos. Sin embargo, tiende a
ocurrir recombinación en ciertas áreas del genoma en lugar de otras y el
El análisis de coalescencia busca rastrear el gen o linajes de secuen­
genoma autosómico humano es al parecer un mosaico de los llamados
cia de DNA hasta que coalescen en un mismo individuo.
bloques de haplotipos (segmentos típicos de 5 a 200 kb de longitud, en
tanto que las tres a siete variantes constituyen la mayor parte de la varia­ Los diferentes linajes de genes o secuencias de DNA específicos en las po­
ción genética que se observa en seres humanos modernos; véase Paabo, blaciones que existen hoy en día (generación G0, hilera inferior) pueden ras­
2003). Los bloques de haplotlpo tienden a ser más cortos en poblaciones trearse al final hasta varios ancestros comunes recientes en generaciones
africanas y por lo tanto un tamaño promedio a nivel de especie para un blo­ previas (G-1 a G -17). El linaje de ramificación más temprano es E, que di­
que haplotlpo puede ser del orden de 10«kb. Cada uno de los bloques de vergió hacia ocho generaciones (G- 8 ; de los linajes F-H). Todos los linajes
haplotipo autosómico posee su historia evolucionista y por consiguiente mi­ coalescen en un ancestro común más reciente (ACMR) hace 13 generacio­
les de otros ACMR habrán contribuido al DNA genético de los hombres mo­ nes (G-13). Todos los círculos en blanco representan casos en los que no
dernos, además de la Eva mitocondrial y el cromosoma Y de Adán. se transmitió la secuencia gen/DNA en estudio a la generación actual.

OAR simple. Al tiempo que confirma el papel dominante que tu­
vo África en la modelación del fondo común génico moderno,
Templeton (2002) sugiere que los seres humanos se expandieron
fuera de África más de una vez y se interparearon en una base re­
gional (véase Excoffier, 2002, para cotejar varios modelos).
12.5.2 La diversidad genética humana es baja y se debe
sobre todo a variación dentro de las poblaciones
más que entre ellas
Los estudios demuestran de manera consistente que la diversidad
genética en seres humanos es baja comparada con otras especies, in­
cluidos ratones y monos, lo que sugiere que el linaje humano sufrió
un cuello d e botella d e p ob lación reciente en términos evolucionis­
tas. El patrón de variación no es uniforme: las poblaciones no afri­
canas muestran de modo característico un subgrupo de la variación
genética que se encuentra en poblaciones africanas.
Un ejemplo notable es la variación que se observa en el minisa­
télite de insulina, que se vincula con susceptibilidad a diabetes y
otros fenotipos. Un estudio reciente de tres poblaciones africanas y
tres no africanas identificó un total de 22 linajes muy divergentes
de alelos relacionados. No fue factible encontrar intermedios es­
tructurales entre estos linajes en las poblaciones que existen en la
actualidad, lo que sugiere un cuello de botella dentro del ancestro
de todos los seres humanos (Stead y Jeffreys, 2002). La diferencia
entre la diversidad en las poblaciones africanas y no africanas es ex­
traordinariamente grande: los 22 linajes se identificaron en .Africa,
pero sólo tres se encontraron en poblaciones no africanas, algo que
es consistente con un origen común fuera de África (cuadro 12-6i.
392 CAPÍTULO DOCE LUGAR DEL HOMBRE EN EL ÁRBOL DE LA VIDA

- 1 Chukchi
2 A ustraliano
3 A ustraliano
0 .000 5 4 P im ano
5 italiano
6 Tierra alta PN G
7 C o sta PN G
8 T ie rra alta PN G
9 G eorgiano
— 10 A lem án
11 U zb e co
12 Saam
13 Tá rta ro crim eano
14 H olandés
15 Francés
16 Inglés
17 S am oano
18 C oreano
19 C hino

20 Indio asiatico
21 Chino
2 2 C o sta PN G
23 A ustraliano
------------24 Evenki
25 Buriat
— 26 Khirgiz
27 W arao
28 W arao
29 Inuit siberiano
30 G uarani

N o africano
A fricano
33 M k a m b a

4 6 Biaka
4 7 M b e n ze le

52 San
53 San

C h im p an cé

Fig. 12-31. Las filogenias de mtDNA sugirieron un origen africano reciente de los seres humanos modernos.

Ésta es una filogenia de unión de vecino basada en esencia en secuencias del genoma completo mtDNA (sin contar el asa D) de 53 individuos (las
poblaciones de origen se proporcionan a la derecha), mediante el chimpancé como grupo externo. Los datos se sometieron a bootstrappend con 1 000
réplicas (los valores bootstrappend se muestran en rojo en los nudos). Los individuos de descendencia africana se encuentran abajo de la línea horizontal
central; los no africanos arriba. El nudo marcado con un asterisco se refiere al ancestro común más reciente del conjunto más joven que contiene individuos
africanos y no africanos. Este análisis sugirió que los seres humanos modernos surgieron de poblaciones africanas tal vez hace alrededor de 50 000
años, un momento un poco más reciente de lo que sugirieron muchos análisis similares. Figura reproducida de Ingman y cois. (2000), Nature 408:708-713,
con autorización de Nature Publishing Group.
 12.5 EVOLUCIÓN DE LAS POBLACIONES HUMANAS 393

Cuadro 12-6. Mayor diversidad genética en poblaciones africanas que en poblaciones no africanas en el minisatélite de insulina
Poblaciones no africanas Poblaciones africanas
Linaje Reino Unido Kazajistán Japón Costa de Marfil Zimbabue Kenia

1 71.6 85.0 94.9 19.2 118.8 15.5

NIA 23.0 11.3 4.2 5.8 1.4 7.1
1116 5.4 3.8 0.8 3.2 1.4 3.6
F — — — — 0.7 —

6 — — — 1.3 0.7 —
H — — — — 1.4 3.6
J — — — 9.6 8.0 9.5
K — — — 20.5 17.4 20.2
L — — — 8.3 5.1 3.6
M — — — 3.2 0.7 3.6
N — — — 2.6 5.8 —

0 — — — 2.6 — —

P — — — — 2.9 2.4
Q — — — 1.9 5.8 9.5
S — — — 4.5 .7 3.6
T — — — .6 4.3 1 .2

U — — — — 1.4 —

CO
V — — — 1.3 1.4

W — — — 1 2 .8 13.0 9.5
X — — — 1.9 4.3 2.4
V — — — 0.6 3.6 —

z — — — — 0.7 —

Un sistema de alta resolución para analizar las distribuciones de repeticiones variables en el locus INS VNTR identificaron 22 linajes muy divergentes de alelos relacionados. Las
frecuencias de linaje se expresan como porcentajes. Sólo se encontraron tres de los linajes en poblaciones no africanas (el símbolo — indica ausencia de alelos vinculados con
linaje). En contraste notable, se reconocieron todos los 22 tipos de linaje en África en donde las diferentes poblaciones mostraron mucha mayor variabilidad. La representación
excesiva del linaje I no africano puede deberse a selección positiva. Reproducido a partir de Stead y Jeffreys (2002), Am. J. Hum. Genet. 71:1273-1284, con autorización de
University of Chicago Press.

A pesar de las diferencias entre las poblaciones que se observan en
el cuadro 12-6, estudios genéticos demuestran de manera sólida que la
gran mayoría de la variación genética humana deriva de diferencias
dentro de poblaciones, no tanto entre ellas. En el más amplio de estos
estudios se halló que las diferencias entre los individuos dentro de la
población constituían 93 a 95% de la variación genética humana, en
tanto que sólo 3 a 5% se explicaba por las diferencias entre grupos ma­
yores de población distintos (Rosenberg y cois., 2002). Si bien cada
persona individual tiene una historia biológica única, las historias bio­
lógicas del hombre están tan superpuestas que es muy engañoso divi­
dir a las personas en categorías biológicas. Por consiguiente, el concepto
de “raza” como una categoría discreta definida p or la biología es irracional
porque no es posible definir estas categorías en sentido biológico.
El estudio de Rosenberg y colaboradores (2002) fue un nuevo
punto de partida, un esfuerzo para definir la estructura genética de
poblaciones humanas sin utilizar a priori inform ación sobre el ori­
gen geográfico d e los individuos estudiados. Sin esta información, se
identificaron cinco grupos genéticos mayores que corresponden a
cinco regiones geográficas mayores: África subsahariana; África sa­
hariana y Eurasia (Europa, Oriente Medio y Asia central y del sur);
Asia del este; América (amerindios) y Oceanía. Por consiguiente,
hay consenso acerca de la asignación geográfica y genética. No
obstante, como se describió, dos genes de dos individuos en cual­
quiera de estas regiones geográficas sólo es en prom edio 4% más si­
milar que dos genes seleccionados de individuos que pertenecen a
la misma región.
394 CAPÍTULO DOCE | LUGAR DEL HOMBRE EN EL ÁRBOL DE LA VIDA
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P AR T E TRES

Mapeo e identificación
de genes patológicos
y mutaciones

13 M apeo g e n é tico d e ca ra cteres m en d elia n os 399

14 Id en tifica ció n d e g en es p a to ló g ico s en seres hu m an os 417

15 M apeo e id en tifica ció n d e g en es q u e co n fieren su scep tib ilid a d

a en ferm ed a d es com p leja s 43 7

16 P atología m olecu la r 465

17 G enética d e l cá n cer 489

18 P ru eba s g en ética s en in d ivid u os y p o b la cio n es 511

CAPÍTULO TRECE

Mapeo genético de caracteres

mendelianos

Contenido del capítulo

400 CAPITULO FRECE MAPEO GENÉTICO DE CARACTERES MENDELIANOS
13.1 Recombinantes y no recombinantes
En principio, el mapeo genérico en seres humanos es exactamente
el mismo que el mapeo genético en cualquiera otro organismo di-
ploide que se reproduce de forma sexual. El objetivo es descubrir la
frecuencia con que se separan dos locus mediante recombinación
meiótica. Considérese que una persona es heterocigota en dos locus
(genotipo A jAj Bj Bj ) y que los alelos Aj y B, provienen de un pa­
dre y A2 y B2 del otro. Cualquiera de los gametos de ese individuo
que lleva una de estas combinaciones parentales ( A ^ o A2B2) no
es recombinante para esos dos locus, en tanto que los gametos que
llevan AiB2 o A2Bt son recombinantes (fig. 13-1). La proporción
de gametos que son recombinantes es la fracción de recombinación
entre los dos locus A y B.
13.1.1 La fracción de recombinación es una medición
de la distancia genética
Cuando dos locus se encuentran en diferentes cromosomas, se se­
gregan de manera independiente. Considérese la espermatogéne­
sis en un sujeto II,, en la figura 13-1, al final de la meiosis I;
cualquiera que sea el espermatozoo que recibe el alelo At, existe
50% de posibilidad de que reciba el alelo Bj y 50% de que reci­
ba el B2. Por consiguiente, en promedio, 50% de los gametos es
recombinante y 50% no recombinante. La fracción de recombi­
nación es de 0.5. Si los locus son sinténicos, es decir, si se en­
cuentran en el mismo cromosoma, entonces cabe esperar siempre
que se segreguen juntos, sin recombinantes. Sin embargo, esta ex­
pectativa simple ignora el cruzamiento meiótico. Durante la pro­
fase de la meosis I, los pares de cromosomas homólogos hacen
sinapsis e intercambian segmentos (fig. 2-11). En cualquier cru­
zamiento particular sólo participan dos de las cuatro cromátides.
Un cruzamiento que ocurre entre las posiciones de los dos alelos
crea dos cromátides recombinantes que llevan A,B2 y A2Bj y de­
jan las dos cromátides no recombinantes que no participaron. Por
C b
Ap A p
B2 b 2
□ —
t 2 o1
B2
T "
A2 A1 A i A, Ai A 1
B2 B| Bi B, B2
NR NR
Fig. 13-1. Recombinantes y no recombinantes.
En esta familia se han segregado los alelos en dos locus (locus A, alelos
de alelos que pueden seguirse a través de la genealogía. En la generación III se pueden distinguir personas que recibieron espermatozoo no recombinante
(A 1 B 1 o A 2 B2) o recombinante (A 1 B2 o A2 B1) de su padre. Debido a que el Individuo ll2 es homocigoto en estos dos locus no es posible Identificar cuál
de los Individuos en la generación III se desarrolló de oocitos no recombinantes o recombinantes.
lo tanto, un cruzamiento produce 50% de recombinantes entre
los locus que lo flanquean.
Las recombinaciones rara vez separan locus situados muy cerca
entre sí en un cromosoma, dado que sólo un cromosoma localiza­
do en el espacio pequeño entre los dos locus crea recombinantes.
Por consiguiente, los grupos de alelos en el mismo segmento
cromosómico pequeño tienden a transmitirse en bloque a través
de una genealogía. Este lote de alelos se conoce como haplotipo.
Los haplotipos marcan segmentos cromosómicos identificables
que pueden seguirse a través de genealogías y poblaciones cuando
no se rompen por recombinación. En la figura 13-9 se muestran
ejemplos.
Cuanto más distantes se encuentren dos locus en un cromoso­
ma, más probable es que un cruzamiento los separe. En consecuen­
cia, la fracción de recombinación es una medida de la distancia
entre dos locus. Las fracciones de recombinación definen la distan­
cia genética, que no es lo mismo que la distancia física. Dos lo­
cus que muestran 1% de recombinación se definen como separados
un centiMorgan (cM) en un mapa genético.
13.1.2 Sin embargo, las fracciones de recombinación
no exceden de 0.5 por muy considerable que sea
la distancia física
Un acontecimiento de recombinación aislado produce dos cromá­
tides recombinantes y dos no recombinantes. Cuando los locus es­
tán muy separados es posible que haya más de un cruzamiento
entre ellos. Los cruzamientos dobles pueden incluir dos, tres o cua­
tro cromátides, pero en la figura 13-2 se muestra que el efecto to­
tal, promediado en todos los cruzamientos dobles, proporciona
50% de recombinantes. Los locus muy alejados en el mismo cro­
mosoma podrían estar separados por tres o más cruzamientos. Una
vez más, el efecto total es suministrar 50% de recombinantes. Las
fracciones de recombinación nunca exceden de 0.5 por muy distan­
tes que se encuentren los locus.
-O o - ■ o
A 2 A-j A, A1 A 2A!
b2 b1 B 2 b-. Bi B1
- o
A, At
B i B-,
□ "zr
A2A1 A i A, a 2a 1 A2A 1
B2 B i Bi B, B, B, B2 Bt
NR NR NR
^ y A2; locus B, alelos B-i y B2). Los cuadros a colores Indican combinaciones
 13.1 ¡ RECOMBINANTES Y NO RECOMBIN 401

R e c o m b in a n te R e c o m b in a n te s d o b le s
único

Dos cad en as Tres c a d e n a s C u a tro c a d e n a s

A) B) C) D)

<
<
Ai

5N
X x j
B iva len te s
en p ro fa s e
d e m e io s is I

>«<
Bi Bi r B| B1] B2
■*

4
C ro m á tid e s C lave:
en g a m e to
N N o re c o m b in a n te
R R e c o m b in a n te
e n tre lo c u s A y B
N R RN NN NN RN RN RR RR

Fig. 13-2. Recombinantes únicas y dobles.

Cada cruzamiento incluye dos de las cuatro cromátides de los dos cromosomas homólogos sinapsados. Un cromosoma lleva alelos ^ y en los dos
locus; el otro lleva alelos A 2 y B2. A) Un solo cruzamiento genera dos cromátides recombinantes y dos no recombinantes (50% de recombinantes). B) Los
tres tipos de cruzamiento doble ocurren en proporciones aleatorias, de tal forma que el efecto promedio de un cruzamiento doble es suministrar 50% de
recombinantes.

13.1.3 Las funciones de mapeo definen la relación w = 1/4 ln (1 + 2 0 )/ (1 -2 0 )

entre la fracción de recombinación y la o
distancia genética 0 = 1/2 [exp (4w) —1] / [exp (4w) + 1]

Debido a que las fracciones de recombinación nunca exceden de
0.5, no son tan sólo aditivas a través de un mapa genético. Si una
serie de locus A, B, C, ... se localiza a intervalos de 5 cM en un ma­
pa, el locus M puede estar a 60 cM del locus A, pero la fracción de
recombinación entre A y M no es 60%. La relación matemática en­
tre la fracción de recombinación y la distancia en el mapa genético
se describe por la función de mapeo. Si los cruzamientos sucedie­
ron de modo aleatorio a lo largo de un bivalente y no se influyeron
entre sí, la función de mapeo apropiada es la fu n ción d e Haldane:
w = — 1/2 ln (1 — 20)
o
6 = 1/2 [1 —exp (—2w)]
en la que w es la distancia en el mapa y 0 la fracción de recombi­
nación; como es usual, ln significa el logaritmo de la base e y exp
representa “e a la potencia de”. Sin embargo, se sabe que la presen­
cia de un quiasma inhibe la formación de un segundo quiasma cer­
cano. Este fenómeno se llama interferencia. Existe una diversidad
de funciones de mapeo que hacen posibles diferentes grados de in­
terferencia. Una función para el mapeo humano que se utiliza con
amplitud es la fu n ción d e Kosambi:
En el mapeo de múltiples puntos se requiere una función de mapeo
(sección 13.4) a fin de convertir los datos generales en la fracción de
recombinación en un mapa genético. Broman y Weber (2000) em­
plearon un grupo muy grande de datos de enlace con objeto de
estimar la mejor función de mapeo para seres humanos. Calcula­
ron que la probabilidad de un cruzamiento doble verdadero entre
marcadores d separados cM se aproxima a (0.0114d-0.0154)4.
Para d = 10 cM esto sólo funciona en 0.01%. El lector interesa­
do debe consultar el libro de Ott (véase las lecturas adicionales)
para un comentario más amplio sobre funciones de mapeo.
13.1.4 Cuentas de quiasmas y longitud total del mapa
Cada cruzamiento durante la meiosis produce dos cromátides recom-
binantes y dos no recombinantes y suministra 50% de recombinación
entre marcadores de flanqueo. Por consiguiente, un cruzamiento con­
tribuye con 50 cM a la longitud total del mapa genético. Al contar los
quiasmas bajo el microscopio y multiplicar el número por células por
50 es posible estimar la longitud total del mapa en cM. La meiosis
masculina puede estudiarse en biopsias testiculares; la cuenta prome­
dio de quiasmas es de 50.6 por célula (Hultén y Lindsten, 1973: ís .
402 CAPÍTULO TRECE MAPEO GENÉTICO DE CARACTERES MENDELIANOS
13-3A), si se toma en cuenta una longitud de mapa de 2 530 cM. La
meiosis I femenina se lleva a cabo a las 16 a 24 semanas de la vida fe­
tal y es muy difícil observarla, pero en fecha reciente una técnica nue­
va hizo posible contar los quiasmas (Tease y cois., 2002). Se utilizan
anticuerpos fluorescentes para marcar los sitios en que se localiza una
proteína, MLH1, que es parte de la maquinaria de recombinación
(fig. 13-3B). Los quiasmas son más frecuentes en la meiosis femenina
(lo que se ejemplifica en la regla de Haldane que señala que el sexo he-
terogamético tiene la cuenta más baja de quiasmas). La cuenta auto-
sómica promedio en ovarios de un feto hembra abortado fue de 70.3
y ello proporciona una longitud de mapa de 3 515 cM. Estas longi­
tudes de mapa derivadas de manera citológica pueden compararse con
las mejores estimaciones del mapeo genético de 2 590 (varón) y 4 281
cM (mujer) (Kong y cois., 2002). Como hecho único, el cromosoma
Y, fuera de la región seudoautosómica (sección 2.3.3), carece de ma­
pa genético porque no está sujeto a sinapsis y cruzamiento durante la
meiosis normal.
13.1.5 Mapas físicos y genéticos: distribución
de recombinantes
Los mapas físicos muestran el orden de características a lo largo del
cromosoma y su distancia en kilobases o megabases; los mapas ge­
néticos muestran su orden y la probabilidad de que se separen me­
diante recombinación. Si bien el orden de características debe ser
igual en ambos mapas, las distancias sólo corresponden si la pro­
babilidad de recombinación por megabase de DNA es constante
para todas las localizaciones cromosómicas. De hecho, las proba­
bilidades de recombinación varían en grado considerable según
sean el sexo y la localización cromosómica. Los individuos pueden
variar en cuanto al número promedio de cruzamientos por meio­
C i
\ I *
I
&t
0
i.
< **. ’ A '
j t H L w
Q - )
Fig. 13-3. Cruzamientos en la meiosis masculina y femenina.
A) Meiosis masculina: espermatocito en metafase I. Obsérvese el pareamiento extremo con extremo de los cromosomas
las posiciones de los cruzamientos dentro de cada bivalente (flechas). B) Meiosis femenina en paquitena. Los puntos brillantes de anticuerpo MLH1
fluorescente marcan las posiciones de los cruzamientos. Fotografías cortesía del profesor Maj Hultén, Birmingham. A partir de Hultén y Tease (2003),
con autorización de Nature Publishing Group.
sis y, si es así, poseen entonces también diferentes longitudes de
mapa genético.
Hoy en día que se cuenta con la secuencia del genoma huma­
no, es posible situar de forma física marcadores microsatélites o
SNP en las bases de datos de secuencias mediante la búsqueda de
compatibles de los cebadores de PCR usados. Por consiguiente, es
posible estimar la distribución de recombinación a lo largo de un
cromosoma sea de manera directa bajo el microscopio (fig. 13-3) o
tras relacionar distancias en el mapa genético con separaciones físi­
cas de marcadores. Ambos métodos muestran que la recombinación
no es aleatoria.. Existe más recombinación hacia los telómeros de los
cromosomas en varones, en tanto que en mujeres las regiones centro-
méricas tienen recombinantes, pero no en varones (véase fig. 13-4
y Kong y cois., 2002). Como se mencionó, la interferencia afecta ei
espaciamiento de recombinantes dobles. Como regla empírica, 1
cM = 1 Mb, pero existen “desiertos” de recombinación hasta de 5
Mb de largo con recombinaciones promediadas por sexo menores
de 0.3 cM por Mb, y “junglas” de recombinación con > 3 cM por
Mb. La desviación más extrema la muestra la región seudoautosó­
mica en la punta de los brazos cortos de los cromosomas X y Y (véa­
se sección 12.2.7). Los varones tienen un cruzamiento obligatorio
dentro de esta región de 2.6 Mb, de tal manera que es de 50 cM de
largo. En consecuencia, para esta región en varones 1 Mb = 19 cM,
en tanto que en mujeres 1 Mb = 2.7 cM.
Trabajos recientes sugieren asimismo que la recom binación no es
aleatoria a nivel de las secuencias de DNA. Como se describe en la
sección 15.4.3, los cromosomas humanos consisten al parecer en
bloques conservados, de manera característica de 20 a 50 kb de lar­
go, separados por puntos críticos de recombinación. Alrededor del
Xy Y Los quiasmas marcan
 13.1 i RECOMBINANTES Y NO RECOMBINANTES 403

A) O cM

O cM

9 6 .5 c M
C ro m o s o m a 13
125 cM

B) O cM
O cM

1 ( F
9 5 .5 c M
C ro m o s o m a 18 118 cM

C) O cM
O> cC M
M

■ i s

■ i

C ro m o s o m a 21 5 3 .5 c M
6 1 .5 c M

Fig. 13-4. La distribución de recombinantes es no aleatoria y específica de sexo.

Hístogramas que ilustran las distribuciones de quiasmas en espermatocítos (azul) y focos MLH1 en oocitos (rojo) en los cromosomas 1 3 ,1 8 y 21.
Cada par de cromosoma está dividido en intervalos de 5% de longitud. Estos patrones de distribución de cruzamiento también se muestran para cada
cromosoma como mapas de recombinacíón. Tales mapas destacan los patrones diferentes de números y distribuciones de cruzamiento en células
gérmenes masculina y femenina y el efecto consiguiente en el mapa de recombínación. Tomado de Hultén y Tease (2 0 0 3 ), con autorización de Nature
Publíshing Group.
404 CAPÍTULO TRECE MAPEO GENÉTICO DE CARACTERES MENDELIANOS
co
I I
S
i ce Q Q
__I__
50
Fig. 13-5. La recombinación se concentra en puntos criticos pequeños.
Distribución a nivel del DNA de recombinación en varones en una región del complejo mayor de histocompatibilidad. El 95% de toda la recombinación
ocurre en puntos criticos muy localizados. Modificado a partir de Jeffreys y colaboradores (2 0 0 1 ),
Publishing Group.
95% de todas las recombinaciones ocurre en estos puntos críticos
de 1 a 2 kb (fig. 13-5; Jeffreys y cois., 2001). Más aún, el examen
detallado de unos cuantos de estos puntos críticos que efectuó A. J.
Jeffreys sugirió que la recombinación siempre se inicia dentro de 10
pb del mismo punto. Infortunadamente, la secuencia de DNA en
estos puntos no tiene ninguna característica especial obvia que ex­
plique esta conducta.
13.2 M arcadores genéticos
13.2.1 El mapeo de genes de enfermedades humanas
requiere marcadores genéticos
Si se considera que la mayoría de los genetistas se interesa en las en­
fermedades, es conveniente contar con un mapa que muestre el or­
den y la distancia de todos los genes patológicos. La calificación de
la fracción de recombinación entre pares de enfermedades sería una
forma obvia para elaborar este mapa, pero en seres humanos no es
posible e l m apeo enferm edad-enferm edad. Como se observó (fig.
13-1), el mapeo genético requiere heterocigotos dobles. Las perso­
nas heterocigotas para dos enfermedades diferentes son en extremo
raras. Incluso si se encuentran, es probable que no tengan hijos o no
sean adecuadas para análisis genéticos en alguna otra forma. Por es­
ta razón, el mapeo genético humano depende de marcadores. Un
marcador es cualquier carácter mendeliano polim órfico que pu ede uti­
lizarse para seguir un segmento cromosómico a través de una genealogía.
Es útil si es posible calificar con facilidad el marcador y usar sin gran
costo material disponible con facilidad (células sanguíneas en lugar
de una biopsia de cerebro), pero el aspecto crítico radica en que de­
O) oo
CQ
Î I s
oü Q.
100 15 0 200
kb
Nal Genet. 2 9 :2 1 7-2 22 , con autorización de Nature
be ser polimórfico lo suficiente para que una persona seleccionada
al azar tenga una buena posibilidad de ser heterocigoto. En el re­
cuadro 13-1 se resume el desarrollo de marcadores genéticos huma­
nos, desde los grupos sanguíneos hasta la generación actual de
microsatélites de DNA y polimorfismos de nucleótido único.
El mapeo d e marcadores de enfermedad, si no es un ejercicio efec­
tuado a ciegas, requiere mapas estructurales de marcadores. Se ela­
boran mediante un mapeo de marcador-marcador. Aunque en teoría
es posible detectar enlace entre locus separados 40 cM, la cantidad
de datos necesaria para ello es prohibitiva. Son suficientes 10 meio-
sis para proporcionar pruebas de enlace si no hay recombinantes,
pero se requerirían 85 meiosis para obtener una prueba igualmen­
te potente de enlace si la fracción de recombinación fuera de 0.3
(véase recuadro 13-3 para una guía de estos cálculos). La obtención
de suficiente material familiar a fin de estudiar más de 20 a 30
meiosis puede ser muy difícil para una enfermedad rara. Por consi­
guiente, el mapeo exige marcadores separados a intervalos no ma­
yores de 10 a 20 cM a través del genoma. Si se toman en cuenta
las longitudes del genoma antes calculadas y la posibilidad de una
información imperfecta (véase más adelante), se requiere un míni­
mo de varios cientos de marcadores. Un logro importante en las
etapas iniciales del proyecto del genoma humano fue generar más
de 10 000 marcadores microsatélites muy polimórficos y a conti­
nuación colocarlos en mapas estructurales (Broman y cois., 1998).
Estos mapas hicieron posible el notable progreso del mapeo de en­
fermedades mendelianas en la década de 1990. Los estudios de re­
lación de enferm edades más recientes (sección 15.4) necesitan
mapas de marcadores mucho más densos y esta necesidad la resol­
vió el desarrollo de varios millones de marcadores de polimorfis­
mo de nucleótido único (SNP).
 13.2 j MARCADORES GENÉTICOS 405

Recuadro 13-1. Desarrollo de m arcadores genéticos humanos

Tipo de marcador Núm. de locus Características

Grupos sanguíneos -2 0 Quizá se requieran sangre fresca, antisueros raros
1 9 1 0-19 6 0 No siempre es posible deducir el genotipo por el fenotipo debido a la
dominancia
No es fácil la localización física

Variantes de movilidad electroforética de ~30 Quizá se necesiten suero fresco, valoraciones especializadas
proteínas séricas
No es fácil la localización física
1 9 6 0-19 7 5
Por lo general polimorfismo limitado

Tipos de tejido HLA 1 (haplotipo) Un grupo enlazado

19 7 0- Muy informativo
Sólo puede estudiar para enlace a 6 p 2 1 .3

RFLP de DNA (figs. 7-5A , 7 -6 ) > 10 5 (potencialmente) Dos marcadores de alelos, heterocigosidad máxima de 0.5
1975-
Inicialmente requería Southern blotting, en la actualidad PCR
Localización física fácil

NVRT de DNA (minisatélites) (fig. 7-5B ) > 10 4 (potencialmente) Muchos alelos, muy informativo
1985- Tipo mediante Southern blotting
Localización física fácil
Tiende a agruparse cerca de los extremos de cromosomas

NVRT de DNA (microsatélites) (fig. 7 -7 )
(repeticiones di-, tri- y tetranucleótidas)
19 8 9-
> 10 5 (potencialmente) Muchos alelos, muy informativo
Puede tipificar mediante PCR multlplex automatizada
Localización física fácil
Distribuido en la totalidad del genoma

SNP de DNA > 4 x 10 6 Menos informativo que microsatélites

(polimorfismos de nucleótido único) Puede tipificarse a muy grande escala mediante equipo automatizado
sin electroforesis en gel

NVRT, número variable de repeticiones tándem.

13.2.2 El contenido de información de
heterocigosidad o polimorfismo mide el
grado de información de un marcador
Para análisis de enlace se requiere meiosis informativa (véase
recuadro 13-2). Los ejemplos en el recuadro muestran que la
meiosis no es informativa con un marcador determinado si el
padre es homocigoto para el marcador y asimismo en la mitad
de los casos en que ambos padres tienen el mismo genotipo he-
terocigoto. Para la mayor parte de los propósitos, la heterocigo­
sidad media de un marcador (la posibilidad de que una persona
seleccionada de manera aleatoria sea heterocigota) se utiliza co­
mo la medida de informatividad. Si hay alelos marcadores
Ai AjjA^... con frecuencias génicas p\, p 2, p y --, entonces la pro­
porción de personas que son heterocigotas es 1 — (p\ + p 2 +
p¿2 +...) (sección 4.5.1). Una medición más complicada, pero
que se emplea rara vez, el contenido de información de poli­
morfismo (CIP) , es útil para casos en los que una persona es
heterocigota pero no informativa, como la genealogía B en el re­
cuadro 13-2.
13.2.3 Los polimorfismos de DNA son la base de todos
los marcadores genéticos actuales
Al inicio de la década de 1980, los polimorfismos de DNA propor­
cionaron, por primera vez, un grupo de marcadores extenso lo sufi­
ciente y espaciado de manera adecuada en la totalidad del genoma
para permitir una búsqueda de enlace en todo del genoma. Los mar­
cadores de DNA tienen la ventaja adicional de que es posible tipifi­
car a todos con la misma técnica. Más aún, puede determinarse su
localización cromosómica mediante el mapeo híbrido por radiación
(recuadro 8-4) o al investigar la secuencia del genoma humano para
una compatibilidad con el cebador de PCR usado para calificar el
marcador. Esto permite que los mapas genéticos basados en DNA se
refieran en forma cruzada con mapas físicos y evita la situación frus­
trante que surgió cuando se mapeó por primera vez el gen de la fi-
brosis quística (CFTR) buscado durante mucho tiempo. Se estableció
el enlace con un polimorfismo proteínico de la enzima paraoxonasa.
pero se desconocía la localización cromosómica del gen de ésta. El
desarrollo de marcadores de DNA hizo posible iniciar el mapeo s í­
nico humano de manera formal.
406 CAPITULO TRECE MAPEO GENÉTICO DE CARACTERES MENDELIANOS

Recuadro 13-2. Meiosis informativa y no informativa

Una meiosis es informativa de enlace cuando es posible identificar si el gameto es recombinante o no. Considérese la meiosis masculina que produ­
ce la contribución paterna al niño en las cuatro genealogías de abajo. El padre tiene un padecimiento dominante que heredó junto con el alelo A, mar­
cador. Transmitió este padecimiento a su hija; pero, ¿es posible indicar o no si el espermatozoo era recombinante entre el gen para el trastorno y el
locus marcador?

B) C )B - -O -O
A> B - -O D> I b

A i A, A 2A 2 A j A* A, A, Aj A2 A, A 2 A j A 2 A;l A 4

Al A2 Ai A2 A j A, A 2A 4

A) Esta meiosis no es informativa: no pueden distinguirse los alelos marcadores en el padre homocigoto. B) Esta meiosis no es informativa: el niño pu­
do heredar A, del padre y A2 de la madre, o viceversa. C) Esta meiosis es Informativa y no recombinante: el niño heredó A, del padre. D) Esta meiosis es
informativa y recombinante: el niño heredó A2 del padre.

Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción
(RFLP)
La primera generación de marcadores de DNA fueron los polimor­
fismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP). De
manera inicial, estos últimos se tipificaron tras preparar Southern
blots a partir de productos digeridos de restricción del DNA de
prueba e hibridarlos con sondas radiomarcadas (véase fig. 7-5). Es­
ta tecnología requirió mucho tiempo, dinero y DNA, y determinó
que la investigación del genoma completo fuera una empresa heroi­
ca. Hoy en día, esto representa menos problemas porque los RFLP
suelen tipificarse mediante reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Se amplifica una secuencia que incluye el sitio de restric­
ción variable, se incuba el producto con la enzima de restricción
apropiada y a continuación se corre en un gel para verificar si se
cortó (fig. 7-6). Una gran desventaja es su baja informatividad. Los
RFLP sólo tienen dos alelos: el sitio existe o no se encuentra. La he-
terocigosidad máxima es de 0.5. El mapeo de enfermedades me­
diante RFLP es frustrante porque con gran frecuencia una meiosis
fundamental en una familia resulta no informativa.
Minisatélites
Los marcadores minisatélites NVRT (número variable de repeticiones
tándem) fueron un gran adelanto. Los NVRT (sección 7.1.3) tienen
muchos alelos y una heterocigosidad elevada. Casi todas las meiosis son
informativas. Sin embargo, los problemas técnicos de Southern blotting
y las sondas radiactivas aún son un obstáculo para el mapeo fácil y los
NVRT no están difundidos de manera uniforme a través del genoma.
Microsatélites
El advenimiento de la PCR permitió por fin el mapeo con relativa ra­
pidez y facilidad. Los minisatélites son muy largos para amplificarse
bien y por consiguiente los medios estándar para el análisis de enlace
de PCR son los microsatélites. Se trata en esencia de repeticiones
(CA)„. Las repeticiones de trinucleótidos y tetranucleótidos han reem­
plazado de forma gradual a las repeticiones de dinucleótidos como los
marcadores de elección porque proporcionan resultados más claros.
Las secuencias de repetición de dinucleótidos son en particular pro­
pensas a deslizamiento de replicación durante la amplificación en
PCR (sección 11.3.1), de tal manera que cada alelo suministra una es­
calera pequeña de “bandas repetidas” en un gel, lo que dificulta su lec­
tura (véase fig. 7-8). Se ha consagrado mucho esfuerzo a producir
grupos compatibles de marcadores microsatélites que pueden ampli­
ficarse juntos en una reacción de PCR múltiple, con objeto de pro­
porcionar tamaños de alelos no superpuestos poder correrse en la
misma línea del gel. Con el marcado fluorescente en varios colores es
posible calificar tal vez 10 marcadores en una muestra en una sola lí­
nea de un gel automatizado.
Polimorfismos de nucleótido único (SNR por sus siglas en
inglés)
Después de 10 años de desarrollar cada vez más marcadores poli-
mórficos, puede parecer molesto que la generación más reciente de
marcadores la constituyan los polimorfismos de nucleótido úni­
co de dos alelos. Incluyen los RFLP comunes, pero también poli­
morfismos que no parecen crear o suprimir un sitio de restricción.
La ventaja de los SNP radica en que permiten una genotipificación
de rendimiento ultraelevado y densidades de marcador altas (Wang
y cois., 1998). Las búsquedas de genes de susceptibilidad a enferme­
dades (cap. 15) requieren la calificación de números enormes de
genotipos con marcadores espaciados de modo muy cercano. No
existen suficientes microsatélites en el genoma para proporcionar la
densidad necesaria para un marcador por 10 kb o menos. Más aún,
los microsatélites se califican mediante electroforesis en gel y ello li­
mita el rendimiento. Un consorcio internacional de académicos e
industriales creó una base de datos pública de más de cuatro millo­
nes de SNP (dbSNP, accesible a través de la página web de NCBI)
y se desarrollan métodos para calificar SNP sin electroforesis en gel
a una escala en extremo grande (sección 18.4.2).
 13.3 MAPEO DE DOS PUNTOS 40"

13.3 M apeo de dos puntos
13.3.1 No siempre es fácil calificar recombinantes en
genealogías humanas
Una vez que se reúnen familias en las que se segrega una enfermedad
mendeliana y se tipifican con un marcador informativo, ¿cómo se sa­
be cuándo se encuentra enlace? Esta pregunta tiene dos aspectos:
1. ¿Cómo es posible encontrar la fracción de recombinación?
2. ¿Qué prueba estadística debe utilizarse para constatar si la frac­
ción de recombinación es significativamente diferente de 0.5, el
valor esperado en la hipótesis nula de no enlace?
En algunas familias es posible responder la primera pregunta de forma
muy simple al contar recombinantes y no recombinantes. La familia
que se muestra en la figura 13-1 es un ejemplo. Hay dos recombinan­
tes en siete meiosis y la fracción de recombinación es de 0.28. En la
figura 13-6A se muestra otro ejemplo. El heterocigoto doble que es in­
formativo para enlace (individuo IIj en las figuras 13-1 y 13-6A) es de
fase conocida: se sabe qué alelos se heredaron de cuál de los padres y
por consiguiente es posible calificar sin ambigüedades cada meiosis
como recombinante o no recombinante. En la figura 13-6B, el indi­
viduo II] es de nueva cuenta doble heterocigoto, pero en esta ocasión
es de fase desconocida. Entre los hijos de ella puede haber cinco no
recombinantes y un recombinante, o bien hay cinco recombinantes y
uno no recombinante. Ya no es posible identificar más los recom­
binantes en forma precisa, incluso si la primera alternativa parece
mucho más probable que la segunda. La figura 13-6C añade más
complicaciones aún (no obstante, si ésta es una familia con una enfer­
medad rara, ningún investigador desearía descartarla). Se requiere al­
gún método para extraer la información de enlace de algún conjunto
de estas familias imperfectas.
13.3.2 El análisis computadorizado de la calificación
lod es el mejor medio para analizar genealogías
complejas para enlace entre caracteres
mendelianos
En la genealogía que se muestra en la figura 13-6B no es posible iden­
tificar sin ambigüedad recombinantes y contarlos. Sin embargo, es
posible calcular la probabilidad total de la genealogía, con las presu­
posiciones alternativas de que los locus están enlazados (fracción de re­
combinación = 0) o no enlazados (fracción de recombinación = 0.5).
La relación de estas dos probabilidades proporciona las posibilidades
de enlace y el logaritmo de las posibilidades es la calificación lod.
Morton (1955) demostró que las calificaciones lod representan la es­
tadística más eficiente para valorar genealogías para enlace y derivó
fórmulas para proporcionar la calificación lod (como una función de
0) para varias estructuras de genealogías estándar. El recuadro 13-3
muestra la forma en que se lleva a cabo lo anterior para estructuras

A) B)

Fig. 13-6. Reconocimiento de recombinantes.

Tres versiones de una familia con una enfermedad autosómica dominante, tipificada por un marcador A. A) Todas las meiosis son de fase conocida. Es
posible identificar sin ambigüedad IIIH II 5 como no recombinantes y lll6 como recombinante. B) La misma familia pero con fase desconocida. La madre,
ll-t, pudo heredar cualquier alelo marcador A, o A 2 con la enfermedad; por consiguiente, su fase es desconocida. Ilh-llls son no recombinantes y lll6 es
recombinante; o Ilh-llls son recombinantes y lll6 no es recombinante. C) La misma familia después del rastreo de familiares. Ill7 y lll8 heredaron también
el alelo marcador ^ junto con la enfermedad de su padre -pero no fue posible estar seguro si el alelo A] del padre es idéntico por descendiente al alelo
A] en su hermana II,-. Es posible que haya dos copias del alelo A, entre los cuatro alelos marcadores de abuelos. La probabilidad de ello depende de la
frecuencia génica del alelo A). En consecuencia, esta genealogía contiene información de enlace, que es problemático extraer.
408 CAPÍTULO TRECE MAPEO GENÉTICO DE CARACTERES MENDELIANOS
Recuadro 13-3. Calculo de calificaciones lod para las familias de la figura 13-6
► Dado que los locus están en verdad enlazados, con fracción de recom­
binación 0 , la probabilidad de que una meiosis sea recombinante es
y la de que sea no recombinante es 1 -Ö .
► Si los locus de hecho no están enlazados, la probabilidad de que una
meiosis sea recombinante o no es 1 / 2 .
Familia A:
Hay cinco no recombinantes y un recombinante.
La probabilidad total, dado el enlace, es (1 - 0 ) 5 -0.
La probabilidad, dado el no enlace, es (1 /2 )6.
La relación de probabilidad es (1 - 0 ) 5 -0 /(1 /2 )6.
La calificación lod, Z, es el logaritmo de la relación de probabilidad.
0 O 0.1 0.2 0.3 0 .4 0.5
Z - infinito 0 .5 7 7 0 .6 23 0 .5 09 0 .2 99 0 En este punto los investigadores cambiaron a la computadora.
simples. Dado que se trata de una función de la fracción de recombi­
nación, se calculan las calificaciones lod para una gama de valores 0.
La fracción de recombinación más probable es el valor al cual es má­
xima la calificación lod. En un grupo de familias, la probabilidad to­
tal de enlace es el producto de las probabilidades en cada familia
individual y por consiguiente las calificaciones lod (puesto que son lo­
garitmos) pueden añadirse a través de familias.
Es difícil calcular la calificación lod completa para la familia de la
figura 13-6C. Con la finalidad de calcular la probabilidad de que III7
y Illg sean recombinantes o no recombinantes, es necesario tomar en
cuenta las probabilidades calculadas para cada posible genotipo de
Ii, I2 y II3, ponderadas por la probabilidad de ese genotipo. Para I¡
e I2, las probabilidades de genotipo dependen de las frecuencias gé-
nicas y los genotipos observados de II], III7 y III8. A continuación
se calculan las probabilidades de genotipo para II3 mediante reglas
mendelianas simples. Con excepción de los casos muy simples, el
análisis de enlace humano depende por completo de programas de
computadora que incluyen algoritmos para manejar estos árboles
de ramificación de probabilidades de genotipos, dados los datos de
genealogía y un cuadro de frecuencias génicas.
13.3.3 Calificaciones lod de + 3 y -2 2 son los criterios
para enlace y exclusión (para una prueba única)
El resultado del análisis de enlace es un cuadro de calificaciones
lod en diversas fracciones de recombinación, al igual que dos cua­
dros en el recuadro 13-3. Los lod positivos proporcionan pruebas
en favor de enlace y los lod negativos son pruebas contra él. Ob­
sérvese que sólo las fracciones de recombinación entre 0 y 0.5 son
significativas y que todas las calificaciones lod son cero a 0 = 0.5
(debido a que en este caso miden la relación de dos probabilidades
idénticas y log10(l) = 0). Los resultados pueden graficarse para
trazar curvas como las de la figura 13-7.
Así, en relación con las dos preguntas que se plantearon al ini­
cio de esta sección, es factible ver ahora que la fracción de recom bi­
nación más probable es aquélla en la que la calificación lo d es más alta.
Si no hay recombinantes, la calificación lod es máxima a 0 = 0. Si
hay recombinantes, Zllega al máximo en la fracción de recombina­
ción más probable (0.167 = 1/6 para la familia de la figura 13-6A,
pero difícil de predecir para la figura 13-6B).
Familia B:
0 Ib es de fase desconocida.
Si ella heredó At con la enfermedad, hay cinco no recombinantes y una
recombinante.
Si ella heredó A 2 con la enfermedad, hay cinco recombinantes y una no
recombinante.
La probabilidad total es 1/2[(1 - 0 ) 5 -0 /(1 /2 )6] + 1 /2 [ ( 1 - 0 ) - O 5/(1 /2 )6].
Ello permite cualquier fase posible, con igual probabilidad previa.
La calificación lod, Z, es el logaritmo de la relación de probabilidad.
0 0 0.1 0.2 0 .3 0.4 0.5
Z - infinito 0 .2 7 6 0 .3 23 0 .2 2 2 0 .0 7 6 0
Familia C:
La segunda pregunta se vincula con el umbral de significancia.
En este caso la respuesta es sorprendente a primera vista. Z =3.0 es
el umbral para aceptar enlace, con un 5% de posibilidad de error.
Puede rechazarse enlace si Z < —2.0. Valores de ¿Centre —2 y +3
no son concluyentes. Para la mayor parte de las estadísticas, se uti­
liza p < 0.05 como el umbral de significancia, pero Z = 3.0 corres­
ponde a 1 000:1 razones de probabilidades [logio(l 000) = 3.0], El
motivo por el que se elige este umbral tan rígido se basa en la im­
probabilidad inherente de que dos locus, elegidos al azar, deban en­
lazarse. Con 22 pares de autosomas de los cuales elegir, no es
probable que se localizaran en el mismo cromosoma (sintenia) e,
incluso si estuvieran, los locus bastantes separados en un cromoso­
ma no están enlazados. El sentido común indica que si algo es in­
herentemente improbable, se requiere una prueba potente para
convencerse de que es cierto. Este sentido común puede trasladar­
se a una calculadora bayesiana (véase recuadro 13-4), que mues­
tra que la probabilidad 1 000:1 corresponde de hecho precisamente
al p - 0.05 umbral convencional de significancia. La misma lógica
sugiere un umbral lod de 2.3 para establecer enlace entre un carác­
ter ligado a X y un marcador del cromosoma X (probabilidad pre­
via de enlace = 1/10).
Es difícil deducir de manera analítica los intervalos de con­
fianza, pero un intervalo de apoyo aceptado con amplitud se ex­
tiende a fracciones de recombinación en las que la fracción lod es
una unidad abajo del valor máximo (la regla lod-1). Por consi­
guiente, la curva 2 en la figura 13-7 proporciona prueba acepta­
ble de enlace (Z > 3) con la fracción de recombinación más
probable de 0.23 y un intervalo de apoyo de 0.17 a 0.32. La cur­
va es más aguda cuanto mayor es la cantidad de datos, pero en ge­
neral los picos son muy amplios. Es importante recordar que las
distancias de mapas genéticos humanos suelen ser estimaciones
muy imprecisas.
Las calificaciones lod negativas excluyen enlace para la región en
la que Z < —2. La curva 3 en la figura 13-7 excluye la distancia de
12 cM en cualquiera de los lados del marcador. Si bien los mapas
génicos esperan una calificación lod positiva, las exclusiones no de­
jan de tener valor. Indican en dónde no se encuentra la enfermedad
(mapeo de exclusión). Ello puede descartar un posible gen candi­
dato y si se elimina suficiente genoma, sólo pueden permanecer
unas cuantas posibles localizaciones.
 13.4 | EL MAPEO DE MÚLTIPLES PUNTOS ES MÁS EFICIENTE QUE EL MAPEO DE DOS PUNTOS 409

13.3.4 Para investigaciones en el genoma completo

debe utilizarse un umbral de significancia de
toda la extensión del genoma
En estudios de enfermedades se tipifican familias marcador por
marcador hasta obtener lod positivos. El umbral apropiado para
significancia es una calificación lod, de tal manera que sólo hay una
posibilidad de 0.05 de que surja un resultado falsopositivo en cual­
quier parte durante una búsqueda del genoma completo. Como se
muestra en el recuadro 13-4, una calificación lod de 3.0 correspon­
de a una significancia de 0.05 en un punto aislado. Pero si se utili­
zaron 50 marcadores, la posibilidad de un resultado falso positivo es
mayor en comparación con emplear sólo un marcador. Un proce­
dimiento rígido (corrección de Bonferroni) es multiplicar el valor p
por 50 antes de valorar su significancia. El umbral de calificación
lod para un estudio en el que se utilizan n marcadores sería 3 +
log(n), que es una calificación lod de 4 para 10 marcadores, 5 para
ÍOO, y así de forma sucesiva. Sin embargo, lo anterior es en exceso
riguroso. Los datos de enlace no son independientes: si se excluye
una localización, entonces aumenta la probabilidad previa de que
el carácter se mapee en otra localización. Se ha propuesto el umbral
para un nivel de significancia en la extensión d el genom a de 0.05, pe­
ro una respuesta que se acepta con amplitud para caracteres men-
delianos es de 3.3 (Lander y Schork, 1994). Para caracteres no
mendelianos, véase la sección 15.3.4. En la práctica, calificaciones
lod menores de 5, sea con un marcador o muchos de ellos, deben
considerarse provisionales.

13 .4 El m apeo de m últiples puntos

es m ás e fic ie n te que el m apeo
de dos puntos
Fig. 13-7. Curvas de calificación lod.

Gráficas de calificación iod contra la fracción de recombinación de un

13.4.1 El enlace de múltiples puntos puede localizar
grupo hipotético de experimentos de enlace. Curva 1, prueba de enlace
(Z > 3) sin recombinantes. Curva 2, prueba de enlace (Z > 3), con
un locus de enfermedad en un marco estructural
fracción de recomblnación más probable de 0.23. Curva 3, enlace ex­ de marcadores
cluido (Z < - 2 ) para fracciones de recombinación abajo de 0.12; no
El análisis de enlace puede ser más eficiente si se analizan de for­
concluyente para fracciones de recomblnación más grandes. Curva 4,
ma simultánea datos para más de dos locus. El análisis m ultilocus
no concluyente en todas las fracciones de recomblnación.
es en especial útil para establecer el orden cromosómico de un

Se ha discutido la probabilidad de que dos locus estuvieran enlazados (la probabilidad previa de enlace), pero se aceptaron con amplitud estimados al­
rededor de uno en 50.

Hipótesis Locus enlazados Locus no enlazados

(fracción de recombinación = 0 ) (fracción de recombinación = 0.5)
................ ....... *.... 11........ . ........ . ................ ..... ...... ' -------------- ------- ----- ------------ ------ —------------------í
Probabilidad previa 1 /5 0 4 9 /5 0
Probabilidad condicional: 1 000:1 probabilidades de enlace 1 000 1
(calificación lod Z (0) = 3.0 )
Probabilidad de unión (previa x condicional) 20 — 1
Debido a la probabilidad previa baja de que dos locus elegidos de modo aleatorio estuvieran enlazados, se requirieron pruebas de 1 000:1 probabilida­
des en favor de enlace a fin de dar probabilidades totales de 20:1 en favor de enlace. Esto corresponde al umbral convencional p = 0 .0 5 de signifi­
cancia estadística. El cálculo es un ejemplo del uso de la fórmula de Bayes para combinar probabilidades (véase recuadro 18 -4 y fig. 18-1 5 ). Véase
también el texto para la descripción de la calificación lod.
410 CAPÍTULO TRECE MAPEO GENÉTICO DE CARACTERES MENDELIANOS
grupo de locus enlazados. Los genetistas experimentados utilizan
desde hace mucho tiempo cruzam ientos d e tres puntos para este
propósito. La clase recombinante más rara es la que requiere una
doble recombinación. En el cuadro 13-1 es aparente de inmedia­
to el orden génico A-C-B. Este procedimiento es más eficiente
que la estimación de las fracciones de recombinación para inter­
valos A-B, A-C y B-C por separado en una serie de cruzamientos
de dos puntos. Como ideal, en un análisis de enlace debe selec­
cionarse para todo el genoma y se emplea el grupo de datos com­
pleto para calcular la probabilidad en cada localización a través
del genoma.
Una segunda ventaja del mapeo de múltiples locus en seres hu­
manos es que ayuda a superar los problemas originados por la in-
formatividad limitada de marcadores. Algunas meiosis en una
familia podrían ser informativas con el marcador A y otras no in­
formativas para A pero sí con el marcador B cercano. Sólo los aná­
lisis de enlace simultáneos de la enfermedad con marcadores A y B
extraen la información completa. Esto es menos importante para
los mapeos en los que se utilizan marcadores microsatélites muy in­
formativos en lugar de RFLP de dos alelos, pero resurge cuando se
usan polimorfismos de nucleótido único (SNP).
13.4.2 Mapas de marco estructural marcador: familias
CEPH
Es en particular útil la potencia de mapeo de múltiples puntos pa­
ra ordenar locus a fin de elaborar mapas d el marco estructural mar­
cador. Sin embargo, la ordenación de locus en estos mapas no es
un problema corriente. Hay n\l2 posibles órdenes para marcado­
res n y los mapas actuales tienen cientos de marcadores por cro­
Cuadro 1 3 -1 . Ordenación génica mediante cruzamientos
en tres puntos.
Clase de Posición de la Número
descendencia recombinación (x)
ABC/abc No recombinante 853
abc/abc
ABc/abc (A, B C ) - x - C 5 enfermedad a través del marco estructural marcador tras calcular la
abC/abc
Abc/abc A —x— (B, c) 47
aBC/abc
AbC/abc B - x - ( A , C) 95
aBc/abc
Se estableció un cruzamiento entre heterocigotos de ratones y tres lo­
cus enlazados (ABC/abc) y triples homocigotos (abc/abc). La clase
más rara de descendencia es aquella cuya producción requiere dos
cruzamientos. De los 1 0 0 0 animales, 142 (95 + 4 7 ) son recombi­
nantes entre A y B, 52 (47 + 5) entre A y C y 100 (95 + 5 ) entre B
y C. Sólo cinco animales son recombinantes entre A y C pero no
entre A y B, de tal manera que éstos deben tener cruzamientos do­
bles, A - x - C - x - B . Por consiguiente, el orden del mapa es A - C - B
y las distancias genéticas son aproximadamente
A —(5 c M )—C —(1 0 c M )—B.
mosoma. Antes de completar la secuencia del genoma humano,
esto resultó una dificultad notoria para marcadores de mapas. En
ocasiones fue necesario emplear más computación inteligente que
fuerza bruta para tener éxito en el orden correcto. Incluso sin da­
tos de secuencia a gran escala, fue inmensamente útil la informa­
ción del mapeo físico. Pueden usarse marcadores que es posible
tipificar mediante PCR como sitios de secuencia marcados (SSM;
recuadro 15-4) y localizarse de forma física, sea mediante base de
datos o de modo experimental con híbridos por radiación (recua­
dro 8-4). El resultado es un marco estructural de marcadores fija d o
d e manera física.
El mapeo de marcadores de enfermedad adolece de la necesi­
dad de utilizar cualquier familia que pueda encontrarse en la que
se segrega la afección de interés. Estas familias rara vez poseen es­
tructuras ideales. Con gran frecuencia, el número de meiosis es in­
deseablemente pequeño y algunas son de fase desconocida. El
mapeo marcador-marcador puede evitar estos problemas. Es posi­
ble estudiar marcadores en cualquier familia, de tal forma que pue­
dan elegirse familias que tienen muchos niños y estructuras ideales
para enlace, como la familia de la figura 13-1. La elaboración de
mapas de marco estructural marcador se benefició en grado consi­
derable por un conjunto de familias (las familias CEPH) reunidas
de manera específica para este propósito por el Centre d’Étude du
Polymorphisme Humain (en la actualidad Fondation Jean Dausset)
en París. Líneas celulares inmortalizadas de cada individuo asegu­
ran una dotación permanente de DNA y desde entonces se descar­
taron muestras confusas y no paternidad al tipificar con muchos
marcadores. Como ejemplo, el mapa CHLC de 1998 (Cooperati-
ve Human Linkage Center) se basa en los resultados de la califica­
ción de ocho familias CEPH con 8 325 microsatélites, que dieron
por resultado más de un millón de genotipos (Broman y cois.,
1998).
13.4.3 Mapeo de marcador de enfermedad de múltiples
puntos
Para un marcador de enfermedad el mapeo del punto inicial es el
mapa del marco estructural de marcadores. Esto se da por hecho y
el objetivo es localizar el gen patológico en uno de los intervalos del
marco estructural. Los programas como Linkmap (parte del paque­
te Linkage) o Genehunter (sección 13.6.2) pueden cortar el locus de
probabilidad total de los datos de genealogía para cada posición. El
resultado (fig. 13-8) es una curva de calificación lod comparada
con la localización en el mapa. Este método también es útil para el
mapeo de exclusión: si la curva permanece abajo de una calificación
lod de —2 a través de la región, entonces se excluye el locus de en­
fermedad de esa región.
La naturaleza al parecer cuantitativa de la figura 13-8 es sospe­
chosa en alto grado. Las alturas máximas de los picos dependen de
forma crucial de las distancias genéticas precisas entre los marcado­
res, que sólo suelen conocerse en forma muy general. Más aún, nin­
guna de las funciones de mapeo (sección 13.1.3) en programas de
enlace se aproxima incluso a las complejidades reales de la distribu­
ción de quiasmas (fig. 13-4). No obstante, a menos que el mapa
marcador sea radicalmente erróneo, es aún cierto que el pico más
alto marca la localización más probable. Si el marco estructural
marcador está fijado de modo físico, como se describió, se estable­
ce entonces el medio para buscar el DNA del intervalo candidato e
identificar el gen de la enfermedad.
 13.5 MAPEO FINO MEDIANTE GENEALOGÍAS EXTENDIDAS Y HAPLOTIPOS ANCESTRALES 411

13.5 Mapeo fino m ediante genealogías
extendidas y haplotipos
ancestrales
La resolución del mapeo depende del número de meiosis -cuanto
más meiosis se analicen mayor es la posibilidad de que un aconte­
cimiento de recombinación reduzca la región de enlace-. El tama­
ño pequeño de la mayor parte de las familias humanas limita de
manera considerable la resolución factible de alcanzar en estudios
de familias. Pese a ello, algunas veces es posible utilizar estructuras
familiares extendidas para el mapeo de alta resolución. En algunas
sociedades, las personas están muy conscientes de los miembros del
grupo y pueden verse a sí mismas como parte de estas familias muy
extendidas. Incluso en sociedades en las que las personas limitan su
sentimiento familiar a los relacionados inmediatos, al final cada
uno se vincula y en ocasiones es posible identificar segmentos cromo-
sómicos ancestrales compartidos entre individuos “no relacionados”.
Las enfermedades autosómicas recesivas conducen por sí mismas a
estos análisis, ya que puede transmitirse un alelo mutado durante
muchas generaciones; para la mayor parte de las enfermedades do­
minantes o ligadas a X, el recambio de alelos mutantes es muy rá­
pido para permitir que se comparta en familias extensas (sección
4.5.2). Aun si se asume que no es posible identificar a portadores
de una enfermedad recesiva mapeada, el límite de mapeo lo estable­
ce el número de personas afectadas relacionadas en grado distante
que heredaron la enfermedad de un ancestro común.
13.5.1 El mapeo de autocigosidad puede mapear con
eficiencia padecimientos recesivos en familias
endogámicas extendidas
Autocigosidad es un término que se emplea para indicar la homo-
cigosidad para marcadores idénticos p o r descendiente heredados de
un ancestro común reciente. Las personas con trastornos recesivos
raros en familias consanguíneas tal vez sean autocigotas para mar­
cadores relacionados con el locus de enfermedad. Supóngase que
los padres son primos segundos; cabría esperar que compartieran
1/32 de todos sus genes por su ancestro común y un niño sería au-
tocigoto en sólo 1/64 de todos los locus. Si ese niño es homocigo-
to para un alelo marcador particular, ello podría deberse a la
autocigosidad o tal vez a la penetración en la familia de manera in­
dependiente de una segunda copia del mismo alelo. Cuanto más ra­
ro sea el alelo en esta población, mayor es la probabilidad de que la
homocigosidad represente autocigosidad. Para un alelo infinita­
mente raro, un niño afectado homocigoto único que nace de pri­
mos segundos genera una calificación lod de log10(64) = 1.8. Si
existen otros dos hermanos afectados que también son homocigo-
tos para el mismo alelo raro, la calificación lod es de 3.0 (log10(64
X 4 X 4); la probabilidad de que el hermano pudiera heredar el
mismo par de haplotipos parentales, incluso si no se relacionan con
la enfermedad, es de uno en cuatro).
En consecuencia, familias endogámicas muy pequeñas pueden
generar calificaciones lod importantes. El mapeo de autocigosidad
es un medio en especial potente si es posible encontrar familias con
múltiples personas afectadas por el mismo padecimiento recesivo
en dos o más consanguíneos enlazados por endogamia. Es posible
hallar familias adecuadas en países del Medio Oriente en los que es
común la consanguinidad (endogamia). El método se aplica con
gran éxito a la localización de genes para la pérdida de la audición
autosómica recesiva (Guilford y cois., 1994; fig. 13-9). La heteroge­
neidad de locus extensa (fig. 4-3) determina que sea imposible ana­
lizar la pérdida de la audición recesiva en conjuntos de familias de
núcleos pequeños.
Una aplicación audaz de autocigosidad en una población del
norte de Europa permitió que Houwen y colaboradores (1994) ma-
pearan el raro padecimiento recesivo, colestasis intrahepática recu-

w r- o^r
oo t- co T -C O
OJ
T—
CM CNJ CMCVJ

co
co
55 55
co co
COCO
coco
CO
CO
Q QQ QQ Q

Fig. 13-8. Mapeo de múltiples puntos en varones.

El eje horizontal es un mapa de marco estructural de marcadores y el eje vertical es la calificación lod del análisis de una familia con síndrome de
Waardenburg. La calificación lod se calcula para cada posible localización del locus de enfermedad. Las calificaciones lod descienden hasta valores
muy negativos cerca de la posición del locus que muestra recombinantes con la enfermedad. El pico más alto marca la localización más probable: ¡as
probabilidades en favor de esta localización se miden por el grado al que sobresale de sus rivales el pico más alto. Modificado a partir de Hughes y
colaboradores (1994), Nat. Genet. 7:509-512, con autorización de Nature Publishing Group.
412 CAPÍTULO TRECE MAPEO GENÉTICO DE CARACTERES MENDELLANOS

rrente benigna, tras recurrir sólo a cuatro individuos afectados (dos
hermanos y dos personas al parecer sin nexo) de una villa holande­
sa aislada. Estudio finlandeses publicaron asimismo aplicaciones
similares de autocigosidad. Cuanto más remoto es el ancestro com­
partido, menor es la proporción del genoma que se comparte por
virtud de ese ancestro común y por consiguiente mayor la impor­
tancia de demostrar que los pacientes comparten un segmento
idéntico por descendiente. Empero, al mismo tiempo, cuanto más
remoto es el ancestro común, mayores son las posibilidades de que
un segundo alelo independiente penetre en la familia desde el exte­
rior y, por consiguiente, menor es la probabilidad de que la homoci-
gosidad represente autocigosidad, sea para una enfermedad o los
marcadores. Con un ancestro común remoto, como en el estudio de
Houwen y colaboradores, todo depende de encontrar a las personas
con un padecimiento recesivo muy raro que son homocigotos para un
alelo marcador raro o, con mayor probabilidad, haplotipo. La poten­
cia del estudio de Houwen parece casi milagrosa, pero es importante
recordar que esta metodología sólo se aplica a enfermedades y pobla­
ciones en las que la mayoría de las personas afectadas es descendiente
de un ancestro común que era portador.
13.5.2 La identificación de segmentos ancestrales
compartidos permitió el mapeo de alta
resolución de los locus para la fibrosis quística
y el síndrome de rotura de Nijmegen
La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad muy rara en países no
europeos en donde las estructuras familiares son más susceptibles de
mapeo de autocigosidad y, por lo tanto, el mapeo de la FQ depende
de núcleos familiares desafortunados raros con más de un niño afec­
tado. Al utilizar lo anterior, se mapeó la FQen 7q31.2, pero después
de emplear todas las recombinantes disponibles, la región candidata
aún era demasiado grande (esto sucedió a fines de la década de 1980
cuando la clonación posicional era trabajo de héroes). Al aducir que
las mutaciones de FQ podrían ser en su mayor parte muy antiguas
(no sólo no hay selección contra heterocigotos, sino que con proba­
bilidad existe selección positiva en su favor; véase sección 4.5.2), los
investigadores buscaron identificar segmentos cromosómicos ances­
trales compartidos en cromosomas de FQ de pacientes “no relacio­
nados”. La repartición estaría indicada por el hallazgo en repetidas
ocasiones del mismo haplotipo de alelos marcadores. El fenómeno se

1 2

Oy-O
4,

Ó T ÍÜ ■O O r í ]
/"'l.

O r ú □ j 6 " Q t O Q tO
5 2 5 5
1 2 1 2
1 2 1 2
8 2 5 2

Ó -r O
3 2 3 2
0 1
IV C h rÓ 2 2
6
2
1
2
D2S305 4 5 5 7 5 7 5 7 3 3 3 3
D2S310 2 1 2 1 12 12 7
6
3
3
7
6
3
3
D2S144 6 1 4 5 1 2 12
D2S171 7 5 2 7 5 3 5 3
AFMb346ye5 1 3 32 3 4 3 4
AFMa052yb5 4 6 5 6 6 3 6 5 6 5
D2S158 2 2 4 2 2 1 2 2 22
D2S174 3 3 4 5 56 5 3 5 3
D2S365 9 7 5 2 2 8 2 7 2 7
D2S170 5 6 2 6 6 2 6 5 6 5

13 I ¿ 15 17

\ b 1l¡ai h 1» 4
D2S305 5 ■ 5 5 6 4 6 5 5 4 5 5 5 7 7 7 7 5 7 7 7 5 2 5 5 5 2 5 2 5 6 5 5 5 6 5 5
D2S310 : 2 1 2 1 1 2 1 12 2 2 12 1 2 1 2 2 2 1 2 2 1 1 2 1 1 1 2 1 2 1 3 1 1 1 1 1 1
D2S144 3 1 3 1 2 1 2 13 6 3 13 5 2 5 2 4 2 5 2 4 1 2 1
D2S171 ;1 5 1 5 2 5 2 5 1 7 1 5 1 7 3 7 3 2 3 7 3 2 5
1
5 2 5
1
5
1
5
2
2
1
5
1
5
1
5
2
3
1
5
1
5
1
5
1
5
1 1
5 5
AFMb346ye5 ¡4 3 4 3 3 3 3 3 4 1 4 3 4 2 4 2 4 3 4 2 4 3 3 3 2 3 3 3 2 3 3 3 2 3 3 3 3 3 3
AFMa052yb5 6 6 6 6 5 6 5 6 6 4 6 6 6 3 5 3 5 6 5 3 5 6 6 6 1 6 6 6 1 6 6 6 2 6 6 6 6 6 6
D2S158 : 2 2 2 2 4 2 4 2 2 2 2 2 2 1 2 1 2 2 2 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
D2S174 5 3 5 3 4 3 4 3 5 3 5 3 5 6 3 6 3 5 3 6 3 5 5 5 3 5 3 5 3 5 3 3 6 3 5 3 5 3 5
D2S365 2 7 2 7 5 7 5 7 2 9 2 7 2 8 7 8 7 2 7 8 7 2 2 2 3 2 7 2 3 2 7 7 7 7 2 7 2
66
7 2
D2S170 6 6 6 6 2 6 2 6 6 5 6 6 6 2 5 2 5 6 5 2 5 6 3 6 6 6 3 6 6 6 2 6 6 6 6

Fig. 13-9. Mapeo de autocigosidad.

Una familia endogámica múltiple grande en la que varios miembros sufren sordera congénita profunda recesiva autosómica (símbolos llenos). El color
marca un haplotipo de marcadores del cromosoma 2 que se segrega con la sordera. Los marcadores AFMa052yb5 y D2S158 son homocigotos en
todas las personas afectadas y las no afectadas. El gen de sordera debe encontrarse en alguna parte entre los dos marcadores que flanquean éstos
(AFMb346ye5 y D2S174). Modificado a partir de Chaíb y colaboradores (1996), Hum. Motee. Genet. 5:155-158, con autorización de Oxford University
Press.
 13.4 EL MAPEO DE MÚLTIPLES PUNTOS ES MÁS EFICIENTE QUE EL MAPEO DE DOS P I NTOS 413

denomina desequilibrio de enlace {DE); véase una descripción rr.ií

Cuadro 13-2. Relación alélica en la fibrosis quística.
amplia en la sección 15.4. El cuadro 13-2 muestra datos típicos de
Alelos Cromosomas Cromosomas dos marcadores dentro de la región candidata de fibrosis quísrica
marcadores de FQ normales (FQ). Los cromosomas que no son de FQ muestran una selección
aleatoria de haplotipos, pero los cromosomas de FQ tienden a llevar
X,,K, 3 49 Xi,K2. La relevancia de este hecho radica en que el DE es un fenó­
Xi ,K2 147 19 meno de límite muy corto (los segmentos ancestrales compartidos
son cortos por recombinación recurrente) y en consecuencia señalan
X2, K-| 8 70 a los investigadores la localización exacta del gen de FQ elusivo.
x2, k2 8 25 Un gen que se clonó en fecha más reciente, que rige el síndrome
de rotura de Nijmegen (SRN; MIM 251 260), muestra una aplica­
Datos de la tipificación para los marcadores de RFLP XV2.C (alelos X, ción más detallada del mismo principio. El SRN es una enfermedad
y X2) y KM19 (alelos K, y K2) en 114 familias británicas con un niño
autosómica recesiva muy rara que se caracteriza por rotura cromosó-
con fibrosis quística (FQ). Los cromosomas que llevan la mutación de
mica, retraso del crecimiento, microcefalia, inmunodeficiencia y pre­
la enfermedad FQ tienden a llevar el alelo X, de XV2.c y el alelo K2
de KM19. Datos de M nson y cote. (1989).
disposición a1 cáncer. La causa que se sospecha es un defecto de la
reparación del DNA. El análisis de enlace convencional en núcleos pe-

M a rca d o r 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
74 haplotipos dieron el alelo de enfermedad de SR N

--------

1 _ _ .
___ ___
! ...................

........................ ........................................... 1___ .... ....................... ............. .

Fig. 13-10. Haplotipo ancestral en pacientes europeos con síndrome de rotura de Nijmegen.

Los pacientes con SRN en apariencia no relacionados quizá heredaron con frecuencia un segmento cromosómico en 8p21 de un ancestro común. Se
definieron los haplotipos mediante 16 marcadores, que se muestran en orden cromosómico a través de la parte superior del cuadro. El color rosa marca
las localizaciones con alelos idénticos a los del supuesto haplotipo ancestral. Los alelos no ancestrales se codifican en amarillo cuando difieren del alelo
ancestral sólo en uno o dos pares de bases y pudieron derivar del alelo ancestral por mutación; los alelos codificados en gris difieren en grado sustan­
cial del alelo ancestral y tal vez resultaron de recombinación. Los blancos marcan locus en los que no hay datos. Sólo en los locus 11 y 12 no existen
alelos recombinantes (gris), lo que sugiere que el gen NBS se mapea en esta posición. Datos de Varón y cois., 1998.
414 CAPÍTULO TRECE MAPEO GENÉTICO DE CARACTERES MENDELIANOS

quefios de familias localizó el locus del SRN en el cromosoma 8p21,
pero después de utilizar todos los recombinantes la región blanco aún
no abarcaba 8 Mb entre los marcadores D8S271 y D8S270. A conti­
nuación se tipificó a 51 pacientes en apariencia no relacionados y sus
padres para una serie de marcadores microsatélites espaciados a través
de la región candidata. Esto generó 102 haplotipos de SRN. De éstos,
74 parecían derivados de un haplotipo ancestral común, quizá de ori­
gen eslavo (fig. 13-10). La región más conservada incluyó los marca­
dores 11 y 12 de la figura 13-10, que luego marcaron la probable
localización del gen NBS. De modo subsecuente se clonó a partir de
esta localización un gen que codifica una nueva proteína y mostró lle­
var mutaciones en personas con síndrome de rotura de Nijmegen.
Como se predijo, todos los enfermos con el haplotipo común tenían
la misma mutación, en tanto que los que tenían haplotipos indepen­
dientes tuvieron mutaciones independientes (Varón y cois., 1998).
El desequilibrio de enlace (DE) es una herramienta central en
los esfuerzos para identificar genes susceptibles para enfermedades
complejas y se comentan con detalle en la sección 15.4.
13.6 El análisis de calificació n lod
están d ar no está exento de
problem as
El análisis estándar de la calificación lod es un método sumamente
potente para seleccionar el genoma en segmentos de 20 Mb a fin
de localizar un gen de enfermedad, pero puede representar dificul­
tades, entre ellas las siguientes:
► vulnerabilidad de errores;
► límites computacionales sobre las genealogías que pueden ana­
lizarse;
► problemas con la heterogeneidad de locus;
► límites sobre la última resolución adquirible;
► necesidad de especificar un modelo genético preciso y detallar
la modalidad de herencia, las frecuencias génicas y la penetran-
cia de cada genotipo.
13.6.1 Los errores en la genotipificación y los
diagnósticos erróneos pueden generar
recombinantes falsas
Con marcadores muy polimórficos, los errores comunes como ge-
les de lectura errónea, muestras cambiadas o falta de paternidad,
tienen casi siempre como resultado la adjudicación de un niño a un
genotipo incompatible con los padres. El programa de análisis de
enlace se detendrá hasta que se corrijan dichos errores. Los errores
que introducen posibles genotipos, pero equívocos, son un gran
problema, en especial el diagnóstico equivocado del estado de en­
fermedad de una persona. Estos errores incrementan la longitud de
los mapas genéticos al introducir recombinaciones falsas: si se asig­
nó a un niño el alelo parental erróneo, parecerá ser un recombinante.

Lo cu s M a p a g e n é tic o
M a rc a d o r 1 1 b2

C ro m o s o m a s
01 = 0 -0 5
h o m ó lo g o s
d e un trip le E n fe rm e d a d +
h e te ro c ig o to d e 02 = 0 -0 5
fa s e c o n o c id a
M a rc a d o r 2 1

--1 - -2 -1 - -2 - -1 - -2 -1 --

G a m e to s -- + - -D - + - -D - -D - - + -D -

--1 - -2 -2 - -1 - -2 - - 1 -1 --

T ip o d e g a m e to N o re c o m b in a n te R e c o m b in a n te s R e c o m b in a n te s
m a rc a d o r-m a rc a d o r d o b le s a p a re n te s

F re c u e n c ia 0-1 + 0g < 0102

e s p e ra d a = 0-9 = 0-1 < 0 0025

Fig. 13-11. Los recombinantes dobles aparentes sugieren errores en los datos.

Debido a la interferencia (sección 13.1.3), la probabilidad de un recombinante doble verdadero con marcadores separados 5 cM es pequeña, bastante
menor de 0.05 x 0.05 = 0.0025. Los recombinantes dobles aparentes suelen señalar un error en la tipificación de los marcadores, un error en el
diagnóstico clínico o heterogeneidad de locus, de tal manera que la afección en este caso no se mapea en el locus D sino en cualquiera otra parte del
genoma. La mutación en uno de los genes o mosaicismo germinal son causas más raras.
 13.6 EL ANÁLISIS DE CALIFICACIÓN LOD ESTÁNDAR NO ESTÁ EXENTO DE PROBLEMAS
Pueden ayudar análisis de múltiples locus, ya que las recombinacio­
nes falsas aparecen como recombinantes dobles cercanas (fig. 13-11).
Como se observó en la sección 13.1.3, la interferencia determina
que sean muy poco probables los recombinantes dobles cercanos.
Cuando se elaboran mapas de marco de estructura marcador, las
rutinas para revisar errores valoran la extensión a la que puede acor­
tarse el mapa y omitir cualquier resultado de una prueba aislada
(véase Broman y cois., 1998). Se sospechan resultados que alargan
de forma significativa el mapa (es decir, añaden recombinantes).
Los errores en el orden de los marcadores en mapas de marcos
estructurales marcadores solían causar dolores de cabeza (los re-
combinantes únicos podían parecer dobles), pero este problema se
ha atenuado a medida que se revisan de forma cruzada mapas ge­
néticos y la secuencia física.
13.6.2 Las dificultades computacionales limitan las
genealogías posibles
Como se comentó en la sección 13.3.2, el análisis de enlace huma­
no depende de programas de computación que utilizan algoritmos
para manejar árboles de ramificación de probabilidades de genotipo
y toman en cuenta los datos de genealogía y las frecuencias génicas.
El Liped fue el primer programa de uso general y el Mlink (parte de
un paquete llamado Linkage) empleaba el mismo algoritmo básico,
el algoritmo Elston-Stewart, pero lo extendía a datos de múltiples
puntos. El algoritmo Elston-Stewart puede manejar de modo arbi­
trario grandes genealogías, pero el tiempo de computación aumen­
ta en grado exponencial con el número cada vez mayor de posibles
haplotipos (más alelos, más locus, o ambos). Esto limita la capaci­
dad de Mlink para analizar datos de múltiples puntos. Se dispone de
un algoritmo alternativo, el algoritmo Lander-Green, capaz de mane­
jar cualquier número de locus (el tiempo de computación aumenta
de manera lineal con el número de locus), pero tiene problemas de
memoria con genealogías grandes. Este algoritmo se instituyó en el
Genebunter (Kruglyak y cois., 1996) y los programas Merlin (Abeca-
sis y cois., 2002). Dichos programas son en particular adecuados
para analizar búsquedas en el genoma completo de genealogías de
tamaño moderado.
La teoría general del análisis de enlace se comenta de manera ex­
celente en el libro de Ott (véase las lecturas adicionales), en tanto
que el libro de Terwilliger y Ott (véase las lecturas adicionales) está
lleno de consejos prácticos indispensables para cualquiera que lleve
a cabo análisis de enlace en seres humanos.
13.6.3 La heterogeneidad de locus siempre es un
posible error en el mapeo de genes humanos
Como se comenta en la sección 4.1.4, es común que las mutacio­
nes en varios genes no enlazados produzcan el mismo fenotipo clí­
nico. Puede ser difícil mapear incluso un padecimiento dominante
con familias grandes si hay heterogeneidad de locus dentro del
conjunto de familias estudiadas. Se requirieron años de trabajo co-
laborativo para demostrar que la esclerosis tuberosa se debía a mu­
taciones en cualquiera de dos locus, TSC1 (MIM 191 100) en
9q34 y TSC2 (MIM 191 092) en 16p 13. Con padecimientos rece­
sivos se multiplican las dificultades por la necesidad de combinar
415
muchas familias pequeñas. En estos casos, la principal solución es
el mapeo d e autocigosidad (véase sección 13.5.1).
G enehunteru H om ogy programas relacionados (véase Terwilliger
y Ott en las lecturas adicionales) pueden comparar la probabilidad
de los datos sobre las suposiciones alternativas de homogeneidad
(todas las familias se mapean para la localización que se estudia) y
heterogeneidad (una proporción a de familias no enlazadas) de lo­
cus y suministran un estimado de probabilidad máxima de a.
13.6.4 El mapeo meiótico tiene una resolución limitada
La resolución de mapeo depende del número de meiosis analizado.
Las familias humanas son muy limitadas para este propósito; por
ejemplo, el conjunto de familias CEPH (sección 13.4.2) puede pro­
porcionar una resolución promedio de sólo unos 3 Mb. Una solu­
ción consiste en usar espermatozoos. Los varones pueden tener muy
pocos niños para mapeo de alta resolución, pero producen con efec­
tividad cantidades ilimitadas de espermatozoos. Es posible calificar
los espermatozoos individuales como recombinantes o no recombi­
nantes para pares de marcadores amplificables mediante reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). Este método no puede emplearse
para mapear enfermedades, pero suministra al investigador la capa­
cidad técnica necesaria para llevar a cabo el mapeo marcador-mar-
cador a cualquier resolución deseada. Lien y colaboradores (2000)
describen una aplicación típica. La existencia de puntos críticos de
recombinación muy localizados (fig. 13-5) se comprobó tras medir
fracciones de recombinación tan bajas como 0.00001 (Jeffreys y
cois., 2001). Por supuesto, esto proporciona sólo información en la
recombinación masculina.
13.6.5 Con los métodos descritos en este capítulo
no es posible mapear caracteres cuya
herencia no es mendeliana
Los métodos de análisis de calificación lod que se describen en este capí­
tulo requieren un modelo genético preciso. Es necesario especificar la
modalidad de herencia, las frecuencias génicas y la penetrancia de
cada genotipo. Para los caracteres mendelianos no suele ser un pro­
blema proporcionar cifras plausibles. La penetrancia puede requerir
un poco de meditación. Si no se permite que personas no afectadas
sean posiblemente portadores génicos no penetrantes, o que las
personas afectadas sean tal vez fenocopias, entonces este individuo
se calificaría como recombinante. Por otra parte, si la penetrancia se
establece muy baja hay una disminución de la potencia para detec­
tar enlace, porque se adquiere una hipótesis menos precisa. Sin em­
bargo, para enfermedades complejas comunes, como diabetes o
esquizofrenia, los problemas son mucho menos factibles de tratarse.
Cualquier modelo genético no es más que una hipótesis -no se
tiene la idea real de las frecuencias o la penetrancia de los genes
de cualquier alelo de susceptibilidad o incluso la modalidad de
herencia-. Lo anterior determina que sea muy razonable aplicar
los métodos descritos en este capítulo a esas enfermedades. No
obstante, la identificación de los com ponentes genéticos d e suscepti­
bilidad a enferm edades complejas es en la actualidad una parte im ­
portan te d e la investigación en genética humana. En el capítulo 15
se incluyen las formas en que es posible llevar a cabo lo anterior.
416 CAPÍTULO TRECE MAPEO GENÉTICO DE CARACTERES MENDELIANOS
Lecturas adicionales
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Bibliografía
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CAPÍTULO CATORCE

Identificación d e gen es patológicos

hum anos

Contenido del capítulo

14.1 Principios y formas de identificar genes patológicos
14.2 Conductas independientes de la posición para identificar genes
de enfermedad
14.3 Clonación posicional
14.4 Uso de anormalidades cromosómicas
14.5 Confirmación de un gen candidato
14.6 Ocho ejemplos ilustran diversas formas de identificar genes
de enfermedades

Recuadro 14-1 Mapeo de transcritos: métodos de laboratorio que complementan los análisis
de bases de datos para identificar secuencias expresadas entre clonas
genómicas
Recuadro 14-2 Mapeo de genes del ratón
Recuadro 14-3 Indicadores de la presencia de anormalidades cromosómicas
Recuadro 14-4 Efectos de la posición: un peligro latente en la identificación de un gen
patológico
Recuadro 14-5 Hibridación genómica comparativa para detectar desequilibrios cromosómicos
submicroscópicos
418 | CAPÍTULO CATORCE IDENTIFICACIÓN DE GENES PATOLÓGICOS HUMANOS
Un título más preciso aunque menos elegante para este capítulo se­
ría “identificación de determinantes genéticos de fenotipos huma­
nos”. Los métodos que se describen pueden también aplicarse a la
identificación de determinantes de enfermedades o variaciones nor­
males, como cabello rojo o ceguera a los colores rojo y verde. No
todos los factores son por fuerza genes, entendidos como secuen­
cias que codifican proteínas. Por definición, deben tener un efecto
en el fenotipo, pero puede tratarse de cierta acción indirecta en el
nivel de expresión de un gen que codifica una proteína o el proce­
samiento o estabilidad de su mRNA. La función de la patología
molecular es comprender por qué una variante de una secuencia de
DNA determinada causa un fenotipo particular (cap. 16); en este
capítulo se comenta la forma de identificar la variante correcta.
Es importante no confundir frases como “el gen para la fibro­
sis quística”, “el gen para la diabetes”, y otras más. Muchos genes
humanos se descubrieron por primera vez al investigar las afec­
ciones consecutivas a mutaciones en ellos y quizá se requieran
años antes de comprender su función normal. De ahí el interés
de esta forma de nominarlos; tampoco se describiría el refrigera­
dor doméstico como un “aparato para arruinar los alimentos
congelados”. Los genes llevan a cabo una labor en las células; si
no se cumple esa función, o se realiza de forma errónea, el resul­
tado puede ser una enfermedad.
Pocos temas han avanzado con tanta rapidez como la identifica­
ción de genes patológicos en seres humanos. Antes de la década de
1980 se habían reconocido muy pocos genes humanos como el lo­
cus de enfermedad. Los escasos éxitos iniciales incluyeron unas
cuantas anormalidades con una base bioquímica conocida en la que
fue posible purificar el producto génico. En la década de 1980 los
adelantos tecnológicos del DNA recombinante hicieron posible
una nueva conducta, que en ocasiones recibió el errático nombre de
“genética inversa”. El número de genes de enfermedades reconoci­
do comenzó a aumentar y estos éxitos iniciales fueron en verdad he­
roicos, ganados con esfuerzo. Con el advenimiento de la PCR para
estudios de enlace y selección de mutaciones esto se facilitó mucho
más. En la actualidad, cuando los proyectos del genoma humanos
y otros permiten disponer de una vasta gama de recursos, la capa­
cidad para identificar el gen de una enfermedad mendeliana depen­
de casi por completo de contar con las familias adecuadas. No
obstante, aún es muy difícil reconocer factores que confieren sus­
ceptibilidad a trastornos complejos comunes.
14.1 Principios y form as de id en tificar
genes patológicos
Existen muchas formas diferentes de identificación (fig. 14-1), pero
todos los caminos convergen en un gen candidato. De una manera u
otra, se reconoce un gen candidato y después, para confirmar la hi­
pótesis, el investigador lo selecciona para mutaciones en pacientes
con la afección.
Los genes candidatos pueden identificarse sin referencia a su lo­
calización cromosómica (sección 14.2); empero, más a menudo se
señala primero una región cromosómica y luego se identifican los
genes candidatos que se hallan dentro de esa región (sección 14.3).
Hoy en día, con la disposición de un buen catálogo (aunque in­
completo) de todos los genes humanos, se facilita en grado notorio
la labor de reconocer candidatos, aunque todavía puede ser muy la­
borioso trabajar con base en una lista de candidatos y buscar mu­
taciones.
La información posicional reduce la lista de posibles candidatos
de un total de 300 000 genes humanos a tal vez unos 10 a 30 en una
región candidata. Este hecho es relevante porque a pesar de la dili­
gencia con la que se intenta adivinar los probables genes, en la ac­
tualidad la capacidad para llevarlo a cabo es muy limitada. Una y
otra vez, cuando por fin se reconoce un gen de enfermedad, aún es
un gran misterio la razón por la que las mutaciones provocan esa
anormalidad particular. ¿Por qué la pérdida de la función de la pro­
teína FMR1, que participa en el transporte de RNA del núcleo al ci­
toplasma, causa retraso mental y macroorquidismo (síndrome de X
frágil, MIM 309 550)?, ¿por qué ciertas mutaciones en la proteína
de enlace TATA (véase sección 1.3.4) producen ataxia espinocerebe-
losa (AEC17; cuadro 16-6)?
14.2 Conductas independientes
de la posición para id en tificar
genes de enferm edad
Desde el punto de vista histórico, los primeros genes de enferme­
dades se identificaron mediante métodos independientes de la po­
sición, tan sólo porque no existía información de mapeo y no se
disponía de técnicas para generarla. En estas circunstancias, el can­
didato debía sugerirlo el conocimiento del producto génico: globi-
na p$ para la enfermedad de células falciformes; hidroxilasa de
fenilalanina para fenilcetonuria, y así de modo sucesivo. Hoy en
día, los estudios que provienen de una dirección bioquímica o bio­
lógica celular pueden todavía identificar productos proteínicos de
genes desconocidos. Se requiere algún método para pasar de la pro­
teína al DNA.
14.2.1 Identificación de un gen de enfermedad por el
conocimiento del producto proteínico
Las técnicas proteínicas modernas permiten identificar o secuenciar
de modo parcial cantidades incluso muy pequeñas de una proteína
mediante espectrometría de masa (Mann y cois., 2001 y sección
19.4.2) y microsecuenciación química (Bartlett, 2001). Si es posi­
ble resolver la secuencia del cDNA que codifica esos aminoácidos,
es factible sintetizar una sonda oligonucleótida y utilizarla para se­
leccionar genotecas a fin de recuperar el cDNA. El problema es la
degeneración del código genético —casi todos los aminoácidos pue­
den codificarse por uno de varios codones-. La sonda debe ser un
oligonucleótido degenerado, un conjunto de todas las posibles se­
cuencias, seleccionado para que sea compatible con una parte de la
secuencia de aminoácidos en la que el número de posibles permu­
taciones no es demasiado grande. Debido a que sólo uno de los oli-
gonucleótidos de la mezcla corresponde a la secuencia auténtica, es
importante conservar bajo el número de diferentes oligonucleóti-
dos para incrementar la posibilidad de identificar el blanco correc­
to. En este caso son muy útiles el triptófano y la metionina, ya que
sólo tienen un codón. Se evitan tanto como sea posible la arginina,
leucina y serina, que poseen seis codones cada una.
La selección de una genoteca puede ser tediosa cuando se emplea
una sonda degenerada, dado que los resultados se influyen en grado
considerable por las condiciones de la hibridación. Una alternativa
más rápida consiste en usar oligonucleótidos degenerados de forma
parcial como cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Es posible reducir el número de permutaciones factibles al
ligar el cDNA blanco a un vector y utilizar un cebador específico de
 14.2 CONDUCTAS INDEPENDIENTES DE LA POSICIÓN PARA IDENTIFICAR GENES DE ENFERMEDAD 419

A1 B1 C1 D1 E1
¿ H o m ó lo g o ¿ R eg ió n N R eu n ir M a p eo genético:
> ¿ L o c a liza d o
c a n d id a to c ro m o s o m ic a fam ilia s búsqued a del
co n éxito?
m apeado? c a n d id a ta ? p a ra m a p e o genom a

B2
r C2 D2 E2
J J
>f

Pensar otra
R evisar bases D eleciones o Clonar los
vez sobre el
d e dato s para ' translocaciones puntos de rotura
modo de herencia,
genes crom osóm icas cromosómicos
heterogeneidad

N
r
A3 B3 D3 E3
Pensar otra
¿ H o m ó lo g o P o s ib le Id e n tific a r
. vez sobre
c a n d id a to g en n u e vo s g e n e s
genes candidatos:
c lo n a d o ? c a n d id a to hum anos
ir a A3, B2, D3

B4 D4
R e s o lv e r la
¿Se caracterizó s e c u e n c ia y
por e s tru c tu ra
com pleto? c o m p le ta s

C5 D5 E5
R eu n ir a ¿Se encontraron
B uscar
p a c ie n te s no m u ta c io n e s -► mutaciones
re la c io n a d o s patogénicas?

Organismos Búsqueda en Información Trabajo de

modelo base de datos clínica laboratorio

Fig. 14-1. Forma de identificar un gen de enfermedad humana. ________________________

No existe una vía única de éxito, pero el paso fundamental consiste en llegar a un gen candidato factible, que a continuación puede estudiarse para mu­
taciones en la persona afectada. Obsérvese la interrelación entre el trabajo clínico, el trabajo de banco de laboratorio y el análisis por computadora. La
investigación de bases de datos es cada vez más crucial a medida que se acumula información de proyectos de genomas.

vector y otro específico de proteína degenerada. Sin embargo, es ne­
cesaria cierta suerte para obtener el producto de la PCR deseado, en
lugar de ninguno o de una revoltura de productos irrelevantes.
Una vía alternativa, si se dispone de la proteína aun en cantida­
des diminutas, supone elaborar un anticuerpo a la proteína y utili­
zarlo para encontrar el gen. Desde el año de 1982 se recuperó el
mRNA que codifica a la hidroxilasa de fenilalanina mediante in-
munoprecipitación de polisomas que sintetizaron la proteína en un
sistema sin células (Robson y cois., 1982). Hoy en día es posible
crear una genoteca de expresión de cDNA al clonar cDNA man­
comunado en un vector de expresión (sección 5.6.1). Las células
huésped que contienen clonas con el gen deseado deben producir
la proteína, o cuando menos partes de ella, y puede identificarse
tras seleccionar filtros de colonias de la genoteca con un anticuer­
po apropiado. En este caso, todo depende de la especificidad del
anticuerpo y la esperanza de que la proteína no sea tóxica para la
célula huésped. La exhibición de íago (sección 5.6.2) perfeccionaría
el método alternativo.
420 CAPÍTULO CATORCE IDENTIFICACIÓN DE GENES PATOLÓGICOS HUMANOS
14.2.2 Identificación del gen patológico a través de un
modelo animal
Muchos genes de enfermedades humanas se identificaron con ayu­
da de modelos animales, si bien casi siempre después de revisar la
información posicional. Es posible que un mutante de ratón y una
afección humana similar en sentido fenotípico se mapeen en las lo­
calizaciones cromosómicas correspondientes (mediante la Parrilla
Oxford, véase fig. 14-7). A continuación, si se clona el gen del ra­
tón, su homólogo humano se constituye en un candidato natural.
De manera alternativa, se identifica en el ratón un gen patológico
y en seguida se aísla el homólogo humano; éste puede mapearse
mediante hibridación de fluorescencia in situ (sección 2.4.2) y se
transforma en un gen candidato para cualquier mapeo de enferme­
dad en esa localización. Ésta es la manera en que se identificó el gen
M ITFcomo causa del síndrome de Waardenburg tipo 2 (MIM 193
510; Hughes y cois., 1994).
Es raro que un gen reconocido en un modelo animal se pruebe
de forma directa en pacientes humanos sin ninguna confirmación
posicional que indique que se trata de los individuos apropiados
para el estudio, pero uno de estos casos es SOXIO. Este gen se
identificó mediante laboriosa clonación posicional del ratón con
mutación dom inante de megacolon (Dom). Los ratones Dom son un
modelo de enfermedad de Hirschsprung humana que se ha estudia­
do durante mucho tiempo (sección 15.6.2). Los sujetos con una
combinación de enfermedad de Hirschsprung, anormalidades pig­
mentarias y pérdida de la audición (síndrome de Waardenburg ti­
po IV, SW4, MIM 277 580) se asemejaron de manera especial a los
ratones. El síndrome de Waardenburg tipo IV (SW4) es muy raro
y en condiciones normales ocurre en familias muy pequeñas, lo que
imposibilita su mapeo, de tal manera que se estudió un grupo de
pacientes con esta afección para mutaciones de SOXIO sin ningún
conocimiento previo del sitio en que podría mapearse la anormali­
dad. El intento redituó beneficios cuando se encontraron mutacio­
nes en SOXIO, aunque no en todos los individuos (Pingault y cois.,
1998).
14.2.3 Identificación de un gen de enfermedad
mediante el conocimiento de la secuencia
de DNA independiente de la posición
Por lo regular, esto surge sobre todo cuando el investigador consi­
dera los trastornos que pueden atribuirse a mutaciones de un gen
particular conocido. Los candidatos independientes de la posición
también se generan mediante experimentos de arreglos de expre­
sión, en los cuales se comparan muestras de mRNA de pacientes y
testigos para crear una lista de genes cuya expresión está alterada en
la enfermedad.
Definir la Obtener clonas Identificar todos
región de todo el DNA los genes en
candidata de la región la región
Fig. 14-2. Lógica de la clonación posicional.
La figura ilustra la progresión lógica de la clonación posicional; empero, hasta que se dispuso de los datos de secuencia y los mapas marcadores de al­
ta resolución actuales, los investigadores intentaron todas las formas de métodos abreviados para reducir la labor de clonación posicional pura.
Una aplicación interesante del conocimiento de la secuencia del
DNA independiente de la posición es el intento de clonar genes que
contienen repeticiones expandidas de trinucleótidos novedosas. Co­
mo se muestra en la sección 16.6.4, éstas ocasionan varios trastornos
neurológicos hereditarios. Con frecuencia, tales padecimientos mues­
tran anticipación, es decir, la afección se presenta a una edad más
temprana y con mayor gravedad en generaciones sucesivas. Si una
anomalía en investigación muestra cualquiera de estas características,
merece la pena seleccionar el DNA de los sujetos afectados para ex­
pansiones repetidas de tripletos. El método de detección de expansión
repetida de Schalling y colaboradores (1993) permite detectar repeti­
ciones expandidas en DNA genómico no fraccionado de personas
afectadas y se han desarrollado métodos para clonar cualquier repeti­
ción expandida reconocida (Koob y cois., 1998). Este método se em­
pleó en una forma por completo independiente de la posición a fin de
identificar una nueva expansión repetida que participa en una forma
de ataxia espinocerebelosa (AEC8) (Koob y cois., 1999).
14.3 Clonación posicional
En la clonación posicional se identifica un gen patológico sin co­
nocer nada, excepto su localización cromosómica aproximada. El
primer éxito con este método fue el reconocimiento del gen para la
enfermedad granulomatosa crónica ligada a X (Royer-Pokora y cois.,
1985). Un campo de prueba importante para los métodos de clo­
nación posicional fue la distrofia muscular de Duchenne (DMD,
MIM 310 200). Años de investigación cuidadosa de los cambios
histopatológicos en el músculo afectado habían fracasado para re­
velar la base bioquímica de esta afección (DMD). Al inicio de la
década de 1980 varios grupos compitieron para clonar el gen de
DMD mediante diferentes conductas. El trabajo pionero de éstos,
que venció dificultades técnicas formidables para clonar un gen sin
precedente, fue tal vez la mayor inspiración para casi todos los es­
fuerzos subsecuentes de clonación posicional. Este trabajo lo revi­
saron bien Worton y Thompson (1988).
La conclusión satisfactoria de este trabajo en 1986 marcó el ini­
cio de una nueva era de triunfo para la genética molecular huma­
na. Se aislaron uno tras otro los genes subyacentes de trastornos
graves, como la fibrosis quística, enfermedad de Huntington, en­
fermedad poliquística del riñón del adulto y cáncer colorrectal fa­
miliar. La lógica de la clonación posicional sigue el esquema que se
indica en la figura 14-2. Sin embargo, antes de disponerse de los
mapas marcadores, las clonas y secuencias actuales, la clonación po­
sicional podía ser una labor desesperadamente difícil. Hacia 1995
sólo se habían identificado con este método alrededor de 50 genes
de enfermedades hereditarias. La naturaleza frustrante de la clona­
ción posicional la resume un investigador en la figura 14-3.
Estudiar genes
Prioridad a la
candidatos
selección de
para mutaciones en
mutación
personas afectadas

R egió n c a n d id a ta
La tía M aría es
una fenocopia. Tres
m eses perdidos
y adición d e 1 M b
al intervalo.
M u y m a l, g en
erró n e o : seis
g e n e s m á s p a ra
estudiar. O tro s
seis m e se s.
El gen
Fig. 14-3. Vía difícil de la región candidata al gen.
Observación de un investigador de las frustraciones de una clonación posicional. Cortesía de Richard Smith, University of lowa.
14.3.1 El primer paso consiste en definir la región
candidata tanto como sea posible
La dificultad de la clonación posicional depende en buena medida
del tamaño de la región candidata, de tal manera que la primera
prioridad es reducirlo cuanto más sea posible. Para anomalías men-
delianas, lo anterior depende en particular del número de meiosis
disponibles para estudio. El límite de resolución se alcanza cuan­
do se mapea el último recombinante entre marcadores espaciados
de modo cercano. Esto se decide tras inspeccionar haplotipos en lu­
gar del análisis por computadora (fig. 14-4). Al emplear la regla
empírica de 1 cM = 1 Mb (sección 13.1.5), un conjunto de fami­
lias con 100 meiosis informativas puede localizar una enfermedad
mendeliana en una región candidata de 1 Mb.
Cuando las recombinaciones aisladas definen los límites de la re­
gión candidata, es importante considerar las posibles causas de error
(sección 13.6.1). Son imprescindibles diagnósticos clínicos meticu­
losos. Los recombinantes esenciales son más seguros si ocurren en
personas no afectadas de modo ambiguo (un individuo no afectado
podría ser portador de un gen no penetrante). Los recombinantes
dobles aparentes son sumamente sospechosos. En ocasiones, a pe­
sar de las buenas calificaciones lod positivas, parece haber recombi­
nantes en los que se intentaron todos los marcadores. Muchas veces
esto indica que una de las familias en el estudio no se mapea en esa
14.3 CLONACIÓN POSICIONAL 421
El c o n tig u o
tie n e un orificio.
A ñ a d ir o tros
tre s m eses.
B uen in te n to
p e ro é s te es un
p o lim o rfis m o
b e n ig n o . 6 5 ex o n e s
m á s p a ra seleccio n ar.
región. De manera alternativa, es posible que los marcadores estén
ordenados de manera incorrecta en el mapa genético.
Para fenotipos no mendelianos, el análisis de enlace es mucho
menos preciso y las regiones candidatas son de forma característica
de 20 cM o más (cap. 15). Es demasiado grande para buscarse sin
indicios adicionales y por esa razón se insiste en utilizar el desequi­
librio de enlace a fin de reducir la búsqueda (sección 15.4). Inclu­
so para enfermedades mendelianas, el desequilibrio de enlace puede
ser una herramienta muy valiosa para mapeo fino, como se obser­
vó en la fibrosis quística y el síndrome de rotura de Nijmegen (sec­
ción 13.5.2).
14.3.2 Es necesario establecer un contiguo de clonas a
través de la región candidata
En el recuadro 8-5 se describen las técnicas para elaborar contiguos.
En los primeros días la formación de contiguos representaba un gran
esfuerzo. El artículo que describe la identificación del gen de la fi­
brosis quística (Rommens y cois., 1989) resume tal vez el ejemplo
más impresionante de esta fase inicial. El uso de selección por hibri­
dación de genotecas para reconocer clonas sucesivas superpuestas
(caminata cromosómica) fue penosamente lento con la disponibi­
lidad de entonces de genotecas de fagos de inserto pequeño y cós-
midos y se complementó con la técnica, hoy en día obsoleta, del
422 CAPÍTULO CATORCE IDENTIFICACIÓN DE GENES PATOLÓGICOS HUMANOS

A)

0
2 3 Ó 1 4 5 6
8 6 3 S84 8 10 8 10 8
6 5 6 S105 3 4 3 3 3
3 2 5 S234 8 6 8 2 8
2 6 5 S129 2 4 2 3 2
1 2 7 S354 7 1 7 5 7
8 2 8 S79 10 6 10 8 10

3
2 8 6 7 6 3 6 7 S84
2 6 5 5 5 6 5 4 S105
1 3 2 4 2 5 2 4 S234
6 2 6 6 6 5 6 2 S129
2 1 2 6 2 7 2 5 S354
2 8 2 2 2 8 2 4 S79

Fig. 14-4. Definición de la región candidata mínima mediante inspección de haplotipos.

Las dos genealogías muestran un trastorno de la piel de herencia dominante, la enfermedad de Darier-White (M IM 124 20 0 ) que se había mapeado con
anterioridad en 12q. Se destaca el haplotipo marcador 12q que segrega con la enfermedad. Los cuadros en gris indican los haplotipos inferidos en la
persona muerta. En el individuo II-6 de la genealogía A, la recombinación mapea el gen patológico distal a D 12584; D12S105 no es informativo porque
1-1 fue evidentemente homocigoto para el alelo 5 (compárese los genotipos de II-3 y II-7). La recombinación que se muestra en 111-1 sugiere que el gen
de la enfermedad se mapea proximal a D12S129, pero es necesario confirmarlo porque la interpretación depende de que se infieran de manera correcta
los genotipos de 11-1 y II-2 y de que 111-1 no sea portador de un gen no penetrante. La recombinación en el individuo II-4 de la genealogía B proporciona
la confirmación. Los datos combinados localizan el gen de Darier en el intervalo entre D12S84 y D12S129. Modificado a partir de Cárter y colaboradores
(19 9 4 ), Genomics 24, 3 7 8 -3 8 2 . © 1 9 9 4 con autorización de Elsevier.

brincado cromosómico (Poustka y cois., 1987). En la actualidad es
posible descargar contiguos elaborados con facilidad a partir de ba­
ses de datos de secuencias del genoma humano, aunque siempre es
necesario revisar estos ensambles antes de confiar en ellos.
14.3.3 Un mapa de transcritos define todos los genes
dentro de la región candidata
Una vez que se establece un contiguo, el paso siguiente es catalogar
todos los genes de su interior. A medida que mejora el conocimien­
to del genoma humano, es más probable cada vez que la causa de
cualquier enfermedad que se investiga sea una mutación de un gen
conocido. Se utiliza una búsqueda general del genoma, como En-
sembl (http://www.ensembl.org) o el buscador general Santa Cruz
(http://genome.cse.ucsc.edu) para mostrar y analizar todos los genes
definidos y posibles en la región candidata (fig. 14-5; véase asimis­
mo la sección 8.3.6 y Wolfsberg y cois., en las lecturas adicionales).
Por impresionantes que sean estas exhibiciones, es importante no
confiar por completo en ellas. Tales herramientas muy complicadas
deben usarse como coadyuvantes del pensamiento y no para susti­
tuirlo. Es necesario complementarlas mediante un estudio personal
a fondo de primera mano de la región mediante una combinación
de trabajo de computadora y experimental. El artículo de Rey-
mond y colegas (2002) ilustra las variedades de análisis adicionales
que pueden instituirse.
Las búsquedas por computadora intentan obtener más informa­
ción de bases de datos de la que pueden extraer los programas de
búsqueda general del genoma. Los programas de búsqueda génica
son malos para encontrar exones pequeños, exones con sitios de
empalme poco comunes o predisposiciones de codón, o bien genes
con regiones no traducidas 5' o 3' demasiado largas. Es posible que
los marcadores de secuencia expresados (MSE) que se elaboran con
exones pequeños empalmados no sean compatibles con su secuen­
cia genómica. Análisis por computadora más amplios pueden enfo­
carse en reconocer homologías. La comparación de las secuencias
humana y del ratón puede revelar secuencias adicionales conserva­
das que sugerirían cierta función. Es posible que las búsquedas uti­
lizadas para anotación automática del genoma pasen por alto
homologías débiles a posibles ortólogos o parálogos. Tal vez surja
una investigación más directa, impulsada por hipótesis, con indica­
dores relevantes de la función génica.
El trabajo experimental implica una revisión doble para equivo­
caciones en el ensamble de secuencias, como subclonas ordenadas
de forma errónea o equivocaciones del ensamble génico, por ejem­
plo omisión o exones falsos, genes cortados o concatenados, etc.
Con la finalidad de comprobar que se crean los productos del ta­
maño predicho, se utilizan cebadores compatibles con diferentes
partes de la secuencia genómica. El fracaso en la amplificación su­
giere un ensamble erróneo de la secuencia genómica. La PCR-RT
con cebadores de diferentes posibles exones suele valorar si puede
amplificarse del todo el producto previsto y, de ser factible, si con­
tiene los exones intermedios esperados. Puede revelar empalme
alternativo no sospechado o exones adicionales. Es posible usar
RACE-5' (sección 7.2.3) a fin de extender secuencias génicas, en
 14.3 CLONACIÓN POSICIONAL 423

Benda cromosomi c a t _E21U _

DNfl (contiguos) AL 136223 > > < fiL 049643 fiL353716 > < fiL 035567 > RL355365 > fiL133375 > > AL359613 > >

riarcadon es II i l l I
D6S322E PFHa272zb5 D8S1790
06E1374 06Í15S 2 06S1S59
D6S2ÍI78 D6S1883
D6S216S
I
Genes
l <¡9HS78 *-RD£ l TBCC l «92S14 l NH_1382% l HEP l NRPL2 l £P.F 1-043598 L£LC22fl7 l «!9NXY3 lN
L NOVEL l «9NU69 l NOUEL l SNHT l 896GH7 l PTK7 L NOVEL L896JH2 l SWNU8 l 89B«54l <
*-015057 LTORC5l PPP2RSD LKLC3_HUHftN l 075188 l N0VEL l TOP4
«¡9HS78 L 0 * 7 5 3 0 4 .1 ^PEX^ LS96EU6. L

l 89NLF6® LC fl6 7 5 3 0 3 .1 1Y076_HUt1flN

LCftB75302.1
LqWT(i9
Leyenda gènica I GEHCS PHEDICHOG EHSOBL (COHOCIDOS) I GEHES PREDICHE EHGEHBL (HUEUOS)
i Goes cum n s ew l ■

Fig. 14-5. Uso de un buscador general de genoma para la lista de genes en una región candidata.

Este esquema parcial del buscador general del genoma Ensembl (www.ensembl.oroi muestra genes confirmados y predichos en una región de 1 Mb del
cromosoma 6p21.1. El click en un gen muestra información sobre la secuencia, estructura y homologías génicas. Véase la sección 8.3.6 para detalles
más amplios de este sistema.

especial si no hay un buen codón de inicio (un ATG en una secuen­
cia consenso de Kozak; véase sección 1.5.1) en el exón más remoto
corriente arriba. Por supuesto, si no se sabe nada sobre el patrón de
expresión del gen predicho, la falta de amplificación puede signifi­
car tan sólo que se estudia el tejido o la genoteca de cDNA equívo­
cos. No obstante, si se encuentra en los MSE cualquiera de las
posibles secuencias génicas, habrá información sobre la genoteca de
cDNA de la que se aisló el marcador de secuencia expresado
(MSE). En donde se transcriben genes adyacentes en la misma di­
rección, puede hacerse una prueba PCR-RT para observar si ambos
podrían ser en verdad parte del mismo gen.
Además de estas revisiones experimentales sobre anotaciones de
bases de datos, pueden efectuarse investigaciones directas para
transcritos. Los métodos generales para identificar secuencias trans­
critas desconocidas del interior de un contiguo de clonas genómicas
se comentan con detalle en la sección 7.2 y se resumen en el recua­
dro 14-1. Hasta fecha muy reciente no se disponía de bases de datos
para revisar, de tal manera que estos métodos constituyeron la prime­
ra línea de mapeo de transcritos.
Siempre que es necesario seleccionar genotecas de cDNA, surge
la pregunta acerca de cuáles deben utilizarse. Muchas veces, la
anomalía que se estudia sugiere una investigación particular. Por
consiguiente, cuando se analiza una enfermedad neuromuscular es
sensato seleccionar primero genotecas de cDNA muscular. Sin em­
bargo, el tejido que muestra la anormalidad no siempre es el que
tiene la expresión más potente, de tal modo que si una genoteca
fracasa, siempre merece la pena seleccionar otras. El cerebro fetal es
una elección común porque posee un número en particular alto de
secuencias expresadas.
14.3.4 Son prioritarios los genes de la región candidata
para pruebas de mutación
De la lista de genes que mapean la región candidata, es necesario
elegir un gen que muestre expresión o función apropiadas, o am­
bas. De manera alternativa o adicional, como se comenta más ade­
lante, podría buscarse homología a algún otro gen humano o no
humano que tenga una expresión o función adecuadas o que pre­
sente mutantes con fenotipos relacionados.
Patrón de expresión apropiado
Un gen candidato adecuado debe tener un patrón de expresión
compatible con el fenotipo de la enfermedad. La expresión no ne­
cesita restringirse al tejido afectado, ya que hay muchos ejemplos de
genes que se expresan ampliamente que causan una enfermedad es­
pecífica de tejido (sección 16.7.1), pero el gen candidato debe ex­
presarse cuando menos en ese tiempo y en el sitio en que se observa
la anomalía. Por ejemplo, es probable que los defectos del tubo
neural incluyan genes que se expresan durante la tercera y cuarta se-

R ecuadro 14-1. Mapeo de transcritos: métodos de laboratorio que complementan los análisis de bases de
datos para identificar secuencias expresadas dentro de clonas genómicas
En la sección 7.2 se describen métodos para mapear transcritos. En re- atrapamiento de exones con objeto de encontrar secuencias genómi­
sumen, incluyen los siguientes: cas flanquedas por señales de empalme funcional (fig. 7-10).
► selección de genotecas de cDNA que utilizan como sondas clonas zoo blotting con la finalidad de buscar secuencias conservadas de
genómicas de una región candidata. modo evolucionista (fig. 7-9).
► selección de cDNA para detección ultrasensible de cDNA derivados ► identificación de islotes de CpG para buscar las regiones de DNA subme-
de la región candidata (fig. 7-11). tilado que se encuentra con frecuencia cerca de genes (recuadro 9-3).
424 CAPÍTULO CATORCE IDENTIFICACIÓN DE GENES PATOLÓGICOS HUMANOS
manas del desarrollo embrionario humano, poco antes de la neuru-
lación o durante ella. La expresión de genes candidatos puede estu­
diarse mediante PCR-RT, Northern blotting o análisis seriado de
expresión genica (ASEG, sección 19.3.2). Gran parte del trabajo
preliminar puede hacerse en bases de datos (base de datos dbEST o
SAGE, ambas accesibles a través de la página NCBI www.nc-
bi.nlm.nih.gov/) más que en el laboratorio. La hibridación in situ
contra mRNA en cortes de tejidos (sección 6.3.4) o la inmunohis-
toquímica con anticuerpos marcados proporcionan el cuadro más
detallado de patrones de expresión. Los estudios suelen efectuarse
en tejidos de ratón, en especial para etapas embrionarias. No siem­
pre se justifica la presuposición común de que los seres humanos y
el ratón poseen patrones de expresión similares y se han estableci­
do recursos centralizados de cortes de embriones humanos en eta­
pas para llevar a cabo análisis equivalentes en estos últimos cuando
es necesario.
Función apropiada
Cuando se conoce la función de un gen en la región candidata, pue­
de ser obvio si se trata de un buen candidato o no para la enferme­
dad -la rodopsina y la fibrilina (sección 14.6.4) proporcionan
ejemplos—.En genes novedosos, el análisis de secuencia suministra a
menudo indicios sobre la función: pueden identificarse dominios
transmembranosos, secuencias típicas de cinasa de tirosina, etc. Es
posible que ello sea suficiente para dar prioridad a un gen como can­
didato, si se toma en cuenta la enfermedad. Por ejemplo, se sabe que
el transporte iónico es esencial para el funcionamiento del oído in­
terno, de tal manera que un gen del canal iónico sería un candidato
natural en la clonación posicional de un gen de la sordera.
Los genes candidatos también pueden sugerirse con base en una
relación funcional cercana con un gen que participa en un padeci­
miento similar. Los genes podrían relacionarse mediante codificación
de un receptor y su ligando o de otros componentes que interactúan
en la misma vía metabòlica o del desarrollo. Por ejemplo, como se
describe en la sección 15.6.2, algunos de los genes que intervienen en
la enfermedad de Hirschsprung se identificaron con esta lógica.
Homología para un gen parálogo importante (humano)
Algunas veces un gen en la región candidata es un homólogo cer­
cano de un gen conocido (un parálogo en seres humanos u ortólo­
go en otras especies). Si las mutaciones en el gen homólogo causan
un fenotipo relacionado, el nuevo gen se constituye en un candida­
to apremiante. Por ejemplo, una vez que se reconoció la fibrilina
como el gen mutado en el síndrome de Marfan (sección 14.6.4), se
A)
Fig. 14-6. Los seres humanos tienen un gen para hacer que crezcan las alas de las moscas.
El defecto en moscas mutantes apterous A) puede corregirse mediante el gen de la mosca de tipo silvestre B) o el gen humano LHX2 C). Tomado de
Rincón-Limas y colaboradores (1999), Proc. NatlAcad. Sci. USA 96:2165-2170, con autorización. © 1999 National Academy of Sciences, USA.
mapeó el gen parálogo, FBN2, en 5q. También se mapeó en la mis­
ma región 5q un padecimiento relacionado, la aracnodactilia con-
tractural congènita (ACC, MIM 121 050). Poco tiempo después se
demostraron mutaciones de FBN2 en personas con esta afección
(Putnam y cois., 1995).
Homología para un gen ortólogo importante (organismo
modelo)
Durante la última década fue cada vez más claro qué tan lejos se ex­
tienden las homologías estructural y funcional a través incluso de
especies relacionadas de manera muy distante. Casi punto a punto,
cada gen del ratón tiene un equivalente humano exacto y es proba­
ble que lo mismo sea cierto en otras especies de mamíferos menos
estudiadas. Más sorprendente aún es que resulta posible detectar
homologías extensas entre genes humanos y genes del pez cebra,
Drosophila, el gusano nematodo Caenorhabditis elegans e incluso la
levadura. Un medio muy potente para conceder prioridad a los can­
didatos entre un grupo de genes humanos es por tanto observar lo
que se sabe sobre los genes homólogos en estos organismos modelo
bien estudiados, como se describe en la sección 19.2. Estos datos po­
drían incluir el patrón de expresión y el fenotipo de mutantes. Stein-
metz y colaboradores (2002) ilustran una selección sistemática de
mutantes en levaduras para posibles genes de enfermedades en seres
humanos. Los ratones son en especial útiles para estas investigacio­
nes y más adelante se considera con mayor detalle su uso.
Incluso más que las secuencias génicas, con frecuencia están
muy conservadas las vías, de tal manera que puede emplearse el co­
nocimiento de una vía del desarrollo o el control en Drosophila o
una levadura para predecir el trabajo probable de vías en seres hu­
manos -aunque a menudo los mamíferos tienen varias vías parale­
las que corresponden a una vía única en organismos inferiores-. En
contraste, es menos probable que correspondan de cerca fenotipos
mutantes. Un ejemplo notable es la mutante apterous sin alas de
Drosophila. Es posible que un gen humano, Lhx2, complemente la
función deficiente del mutante, de tal modo que las moscas desa­
rrollan alas normales (fig. 14-6). Es necesario tener una vía del de­
sarrollo virtualmente idéntica a la de Drosophila, pero se utiliza para
un propósito diferente. Otro ejemplo lo representa el síndrome
branquiootorrenal (sección 14.6.3).
14.3.5 Importancia especial de los mutantes de ratón
Las homologías fenotípicas del ser humano y el ratón suministran
indicios en particular valiosos para identificar genes de enfermedad
humana por varias razones:
 14.4
► los programas de mutagénesis sistemática generan números
muy grandes de mutantes de ratón (Justice, 2000; Brown y Ba-
Uing, 2001);
► es más probable que las mutaciones de genes ortólogos pro­
duzcan fenotipos similares en personas y ratones que en seres
humanos y moscas o gusanos. No obstante, las similitudes tal
vez no sean tan cercanas como se desearía (sección 20.4.6);
► con frecuencia se traslada con facilidad información fenotípi-
ca del ratón a la información del candidato posicional. El ma-
peo retrocruzado (véase recuadro 14-2) permite mapear con
rapidez y precisión en el ratón. Por consiguiente, se ha mapea-
do la mayor parte de los mutantes en el ratón o pueden ma-
pearse sin demasiados problemas. Una vez que se conoce la
localización cromosómica de un gen de interés en el ratón o el
ser humano, casi siempre es posible predecir la localización de
ese gen en la otra especie. La figura 14-7 ilustra la correspon­
dencia general entre ubicaciones cromosómicas del ratón y se­
res humanos, basada en genes ortólogos que se mapearon en
ambas especies. La compatibilidad cruzada de secuencias genó-
micas humanas y del ratón proporciona un cuadro muy deta­
llado de la relación entre cromosomas de personas y ratones
(Gregory y cois., 2002; fig. 14-8);
► las secuencias exónicas y las estructuras exón-intrón suelen estar
muy bien conservadas entre genes ortólogos humanos y del ratón.
Esto significa que una vez que se aísla un gen humano o de ratón,
pueden diseñarse sondas o cebadores para seleccionar genotecas
de DNA de otras especies a fin de identificar el gen ortólogo;
► luego de identificar un gen candidato en seres humanos, pue­
den elaborarse mutantes de ratón para permitir el análisis fún-
Recuadro 14-2. Mapeo de genes del ratón
Se dispone de varios métodos para el mapeo fácil y rápido de fenotipos
o clonas de DNA en ratones. Junto con la capacidad para crear ratones
transgénicos (cap. 20), determinan que el ratón sea en especial útil para
establecer comparaciones con seres humanos. Los métodos incluyen los
siguiente:
Cruzamientos interespecíficos (Mus m usculus/M us spretus o Mus cas-
taneus)
Las especies tienen diferentes alelos en muchos locus polim órficos, lo
que facilita reconocer el origen del alelo marcador. Esto se aprovecha en
dos formas:
► elaboración de mapas de marco estructural señalador. Varios labora­
torios produjeron grandes grupos de ratones Fz con retrocruzamien-
to. Es posible asignar con rapidez cualquier marcador o gen clonado
a un segmento crom osóm ico pequeño definido por dos puntos de ro­
tura de recombinación en el conjunto de ratones de retrocruzamien-
to. Por ejemplo, el retrocruzamiento colaborador europeo se produjo
a partir de un cruzamiento de M. spretus/musculus (C57BL). Se pro­
dujeron mediante retrocruzamiento con spretus 500 ratones F2 y 500
por retrocruzamiento con C57BL. Se califican en cada ratón todos los
microsatélites en el área del mapa de armazón estructural.
► mapeo de un nuevo fenotipo. Debe efectuarse un cruce específico pa­
ra llevar a cabo este mapeo pero, a diferencia de los seres humanos,
es posible aparear cualquier número de ratones F2 a fin de mapear la
resolución deseada. Son más fáciles de aparear los cruces de Mus-
culus x castaneus que musculus x spretus.
USO DE ANORMALIDADES CROMOSÓMICAS 425
cional. La capacidad para crear knockouts totales o condiciona­
les, y manipular mediante ingeniería mutaciones específicas en
un organismo relacionadas bastante de cerca con las de seres
humanos, determina que el ratón sea una herramienta muy po­
tente para explorar la función génica humana.
14.4 Uso de anorm alidades
crom osóm icas
En ocasiones, las anormalidades cromosómicas proporcionan un
método alternativo para localizar un gen patológico, en lugar del
análisis de enlace. En padecimientos esporádicos, como muchos
dominantes graves, las aberraciones cromosómicas pueden sumi­
nistrar el único método para llegar a un gen candidato (sección
14.6.1). Con buena suerte, es posible que incluso señalen de forma
directa la localización precisa en vez de definir una región candida-
ta, como en el enlace. Son en especial útiles las anormalidades equi­
libradas (translocaciones o inversiones). En la identificación de
estos pacientes tienen un papel crucial los clínicos atentos (recua­
dro 14-3). Las deleciones submicroscópicas y las translocaciones
crípticas son cuando menos tan valiosas como las anormalidades
cromosómicas vecinas.
14.4.1 Son interesantes los pacientes con una
anormalidad cromosómica equilibrada
y un fenotipo inexplicable
No cabría esperar que una translocación e inversión equilibradas,
con nada adicional o faltante, tuvieran algún efecto fenotípico en
Cepas endogámicas recombinantes
Se obtienen mediante endogamia sistemática de la progenie de un cruza­
miento, por ejemplo las cepas de BXD que se utilizan en extenso son un
grupo de 26 líneas derivadas de más de 60 generaciones de endogamia
a partir de la progenie del cruzamiento C57B176J x DBA/2J. Proporcionan
abastecimientos ilimitados de un grupo de cromosomas con puntos de
recombinación fijos. Se dispone de DNA como un recurso público y las
cepas funcionan de modo similar a la forma en que las familias CEPH lo
llevan a cabo en seres humanos (sección 13.4.2). Las cepas endogámi­
cas recombinantes son en particular adecuadas para mapear caracteres
cuantitativos (véase sección 15.6.8), que pueden definirse en cada cepa
parental y promediarse con un número de animales de cada tipo recom-
binante. En comparación con ratones de cruzamientos interespecíficos,
suele ser más difícil encontrar un marcador en una región determinada
que distingue las dos cepas originales y la resolución es más baja por las
cifras más pequeñas.
Cepas congénicas
Son idénticas excepto en un locus específico. Se producen mediante re­
trocruzamiento repetido y pueden emplearse para valorar el efecto de
cambiar tan sólo un factor genético en un fondo común constante.
Silver (1995) proporciona una revisión general de la genética del ratón
(véase las lecturas adicionales) y Copeland y Jenkins (1991) d e sc rib a
los usos de cruzamientos interespecíficos.
426 | CAPÍTULO CATORCE IDENTIFICACIÓN DE GENES PATOLÓGICOS HUMANOS

Ortólogos totales: 7 762

Total m apeado en am bas especies: 7 1 4 3 _ ,, , , .
R a tó n , la b o ra to rio
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 X Y XY UN MT

1 210 2 186 252 7 3 12 7 3 14 1 55 1

2 184 97 15 60 2 2 22 36 1 39 5 1 32 2

3 1 1 56 1 57 1 138 1 1 32 88 5 44 3

4 1 73 157 9 42 1 22 4

5 2 1 1 79 124 31 1 8 107 31 5

6 14 2 19 1 2 23 84 52 1 205 28 6
7 2 147 132 3 1 28 28 14 15 7

8 22 14 25 2 55 1 46 75 4 25 8

9 82 106 2 1 31 31 20 9

10 31 4 24 3 31 7 42 1 9 97 21 10

11 60 1 161 127 1 118 26 11

12 73 106 1 1 98 1 82 1 1 30 12

13 3 11 14 1 30 61 10 13

14 1 1 1 150 65 2 6 14 X
c
15 51 1 63 1 90 1 1 1 1 21 15 |

16 1 60 137 11 32 44 1 37 16 °

17 1 1 427 2 1 1 1 40 17

18 9 1 2 14 71 6 18

19 1 1 1 202 71 25 66 1 1 32 48 19

20 188 1 1 16 20

21 1 31 1 77 17 5 21

22 11 10 5 19 18 1 1 82 40 15 22

X 2 1 1 1 1 1 303 1 22 X

Y 6 Y

XY XY

UN 1 1 4 4 3 2 5 1 2 4 1 2 2 1 1 1 9 UN

MT 37 m
X;Y 1 X;Y

16p 16p
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 X Y XY UN MT
R a tó n , la b o ra to rio

Fig. 14-7. Conservación de sintenia entre los mapas genéticos humano y del ratón.

La Oxford Grid (Parrilla Oxford) resume la relación entre los cromosomas humanos y del ratón. Las celdillas están codificadas por color de acuerdo con
el número de ortólogos mapeados. Es obvia la distribución no aleatoria. Casi siempre es posible predecir la localización de un gen humano si se conoce
su situación en el ratón, o viceversa. Esta figura proporciona una lista general; la información detallada se encuentra en una base de datos accesible en
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/Homology (DeBry y Seldin, 1996). Figura reproducida con autorización de Mouse Genome Database, Mouse Genome
Informatics, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine (http://www.informatics.jax.org).

el portador. Si una persona con una anormalidad cromosómica al
parecer equilibrada es anormal desde el punto de vista fenotípico,
existen tres explicaciones posibles:
► el hallazgo es una coincidencia;
► el reordenamiento no está de hecho equilibrado: hay una pér­
dida o ganancia de material no observadas;
► uno de los puntos de rotura del cromosoma causa la enfermedad.
Una rotura cromosómica puede provocar un fenotipo de pérdida
de función si altera la secuencia de codificación de un gen o la se­
para de una región reguladora cercana. De manera alternativa, po­
dría ocasionar una ganancia de función, por ejemplo mediante el
empalme de exones de dos genes juntos para crear un nuevo gen
quimérico (este hecho es raro en una enfermedad hereditaria, pero
común en la tumorigénesis; véase cap. 17). En cualquiera de los ca­
sos, el punto de rotura proporciona un indicio valioso sobre la lo­
calización física exacta del gen patológico. La posición precisa del
punto de rotura se define con mayor facilidad al utilizar hibrida­
ción fluorescente in situ (HFIS; fig. 14-9). Un ejemplo de la poten­
cia de este método es la identificación del gen del síndrome de
Sotos (sección 14.6.1). Sin embargo, el indicio posicional no es in­
falible: algunas veces los puntos de rotura alteran la expresión de un
gen situado cientos de kilobases lejos y afectan la estructura de do­
minios de eromarina a gran escala (recuadro 14-4).
 14.4
■ al gen de DMD se utilizó este método. Una de las mujeres raras con
mm
f t
— nas XJ (unión de X), que se reconocieron dentro del gen de distro-
M m u9
a ' : :
1§ M
M ■ ■
■ ■
mm m r-m
mm
mtm
M m u4 H sa 6
Fig. 14-8. Segmentos conservados entre el cromosoma humano 6
(Hsa6) y los cromosomas de ratón (Mmu).
Se han identificado 20 bloques de sintenia conservada mediante com ­
paración de las secuencias genómicas humanas y del ratón. Las líneas
de guiones indican bloques invertidos en relación con los diagramas
cromosómicos del ratón. Las barras azules en el centro del ideograma
cromosómico representan los contiguos incluidos en el análisis. Re­
producido a partir de Gregory y colaboradores (2002), Nature
418:743-750, con autorización de Nature Publishing Group.
Incluso si un punto de rotura de translocación altera un gen, se
pierde la función sólo en una de las dos copias del gen. No hay un
efecto fenotípico a menos que una reducción del 50% del valor del
producto cause problemas (haploinsuficiencia, sección 16.4.2). Un
caso especial es el de las translocaciones d el autosoma X en mujeres
por inactivación de X. La inactivación es aleatoria, pero las células
que inactivan el X translocado sufren a menudo desequilibrios ge­
néticos letales (fig. 14-10), de tal manera que una mujer portadora
de una de estas translocaciones posee por completo células que tie­
nen inactivado el X normal. Si el punto de rotura de la transloca­
ción altera un gen en el cromosoma X, la mujer queda sin una
USO DE ANORMALIDADES CROMOSÓMICAS 42~
copia funcional activa del gen. Hay alrededor de dos docenas de
mujeres en el mundo que sufren DMD por translocaciones del au­
tosoma X. Cada translocación incluye un punto de rotura autosó-
mico diferente, pero el punto de rotura de X siempre ocurre en
Xp21. El estudio de estas mujeres complementó el trabajo inicial
sobre enlace en el mapeo del gen de DMD en Xp21 y una de ellas,
con una translocación X;21, suministró uno de los medios para clo­
nar el gen de DMD (véase más adelante).
Un reordenamiento que sitúa la búsqueda después del gen cer­
cano a una secuencia conocida proporciona una vía inmediata pa­
ra el gen desconocido. Muchos genes en organismos modelos se
clonaron mediante mutaciones inducidas por la inserción de un
transgén o un elemento movible. En seres humanos, en un ataque
DMD (véase antes) tenía una translocación Xp;21p. Al conocer
que 21p está ocupado por reordenamientos de genes rRNA repeti­
dos (sección 9.2.1), el grupo de Worton preparó una genoteca ge-
nómica y emprendió la búsqueda de clonas que contenían rDNA y
secuencias del cromosoma X. Esto condujo al aislamiento de clo­
fina, en el intrón 7 (Worton y Thompson, 1988).
No debe soslayarse la segunda posible explicación, ya mencio­
nada. Los estudios de pacientes que tienen una anormalidad en
apariencia equilibrada y un fenotipo nuevos mostraron que la ma­
yoría posee en realidad un reordenamiento cromosómico comple­
jo, que muchas veces incluye una deleción submicroscópica. La
pérdida incluso de una megabase de DNA no sería visible en pre­
paraciones citogenéticas estándar. Deleciones más grandes de unas
cuantas kilobases pueden detectarse mediante HFIS (véase fig.
14-12); las más pequeñas en portadores heterocigotos de translo­
cación se estudian mejor mediante PCR después de segregar el
cromosoma derivado en un híbrido de célula somática (véase re­
cuadro 8-4).
14.4.2 Los pacientes con dos trastornos mendelianos,
o uno mendeliano junto con retraso mental,
pueden tener una deleción cromosómica
Las deleciones cromosómicas tienen menos valor para identificar
genes que las anormalidades equilibradas porque la región comple­
ta eliminada se convierte en el foco de investigación, en lugar de un
punto de rotura específico. No obstante, las deleciones han sido
fundamentales en la identificación de varios genes mayores de en­
fermedad, incluido el triunfo sobresaliente inicial, la identificación
del gen de la distrofina.
En este caso, el punto de inicio fue un niño, “BB”, que tenía
DMD y una deleción Xp21 citogenética visible. Se utilizó un pro­
cedimiento de clonación de sustracción técnicamente muy difícil
para aislar clonas del DNA normal que correspondieran a las se­
cuencias eliminadas en BB (Kunkel y cois., 1985). A continuación
se emplearon clonas individuales de DNA en la genoteca de sus­
tracción como sondas en hibridación Southern blot contra muestras
de DNA de personas normales y pacientes con distrofia muscular
de Duchenne (DMD). Una clona, pERT87-8, reconoció delecio­
nes en DNA en casi 7% de pacientes con DMD normales desde el
punto de vista citogenético. Asimismo, detectó polimorfismos que
mediante estudios de familias se demostró que estaban enlazados de
forma estrecha con la DMD. Estos resultados mostraron que
pERT87-8 se hallaba mucho más cerca del gen de DMD que cual­
quier clona aislada con anterioridad (de hecho, fue dentro del gen.
428 ¡ CAPÍTULO CATORCE 1 IDENTIFICACIÓN DE GENES PATOLÓGICOS HUMANOS
Recuadro 14-3. In d icad o res de la presencia de anormalidades cromosómicas
I
Los clínicos pueden contribuir de manera notable a identificar genes de
enfermedades al hallar a personas que padecen anormalidades cromosó­
micas causales.
Una anormalidad citogenética en un paciente con la presentación
clínica estándar
Cuando ya se mapeó el gen de una enfermedad a una cierta localización
y a continuación se encuentra a un sujeto con ese trastorno que tiene una
alteración cromosómica que afecta esa mism a localización, es muy pro­
bable que la anormalidad cromosómica causara el padecimiento.
► Los pacientes con translocaciones o inversiones equilibradas suelen
tener puntos de referencia localizados dentro del gen de enfermedad
o muy cerca de él. La clonación de sus puntos de rotura puede pro­
porcionar la vía más rápida para identificar el gen patológico.
► En deleciones intersticiales es posible situar los puntos de rotura a
cierta distancia del gen de la enfermedad, pero si el segmento elimi­
nado es más pequeño que la región candidata actual, la definición de
los puntos de rotura ayuda a ubicar el gen.
A)
W lf
d e r(8 ) d e r(1 6) 16
Fig. 14-9. Uso de la hibridación de fluorescencia in situ para definir un punto de rotura de translocación.
A) Translocación t(8;16)(p22;q21) definida de forma citogenética. B) Mapa físico de una parte de la región del punto de rotura en un cromosoma normal
8 que muestra las localizaciones aproximadas de siete clonas. C) Resultados de experimentos de HFIS sucesivos. El punto de rotura se encuentra dentro
de la secuencia representada en la clona D. En condiciones normales, este resultado se confirmaría mediante clonas del cromosoma 16.
en el intrón 13). Se aislaron otras sondas genómicas cercanas me­
diante caminata cromosómica y a continuación se buscaron secuen­
cias conservadas con zoo b lottin g y se utilizaron para seleccionar
genotecas de cDNA muscular. Si se toma en cuenta la escasez de
mRNA de distrofina y, como se sabe hoy en día, el tamaño peque­
ño y la localización muy diseminada de los exones, dista mucho de
ser fácil encontrar clonas de cDNA, aunque al final se reconocieron
La mayoría de estos individuos muestra mutaciones nuevas. Algunos in­
vestigadores piensan que llevar a cabo el análisis cromosómico en todos
los enfermos con mutaciones nuevas es un gasto de investigación que
merece la pena.
Retraso mental adicional
Un paciente puede tener una enfermedad mendeliana típica, además de
retraso mental muy grave. Es posible que sea coincidental, pero estos ca­
sos pueden deberse a deleciones que eliminan el gen patológico aunado
a genes vecinos adicionales. Las grandes deleciones cromosómicas ca­
si siempre causan retraso mental grave, que refleja la participación de
una elevada proporción de los genes en el desarrollo del cerebro fetal.
Cuando el sujeto evidencia una mutación nueva, se justifican los análisis
citogenético y molecular.
Síndromes de gen contiguo
Muy rara vez, un paciente parece sufrir varios trastornos genéticos dife­
rentes al mism o tiempo. Es posible que se trate tan sólo de mala suerte,
pero algunas veces se debe a la deleción simultánea de un grupo de ge­
nes contiguos. Los síndromes de gen contiguo se describen en la sec­
ción 16.8.1; se definieron en particular bien en los trastornos ligados a X.
B)
8cen 8 p te r
B C D E F G
C)
Sonda c ro m o s o m a s + v e
A 8 , d e r(8 )
G 8, d e r(1 6)
B 8 , der(8)
F 8 , d e if l 6)
E 8 , d e r(1 6)
D 8, d e r(8 ), d e r(1 6 )
clonas y luego se caracterizó la totalidad del gen de la distrofina (véa­
se fig. 10-14).
Un ejemplo más reciente del empleo de deleciones se relaciona
con el gen PHEXque está mutado en el dominio ligado a X del ra­
quitismo resistente a vitamina D (MIM 307 800). El gen se había
mapeado a un intervalo pequeño en Xp, pero la demostración de
deleciones submicroscópicas en cuatro de 150 varones afectados
 14.5 CONFIRMACIÓN DE UN GEN CANDIDATO 429

Recuadro 14-4. Efectos de la posición: un peligro latente en la identificación de un gen patológico

En general, los genes parecen estar dispuestos más o menos de forma
aleatoria en los cromosomas y no importa la disposición o el orden exac­
tos. Sin embargo, en Drosophila se sabe bien que la configuración local de
cromatina a escala de megabase puede afectar la expresión génica (en
particular, se silencian genes si se colocan dentro de la heterocromatina o
cerca de ella). Al parecer, sucede lo mismo en ratones y seres humanos.
Estudios de expresión transgénica (sección 20.2.3) muestran que la
expresión génica específica de tejido correcta puede depender de se­
cuencias localizadas cientos de kilobases alejadas de la secuencia de co­
dificación de un gen. Se conocen varios ejemplos en seres humanos de
puntos de rotura de translocación que afectan la expresión de un gen has­
ta una megabase de distancia. En la sección 10.5.1 se mencionan ejem­
plos de aniridia (MIM 106 210) y el gen PAX6, además de displasia
campomélica (MIM 211 970) y el gen SOX9.
Por consiguiente, los puntos de rotura de translocación equilibrada no se
localizan en todos los casos dentro del gen, o incluso muy cerca de él, y
ello reduce su valor como herramientas para la clonación de genes de en­
fermedades.

D os co p ia s activas
d e X p distal

P arte del au to so m a
m ► in activad o M u e rte celular

Un gen d e distrofina
activo
DMD

Inactivación
Inactivo
a leato ria d e X
Inactivo

Un X ac tivo

Dos autosom as activos

X X /A N o hay gen d e distrofina

activo
P o rtad o r d e una tran s lo ca ció n
recíproca eq u ilib ra d a del
au to s o m a X

Fig. 14-10. Ocurre inactivación de X no aleatoria en mujeres con DMD y translocaciones del autosoma Xp21.
La translocación es equilibrada, pero el punto de rotura del cromosoma X altera el gen de distrofina (cuadro rojo). La inactivación de X es aleatoria,
aunque las células que inactivan el X translocado mueren por desequilibrio genético letal. El embrión se desarrolla por completo a partir de células en las
que está inactivado X normal, lo que crea a una mujer con un gen de distrofina no funcional. El fracaso resultante para producir cualquier distrofina causa
distrofia muscular de Duchenne.

permitió enfocar la atención en una parte pequeña de la región can-
didata (HYP Consortium, 1995). Las deleciones son en particular
útiles en padecimientos ligados a X porque en los varones afectados
no hay interferencia del cromosoma normal.
Por lo general se piensa que las microdeleciones causan un gran
número de síndromes genéticos inexplicables. Debido a que la re­
gión eliminada es pequeña, serían en especial valiosas para identifi­
car los genes relacionados con el trastorno. Sin embargo, hasta
fecha reciente no había una forma de investigarlas de manera siste­
mática. Por fortuna, el desarrollo de técnicas sensibles de hibrida­
ción genómica comparativa de alta resolución (recuadro 14-5)
solucionará este problema. Es importante confirmar las deleciones
que se sospechan mediante HFIS (véase fig. 14-12) o electroforesis
en gel de campo pulsado y Southern blotting (el fracaso de la PCR
para crear un producto puede deberse a un cambio de secuencia en
el sitio de enlace del cebador en lugar de una deleción).
14.5 Confirm ación de un gen candidato
Los genes candidatos deben estudiarse de modo individual para ve­
rificar si existen pruebas adecuadas que comprueben que las muta­
ciones en ellos causan la enfermedad en cuestión. La demostración
de que es probable que un gen candidato sea el locus de la anorma­
lidad puede llevarse a cabo por varios medios:
► Selección de mutación. La selección para mutaciones especmcai
del paciente en el gen candidato es con mucho el método m u di­
fundido, puesto que es aplicable y rápido en términos comroia-
430 CAPÍTULO CATORCE IDENTIFICACIÓN DE GENES PATOLÓGICOS HUMANOS
tivos. En el capítulo 16 se comentan las razones por las que pue­
den encontrarse mutaciones particulares en ciertas afecciones y en
el capítulo 18 se describen los métodos para estudiar las mutacio­
nes. l a identificación de mutaciones en varios individuos afecta­
dos no relacionados sugiere con solidez que se eligió el candidato
correcto, pero la prueba formal exige estudios adicionales.
► Restablecimiento del fenotipo normal in vitro. Si se demues­
tra en células de pacientes un fenotipo mutante, es posible veri­
ficar si la transfección de un alelo normal de un gen candidato,
clonado en un vector de expresión (sección 5-6.1), es capaz de
“rescatar” al mutante y restablecer el fenotipo normal. No todos
los fenotipos mutantes son reversibles, de tal forma que el resul­
tado negativo no excluye en todos los casos a ese candidato.
► Producción de un modelo de ratón de la enfermedad (sec­
ción 20.4.3). Una vez que se identifica un posible gen de enfer­
medad, puede elaborarse un modelo de ratón transgénico, si no
existe ya una mutante importante. La pérdida de fenotipos de
función puede modelarse mediante knockout con el envío géni-
co dirigido a la línea germen del ratón (sección 20.4.4). Para fe­
notipos con ganancia de función es necesario introducir el alelo
de la enfermedad en la línea germen del ratón. Se espera que los
ratones mutantes muestren cierta semejanza con los seres huma­
nos que sufren la enfermedad, aunque esta expectativa no siem­
pre se satisface incluso cuando se identifica el gen correcto.
14.5.1 Selección de mutación para confirmar un gen
candidato
La selección de una mutación suele ser directa para enfermedades
en las que una buena proporción de pacientes lleva mutaciones in­
dependientes. De manera característica, son trastornos autosómi-
cos dominantes o ligados a X graves de inicio temprano en los que
el fenotipo de la enfermedad resulta de la pérdida de función géni-
ca. Como se explica en la sección 16.3.2, si se estudia el gen correc­
to mediante uno o más de los procedimientos de selección de
mutación que se describen en la sección 18.3, un grupo de muestras
de personas no relacionadas por lo general evidencia una diversidad
de mutaciones diferentes. Afortunadamente, ello incluye algunas
con un efecto perjudicial evidente en la expresión génica, como
mutaciones sin sentido, cambios de marco, etc. La figura 16-1
muestra un ejemplo. Es necesario revisar testigos normales a fin de
comprobar que cualquiera de los cambios no son variantes comu­
nes en la población.
En otras circunstancias, es posible que sea más difícil identificar
mutaciones e interpretar la selección de una mutación.
► Heterogeneidad de locus inesperada. Con frecuencia, las
mutaciones en varios genes diferentes pueden proporcionar fe­
Recuadro 14-5. Hibridación genómica comparativa (HGC) para la detección de desequilibrios cromosómicos
submicroscópicos
Se recurre a la hibridación genómica comparativa (HGC) a fin de detec­
tar monosomías o trisomias parciales, o bien deleciones o amplificaciones
cromosómicas. Como se describe en la sección 17.3.3, la HGC se basa
en la competencia que el DNA de prueba y el DNA testigo establecen por
hibridar un blanco. Este último puede ser una diseminación de cromoso­
mas normales en un portaobjetos para microscopio, con utilización de
métodos estándar para hibridación de fluorescencia in situ (sección 6.3.4)
notipos casi idénticos, de tal modo que un grupo de muestras
de pacientes no seleccionados puede tener mutaciones patogé­
nicas en diferentes genes. Si el gen candidato que se estudia es
el causante sólo de una proporción pequeña de los casos, casi
ninguna de las muestras revela mutación en ese gen. Como ideal,
se usan sólo muestras de familias con enlace demostrado con la
región candidata, pero tal vez ello no sea factible: los tamaños de
familias con trastornos recesivos y algunos dominantes suelen
ser muy pequeños para los análisis de enlace independientes y
en algunos trastornos dominantes graves la mayoría de los in­
dividuos se presenta como casos esporádicos sin un antecedente
familiar.
► Homogeneidad mutacional. Si la mayoría de los sujetos al pa­
recer no relacionados evidencia el mismo cambio de secuencia,
puede tratarse de la mutación patogénica o tal vez una varian­
te rara en desequilibrio de enlace potente con la mutación ver­
dadera. Se requiere una prueba funcional que indique que el
cambio es patogénico.
► Las mutaciones no son patogénicas de manera imprecisa.
Quizá sea difícil identificar mutaciones en sentido erróneo co­
mo patogénicas, en oposición a que sean variantes neutrales ra­
ras sin un efecto mayor en la expresión génica. En el recuadro
16-4 se proporcionan algunos lincamientos a fin de ayudar a
decir si un cambio de secuencia es patogénico.
► P u ed e ser d ifíc il en co n tra r m u ta cion es. Aparte del problema
práctico de seleccionar un gen grande con muchos exones, al­
gunas mutaciones no pueden identificarse al estudiarse me­
diante PCR el DNA genómico. Por ejemplo, la detección de
grandes inversiones que alteran el gen del factor VIII (sección
11.5.5 y fig. 11-20) o la mutación CFTR3 849 + 10 kb C >
T que activa un sitio de empalme críptico profundo dentro de
un intrón (sección 16.4.1) requiere Southern blotting o PCR-
RT, respectivamente.
14.5.2 Una vez que se confirma un gen candidato, el
paso siguiente es comprender su función
La identificación del gen relacionado con una enfermedad genética
abre el camino a varias líneas de investigación. La capacidad para
identificar mutaciones debe conducir de inmediato a una mejoría
del diagnóstico y la asesoría, como se describe en el capítulo 18. El
conocimiento de la anomalía molecular (la razón por la cual el gen
mutado causa la enfermedad; véase cap. 16) también debe suminis­
trar información sobre trastornos vinculados y al final un trata­
miento más eficaz.
Una segunda línea de indagación se refiere a la función normal
del producto gènico. Hasta que se identificó el gen de la DMD no
o un grupo de clonas BAC definidas dispuestas en un portaobjeto (HGC de
configuración). Las regiones cromosómicas o las clonas BAC en las que
es diferente el número de copias en las pruebas y muestras testigo se
muestran como áreas o puntos de señal fluorescente de color diferente
(fig. 17-3). La HGC de configuración tiene la posibilidad de permitir selec­
ciones en la extensión del genoma para microdeleciones y microduplicacio-
nes en individuos con trastornos congénitos.
 14.6 ¡ OCHO EJEMPLOS ILUSTRAN DIVERSAS FORMAS DE IDENTIFICAR GENES DE ENFERMEDADES
se sabía nada sobre la forma en que el mecanismo contráctil de las
células musculares está fijado al sarcolema. El análisis de dominios
funcionales y secuencias típicas y la investigación de homólogos
manipulables de forma experimental en el ratón, la mosca de la fru­
ta, los nematodos y la levadura son herramientas potentes para es­
ta labor. Dichos temas amplios se comentan en los capítulos 19 y
20, respectivamente; una anticipación importante de la clase de in­
formación que es posible conseguir mediante la búsqueda en bases
de datos puede obtenerse en Hereditary Hearing Loss Homepage
(http://www.uia.ac.be/dnalab/hhh/), que describe el gen que se
identificó mediante clonación posicional de un locus autosómico
dominante de pérdida de la audición (DFNA1) en una familia
grande de Costa Rica (véase OMIM, entrada 124 900):
El producto de la proteína humana DFNA1, DIAPH1, p l4 0 m -
Dia del ratón y Drosophila diaphanous son homólogos de la pro­
teína B n ilp de Saccharomyces cerevisiae. Las proteínas están muy
conservadas. Los genes que codifican estas proteínas son miem­
bros de la familia génica formina, que incluye asimismo al gen del
ratón de deformación de la extremidad, Drosophila cappuccino, el
gen de Aspergillus nidulans sepA y los genes de Schizosaccharomy-
ces p o m b efu sl y cdcl2 . Estos genes participan en la citocinesis y
establecimiento de la polaridad celular. Todas las forminas com­
parten dominios de enlace de Rho en sus regiones terminales N,
tiras de poliprolina en la región central de cada secuencia y domi­
nios de homología de formina en las regiones terminales C.
14.6 Ocho ejem plos ilustran diversas
form as de id en tific a r genes
de enferm edades
14.6.1 Identificación directa de un gen a través de una
anormalidad cromosómica: síndrome de Sotos
El síndrome de Sotos (MIM 117 550) se distingue por crecimien­
to excesivo, características dismórficas y retraso mental. Casi todos
C ro m o s o m a 8
d er(5) í i b K i m m u IB M
G O D L L ftA I i f
RP3-378023
RP3-469e8
P A C /B A C RP1-32C5
RP1-251C21
RP1-118m12
C6B i
C ó s m id o c2B !
S e c u e n c ia g e n ó m ic a
JA Z FG FR 4
G en
12
Fig. 14-11. Una translocación 5;8 equilibrada altera el gen NSD1 en un paciente con síndrome de Sotos.
Reproducido a partir de Kurotaki y colaboradores (2002), Nat. Genet. 30;365-366, con autorización de Nature Publishing Group.
431
los casos son esporádicos; los individuos afectados rara vez se re­
producen y no existen buenas genealogías para mapeo de enlace.
Se ha identificado a un paciente con síndrome de Sotos con una
translocación equilibrada en 46,XX,t(5;8)(q35;q24.1). Se reco­
nocieron mediante HFIS PAC/BAC y clonas cósmidas que abar­
caban el punto de rotura (como en la fig. 14-9). La secuenciación
alrededor del punto de rotura reveló un homólogo de secuencia
genómica parcial con el gen del ratón N sdl. Se clonó y caracteri­
zó el gen humano NSD1 y se demostró que estaba alterado por
translocación (fig. 14-11). Esto pudo tratarse de una coinciden­
cia. La prueba de que NSD1 era el gen mutado en el síndrome
de Sotos se obtuvo al demostrar mutaciones de punto en cuatro de
38 pacientes independientes con la enfermedad y microdeleciones
(fig. 14-12) en 20 de 30 (Kurotaki y cois., 2002). Sin embargo, ca­
be señalar que los genes pueden afectarse por un reordenamiento
cromosómico, incluso cuando no se alteran de forma física (recua­
dro 14-4), de tal manera que no siempre es tan directo el descubri­
miento de una translocación que causa una anormalidad.
14.6.2 Mapeo de transcritos puros: síndrome
de Treacher-Collins
El síndrome de Treacher-Collins (STC; MIM 154 500) es un tras­
torno autosómico dominante del desarrollo craneofacial con un fe­
notipo variable que incluye anormalidades de los oídos externo y
medio, hipoplasia de la mandíbula y complejo cigomático, además
de paladar hendido. El enlace se estableció de forma inicial en 1991
con marcadores en 5q31-q34. Debido a que los marcadores en di­
cha región conocidos en esa época no eran muy informativos, se
aislaron y utilizaron nuevos microsatélites para depurar la región
candidata a 5q32-33.1. Se elaboró un mapa genético híbrido por
radiación combinado a través de este intervalo y en 1994 el grupo
pudo ensamblar un contiguo de cromosoma artificial de levadura
(YAC). Este último se convirtió en un contiguo cósmido y se usó
la selección de genotecas de cDNA y atrapamiento de exones para
generar un mapa de transcripción. Se identificaron en la región crí­
tica cuando menos siete genes. Rondas adicionales de aislamiento
tel
> CTC-2301 a4
i c6A
■c4D
CTC-549a4 (AC008570)
CTC-286c20 (AC027314)
432 CAPÍTULO CATORCE IDENTIFICACIÓN DE GENES PATOLÓGICOS HUMANOS
Fig. 14-12. Microdeleción de NSD1 demostrada mediante hibrida­
ción de fluorescencia in situ en un paciente con síndrome de Sotos.
Se identificaron los dos homólogos del cromosoma 5 mediante una
sonda de HFIS roja que reconoce una secuencia en 5pter. La sonda
HFIS verde es una BAC de 5qter que contiene el gen NSD1; esta
secuencia carece de una copla del cromosoma 5. Reproducido a partir
de Kurotaki y colaboradores (2002), Nat. Genet. 30:365-366, con
autorización de Nature Publlshing Group.
de marcador y análisis cruzado proporcionaron un cuadro confuso de
recombinaciones superpuestas, pero condujeron al final al aisla­
miento de un cDNA incompleto candidato de una genoteca pla-
centaria. Las pruebas Northern blottin gy zoo blootingmostraron que
el gen se expresaba de modo amplio y estaba conservado a través de
la especie, pero las búsquedas en bases de datos no revelaron homo­
logías de importancia. Se determinó la estructura exón-intrón y el
análisis de mutación demostró diferentes mutaciones en cinco pa­
cientes no relacionados.
El aislamiento del gen TCOF1 (Treacher-Collins Syndrome
Collaborative Group, 1996) ilustra la clonación posicional en su
forma más pura. No se reconocieron anormalidades cromosómicas
de consideración (hubo cuatro sujetos con STC que tenían trans­
locaciones o deleciones cromosómicas, pero los marcadores de ca­
da uno de los puntos de rotura no mostraron enlace con STC en
estudios de familias, de tal manera que tal vez todos estos casos fue­
ron coincidentes). No hay desequilibrio de enlace: este hecho no es
de sorprender, ya que 60% de los casos corresponde a mutaciones
nuevas. La región candidata es abundante en genes, de modo que
había muchos posibles candidatos y el gen que se identificó al final
no tiene características que lo tornaran en un candidato en particu­
lar prometedor. El producto del gen es una fosfoproteína nucleolar,
pero aún no se sabe con exactitud por qué las mutaciones causan el
síndrome de Treacher-Collins.
14.6.3 Secuenciación y búsqueda de homólogos a gran
escala: síndrome branquiootorrenal
El síndrome autosómico dominante branquiootorrenal (BOR;
MIM 113 650: fístulas branquiales, malformación de los oídos ex­
terno e interno con pérdida de la audición; hipoplasia o ausencia de
riñones) se mapeó en 8ql3 con base en un indicio de un paciente
afectado que tenía un reordenamiento del cromosoma 8. Se depuró
el intervalo inicial de 7 cM a 470 a 650 kb mediante mapeo adi­
cional y el descubrimiento de una deleción cromosómica submi-
croscópica en el sujeto mencionado. Se aislaron clonas P1 y PAC
mediante la selección de genotecas genómicas con marcadores den­
tro de la región candidata o cerca de ella y se llenaron las brechas
en los contiguos mediante caminata cromosómica. La vía cubier­
ta mínima a través de la región candidata incluyó tres clonas P1 y
tres PAC.
Se decidió identificar los genes en el contiguo mediante se­
cuencias a una gran escala. Al contrastar la secuencia con EMBL
y GenBank, las bases de datos de proteínas y ácido nucleico re­
velaron homología entre parte de la secuencia obtenida y el gen
del desarrollo de ausencia d e ojos {eya) de Drosophila. Se buscó la
secuencia genómica para marcos de lectura abiertos que se tradu­
jeron y compararon con la secuencia de aminoácidos de eya. Es­
to hizo posible identificar siete posibles exones que mostraron
69% de identidad y 88% de similitud a nivel del aminoácido con
la posible proteína eya. A continuación se aisló el cDNA huma­
no de una genoteca de mRNA fetal total de nueve semanas y se
demostraron siete mutaciones en el gen, denominadas EYA1 en
42 pacientes con síndrome BOR no relacionados (Abdelhak y
cois., 1997).
A medida que se completen más las bases de datos de secuen­
cias genómicas, el tipo de análisis que se llevó a cabo aquí se cons­
tituirá en el método estándar. Como en este caso, es posible que las
homologías con genes en organismos relacionados de forma distan­
te sean más aparentes en la secuencia de aminoácidos que en la se­
cuencia de DNA o el fenotipo. En esta etapa no se reconoció la
función del producto del gen ni tampoco fue obvio por qué el fe­
notipo de Drosophila consiste en disminución o ausencia de ojos
compuestos, en tanto que los seres humanos no tienen problemas
oculares. Como sucede con frecuencia con la clonación posicional,
la identificación del gen fue tan sólo el inicio para comprender el
síndrome.
14.6.4 Candidatos posicionales definidos mediante
función: rodopsina y fibrilina
El gen del fotopigmento humano rodopsina (RHO) se clonó en
1984 y se mapeó en 3q21-qter en 1986. Entre los trastornos que
incluyen degeneración hereditaria de la retina se encuentran las di­
versas formas de retinitis pigmentosa (RP), que se caracterizan por
pérdida visual progresiva que resulta de la aglomeración del pig­
mento retiniano. Aunque RHO fue un posible gen candidato para
algunas formas de RP, se sabe que sólo uno de muchos genes que
codifican proteínas participan en la fototransducción. Sin embar­
go, en 1989 el análisis de enlace en una familia irlandesa grande
con RP mapeó su gen de enfermedad en 3q en la cercanía del foto-
pigmento humano rodopsina {RHO). Éste era ahora un gen can-
 14.6 ¡ OCHO EJEMPLOS ILUSTRAN DIVERSAS FORMAS DE IDENTIFICAR GENES DE ENFERMEDADES
c^dato importante y en el transcurso de un año se identificaron
—ntaciones específicas de pacientes (véase entrada OMIM 180
380).
El fenotipo del síndrome de Marfan (SM, MIM 154 700:
crecimiento excesivo de huesos largos; articulaciones laxas; luxa­
ción de los cristalinos; riesgo de aneurismas aórticos) sugirió
cierta anormalidad en el tejido conjuntivo. El análisis de enlace
—.apeó el gen del SM en 15q. Cuando se localizó el gen para la
rroteína de tejido conjuntivo fibrilina en 15q21.1 mediante hi­
bridación in situ, se constituyó en un candidato posicional obvio.
Poco tiempo después se demostraron mutaciones en pacientes
ion SM (véase McKusick, 1991, para un comentario de los ante­
cedentes).
14.6.5 Un candidato posicional identificado a través de
la comparación de mapas humanos y de ratón:
PAX3 y síndrome de Waardenburg
El síndrome de Waardenburg tipo 1 (SW1, MIM 193 500) ilus­
tra el valor de las comparaciones entre ser humano y ratón. En la
ñgura 4-5C se muestra la genealogía de este padecimiento auto-
sómico dominante pero variable. Las anormalidades pigmenta­
rias y la pérdida de la audición características del SW1 se deben
a la ausencia de melanocitos en las partes afectadas, incluido el
oído interno, en donde se requieren melanocitos en las estrías
vasculares de la cóclea a fin de que se desarrolle la audición nor­
mal. El análisis de enlace, asistido mediante la descripción de
una anormalidad cromosómica en un paciente afectado, localizó el
gen del SW1 en la parte distal de 2q. Esta región cromosómica
tiene una sintenia conservada fuertemente con parte del cromoso­
ma 1 del ratón. En este punto surgió un probable homólogo del
ratón. El ratón mutante Splotch (Sp) sufre anormalidades pigmen­
tarias secundarias a la ausencia de melanocitos en placas. Esto qui­
zá resulta de un defecto de la cresta neural embrionaria. A pesar de
varias diferencias entre los dos fenotipos, parecía bastante proba­
ble que Sp y SW 1 eran consecutivos a mutaciones en genes ortó­
logos.
No se había identificado ningún gen, pero surgió un candidato
posicional cuando se mapeó el gen murino Pax-3 en la cercanía del
locus Sp. Pax-3 codifica un factor de transcripción que se expresa
en embriones de ratones en el sistema nervioso en desarrollo, que
incluye la cresta neural. La secuencia de Pax-3 murino fue casi
idéntica a la secuencia limitada publicada antes para una clona ge­
nómica humana no mapeada, HuP2. Estas observaciones llevaron
a la selección de mutación de Pax-3 y HuP2 y a la identificación de
mutaciones en el ratón Splotch y seres humanos con SW 1 (revisado
por Strachan y Read, 1994). Debido a que los genes subyacentes
eran ortólogos con claridad, se cambió el nombre del gen HuP2 por
PAX3.
14.6.6 Interferencia de la función in vitro: anemia
de Fanconi
La anemia de Fanconi es un trastorno recesivo con anomalías
congénitas muy diversas, en especial aplasia radial y predisposi­
ción a insuficiencia de la médula ósea y afección maligna, en par­
ticular leucemia mielógena aguda. El problema subyacente es un
defecto de la capacidad para reparar DNA dañado. Este defecto
433
puede observarse en cultivos celulares en la forma de hipersensi-
bilidad a agentes de enlace cruzado de DNA como diepoxibutano.
Experimentos de fusión celular permitieron dividir a los pacientes
con Fanconi cuando menos en ocho grupos de complementación
(A-H): cuando se fusionaron, se complementaron entre sí células
de sujetos en diferentes grupos, en tanto que las de enfermos en el
mismo grupo permanecieron defectuosas. Tras estudiar las clonas
de una genoteca de cDNA en cuanto a su capacidad para curar la
sensibilidad celular a diepoxibutano de un paciente con anemia de
Fanconi del grupo C, Strathdee y colegas (1992) pudieron aislar el
gen de la anemia de Fanconi del grupo C (AFGC; MIM 227 645).
Una conducta similar identificó después los genes de los grupos A
(AFGA) y G (AFGG). En otras aplicaciones de la clonación funcio­
nal se utilizó la capacidad de cromosomas o clonas transferidos pa­
ra corregir el crecimiento incontrolable de líneas de células
tumorales a fin de ayudar a localizar y después identificar genes su-
presores de tumor (sección 17.4).
14.6.7 Interferencia de función in vivo: miosina 15
y sordera DFNB3
Algunas veces se identificó un gen de enfermedad del ratón me­
diante el rescate del fenotipo mutante con un transgén de DNA ti­
po silvestre de una región candidata. Esta medida se utilizó por
primera vez para reconocer un gen reloj (Antoch y cois., 1997) y en
fecha más reciente fue un paso crucial en la identificación del gen
de la sordera humana DFNB3 (Probst y col., 1998; fig. 14-13). El
mapeo comparativo demostró que DFNB3 se hallaba en una posi­
ción en seres humanos correspondiente a la localización del gen de
la sordera shaker-2 en el ratón. El ratón transgénico shaker-2 se
construyó al usar BAC tipo silvestre de la región candidata shaker-
2. Se identificó un BAC que corrigió el fenotipo y resultó que con­
tenía un gen de miosina no convencional, myo 15. A continuación
se aisló el gen humano M YOl5 con base en su homología cercana
al gen del ratón, se confirmó su posición dentro de la región can­
didata DFNB3 y en seguida se demostraron mutaciones en DFNB3
en personas afectadas.
14.6.8 Interferencia del patrón de expresión: otoferlina
Las genotecas de cDNA de genes que se expresan de forma espe­
cífica en el oído interno del ratón son herramientas útiles para
identificar genes candidatos de la sordera. Las genotecas se pro­
ducen mediante hibridación sustractiva de una genoteca de cD­
NA del oído interno contra una o más genotecas inespecíficas, a
fin de intentar extraer genes que se expresan en una variedad de
tejidos -un truco técnico (Swaroop y cois., 1991)-. Ya se observó el
análisis de enlace que mapeó el gen de la sordera no sindrómico
DFNB9 (fig. 13-8). Durante la clonación posicional subsecuente
(Yasunaga y cois., 1999), una secuencia génica parcial de una re­
gión crítica mostró 90% de identidad de aminoácidos y 97% de
similitud con una clona de la genoteca del oído interno del ra­
tón. El gen, que se denominó otoferlin, se caracterizó por com­
pleto y la selección de mutación reveló una mutación sin sentido
en la familia.
Una conducta alternativa pudo consistir en identificar homólo­
gos humanos de las clonas del ratón y mapearlos mediante HFIS
(sección 2.4.2). A continuación habrían sido candidatos posiciona-
les para cualquier gen de sordera mapeado en la posición corres­
pondiente.
434 CAPÍTULO CATORCE IDENTIFICACIÓN DE GENES PATOLÓGICOS HUMANOS

R ató n sh a k e r-2 s h 2 /s h 2 R ató n silve stre

Sordo; la disfunción — - > •
vestibular causa
circunducción y
sacud ida d e la ca b eza
Utilizar cruzam ientos de ratón -►
para m apear sh2 en la región
de 1 cM del cromosoma 11 del ratón
Éste corresponde a 17p11.2
en seres humanos, la región candidata
para el gen de sordera DFNB3
Las clonas BAC aisladas
recubren la región candidata
del ratón tipo silvestre
In y e c ta r h u e vo s fe c u n d a d o s
sh2/sh2 p a ra c re a r rato n e s
tra n s g é n ic o s

BAC 425 p24

co rrig e el
d e fe c to sh2

1. Gen M Y015 humano

aislado mediante
I8 9 2 F cebadores diseñados C674Y S e c u e n c ia B A C 4 2 5 p 2 4
N 890Y a partir del ratón
K 1300X M u ta c ió n m yo15 El análisis por co m p u tad o ra
2. U sar híbridos d e células id e n tific a d a en identifica un nuevo gen
M u ta c io n e s M Y 0 1 5 som áticas para revisar si el rató n sh2 d e m iosina, myo15
id e n tific a d a s en tres m a p e a en 17 p 1 1.2
p a c ie n te s D FN B 3
no re la c io n a d o s

Fig. 14-13. Complementación funcional en ratones transgénicos como una herramienta para identificar un gen de enfermedad humana.

Se identificó una mutación del ratón shaker-2 al reconocer una clona de tipo silvestre que corrigió el defecto. Las familias humanas con un fenotipo
similar que se mapea en la localización cromosómica correspondiente mostraron mutaciones en el gen ortólogo.

Lecturas adicionales

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CAPÍTULO QUIN CE

M apeo e identificación d e gen es

que confieren susceptibilidad
a enferm edades com plejas

Contenido del capítulo

15.1 Decidir si un carácter no mendeliano es genético: función
de los estudios de familia, gemelos y adopción
15.2 El análisis de segregación permite analizar los caracteres que se
encuentran en cualquier parte del espectro entre puramente mendeliano
y sólo poligénico
15.3 Análisis de enlace de caracteres complejos
15.4 Estudios de asociación y desequilibrio de enlace
15.5 Identificación de alelos de susceptibilidad
15.6 Ocho ejemplos que ilustran el éxito variable de la disección genética
de enfermedades complejas
15.7 Generalidades y resumen

Recuadro 15-1 Corrección de la relación de segregación

Recuadro 15-2 Mediciones de desequilibrio de enlace
Recuadro 15-3 Prueba de desequilibrio de transmisión (PDT) para determinar
si el alelo marcador M1 se relaciona con una enfermedad
Recuadro 15-4 Tamaños de muestras necesarios para encontrar un locus de
susceptibilidad a una enfermedad por el estudio del genoma completo
mediante el uso de pares de hermanos afectados (PHA) o la prueba
de desequilibrio de transmisión (PDT)
Ética, recuadro 1 Enfermedad de Alzheimer, prueba de ApoE y discriminación
438 ¡ CAPITULO QUINCE j MAPEO E IDENTIFICACIÓN DE GENES

En todo el mundo la principal contribución genética a la morbi­
lidad y la mortalidad la hace el componente genético de las en­
fermedades frecuentes. En consecuencia una labor central de la
investigación médica se relaciona con la identificación de los ge­
nes. Una secuencia lógica para investigar cualquier enfermedad
compleja sería:
► realizar estudios de familia, gemelos o adopción a fin de com­
probar que la susceptibilidad es genética cuando menos en parte;
► utilizar análisis de segregación para estimar el tipo y la fre­
cuencia de alelos de susceptibilidad;
► mapear locus de susceptibilidad mediante análisis de enlace,
por lo general de pares de hermanos afectados;
► reducir la región candidato por medio del estudio de relaciones
de población;
► identificar las variantes de secuencias de DNA que confieren
susceptibilidad y definir su acción bioquímica.
A continuación se desarrollan estos pasos, seguidos del comentario
de ocho enfermedades específicas para ilustrar lo que puede ocurrir
en la práctica. Por último se comenta la pregunta aún abierta de si
este paradigma completo para identificar factores de susceptibili­
dad es la clave del futuro de la genética médica o si, como algunos
afirman, no es probable que tenga éxito en general.
15 .1 D ecidir si un c a rá c te r no
m endeliano es genético:
función de los estudios de
fa m ilia , gem elos y adopción
15.1.1 El valor lambda es una medida de agrupamiento
familiar
Nadie discutiría la participación de genes en un carácter que pro­
porciona de manera consistente patrones de genealogía mendelia-
nos o que se acompañan de una anormalidad cromosómica. Sin
embargo, con los caracteres no mendelianos, sea continuos (cuan­
titativos) o discontinuos (dicótomos), es necesario probar las
afirmaciones de determinación genética. El medio obvio para
abordarlo es demostrar que el carácter se presenta en familias. El
grado de agrupamiento familiar de una enfermedad puede expre­
sarse mediante la cantidad X.&e l riesgo para el fa m iliar R d e un pro­
bando afectado comparado con el riesgo en la población. Es posible
calcular valores separados para cada tipo de familiar, por ejemplo,
\s, para hermanos. Las propiedades matemáticas de \R fueron de­
rivadas por Risch (1990a). El cuadro 15-1 muestra datos manco­
munados de varios estudios de esquizofrenia. El agrupamiento
familiar es evidente por los valores elevados de Á. y, como cabe es­
perar, tales valores disminuyen de nuevo a 1 para relaciones más
distantes.
15.1.2 Importancia del ambiente familiar compartido
Los genetistas nunca deben olvidar que los padres proporcionan
a sus hijos tanto su ambiente como sus genes. Muchos caracteres
se presentan en familias a causa del am biente fa m ilia r compartido
—por ejemplo, si el lenguaje nativo de la persona es inglés o chi­
no-. Por consiguiente siempre es necesario preguntar si el am­
biente compartido puede explicar un carácter familiar. Esto tiene
importancia especial en atributos conductuales, como el IQ o la
esquizofrenia, que dependen cuando menos en parte de la crian­
za. No es posible ignorar inclusive los caracteres físicos o los de­
fectos de nacimiento: una familia podría compartir una dieta
poco usual o algún medicamento tradicional que tal vez cause de­
fectos del desarrollo. Se requiere algo más que una tendencia fa­
miliar para demostrar que un carácter no mendeliano está
controlado genéticamente. La bibliografía médica no siempre
consigna estas influencias con la claridad necesaria. El cuadro 15-5
muestra lo que puede ocurrir si el ambiente familiar compartido
se ignora.

Cuadro 15-1. Riesgo de esquizofrenia entre familiares de esquizofrénicos: resultados mancomunados de varios estudios
Familiar Núm. con riesgo3 Riesgo, % xb

Padres 8020 5.6 7

Hermanos 9920.7 10.1 12.6
Hermanos, un padre afectado 623.5 16.7 20.8
Descendencia 1577.3 12.8 16
Descendencia, ambos padres afectados 134 46.3 58
Medios hermanos 499.5 4.2 5.2
Tíos, tías, sobrinos, sobrinas 6386.5 2.8 3.5
Nietos 739.5 3.7 4.6
Primos 1600.5 2.4 3

aLos números con riesgo se corrigieran para permitir que algunos familiares en riesgo estuvieran abajo o justo en la edad de riesgo de esquizofrenia (es
decir, 15 a 35 años de edad).
t o s valores X se calcularon con base en una incidencia en la población de 0.8%.
Datos obtenidos por McGuffin (1984).
 15.1 DECIDIR SI UN CARÁCTER NO MENDELIANO ES GENÉTICO.
15.1.3 Los estudios de gemelos adolecen de muchas
limitaciones
Francis Galton, quien estableció gran parte de la base de la genéti­
ca cuantitativa, señaló el valor de los gemelos para la genética. Los
gem elos m onocigóticos (MC) son clonas genéticam ente idénticas y
siempre serán concordantes (ambas iguales) para cualquier carácter
heredado genéticamente. Esto es cierto con independencia del mo­
do de herencia o del número de genes relacionados; las únicas ex­
cepciones son los caracteres que dependen de cambios genéticos
somáticos poscigóticos (el patrón de inactivación X en mujeres, el
repertorio de genes funcionales de inmunoglobulina y del receptor
de célula T, etc.). Los gem elos dicigóticos (DC) comparten la m itad de
sus genes en prom edio, como cualquier par de hermanos. En conse­
cuencia los caracteres genéticos deben mostrar una concordancia
más alta en gemelos MC que en DC y en muchos caracteres así es
(cuadro 15-2).
Sin embargo, una concordancia más alta en gemelos MC que
en los DC no prueba un efecto genético. Para iniciar, la mitad de
los gemelos DC es de sexo diferente, en tanto que todos los gemelos
MC son del mismo sexo. Aun si la comparación se restringe a ge­
melos DC del mismo sexo (como en los estudios que se muestran
en el cuadro 15-2) podría decirse que, cuando menos para caracte­
res conductuales, es más probable que los gemelos MC sean muy
similares, se vistan y traten igual y, por tanto, compartan más de su
ambiente que los gemelos DC.
Los gemelos MC que se separan al nacer y se crían en ambien­
tes por completo separados constituirían un experimento ideal
(Francis Crick sugirió de manera irónica que una vez que nacen ge­
melos deben donarse a la ciencia para este propósito). En años pre­
téritos estas separaciones eran más frecuentes de lo que cabría esperar
porque a veces el nacimiento de gemelos era el golpe de gracia para
una madre con una carga excesiva. Pueden hacerse programas de te-
Cuadro 15-2. Estudios de gemelos en esquizofrenia.
Estudio Pares MC Pares DC
concordantes concordantes
Kringlen, 1968 14/55 (21/55) . 4-10%
Fischer, 1969 5/21 (10/21) 10-19%
Tienari, 1975 3/20 (5/16) 3/42
Farmer, 1987 6 /1 6 (1 0 /2 0 ) 1/21 (4/31)
Onstad, 1991 8/24 1/28
Los números muestran concordancias en pares, es decir, cuentas del
número de pares concordantes ( + / + ) y discordantes ( + / - ) indagados
a través del probando afectado. Las cifras entre paréntesis se obtienen
utilizando una definición más amplia de afectado que incluye fenotipos
limítrofes. La concordancia también puede calcularse a nivel de pro­
bando contando dos veces un par si ambos eran probandos. Esto pro­
porciona valores más altos para la concordancia monocigótica (MC).
Se piensa que las concordancias a nivel de probando son más compa­
rables con otras medidas de agrupamiento familiar. Sólo en los estu­
dios de Onstad y Farmer se emplean los criterios diagnósticos estándar
actuales, DSM-lll. Para referencias, véase Onstad y colaboradores
(1991) y Fischer y colaboradores (1969).
439
levisión fascinantes acerca de gemelos que se reunieron después de 40
años de separación y descubrieron que tenían trabajos similares, usa­
ban ropas parecidas y gustaban de la misma música. Sin embargo, los
gemelos separados pueden tener muchos inconvenientes como ma­
terial de investigación:
► cualquier investigación se basa siempre en números pequeños
de personas discutiblemente excepcionales;
► con frecuencia la separación no fue total: a menudo estuvieron
separados algún tiempo después de nacer y fueron reunidos por
familiares;
► hay un sesgo de indagación: todos desean saber en cuanto a
gemelos separados muy similares, pero los muy diferentes no
son una noticia que merezca la pena;
► inclusive en principio, la investigación en gemelos separados no
puede diferenciar causas ambientales intrauterinas de las genéti­
cas. Esto puede ser importante, por ejemplo, en estudios de
orientación sexual (“el gen homosexual”), en los que algunas
personas sugieren que las hormonas maternas pueden afectar el
feto in útero a fin de influir en su orientación sexual futura.
En consecuencia, por toda su fascinación anecdótica, la contribu­
ción de los gemelos separados a la investigación genética humana
es hasta cierto punto poca.
15.1.4 Estudios de adopción: el estándar ideal para
desenmarañar factores genéticos y ambientales
Cuando la separación de gemelos no es un medio práctico para de­
senmarañar el ambiente hereditario del familiar, la adopción es mu­
cho más prometedora. Es posible diseñar dos estudios:
► encontrar personas adoptadas que sufrieron una enfermedad
particular que se sabe que se presenta en familias y preguntarles
si la padecía su familia biológica o su familia adoptiva;
► encontrar a los padres afectados cuyos niños se adoptaron lejos
de la familia y preguntarles si este hecho salvó a los niños de la
enfermedad familiar.
Un estudio celebrado (y controversial) de Rosenthal y Kety (véa­
se Lecturas adicionales) utilizó el primero de estos diseños para
estudiar factores genéticos en la esquizofrenia. Los criterios diag­
nósticos empleados en este estudio recibieron críticas; también se
sostuvo (disputó) que no todos los diagnósticos se establecieron
en realidad en forma ciega. Sin embargo, un nuevo análisis inde­
pendiente en el que se aplicaron criterios diagnósticos del DSM-
III (Kendler y cois., 1994) alcanzó las mismas conclusiones. El
cuadro 15-3 muestra los resultados de una extensión posterior de
este estudio (Kety y cois., 1994).
El principal obstáculo en estudios de adopción es la fa lta de in­
form ación de la fam ilia biológica, que a menudo empeora por lo in­
deseable de abordarlos con preguntas. Sólo unos cuantos países
cuentan con registros de adopción eficientes. Un problema secun­
dario es la colocación selectiva, en la que la agencia de adopción, en
el interés del niño, elige una familia que es probable que se aseme­
je a la biológica. Aunque resulta indudable que los estudios de
adopción son el estándar ideal para controlar qué tanto un carácter
está determinado genéticamente, como son tan difíciles, se realizan
sobre todo sólo para padecimientos psiquiátricos en los que los ar­
gumentos de naturaleza-crianza son en particular contenciosos.
440 | CAPÍTULO QUINCE ¡ MAPEO E IDENTIFICACIÓN DE GENES
Cuadro 15-3. Un estudio de adopción en esquizofrenia.
Casos índice (47 esquizofrénicos crónicos adoptados)
Adoptados testigo (compatibles por edad, sexo, estado social
de la familia adoptiva y número de años institucionalizados)
El estudio incluyó a 14 427 personas adoptadas de 20 a 40 años de edad en Dinamarca, 47 de las cuales se diagnosticaron como esquizofrénicos
crónicos.
Los 47 se compararon con 47 sujetos testigo no esquizofrénicos del mism o grupo de adoptados. Datos de Kety y colaboradores (1994).
15.2 El análisis de segregación perm ite
analizar los caracteres que se
encuentran en cualquier parte
del espectro entre puram ente
m endeliano y sólo poligénico
Como se observa en la figura 4-6, los caracteres puramente mende-
lianos y los sólo poligénicos constituyen los extremos opuestos de
un continuo. Entre ellos se encuentran los caracteres oligogénicos
regidos por unos cuantos locus de susceptibilidad mayor, que tal
vez operan contra un fondo poligénico y pueden estar sujetos a
muchas influencias ambientales. El análisis de segregación es el
principal método estadístico para analizar la herencia de cualquier
carácter. Puede brindar evidencias a favor o en contra de un locus
de susceptibilidad mayor y definir cuando menos en parte sus pro­
piedades. Los resultados pueden ayudar a guiar estudios futuros de
enlace o de asociación.
15.2.1 El sesgo de indagación suele ser un
problema con datos familiares: el ejemplo
de padecimientos autosómicos recesivos
Puesto que los estudios de enfermedades se basan en la reunión de
casos y familias, el primer paso consiste en considerar los sesgos que
el método de indagación puede imponer en los datos crudos. El
análisis de segregación requiere grandes grupos de datos y es muy
sensible a sesgos sutiles en la manera en que se reúnen los datos. Un
ejemplo mendeliano puede ilustrar lo anterior. Supóngase que se
desea demostrar que un padecimiento es autosómico recesivo. Po­
dría reunirse a un grupo de familias y revisarse que la relación de
segregación (la proporción de niños afectados) es de uno en cua­
tro. A primera vista esto parecería una labor trivial, a condición de
que el padecimiento no sea muy raro. Pero de hecho la proporción
esperada de niños afectados en la muestra no es de uno en cuatro.
El problema es el sesgo de indagación.
Si se asume que no hay una forma independiente de reconocer
a los portadores, los familiares se identificarán a través del niño
afectado. Por consiguiente las familias que se muestran sombreadas
en la figura 15-1 no se indagarán y la relación de segregación ob­
servada en las familias de dos niños reunidas no es de 1/4 sino de
Casos de esquizofrenia Casos de esquizofrenia
entre familiares biológicos entre familiares adoptivos
44/279 (15.8%) 2 /111 (1 .8%)
5/234 (2.1%) 2/117(1.7% )
8/14. Las familias con tres niños, que se estudian en la misma for­
ma, darían una relación de segregación distinta: 48/111. La rela­
ción para cualquier tamaño de familia determinado puede
estimarse a partir de la distribución binomial truncada, una ex­
pansión binomial de (1/4 + 3/4)" en la que el último término (nin­
guno afectado) se omite. Los datos experimentales para este sesgo
pueden corregirse de modo simple por el método de Li y Mantel
que se muestra en el recuadro 15-1.
El ejemplo anterior presupone una indagación truncada com­
pleta: los autores reúnen a todas las familias de cierta población de­
finida que tienen cuando menos un niño afectado, pero éste no es
el único medio posible de reunir familias. Podrían investigarse los
niños afectados tomando los 100 primeros observados en una clí­
nica muy ocupada (de manera que podrían haberse averiguado mu­
chos más de la misma población si se efectuara por más tiempo).
Bajo estas condiciones es el doble de probable que una familia con
dos niños afectados se capte como si fuera una con sólo un niño
afectado y es cuatro veces más probable una con cuatro afectados.
La selección aislada, en la que la probabilidad de ser investigado es
proporcional al número de niños afectados en la familia, introduce
un sesgo de indagación diferente y demanda una corrección esta­
dística distinta (véase recuadro 15-1). Los autores observaron que
resolver una relación d e segregación requiere datos que se reunieron en
concordancia con un esquema explícito de indagación, de modo que
pueden aplicarse las correcciones apropiadas.
15.2.2 El análisis de segregación compleja es un
método general para estimar la mezcla más
probable de factores genéticos en datos
mancomunados de familias
El análisis de datos de los familiares de un conjunto grande de
personas afectadas por una enfermedad familiar pero no mende-
liana no es una labor simple. Podrían actuar factores tanto gené­
ticos como ambientales; es posible que los factores genéticos sean
poligénicos, oligogénicos o mendelianos con cualquier modali­
dad de herencia, o una combinación de ellos, en tanto que los
factores ambientales pueden incluir variables tanto familiares co­
mo no familiares. En el análisis de segregación compleja se per­
mite una gama completa de posibles mecanismos, frecuencias
 15.2 I EL ANÁLISIS DE SEGREGACIÓN PERMITE ANALIZAR LOS CARACTERES -h 1

IZ H rO EH-® S -T -® IZ h r-®

á i a ¿ ¿ ¿ n

H - r -®

E H r-© 0 -r-® E H rK 2

¿ ¿

t í c 1)' ¿ Ü

Total d e niños : A A 2- A a 1- | aa —
32 32 32

In d a g a d o s : A A 2. Aa ^ aa ^

C o rre c c ió n (L i-M a n te l): p = (R - S )/(T - S) = (8 - 6 )/(1 4 - 6) = -

= 0 .2 5 8

Fig. 15-1. Indagación sesgada de familias con un padecimiento autosómico recesivo (indagación truncada completa).

Ambos padres son portadores de un padecimiento autosómico recesivo. En total, un niño en cuatro está afectado -pe ro si las familias se Indagan a
través de niños afectados, sólo se captarán las familias que se muestran en el área sombreada y la proporción de niños afectados es 8 de cada 14 -, La
relación verdadera se recupera mediante la corrección de Li-Mantel (recuadro 15-1).

génicas, penetraciones, etc., y la computadora efectúa un análi­
sis de probabilidad máxima para encontrar la mezcla de valores
parámetro que proporciona la mayor probabilidad total para los
datos observados. El recuadro 15-4 muestra un ejemplo. Igual
que con el análisis de calificación lod (cap. 13), la pregunta es
qué tanto más son probables las observaciones en una hipótesis
comparada con otra.
En el ejemplo del cuadro 15-4 se comparó la capacidad de mo­
delos específicos (esporádico, poligénico, dominante, recesivo) pa­
ra explicar los datos con la posibilidad calculada mediante un
modelo general (“modelo mixto”) en el que la computadora pudo
optimar con libertad la mezcla de causas de gen único, poligénicas
y ambientales aleatorias. Todos los modelos se restringieron por in­
cidencias totales, relaciones de sexo y probabilidades de indagación
estimadas a partir de los datos reunidos. Un modelo dominante de
locus único no es mucho peor que el modelo mixto para explicar
los datos (x = 2.8; p = 0.42), en tanto que los modelos que asu­
men ausencia de factores genéticos, herencia poligénica pura o he­
rencia recesiva pura se comporten muy mal. Si se argumenta que
las explicaciones simples son preferibles a las complicadas, el análisis

Recuadro 15 -1. Corrección de la relación de segregación

Indagación del truncado completo: p = (R -S )/(T-S )

Selección única: p = (R -N )/(T-N )
p = relación de segregación verdadera (no sesgada)
R = número de niños afectados
S = número de niños únicos afectados (los únicos niños afectados en la familia)
T = número total de niños
N = número de hermanos
442 | CAPÍTULO QUINCE MAPEO E IDENTIFICACIÓN DE GENES

sugiere la existencia de una susceptibilidad dominante mayor en 15.3 Análisis de enlace de c a ra c te re s

la enfermedad de Hirschsprung. Varios de esos factores están iden­
tificados en la actualidad (sección 15.6.2).
Sin importar la habilidad del programa de análisis de segrega­
ción, sólo puede maximizar la posibilidad mediante los parámetros
que se le proporcionan. El resultado puede ser engañoso si se omi­
te un factor mayor. Los datos de McGuffin y Huckle ilustran bien
este hecho (cuadro 15-5). Ellos interrogaron respecto a clases de es­
tudiantes médicos cuyos familiares asistieron a escuelas de medici­
na. Cuando alimentaron los resultados a través de un programa de
análisis de segregación, éste presentó resultados que parecían favore­
cer la existencia de un gen recesivo para quienes asistieron a la escue­
la de medicina. Aunque divertido, no se realizó como una broma, ni
tampoco con objeto de desacreditar el análisis de segregación. Los
autores no permitieron que la computadora considerara el probable
mecanismo verdadero: el ambiente familiar compartido. La siguien­
te mejor alternativa de la computadora fixe válida en términos mate­
máticos pero no realista desde la perspectiva biológica. El punto
importante que McGuffin y Huckle estudiaron es que muchas posi­
bles trampas en el análisis de segregación de caracteres conductuales
humanos y los análisis no cuidadosos pueden generar efectos genéti­
cos falsos.
com plejos
15.3.1 El análisis de calificación lod estándar no suele
ser apropiado para caracteres no mendelianos
El análisis de calificación lod estándar se denomina paramétrico
porque requiere un modelo genético preciso, que detalle la moda­
lidad de herencia, las frecuencias génicas y la penetrancia de cada
genotipo. En tanto se dispone de un modelo válido, el enlace para­
métrico constituye un método en extremo potente para explorar el
genoma en segmentos de 20 Mb a fin de localizar un gen de enfer­
medad. Aunque la especificación de un modelo adecuado no debe
ser un gran problema para caracteres mendelianos, los padecimien­
tos no mendelianos son mucho menos manejables.
El problema crucial de los criterios diagnósticos
Un problema importante consiste en establecer criterios diagnósti­
cos que sean relevantes para el análisis genético. Las características
de un paciente que forman parte del síndrome y las que son coin-
cidentales suelen ser bastante obvias en los síndromes mendelianos.
Diferentes características pueden tener distintas penetrancias, pero

Cuadro 15-4. Análisis de segregación complejos.

M odelo d t q H z X x2 P

Mixto 1.00 7.51 9.6 x 10-6 0.01 0.15

Esporádico 334 <1 x 10~5
Poligénico 1.00 1.00 78 <1 x 10“5
Locus recesivo mayor 0 .0 0 8.22 3.8 x 10~3 35 <1 x 10~5
Locus dominante mayor 1.00 7.56 1.2 x 1 0 '5 0.19 2.8 0.42

Los datos son de familias descubiertas a través de un probando con enfermedad de Hirschsprung de segmento largo. Los parámetros que pueden variar
son t (la diferencia en el riesgo entre personas homocigotas para los alelos de susceptibilidad baja y de susceptibilidad alta de un gen de susceptibilidad
mayor, medidos en unidades de desviación estándar de riesgo), d (el grado de dominancia de cualquier alelo de enfermedad mayor), q (la frecuencia génica
de cualquier alelo de enfermedad mayor), H (la proporción de varianza total en el riesgo debida a herencia poligénica, en adultos), z (la relación de herencia
en niños con herencia en adultos) y x (proporción de casos debidos a nueva mutación). Un locus mayor aislado que codifica susceptibilidad dominante ex­
plica los datos, así como un modelo general en el que se permite una mezcla de todos los mecanismos. Datos de Badner y colaboradores 1990.

Cuadro 1 5 -5 . ¿Un gen recesivo para asistir a la escuela de medicina?

M odelo d t q H x2 P

Mixto 0.087 4.04 0.089 0.008

Esporádico 163 <1 x 10~5
Poligénico 0.845 14.4 0.005
Locus recesivo mayor 0.00 7.62 0.88 0.11 N.S.
Datos de McGuffin y Huckle (1990) de una encuesta de estudiantes de medicina y sus familias. El significado de los símbolos es el mism o que el del
cuadro 15-4. "Afectado” se define como asistir a la escuela de medicina. Al parecer el análisis apoya la herencia recesiva ya que explica tan bien los da­
tos como el modelo no restrictivo. El objeto de este trabajo es ilustrar cómo el análisis de datos familiares puede producir resultados falsos si se ignora
el ambiente familiar compartido (véase texto).
 15.3 I ANÁLISIS DE ENLACE DE CARACTERES COMPLEJOS
los componentes del síndrome son los que se cosegregan en un pa­
trón mendeliano. Este control de la realidad no existe en los pade­
cimientos no mendelianos. Se realizan grandes esfuerzos, sobre
todo en enfermedades psiquiátricas, con objeto de establecer cate­
gorías diagnósticas que sean válidas, en el sentido de que dos inves­
tigadores independientes concuerden en si se aplicó o no cierta
designación a un paciente determinado. Pero una designación diag­
nóstica puede ser válida sin ser biológicamente significativa. Por lo
general los criterios diagnósticos son arbitrarios desde el punto de
vista biológico, sobre todo en fenotipos psiquiátricos y conductua-
les. Adherirse a ellos permite que estudios diferentes sean compara­
bles, pero no garantiza que se esté haciendo la pregunta genética
adecuada.
Análisis de enlace en familias “casi mendelianas”
Una vez que los criterios diagnósticos se acuerdan, un método pa­
ra el análisis genético es buscar un subgrupo de familias en las que
el padecimiento se segregue en una forma casi mendeliana. El aná­
lisis de segregación se utiliza para definir los parámetros de un mo­
delo genético en estas familias, que luego se emplea en un análisis
de enlace estándar (paramétrico). Estas familias pueden surgir en
tres formas:
► es probable que cualquier enfermedad compleja sea heterogénea,
de manera que la reunión de familias bien puede incluir alguna
con padecimientos mendelianos no diferenciables en cuando a
fenotipo de la mayoría no mendeliana;
► las familias casi mendelianas puede representar casos en los que,
por azar, la mayoría de las personas ya presenta muchos deter­
minantes de la enfermedad, de modo que el balance se tipifica
por la segregación mendeliana de sólo uno de los múltiples fac­
tores de susceptibilidad;
► el patrón “casi mendeliano” puede ser falso: apenas agregaciones
al azar de personas afectadas dentro de una familia.
En el primer caso tiene un valor intrínseco valioso identificar el
subgrupo mendeliano, pero no siempre arroja alguna luz sobre las
causas de la enfermedad no mendeliana. Esto ocurrió con el cáncer
de mama (sección 15.6.1) y la enfermedad de Alzheimer (sección
15.6.3). En el segundo caso, los locus mapeados también son fac­
tores para el padecimiento común no mendeliano —la enfermedad
de Hirschsprung (sección 15.6.2) proporciona ejemplos-. Por últi­
mo el trabajo inicial en la esquizofrenia ejemplificó el tercer caso al
proporcionar una calificación de seis que en la actualidad suele
considerarse sospechosa (véase Byerley, 1989). Este desastre fue su­
ficiente para persuadir a la mayoría de los investigadores a cambiar
al análisis no paramétrico.
15.3.2 El análisis de enlace no paramétrico no requiere
un modelo genético
Los métodos de análisis de enlace sin modelo o no paramétricos
buscan alelos o segmentos cromosómicos que los individuos afec­
tados comparten. Algunas de las ideas básicas que sustentan estos
métodos se establecieron en tres artículos de Neil Risch en 1990
443
(Risch 1990a, b, c). Los métodos de segmento compartido pue­
den emplearse dentro de familias (sección 15.3.3) o en poblaciones
completas (sección 15.4).
Es importante distinguir los segmentos idénticos por descen­
diente (IPD) de los idénticos por estado (IPE). Los alelos IPD
son copias demostrables del mismo alelo ancestral (casi siempre paren-
tai). Los alelos IPE se ven idénticos, y de hecho pueden serlo, pero su
ancestro común no es demostrable y por consiguiente deben tratar­
se matemáticamente en términos de frecuencia de población en lu­
gar de probabilidad mendeliana de herencia del ancestro común
definido. La figura 15-2 ilustra la diferencia. Para alelos muy raros
no son probables dos orígenes independientes, de manera que IPE
por lo general implica IPD, pero esto no es cierto para alelos comu­
nes. Los microsatélites multialelos son más eficientes que los mar­
cadores de dos alelos para definir IPD y los haplotipos multialelos
multilocus son aun mejores porque cualquier haplotipo puede ser
raro. El análisis de segmento compartido puede efectuarse con da­
tos de IPE o IPD, a condición de que se utilice el análisis apropia­
do. El IPD es el más potente, pero requiere muestras de más
familiares. En una genealogía compleja con varias personas afecta­
das puede emplearse información del marcador para calcular la
probabilidad de que un par de familiares afectados comparta haplo­
tipos idénticos por descendiente (IPD) (Arnos y cois., 1990).
15.3.3 Análisis de segmento compartido en familias:
análisis de par de hermanos afectados y
miembro de la genealogía afectada
Si se toma un segmento cromosómico al azar, se espera que pares
de hermanos compartan 0 , 1 o 2 haplotipos parentales con fre­
cuencias de /4, /2 y U respectivamente. Sin embargo, si ambos
hermanos están afectados por una enfermedad genética, entonces
es probable que compartan cualquier segmento cromosómico que
porte el locus de la enfermedad. Si todas las personas con la en­
fermedad llevan un alelo mutante a este locus, entonces compar­
tirán cuando menos un haplotipo parental si la enfermedad es
- o
■O
A ,1 A.
m2 A1 A3 Ai A2 a2a 3
A1 A3 A1 A2 Ai A3 A1 A2
Fig. 15-2. identidad por estado (IPE) e identidad por descendiente
(IPD ).___________________________________ __
Los dos pares de hermanos comparten el alelo A,. El primer par de her­
manos tiene dos copias independientes de A^ (IPE pero no IPD): el segun­
do par de hermanos comparte copias del mismo alelo paterno A, (IPD
La diferencia sólo es aparente si se conocen los genotipos parentales.
444 j CAPÍTULO QUINCE ! MAPEO E IDENTIFICACIÓN DE GENES
AD
BC
BD
Fig. 15-3. Análisis de par de hermanos afectados.
A) Por segregación aleatoria los pares de hermanos comparten 0,1 o 2 haplotipos parentales 1/4,1/2 y 1A de las veces respectivamente. B) pares de hermanos
que son afectados por un padecimiento dominante comparten una o dos copias del segmento cromosómico parental importante. C) Pares de hermanos
afectados ambos por un padecimiento recesivo necesariamente comparten los dos haplotipos parentales para el segmento cromosómico importante.
El haplotipo arriba del azar compartido por pares de hermanos afectados identifica segmentos cromosómicos que contienen genes susceptibles.
dominante y dos si es recesiva (fig. 15-3). Esto permite una for­
ma simple de análisis de enlace. Los pares de hermanos afecta­
dos (PHA) se tipifican para marcadores y se buscan regiones
cromosómicas en las que la repartición es mayor que las relacio­
nes al azar 1:2 :1 de compartir 2, 1 o O haplotipos idénticos por
descendiente. Si los pares de hermanos se estudian sólo para iden­
tidad por estado, la repartición esperada en la hipótesis nula debe
calcularse como una función de las frecuencias génicas. El análisis
PHA puede realizarse sin hacer ninguna suposición respecto a la
genética de la enfermedad y suele ser más fácil reunir pares de her­
manos afectados que familias extensas. El análisis de múltiples
puntos se prefiere sobre el análisis de punto único porque extrae
con mayor eficiencia la información acerca de la repartición IPD a
través de la región cromosómica. El programa M A P M AKER /SlBS de
Kruglyak y Lander (1995) se utiliza con amplitud para analizar da­
tos de PHA de múltiples puntos y proporciona calificaciones lod
no paramétricas (LNP).
Un inconveniente del análisis de PHA es que las regiones can­
didato que identifica suelen ser imposiblemente grandes para clo­
nación posicional. Pocas recombinantes separan hermanos, de tal
manera que comparten segmentos cromosómicos parentales gran­
des ya sea por azar o por una susceptibilidad compartida. Es crucial
que el análisis complejo de enfermedad no tiene procesos análogos
al juego final del mapeo mendeliano, en el que se estudian marca­
dores cada vez más cercanos hasta que ya no hay más recombinan­
tes. Si un factor de susceptibilidad no es necesario ni suficiente para
la enfermedad, entonces no todos los pares de hermanos afectados
compartirán el segmento cromosómico importante. Más aún, pa­
res de hermanos comparten muchos segmentos por azar. No obs­
tante, a su causa de sencillez y potencia, el mapeo de PHA es uno
de los principales medios para buscar genes que confieren suscepti­
bilidad a enfermedades frecuentes no mendelianas (véase sección
15.6). Sham y Zhao detallaron las matemáticas de los análisis de
PHA (véanse Lecturas adicionales).
Programas como G E N E H U N TE R (sección 13.6.2) extienden el
análisis de segmento compartido a otras relaciones. Los progra­
mas calculan la extensión a la que los familiares afectados com­
AD
parten alelos idénticos por descendiente y comparan el resultado
a través de todos los miembros de la genealogía afectados con la
hipótesis nula de segregación mendeliana simple (los marcadores
deben segregarse de acuerdo con relaciones mendelianas a menos
que la segregación por enlace o relación se distorsione). La com­
paración puede usarse para computar una calificación lod no pa-
ramétrica.
15.3.4 Los umbrales de significancia son una
consideración importante en el análisis
de enfermedades complejas
Si bien la mayor parte de los genes mendelianos que se localiza­
ron mediante calificaciones lod significativas se clonó después
con éxito, la historia del análisis de enfermedades complejas se
caracteriza por una sucesión de resultados no reproducibles. Ca­
da una de las regiones candidato definidas en estudios indepen­
dientes de la misma enfermedad coincidieron muy rara vez.
Risch y Botstein (1996) delinearon una historia típica, la de la
psicosis maniacodepresiva, y Altmüller y colaboradores (2001)
reafirmaron el concepto en un metaanálisis de 101 estudios de
enlace en 31 enfermedades complejas. Cualquiera que sea la cau­
sa exacta de estos problemas en casos individuales, una amenaza
clara es la dificultad para decidir cuándo considerar significativos
los resultados.
Los problemas para decidir umbrales apropiados de significancia
son en parte técnicos y en parte filosóficos. La distinción entre sig­
nificancia de punto sensato (o nominal) y de extensión del geno-
ma ya se comentó (sección 13.3.4).
► el valor p del punto sensato de una estadística de enlace es la
probabilidad de exceder el valor observado en la posición es­
pecificada en el genoma, si se asume la hipótesis nula de no
enlace;
► el valor p de extensión del genoma es la probabilidad de que
el valor observado se exceda en cualquier parte del genoma, con
base en la hipótesis nula de no enlace.
 15.4 ESTUDIOS DE ASOCIACIÓN Y DESEQUILIBRIO DE ENLACE
£n un estudio del genoma completo el umbral de significancia
irropiado es un valor en el que la probabilidad de encontrar una
positiva falsa en cualquier pa rte d el genom a es de 0.05. Argumentos
Teóricos (Lander y Kruglyak, 1995) sugieren umbrales de califica­
ron lod de la extensión del genoma de 3.6 para pruebas IPD de
rires de hermanos afectados y de 4.0 para pruebas IPE. Los estu­
dios de enfermedades complejas suelen estimar sus umbrales de sig-
rrficancia mediante simulación. Por lo general se generan 1 000
-tricas de la reunión de familias mediante computadora con geno-
rros marcadores aleatorios, pero basados en frecuencias de alelos,
Tracciones de recombinación, etc., correctas. Se efectúa una bús-
qreda de la totalidad del genoma en cada grupo de datos simulado
v se observa la calificación lod máxima. El umbral de significancia
rt .i extensión del genoma se toma como una calificación que me­
ros de 5% de las réplicas excede.
En respuesta al fracaso frecuente para replicar localizaciones
ir.rmadas de genes de susceptibilidad a enfermedad, Lander y
Kruglyak (1995) propusieron la serie de umbrales del cuadro
15-6. Obsérvese que un valor p de punto sensato de 1 X 10~
- o equivale a una calificación lod de 5.0 -las dos medidas no
son iguales:
► una calificación lod de 5 significa que los datos son 105 veces
más probables en la hipótesis de enlace determinada que en la
hipótesis nula;
► un valor p de 10~5 significa que la calificación lod indicada só­
lo se excederá una vez en 105 veces, con base en la hipótesis
nula.
?ira una discusión respecto a los criterios de Lander y Kruglyak,
•. jase la sección de correspondencia del número de abril de 1996 de
Sature Genetics.
15.4 Estudios de asociación y
desequilibrio de e n lace
Asociación no es un fenómeno específicamente genético; es sólo
ma afirmación estadística respecto a la coocurrencia de alelos o fe-
roripos. El alelo A se asocia con la enfermedad D si la persona que
Cuadro 15-6. Criterios sugeridos para informar enlace (Lander y Kruglyak, 1995). Las cifras para los valores p y las
calificaciones lod son de Altmüller y colaboradores (2001).
Categoría de enlace Número esperado de ocurrencias por azar
en una examen del genoma completo
Sugestiva 1 7 x 1 0 ^ -3 x 10“5
Significativa 0.05
Altamente significativa 0.001
Confirmada 0.01 en un estudio de una región candidato
que dio un enlace significante en un estudio
independiente previo
445
tiene D también tiene A con una frecuencia mucho mayor (o tal
vez menos frecuente) de lo que podría predecirse a partir de las fre­
cuencias individuales de D y A en la población. Por ejemplo, HLA-
DR4 se encuentra en 36% de la población británica general pero
en 78% de las personas con artritis reumatoide.
15.4.1 ¿Por qué suceden asociaciones?
Una asociación de población puede tener múltiples causas posibles,
no todas genéticas:
► causa directa: tener un alelo A torna a la persona susceptible a
la enfermedad D. Es posible que la posesión de A no sea nece­
saria ni suficiente para que una persona desarrolle D, pero au­
menta la probabilidad;
► selección natural: podría ser más probable que las personas que
tienen la enfermedad D sobrevivan y tengan niños si también
tienen el alelo A;
► estratificación de población: la población contiene varios
subgrupos genéticamente distintos y tanto la enfermedad co­
mo el alelo A son en particular frecuentes en un subgrupo.
Lander y Schork (1994) dan el ejemplo de la asociación en el
área de la Bahía de San Francisco entre HLA-A1 y la capaci­
dad para comer con palillos chinos. HLA-A1 es más frecuen­
te entre chinos que entre caucásicos;
► error tipo 1: por lo general los estudios de asociación valoran
un número grande de marcadores para asociación con una en­
fermedad. Inclusive sin ningún efecto verdadero, 5% de los
resultados será significativo en el nivel p = 0.05 y 1% en el ni­
vel p = 0.01. Los valores p crudos necesitan corregirse para el
número de preguntas hechas (sección 15.4.4). Antes los inves­
tigadores a menudo aplicaban correcciones inadecuadas e in­
formaban asociaciones que no pudieron replicarse en estudios
subsecuentes;
► desequilibrio de enlace (DE): el objetivo de los estudios de
asociación en la enfermedad compleja es descubrir asociaciones
causadas por DE entre el marcador y la enfermedad. El fenó­
meno de DE se comenta más adelante y el recuadro 15-2 des­
cribe la manera de medir tal desequilibrio.
Límites de valores Límites de calificaciones
p aproximados lod aproximadas
2 .2 -3 5
2 x 1 0-5—4 x 10“7 3,6-5.3
< 3 x 10-7 > 5 .4
446 CAPÍTULO QUINCE MAPEO E IDENTIFICACIÓN DE GENES

Recuadro 15-2. Mediciones de desequilibrio de enlace

Si dos locus tienen alelos A,a y B,b con frecuencias pAi pa, pB y pb, hay
cuatro posibles haplotipos AB, Ab, aB y ab. Asúmase que las frecuencias
de los cuatro haplotipos sean pAB, pAb, paB y pab. Si no hay desequilibrio
de enlace (DE), pAB = pApB, etc. El grado de partida desde esta asocia­
ción aleatoria puede medirse mediante D = pABpab- pabpaB.
Como una medición del DE, los D adolecen de la propiedad de que su va­
lor absoluto máximo depende tanto de las frecuencias génicas en los dos
locus como de la extensión del desequilibrio. Entre las mediciones prefe­
ridas se encuentran:
► O' = (PAB-PAPsI/Dmáx. donde Dmáx es el valor máximo de |pAB- p ApB|
posible con las frecuencias de alelos dadas.
► A 2 = (P a b P a P b )2/ (P A P a P B P b )
D' es la que más se utiliza. Varia entre 0 (no DE) y ± 1 (asociación com ­
pleta), y depende menos de D en las frecuencias de alelos. Como regla
empírica, D' > 0.33 a menudo se considera como el nivel de umbral de
DE arriba del cual serán aparentes asociaciones en el tamaño usual del
grupo de datos. La proliferación de medidas alternativas sugiere que nin­
guna es ideal (Devlin y Risch, 1995). Estas medidas se desarrollaron en
particular para pares de locus, en tanto que la mayor parte de los estu­
dios del genoma completo usan análisis de múltiples puntos. Estos datos
deben observarse para haplotipos conservados y no sólo analizarse para
DE a nivel de pares.

15.4.2 Asociación es un principio muy distinto de brá reducido el segmento cromosómico compartido a una región
enlace, pero donde la familia y la población se muy pequeña. Sólo se compartirán los alelos en locus estrechamen­
fusionan, el enlace y la asociación se funden te enlazados al locus de susceptibilidad a la enfermedad. Para que un
locus muestre una fracción de recombinación theta (0) con el locus
En principio enlace y asociación son fenómenos por completo dis­ de susceptibilidad, una proporción 0 de cromosomas ancestrales
tintos. Enlace es una relación entre locus, pero asociación es una re­ perderá la asociación cada generación y una proporción (1-0) la re­
lación entre alelos o fenotipos. Enlace es una relación específicamente tendrá. Después de n meiosis, una fracción (1—0)n de los cromoso­
genética en tanto que asociación, como se mencionó, es sólo una mas conservará la asociación. La media vida de DE entre locus
observación estadística que puede tener varias causas. separados 1 cM y 2 cM es de 69 y 34 meiosis respectivamente, ya
El enlace no produce por sí mismo ninguna asociación en la po­ que (0.99)6"1= (9.98)34 = 0.5. Antes se calculó que los ancestros
blación general. Por ejemplo, aunque el locus marcador STR45 es­ de dos personas británicas “no relacionadas” se fusionaron por
tá enlazado con el locus de distrofina, la distribución de los alelos completo 22 generaciones atrás. Ese cálculo se simplificó de mane­
STR45 en un grupo de pacientes con distrofia de Duchenne no re­ ra gruesa porque se supuso que toda la población británica fue una
lacionados es justo la misma que en la población general. Sin em­
bargo, dentro de una familia en la que una mutación de distrofina
está segregándose, cabría esperar que la persona afectada compar­
tiera el mismo alelo STR45 porque los locus están enlazados de ma­
nera estrecha. Por consiguiente el enlace crea asociaciones dentro de
familias, pero no entre personas no relacionadas. No obstante, si dos
personas supuestamente no relacionadas con la enfermedad D en
realidad heredaron su enfermedad de un ancestro común distante,
también pueden tender a compartir alelos ancestrales particulares
en locus enlazados en forma cercana a D. En la sección 13.5.2 se
muestran ejemplos de este fenómeno.
Los ancestros comunes son importantes porque todas las perso­
Fecha
nas los tienen. Si se retrocede lo suficiente, todos los humanos es­
tán relacionados. En la medida en que una población es una familia
C la v e
extendida, han de existir asociaciones a nivel de la población que se
deben a DE entre genes de susceptibilidad a enfermedades ances­ • — • Núm. de ancestros (generación de 25 años)
trales y marcadores enlazados de modo cercano. Un cálculo grueso ------- Población británica (aproximada)
sugiere que en el Reino Unido dos personas “no relacionadas” com­
partirían ancestros no más de 22 generaciones antes. Si son por
completo exogámicas, tendrán 2 = 4 millones de ancestros cada Fig. 15-4. Fusión en un fondo común géníco.
uno en ese tiempo. Veintidós generaciones representan alrededor
de 500 años y en 1500 la población británica se acercaba a 4 millo­ Una persona por completo exogámica tiene 2" ancestros hace n gene­
raciones. Si toda la población británica fuera del todo exogámica, dos
nes (fig. 15-4).
personas actuales “ no relacionadas" compartirían todos los mismos
Supóngase que cada una de las dos personas “no relacionadas”
ancestros en 1500. En realidad, por supuesto, la población no es com­
hereda un alelo de susceptibilidad de enfermedad de su ancestro co­
pletamente exogámica y las dos personas tendrán una superposición
mún. Durante las múltiples generaciones y las muchas meiosis que
potente pero no fondos comunes idénticos de ancestros en 1500.
las separaron de su ancestro común, la recombinación repetida ha­
 15.4 I ESTUDIOS DE ASOCIACIÓN Y DESEQUILIBRIO DE ENLACE 44-

Fíg. 15-5. Desequilibrio de enlace alrededor del locus de la enfermedad de Huntington.

S10, S125, etc. son abreviaturas de los marcadores de DNA D4S10, D4S125, etc., que se muestran en sus posiciones en el mapa en relación con el locus HD.
La distancia total representada es de 2 500 kb. Para algunos locus, existen varios PRLF diferentes, que en ocasiones muestran una asociación alélica muy
distinta, por ejemplo, marcador S95 (véase texto). Tomado de Krawczak y Schmidtke (1998) DNA Fingerprinting, 2a ed. BIOS Scientific, Publishers, Oxford.

unidad libremente interendogámica durante los últimos 500 años.
Sin embargo, proporciona un primer estimado grueso de que las
asociaciones alélicas que reflejan segmentos ancestrales comparti­
dos pudieran comenzar a notarse para locus dentro de 1 cM entre
sí en la población británica. Cálculos más complicados utilizan una
distribución Poisson de acontecimientos de recombinación e incor­
poran suposiciones respecto a la estructura y la historia de la pobla­
ción (Kruglyak, 1999). Un determinante fundamental es el tiempo
de coalescencia, el número de generaciones anteriores al ancestro
compartido más reciente (véase recuadro 12-6). Sin embargo, la va-
rianza fortuita amplia y la confiabilidad en detalles desconocidos de
la historia de la población determinan que inclusive los cálculos
más elaborados no sean seguros. Lo que se requieren son datos y en
fecha reciente ha sido posible disponer de cantidades crecientes de
datos reales.
15.4.3 Muchos estudios muestran islotes de
desequilibrio de enlace separados por
puntos críticos de recombinación
El gen de la fibrosis quística se identificó ascendiendo un gradien­
te de DE hasta llegar a un máximo (sección 13.5.2). Sin embargo,
la investigación de otras enfermedades mostró pronto que los gra­
dientes uniformes de DE eran la excepción más que la norma. En
la enfermedad de Huntington (fig. 15-5) es posible observar casos
de una asociación potente con un marcador más distante y una aso­
ciación débil con un marcador más cercano. Aun más curioso re­
sulta que el marcador D4S95, enlazado en forma cercana al locus
HD, detecta PRLF con tres enzimas, Tacj[, M bol y Accl. Los resul­
tados confirmados en varios estudios independientes mostraron
una asociación potente con un alelo particular Accl y uno particu­
lar Mbol, pero ninguna asociación con cualquier alelo Taq\. Estos
patrones desconcertantes deben reflejar una historia compleja, con
acontecimientos de recombinación al azar en poblaciones fundado­
ras pequeñas y tal vez un origen más reciente de algunos polimor­
fismos marcadores que ciertas mutaciones de enfermedad.
En fecha reciente se publicaron varios estudios sistemáticos de
DE marcador-marcador a través de segmentos cromosómicos im­
portantes (Gabriel y cois., 2002b y las referencias que incluye). Un
hallazgo frecuente es que el DE no declina de manera uniforme
con la distancia. Por el contrario, los cromosomas contienen una
serie de islotes de DE de relativamente largo alcance que están se­
parados con precisión entre sí (fig. 15-6). En todos los islotes pue­
den extenderse DE útiles por 50 kb (en europeos; menos en
africanos) pero aun los marcadores espaciados en forma muy cer­
cana en diferentes islotes no muestran DE entre sí. El examen de­
tallado de unas cuantas regiones confirmó que los límites de islotes
son en realidad puntos críticos de recombinación. Es posible que
ello muestre el mosaico de segmentos cromosómicos ancestrales
que caracteriza la herencia compartida del hombre. Si fuera posible
definir la estructura de DE del islote de una población a través del
genoma completo, entonces sería factible identificar un grupo de
marcadores (“SNP-hap”) para establecer haplotipos en cada islote
que después podrían estudiarse en cuanto a su vínculo con cual­
quier enfermedad. Se sugiere que la mayor parte de los islotes sólo
tendrá cuatro a seis haplotipos comunes diferentes en cualquier po­
blación (Gabriel y cois., 2002b). Se encuentran en curso esfuerzos a
gran escala para definir estas estructuras mediante el mapeo exten­
so marcador-marcador (véase www.genome.gov/10005336).
448 j CAPÍTULO QUINCE MAPEO E IDENTIFICACIÓN DE GENES

15.4.4 Diseño de estudios de asociación
La búsqueda de asociaciones en la población es una opción atrac­
tiva para identificar genes de susceptibilidad a enfermedad. Los
estudios de asociación son más fáciles de conducir que los análi­
sis de enlace porque no se requieren familias con múltiples casos
ni estructuras familiares especiales. En algunas circunstancias la
asociación también puede ser más potente que el enlace para de­
tectar alelos de susceptibilidad débil (véase más adelante). Sin
embargo, es importante pensar con cuidado respecto al diseño ex­
perimental.
Elección del método para estudiar la asociación
Aunque la elección del grupo testigo es crucial en cualquier estudio
de asociación, por mucho que se intente equiparar los testigos con
los casos resulta imposible estar por completo seguro de no haber
pasado por alto nada. En consecuencia, cuando se encuentra una
asociación, siempre existe la preocupación de que se deba a testigos
equiparados de modo inadecuado y no a desequilibrio de enlace
con un locus de susceptibilidad. La combinación de esta incerti-
dumbre y una plétora de resultados no factibles de reproducirse (en
especial para asociaciones HLA-enfermedad) condujeron a que los
genetistas humanos dejaran de preferir los estudios de casos y testi­
gos durante el decenio de 1980.
En fecha reciente se desarrolló un grupo de métodos que evita
en gran parte este problema. En conjunto, estos métodos pueden
denominarse estudios de asociación con testigos internos. El
método más popular es la prueba de desequilibrio de transmi­
sión (PDT; Schaid, 1998). La PDT se inicia con parejas que tie­
nen uno o más descendientes afectados. No tiene importancia si
cada padre está afectado o no. Para estudiar si el alelo marcador
M, se relaciona con la enfermedad, se eligen los padres que son
heterocigotos para M ¡. La prueba sólo compara el número de ca­
sos en los que este padre transmite a la descendencia afecta­
da con el número en el que transmite su otro alelo (recuadro
15-3). La estratificación de la población no afecta el resultado.
Se desarrolló una PDT extendida (PDTE; Sham y Curtís, 1995)
a fin de manejar datos de marcadores multialélicos como micro-
satélites. La PDT puede utilizarse cuando sólo se dispone de un
padre, pero ello suele sesgar el resultado (Schaid, 1998). Cuan­
do no se cuenta con padres (un problema frecuente en las enfer­
medades de inicio tardío), en una variante alternativa, la PDT de
hermanos, se buscan diferencias en las frecuencias del alelo mar­
cador entre los hermanos afectados y los no afectados (Spielman
y Ewens, 1998).
Se discute un poco si la PDT es una prueba de enlace o de aso­
ciación. Ya que pregunta respecto a alelos y no locus, es sobre todo
una prueba de asociación. El alelo asociado puede ser en sí mismo
un factor de susceptibilidad o encontrarse en desequilibrio de enla­
ce con un alelo de susceptibilidad en un locus cercano. La PDT no
puede detectar enlace en ausencia de desequilibrio -un punto que
debe recordarse cuando se consideran esquemas para emplearla en
exploraciones del genoma completo.
En la actualidad se prefieren de nuevo los estudios convencio­
nales de casos y testigos como una alternativa a la PDT. Tales estu­
dios necesitan menos muestras que la PDT y son más fáciles de
realizar para enfermedades de inicio tardío en las que rara vez se
dispone de los padres. Se piensa que el riesgo de asociaciones falsas
debidas a estratificación de la población se ha exagerado y es posi-

WTC82P:‘

WTC16P'
7WTC7P‘
WTC72P:
WTC75P‘
WTC58Pj
VTC1Q4P=
¡WTC81P:
VTC110P!
¿WTC91P5

TC49WP:
‘
WTC21P-

¡WTC96P-
IWTC12P-

¡WTC89P-

¡9WTC1P-
¡WTC53PI.

Fig. 15-6. Patrones de desequilibrio de enlace en dos regiones cromosómicas.

En cada cuadro está representado el mismo grupo de marcadores, en orden cromosómico, en los ejes X y Y. El color de la coordenada cartesiana para
cada par de marcadores muestra la potencia de DE a nivel de pares según la escala en el centro. El programa GOLD llena el espacio entre puntos mediante
interpolación. Si el DE fuera sólo una función de distancia, cada cuadro mostrarla un color rojo uniforme en la diagonal, sombreando a través del azul
uniforme por puntos muy alejados en la diagonal. Obsérvese el patrón básico de islotes aislados de DE, pero con un gran cúmulo de detalles complicados.
Panel izquierdo, parte del cromosoma 2; panel derecho, parte del cromosoma 13. Cortesía del doctor William Cookson, Oxford.
 15.4 I ESTUDIOS DE ASOCIACIÓN Y DESEQUILIBRIO DE ENLACE
Recuadro 15-3. P ru eb a de desequilibrio de transmisión (PDT) para determinar si el alelo marcador M, se
re la cio n a con una enfermedad
1) Se indagan los probandos.
2) Los probandos y sus padres se tipifican para el marcador.
3) Los padres que son heterocigotos para el alelo marcador M, se selec­
cionan. Pueden estar o no afectados.
ble revisar los datos para posibles efectos de la estratificación si se
comparan las frecuencias de alelo en una gama de locus no enlaza­
dos en los casos y los testigos (Pritchard y Rosenberg, 1999). El di­
seño óptimo del estudio, según Risch y Teng (1998), consiste en
usar pares de hermanos afectados como casos con dos testigos no
relacionados.
Cualquiera que sea la prueba de asociación que se utilice, es im­
perativo abordar el problema de múltiples pruebas. Una corrección
completa Bonferroni (en la que el valor umbral p se divide por N,
el número total de preguntas hechas) es demasiado conservadora
para valores grandes de N. El umbral preferido de significancia es
p' = 1 —(1 —p )N(Emahazion y cois., 2001). Cardón y Bell (2001)
discuten con detalle no matemático algunos problemas generales del
diseño de los estudios de asociación; véase Lecturas adicionales.
Selección de marcadores
Los marcadores de elección para estudios de asociación son los po­
limorfismos de nucleótido único (SNP, recuadro 13-1), por dos
razones:
► a diferencia de los microsatélites, son suficientemente numero­
sos (> 1 por kb en promedio) para definir islotes de DE y pue­
den calificarse por varios métodos de rendimiento ultra alto
(sección 18.4.2).
► los SNP son menos mutables que los microsatélites. Si es cier­
to, como suele sugerirse, que la susceptibilidad a enfermedades
frecuentes está determinada sobre todo por variantes de DNA
antiguas comunes, sería necesario utilizar marcadores que son
estables durante una escala de tiempo prolongada para identifi­
car los haplotipos ancestrales.
Para regiones cromosómicas y poblaciones en las que el patrón de
desequilibrio de enlace se conoce (como las que se ilustran en la fig.
15-6), se seleccionarían marcadores para definir haplotipos en cada
islote de desequilibrio. Si no se cuenta con tal conocimiento, todo
es conjetura. Cuanto más antiguo es un alelo de enfermedad en la
historia humana mayor es la densidad de SNP necesarios para de­
tectarla (Kruglyak, 1999; Wright y cois., 1999). Algunos investiga­
dores apoyan los SNP localizados dentro de genes y en especial los
que se encuentran en secuencias de codificación (cSNP) porque
argumentan que es más probable que estas variantes sean las deter­
minantes de susceptibilidad reales. Es cierto que en la actualidad
nadie conoce la estrategia óptima para seleccionar un marcador.
Diversas enfermedades en distintas poblaciones tienen diferentes
449
Asúmase que a es el número de veces que un padre heterocigoto trans­
mite M, a la descendencia afectada y bel número de ocasiones que se
transmite el otro alelo.
La estadística de la PDT es ( a - b ) 2/(a + b ). Ésta tiene una distribución \ 2
con 1 grado de libertad, a condición de que los números sean razonable­
mente grandes.
historias y es posible que cada estudio individual requiera una es­
trategia a la medida.
Elección de la población de estudio
Una pregunta contenciosa es si los estudios de asociación serán
más fructíferos en poblaciones aisladas. Se espera que las poblacio­
nes derivadas de un número pequeño de fundadores muestren una
diversidad de haplotipos limitada y valores más altos de desequili­
brio de enlace. El concepto de que será más fácil identificar alelos
que causan enfermedad en locus de susceptibilidad en poblaciones
aisladas se basa en el proyecto de DeCode en Islandia y proyectos
similares en alguna otra parte (Gulcher y cois., 2001). Dichas po­
blaciones bien pueden mostrar desequilibrio potente y de largo al­
cance alrededor del locus para las enfermedades mendelianas raras
que caracterizan a la población (p. ej., enfermedades “finlandesas”
en Finlandia), pero ese desequilibrio sólo existe en cromosomas
que llevan el alelo de enfermedad, que tal vez se derivaron todos
de un ancestro compartido único. Para variantes más frecuentes,
datos empíricos no muestran un desequilibrio mucho mayor (Va-
rilo y cois., 2000; Pritchard y Przeworski, 2001). Puede ser más im­
portante disponer de un gran número de posibles sujetos con
buenos expedientes médicos que la estructura de la población -lo
que constituye el pensamiento que respalda el proyecto BioBank
en el Reino Unido, que pretende reunir datos médicos, del estilo
de vida y del DNA de 500 000 británicos de 45 a 69 años de edad
y seguir su salud en forma prospectiva.
Las poblaciones del Africa subsahariana muestran una diver­
sidad genética más alta que las europeas, compatible con la hipó­
tesis de los orígenes humanos “fuera de Africa”, y datos limitados
sugieren que el desequilibrio de enlace es de corto alcance en
africanos (Reich y cois., 2001). Por otra parte, poblaciones deri­
vadas mediante mezcla reciente pueden mostrar desequilibrio de
enlace muy potente (p. ej., las poblaciones Lemba, un híbrido
Bantu-semítico estudiado por Wilson y Goldstein, 2001). En
teoría, si las dos poblaciones fuente tuvieran incidencias muy di­
ferentes de una enfermedad común, la población mixta podría
utilizarse para mapear los determinantes con bastante eficiencia
(como en un cruzamiento de ratón), pero la idea aún no se estu­
dia en la práctica. En resumen, todavía no se aclara si alguna po­
blación presenta ventajas especiales para estudios de asociación
en enfermedades complejas. Para excelentes comentarios de estos
problemas, véanse Wright y colaboradores (1999) y Peltonen y
colaboradores (2000).
450 s CAPÍTULO QUINCE MAPEO E IDENTIFICACIÓN DE GENES
¿Genotipos o haplotipos?
Cuando se estudian individuos en lugar de familias, los datos cru­
dos consisten en genotipos, pero los análisis de asociación requie­
ren haplotipos. Estos últimos se deducen a partir de los genotipos
mediante un análisis por computadora de expectación-maximiza-
ción (Long y cois., 1995), pero en principio resulta imposible
efectuar lo anterior con 100% de seguridad; el único medio por
completo seguro es tipificar híbridos de células somáticas que
contienen cromosomas haploides (Douglas y cois., 2001). Algu­
nos argumentan que éste es un error fundamental en el diseño de
los estudios de asociación actuales a gran escala. Los optimistas
piensan que los estudios funcionarán porque casi todos los islotes
de DE (sección 15.4.3) sólo comparten un número pequeño de
haplotipos, que pueden identificarse en forma adecuada y segura
a partir de datos de genotipo. Será interesante observar quiénes
están en lo correcto.
Enlace comparado con asociación: practicando el juego
de números
Un artículo importante de Risch y Merikangas (1996) sugirió que
la asociación puede ser más potente que el enlace para detectar ale-
los de susceptibilidad débil. Los autores compararon la potencia del
enlace (par de hermanos afectados, PHA) y la prueba de asociación
(PDT) con objeto de identificar un marcador enlazado en forma
estrecha a un locus de susceptibilidad a enfermedad. Calcularon el
número de tríos de PHA o de PDT (niños y ambos padres afecta­
dos) necesarios para distinguir un efecto genético de la hipótesis
nula, con una potencia y un nivel de significancia determinados. El
recuadro 15-4 ilustra su método (para detalles más amplios consúl­
tese el artículo original) y el cuadro 15-7 muestra los resultados tí­
picos de la aplicación de su fórmula. La conclusión es clara. El
análisis de PHA requeriría muestras grandes no factibles para de­
Recuadro 15-4. Tamaños de muestras necesarios para encontrar un locus de susceptibilidad a una enfermedad
por el estudio del genoma completo mediante el uso de pares de hermanos afectados (PHA) o
la prueba de desequilibrio de transmisión (PDT)
Risch y Merikangas (1996) calcularon los tamaños de muestras necesa­
rios para distinguir un efecto genético de la hipótesis nula con potencia
(1-(3) y nivel de significancia alfa. Aunque este recuadro resume sus fór­
mulas y ecuaciones, debe consultarse el artículo original para las deriva­
ciones y los detalles.
Una pieza estándar de estadística índica que el tamaño necesario de la mues­
tra M está determinado por (Zq -o -Z ! _b)2/ Ij.2, donde Z se refiere a la des­
viación normal estándar. La n media y la varíanza o-2 se calculan como
funciones de la frecuencia del alelo de susceptibilidad (p) y el riesgo re­
lativo 7 conferido por una copla del alelo de susceptibilidad. El modelo
asume que el riesgo relativo para que una persona porte dos alelos de
susceptibilidad es y 2, que el marcador utilizado siempre sea informativo
y que no haya recombinación con el locus de susceptibilidad.
Para la PHA, el alelo esperado que comparte el locus de susceptibilidad
es determinado por V = (1 + w ) /( 2 + w ), donde w = [pq(-y—1 )2/(p -/+ q ).
tectar el locus de susceptibilidad que confiere un riesgo relativo me­
nor cercano a tres, en tanto que la PDT podría detectar alelos que
dan un riesgo relativo menor de dos con tamaños de muestras ma­
nejables. Por cualquiera de los métodos sería muy difícil encontrar
alelos de susceptibilidad que confieren un riesgo relativo menor de
1.5. Sin embargo, cabe señalar que su resultado incorpora varias su­
posiciones -en particular asume un alelo de susceptibilidad ances­
tral único en el locus de enfermedad—. Cualquier heterogeneidad
alélica degradaría con rapidez la ejecución de una prueba de asocia­
ción, en tanto que no afectaría la potencia de una prueba de enla­
ce. En la actualidad se cuenta con algunos datos que ilustran lo
anterior (sección 15.6.6).
15.4.5 Enlace y asociación: técnicas complementarias
El enlace y la asociación proporcionan datos complementarios
en muchas formas. El enlace opera en límites cromosómicos lar­
gos y puede explorar la totalidad del genoma en unos cuantos
cientos de pruebas. Un estudio típico de 250 pares de hermanos
afectados con 300 marcadores demandaría generar 1.5 a 3 X 10’
genotipos (lo que depende de que los padres se tipificaran o no).
Éste es un trabajo de unas cuantas semanas para un laboratorio
bien automatizado y consolidado. Por otra parte, los autores ob­
servaron que el desequilibrio de enlace es un fenómeno de corto
alcance, con islotes de DE de 20 a 50 kb de tamaño por lo gene­
ral. Un estudio de PDT del genoma completo de 300 tríos (ni­
ño y ambos padres afectados), incluso cuando se estudia un SNP
aislado en cada islote, requeriría 108 genotipos, si se consideran
islotes promedio de 25 kb de tamaño. Aunque las tecnologías en
surgimiento ofrecerán en poco tiempo este rendimiento, el cos­
to aún será atemorizante. Por consiguiente los estudios de aso­
ciación deben dirigirse a regiones candidato predeterminadas.
Aunque esto puede sugerirse por referencia a modelos animales o
m- = 2 Y -1 y a 2 = 4Y (1 - Y ) . El umbral de significancia en la extensión
del genoma (probabilidad de una positiva falsa en cualquier parte del ge­
noma = 0.05; las pruebas para com partir IPD) requiere una calificación
lod de 3.6, que corresponde a a = 3 x 10” 5, y Z„ = 4.014. Para una
potencia de 80% para detectar un efecto, 1 - p = 0.2 y Z ^ B = -0 .8 4 .
Para la PDT, la probabilidad de que un padre será heterocigoto para el ale­
lo en cuestión es h = pq (-y+1)/(p-y+q). P(trA), la probabilidad de que es­
te padre heterocigoto transmitirá el alelo de alto riesgo al niño afectado, es
= 7/(1 + 7 ). ¡X = Vh(7 - 1 )/(7 + 1 ), y a 2 = 1 - [h(7 - 1)2/(7 - 1 )2]. Como
se comentó, para una selección final del genoma que incluye 1 000 000 de
pruebas, a = 5 x 10"8, Z„ = 5.33 y, como antes, Z,_p = -0 .8 4 .
En el cuadro 15-7 los valores Za, Z ^ , |¿ y a 2 se utilizan para calcular ta­
maños de muestras sustituyendo en la fórmula M = {Za - a l ^ ) 2/ ^ 2. Pa­
ra la PDT la respuesta es la mitad porque cada trío padre-hijo permite dos
pruebas, una en cada padre.
 15.6 OCHO EJEMPLOS QUE ILUSTRAN EL ÉXITO VARIABLE DE LA DISECCIÓN GENÉTICA. 451

genes conocidos, de manera alternativa suele definirse mediante rán inclusive un alelo de susceptibilidad verdadera y algunos
estudios de enlace. Como se comentó, las regiones candidato de­ pacientes no. Además los principales determinantes de sus­
finidas por estudios de PHA suelen ser imprácticamente grandes ceptibilidad pueden ser diferentes en distintas poblaciones;
para clonación posicional de genes de susceptibilidad. En conse­
► la naturaleza dispersa del DE, con la coexistencia de algunas co­
cuencia el diseño natural de un estudio consiste en iniciar una
rrelaciones de largo alcance con falta de correlación de corto al­
selección de la extensión del genoma mediante enlace, tal vez en
cance, significa que a pesar de la alta resolución teórica de los
pares de hermanos afectados, y a continuación, una vez que la lo­
estudios de asociación, en realidad rara vez puede tenerse la
calización inicial se logra, reducir la región candidato por mapeo
confianza de estar buscando justo en el sitio adecuado para el
de desequilibrio de enlace.
determinante de susceptibilidad. Más aún, no hay una forma
genética de identificar el determinante verdadero entre un gru­
po de alelos que se encuentran en su totalidad en desequilibrio
15.5 Id en tificación de aleios de potente entre sí;
susceptibilidad ► es posible que las variantes genéticas que causan susceptibili­
En enfermedades mendelianas puede ser difícil encontrar el gen co­ dad a enfermedades frecuentes no sean mutaciones obvias.
rrecto, pero suele ser obvio cuando se logra el éxito. Los pacientes Aunque se conocen excepciones, las enfermedades mendelia­
tienen mutaciones ambiguas, que no se encuentran en testigos, en nas suelen deberse a mutaciones que inactivan por completo
un gen cuya posición casi siempre se definió mediante análisis de un gen, o cuando menos tienen un efecto mayor en su expre­
enlace. Para enfermedades complejas es muchísimo más difícil dis­ sión (cap. 16), y no suele ser difícil resolver si una variante de
tinguir factores de susceptibilidad verdaderos de polimorfismos de secuencia del DNA candidato lo llevaría a cabo. Es más proba­
DNA sin importancia. Hay tres razones para ello: ble que la susceptibilidad a enfermedades frecuentes dependa de
una combinación de cambios muy sutiles en la expresión de va­
► puesto que la mutación de un gen único no es necesaria ni su­ rios genes, ninguno de los cuales es patógeno en forma aislada,
ficiente para causar la enfermedad, algunos testigos presenta- y todos los cuales pueden ser muy frecuentes en la población sa­
na. La susceptibilidad puede modelarse mejor como un locus de
carácter cuantitativo (LCC, véase sección 15.6.8) que como
un factor binario (presente/ausente). Los factores de suscepti­
Cuadro 15-7. Tamaños de muestra para una potencia de bilidad pueden ser polimorfismos en DNA no codificante que
80% a fin de detectar enlace o asociación significativos en tienen cierto efecto pequeño en la actividad promotora, el em­
una búsqueda en toda la extensión del genoma. palme o la estabilidad de mRNA. Por ejemplo, el alelo
UCSNP-43 G que se relacionó con la susceptibilidad a la dia­
Análisis de PHA Análisis de PDT
betes tipo 2 (sección 15.6.5) se encuentra a profundidad den­
7 p Y N-ASP P(trA) N-TDT tro de un intrón del gen candidato y tiene una frecuencia de
0.75 en testigos no afectados.
5 0.01 0.534 2 530 0.830 747
Para un comentario meditado del problema (en el contexto de la
0.1 0.634 161 0.830 108 diabetes tipo 2) véase la revisión de Altshuler, Daly y Kruglyak
0.5 0.591 355 0.830 53 (2000).
3 0.01 0.509 33 797 0.750 1 960
0,1 0.556 953 0.750 251
0.750 150
15.6 Ocho ejem plos que ilustran
0.5 0.556 953
el éxito v ariab le de la disección
2 0.1 0.518 9167 0.667 696
g enética de enferm edades
0.5 0.526 4 254 0.667 340
com plejas
1.5 0.1 0.505 115 537 0.600 2 219
0.5 0.510 30 660 0.600 950 No se cuenta con una historia unificada en el análisis genético de
enfermedades complejas. Los autores no intentan resumir el estado
1.2 0.1 0.501 3 951 997 0.545 1 1 868
actual de jugar a través de todo el campo: cada enfermedad es dife­
0.5 0.502 696 099 0.545 4 606 rente. Los lectores interesados en una enfermedad específica deben
-y es el riesgo relativo para individuos del genotipo Aa comparados con recurrir a PubMed para encontrar una buena revisión actualizada
aa; p es la frecuencia del alelo de susceptibilidad A. Para análisis de del padecimiento que elijan. Las ocho enfermedades que se resu­
pares de hermanos afectados (ASP), Y es el alelo esperado com parti­ men en este capítulo se escogieron para ilustrar algunos de los te­
do y N-ASP el número de pares necesarios para significancia, basado mas recurrentes de la investigación de una enfermedad compleja.
en pruebas IBD (_ = 3 x 10.5). Para pruebas de desequilibrio de trans­ Los autores no se concentraron en presentar historias de éxito. En
misión (TDT), P(trA) es la probabilidad de que un padre Aa transmita A algunos casos hay muy poco progreso que informar. La falta de éxi­
a un niño afectado, y N-TDT es el número de tríos padres-hijo necesa­
to es casi tan interesante como el éxito si se toman en cuenta los
rios para significancia. Según Risch y Merikangas (1996).
grandes esfuerzos relacionados en cada caso.
452 | CAPÍTULO QUINCE | MAPEO E IDENTIFICACIÓN DE GENES

15.6.1 Cáncer de mama: la identificación de un
subgrupo mendeliano condujo a adelantos
médicos importantes, pero no explica
las causas de la enfermedad esporádica
frecuente
Aunque los cánceres comunes suelen ser esporádicos, la existencia de
“familias con cáncer” se conoce desde hace mucho tiempo. Cuando
varios familiares sufren el mismo cáncer raro, como los schwanno­
mas vestibulares (véase NF2, MIM 101 000), es fácil sospechar un
síndrome mendeliano, y la investigación de estas familias condujo
a identificar los genes supresores de tumor que se describen en la
sección 17.4. Puesto que el cáncer de mama es frecuente -el riesgo
durante toda la vida para una mujer inglesa es de 1 en 12-, cuan­
do varios familiares tienen cáncer de mama es menos claro si se tra­
ta sólo de mala suerte o de una verdadera familia con cáncer. Sin
embargo, un antecedente familiar fuerte de cáncer de mama tam­
bién se relaciona con una edad de inicio excepcionalmente tempra­
na, con cáncer de mama aunado a cáncer de ovario, tumores
bilaterales frecuentes y a veces varones afectados. La investigación
de estas familias condujo a la identificación de los genes BRCA1 y
BRCA2.
Un análisis de segregación a gran escala de 1 500 familias (New-
man y cois., 1988) apoyó el concepto de que 4 a 5% del cáncer de
mama, en particular los casos de inicio temprano, podría atribuir­
se a factores hereditarios. Se reunieron análisis de enlace en familias
con patrones de genealogía casi mendelianas (fig. 15-7; véase MIM
113 705 para detalles del trabajo de enlace). Un locus de suscepti­
bilidad, denominado BRCA1, se mapeó a 17 q21 en 1990. La edad
media al momento del diagnóstico en familias enlazadas con 17q
fue antes de los 45 años. Las familias con inicio más tardío tuvie­
ron calificaciones lod negativas. En 1994 una búsqueda de enlace
en 15 familias grandes con cáncer de mama no enlazadas con 17c
identificó un locus BRCA2 en 13 q l2 (véase MIM 600 185). Lue­
go sobrevino uno carrera turbulenta para identificar los dos genes
mapeados. BRCA1 se clonó en 1994 y BRCA2en 1995; véanse en­
tradas MIM 113 705 y 600 185 para detalles. Parecía que BRCA1
podría explicar 80 a 90% de familias tanto con cáncer de manu

A nálisis d e
se g reg ació n Alelo de enfermedad dominante, frecuencia - 0.01
c o m p lejo Riesgo Por edad Por edad Tiempo
40 55 de vida
Portador del gen 0.37 0.66 0.82 • 0 m • •
No portador 0.004 0.028 0.081 23 fam ilias de m últiples casos seleccionadas

M odelo de susceptibilidad gen ética (4% de fam ilias)

A nálisis d e calificación lod

G en BRCAI
24 exones
1 863
am inoácidos Locus en 17q21
(Z = 3 .2 8 - 5.98 con D 17S84)

214 familias de múltiples casos

seleccionadas (estudio internación a.
de colaboración)

R egión c a n d id a to d e BRCAI

Fig. 15-7. Forma en que se encontró el gen BRCA1.

La clonación posicional estándar identificó de manera satisfactoria un gen que confería susceptibilidad a una enfermedad frecuente -pe ro sólo a un
subgrupo mendeliano de la enfermedad-, Al parecer BRCA1 tiene poca función en el cáncer de mama esporádico común.
 15.6 1 OCHO EJEMPLOS QUE ILUSTRAN EL ÉXITO VARIABLE DE LA DISECCIÓN GENÉTICA. . . [ 453
como de ovario, pero una proporción mucho menor de familias
con cáncer de mama nada más. El cáncer de mama en varones se
observó sobre todo en familias con BRCA2.
Ambos genes codifican proteínas nuevas grandes que al final
resultaron ser coactivadores transcripcionales, con funciones adi­
cionales en la reparación del DNA (véase sección 17.5.1). Se com­
portan como genes supresores de tumor, porque las mutaciones
heredadas causan pérdida de función (sección 16.3) y los tumores
de casos familiares pierden el alelo de tipo silvestre. Sin embargo, la
historia del cáncer de mama ofrece un contraste notable con el cán­
cer de colon. En este último, el gen APC, que se identificó median­
te el estudio de una forma mendeliana rara de la enfermedad,
también suele estar mutado en las formas esporádicas frecuentes
(sección 17.5.4). En contraste BRCA1 y BRCA2 rara vez están
inactivados en el cáncer de mama esporádico. Más aún, las muta­
ciones en estos dos locus explican sólo 20 a 25% del riesgo familiar
de cáncer de mama (Pharoah y cois., 2002). Una encuesta de 257
familias con cuatro casos o más de cáncer de mama (Ford y col.,
1998) sugirió que de las que tenían cuatro o cinco casos de cáncer
de mama en mujeres pero sin cáncer de mama en ovario o cáncer de
mama en varones, tal vez 67% no incluyó mutaciones BRCA1/2.
Nathanson y Weber (2001) describieron la búsqueda de más genes
de susceptibilidad. El análisis de segregación es compatible con que
la susceptibilidad restante es poligénica y se identificó un alelo de
riesgo común de penetración baja: una mutación en el gen de cina-
sa del ciclo celular CHEK2 se encontró en 1.1% de los testigos pe­
ro en 5% de pacientes con cáncer de mama (CHECK2-Breast
Cáncer Consortium, 2002).
Los datos iniciales sugirieron que una mujer que porta una mu­
tación BRCA1 tiene 85 a 90% de posibilidad de desarrollar cáncer
de mama y 40% de riesgo de cáncer de ovario. El riesgo de cán­
cer de mama (pero no de ovario) para una mujer con una muta­
ción BRCA2 es similar. Sin embargo, estos análisis se basaron en
mujeres de las familias grandes que se utilizaron para el mapeo.
Más adelante, cuando se encontraron mutaciones en mujeres no
seleccionadas por antecedente familiar, se observaron mucho
más casos no penetrantes entre sus familiares. Tres mutaciones
particulares (185delAG y 5382insC en BRCA1, 6174delT en
BRCA2) son más frecuentes en mujeres judías ashkenazi. Un es­
tudio de familiares de mujeres ashkenazi con cáncer de mama,
no seleccionadas con base en el antecedente familiar, sugirió un
riesgo de 36% durante la vida de las portadoras de estas muta­
ciones en lugar de 85 a 95% que suele señalarse (Fodor y cois.,
1998). Una característica general de la investigación de una en­
fermedad compleja que estima de manera inicial la penetrancia,
la gravedad y el riesgo para los familiares, definidos en los con­
juntos de familias empleadas para la identificación original del
locus de susceptibilidad, exagera el riesgo en la población general
(Góring y cois., 2001). Este hecho tiene implicaciones importan­
tes para la selección de población. Es probable que las mutacio­
nes definidas en estudios familiares iniciales tengan un efecto
mucho menos notable en casos en que se precisan mediante selec­
ción y además bien pueden existir mutaciones de penetrancia ba­
ja que podrían no advertirse en el estudio inicial pero revelarse
mediante la selección de población.
15.6.2 Enfermedad de Hirschsprung: una enfermedad
oligogénica
La enfermedad de Hirschsprung (HSCR) es una ausencia congèni­
ta de ganglios en la totalidad o alguna parte del intestino grueso o
colon. La consecuente falta de actividad peristáltica produce un
megacolon muy distendido que es letal para el neonato a menos
que el segmento afectado se extirpe. Amiel y Lyonnet (2001) revi­
saron la genética de la enfermedad de Hirschsprung (HSCR). La
HSCR es parte de un síndrome en 18% de los casos y 12% más
presenta anomalías cromosómicas. El restante 70% tiene HSCR
aislada, un padecimiento “multifactorial” típico, a menudo familiar
pero no mendeliano. El resultado del análisis de segregación ya se
comentó (cuadro 15-4). Los métodos de clonación posicional clá­
sica tuvieron éxito para identificar varios locus en la HSCR.
► Una anormalidad cromosómica: se observaron dos pacientes
con HSCR que tenían deleciones visibles de 1Oql lq21. El on-
cogén RET se encuentra en la región eliminada y codifica una
cinasa de receptor de tirosina que se expresa en las células apro­
piadas. Resultó que alrededor de 50% de los familiares y 15 a
35% de los pacientes esporádicos con HSCR aislada tienen una
mutación RET, pero también algunos familiares no afectados.
Las variantes conocidas de RET no explican la totalidad del
efecto del locus RET en la susceptibilidad; tal vez variantes no
codificantes también desempeñen una función (Gabriel y cois.,
2002a). Véase la patología molecular interesante de las muta­
ciones de RET en la sección 16.6.2.
► Enlace y un modelo de ratón: un segundo locus de suscep­
tibilidad se mapeó en el cromosoma 13q en una genealogía
menonita muy numerosa con múltiples consanguinidades; la
presencia de HSCR en varios pacientes no relacionados con dc-
leciones de 13q apuntó asimismo hacia esta región. De manera
independiente, el gen del receptor de endotelina B (ednrli) del
ratón se knocked como parte de una investigación de la partici­
pación de las endotelinas en el control del tono vascular. Resul­
tó inesperado que el knockout tiene el fenotipo de un modelo de
ratón de HSCR bien estudiado, piebald-lethal ( s l\). En el hom­
bre, EDNRB se encuentra en la región candidato de HSCR en
13q y poco tiempo después se demostró una mutación en la ge­
nealogía menonita. Como hecho interesante, una vez que la
mutación familiar se definió (como W276C), se encontró que
no era necesaria ni suficiente. La penetrancia fue específica de
sexo y distinta para cada genotipo: 0.13 (M), 0.09 (F) para
W/W, 0.33 (M), 0.08 (F) para W/C, y 0.85 (M), 0.60 (F) pa­
ra C/C, lo que ilustra el carácter oligogénico de la enfermedad
de Hirschsprung. Merece la pena leer los informes de este tra­
bajo (Puffenberger y cois., 1994a, b) como una ilustración de las
complejidades de la identificación de genes en una enfermedad
oligogénica hasta cierto punto frecuente.
► Pruebas directas de genes candidato: puesto que tanto RET
como EDNRB codifican receptores, los genes que codifican sus
ligandos (GDNF, NT Ny EDN3) fueron genes de susceptibili­
dad candidatos naturales. En un número pequeño de familias se
demostraron mutaciones en cada uno; otra familia tenía una
454 I CAPÍTULO QUINCE j MAPEO E IDENTIFICACIÓN DE GENES
mutación en el gen ECE1 que codificaba una enzima necesaria
para la maduración proteolítica de la endotelina 3. Se identificó
un gen candidato adicional, SOXIO, cuando el gen subyacente
en otro modelo de ratón de HSCR, megacolon dominante, se clo­
nó pero dio por resultado que los humanos con mutaciones
SOXIO tuvieran síndromes complejos en lugar de HSCR típica.
Las mutaciones en SMAD1P1 en 2q22 son frecuentes en pacien­
tes con HSCR y retraso mental.
► Mapeo de locus de susceptibilidad restantes: aunque RET es
el gen principal, la penetrancia es incompleta y dependiente del
sexo (65% en varones, 45% en mujeres). Los otros genes identi­
ficados son importantes en familias ocasionales, pero no contri­
buyen de manera significativa a la susceptibilidad total. Gabriel
y colaboradores (2002a) realizaron análisis de enlace sistemáti­
cos, a partir de los cuales concluyeron que las variaciones en el
locus RET, que interactúan con variación en locus desconocidos
en 3p21 y 19ql2, aunadas a un modificador dependiente de
RET en 9q31, explicarían toda la susceptibilidad genética a la
enfermedad de Hirschsprung (HSCR). Sin embargo, en la ge­
nealogía menonita mencionada, al parecer la susceptibilidad es­
tá determinada por una interacción entre alelos en los locus RET
y EDNRB, junto con un locus no identificado en 16q23 (Ca-
rrasquillo y col., 2002). Como hecho curioso no se observó nin­
guna asociación sugestiva con los locus 3p21 a 19ql2, ni con
21q22.3, que antes se informó que estaban asociados dentro de
esta genealogía.
La HSCR aislada surge como una enfermedad oligogénica (Amiel
y Lyonnett, 2001). Si la clonación posicional y los estudios funcio­
nales apoyan este análisis, la HSCR bien podría ser la primera de
estas enfermedades que se analiza por completo. Un contribuyente
importante de este éxito es el valor muy alto, 187, de \s (Gabriel y
cois., 2002a).
15.6.3 Enfermedad de Alzheimer: los factores genéticos
son importantes tanto en la forma frecuente
de inicio tardío como en las formas mendelianas
raras de inicio temprano, pero son genes
diferentes que actúan de maneras distintas
La enfermedad de Alzheimer (EA) (AD; MIM 104 310) afecta a
alrededor de 5% de las personas mayores de 65 años y a casi 20%
de las de más de 80. Ocurre una pérdida progresiva de la memo­
ria, seguida de alteraciones de la conducta emocional y deterioro
cognoscitivo general. Las necropsias del cerebro revelan pérdida
de neuronas con muchas placas que contienen amiloide. Las
neuronas en degeneración incluyen marañas neurofibrilares ca­
racterísticas. Rara vez inicia a una edad mucho menor. Las carac­
terísticas clínicas y anatomopatológicas son idénticas en la EA de
inicio temprano y la de inicio tardío, pero a veces la enfermedad
de inicio temprano es mendeliana y autosómica dominante, en
tanto que la EA de inicio tardío no es mendeliana y sólo muestra
un agrupamiento familiar moderado. El análisis de calificación
lod estándar permitió mapear y después clonar los tres genes, APP
en 21 q21, presenilina-1 en 14q24 y presenilina-2 en 1q42 (véase
MIM, 104 300, 104 311 y 600 579 respectivamente) en familias
dominantes de inicio temprano. Aunque las mutaciones en estos
tres locus sólo explican alrededor de 10% de los casos de EA que
inician antes de los 65 años de edad, se observan en particular en
las familias raras afectadas por EA dominante muy penetrante de
inicio notablemente temprano. Cualquier persona que desee in­
formación respecto a lo que esta enfermedad significa para una
familia debe leer Hannab' s Heirs de Daniel Pollen (véase Lecturas
adicionales).
Las familias de inicio tardío de múltiples casos no mostraron evi­
dencias de enlace con los locus relacionados con la enfermedad de
inicio temprano, pero sí enlace con el cromosoma 19. Por último el
locus de susceptibilidad se identificó como APOE (apolipoproteína
E, MIM 107 741), localizado en 19ql3.2. Se conocen tres alelos con
frecuencias (en caucásicos) de 0.08 (E2), 0.77 (E3) y 0.15 (E4). Tan­
to la EA familiar de inicio tardío como la esporádica se relaciona con
firmeza con el alelo E4, mientras que E2 se vincula con resistencia a
la enfermedad de Alzheimer (EA). En estudios seccionales cruzados
de personas mayores de 65 años los pacientes E3/E4 tuvieron alrede­
dor de tres veces el riesgo y los de E4/E4 casi 14 veces, en compara­
ción con homocigotos E3. Al parecer ApoE explica cerca de 50% de
la susceptibilidad a la EA de inicio tardío. Por consiguiente, en con­
traste con el cáncer de mama, no sólo las formas mendelianas raras
sino también la forma esporádica frecuente tienen un grado impor­
tante de determinación genética. Un estudio longitudinal (Meyer y
col., 1998) sugirió que E4 puede regir la edad de inicio más que la
susceptibilidad. Una vez que la EA comienza, su progreso no es dis­
tinto en personas con E4 o sin él. Si bien no hay discusión en cuan­
to a la relación de E4 con EA de inicio tardío, el mecanismo aún no
se aclara. Los determinantes E2/E3/E4 son sustituciones de los ami­
noácidos R112C y R158C; investigaciones intensivas no revelaron
ningún determinante de susceptibilidad “verdadero” en el desequili­
brio de enlace con E4.
Estudios de enlace y asociación más amplios proporcionaron
una plétora de otras regiones de susceptibilidad candidatas. Ema-
hazion y colaboradores (2001) hicieron una lista de ellas y publica­
ron un estudio de asociación a gran escala utilizando SNP de 60
regiones o genes candidatos. Los resultados, después de corregir los
valores p crudos para pruebas múltiples, apenas identificaron
APOE y fueron negativos para todos los otros candidatos. Los au­
tores emplean estos datos para destacar lo difícil que será confirmar
o refutar las asociaciones sostenidas en enfermedades complejas.
Por lo general los estudios de seguimiento no replicaron una loca­
lización inicial: con cuánta frecuencia esto se debe a que el infor­
me inicial fue un error tipo 1 y qué tan a menudo a que el estudio
de seguimiento carecía de potencia? Con base en la tendencia es­
tadística de los estudios a estimar en exceso el efecto de cualquier
locus verdadero que identifican (Góring y cois., 2001), no resulta
fácil decidir qué tanta potencia requeriría un estudio de segui­
miento para refutar un enlace.
La historia ApoE también es muy importante para las discusio­
nes acerca de las posibles implicaciones sociales y éticas de la iden­
 15.6 OCHO EJEMPLOS QUE ILUSTRAN EL ÉXITO VARIABLE DE LA DISECCIÓN GENÉTICA.. .
tificación del alelo de susceptibilidad para una enfermedad frecuen­
te (véase Recuadro de ética 1).
15.6.4 Diabetes mellitus tipo 1: ¿aún es la pesadilla
de los genetistas?
El primer paso para comprender la genética de la diabetes consistió
en distinguir los diferentes tipos de esta afección (cuadro 15-8). Las
diabetes tipo 1 y tipo 2 son enfermedades diferentes, con causas
distintas, evoluciones diversas y genética distinta. La diabetes tipo
Ética, recuadro I . Enfermedad de Alzheimer, prueba de ApoE y discriminación
La identificación de genotipos susceptibles a enfermedades frecuentes da lugar
a problemas éticos y sociales que ApoE ¡lustra bien. ¿Los patrones y las ase­
guradoras presionarán para el uso amplio de las pruebas, y ello conduciria a
una discriminación Injusta en el empleo, el cuidado de la salud y el seguro?
Empleo. Los patrones tienen un Interés legitimo en la capacidad en cur­
so de una persona para realizar el trabajo, pero muy poco Interés en lo
que pudiera suceder en un tiempo de 10 años. Sólo los trabajos que re­
quieren que el patrón invierta intensamente en entrenamiento especializa­
do son una excepción parcial a ello. En el Reino Unido sería ¡legal que un
patrón discriminara a una persona sana por su riesgo de desarrollar una
enfermedad en alguna fecha posterior.
Cuidado de la salud. En países con sistemas médicos especializados no
se presenta el problema de discriminación en el cuidado de la salud. Don­
de el acceso depende de seguros privados, el problema regresa al aspec­
to de la discriminación en seguros.
Seguro. El seguro comercial se basa en el principio de mutualidad; el ase­
gurador asigna al solicitante a un fondo común de riesgo y la prima refleja
el riesgo al que el solicitante contribuye al fondo común. En pólizas de se­
guros suscritas de manera individual siempre habrá un conflicto entre la
justicia actuarial y la justicia moral. ¿Es justo que se penalice a un solici­
tante por una constitución genética que no está bajo su control? No obs­
tante, la mayoría de las personas no tiene problemas con compañías que
asignan diferentes tarifas para varones y mujeres. La solución obvia es
comprobar que el seguro basado en mutualidad no se utiliza para sufragar
las necesidades de una vida civilizada, como el cuidado básico de la salud,
sino que se limita a productos que la persona puede elegir comprar o no
como parte de sus elecciones normales en las sociedades consumidoras.
Fondo común Fondo común Fondo común
de riesgo A de riesgo B de riesgo C
prima $ 1.00 prima $1.50 prima $3.00
Al contrario de la creencia popular, las aseguradoras tienen muy poco Inte­
rés en que las personas se sometan a pruebas genéticas. En el ejemplo ilus­
trado la compañía aseguradora no recibe un beneficio por el uso de pruebas
genéticas para dividir el fondo común de riesgo A en los fondos comunes B
j 455
1 (DT1, diabetes dependiente de insulina; véase MIM 222 100) se
debe a la destrucción autoinmunitaria de las células (3 pancreáticas,
suele afectar a personas jóvenes y éstas requieren tratamiento con
insulina toda la vida. Se observa un agrupamiento familiar bastan­
te fuerte (\s =15, concordancia de gemelos MC, cerca de 30%).
En el decenio de 1970 se estableció una asociación con ciertos ale-
los HLA.
En el Reino Unido, alrededor de 95% de los pacientes con DT1
tiene antígenos HLA-DR3, DR4, o ambos, en comparación con 45
a 54% de la población general. HLA constituye cerca de 40% de la
y C. El interés de las aseguradoras es evitar la antlselección. Ésta surge
cuando los proponentes utilizan el conocimiento secreto para obtener una
ventaja injusta. Alguien que sabe en secreto que tiene un riesgo alto adquie­
re una póliza especialmente considerable en términos estándar, en tanto que
alguien que sabe que tiene un riesgo bajo decide no molestarse con un se­
guro. Por tanto las aseguradoras desean conocer tanto como sea posible del
solicitante respecto a pruebas preexistentes importantes; la única razón le­
gítima para hacer que un solicitante se someta a pruebas extra es cuando se
sospecha que, de hecho, ya se las hizo en secreto.
El criterio de lo que es “ importante" es distinto para pruebas clínicas y de
aseguradoras. En una prueba clínica útil el resultado debe ser predecible
para cada individuo. Para la aseguradora, en principio, sólo es necesario
disponer de una prueba para distinguir grupos con riesgos promedio muy
diferentes -un a labor mucho menos exigente. Ésta es la diferencia entre
desviación estándar y error estándar de la media. AP0E4 no es necesa­
ria ni suficiente para la enfermedad de Alzheimer (EA). Casi la mitad de
las personas con APOE4 nunca desarrollará EA, sin Importar cuánto tiem ­
po vivan, en tanto que muchos pacientes con EA carecen de AP0E4. La
incertidumbre no permite ni la confirmación de un diagnóstico clínico ni
pruebas de predicción útiles en personas sanas. El American College of
Medical Genetics y la American Society of Human Genetics recomiendan
no utilizar la prueba ApoE para el diagnóstico clínico de rutina o pruebas
de predicción en la enfermedad de Alzheimer (EA) (ACMG/ASHG Working
Group, 1995). La única indicación clínica para la genotipificación ApoE en
la enfermedad de Alzheimer sería que un medicamento caro utilizado pa­
ra el tratamiento de pacientes con Alzheimer sólo fuera eficaz para cier­
tos genotipos ApoE o en especial perjudicial en ciertos genotipos. El
problema crucial para el seguro consiste en saber si los genotipos ApoE
definen fondos comunes con riesgos suficientemente diferentes para que
las pruebas sean importantes. Según los actuarios Macdonald y Pritchard
(2001), la pregunta básica, con unas cuantas calificaciones, es “ no".
Aunque resulte que la prueba ApoE no origine problemas de política públi­
ca mayores, es posible que lleguen otras pruebas que sí requieran control
social. Las tres características de una prueba que originaría alarmas son:
► predecir un riesgo que ya no es evidente en el estilo de vida o el an­
tecedente familiar (esto excluye, por ejemplo, pruebas para enferme­
dad de Huntington);
► el padecimiento debe ser suficientemente frecuente y la prueba lo
bastante predecible para que la aseguradora no corra el riesgo de ig­
norarla, pero la prueba no debe estar disponible como parte del ser­
vicio clínico rutinario;
► deben estar disponibles pruebas confidenciales privadas y utilizarlas
con amplitud.
456 j CAPITULO QUINCE MAPEO E IDENTIFICACIÓN DE GENES
predisposición genética, pero varios haplotipos diferentes se relacio­
nan con susceptibilidad o resistencia. El desequilibrio de enlace po­
tente dentro del complejo mayor de histocompatibilidad dificulta
la identificación del principal determinante de susceptibilidad. Se
encontró que todos los haplotipos que se acompañan de un riesgo
bajo de diabetes llevan un alelo en el locus DQB1 en el que el ami­
noácido 57 es ácido aspártico, en tanto que los haplotipos de alto
riesgo tienen alelos DQB1 con algún otro aminoácido en esta po­
sición (Todd y cois. 1987). En un estudio, 96% de diabéticos pero
sólo 20% de testigos fueron homocigotos no Asp en la posición 57
de DQB1. Es probable que un factor de resistencia esté definido
por un antígeno epitopo que incluye Asp-57 que varias moléculas
diferentes de HLA comparten. La idea del epitopo compartido sue­
le aplicarse también a otras enfermedades autoinmunitarias relacio­
nadas con HLA, con un éxito mixto.
Asimismo, el trabajo inicial en la DT1 identificó un segundo
locus de susceptibilidad, IDDM2, cerca de INS, el gen estructural
para insulina. El mapeo de desequilibrio de enlace reveló el deter­
minante real como una repetición minisatélite de 14 pb corriente
arriba del gen. La susceptibilidad se vinculó con repeticiones cor­
tas (unidades de repetición 26 a 63). Las repeticiones largas (140
a 210 unidades) determinan que el gen de insulina se transcriba
a un nivel bastante más alto en el timo en desarrollo; se argumen­
ta que esto incrementa la eficiencia de la deleción de las clonas de
células T reactivas a insulina durante el desarrollo del sistema in-
munitario y reduce el riesgo de un ataque autoinmunitario.
Tanto el trabajo HLA-DQB como los hallazgos INS subrayan la
probable diferencia entre el tipo de cambios genéticos sutiles
que pueden sustentar la susceptibilidad a una enfermedad fre­
cuentes y los cambios gruesos que se observan en enfermedades
mcndelianas.
Varios grupos siguen con firmeza la estrategia de exámenes de
enlace del genoma completo seguidos de mapeo de desequilibrio
Cuadro 15-8. Clasificación clínica de la diabetes.
Diabetes tipo 1 Diabetes tipo 2
Inicio juvenil Inicio en la madurez ( > 40 años)
0.4% de la población británica 6% de la población estadounidense
Requiere Insulina Por lo general controlable con hipoglucemiantes orales
Ausencia de obesidad Asociación potente con obesidad
Familiar: Familiar:
Concordancia de MC 30% Concordancia de gemelos MC 40 a 100%
riesgo de hermanos 6 a 10 % riesgo de hermanos 30% (puede ser subclínica)
Se relaciona con Sin relación con HLA
HLA-DR3 y DR4
DJIM (diabetes juvenil de Inicio en la madurez) es una form a Infrecuente mendeliana, rara, para la que se identificaron varios genes (véase MIM
600496). Además la diabetes puede ser parte de varios síndromes raros.
de enlace dentro de las regiones candidato. El artículo del Euro-
pean Consortium (2001) proporciona referencias de los principales
estudios de enlace y el cuadro 15-9 incluye una lista de las princi­
pales regiones implicadas hasta la fecha. A fin de evitar el efecto
potente de HLA de ocultar señales más débiles, los datos para el
genotipo HLA suelen estratificarse antes de buscar enlace a otros
locus. Las regiones definidas mediante estudios de PHA son muy
amplias y, más aún, el locus “verdadero” puede situarse bastante le­
jos del pico de calificación máxima, lo que determina que sea muy
difícil conocer cuántos locus de susceptibilidad distintos se en­
cuentran en 2q y 6q, por ejemplo. En teoría la contribución total
de cada locus puede medirse mediante la expresión de su \s como
una fracción de la Xs total para D Tl (Risch, 1990a), de manera
que es posible saber cuánto queda por explicar. Sin embargo, la
práctica usual de emplear el mismo grupo de datos para definir
una región candidato y luego calcular \s proporciona estimaciones
muy poco confiables (Góring y cois., 2001). Tal vez HLA e INS ex­
pliquen 50% de la susceptibilidad, pero la contribución total de
los otros locus del cuadro 15-9 se desconoce.
Varias características de la DTl parecen favorecer la investiga­
ción genética. Con bastante frecuencia (tres por mil) es posible
reunir grupos grandes de pacientes para estudio. Los enfermos
son jóvenes y sus padres suelen estar disponibles para análisis de
pruebas de desequilibrio de transmisión (PDT). El diagnóstico
no es ambiguo y se cuenta con un buen modelo animal, el ratón
NOD (no obeso diabético), en el que la enfermedad también es
poligénica. Por todas estas razones, y a causa de sus costos finan­
ciero y personal considerables, durante decenios la D Tl se ha in­
vestigado de manera intensa mediante enlace, estudios de gen
candidato y organismo modelo. Si se considera el progreso hasta
cierto punto modesto logrado hasta la fecha, tal vez sea tiempo de re­
sucitar la antigua descripción de la diabetes como la pesadilla de
los genetistas.
DJIM
Inicio juvenil
Rara
Como la diabetes tipo 2
Ausencia de obesidad
Familiar:
¿autosómica
dominante?
Sin relación con HLA
 15.6 j OCHO EJEMPLOS QUE ILUSTRAN EL ÉXITO VARIABLE DE LA DISECCIÓN GENÉTICA. 457

Cuadro 15-9. Principales locus de susceptibilidad a diabetes tipo 1 sugeridos por análisis de pares de hermanos afectados
(PHA) o prueba de desequilibrio de transmisión (PDT).
Lo cu s M IM nú m . L o c a liz a c ió n E stado

IDDM1 222100 6p21 x s = 3.1; el determinante es HLA-DBQ

IDDM2 125852 1 1 p15 \ s - 1.3; el determinante es un NVRT corriente arriba del gen INS

IDDM4 600319 1 1 q13 \ s = 1.6; enlace significativo en resultados combinados de tres selecciones (596 familias)

IDDM5 600320 6q24-q27 \ s = 1 .2; observada en cuatro estudios

IDDM6 601941 18q21 Pruebas de PHA y PDT en un estudio

IDDM7 600321 2q31-q33 \ s = 1.3; observado en tres estudios de PHA. Desequilibrio de enlace con gen candidato CTLA4,

ID DM 12 600388 2q33 p = 5 x 10“ 5 pero sólo en algunas poblaciones

IDDM8 600883 6q25-q27 \ s = 1.8; no claramente distinto de IDDM5

ID DM 10 601942 10 p1 1 -q1 1 Datos de PHA y PDT de tres estudios

ID DM 13 601318 2q34 ¿Igual que ID D M 7 ,12, o ambos?

IDDM15 601666 6q21 Confirmado (a través de un efecto difícil de separar de HLA)

Datos de las entradas OMIM y artículos citados en las mismas; los valores \ s son de Lou y colaboradores (1995).

15.6.5 Diabetes tipo 2: dos factores de susceptibilidad,
uno muy frecuente para ser indetectable
mediante enlace; el otro muy complejo y
sólo en ciertas poblaciones
La diabetes mellitus no dependiente de insulina o tipo 2 (DT2)
es la forma más usual de este trastorno heterogéneo, que afecta a
cerca de 135 millones de personas en todo el mundo. La DT2 es
resultado de una combinación de deterioro de la secreción de in­
sulina y disminución de la respuesta de órgano final; los factores de
riesgo que se conocen incluyen edad, obesidad y falta de ejercicio.
En muchos países desarrollados 10 a 20% de las personas mayores
de 45 años de edad está afectado y ciertas poblaciones tienen inci­
dencias en particular altas.
Se informaron asociaciones entre DT2 y cuando menos 16 va­
riantes genéticas distintas (resumidas por Altshuler y cois., 2000a).
Un estudio muy grande de Altshuler y colaboradores sólo replicó
una. Un alelo común (p = 0.15) del gen PPARGst vinculó con dis­
m inución del riesgo de DT2 en varias cohortes (razón de posibili­
dades = 0.8). Como el alelo de riesgo mayor t s tan frecuente (p =
0.85) tal vez nunca se detecte mediante análisis de enlace. PPARG
no es un gen candidato que cause sorpresa: codifica un receptor nu­
clear hormonal que regula la adipogénesis y es un blanco de los me­
dicamentos de la tiazolidinediona que se utilizan para el tratamiento
de la diabetes tipo 2 (DT2).
Altmüller y colaboradores (2001) detallaron 10 exámenes del
genoma completo e informaron un enlace importante de 25 locus
en 15 cromosomas diferentes. Como es usual, los hallazgos no se
replicaron bien entre estudios. Un locus, NIDDM1 en 2q37, se
identificó en mexicoestadounidenses y al parecer interactúa con un
locus en el cromosoma 15 para incrementar la susceptibilidad en
este grupo (véase Horikawa y cois., 2000 para referencias). El artículo
de Horikawa y colaboradores describe la identificación de una com­
binación particular de SNP dentro del gen calpaína 10 (CAPN10) en
2q37 como el determinante de susceptibilidad en mexicoestadou­
nidenses. Para mencionar una editorial que merece mucho la pena
leer, “el estudio proporciona una visión sin precedentes en el borde
de corte de la clonación posicional para caracteres complejos y en­
seña lecciones de importancia duradera respecto a lo difícil que
puede ser encontrar genes para enfermedades frecuentes” (Altshu-
ler y cois., 2000b).
El trabajo se inició reduciendo la región candidato a una re­
gión de 7 cM en 2q37. En términos físicos esto correspondió a
un contiguo de 1.7 Mb (las tasas de recombinación tienden a ser
más altas cerca de telómeros, sección 13.1.5). Se estudió una serie
de polimorfismos a partir de esta región, no sólo para la asociación
con DT2, sino también para la asociación con la prueba para enla­
ce. La justificación consistió en que aunque sólo un subgrupo de
casos estaba enlazado al locus 2q37, ésos deben ser los únicos que
llevan el determinante de susceptibilidad. Análisis iniciales sugirie­
ron una región blanco de 66 kb, que en el examen contenía tres ge­
nes, CAPN10, RNPEPL1 y GPR35, y 179 variantes de secuencia
(en un grupo de 10 diabéticos mexicanos). Lo anterior condujo a
identificar una variante, UCSNP-43, en la que el genotipo homo-
cigoto G/G mostró asociación con la prueba para enlace y quizá
también con diabetes (razón de posibilidades, 1.54; intervalo de
confianza, 0.88 a 2.41). Luego dio inicio la búsqueda de haploti-
pos que fueran: a) más frecuentes en los grupos de pacientes con
mayor evidencia de enlace 2q37; b) compartidos por pares de her­
manos afectados con mayor frecuencia de la esperada, y c) vincula­
dos con riesgo más alto de diabetes. Una combinación heterocigota
de dos haplotipos (definidos mediante tres SNP dentro de intrones
458 j CAPITULO QUINCE | MAPEO E IDENTIFICACIÓN DE GENES

C en 1 25 marcadores SNP alrededor del locus NIDDM1 Tel

Fig. 15-8. Genotipos de pacientes con diabetes tipo 2 en el locus calpaína-10.

Cada hilera resume los resultados de un paciente con 25 SNP (columnas). Azul: homocigoto para alelo común; rojo: heterocigoto; amarillo: homocigoto
para alelo raro; blanco: no hay datos. Los pacientes se disponen desde la parte superior hasta la inferior en orden de prueba decreciente de enlace a
NIDDM1. Obsérvese cómo cambian los colores de la parte central del diagrama, el sitio del gen CAPN10, desde la parte superior hasta la Inferior, pero
no los colores de otras partes. Esto muestra cómo ciertos genotipos en el locus CAPN10 se asocian con la evidencia para enlace. Adaptado de Cox NJ
(2001) Hum. Mol. Genet. 10. 2301-2305 con autorización de Oxford Unlversity Press.

del gen CAPN10) satisfizo todos los criterios. Ningún haplotipo en
la forma homocigota tuvo un factor de riesgo. Por consiguiente el
determinante de susceptibilidad en NIDDM1 parece ser una com­
binación heterocigota particular de SNP no codificante que inte-
ractúa con un factor no identificado en el cromosoma 15. La figura
15-8 pretende brindar una impresión visual de lo que significa
“asociación con evidencia para enlace”.
¿Qué tanta confianza puede tenerse en que este proyecto impre­
sionante identificara en realidad el factor de susceptibilidad de
NIDDMP. Los estudios de seguimiento arrojan resultados conflic­
tivos (resumidos por Fullerton y cois., 2002); es cierto que no se ob­
serva asociación universal entre el genotipo de susceptibilidad
propuesta y DT2 en todo el mundo. Calpain 10 fue un candidato
inesperado; sin embargo, se publicó un efecto de UCSNP-43 en la
transcripción del gen y se sugirió un posible efecto corriente abajo
en el recambio de glucosa estimulado por insulina. En conjunto,
este estudio impulsa a tener una gran precaución respecto a la iden­
tificación de factores de susceptibilidad de una enfermedad com­
pleja. En el lado positivo, se identificó un gen candidato nuevo; en
el lado negativo, está lejos de ser claro que se haya identificado la
variante real que causa susceptibilidad y tampoco está claro cómo
podría resolverse esta incertidumbre. ¿Otros factores de riesgo de
una enfermedad frecuente serán igual de oscuros y complejos? ¿Re­
sultarán específicos de poblaciones particulares? La labor heroica de
Horikawa y colaboradores proporciona cuando menos muchos da­
tos para pensar.
15.6.6 Enfermedades inflamatorias del intestino:
un gen de susceptibilidad preciso identificado
La colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn son formas de en­
fermedades inflamatorias del intestino (Eli) que en total afectan de
una a tres personas por mil en el mundo occidental. Estudios de fa­
milias y gemelos apoyan una susceptibilidad genética para cada en­
fermedad con ciertos componentes compartidos. El valor de \s es
de 20 a 30 para EC y de 8 a 15 para CU. Análisis de enlace de pa­
res de hermanos y familia realizados por muchos grupos definieron
varias regiones con enlace confirmado o replicado (IBD1, 16pl2-
q l3; IBD 212pl3; IBD3 6p; IBD 414ql l-q l2 ; Z&D5 5q31) y mu­
chos otros de enlace sugestivo (para referencias, véase OMIM
entrada 266 600). Se confirmó en particular el enlace a IBD1 con
una calificación lod máxima de 5.79 en familias con EC (pero no
CU) en un estudio mancomunado muy grande de 613 familias con
1 298 hermanos afectados con EC, CU, o ambas (IBD Internatio­
nal Genetics Consortium, 2001).
En fecha reciente tres grupos identificaron un gen relacionado
con IBD1 (Hugot y cois., 2001; Oguray col., 2001; Hampe y cois.,
2001). Ogura y colaboradores clonaron CARD15 (NOD2) como
un regulador de la respuesta inflamatoria N F-kB. Lo probaron en
Eli porque se mapeó al locus de IBD1 y desde el punto de vista
biológico fue un candidato prometedor de enfermedad inflamato­
ria del intestino (Eli). En contraste, Hugot y colaboradores siguie­
ron una vía de asociación de enlace puro. La región candidato se
 15.6 | OCHO EJEMPLOS QUE ILUSTRAN EL ÉXITO VARIABLE DE LA DISECCIÓN GENÉTICA. . . | 459
redujo mediante enlace y luego se efectuaron estudios de asocia­
ción. Cabe destacar que el resultado de la PDT que condujo a
CARD15 sólo fue significativo limítrofe (/>= 0.05) y aunque se re­
plicó en una muestra independiente con p < 0.01, en esta ocasión
la asociación ¡fue con un alelo diferente del marcador! De hecho
la observación cuidadosa de sus datos sugiere que una búsqueda
aleatoria basada en microsatélites para asociación en una cohorte
grande no hubiera proporcionado resultados positivos. Por últi­
mo asociaciones potentes, aunque no espectaculares, destacaron
una región genómica de la que clonaron los 10 genes CARD15 no
publicados.
El principal factor de susceptibilidad en IBD1 es una inser­
ción de base aislada, 3 020insC, en la parte terminal C del gen
CARD15- Hampe y colaboradores demostraron una asociación
PDT muy fuerte entre pacientes con EC y esta mutación. La inser­
ción tiene una frecuencia de 0.08 en pacientes con EC, 0.02 en tes­
tigos y 0.02 en enfermos con CU, lo que demuestra que es un
factor de susceptibilidad para EC pero no para colitis ulcerosa. El
riesgo relativo de EC se aproxima a 3 para heterocigotos y a 23 pa­
ra homocigotos. La inserción produce una proteína truncada en 33
aminoácidos que afecta una región con importancia demostrable
en la activación de NF-kB.
Este trabajo destaca tres puntos. Primero, demuestra que la
empresa es posible: los genes de susceptibilidad pueden identifi­
carse, cuando menos en ocasiones, mediante un método genéti­
co. Segundo, resalta la necesidad de estudios de familias a gran
escala. Por último, los resultados débiles de PDT para marcado­
res de enlace en el estudio de Hugot y colaboradores, comparados
con los resultados muy potentes que observaron Hampe y cola­
boradores cuando estudiaron la mutación de inserción de mane­
ra directa, enseñan una lección importante acerca de los estudios
de asociación. No sorprende que otras mutaciones en el gen
CARD15 también contribuyan a la susceptibilidad de la EC.
Otras dos cSNP, G908R y R702W (numeradas de manera distin­
ta por Hugot y cois.), se asocian fuertemente con EC y una varie­
dad completa de cambios en sentido erróneo raros en el gen
CARD15 es más frecuente en pacientes con EC que en testigos.
Aun en presencia de desequilibrio de enlace, cada mutación se
acompañará de su haplotipo individual propio. Esta heterogenei­
dad alélica es por completo esperada -pero origina restricciones
graves en las posibilidades de localizar un gen de susceptibilidad
dentro de una región candidato mediante una estrategia basada
en asociación.
15.6.7 Esquizofrenia: los problemas especiales de
los trastornos psiquiátricos o conductuales
Los genetistas que estudian una enfermedad psiquiátrica o con­
ducta antisocial enfrentan dos problemas adicionales, además de
todas las dificultades inherentes al estudio de cualquier enferme­
dad compleja.
a) A rgumentos respecto a naturaleza-crianza. Como el ambiente
familiar compartido es una explicación tan plausible para la
tendencia a que se presenten problemas psiquiátricos o con­
ductuales en familias, se requiere un estándar muy alto de
pruebas para hacer afirmaciones acerca de factores genéticos.
Los cuadros 15-1 a 15-3 resumen algunas de las evidencias
de estudios de familias, gemelos y de adopción para la esqui­
zofrenia. Muy a menudo los argumentos de naturaleza y
crianza son tan sólo sustitutos de argumentos políticos y se
elaboran con todo el decoro y la objetividad de las políticas
públicas. Ambos lados basan su pasión en la premisa falsa de
que si un padecimiento es genético, entonces no puede me­
jorarse con ninguna intervención social. Por consiguiente las
personas de la izquierda favorecen la causa ambiental y las de
la derecha apoyan causas genéticas. En la actualidad parte
del acaloramiento de los argumentos respecto a psiquiatría se
eliminó, pero los genetistas buscan una conducta antisocial
que aún atrae una posición virulenta y patrocinadores no
bienvenidos.
b) Criterios diagnósticos. Como se comenta en la sección 15.3.1,
los criterios diagnósticos constituyen otra área muy difícil en
genética psiquiátrica. “La esquizofrenia no debe considerarse
una enfermedad sino, igual que la epilepsia, un síndrome que
se reconoce por un conjunto de signos y síntomas que tienen
una patogénesis diversa” (Trimble, 1996). Los criterios acorda­
dos, como DSM-IV, se basan en el mejor juicio de psiquiatras
experimentados respecto a lo que constituye el núcleo esencial
del padecimiento -pero finalmente son arbitrarios-. ¿Es posi­
ble que la “personalidad esquizoide” sea una manifestación de
los genes que tornan a las personas susceptibles a la esquizofre­
nia DSM-IV? O, ¿existe quizás una susceptibilidad genética
general a una enfermedad psicòtica y también debe incluirse la
enfermedad bipolar y depresiva? Con frecuencia los análisis ge­
néticos utilizan dos o más grupos de criterios distintos, uno es­
trecho y uno amplio, a fin de observar cuál proporciona la
mejor calificación. De otra manera los investigadores pueden
buscar enlace a un fenotipo intermedio, algo que no es esqui­
zofrenia pero que pudiera formar parte de la susceptibilidad y
ser más simplemente determinado en forma genética -tal vez
cierta variante fisiológica o neuropsicológica-.
La esquizofrenia, como un padecimiento familiar hasta cierto punto
frecuente y muy aflictivo, suele ocupar un lugar alto en la lista de prio­
ridades de los investigadores genéticos. Altmüller y colaboradores
(2001) listan 10 estudios del genoma completo efectuados desde
1994 y se conocen muchos estudios adicionales de genes o regiones
candidato individuales. Los candidatos típicos son genes codifica­
dores de proteínas que participan en la neurotransmisión o que se
afectan por fármacos que se utilizan para el tratamiento de la esquizo­
frenia. Las múltiples genealogías grandes afectadas no son raras y a
menudo se emplean para estudios de enlace. La elección de estas fa­
milias tiene implicaciones para el análisis: el programa Genehunter,
que se usa con más frecuencia para enlace de enfermedad compleja,
no puede manejar genealogías grandes (sección 13.6.2) y determina
que muchos investigadores utilicen análisis paramétricos de califica­
ción lod (sección 13.3.1), pero con una diversidad de modelos gené­
ticos alternativos. Aunque realizar lo anterior es del todo válido,
introduce grados adicionales de libertad y por tanto disminuye la
potencia del estudio. En combinación con el uso de múltiples crite­
rios diagnósticos (véase antes), esto determina que la estimación de
460 CAPÍTULO QUINCE ¡ MAPEO E IDENTIFICACIÓN DE GENES
la significancia de los resultados sea excepcionalmente falsa. No obs­
tante, múltiples modelos pueden ser realistas en términos biológicos;
es por completo factible que un alelo de riesgo en un locus confiera
susceptibilidad dominante a una enfermedad definida de manera am­
plia, en tanto que un alelo en otro locus puede conferir susceptibili­
dad recesiva a la esquizofrenia definida sólo de manera estrecha.
En la actualidad uno o más estudios muestran pruebas de enla­
ce a casi una docena de regiones cromosómicas, pero aún no se
identifica con claridad algún alelo de susceptibilidad. Un candida­
to prometedor es el alelo de valina de un polimorfismo Metl58Val
en el gen COMT (catecol-O-metiltransferasa). En términos bioló­
gicos es un candidato plausible y a pesar de ciertos estudios negati­
vos varios otros informaron una asociación y resultados de la PDT
positivos. Por ejemplo, Weinberger y colaboradores (2001) encon­
traron una frecuencia de 52% en testigos y de 60% en esquizofré­
nicos con una razón de posibilidades de 1.5 para homocigotos. Sin
embargo, aun si se confirma, este factor sólo explicaría 4% de la va-
rianza del riesgo. La entrada OMIM 181 500 proporciona víncu­
los para discusiones de las principales regiones candidato, en tanto
que los estudios de Gurling y colaboradores (2002), Camp y cola­
boradores (2001), Weinberger y colaboradores (2001) y Lewis co­
laboradores (2003) brindan un buen cuadro de los problemas y
algunos de los métodos que se utilizan para intentar y descubrir la
genética de esta enfermedad trágica. Los problemas planteados en
este inciso se aplican por igual a una gama de otros fenotipos psi­
quiátricos y conductuales humanos.
15.6.8 Obesidad: análisis genético de un carácter
cuantitativo
Como un problema emotivo contencioso, la obesidad rivaliza con
la esquizofrenia, con una escuela de pensamiento que prevalece en­
tre personas delgadas que culpa a una mala autodisciplina y laxitud
moral y la parte fuerte que culpa a una predisposición constitucio­
nal. La obesidad es una preocupación de salud pública importante
en países desarrollados y es de gran interés para compañías de bio­
tecnología, que ven la fortuna que pueden hacer con una píldora
eficaz para la delgadez. Para los propósitos actuales, el principal in­
terés en la obesidad es como ejemplo de un carácter cuantitativo
(Barsh y cois., 2000).
La medición simple del peso no constituye una buena variable
cuantitativa para el análisis porque confunde a las personas delga­
das altas con las personas gordas bajas. El índice de masa corporal
(IMC; peso en kg/estatura en m2) es una medida mucho más ade­
cuada. El IMC medio en Estados Unidos era de 22 kg/m2 en 1983.
Otros investigadores intentan usar medidas más cercanas de la fi­
siología subyacente, por ejemplo, el porcentaje de tejido adiposo o
la concentración sérica de leptina. En cada caso podrían utilizarse
ciertos límites para definir la obesidad, como IMC 25 a 29 kg/m
= grado 1, IMC 30 a 40 kg/m" = grado II e IMC > 40 = grado III,
con ajustes para la edad y el sexo. Sin embargo, esta conducta es ar­
bitraria y conduce a la pérdida de datos. Es mucho mejor analizar
en forma directa la variable cuantitativa para identificar un locus
de carácter cuantitativo (LCC). Estas medidas cuantitativas son el
pan de cada día de la reproducción de animales y plantas. La técni­
ca usual para el análisis del LCC en genealogías humanas es el aná­
lisis de enlace varianza-componente. Almasy y Blangero (1998)
describieron la base matemática del método. En esencia, como en
el análisis convencional de calificación lod, se calcula una califica­
ción lod a partir de la relación de la posibilidad de los datos en dos
hipótesis alternativas. En este caso los datos son covarianzas entre
familiares para el fenotipo cuantitativo y las hipótesis alternativas
consisten en que existe o no un LCC en la localización cromosó-
mica en cuestión. Las covarianzas pueden ajustarse para variables
de confusión como edad y sexo. En la hipótesis de la existencia de
un LCC, su efecto se predice a partir de la identidad por descen­
diente del segmento cromosómico en el par de familiares, según lo
evidencian los datos marcadores. El método de múltiples puntos
descrito por Almasy y Blangero proporciona un intervalo de con­
fianza para la localización del LCC y un estimado de su efecto.
Aunque el IMC se analiza como un LCC en lugar de la obesidad
como un carácter dicótomo, aún es preferible concentrarse en per­
sonas en los extremos de la distribución a fin de llevar al máximo
la potencia estadística.
OMIM tiene 44 entradas que comprenden “obesidad” en el tí­
tulo o sinopsis clínica, inclusive la obesidad espectacular rara que
abarca componentes de las vías que regulan el consumo de alimen­
tos -la hormona leptina, el receptor de leptina, la pro-opiomela-
nocortina y el receptor de la melanocortina-4-. Sin embargo, la
mayor parte de la obesidad no es mendeliana. De hecho los sín­
dromes con obesidad inevitable tienen poco interés: el objetivo de
la investigación de la obesidad es descubrir los mecanismos que
tornan susceptibles o resistentes a las personas a la obesidad indu­
cida por dieta, en lugar de aquellos que controlan el peso corporal
p o r sí mismos -un punto importante cuando se consideran mode­
los animales-. Esta línea de pensamiento sugiere que el mejor di­
seño de investigación sólo tendría en cuenta a personas, obesas o
de otra índole, que viven con alimentos chatarra y no hacen ejer­
cicio. Pueden captarse a la salida de un sitio de alimentos rápidos
en automóvil.
Como siempre la primera labor es revisar si hay algún compo­
nente genético en la causa. La obesidad tiende a presentarse en fa­
milias, pero ello fácilmente podría ser un efecto de un ambiente
familiar compartido. Sin embargo, estudios en gemelos y de adop­
ción sugieren que alrededor de 70% de la varianza en el IMC pue­
de atribuirse a factores genéticos. Análisis de segregación sugieren
que 20 a 65% de la varianza de IMC en la población podría deber­
se a uno o dos genes recesivos mayores (resumidos por Feitosa y
cois., 2002). Altmüller y colaboradores (2001) publicaron una lista
de cinco exámenes del genoma total informados antes de diciem­
bre del año 2000; Feitosa y colaboradores (2002) y Deng y colabo­
radores (2002) elaboraron dos informes más recientes. Los dos
últimos muestran curvas de calificación lod para cada cromosoma
que ilustran con claridad el problema general de la falta de replica-
ción de los resultados. Como con muchas otras enfermedades com­
plejas, la pregunta fundamental es si el fracaso para replicarlas
indica que el informe inicial fue erróneo o que el estudio de segui­
miento no tenía potencia. En el caso de la obesidad también mere­
ce la pena indicar que algunos de los mejores datos pueden estar
ocultos en los expedientes de compañías de biotecnología, que no
se revelarán hasta que se logre algo patentable.

15.7 G eneralidades y resum en
15.7.1 ¿Por qué es tan difícil?
La identificación de factores de susceptibilidad resulta mucho
más difícil de lo que las personas imaginaban hace 10 años. Weiss
y Terwilliger (2002) preguntan de manera pertinente “¿qué por­
centaje de proyectos de mapeo del gen de enfermedades comple­
jas, cuyas proposiciones acordadas prometieron una potencia de
80%, ha tenido éxito real para identificar los genes de enferme­
dad que se asumía que existían en los datos?” La respuesta está
muy por debajo de 80% de que algo seguramente está mal. Su ar­
tículo debe leerlo cualquier persona que piense que es fácil inves­
tigar una enfermedad compleja. No obstante, cualquier aventura
importante hacia lo desconocido se acompaña siempre de argu­
mentos doctos apremiantes que demuestran por qué nunca pue­
de funcionar -que luego se comprueba que son erróneos-. La
opinión de la mayoría es que los fracasos se debieron a falta de
potencia y pueden remediarse con cohortes de pacientes más
grandes, una genotipificación más efectiva y una prueba estadís­
tica más potente.
El problema central debe ser la heterogeneidad
Para el enlace, el análisis de un par de hermanos afectados es un
método en extremo robusto. El hecho de que tengan tan pocas
calificaciones lod importantes y que los estudios se repliquen
tan rara vez entre sí (Altmüller y cois., 2001) sólo puede deber­
se a heterogeneidad de locus. Es evidente que la susceptibilidad
a la mayor parte de las enfermedades complejas está determina­
da por muchos locus menores y no por unos cuantos locus ma­
yores. El análisis de pares de hermanos se limita a detectar
factores de susceptibilidad bastante fuertes. Los cálculos del
cuadro 15-7 muestran que para gamma ^ 2 el exceso de com­
partir alelos por pares de hermanos afectados es muy pequeño y
la detección requeriría números muy considerables. Altmüller y
colaboradores (2001) compararon 101 estudios del genoma
completo para observar si podría aprenderse alguna lección de
la forma en que tuvieran éxito, pero no pudieron identificar
ninguna regla de oro además de pensamientos obvios como el
tener una muestra grande por analizar. Una consideración adi­
cional es que la susceptibilidad en poblaciones diferentes puede
tener distintas causas genéticas. Por ejemplo, en una encuesta de
483 pacientes japoneses con enfermedad de Crohn (Yamazaki y
cois., 2002) se encontraron pocas evidencias de mutaciones en
CARD15, que es un gen de susceptibilidad mayor entre euro­
peos (véase sección 15.6.6).
Los estudios de asociación, el otro medio principal para la in­
vestigación, dependen del desequilibrio de enlace. Cada vez es
más claro que en tanto no se tengan buenos mapas de desequili­
brio a lo largo de las líneas de la figura 15-6 no se contara con una
base racional para seleccionar los marcadores que deben utilizar­
se. No obstante, también es claro que, al contrario de los cálculos
de Kruglyak (1999), en muchos casos el desequilibrio es lo bas­
tante extenso para proporcionar una posibilidad razonable de éxi­
to de los estudios de asociación de SNP en las escalas actuales.
15.7 i GENERALIDADES Y RESUMEN 461
Una vez que se eligen los SNP apropiados para estudio, el princi­
pal problema es la heterogeneidad alélica. Las enfermedades infla­
matorias del intestino (sección 15.6.6) ilustran a la perfección la
forma en que los estudios de potencia de asociación se hunden
rápidamente tan pronto existe más de un alelo de susceptibilidad
común en un locus de riesgo. Los cálculos de Risch y Merikan-
gas (1996), que influyeron tanto en el impulso de estudios de
PDT al frente de la investigación de enfermedades complejas,
consideran un alelo de susceptibilidad aislado en el locus de en­
fermedad. Es importante recordar que sus cálculos se aplican a
ese alelo y no a la influencia total del locus en la enfermedad. El
grado de heterogeneidad alélica en un locus de susceptibilidad
surge como un determinante fundamental del éxito o el fracaso.
¿La mayor parte de los alelos de susceptibilidad antiguos la cons­
tituyen polimorfismos comunes (la hipótesis de “enfermedad co­
mún-variante común”), o un conjunto heterogéneo de mutaciones
raras recientes, como la mayor parte de las enfermedades mendelia-
nas? Se conocen argumentos para ambas posiciones (Reich y Lan-
der, 2001; Pritchard, 2001; Wright y cois., 2003). El jurado aún está
preparado.
15.7.2 Si todo funciona y se identifican alelos
de susceptibilidad, ¿entonces qué?
En el supuesto de que puede hacerse funcionar, la identificación
de factores de susceptibilidad para una enfermedad debe au­
mentar el conocimiento de su patogénesis. Aunque ello no con­
duce de manera automática a una mejoría del tratamiento -es
posible que un padecimiento permanezca incurable inclusive si
se comprende bien y en ocasiones la terapéutica puramente sin­
tomática es muy eficaz- comprender la patología debe permitir
establecer conductas para el tratamiento más razonables y diri­
gidas. Los pacientes con genotipos distintos pueden tener dife­
rencias en la patología subyacente y por tanto en la respuesta a
diversos fármacos.
Es mucho menos claro si la identificación de factores de riesgo
conducirá a una preven ción efectiva. Los adelantos técnicos en la
genotipificación de alto rendimiento permitirán seleccionar a la
población con mayor facilidad, pero siempre es imperativo pre­
guntarse si esta selección será eficaz para el costo y aceptable des­
de el punto de vista ético. Los condiciones necesarias se comentan
con detalle en la sección 18.3. El punto único más esencial, de ma­
yor importancia aún que cualquier problema técnico, es que la
identificación de una persona con riesgo debe conducir a cierta ac­
ción útil. En general se habla de cambios en el estilo de vida. La
terapéutica farmacológica profiláctica sólo se justificará si es posi­
ble dirigirla a un número pequeño de personas con riesgo alto y
estos grupos son característicos de enfermedades mendelianas más
que complejas. Pharoah y colaboradores (2002) también estable­
cen el punto importante de que en los casos en que se identifican
personas con riesgo alto mediante genotipificación de múltiples
locus, las intervenciones que se basan en mecanismos específicos
de predisposición tal vez sólo aborden una pequeña parte específi­
ca de su riesgo adicional.
La capacidad para definir la susceptibilidad genética contri­
buirá de modo considerable a identificar factores de estilo de vida
462 CAPITULO QUINCE j MAPEO EIDENTIFICACIÓN DE GENES
importantes. Éstos podrían determinarse con mucho mayor facilidad
en una cohorte que se sabe que es susceptible genéticamente en su
totalidad. Las opiniones respecto al impacto que ese conocimiento
podría tener difieren con amplitud. Las dos posiciones extremas po­
drían caricaturizarse como las posturas con la cabeza en las nubes y
la cabeza en la arena (fig. 15-9). La postura con la cabeza en las nu­
bes asume que no sólo podrían identificarse cambios en el estilo de
c y
¡E U R E K A !
LA MEDICINA PEI-
SI GIO XXI CAMBIARÁ ’
VE "DIAGNÓSTICO
+ TRATAMIENTO" A
"PREDICCIÓN + M O P 6 U
PREVENTIVO"
> ■
r
Fig. 15-9. Cabeza en las nubes y cabeza en ia arena: imágenes contrastantes del impacto que la Identificación de factores de susceptibilidad para
una enfermedad compleja ejerce sobre la medicina del siglo xxi.
Cartoon by Maya Evans.
Lecturas adicionales
Cardon LR, Bell Jl (2001) Association study designs for complex
diseases. Nature Rev. Genet. 2, 91-99.
Falconer DS, Mackay TFC (1996) Introduction to Quantitative
Genetics. Longman, Harlow.
Kety SS, Rowland LP, Sidman RL, Matthysse SW (eds) (1983)
Genetics of Neurological and Psychiatric Disorders. Raven Press,
New York.
Ott J (1999) Analysis of Human Genetic Linkage, 3a. ed. Johns
Hopkins University Press, Baltimore.
Bibliografía
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Alzheimer disease. J.A.M.A. 274, 1627-1629.
Almasy L, Blangero J (1998) Multipoint quantitative-trait linkage
analysis in general pedigrees. Am. J. Hum. Genet. 6 2 ,1198-1211.
Altmüller J, Palmer LJ, Fischer G, Scherb H, Wjst M (2001)
Genomewide scans of complex human diseases: true linkage is
hard to find. Am. J. Hum. Genet. 69, 936-950.
vida muy protectores sino que también la persona seguiría el conse­
jo para adoptarlos. Esto parece un poco optimista si se considera
la epidemia actual en la mayor parte de los países desarrollados de
una enfermedad por completo prevenible causada por el tabaquis­
mo, la obesidad y la falta de actividad. No obstante, no debe colap-
sarse hacia el pesimismo: el esfuerzo habrá valido la pena si es posible
prevenir con efectividad inclusive una enfermedad frecuente.
"V
ÍWO FUNCIONARÁ!
LA MAYOR PARTE
V e LOS FACTORES
VB RIES<30 MO TIEUE
UTIUPAP PREPICTIVA...
LA PREDICCIÓN
^RARA VEZ COUVUCe
I A UKiA PREVEMCIÖW
EFECTIVA,
Pollen DA (1996) Hannah's Heirs (expanded edition). Oxford
University Press, Oxford.
Rosenthal D, Kety SS (1968) The transmission of Schizophrenia.
Pergamon Press, Oxford.
Sham S, Zhao J (1998) Linkage analysis using affected sib-pairs
In: Guide to Human Genome Computing, 2a. ed. (ed. M.
Bishop). Academic Press, San Diego CA.
Terwilliger J, Ott J (1994) Handbook for Human Genetic Linkage.
Johns Hopkins University Press, Baltimore.
Altshuler D, Hirschhorn JN, Klannemark M et al. (2000a) The
common PPAR-y Pro12Ala polymorphism is associated with
decreased risk of type 2 diabetes. Nature Genet. 26, 76-79.
Altshuler D, Daly M, Kruglyak L (2000b) Guilt by association.
Nature Genet. 26, 135-137.
Amlel J, Lyonnet S (2001) Hirschsprung disease, associated syn­
dromes and genetics: a review. J. Med. Genet. 38, 729-739.
CAPÍTULO D IECISÉIS

Patología m olecular

Contenido del capítulo

466 CAPÍTULO DIECISÉIS PATOLOGÍA MOLECULAR
16.1 Introducción
La patología molecular trata de explicar por qué un cambio genético
determinado debe dar por resultado un fenotipo clínico particular.
En el capítulo 11 se revisaron la naturaleza y los mecanismos de las
mutaciones (que se resumen de manera breve en el recuadro 16-1);
este capítulo se relaciona con los efectos en el fenotipo. La patología
molecular debe resolver el efecto de una mutación en la cantidad o
función del producto génico y explicar por qué el cambio es pató­
geno o no para cualquier célula, tejido o etapa del desarrollo en par­
ticular.
Con base en la complejidad de las interacciones genéticas, no
sorprende que la patología molecular sea una ciencia muy imper­
fecta. Los mayores éxitos hasta la fecha se dan en el conocimiento
del cáncer, en el que el fenotipo por explicar —proliferación celular
incontrolable- es hasta cierto punto simple, y en las hemoglobino-
patías —en las que la patología es un resultado muy directo de una
anormalidad de la globina-. En la mayor parte de las enfermedades
genéticas las características clínicas son el resultado final de una ca­
dena larga de causas y el grial de la patología molecular, y nunca se
obtendrá la correlación genotipo-fenotipo porque en realidad
aun las enfermedades mendelianas “simples” no son simples en lo
absoluto (Scriver y Waters, 1999; Dipple y McCabe, 2000; Weat-
herall, 2001). Estas revisiones, en especial la de Scriver y Waters, se
recomiendan firmemente (véanse Lecturas adicionales).
A pesar de todas las dificultades, los humanos tienen una gran
ventaja para quienes estudian la patología molecular: se sabe mu­
cho más acerca de los fenotipos humanos que de cualquiera otro
organismo. No sólo es más probable que se note una variante sutil
en un humano que en una mosca o un gusano, sino que los siste­
mas de cuidados de la salud en todo el mundo actúan como una
selección de mutaciones gigantesca y continua. Es probable que
cualquier fenotipo humano que ocurre con una frecuencia mayor
de 1 en 109 ya esté descrito en alguna parte en la bibliografía. Más
aún, se conocen muchas mutaciones distintas en casi todos los ge­
nes de enfermedad identificados. No es posible realizar experimentos
en humanos o aparearlos a voluntad, pero brindan oportunidades
únicas para observar los efectos fenotípicos de muchos cambios di­
ferentes en un gen determinado. Conforme el énfasis del Proyecto
del Genoma Humano progresó de catalogar genes a conocer su
función, el estudio de la patología molecular avanzó a la etapa cen­
tral. Los estudios en humanos generan hipótesis, que luego deben
probarse en animales. Por tanto, la investigación de muchos genes
en humanos que ocurren de manera natural se complementan con
estudios de mutaciones naturales específicas o por ingeniería en
animales (véase cap. 20).
Recuadro 16-1. P rin cip a les clases de mutación
Deleciones, varían de un pb a megabases
Inserciones, inclusive duplicaciones
Sustituciones de base única;
mutaciones de sentido erróneo, sustituyen un aminoácido con otro
en el producto génico;
mutaciones sin sentido, reemplazan un codón aminoácido con un
codón de detención;
mutaciones de sitio de empalme, crean o destruyen señales para
empalme de exón-intrón
16.2 La no m enclatura conveniente de
alelos A y a oculta una inm ensa
diversidad de secuencias de DNA
Cuando se describe el genotipo de un portador de fibrosis quística
como Ag, lo que se quiere indicar con a es cualquier secuencia gé-
nica CFTR mutada de tal manera que no produce un canal de clo­
ruro funcional. Se describieron ya más de 750 de estos alelos
diferentes. De igual forma A indica cualquier secuencia funcional;
la secuencia real de DNA de genes A en personas no relacionadas
no siempre será 100% idéntica. Para asesoría genética y análisis de
genealogías es el nivel más útil de descripción, pero para patología
molecular es necesario observarlo más de cerca. El recuadro 16-1
contiene un breve resumen de los múltiples tipos de cambios de
secuencias de DNA que se observan en mutaciones patógenas y el
recuadro 16-2 resume las convenciones para describirlos.
Un problema en patología molecular es que no se cuenta
con una base de datos amplia que incluya una lista de todas las
mutaciones humanas conocidas. La Human Mutation Database
(www.hgmd.org) tiene listados útiles para varios genes pero no es
amplia, en tanto que OMIM sólo es un intento bastante indi­
ferente e inconsistente de listar alelos mutantes. A esta informa­
ción no puede accederse a través de PubMed porque las revistas
de investigación no suelen publicar informes de mutaciones
nuevas en genes bien estudiados. En la actualidad se realizan in­
tentos para remediarlo a través de HUGO Mutation Database
Initiative (véase www.genomic.unimelb.edu.au/mdi/ para deta­
lles y muchos enlaces útiles).
16.3 Una prim era clasificación
de m utaciones con pérdida
de función com paradas con
m utaciones con ganancia
de función
16.3.1 El aspecto importante para la patología
molecular no es la secuencia de una alelo
mutante sino su efecto
En estudios genéticos es importante conocer las secuencias de un ale­
lo mutante (cap. 18), pero en patología molecular es necesario cono­
cer lo que sucede en consecuencia. Un gen mutado podría tener toda
clase de efectos sutiles en un organismo, pero una primera pregunta
valiosa es si produce una pérdida o una ganancia de función.
Cambios de marco, pueden producirse por deleciones, inserciones o
errores de empalme.
Mutaciones dinámicas, son repeticiones tándem que suelen cambiar de
tamaño en la transmisión a niños
Véanse cuadro 16-1 para algunos ejemplos y capítulo 11 para más deta­
lles y comentarios respecto a los mecanismos.
 16.3
Recuadro 16-2. Nomenclatura para describir cambios de secuencia
Véanse www.dmd.nl/mutnomen.html y Den Dunnen y Antonarakis (2001)
para detalles completos.
Sustituciones de aminoácidos
Comenzar con 'p .' para Indicar la proteína si es necesario. Utilizar los
códigos de una letra: A, alanina; C, cisterna, D, ácido aspártico; E, ácido
glutámico; F, fenilalanina; G, glicina; H, histidina; I, isoleucina; K, lisina;
M, metionina; N, asparagina; R prolina; Q, glutamina; R, arginina; S, se-
rina; T, treonina; V, valina; W, triptófano; Y, tirosina; X significa un codón
de detención. También los códigos de tres letras son aceptables.
P.R117H o Arg117His: reemplaza arginina 117 por histidina (la metioni­
na de inicio es el codón 1 ).
P.G542X o Gli542Stop: glicina 542 sustituida por un codón de detención.
Sustitución de nucleótido
Comenzar con 'g .' (genómico) o 'c .' (cDNA) si es necesario. La A del
codón de inicio ATG es + 1 ; la base precedente es - 1 .
► En las mutaciones con pérdida de función el producto no
tiene función o ésta es reducida.
► En las mutaciones con ganancia de función el producto ha­
ce algo positivamente anormal.
El recuadro 16-3 muestra una forma de describir estos efectos.
Las mutaciones con pérdida de función suelen producir fenoti­
pos recesivos. En casi todos los productos génicos la cantidad pre­
cisa no es crucial y puede obtenerse alrededor de la mitad de la
normal. Por consiguiente la mayor parte de los errores innatos del
metabolismo es recesiva. Sin embargo, en algunos productos géni­
cos 50% del valor normal no es suficiente para una función nor­
mal y la haploinsuficiencia produce un fenotipo anormal, que en
consecuencia se hereda en una forma dominante (véase sección
16.4.2). Asimismo en ocasiones un polipéptido mutante no fun­
cional interfiere con la función del alelo normal en una persona he-
terocigota y da un efecto dominante negativo (un antimorfo en la
terminología del recuadro 16-3; véase sección 16.4.3).
Las mutaciones con ganancia de función suelen causar fenoti­
pos dominantes porque la presencia de un alelo normal no impide
que el alelo mutante se comporte de manera anormal. Con fre­
cuencia esto incluye un sistema de control o señalamiento que se
comporta de modo inapropiado -señala cuando no debe o no su­
prime un proceso cuando debería hacerlo-. A veces la ganancia de
función consiste en que el producto realiza algo nuevo —p. ej., una
proteína que contiene una repetición poliglutamina extendida que
forma agregados anormales-.
Algunas mutaciones no pueden clasificarse con facilidad como
pérdida o ganancia de función. ¿Un canal de iones abierto en for-
Recuadro 16-3. Nomenclatura para describir el efecto de un alelo
Alelo nulo o amorfo: alelo que no produce un producto
Hipomorfo: alelo que produce una cantidad o actividad reducida de pro­
ducto
Hipermorlo: alelo que produce una cantidad o actividad mayor de pro­
ducto
UNA PRIMERA CLASIFICACIÓN DE MUTACIONES. . . ! 467
No hay cero. Dar al nucleótido el número seguido por el cambio. Para
cambios dentro de intrones, cuando sólo la secuencia de cDNA se cono­
ce completa, especificar el número de intrón mediante IVSn o el número
de la posición del exón más cercano.
g.1162G^A: reemplaza la guanina en la posición 1165 por adenina.
g.621+1G ->T o IVS4+1G-»T: sustituye G por T en la primera base del
intrón 4; el exón 4 termina en nt 621.
Deleciones e inserciones
Utilizar del para deleciones e ins para inserciones. Como arriba, en cambios
del DNA la posición o intervalo del nucleótido va primero, para cambios de
aminoácidos primero se incluye el símbolo del aminoácido.
p.F508del: deleción de la fenilalanina 508.
c.6232_6236del o c.6232_6236delATAAG: deleción de cinco nucleóti-
dos (que pueden especificarse) a partir de nt 6232 del cDNA.
g.409_41 OinsC: insertó C entre nt 409 y 410 del DNA genómico.
ma permanente perdió la función de cerrar o ganó la función de
abertura inapropiada? Un alelo mutante negativo dominante per­
dió su función pero también efectúa algo positivamente anormal.
Una mutación puede cambiar el balance entre varias funciones de
un producto génico. No obstante, la distinción entre pérdida y ga­
nancia de función es el primer elemento esencial para pensar res­
pecto a patología molecular.
16.3.2 Una pérdida de función es probable cuando las
mutaciones de punto en un gen producen el
mismo cambio patológico que las deleciones
Las pruebas puramente genéticas, sin estudios bioquímicos, a me­
nudo sugieren si un fenotipo se debe a pérdida o ganancia de fun­
ción. Cuando un fenotipo clínico es resultado de pérdida de función
de un gen cabría esperar cualquier cambio que inactive el producto
génico para producir el mismo resultado clínico. Es necesario en­
contrar mutaciones de punto que tienen el mismo efecto que las
mutaciones que eliminan o alteran el gen. El síndrome de Waar-
denburg tipo 1 (MIM 193500: pérdida de la audición y anormali­
dades pigmentarias) constituye un ejemplo. Como se muestra en la
figura 16-1, las mutaciones causales en el gen PAX3 incluyen susti­
tuciones de aminoácidos, cambios de marco, mutaciones de empal­
me y en algunos pacientes deleción completa del gen. Como todos
estos acontecimientos producen el mismo resultado clínico, su cau­
sa debe ser una pérdida de función de PAX3. De igual forma las en­
fermedades originadas por repeticiones de trinucleótidos inestables
(sección 16.6.4), X frágil y ataxia de Friedreich en ocasiones son
causadas por otros tipos de mutación en sus genes respectivos, lo
Neomorfo: alelo con actividad o producto nuevo
Antimorfo: alelo cuya actividad o producto antagoniza la actividad del
producto normal
468 CAPÍTULO DIECISÉIS PATOLOGÍA MOLECULAR

que señala una pérdida de función, en tanto que la enfermedad de
Huntington nunca se observa con ningún otro tipo de mutación,
lo que sugiere una ganancia de función.
16.3.3 Una ganancia de función es probable cuando
sólo una mutación específica en un gen produce
una patología determinada
Es probable que la ganancia de función requiera un cambio
mucho más específico que la pérdida de función. La gama mu-
tacional en padecimientos con ganancia de función debe ser co­
rrespondientemente más restrictiva y el mismo padecimiento no
ha de producirse por deleción o alteración del gen. Los ejemplos
usuales incluyen la enfermedad de Huntington (sección 16.6.4)
y la acondroplasia (MIM 100 800: enanismo por miembros
cortos). Casi todos los acondroplásicos tienen el mismo cambio
de aminoácido, G380R, en el receptor del factor de crecimiento de
fibroblastos FGFR3. Otras sustituciones en la misma proteína
producen otros síndromes (sección 16.7.3). Por razones que se
desconocen, la tasa de mutaciones de G380R es en extremo alta, de
manera que la acondroplasia es una de las anormalidades genéti­
cas más frecuentes a pesar de que requiere un cambio de secuen­
cias de DNA muy específico.
Aunque la homogeneidad mutacional es un indicador de ganan­
cia de función, hay otras razones por las que una mutación aislada
puede constituir la mayor parte de todos los casos de una enfermedad:
► las enfermedades en las que se observa una relación muy direc­
ta con el producto génico en sí mismo, en lugar de una conse­
cuencia más remota del cambio genético, pueden definirse en
términos de un producto variante particular, como la enferme­
dad de células falciformes (véase recuadro 16-4);
► algún mecanismo molecular específico puede ha cer un cambio
en cierta secuencia en un gen con mucho mayor probabilidad
que cualquiera otro cambio; por ejemplo, la expansión CGG
en el síndrome de X frágil (sección 16.6.4);
► puede haber un efecto fundador; p. ej-, ciertas mutaciones de
enfermedad son frecuentes entre judíos ashkenazis y tal vez re­
flejen mutaciones presentes en un número bastante pequeño de
fundadores de la población ashkenazi actual (Motulsky, 1995);
► la selección que favorece heterocigotos (sección 4.5.3) incremen­
ta los efectos fundadores y a menudo ocasiona que una o unas
cuantas mutaciones específicas sean frecuentes en una población.
16.3.4 Puede ser difícil decidir si el cambio en una
secuencia de DNA es patógeno
No todas las variantes de secuencia que se observan en una perso­
na afectada son patógenas ¿Cómo es posible decidir si un cambio
de secuencia descubierto es la mutación patógena que se busca o
una variante innocua? Los criterios, en orden descendente de con-
fiabilidad, son:

451 + 1 G > T Q 254X

M u ta c io n e s tru n c a n te s
4 5 2 -2 A > G 8 7 4 -8 7 5 in s G • Sin s e n tid o
■ E m p a lm e
+ In s /d e ln
^ + ++
+ •
+ +
+ + • +• +

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

H h

u ■■■ ■

J
A 1 9 6 T -1 R 271C ►■
■
M u ta c io n e s no tru n c a n te s
■ S e n tid o erró n e o
+ D e le c ió n en m a rc o

__ ___
I I Dominio pareado I I H o m e o d o m in io

Fig. 16-1. Mutaciones con pérdida de la función del gen PAX3.

Se muestran los 10 exones del gen como cuadros, con los intrones de conexión; no están en escala. Las áreas sombreadas indican la secuencia que
codifica los dos dominios de enlace de DNA de la proteína PAX3. Obsérvese que las mutaciones que destruyen por completo la estructura de la proteína
PAX3 (se dibujan arriba del diagrama génico) están dispersas cuando menos sobre los seis primeros exones del gen, pero las mutaciones de sentido
erróneo (se muestran abajo del diagrama del gen) están concentradas en dos regiones, la parte 5 ' del dominio pareado y la tercera hélice del
homeodominio. Se piensa que A196T afecta el empalme. Las otras mutaciones mencionadas se comentan en el cuadro 16-1. La mutación 874-875insG
introduce un séptimo G en un grupo de seis G; puede surgir de manera Independiente varias veces e ilustra la frecuencia hasta cierto punto alta del
pareamiento erróneo de cadena deslizada (sección 11.3.1).

1) estudios funcionales que muestran que el cambio es patógeno;
2) precedente: ese cambio se observó antes en pacientes con esta
enfermedad (y no en testigos étnicamente comparables);
3) una mutación nueva, que no está presente en los padres, en una
persona con una enfermedad nueva-,
4) un cambio de secuencia nuevo que no se encuentra en un gru­
po de, por ejemplo, 100 testigos normales;
5) la naturaleza del cambio de secuencia (véase recuadro 16-5).
Los estudios funcionales son el estándar ideal; ninguno de los otros
criterios es por completo seguro. Como se explicó, para fenotipos con
ganancia de función es probable que la causa sea muy específica.
Cualquier cambio de secuencia diferente de la mutación estándar
tal vez no sea patógeno, cuando menos para la enfermedad en cues­
tión. Los padecimientos con pérdida de función originan mucho
más preguntas de interpretación.
16.4 M utaciones con pérdida de
función
16.4.1 Muchos cambios distintos en un gen pueden
causar pérdida de función
No sorprende que las formas de reducir o abolir la función de un
producto génico sean muchas (cuadro 16-1). Algunas de ellas se co­
mentan en la sección 11.4. Las hemoglobinopatías (recuadro 16-4)
ejemplifican especialmente bien muchos de estos mecanismos. De
hecho las globinas podrían utilizarse para ilustrar casi todos los pro­
cesos que se describen en este libro. Se recomienda a los lectores
consultar una revisión como la de Weatherall y colaboradores
(2001; véase Lecturas adicionales) para obtener una descripción pa­
ralela de patología molecular.
El recuadro 16-5 presenta ciertos lineamientos para considerar
el resultado probable de una mutación en el producto génico.
Recuadro 16-4. Hemoglobinopatías
Las hemoglobinopatías ocupan un sitio especial en la genética clínica por
muchas razones. Son con mucho las enfermedades mendelianas impor­
tantes más frecuentes en el mundo. Las globinas ilustran aspectos esen­
ciales de la evolución del genoma (figs. 12-4 a 12-6) y de enfermedades
en poblaciones. Es probable que los controles del desarrollo en las globi­
nas se comprendan mejor que los de cualquier otro gen humano (figs. 10-
22, 10-23). Se describen más mutaciones y enfermedades para las
hemoglobinas que para cualquier otra familia géníca. Los síntomas clíni­
cos son consecuencia muy directa del mal funcionamiento de la proteí­
na, que es fácil estudiar con 15 g por 100 mi de sangre, de modo que la
relación entre los acontecimientos moleculares y clínicos es más clara en
las hemoglobinopatías que en la mayor parte de las otras enfermedades.
Las hemoglobinopatías se clasifican en tres grupos principales:
► Talasemias, que son causadas por cantidades inadecuadas de las
cadenas a o (3. Los alelos se dividen en los que no producen pro­
ducto (a°, (3o) y en los que elaboran cantidades reducidas del m is­
mo ( a + , |3+ ). Los defectos subyacentes incluyen los de todos los
tipos que se detallan aquí y en la sección 16.4 (véase también cua­
dro 18-5).
16.4 MUTACIONES CON PÉRDIDA DE FUNCIÓN [ 469
Las deleciones e inserciones pequeñas tienen un efecto mucho más
drástico en el producto génico si introducen un cambio de marco
(es decir, si añaden o eliminan varios nucleótidos que no son un múl­
tiplo exacto de tres). Las deleciones en el gen de distrofina consti­
tuyen ejemplos notables (fig. 16-2). En general las deleciones con
cambio de marco producen la distrofia muscular de Duchenne gra­
ve, en la que no se produce distrofina, en tanto que las mutaciones
sin cambio de marco causan la forma más leve de Becker, en la que
existe distrofina pero es anormal.
Por lo general las mutaciones sin sentido (las que generan codo-
nes de terminación prematura) funcionan como alelos nulos por­
que desencadenan una declinación de mRNA mediada sin
sentido (Hentze y Kulozik, 1999). Es raro que el mRNA se traduz­
ca para producir una proteína truncada. La declinación mediada
sin sentido es usual siempre que un codón de terminación prema­
tura se encuentra cuando menos 50 nucleótidos corriente arriba de
la última unión de empalme. Véase Likke-Andersen y colaborado­
res (2001) para detalles del mecanismo.
A menudo las mutaciones d e em palme (splicing) se consideran só­
lo como mutaciones que alteran las secuencias GT...AG conserva­
das en los extremos de intrones. De hecho una variedad mucho
más alta de cambios de secuencia puede afectar el empalme, pero es
difícil predecir estos efectos. Por tanto muchas mutaciones que afec­
tan el empalme no se reconocen a menos que se realicen estudios
de PCR-RT y esta clase de mutación se diagnostica mucho menos.
Es posible observar varios ejemplos entre las mutaciones de globi-
na (3 que se incluyen en el cuadro 18-5. Tres tipos de cambio de se­
cuencia causan empalme aberrante:
► alteraciones de los sitios de empalme normales: el empal­
me (splice, corte y unión) (sección 11.4.3) no sólo requiere la
secuencia canónica GT...AG, sino también un contexto de se­
cuencia definida de manera menos rígida que rodea el sitio. Los
cambios aquí pueden alterar la relación de diferentes isoformas
de empalme en lugar de abolir el empalme por completo; p.
ej., el polimorfismo 5T/7T/9T en el intrón 8 del gen CFTR
(véase MIM 602 421) altera la proporción de transcritos que
► Hemoglobinas anormales con cambios de aminoácidos, que ocasio­
nan una diversidad de problemas, de los que la enfermedad de células
falciformes es la que mejor se conoce. La mutación E6V reemplaza un
aminoácido polar por uno neutral en la superficie externa de la molécu­
la de globina (3. Esto origina un incremento en la adherencia intermole­
cular, que conduce a la agregación de desoxihemoglobina y la
deformación de los glóbulos rojos. Las células falciformes tienen un
tiempo de supervivencia menor (que da lugar a anemia) y tienden a
ocluir capilares, lo que origina isquemia e infarto de órganos corriente
abajo del bloqueo. Otros cambios de aminoácidos pueden causar ane­
mia, cianosis, policitemia (número excesivo de glóbulos rojos), metahe-
moglobinemia (conversión del hierro del estado ferroso al férrico), etc.
► Persistencia hereditaria de hemoglobina fetal, causada por un de­
fecto en el cambio normal de hemoglobina fetal a la del adulto, pue­
de ser un modificador importante de los efectos clínicos de las otras
dos clases de mutantes.
Véase Weatherall y colaboradores (2001; Lecturas adicionales) para una
revisión amplia.
470 i CAPÍTULO DIECISÉIS PATOLOGÍA MOLECULAR

Cuadro 16-1. Once formas de reducir o suprimir la producción de un producto génico funcional.
C a m b io E je m p lo

Deleción:

a) todo el gen Casi todas las mutaciones de talasemia a (fig. 16-3)

b) parte del gen 60% de la distrofia muscular de Duchenne (fig. 16-2)

Inserción de una secuencia en el gen Inserción de secuencias repetidas LINE-1 (véase sección 11.5.6) dentro del gen
F8 en la hemofilia A
Alterar la estructura génica:

a) mediante una translocación Translocaciones del autosoma X en mujeres con distrofia muscular de Duchenne
(fig. 14-10)
b) por una inversión Inversión en el gen F8 (fig. 11-20)

Prevenir la actividad del promotor:

a) mediante mutación Mutación de globlna (3 g.-29A-*G (cuadro 18-5)

b) por metilación Gen CDKN2A en muchos tumores (sección 17.6.1)

Desestabilización del mRNA:

a) mutación del sitio de poliadenilaclón Mutación de globina a g.AATAAA->AATAGA

b ) por declinación del RNA mediada sin sentido Globina |3 p.Q39X

Prevención del empalme correcto (sección 11.4.3)

a) inactivación del sitio de empalme donador Mutación P/IX3g.451 + 1G -*T (fig. 16-1)

b) inactivación del sitio de empalme aceptor Mutación PAX3g.452-2A-*G (fig. 16-1)

c) alteración de un intensificador de empalme exónico Exón SMN2 7 g.C6T (Cartegni y Krainer, 2002)

d) activación de un sitio de empalme crítico (puede ser profundo LGMD2A G624G (fig. 11-12)
dentro de un intrón)
Mutación de globina p IVS1-110G—*A (cuadro 18-5)

C /7 fl3 8 4 9 + 1 0 k b C - T (cuadro 18-6)

Introducción de un cambio de marco en la traducción Mutación PAX3g.874_875ínsG (fig. 16-1)

Conversión de un codón en un codón de detención Mutación PAX3p.Q254X (fig. 16-1)

Sustitución de un aminoácido esencial Mutación PAX3p.R271C (fig. 16-1)

Prevención del procesamiento postranscripcional Propéptido terminal N de colágena resistente a corte en el síndrome de Ehlers
Danlos VII (sección 16.6.1)

Prevención de la localización celular correcta del producto Mutación p.F508del en fibrosis quística

Recuadro 16-5. Lineamientos para estimar la significancia de un cambio de secuencia de DNA

► Las deleciones de todo el gen, las mutaciones sin sentido y los cam ­
bios de marco destruyen casi con certeza la función.
► Las mutaciones que cambian los nucleótidos GT...AG conservados
que flanquean la mayor parte de los intrones afectan el empalme y
por lo general suprimirán la función génica. Muchos otros cambios de
secuencia pueden afectar el empalme pero en formas mucho más di­
fíciles de predecir (véase más adelante).
► Es más probable que una mutación de sentido erróneo sea patógena
si afecta una parte de la proteína que se sabe que es funcionalmente
importante. El modelo de computadora de la estructura proteínica
puede ayudar a sugerir los residuos que son críticos. Por ejemplo, las
mutaciones de sentido erróneo de la figura 16-1, que causan pérdida
de la función, se concentran en los dominios de enlace de DNA fun­
damentales de la proteína PAX3.
► Es más factible que el cambio de un aminoácido afecte la función si
ese aminoácido se conserva en genes relacionados (ortólogos o pa­
tólogos).
► Es más probable que las sustituciones de aminoácidos afecten la fun­
ción si no son conservadoras (sustitución de un aminoácido polar por
otro no polar o de uno ácido por otro básico; véase recuadro 11-3).
 16.4 MUTACIONES CON PÉRDIDA DE FUNCIÓN | 471

N --H
h-------------- H

Fig. 16-2. Oeleciones en la parte central del gen de distrofína en pacientes con distrofia muscular de Duchenne o de Becker.
Los cuadros numerados representan los exones 45 a 55. Los números arriba de cada cuadro muestran el efecto que tiene la deleción del exón en el
marco de lectura (0 sin efecto, -1 cambio de 1 nucleótido retrógrado, + 1 cambio de 1 nucleótido anterógrado). Las barras rojas muestran deleciones
en pacientes con DMD letal, las barras en azul indican deleciones en pacientes con DMB más leve. En general las deleciones de cambio de marco
causan DMD y las neutrales de marco producen DMB. Las excepciones se indican mediante líneas de guiones. Las posibles razones de las excepciones
incluyen deleciones que terminan dentro de un exón, acciones de genes modificadores o efectos ambientales, o tal vez errores clínicos o de laboratorio.
Datos del sitio de red (website) Leiden Muscular Dystrophy w w w.dm d.nl, que deben consultarse para obtener información más completa de los datos
básicos. La figura 18-6 muestra cómo se caracterizan estas deleciones en el laboratorio.

brincan el exón 9. Es probable que estos efectos contribuyan
con frecuencia a una enfermedad genética, en especial quizá
susceptibilidad a enfermedades frecuentes (Nissim-Rafinia y
Kerem, 2002);
► alteraciones de intensificadores o silenciadores de empalme:
estas secuencias importantes pero mal definidas pueden locali­
zarse en exones o intrones (Nissim-Rafinia y Kerem, 2002). Car-
tegni y Krainer (2002) proporcionan un ejemplo en particular
claro de una mutación que altera un intensificador de empalme
sónico;
► activación de sitios de empalme críptico: las sustituciones
de bases al parecer innocuas pueden dar lugar a que una se­
cuencia antes inactiva se utilice como sitio de empalme. El si­
tio críptico puede encontrarse en un exón o un intrón. La
figura 11-12 muestra un ejemplo. Si el sitio está situado a
profundidad en un intrón, la mutación podría pasarse por al­
to sin estudios de PCR-RT; p. ej., la mutación CFTR 3849 +
lOkbC -* T activa un sitio de empalme críptico situado 10 kb
dentro del intrón 19.
16.4.2 En la haploinsuficiencia una reducción de 50%
del nivel de la función génica causa un fenotipo
anormal
Las mutaciones con pérdida de función tienden a ser recesivas porque
a menudo los heterocigotos funcionan en forma perfectamente nor­
mal. Esto a veces se debe a que asas de retroalimentación en la trans­
cripción o el nivel de actividad de la proteína compensan la dosis
reducida, pero en muchos casos la célula y el organismo son capaces
de funcionar de modo normal con apenas 50% del nivel de la acción
génica. Hasta cierto punto pocos genes muestran haploinsuficiencia;
el cuadro 16-2 presenta algunos ejemplos. Otros cuantos genes mues­
tran otras formas de sensibilidad de dosis (véase fig. 16-3 y 16-8).
Sería razonable preguntarse por qué debe haber sensibilidad de
dosis para cualquier producto génico ¿Por qué la selección natural
no manejó mejor las cosas? Si un gen se expresa de modo que dos
copias produzcan una cantidad apenas suficiente del producto, la
selección de variantes con valores más altos de expresión debe con­
ducir a la evolución de un organismo más robusto, sin un precio
472 CAPÍTULO DIECISÉIS PATOLOGÍA MOLECULAR

a l ex I a | a «I J a|
\ |/ a
o
alai a a l

\|/a N o rm a l C a rá c te r d e A n e m ia leve
ta la s e m ia -a + (ta l-a +)

; ; C ruzam iento R e p e tic ió n X E n fe rm e d a d H id ro p e s ía

\i entre repeticio- R e p e tic ió n Z HbH feta l
'■ nes alineadas
erróneam ente
1

Fig. 16-3. Deleciones de genes de globina a en la talasemla a

Las copias normales del cromosoma 16 llevan dos genes de globina a activos y un seudogén inactivo dispuesto en tándem. Los bloques repetidos
(marcados X y Z) pueden alinearse de modo erróneo y permitir un cruzamiento desigual. El diagrama muestra cruzamiento desigual entre las
repeticiones Z mal alineadas que produce un cromosoma que sólo lleva un gen a activo. Los cruzamientos desiguales entre repeticiones X tienen un
efecto similar. Los cruzamientos desiguales entre otras repeticiones (no se muestran) suelen producir cromosomas que llevan un gen a no funcional.
Por consiguiente los individuos pueden tener cualquier número de 0 a 4 o más genes de globina a. Las consecuencias se tornan más graves conforme
el número de genes a disminuye. Véase Weatherall y colaboradores (Lecturas adicionales) para detalles.

obvio que pagar. La respuesta es que en la mayor parte de los casos
esto en realidad sucedió -ésta es la razón por la que relativamente
pocos genes son sensibles a dosis-. Sin embargo, ciertas funciones
génicas son sensibles a dosis de manera inherente. Incluyen:
► productos génicos que son parte de un sistema de señalamien­
to cuantitativo cuya función depende de la ocupación parcial o
variable de un receptor, sitio de unión de DNA, etcétera;
► productos génicos que compiten entre sí para determinar un
cambio de desarrollo o metabólico;
► productos génicos que cooperan en interacciones con estoi-
quiometría fija (como las globinas a y p, y muchas proteínas
estructurales).
En cada caso el producto génico se ajusta contra algo más en las cé­
lulas. Lo que interesa no es el valor absoluto correcto del producto,
sino los valores relativos correctos de productos que interactúan. Los
efectos son sensibles a cambios en todos los compañeros que inte­
ractúan y en consecuencia estos padecimientos dominantes suelen
mostrar una expresión muy variable (véase sección 16.6.3). Los ge­
nes cuyos productos actúan en esencia solos, como muchas enzimas
del metabolismo solubles, rara vez muestran efectos de dosis.
Además en algunos casos en que una célula sólo con una copia
funcional de un gen apenas puede satisfacer la demanda de un pro­
ducto génico que se requiere en grandes cantidades. Un ejemplo pue­
de ser la elastina. En personas heterocigotas para una deleción o una
mutación con pérdida de la función del gen de elastina no se afectan
los tejidos que sólo requieren cantidades moderadas de elastina (piel,
pulmón), pero la aorta, que demanda mucha más elastina, a menu­
do muestra una anormalidad (estenosis aórtica supravalvular) que tal
vez requiera una intervención quirúrgica (véase sección 16.8.1).

Cuadro 16-2. Fenotipos probablemente causados por haploinsuficiencia.

Véase texto para detalles

P a d e c im ie n to M IM # Gen N ota s

Síndrome de Alagille 118450 JAG1 Véase sección 16.8.1

Exostosis múltiple 133700 EXT1 Véase cuadro 16-8
Neuropatía tomaculosa 162500 PMP22 Véase sección 16.6.2
Estenosis aórtica supravalvular 185500 ELN Véase esta sección

Síndrome trico-rino-faríngeo 190350 TRPS1 Véase cuadro 16-8

Síndrome de Waardenburg tipo 1 193500 PAX3 Véase sección 16.3.2
 16.5 ! MUTACIONES CON GANANCIA DE FUNCIÓN
16.4.3 Las mutaciones en proteínas que actúan como
dímeros y multímeros a veces producen efectos
dominantes negativos
Un efecto dominante negativo ocurre cuando un polipéptido mu­
íante no sólo pierde su función, sino también interfiere con el
producto del alelo normal en un heterocigoto. Algunas personas
argumentarían que estas son mutaciones con ganancia de función,
no pérdida de función, pero éste es sólo un argumento sobre pala­
bras. Las mutaciones dominantes negativas producen efectos más
graves que los alelos nulos simples del mismo gen. Las proteínas es­
tructurales que forman estructuras multiméricas son en particular
vulnerables a efectos dominantes negativos. Las colágenas represen­
tan un ejemplo clásico.
Las colágenas fibrilares, las principales proteínas estructurales
del tejido conjuntivo, están constituidos por hélices triples de cade­
nas polipéptidas, en ocasiones homotrímeros, a veces heterotrímeros,
que se ensamblan en una disposición de enlace cruzado empacada
de modo estrecho para formar fibrillas rígidas. En cadenas polipép­
tidas recién sintetizadas (preprocolágena), los polipéptidos en la
terminal N y la terminal C flanquean una secuencia de repetición
regular (Gli-X-Y)n, en la que X o Y suelen ser prolina y la otra es
cualquier aminoácido. Tres cadenas de preprocolágena se vinculan
y se tuercen en una triple hélice bajo el control del propéptido de
la terminal C. Tras la formación de la triple hélice, los propéptidos
de la terminal N y la terminal C se cortan y eliminan. Un polipép­
tido que forma complejos con cadenas normales pero después des­
troza la triple hélice puede reducir el rendimiento de la colágena
funcional a bastante menos de 50% (fig. 16-4). La patología mo­
lecular de mutaciones de la colágena es muy abundante y se estu­
dia más adelante (véanse sección 16.6.1 y cuadro 16-7).
Las proteínas no estructurales que se dimerizan u oligomerizan
también muestran efectos dominantes negativos. Por ejemplo, los
factores de transcripción de la familia b-HLH-Zip (fig. 10-9) unen
DNA como dímeros. Las mutantes que no se dimerizan suelen cau­
sar fenotipos recesivos, pero las mutantes que son capaces de se­
cuestrar moléculas funcionales al interior de dímeros inactivos dan
fenotipos dominantes (Hemesath y cois., 1994). Los canales iónicos
en membranas celulares proveen otro ejemplo de estructuras mul­
timéricas sensibles a efectos dominantes negativos (sección 16.6.1).
16.4.4 La modificación epigenética puede abolir la
función génica aun sin un cambio
de secuencia de DNA
Los cambios que son hereditarios (de la célula a la célula hija o del pa­
dre al niño) pero que no dependen de cambios en las secuencias del
DNA se denominan epigenéticos (sección 10.1). Un grupo de mini-
rrevisiones en el número del 1 de mayo de 1998 de Cell (Vol. 93, pp.
301 a 337) analiza muchas de las diversas facetas de la epigenética. Los
efectos epigenéticos son en particular claros en el cáncer (Jones y Bay-
lin, 2002). Para los propósitos de este capítulo el principal mecanis­
mo epigenédco de interés es la mediación del DNA. Para detalles
más amplios respecto a este tema, véase la revisión de Bird (2002).
Como se mencionó (sección 10.4.2), las bases de citosina en el
DNA humano que se encuentran cerca de la guanina (un di-
nucleótido CpG) a menudo están metiladas en el carbono 5 y la
metilación original de CpG puede transmitirse en forma estable
cuando el DNA se replica (fig. 16-5). Estos patrones de metilación
son señales importantes para controlar la transcripción de genes
473
(sección 10.4.3). La inactivación de X depende cuando menos en
parte de la metilación del DNA y la transmisión epigenética del pa­
trón de metilación asegura que se inactive la misma X en las célu­
las madre y las hijas. La metilación inapropiada puede causar una
pérdida de función patógena heredable. Por ejemplo, en muchos
tumores la función del gen supresor de tumor p l6 (CDKN2A) se
suprime por metilación del promotor en lugar de mutación de su
secuencia de DNA (sección 17.4.3). Por el contrario, se piensa que
la desmetilación inapropiada inicia la expresión de oncogenes en
tumores.
Los genes con improntas (secciones 4.3.4, 10.5.4) son un ejem­
plo en especial intrigante de modificación epigenética. Su expresión
está controlada por patrones de metilación que difieren según el ori­
gen parental del gen. Cuando el funcionamiento inadecuado del
mecanismo de improntación o el origen parental no es el esperado,
puede ocurrir una pérdida de función o una expresión inapropiada
en genes intactos. Los genes con improntas ocurren en el grupo que
contiene genes improntos tanto maternos como paternos, algunos
de los cuales sólo están improntos en ciertos tejidos. Con frecuencia
ambas cadenas de DNA poseen el potencial de transcribirse -uno de
los transcritos es un mRNA y el otro un RNA antisentido no tra­
ducible grande (> 100 kb)—,pero la transcripción de una cadena im­
pide la de la otra. Por tanto la patología molecular de enfermedades
humanas por improntación es fascinante pero muy complicada. El
recuadro 16-6 describe las enfermedades humanas por improntación
que mejor se conocen, los síndromes de l’rader-Willi y de Angel-
man; para mayor información de otras enfermedades véanse OMIM
130650 (síndrome de Beckwith-Wiedemann), OMIM 139320
(GNAS) y las revisiones de Reik y Walter (2001) y Rougeulle y
Heard (2002).
16.5 M utaciones con g anancia de
función
El cuadro 16-3 contiene una lista de varios mecanismos que pueden
producir un fenotipo con ganancia de función.
16.5.1 La adquisición de una función nueva es rara en
enfermedades hereditarias pero frecuente en el
cáncer
Realizar cambios aleatorios en un gen es muy similar a detener su
trabajo, pero es muy improbable que proporcionen una función
novedosa. El único mecanismo que suele generar genes funcionales
nuevos es cuando un reordenamiento cromosómico une exones
funcionales de dos genes distintos (fig. 17-4A). Sin duda esta mez­
cla de exones fue importante en la evolución; en patología molecu­
lar se observa más a menudo cuando conduce a cáncer. Muchos
reordenamientos cromosómicos específicos de tumor adquiridos
producen genes quiméricos con actividades nuevas que llevan a la
proliferación celular incontrolada (véase cuadro 17-3). Un caso ra­
ro de una mutación de punto hereditaria que confiere una función
nueva en una proteína es el alelo Pittsburgh en el locus P I (MIM
107 400; fig. 16-6).
16.5.2 La expresión excesiva puede ser patógena
La expresión excesiva gruesa de ciertos genes es frecuente en células
cancerosas. Los mecanismos por los que los cambios genéticos so-
474 | CAPÍTULO DIECISÉIS I PATOLOGÍA MOLECULAR

Normal OI grave OI leve

M utación en M utación
COL1A1 COL1A2 sen tid o erróneo m ayor

iti íH
locus locus
17q 7q

'O
'</> E Hí cH i H i í H i
i I
o . C

Y Y Y Y Y Y
X (Ü ,
LU y

n cadenas n cadenas n cadenas

n cadenas
2n c a d e n a s n cadenas no rm ales
V
+ n cadenas m u tan te s

K Æ S S W W i
n m oléculas de ^ m oléculas d e pro co lág en a I m oléculas d e
p ro co lág en a norm al pro co lág en a
(tres c ad en as)
+

v/\/\/\
\S \/\/\
^ c a d e n a s a2 (d eg rad ad as

2?4 m oléculas d e
pro co lág en a anorm ales

S ustitución en la parte S ustitució n en la p a rte

term inal N d e la triple term inal C d e la triple
hélice: alteración m enor hélice: alteración m ayor
del em p aq u e del em p aq u e

Fig. 16-4. Efectos dominantes negativos de mutaciones del gen de colágena

Las fibrillas de colágena están constituidas por arreglos de unidades de procolágena de triple hélice. La procolágena tipo I comprende dos cadenas
codificadas por el gen C0L1A1 y una codificada por C0L1A2. Las mutaciones nulas en cualquier gen tienen un efecto menos grave que las mutaciones
que codifican polipéptidos que están incorporados en la triple hélice y destruyen su función.

máticos producen expresión excesiva incluyen reduplicación génica
masiva o transposición de un gen que suele expresarse a un nivel ba­
jo en un ambiente cromatínico muy activo. Este hecho se comenta
con mayor amplitud en la sección 17.3.3.
Con frecuencia las enfermedades hereditarias no se deben a ex­
presión excesiva constitucional de un gen aislado. La duplicación
del gen DSS en Xp21.3 causa reversión del sexo masculino a feme­
nino, tal vez como resultado directo de duplicación de la dosis
(Bardoni y col., 1994). En el gen de proteína de mielina periférica
PMP22, un incremento en la dosis génica de dos a tres copias es su­
ficiente para producir la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth
(véase más adelante y fig. 16-8). Es probable que estos incremen­
tos moderados en la expresión génica rara vez sean patógenos, aunque
un grado similar de sensibilidad a la dosis de genes no identificados
debe explicar muchas características de las trisomías cromosómicas
(sección 16.8.2). La actividad excesiva de un producto génico anor­
mal, con transcripción y traducción normal del gen, puede produ­
cir efectos similares.
16.5.3 Los cambios cualitativos en el producto de un
gen pueden causar ganancia de función
Aunque las ganancias de función de verdad nuevas son muy ra­
ras en enfermedades hereditarias, las mutaciones activadoras que
 16.6 PATOLOGÍA MOLECULAR: DEL GEN A LA ENFERMEDAD 475

modifican las respuestas de señalamiento celular muy a menudo M

5' > CpG : : CpG— :r" — ~> 3'
producen fenotipos dominantes. Los receptores hormonales aco­
3' < GpC GpC ■ ? 5'
plados a la proteína G proveen buenos ejemplos. Muchas hor­ M
monas ejercen sus efectos en células blanco por enlace a los
dominios extracelulares de receptores transmembrana. El enlace
^ Duplicación de DNA
del ligando da lugar a que la cola citoplásmica del receptor cata­
lice la conversión de una proteína G inactiva (enlace GDP) en
M
una forma activa (enlace GTP) y ello releva la señal adicional­ 5' CpG ___ C p G ~ . ...... ....... 3'
mente al estimular la ciclasa de adenilato. Algunas mutaciones 3' ~ GpC~ ~ GpC~ 5’
ocasionan que los receptores activen la ciclasa de adenilato inclu­
sive en ausencia de ligando. +
5' ’m m sí'/í !.- CpG :--g.^ M a n p G v:-';.‘a¿£asBiv^£» 3'
► En la pubertad precoz masculina familiar (MIM 176 410: ini­
3' 11 GpC - GpC ~<T 5'
cio de la pubertad cerca de los cuatro años de edad en los niños M
afectados) se encuentra un receptor de hormona luteinizante
M etilasa
con actividad constitucional.
► La hiperplasia tiroidea autosómica dominante puede deberse a
I d e s o s té n
una mutación activadora en el receptor de hormona estimulan­
te de la tiroides (véase MIM 275 200). M
5' > CpG CpG ——> 3'
► La condrodistrofia metafisaria de Jansen (MIM 156 400: un
3 ' 5
trastorno del crecimiento) puede ocasionarla un receptor de
+
hormona paratiroidea con actividad constitucional. M
5' 3 '-;*s.fe;C p G S B » ’a«;v-;;:'vH;!g C p G - - - i a s g = q > 3'
► Una proteína Gsa constitucionalmente activa (parte del recep­
3' <~ GpC GpC T 5'
tor que acopla proteína G) causa el síndrome de McCune-Al- M
bright o displasia fibrosa poliostósica (DFP) (PFD, MIM 174
800). La DFP se conoce como un padecimiento somático só­ Fig. 16-5. Herencia del patrón de metilación CpG.
lo en mosaicos -las mutaciones constitucionales podrían ser le­
La metilasa de sostén reconoce CpG hemimetilado en DNA recién
tales-. Según los tejidos que portan la línea celular mutante, el
replicado, lo que permite que el patrón de metilación CpG se herede
resultado es displasia fibrosa poliostósica, manchas de café con
(véase sección 10.4.2 y Bird, 2002).
leche, precocidad sexual y otras endocrinopatías hiperfúncio-
nales. Las mutaciones con pérdida de función del mismo gen
suelen causar una enfermedad distinta, la osteodistrofia here­ A. Un padecimiento recesivo simple. Las personas heterocigotas
ditaria de Albright (véase cuadro 16-5). para una mutación que suprime del todo la función génica son
normales en cuanto a fenotipo, a condición de que el alelo res­
tante no sea muy defectuoso.
16.6 Patología m olecular: del gen a la B. Un padecimiento dominante causado por haploinsuficien-
enferm edad cia. En realidad esta situación simple es rara. Si una reducción
de 50% en el producto génico causa síntomas, una disminu­
El punto inicial del pensamiento acerca de la patología molecular ción más grave quizá tenga efectos más graves.
puede ser un gen o una enfermedad. Estas dos conductas se consi­
C. Un padecimiento recesivo de gravedad gradual. Entre múlti­
deran por separado en esta sección y la siguiente, aunque, por su­
ples ejemplos se encuentran:
puesto, el conocimiento total de la patología molecular reúne
ambas. • mutantes en el gen de la fosforribosiltransferasa de guanina
e hipoxantina (HPRT) ligado a X. La extensión de la acti­
vidad de la enzima residual en mutantes se correlaciona
16.6.1 En mutaciones con pérdida de función el efecto bien con el fenotipo clínico de varones afectados (cuadro
fenotípico depende del nivel residual de función 16-4);
génica • números de copias reducidos de un gen de globina a produ­
cen efectos cada vez más graves. Como se muestra en la fi­
Los cambios de secuencias del DNA que se describen en el cuadro
gura 16-2, la mayoría de las personas tiene cuatro copias del
16-1 pueden ocasionar grados variables de pérdida de función. Mu­
gen de globina a (aa/ aa). Las personas con tres copias
chas sustituciones de aminoácidos no tienen efecto, o muy poco, en
(aa/ a—) son sanas; quienes poseen dos (sea la fase a —l a —o
tanto que algunas mutaciones suprime por completo la función.
a a /~) sufren talasemia a leve; las que sólo tienen un gen
Una mutación puede presentarse en una o ambas copias de un gen.
(a-/—) padecen la enfermedad grave, en tanto que la ausen­
A menudo las personas con padecimientos autosómicos recesivos
cia de todos los genes a (- / —) causa hidropesía fetal mortal.
son heterocigotas compuestas, con dos mutaciones diferentes. Si
las dos mutaciones causan pérdida de función, pero en grados dife­ D. Varios fenotipos. La disminución de la función residual de un
rentes, el alelo menos grave regirá el grado de función residual. gen puede extender el fenotipo y tal vez causar un padecimien­
La figura 16-7 representa cuatro posibles relaciones entre el ni­ to con un nombre clínico distinto. Según la posición de los
vel de función génica residual y el fenotipo clínico. umbrales, pueden surgir varias situaciones diferentes:
476 CAPITOLO DIECISÉIS PATOLOGÍA MOLECULAR

Recuadro 16-6. Patología m olecular de los síndrom es de Prader-W illi y d e A ngelm an

Los síndromes de Prader-Willi (SPW) y de Angelman (SA) se deben a pro­
blemas con genes diferencialmente con improntas en 15q11-q13. Ejem­
plifican la patología m olecular com plicada que se relaciona con
agrupaciones de genes con improntas (Nicholls y Knepper, 2001).
► Síndrome de Prader-WIII (SPW) (MIM 176 260: retraso mental, hipo-
tonía, obesidad notable, hipogenitalismo masculino) lo ocasiona la fal­
ta de función de genes que sólo se expresan del cromosoma paterno.
► Síndrome de Angelman (SA) (MIM 105 830: retraso mental, falta de
habla, retraso del crecimiento, hiperactividad, risa inapropiada) se de­
be a falta de función de un gen enlazado de manera cercana que se
expresa sólo del cromosoma materno. Algunos niños con SA tendrán
dos copias funcionales de los genes del SPW, y viceversa, pero esta
expresión excesiva no parece tener ningún efecto fenotípico.
Como se muestra en el cuadro, una variedad de acontecimientos puede
conducir a falta de una copia paterna (SPW) o materna (SA) de las 15 se­
cuencias del cromosoma importante.
► La causa más frecuente son deleciones nuevas de 4 a 4.5 Mb entre
repeticiones de flanqueo 15q11-q13. Las deleciones en el crom oso­
ma paterno causan SPW: las deleciones de la misma región en el cro­
mosoma materno producen SA.
► Disomía uniparentai, se detecta cuando los estudios de marcador de
ONA muestran que una persona con cromosomas aparentemente nor­
males heredó ambos homólogos de un par particular (número 15 en
este caso) de un padre. La causa usual es trisomía de rescate. Un
conceptus con trisomía 15 se desarrolla hasta una etapa multicelular;
en condiciones normales moriria, pero si una no disyunción mitótíca
al azar (sección 2.5.2) produce una célula con sólo dos copias del
cromosoma 15 en una etapa del desarrollo lo bastante temprana, esa
célula puede proseguir para form ar un niño completo que sobrevive.
Casi todos los conceptus con trisomía 15 son 15M15M15P. Una oca­
sión de cada tres, la pérdida aleatoria de un cromosoma 15 producirá
un feto con disomía uniparentai materna, 15M15M. Cuando cualquier
cromosoma 15 paterno falta, el feto tendrá síndrome de Prader-Willi.
► A veces el mecanismo de improntación es erróneo. Ambos crom oso­
mas 15 homólogos llevan el mism o patrón de metilación específico
del padre, aunque estudios de marcador muestran que se originan de
diferentes padres. Estos casos interesantes son causados por dele­
ciones pequeñas que definen elementos de control de improntación
de SPW y SA no superpuestos.
► El SA puede deberse por completo a falta de expresión del gen UBE3A
ya que algunos casos hereditarios tienen estructura e improntación
cromosómica normales, pero mutaciones de punto en este gen. El
SPW es más complejo. El cromosoma paterno codifica un transcrito
inmenso (hasta 460 kb y 148 exones) con múltiples formas de em­
palme. Los 10 primeros exones codifican dos proteínas, SNURF y
SNRPN, en tanto que los exones corriente abajo carecen de marcos
de lectura abiertos pero algunos de los intrones codifican RNA nu-
cleolares pequeños (snoRNA) que forman parte de la maquinaria de
empalme. La ausencia de snoRNA puede ocasionar los síntomas del
síndrome de Prader-Willi (SPW). La parte corriente abajo del transcri­
to se superpone en el gen UBE3A de la cadena opuesta y tal vez ac­
túa como un RNA antisentido, io que previene la transcripción de
UBE3A del cromosoma paterno (Runte y cois., 2001).
Orígenes de los síndromes de Prader-Willi y Angelman
Acontecimiento Proporción Proporción
de SPW de SA
Deleciones ~ 75% 75%
Disomía uniparentai ~ 20% 3%
Errores de improntación ~ 2% 5%
Mutaciones de punto No se observan 15% (en el genUBE3A)

Cuadro 16-3. Mecanismos de mutaciones de ganancia de función.

Disfunción Gen Enfermedad MIM núm.

Expresión excesiva PMP22 Enfermedad de Charcot-Marie-Tooth 118200

Receptor “encendido” permanentemente GNAS Enfermedad de McCune-Albright 174800

Adquisición de nuevo sustrato (alelo Pittsburgh) Pl Deficiencia de antitripsina a ! 107400

Canal iónico abierto de modo inapropiado SCN4A Paramiotonía congénita 168300

Multímeros con estructura anormal C0L2A1 Osteogénesis imperfecta Varios

Agregación de proteínas HD Enfermedad de Huntington 143100

Gen quimérico BCR-ABL Leucemia mieloide crónica 151410

• Varios padecimientos recesivos relacionados pueden deberse
a reducciones sucesivas de la función génica en un locus ais­
lado. Por ejemplo, la matriz extracelular es rica en proteoglu-
canos sulfatados, como el sulfato de heparán y el sulfato de
condroitina, y los defectos en el transporte de sulfato inter­
fieren con el desarrollo esquelético. Las mutaciones con pér-
dida de función del transportador de sulfato DTDSTocasio­
nan cuatro displasias esqueléticas autosómicas recesivas rela­
cionadas: displasia diastrófica (MIM 226 600), displasia
epifisaria múltiple 4 (MIM 226 900), atelosteogénesis II
(MIM 256 050) y acondrogénesis tipo IB (MIM 600 972)
de acuerdo con la extensión de la pérdida (Karniski, 2001).
 16.6 PATOLOGÍA MOLECULAR: DEL GEN A LA ENFERMEDAD 477

Fig. 16-6. Mutación hereditaria que ocasiona la adquisición de una función nueva por una proteína

La metionina 358 en el centro reactivo de la antitripsina a ! actúa como un “ señuelo” para elastasa. La elastasa corta el enlace péptido entre Met358 y
Ser359, y da lugar a que los dos residuos se separen 65 Á, como se muestra aquí (esferas verdes). La elastasa es atrapada e inactivada. La variante
Pittsburgh tiene una mutación de sentido erróneo M358R que reemplaza el señuelo de metionina con arginina. Esto destruye la afinidad por la elastasa
pero crea un señuelo para trombina. Como una antitrombina nueva con actividad constitutiva, la variante Pittsburgh produce un trastorno hemorrágico
letal. Imagen de la University of Geneva ExPASy molecular biology World Wide Web server.

Una pérdida de 50% tal vez no tenga efecto; una pérdida un
poco mayor, causada por efectos dominantes negativos, pue­
de producir un padecimiento dominante; en tanto que la
pérdida total de función ocasiona un padecimiento recesivo
más grave. Las mutaciones con pérdida de función simples
del canal KVLQT1 K+ no tienen efecto en heterocigotos, pe­
ro originan el síndrome recesivo de Jervell y Lange-Nielsen
(MIM 220 400: problemas cardiacos y pérdida de la audi­
ción) en homocigotos. Sin embargo, una mutación dominante
negativa en el mismo gen produce el síndrome de Romano-
Ward que se hereda en forma dominante (MIM 192 500:
arritmia cardiaca). En oocitos de Xenopus transfectados, los
canales iónicos Romano-Ward tienen alrededor de 20%
de la actividad normal, pero los canales iónicos de pacientes

Sin efecto E nferm edad

A) L

Sin efecto E nferm edad

B) i

Sin efecto E nferm edad

Leve ----------------------- G rave
C)

Sin efecto Efecto en el sistema A , E fecto en el sis te m a A + B

100 50
Nivel d e función g è n ic a residu al (%)

Fig. 16-7. Cuatro posibles relaciones entre pérdida de la función y el fenotipo clínico.

Véase sección 16.6.1 para el comentario.

478 CAPÍTULO DIECISÉIS PATOLOGÍA MOLECULAR
JLN carecen por completo de función (Wollnik y col,,
1997).
• Las mutaciones en el mismo gen pueden producir dos o más
padecimientos dominantes, el más leve por haploinsuficiencia
simple y las formas más graves mediante efectos dominantes
negativos. Esto ocurre en los genes COL1AI o C0L1A2que
codifican colágena tipo I (fig. 16-4). Las mutaciones en es­
tos genes suelen producir osteogénesis imperfecta (OI: enfer­
medad de huesos frágiles). Los cambios de marco y las
mutaciones sin sentido producen OI tipo 1, la forma más le­
ve, en tanto que en las sustituciones de aminoácidos en uni­
dades repetidas Gli-X-Y se observan los tipos más graves de
OI, II, III y IV. La relación genotipo-fenotipo es muy sutil.
Las sustituciones de glicina por un aminoácido más volumi­
noso en la unidad Gli-X-Y tienen un efecto dominante ne­
gativo al interrumpir el empacamiento estrecho de la hélice
triple de colágena. La hélice se ensambla a partir del extremo
terminal C y la sustitución de glicina cerca de ese extre­
mo tiene un efecto más grave que las sustituciones cercanas
al extremo terminal N. La omisión del exón 6 (de COL 1Al
o C0L1A2) tiene un efecto muy diferente. El sitio de corte
del propéptido terminal N se pierde y se produce una colá­
gena anormal que ocasiona el síndrome de Ehlers-Danlos
tipo VII (MIM 130 060; laxitud de la piel y las articulacio­
nes). Una función diferente se perdió y dio por resultado un
fenotipo distinto.
16.6.2 Las mutaciones con pérdida de función y
ganancia de función en el mismo gen causarán
diferentes enfermedades
Ya se comentó que las mutaciones con pérdida de función en el gen
PAX3 ocasionan las anormalidades del desarrollo del síndrome de
Waardenburg tipo 1 (fig. 16-1). Un fenotipo por completo diferen­
te se observa cuando una translocación cromosómica adquirida
crea un gen quimérico nuevo por fusión de PAX3 a otro gen de fac­
tor de transcripción, FKHR, en una célula somática. La ganancia de
función de este factor de transcripción híbrido origina el desarrollo
del tumor de la niñez rabdomiosarcoma alveolar (cuadro 17-3).
Un ejemplo notable se relaciona con el gen RET (Manié y cois.,
2001). RET codifica un receptor que abarca la membrana celular.
Cuando su ligando (GDNF) se enlaza al dominio extracelular indu­
ce la dimerización de los receptores, que luego transmiten la señal al
interior de la célula por medio de módulos de cinasa de tirosina en
su dominio citoplásmico. Una variedad de mutaciones con pérdida
de función -cambios de marco, mutaciones sin sentido y sustitucio­
Cuadro 16-4. Consecuencias de la disminución de la función de la fosforribosiltransferasa de guanina e hipoxantina (HPRT).
Actividad de HPRT (% del normal) Fenotipo
> 60 Normal
8-60 Neurològicamente normal: hiperuricemia (gota)
1.6-8 Problema neurològico (coreoatetosis)
1.4-1.6 Síndrome de Lesch-Nyhan (coreoatetosis, automutilación) pero inteligencia normal
< 1.4 Síndrome clásico de Lesch-Nyhan (MIM 308 000; coreoatetosis, automutilación y retraso mental)
nes de aminoácidos que interfiere con la maduración postraduccional
de la proteína RET- son una causa de enfermedad de Hirschsprung
(MIM 142 623; estreñimiento rebelde por ausencia de ganglios en­
téricos en el intestino; véase sección 15.6.2). Ciertas mutaciones en
sentido erróneo muy específicas en el gen RET se observan en un
grupo del todo distinto de enfermedades, el carcinoma medular de
la tiroides familiar y la neoplasia endocrina múltiple tipo 2 relacio­
nada pero más extensa. Éstas son mutaciones con ganancia de fun­
ción que producen receptores que reaccionan en exceso al ligando o
que tienen actividad constitucional y dimerizan inclusive en ausen­
cia de ligando. Como hecho curioso, algunas personas con mutacio­
nes en sentido erróneo que afectan la cisteína 618 o 620 sufren tanto
cáncer de la tiroides como enfermedad de Hirschsprung —pérdida y
ganancia de función simultánea—. Esto recuerda que la pérdida de
función y la ganancia de función no son simples cantidades numé­
ricas; las mutaciones pueden tener diferentes efectos en los distintos
tipos de células en que un gen se expresa.
El cuadro 16-5 incluye una lista de varios casos en que las mu­
taciones en un gen aislado pueden originar más de una enferme­
dad. Por lo general la ganancia de función mutante produce una
proteína de calidad anormal. En ocasiones un efecto de dosis sim­
ple puede ser patógeno -un ejemplo es el gen de la proteína de mie-
lina periférica PMP22-. Cruzamientos desiguales entre secuencias
repetidas en el cromosoma 17pl 1 crean duplicaciones o deleciones
de una región de 1.5 Mb que contiene el gen PMP22 (fig. 16-8).
Los portadores heterocigotos de la deleción o duplicación tienen
una copia o tres copias respectivamente de este gen. Las personas
que sólo tienen una copia sufren neuropatía hereditaria con paráli­
sis por presión o neuropatía tomaculosa (MIM 162 500), en tanto
que, como ya se mencionó, las personas con tres copias padecen
una neuropatía clínicamente diferente, la enfermedad de Charcot-
Marie-Tooth 1A (CMT1A; MIM 118 220).
16.6.3 La variabilidad entre familias es evidencia de
genes modificadores o efectos al azar
Muchos padecimientos mendelianos son clínicamente variables
aun entre los miembros afectados de la misma familia que llevan
justo la misma mutación. La variabilidad intrafamiliar debe ser
causada por cierta combinación de los efectos de otros genes no en­
lazados (genes modificadores) y por efectos ambientales (inclusive
acontecimientos al azar). Como se comentó, los fenotipos que de­
penden de haploinsuficiencia son en especial sensibles a los efectos
de modificadores (sección 16.4.2). El síndrome de Waardenburg es
un ejemplo típico: la figura 16-1 muestra evidencias de que este pa­
decimiento dominante se debe a haploinsuficiencia y la figura 4-5C
presenta una variación intrafamiliar típica.
 16.6 I PATOLOGÍA MOLECULAR: DEL GEN A LA ENFERMEDAD 479

Cuadro 1 6 -5 . Ejemplos de genes que causan más de una enfermedad.

Gen Localización Enfermedades Símbolo MIM núm.

PAX3 2q35 Síndrome de Waardenburg tipo WS1 193500

Rabdomiosarcoma alveolar RMS2 268220

CFTR 7p31,2 Fibrosis quística CF 279700

Ausencia bilateral de conductos deferentes

RET 10q11.2 Neoplasia endocrina múltiple tipo 2A MEN2A 171400

Neoplasia endocrina múltiple tipo 2B MEN2B 162300

Carcinoma medular de la tiroides FMTC 155420

Enfermedad de Hirschsprung HSCR 142623

PMP22 17p11.2 Neuropatía de Charcot-Marie-Tooth tipo 1A CMT1A 118220

Neuropatía tomaculosa HNPP 162500

SCN4A 17q23.1-q25.3 Paramiotonía congénita PMC 168300

Parálisis hiperpotasémica periódica HYPP 170500

Miotonía congénita que responde a acetazolamida

PRNP 20p12-pter Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob CJD 123400

Insomnio fatal familiar FFI 176640

GNAS 20q13.2 Osteodistrofia hereditaria de Albright AH0 103580

Síndrome de McCune-Albright PFD 174800

AR Xcen-q22 Síndrome de feminización testicular TFM 313700

Atrofia muscular espinobulbar SBMA 313200

La variabilidad intrafamiliar es un gran problema en asesoría ge­
nética porque las familias que consideran la procreación desean sa­
ber con qué tanta gravedad se afectarán. En consecuencia hay una
motivación tanto clínica como científica para identificar genes mo­
dificadores. El conocimiento de las interacciones bioquímicas del
producto génico primario o los estudios en ratones en los que el
análisis genético necesario es factible suelen sugerir los genes modi­
ficadores candidato (Nadeau, 2001). El trabajo de Easton y colabo­
radores (1993) respecto a la neurofibromatosis tipo 1 (MIM 162
200) muestra la forma en que el análisis estadístico de fenotipos clí­
nicos dentro de familias grandes puede proporcionar evidencias de
genes modificadores. Tampoco debe ignorarse la función del azar
puro, sobre todo en padecimientos con un fenotipo en placas. Los
ejemplos comprenden la despigmentación en placas en el síndrome
de Waardenburg y los números variables de neurofibromas o póli­
pos en la neurofibromatosis tipo 1 y la poliposis adenomatosa del
colon (MIM 175 100) respectivamente.
Un ejemplo de la forma en que un modificador pudiera actuar
proviene de una familia interesante con herencia de albinismo ocular
al parecer digénico (Morell y cois., 1997). La tirosina es una enzima
fundamental de los melanocitos; su deficiencia conduce a albinismo
oculocutáneo (MIM 203 100). Una variante frecuente del gen de ti-
rosinasa, R402Q, codifica una enzima con actividad reducida, pero la
actividad residual es suficientemente alta para que inclusive los homo-
cigotos tengan una pigmentación normal. Sin embargo, en la familia
publicada por Morell y colaboradores las personas que portaban una o
dos copias de R402Q mostraron albinismo ocular (una forma leve de
albinismo oculocutáneo) cuando también tenían una mutación en
MITF, un gen que participa en la diferenciación de los melanocitos.
Las mutaciones en MITF solas no causan albinismo ocular.
16.6.4 Repeticiones en expansión inestables: una
nueva causa de enfermedad
Las repeticiones de nucleótidos en expansión inestables (mutacio­
nes dinámicas) fueron un mecanismo de enfermedad por comple­
to nuevo y sin precedente cuando se descubrieron por primera vez
en 1991. El cuadro 16-6 muestra los ejemplos que se conocen en la
actualidad. Originan dos preguntas mayores:
► ¿cuál es el mecanismo de la inestabilidad de la expansión? Esto
se comenta en la sección 11.5.2;
► ¿por qué las repeticiones expandidas causan enfermedad? Este
problema se analiza en este inciso.
Una característica de las enfermedades originadas por repeticiones
dinámicas es la anticipación -es decir, la edad de inicio es menor,
la gravedad mayor, o ambas, en generaciones sucesivas-. Véase la
sección 4.3.3 para una nota de advertencia respecto a la anticipa­
ción. En algunos casos alelos de tamaño intermedio no son patóge­
nos pero sí inestables y se expanden con facilidad hasta alelos de
mutación completa (p. ej-, las repeticiones FRAXA de 50 a 200
unidades); en otros casos estos alelos sólo se expanden de manera
muy ocasional (p. ej., alelos HD con 29 a 35 repeticiones). Las ex­
pansiones patógenas corresponden a dos clases principales:
480 CAPÍTULO DIECISÉIS í PATOLOGÍA MOLECULAR

Norm al E n ferm ed ad d e N eu ro p atía to m a c u lo sa

C harcot-M arie-T ooth (CMT1A) (HNPP)

_ | -------------- U ----------- 1------------- m ------------------ y _ ------------------[ ] -------------

H etero cigo to p a ra du plicación H eterocigo to p a ra deleción

d e 1.5 Mb

H om ocigoto p a ra du plicación Mutación de punto con

d e 1.5 M b -en ferm edad g rave

C lave:
■ PMP22
I-------■-------1 Límites d e región
du plicada d e 1.5 Mb
Mutación de punto activante

Fig. 16-8. Efectos de la dosis génica con el gen PMP22

Casi todos los pacientes con enfermedad de Charcot-Marie-Tooth son heterocigotos para una duplicación de 1.5 Mb en 17p11.2, que incluye el gen
para proteína de mielina periférica, PMP22 (cuadro a color). Un paciente homocigoto para la duplicación padeció la enfermedad muy grave. Algunos
enfermos sólo tienen dos copias del gen PMP22, pero una copia lleva una mutación activante. La deleción o la mutación de pérdida de función del gen
PMP22 se observa en pacientes con neuropatía tomaculosa (Patel y Lupski, 1994).

► repeticiones muy expandidas fuera de secuencias de codificación;
► expansiones moderadas de repeticiones CAG que codifican
vías de poliglutamina en el producto génico.
Repeticiones muy expandidas fuera de secuencias de
codificación
En el síndrome de X frágil y en la ataxia de Friedreich, una repetición
demasiado expandida origina pérdida de función porque suprime la
transcripción. Lo mismo sucede en la expansión 12-mer en la epilep­
sia mioclónica juvenil. En cada caso la enfermedad a veces se debe
a mutaciones con pérdida de función diferentes, más convenciona­
les en el gen. Estas mutaciones producen el fenotipo clínico idéntico
a expansiones, aparte (posiblemente) de no mostrar anticipación.
Otras repeticiones muy expandidas similares, como FRA16A (repeti­
ción CCG expandida) o FRA16B (una expandida minisatélite de 33
pb) no son patógenas, quizá porque no se localizan cerca de un gen
importante. Tal vez las repeticiones suprimen la transcripción me­
diante la alteración de la estructura cromatínica local. En X frágil, es­
to conduce a metilación del promotor.
La expansión grande en la distrofia miotónica es distinta. Pues­
to que nunca se ha encontrado otra mutación en un paciente con
distrofia miotónica, debe haber algo muy específico respecto a la
acción de la repetición CTG. En fecha reciente se aclaró que la prin­
cipal acción patógena (en DM1 y DM2) se da a través del enlace
de mRNA y el secuestro de proteínas de enlace de CUG que se re­
quieren para el empalme correcto de otros transcritos. El empalme
aberrante conduce a pérdida del canal de cloruro específico de
músculo, entre otros transcritos (revisado por Tapscott y Thornton,
2001). También debe haber otros efectos porque el sitio de expan­
sión forma parte del islote CpG del gen adyacente, S1X5 (MIM
600 963) y la expansión reduce la expresión de este gen.
Al parecer el gen SCA8 (Koob y cois., 1999) codifica un RNA no
traducido que actúa como un regulador antisentido de un gen en
la otra cadena del DNA (similar a los transcritos improntos que se
mencionan en la sección 16.4.4). La forma en que la expansión
produce la enfermedad se desconoce -de hecho no es del todo cier­
to que este cambio sea patógeno.
Expansiones modestas de repeticiones CAG dentro de
regiones de codificación que codifican vías de poliglutamina
dentro del producto génico
Las características comunes de ocho enfermedades causadas por
expansión de una repetición CAG inestable dentro de un gen in­
cluyen:
► enfermedades neurodegenerativas de inicio tardío y, excepto
por la enfermedad de Kennedy, todas se heredan en forma do­
minante;
► aún no se encuentra otra mutación en el gen que cause la en­
fermedad;
► el alelo expandido se transcribe y traduce;
► la repetición de trinucleótidos codifica una vía de poliglutami­
na en la proteína;
► un umbral crítico del tamaño de la repetición abajo del cual es­
ta última no es patógena; cuando se excede, la repetición cau­
sa enfermedad;
 16.6 PATOLOGÍA MOLECULAR: DEL GEN A LA ENFERMEDAD 481

Cuadro 16-6. Enfermedades causadas por repeticiones expandidas de nucleótidos inestables.

Enfermedad MIM núm. Modalidad Localización Localización Secuencia Repetición Repetición
de herencia del gen de la repetida estable Inestable
repetición núm. núm.

1. Expansiones de repeticiones muy grandes fuera de secuencias de codificación:

X frágil sitio A (FRAXA) 309550 X Xq27.3 5'UTR (CGG)n 6-54 200-1000+

X frágil sitio E (FRAXE) 309548 X Xq28 Promotor (CCG)n 6-25 200+

Ataxia de Friedreich (FA) 229300 AR 9q13-q21.1 Intrón 1 (GAA)n 7-22 200-1700

Distrofia miotónica 1 (DM1) 160900 AD 19q13 3'UTR (CTG)n 5-35 50-4000

Distrofia miotónica 2 (DM2) 602668 AD 3q21 Intrón 1 (CCTG)n 12 75-11 000

Ataxia espinocerebelosa 8 603680 AD 13q21 RNA no traducido (CTG)n 16-37 11 0-5 00+

Ataxia espinocerebelosa 11 604432 AD 15q14-21 Intrón 9 (ATTCT)n 10-22 Hasta 22 kb

Epilepsia mioclónica 254800 AR 21q22.3 Promotor (CCCCGCCCCGCG)n 2-3 40-80

juvenil (JME)

2. Expansiones moderadas de repeticiones CAG en secuencias de codificación:

Enfermedad de Huntington (HD) 143100 AD 4p16.3 Codificación (CAG)n 6-35 3 6 -1 0 0 +

Enfermedad de Kennedy 313200 XR Xq21 Codificación (CAG)n 9-35 38-62

SCA1 164400 AD 6p23 Codificación (CAG)n 6-38 39-83

SCA2 183090 AD 12q24 Codificación (CAG)n 14-31 32-77

Enfermedad de 109150 AD 14q32.1 Codificación (CAG)n 12-39 62-86

Machado-Joseph (SCA3)

SCA6 183086 AD 19p13 Codificación (CAG)n 4-17 21-30

SCA7 164500 AD 3p12-p21.1 Codificación (CAG)n 7-35 37-200

SCA17 607136 AD 6q27 Codificación (CAG)n 25-42 47-63

Atrofia dentatorrubro- 125370 AD 12p Codificación (CAG)n 3-35 49-88

palidoluisiana (DRPLA)

SCA, ataxia espinocerebelosa

► cuanto más grande es la repetición, por arriba del umbral, más
temprana es la edad promedio de inicio (no es posible establecer
predicciones en pacientes individuales, pero se observa una co­
rrelación estadística clara).
La mutación del receptor de andrógeno en la enfermedad de Ken­
nedy provee evidencias claras que indican que las enfermedades por
repetición de CAG comprenden una ganancia de función específi­
ca. Las mutaciones con pérdida de función en este gen se conocen
bien y causan insensibilidad al andrógeno o síndrome de feminiza­
ción testicular (MIM 300 068), una falla de la diferenciación sexual
masculina. En contraste, la expansión de poliglutamina ocasiona
una enfermedad neurodegenerativa muy distinta, aunque con frecuen­
cia los pacientes también muestran feminización menor. El meca­
nismo patógeno que comparten abarca formación de agregados
proteínicos (véase más adelante).
Además de las repeticiones expandidas inestables clásicas, algu­
nas enfermedades pueden deberse a expansiones repetidas de trinu-
cleótidos más cortas y bastante estables. Los ejemplos incluyen
distrofia muscular bucofaríngea (gen PABP2, MIM 602 279), seu-
doacondroplasia (gen COMP, MIM 600 310) y simpolidactilia
(gen HOXD13, MIM 186 000). Éstas no son mutaciones dinámi­
cas y no pertenecen a las repeticiones expandidas inestables clásicas.
Diagnóstico de laboratorio de repeticiones expandidas
Una PCR aislada establece el diagnóstico en enfermedades por
repetición de poliglutamina. Las expansiones muy grandes en la
distrofia miotónica requieren Southern blotting. La X frágil se diag­
nostica con un método de Southern blotting que depende tanto del
tamaño como del estado de metilación del gen FRAXA. Para deta­
lles más amplios y fotografías de gel, véase la sección 18.4.3 y la fi­
gura 18-12.
16.6.5 La agregación de proteínas es un mecanismo
patógeno frecuente en enfermedades por
ganancia de función
En fecha reciente se evidenció que la formación de agregados pro­
teínicos es una característica que varias enfermedades neurológicas
que se inician en adultos comparten, inclusive las enfermedades
482 CAPÍTULO DIECISÉIS PATOLOGÍA MOLECULAR
por poliglutamina antes descritas y las de Alzheimer, Parkinson,
Creutzfeldt-Jakob y el grupo heterogéneo conocido como amiloi-
dosis. Aunque la historia completa todavía no se esclarece, surge un
tema común. Moléculas proteínicas globulosas semejan gotas de
aceite, con los residuos hidrofóbicos en el interior y grupos polares
en el exterior. El doblez correcto es un proceso crítico y muy espe­
cífico, y entre todas las posibles secuencias proteínicas se seleccio­
nan proteínas que ocurren de manera natural, en parte por su
capacidad para doblarse de manera correcta. Las proteínas mutantes
pueden ser más propensas al doblamiento erróneo. Las moléculas
mal dobladas con grupos hidrofóbicos expuestos pueden agregarse
entre sí o con otras proteínas; esto resulta un poco tóxico para las
neuronas y puede serlo para otras células. En ocasiones parece que
un cambio de conformación puede propagarse a través de una po­
blación de moléculas proteínicas, que se convierten de una confi­
guración natural estable en una nueva forma con diferentes
propiedades en un proceso tal vez análogo a la cristalización. La
conducta de las proteínas prión (Prusiner y cois., 1998) es el ejem­
plo más notable. El doblez erróneo puede iniciarse con un doblez
erróneo al azar de una molécula con estructura normal recién sin­
tetizada (casos esporádicos), una secuencia mutante con una mayor
propensión al doblez erróneo (una enfermedad genética) o una
molécula doblada erróneamente adquirida en alguna forma del am­
biente (casos infecciosos). Por consiguiente esta vía final compartida
une entre sí un grupo de enfermedades con orígenes muy distintos
(Perurz y Windle, 2001; Bucciantini y cois., 2002).
16.6.6 La heteroplasmia y la inestabilidad complican la
relación entre genotipo y fenotipo en las
mutaciones mitocondriales
Las mutaciones de punto, las deleciones o las duplicaciones que supri­
men la función de genes en el genoma mitocondrial densamente em­
pacado (fig. 9-2) se relacionan con una gama amplia de enfermedades
degenerativas que incluyen sistema nervioso central, corazón, múscu­
lo, sistema endocrino, rifiones e hígado. Las células contienen muchas
moléculas de mtDNA. Pueden ser homoplásmicas (cada molécula de
mtDNA es igual) o heteroplásmicas (una población mixta de DNA
mitocondrial normal y mutante). A diferencia del mosaicismo, la
heteroplasmia puede transmitirse de la madre al niño a través de un
óvulo heteroplásmico. Con frecuencia tanto las mutaciones como la
heteroplasmia parecen evolucionar con el tiempo en un individuo.
La misma persona puede llevar tanto deleciones como duplicaciones
y es posible que la proporción cambie con el tiempo (Poulton y cois.,
1993).
A menudo se observa el mismo cambio de secuencia en perso­
nas con diferentes síndromes y es muy difícil establecer correlacio­
nes fenotipo-genotipo. Por ejemplo, 50% de las personas con
neuropatía óptica hereditaria de Leber (MIM 535 000: pérdida sú­
bita irreversible de la visión) tienen una sustitución G-»A en el
nucleótido 11 778 del genoma mitocondrial. Casi todos estos pa­
cientes son homoplásmicos, pero alrededor de 14%, con la misma
gravedad de la afección, es heteroplásmico. Aun en familias homo-
plásmicas el padecimiento es muy variable; la penetrancia total es
de 33 a 60% y 82% de los individuos afectados lo constituyen va­
rones (Wallace y cois., 2001). Las posibles razones de la mala corre­
lación incluyen:
► la heteroplasmia puede ser específica de tejido y es posible que
el que se examine (por lo general sangre o músculo) no sea el
tejido crítico en la patogénesis;
► el mtDNA es mucho más variable que el DNA nuclear y algu­
nos síndromes pueden depender de una combinación de la
mutación informada con otras variantes no identificadas;
► al parecer algunas enfermedades mitocondriales son de natura­
leza cuantitativa: se acumulan cambios mutacionales pequeños
que reducen la capacidad de la mitocondria para generar ener­
gía y a cierto umbral de déficit surgen síntomas clínicos;
► muchas funciones mitocondriales son codificadas por genes
nucleares (véase recuadro 9-2), de manera que la variación nu­
clear puede ser una causa importante o modificar el fenotipo
mitocondrial.
La base de datos MITOMAP de mutaciones mitocondriales (www.-
mitomap.org) contiene una buena discusión general, aunada a cua­
dros de datos extensos que muestran tan sólo lo considerable que es
el desafío de predecir fenotipos.
16.7 Patología m olecular: de la
enferm edad al gen
Con mucha frecuencia el punto de inicio del pensamiento acerca
de la patología molecular es una enfermedad en lugar de un gen.
Este enfoque proporciona un punto de vista alternativo de las co­
rrelaciones genotipo-fenotipo. El mensaje total es que no se debe
ser inocente cuando se especula respecto al defecto génico subya­
cente a un síndrome mendeliano.
16.7.1 Es posible que el gen subyacente a una
enfermedad no sea el obvio
Las mutaciones que conducen a deficiencia de una proteína
no siempre se encuentran en el gen estructural que codifica
la proteína
La agammaglobulinemia (falta de inmunoglobulinas, que conduce
a inmunodeficiencia clínica) suele ser mendeliana. Es natural supo­
ner que la causa serían mutaciones en los genes de inmunoglobuli-
na, pero estos últimos se localizan en los cromosomas 2, 14 y 22, y
las agammaglobulinemias no se mapean en estos sitios. Muchas
formas son ligadas a X. Si se recuerdan los múltiples pasos nece­
sarios para cambiar un polipéptido recién sintetizado en una pro­
teína que funciona en forma correcta (sección 1.5), esta falta de
correspondencia uno a uno entre la mutación y el gen de la proteí­
na estructural no debe ser una gran sorpresa. Las fallas en el proce­
samiento del gen de inmunoglobulina, en la maduración de la
célula B o en el desarrollo total del sistema inmunitario producirán
inmunodeficiencia.
En ocasiones un defecto génico puede ocasionar múltiples
defectos enzimáticos
La enfermedad de célula I o mucolipidosis II (MIM 252 500) se
caracteriza por deficiencias de múltiples enzimas lisosómicas. El
principal defecto no se encuentra en el gen estructural para ningu­
na de estas enzimas sino en una enzima, la 1-fosfotransferasa de N-
acetilglucosamina, que fosforila residuos de mañosa en moléculas
de la enzima glucosilada. La fosfomanosa es una señal que dirige las
enzimas a lisosomas; cuando falta, los lisosomas carecen de una se­
rie completa de enzimas.
 16.7 PATOLOGÍA MOLECULAR: DE LA ENFERMEDAD AL GEN
A menudo las mutaciones sólo afectan un subgrupo de los
tejidos en que el gen se expresa
El patrón de expresión específico de un gen es un mal indicador de
predicción de los efectos clínicos de las mutaciones. No es proba­
ble que los tejidos en que un gen no se expresa sufran patología pri­
maria, pero lo contrario no es cierto. Por lo general sólo se afecta
un subgrupo de tejidos de expresión. El gen HD se expresa con
amplitud, pero la enfermedad de Huntington sólo afecta regiones
limitadas del cerebro. El gen de retinoblastoma (sección 17.6.1) se
expresa de modo ubicuo, pero sólo la retina suele afectarse por
mutaciones heredadas. Esto también se observa con firmeza en
trastornos lisosómicos. Se requiere la expresión gènica en un tipo
de célula aislada, el macròfago, que se encuentra en muchos teji­
dos. Sin embargo, no todos los tejidos que contienen macrófagos
son anormales en los pacientes afectados. No es difícil encontrar
explicaciones:
► los genes no siempre se expresan sólo en los tejidos en que se
requieren. A condición de que la expresión no cause daño, pue­
de haber poca presión de selectividad para suspender la expre­
sión, inclusive en los tejidos en que la expresión no confiere
beneficio;
► la pérdida de una función gènica afectará algunos tejidos mu­
cho más que otros, a causa las funciones y necesidades meta-
bólicas variables de diferentes tipos de células y los grados
variables de redundancia funcional en la red de interacciones
dentro de una célula. Además del recambio celular que es erró­
neo en el cáncer, es probable que el concepto del “gen celador”
de la genética del cáncer (sección 17.7.2) sea aplicable a mu­
chas otras funciones y disfunciones celulares;
► cualquier ganancia de función puede ser patológica para cier­
tos tipos celulares y perjudicial para otros; véase el ejemplo del
gen RET (sección 16.6.2).
16.7.2 La heterogeneidad de locus es la regla en lugar
de la excepción
Heterogeneidad de locus describe la situación en que la misma
enfermedad puede ser causada por mutaciones en varios genes di­
ferentes. Es importante pensar en la función biológica del produc­
to gènico, y las moléculas con que interactúa, en lugar de esperar
una relación uno a uno entre genes y síndromes. Como se comen­
ta en la sección 4.2.4, los síndromes clínicos suelen resultar de fa­
lla o mal funcionamiento de una vía del desarrollo o fisiológica; de
igual forma, muchas estructuras y funciones celulares dependen
de agregados proteínicos de múltiples componentes. Si se requiere
el funcionamiento correcto de varios genes, entonces las mutacio­
nes en cualquiera de ellos pueden causar el mismo fenotipo, o uno
muy similar.
Una vez más las colágenas (fig. 16-4; sección 16.6.1) brindan
buenos ejemplos. Ya se comentó que la colágena tipo I, la principal
colágena de piel, huesos, tendones y ligamentos, está formado por
triples hélices que comprenden dos cadenas a ( l) y una a(2). Las
mutaciones en cualquiera de los genes COL1A1 o COL1A2 causan
el mismo trastorno, osteogénesis imperfecta dominante. La coláge­
na tipo II forma fibrillas en cartílago y otros tejidos, inclusive el
vitreo del ojo. Está constituida por hélices homotriméricas de cade­
nas COL2A1. Diferentes mutaciones en el gen C0L2A1 producen
una gama de superposiciones de displasias esqueléticas que abarcan
483
el síndrome de Stickler, la displasia espondiloepifisaria y la displa-
sia de Kniest. Un fenotipo similar puede resultar de mutaciones en
la colágena tipo XI, un componente menor de la fibrilla tipo II.
En todos estos casos el síndrome que se produce depende del efec­
to total en las fibrillas finales de colágena, en lugar del gen que es­
tá mutado.
16.7.3 Mutaciones en diferentes miembros de una
familia génica pueden producir una serie de
síndromes relacionados o superpuestos
Las mutaciones en miembros de una familia génica con funciones
parcialmente superpuestas pueden producir un grupo de fenoti­
pos parcialmente superpuestos que resultan difíciles de diferenciar
en la clínica. Las mutaciones que afectan los receptores del factor
de crecimiento de fibroblastos ilustran este hecho. Los 10 factores de
crecimiento de fibroblastos rigen procesos importantes del desa­
rrollo a través de cuatro receptores de superficie celular, FGFR1 a
4. Casi todos los tejidos expresan múltiples FGFR, inclusive va­
riantes empalmadas de cada uno. Los FGFR son receptores de ci-
nasas de tirosina que actúan en forma similar a la proteína RET
descrita: la transducción de señal requiere dimerización del recep­
tor y esto puede comprender homodímeros o heterodímeros. Las
mutantes de FGFR podrían producir un equilibrio alterado de
las formas de empalme, cambiar el equilibrio de homodímeros y
heterodímeros, reducir el señalamiento por un efecto negativo do­
minante o producir dímeros con actividad constitucional. Por tan­
to existe la posibilidad de efectos genéticos complejos.
Varias mutaciones específicas de los genes de receptor originan
una serie de trastornos dominantes del crecimiento esquelético (fig.
16-9). Las mutaciones en FGFR2 en 10q26 se encuentran en los
síndromes de Crouzon, Jackson-Weiss, Pfeiffer y Apert, en tanto
que distintas mutaciones específicas en FGFR3 en 4p l6 producen
acondroplasia, displasia tanatofórica tipos 1 y 2, hipocondroplasia,
síndrome de Crouzon con acantosis nigricans y craneosinostosis
coronal de Muencke. Algunos pacientes con síndrome de Pfeiffer
tienen una mutación en FGFR1. Para las descripciones clínicas, re­
ferencias y una introducción a la patología molecular de estos
síndromes, véanse OMIM y Wilkie (1997). La naturaleza muy es­
pecífica de las mutaciones sugiere una ganancia de función y está
demostrado que las mutantes de acondroplasia, displasia tanatofó­
rica y de Crouzon producen receptores con grados variables de
activación constitutiva (independiente del ligando) cuando se trans-
fectan en ciertos tipos de células (Naski y cois., 1996).
16.7.4 Las clasificaciones clínica y molecular son
herramientas alternativas para pensar acerca
de las enfermedades y cada una es válida en su
esfera
Los trastornos del tejido conjuntivo que se deben a mutaciones del
gen de colágena, un tema recurrente en este capítulo, ilustran la di­
ferencia entre las clasificaciones clínicas y moleculares de las enfer­
medades (cuadro 16-7).
► Todas las enfermedades mendelianas pueden clasificarse con
base molecular, primero por el locus relacionado y segundo por
el alelo mutante particular en ese locus.
► Las enfermedades genéticas también pueden clasificarse clíni­
camente según sus síntomas y pronóstico. Las categorías clínicas
484 CAPÍTULO DIECISÉIS í PATOLOGÍA MOLECULAR

que se definen en esta forma tal vez no correspondan con exac­
titud a una clasificación molecular, pero pueden ser más útiles
para la asesoría y el tratamiento de pacientes.
Los nombres clínicos no son sólo convenciones. Evolucionan confor­
me el conocimiento de la genética subyacente avanza -las enfermeda­
des se agrupan entre sí (distrofias musculares de Duchenne y de
Becker) o se dividen (cáncer de mama BRCA1 del cáncer de mama es­
porádico)-. Para establecer el diagnóstico molecular es esencial una cla­
sificación molecular y puede posibilitar una asesoría más precisa -p.
ej., sólo el análisis molecular podría mostrar que los padres no afecta­
dos que tienen más de un niño afectado por osteogénesis imperfecta
son mosaicos germinales en lugar de portadores de una forma recesi­
va de osteogénesis imperfecta (OI)-. Sin embargo, una clasificación
molecular plena no siempre tiene utilidad clínica; p. ej., aunque la
OMIM incluye una lista de 11 locus que causan síndromes de Usher
(sordera-ceguera recesiva), en clínica sólo es útil para distinguir tres ti­
pos, cuya gravedad es variable. Por consiguiente una clasificación
molecular ilumina en lugar de superar la clasificación clínica.
16.8 Patología m olecular de trastornos
crom osóm icos
16.8.1 Los síndromes de microdeleción unen la brecha
entre síndromes de gen único y cromosómicos
Si el genoma humano de 3 000 Mb contiene 30 000 genes, una de-
leción de alrededor de una megabase, que es muy pequeña para ob­
servarse bajo el microscopio, aún puede incluir una docena más de
genes. El análisis de FISH y el arreglo-HGC (secciones 2.4.2,
17.3.3) revelan números crecientes de estas anormalidades cromo-
sómicas submicroscópicas (cuadro 16-8). Desde el punto de vista
de la patología molecular, corresponden a tres clases:
► Síndromes de gen único, en el que todos los efectos fenotípi-
cos se deben a deleción (o en ocasiones duplicación) de un gen
único. Por ejemplo, el síndromes de Alagille (MIM 118 450)
se observa en pacientes con una microdeleción en 20pl 1. Sin
embargo, 93% de los enfermos con Alagille no tiene una dele­
ción, sino que por el contrario incluye mutaciones de punto en
el gen JAG1 localizado en 2 0 p ll. En todos los casos la causa
del síndrome es haploinsuficiencia para JAG1.
► Síndromes de gen contiguo, que se observan sobre todo en
varones con deleciones del cromosoma X. El caso clásico fue el
niño 'BB' que sufría distrofia muscular de Duchcnne (DMD
(MIM 310 200), enfermedad granulomatosa crónica (MIM
306 400) y retinitis pigmentosa (MIM 312 600), aunadas a re­
traso mental (Francke y cois., 1985). Tenía una deleción cromo-
sómica en Xp21 que eliminó un grupo de genes contiguos y de
manera incidental brindó a los investigadores los medios para
clonar los genes cuya ausencia ocasionó dos de sus enfermeda­
des, DMD y la enfermedad granulomatosa crónica (sección
14.4.2). Otro grupo de síndromes de gen contiguo muestra de­
leciones de punto de Xp. Deleciones cada vez más grandes eli­
minan más genes y añaden más enfermedades al síndrome
(Ballabio y Andria, 1992). Las microdeleciones son hasta cier­
to punto frecuentes en algunas partes del cromosoma X (p. ej~

FGFR1
8p11

FGFR2
10q25

A CA H T2 T1

FGFR3
4 p 1 6 Señal Región ti m TM Cinasa Cinasa 2
péptida ácida

Fig. 16-9. Correlaciones entre fenotipo y genotipo en mutaciones FGFR.

Se muestran tres de los cuatros receptores de factor de crecimiento de fibroblasto altamente homólogo. Cada cinasa de tirosina receptora tiene tres
dominios extracelulares similares a inmunoglobulina (obtenidos por puentes S-S), un dominio transmembrana (TM) y dominios de cinasa de tirosina
intracelulares pareados. Las mutaciones de sentido erróneo muy específicas se relacionan con una serie de displasia esqueléticas (acondroplasia A,
hipocondroplasia C, displasia tanatofórica tipos 1 y 2, T1 y T2) y síndromes de craneosinostosis (Apert Ap, Crouzon C, Jackson-Weiss JW, Muencke U
Pfeiffer P). Otras mutaciones pueden ocasionar la enfermedad cutis girata de Beare-Stevenson (CA) y algunas mutaciones en el dominio Ig3 de FGFR2
se vinculan con síndromes de Crouzon, Jackson-Weiss y Pfeiffer en diferentes familias.
 16.8 I PATOLOGÍA MOLECULAR DE TRASTORNOS CROMOSÓMICOS 485

Xp21, Xq proximal) pero raras o desconocidas en otros (como
Xp22.1-22.2, Xq28). La deleción de ciertos genes individuales
y las deleciones visibles en regiones abundantes en genes serían
letales sin duda.
► Síndromes de aneuploidía segmentaria. Las microdeleciones
autosómicas rara vez son síndromes de gen contiguo verdade­
ros. Por lo general el fenotipo en heterocigotos depende sólo de
un subgrupo de los genes eliminados, los que son sensibles a
dosis (fig. 16-10). Varios síndromes bien definidos se producen
por microdeleciones nuevas recurrentes (Budarf y Emanuel,
1997). Las regiones propensas a deleción están flanqueadas por
repeticiones largas, que permiten recombinaciones alineadas de
modo erróneo (fig. 11-7). A menudo las repeticiones contienen
secuencias transcritas que pueden hacer una estructura croma-
tínica más abierta y propensa a combinación. Las inversiones
de algunas de estas regiones de tamaño megabase ocurren como
polimorfismos no patógenos comunes que pueden predisponer
a la eliminación por pareamiento erróneo de las repeticiones de
flanqueo (Giglio y cois., 2001).
Resulta muy difícil identificar qué genes en la región eliminada
causan qué partes del fenotipo de estos síndromes de microdele-
ción. Tres estrategias son posibles:

Cuadro 16-7A. Clasificación clínica de las enfermedades del tejido conjuntivo que se mencionan en el texto y en el cuadro 16-7B.
Enfermedad MIM núm. Características

0I tipo I (dividida según hallazgos 166200 (166240) Fragilidad ósea leve a moderada; escleróticas azules; estatura normal; pérdida de la
dentales en IA, IB, IC) audición (50%)

OI tipo II 166210 Fragilidad ósea muy grave; letal perinatal

OI tipo III (166230) Fragilidad ósea moderada a grave; deformación progresiva; estatura muy corta; con
frecuencia pérdida de la audición

OI tipo IV (dividida según hallazgos 166220 Fragilidad ósea leve a moderada; escleróticas normales; estatura variable
dentales en IVA, IVB)

DEE 183900 Estatura baja, cuello corto, displasia espondiloepifisaria

Síndrome de Stickler 108300 DEE leve, paladar hendido, miopía intensa, pérdida de la audición

Displasia de Kníest 156550 Estatura baja desproporcionada; cuello corto; DEE, etcétera

SED tipo VII 130060 Articulaciones y piel laxas

01, osteogenesis imperfecta (enfermedad de huesos frágiles); DEE, displasia espondiloepifisaria; SED, síndrome de Ehlers-Danlos.

Cuadro 16-7B. Clasificación molecular de las enfermedades del tejido conjuntivo que se mencionan en el texto y en el cuadro
16-7A.
Gen Localización Mutaciones Sindrome

C0L1A1 17q22 Alelos nulos 0 l tipo I

Deleciones parciales; sustituciones en la terminal C 01 tipo II

Sustituciones en la terminal N 01 tipos I, III o IV

Deleción del exón 6 SED tipo VII

C0L1A2 7q22.1 Mutaciones de empalme; deleciones de exón 01 tipo I

Mutaciones en la terminal C 01 tipos II, IV

Sustituciones en la terminal N 01 tipo III

Deleción del exón 6 SED tipo VII

C0L2A1 12q13 Mutaciones de punto DEE

Mutación sin sentido Sindrome de Stickler

Defecto en la conversión Displasia de Kniest

Sentido erróneo Acondrogénesis II, displasia espondilometaepifisaria

C0L11A2 6p21.3 Mutación de empalme Sindrome de Stickler

486 CAPÍTULO DIECISÉIS ! PATOLOGÍA MOLECULAR

► encontrar a las personas que tienen un componente del síndro­
me heredado como padecimiento mendeliano causado por
mutación de un gen único dentro de la región candidato;
► encontrar a las personas que tienen microdeleciones más pe­
queñas de lo normal y que sólo muestran características parcia­
les del síndrome;
► eliminar la región correspondiente en el ratón: cruzar los rato­
nes con la deleción con ratones transgénicos para genes indivi­
duales de la región y correlacionar el fenotipo con la extensión
de la haploinsuficiencia restante.
El síndrome de Williams (SWL) (WLS; MIM 194 050) constituye
un buen ejemplo de los problemas. Las personas con SWL tienen
una cara reconocible, retraso del crecimiento, durante la lactancia
pueden padecer hipercalcemia que pone en peligro la vida y a me­
nudo presentan estenosis aórtica supravalvular (EASV). Además
suelen tener retraso mental moderado, casi del mismo grado que el
de las personas con síndromes de Down, pero poseen un perfil cog­
noscitivo y una personalidad muy característicos. Son muy socia­
bles y con frecuencia muy musicales, hablan notablemente bien
pero tienen una incapacidad específica para manipular formas, (ha­
bilidad constructiva visuoespacial). El SWL se debe a una deleción
de 1.6 Mb, resultado de la recombinación entre repeticiones de
flanqueo, en especial en personas heterocigotas para una inversión
común de la región total (Osborne y cois., 2001). Se identificaron
alrededor de 20 genes en la región eliminada (Tassabehji y cois.,
1999). La identificación de los genes importantes entre todos los
eliminados en el SWL podría mostrar un camino para identificar
determinantes genéticos de la cognición y la conducta humanas
normales.
Como se mencionó (sección 16.4.1), la estenosis aórtica supra­
valvular (EASV) puede deberse a deleción o alteración del gen de
elastina. Este gen se encuentra dentro de la región crítica de Wi-
lliams y sin duda la haploinsuficiencia para elastina es la causa de la
estenosis aórtica supravalvular que se observa en el síndrome de
Williams. Aunque es posible que las características faciales también
se deban a una deficiencia de esta proteína de tejido conjuntivo, re­
sulta obvio que no es el caso porque las personas con mutaciones
de elastina simples suelen tener EASV pero no presentan la cara de
Williams. Hasta la fecha ninguna otra característica del síndrome
se atribuye convincentemente a ninguno de los otros genes en la re­
gión. Al parecer las personas con deleciones parciales de la región
tienen sólo EASV o el síndrome completo. Una pregunta interesan­
te es si sería factible reconocer en ratones el fenotipo de Williams.
También otros síndromes por microdeleción se relacionan con con­
ductas específicas y por tanto el descubrimiento de los genes
constitutivos de estos síndromes es un área de gran interés e inves­
tigación en la actualidad.
16.8.2 Los principales efectos de las aneuploidías
cromosomicas pueden deberse a desequilibrios
de dosis en unos cuantos genes identificables
Es probable que las monosomías y las trisomías deban sus fenoti­
pos característicos a unos cuantos efectos génicos mayores super­
puestos en muchas alteraciones menores del desarrollo. Los genes
en que 50% de aumento de la dosis tiene un efecto mayor deben
ser muy raros y por consiguiente ha de ser posible identificar los
pocos genes que causan las principales características, por ejemplo,
del síndrome de Down (SD). Estudios de pacientes con transloca­
ciones muestran que la región crítica de SD se encuentra en
21 q22.2; las trisomías de otras partes del cromosoma 21 no ocasio­
nan SD. En esta región se identificaron cuando menos dos genes
candidato para las características del síndrome de Down: DYRK,
un gen cuyos homólogos en Drosophila y en el ratón (minicerebro)

Cuadro 16-8. Síndromes relacionados con microdeleciones cromosomicas.

Los síndromes causados por haploinsuficiencia de un gen aislado suelen observarse en pacientes que no tienen una microdeleción, sino una mutación
de punto en el gen

Sindrome MIM num. Localización Tipo de anomalía

Wolf-Hirschhorn 194190 4p16.3 Aneuploidía segmentaria

Maullido de gato 123450 5p15.2-p15.3 Aneuploidía segmentaria

Williams 194050 7q11.23 Aneuploidía segmentaria

Langer-Giedon 150230 8q24 Gen contiguo (TRPS1, EXT1)

WAGR 194072 11 p13 Gen contiguo (PAX6, WT1)

Prader-Willi 176270 15q11 -q13 Aneuploidía segmentaria (ausencia de copia paterna)

Angelman 105830 15q11 -q13 Ausencia de UBE3A materno

Rubinstein-Taybi 180849 16p13.3 Haploinsuficiencia para CBP

Miller-Dieker 247200 17p13.3 Gen contiguo {LIS1, YWHAE, etc.)

Smith-Magenis 182290 17p11.2 Aneuploidía segmentaria

Alagille 118450 20p12.1 Haploinsuficiencia para JAG1

Di George/VCFS 192430 22q11.21 Aneuploidía segmentaria

WAGR, tum or de Wilms, aniridia, anormalidades congénitas, retraso mental; VCFS, síndrome velocardiofacial.
 BIBLIOGRAFÍA 487

Varones con deleciones del Pacientes heterocigotos Paciente sin

cromosoma X para deleciones autosómicas deleción

M apa
Mapa X 1 autosómico 5

Xi + A,

X2 A2

X3 A3

X4 A4

A5

A6

a7

A,8

Fenotipo X6
del paciente: + +
X, 3
+
X4

Flg. 16-10. Síndromes de microdeleción ligados a X y autosómicos.

En el cromosoma X, la deleción de los genes X, o X5 es letal en varones. Los pacientes 1 a 3 muestran una serie anidada de síndromes de gen contiguo,
en tanto que el paciente 4 tiene un síndrome de gen contiguo diferente. En el autosoma, sólo el gen A5 es sensible a dosis. Los pacientes 5 a 7, con
deleciones de diferente tamaño, muestran el mism o fenotipo del paciente 8, que es heterocigoto para una mutación de punto con pérdida de la función
en el gen A5.

producen defectos del aprendizaje sensibles a dosis (Aitafaj y cois.,
2001) y DSCAM, una molécula de adherencia celular que se expre­
sa en el sistema nervioso en desarrollo y en el corazón (Barlow y
cois., 2001).
La monosomía y trisomía del cromosoma X despiertan interés
particular porque la inactivación de X debería tornarlos asintomá-
ticos en tejidos somáticos. Sin embargo, no todos los genes ligados
a X están inactivados. Las anormalidades esqueléticas del síndrome
de Turner son causadas por haploinsuficiencia para SHOX, un gen
homeobox en la región seudoautosómica Xp/Yp (sección 2.3.3, fig.
12-15) (Clement-Jones y cois., 2000). Es probable que otras carac­
terísticas somáticas surjan de haploinsuficiencia de otros genes que
escapan a la inactivación de X y que tienen una contraparte Y fun­
cional (véase fig. 12-14). Puesto que sólo se conocen 18 de estos ge­
nes (Lahn y Page, 1997), la lista de posibles candidatos parece
manejable.

Lecturas adicionales

Dipple KM, McCabe ERB (2000) Phenotypes of patients with
'simple' Mendelian disorders are complex traits: thresholds,
modifiers and system dinamics. Am. J. Hum. Genet. 66, 1729-
1735.
Scriver CR, Waters PJ (1999) Monogenic traits are not simple:
lessons from phenylketonuria. Trends Genet. 15, 267-272.
Weatherall DJ (2001) Phenotype-genotype relationships in mono­
genic disease: lessons from the thalassaemias. Nature Rev. Ge­
net. 2, 245-255.
Weatherall DJ, Clegg JB, Higgs DR, Wood WG (2001) The he­
moglobinopathies. En: The Metabolic and Molecular Basis of In­
herited Disease, 8a. ed. Edn (eds CR Scriver, AL Beaudet, WS Sly,
D Valle). McGraw Hill, New York, pp. 4571-4636.
CAPÍTULO DIECISIETE

Genética del cáncer

Contenido del capítulo

Recuadro 17-1 Dos formas de establecer una serie de mutaciones sucesivas más probables 491
490 CAPÍTULO DIECISIETE GENÉTICA DEL CÁNCER

17.1 Introducción en los principios de la tumorigénesis, como se comprende en la ac­

El cáncer es tanto una enfermedad como la etapa final natural de
cualquier organismo multicelular. Todas las personas están familia­
rizadas con la idea darwiniana básica que señala que una población
de organismos cuya capacidad de reproducción muestra variación
hereditaria evolucionará por selección natural. Los genotipos que
se reproducen más rápido o con mayor extensión llegarán a domi­
nar las generaciones posteriores, sólo para ser sustituidos a su vez
por reproductores más eficientes aún. El factor determinante pue­
de ser un incremento en la tasa de mortalidad o una disminución
de la misma. Justo lo mismo se aplica a la población de células que
constituye un organismo multicelular como el hombre. El naci­
miento y la muerte celulares están controladas genéticamente y si
la m utación som ática crea una variante que prolifera con mayor ra­
pidez, la clona mutante tenderá a hacerse cargo del organismo. Por
consiguiente el cáncer puede considerarse como un proceso evolu­
tivo natural.
Los cánceres son el resultado de una serie de mutaciones somá­
ticas y en ciertos casos también de una predisposición hereditaria.
Pueden clasificarse según los tejidos de origen (los carcinomas de­
rivan de células epiteliales, las leucemias y los linfomas de precur­
sores de células sanguíneas, etc.) y la histología que se observa al
microscopio (fig. 17-1). El uso reciente de arreglos de expresión
para mostrar el patrón total de expresión génica en un tumor (véa­
se fig. 17-18) promete refinar aún más la clasificación. Estas divi­
siones son importantes para establecer el pronóstico y el
tratamiento, pero no explican cómo evolucionó el cáncer. El obje­
tivo de la genética del cáncer es comprender la vía mutacional y se­
lectiva de múltiples pasos que permitió que una célula somática
normal originara una población de células cancerosas proliferantes
e invasoras. Conforme se descubren acontecimientos moleculares
fundamentales, los patólogos disponen de nuevos indicadores pro­
nósticos.
La genética del cáncer puede ser muy confusa. Cada tumor es
individual. Existen tantos genes diferentes que adquieren mutacio­
nes en uno u otro tumor y a continuación interactúan en formas
tan complejas que es fácil perderse en un mar de detalles. En este
capítulo se intentará evitar confusiones mediante la concentración
tualidad, en lugar de catalogar genes y mutaciones.
1 7 .2 Evolución del cáncer
Como ya se describió, las células se encuentran bajo una presión se­
lectiva potente para evolucionar a células tumorales. Pero si bien los
tumores tienen mucho éxito como células, como organismos son
fracasos desesperados. No dejan descendientes más allá de la vida de
su huésped. Por tanto, a nivel del organismo total, hay un selección
potente para mecanismos que evitan que una persona muera por un
tumor, cuando menos hasta que tuvo éxito y crió a sus hijos. En
consecuencia el hombre está regulado por dos grupos opuestos de
fuerzas selectivas. No obstante, la selección para tumorigénesis es a
corto término, en tanto que la selección para resistencia es a largo
plazo. La evolución de una célula somática normal en un tumor ma­
ligno ocurre durante la vida de una persona y tiene que comenzar de
nuevo con cada nuevo individuo. Sin embargo, un organismo con
un buen mecanismo antitumoral lo transmite a su descendencia, en
la que continúa en evolución. Mil millones de años de evolución do­
taron al hombre de mecanismos de engrane y superposición compli­
cados para protegerlo contra tumores, cuando menos durante su
vida reproductiva. Las posibles células tumorales se reparan y regre­
san de nuevo a la línea o bien a destruirse por sí mismas (apoptosis).
Ninguna mutación aislada puede evitar estas defensas y convertir
una célula normal en otra maligna. Hace mucho tiempo los estudios
de la dependencia del cáncer en la edad sugirieron que se requieren
en promedio seis a siete mutaciones sucesivas para convertir una cé­
lula epitelial normal en un carcinoma invasor. En otras palabras, una
célula normal puede convertirse en un tumor maligno sólo si la mi­
tad de una docena de defensas independientes es incapacitada por
mutaciones (fig. 17-2).
La posibilidad de que una célula aislada sufra seis mutaciones
independientes es insignificante, lo que sugiere que el cáncer debe
ser cada vez más raro. Sin embargo, dos mecanismos generales
pueden permitir que la progresión ocurra (recuadro 17-1). No
obstante, como la acumulación de todas estas mutaciones requie­
re tiempo, el cáncer es sobre todo una enfermedad de la vida pos-

Fig. 17-1. Histología de tum ores.

Etapas en el desarrollo de un carcinoma. Tres cortes histológicos de mucosa bucal, teñidos con hematoxilina y eosina, que muestran las etapas del
desarrollo de cáncer bucal. A) Epitelio normal. B) Epitelio displásico, que es un cambio potencialmente premaligno. El epitelio muestra crecimiento y
maduración desordenados, células anormales e incremento de mitosis. C) Cáncer originado del epitelio superficial que invade los tejidos conjuntivos
subyacentes. Los islotes del tum or (carcinoma) muestran diferenciación desordenada, células anormales y mayor número de mitosis atípicas. Los
anatomopatólogos utilizan estos cambios de la arquitectura tisular para identificar y graduar los tumores. Cortesía del doctor Nalin Thakker.

Mutación num. 1 Mutación núm. 2 Mutación núm. 3
Crecimiento selectivo Crecimiento selectivo
de la clona con de la clona con
mutación núm. 1 mutaciones 1+2
Fig. 17-2. Evolución del cáncer en múltiples etapas.
Cada mutación sucesiva proporciona a la célula una ventaja en el crecimiento, de manera que forma una clona expandida, que en consecuencia presentan
un blanco más grande para la mutación siguiente.
reproductiva, cuando la presión selectiva para mejorar aún más las
defensas es poca.
Si se consideran los genes que son blanco de estas mutaciones,
es posible distinguir dos categorías amplias, aunque, como sucede
siempre en biología, hay más medios para pensar respecto al cáncer
que clasificaciones sin argumentos exclusivas.
► Oncogenes (sección 17.3). Son genes cuya actividad normal
promueve la proliferación celular. Las mutaciones de ganancia
de función en células tumorales crean formas que muestran ac­
tividad excesiva o inapropiada. Un alelo mutante aislado pue­
de afectar el fenotipo de la célula. Las versiones no imitantes se
denominan con propiedad protooncogenes.
► Genes supresores de tumor (ST) (sección 17.4). Los produc­
tos de los genes ST inhiben acontecimientos que conducen al
cáncer. Las versiones mutantes en las células de cáncer perdie­
ron su función. Algunos productos génicos de ST impiden la
progresión inapropiada del ciclo celular, otros desvían células
hacia la apoptosis, en tanto que varios mantienen estable el ge-
noma y las tasas de mutación bajas para asegurar la replicación,
la reparación y la segregación precisas del DNA celular. Es ne­
cesario investigar ambos alelos de un gen ST a fin de cambiar
la conducta de la célula.
Por analogía con un autobús, es posible imaginar que los oncoge­
nes son el acelerador y los genes supresores de tumor, el freno. La
presión del acelerador (una ganancia de función dominante de un
oncogen) o la falla de todos los frenos (una pérdida recesiva de
función de un gen ST) determinarán que el autobús corra fuera
de control.
Recuadro 1~-1. Dos formas de estab lec er una serie de m utaciones sucesivas m ás probables
El cambio de una célula epitelial normal en una célula cancerosa maligna
tal vez requiera seis mutaciones específicas en la célula. Si una tasa de
mutación típica es de 10 7 por gen por generación celular, resulta cada
vez menos probable que una célula sufra tantas mutaciones (que es la ra­
zón por la que la mayoria de los humanos está viva). La probabilidad de
que esto suceda a cualquiera de las 1013 células en una persona es 1013
x 1 0 ” 42 o 1 en 1029. No obstante, el cáncer ocurre por una combinación
de dos mecanismos:
► algunas mutaciones incrementan la proliferación celular y crean una
población blanco de células expandida para la siguiente mutación
(fig. 17-2);
17.3 ONCOGENES 491
Continuación de la
evolución mediante
selección natural
17.3 Oncogenes
17.3.1 Histeria de los oncogenes
Los oncogenes se descubrieron en el decenio de 1960 cuando se reco­
noció que ciertos cánceres de animales (en especial leucemias y linfo-
mas) eran causados por virus. Algunos de los virus tenían genomas
DNA hasta cierto punto complicados (virus SV40, papilomavirus),
pero otros eran retrovirus de transformation aguda con genomas RNA
muy simples. El genoma de un retrovirus estándar posee sólo tres uni­
dades de transcripción: gag, proteínas de codificación interna; poL, co­
dificación de polimerasa, y env, codificación de proteínas de envoltura
(cada transcrito se corta para codificar varias proteínas). El descubri­
miento de que las propiedades transformantes de los retrovirus que se
transforman en forma aguda se debían por completo a que poseían un
gen extra, el oncogen, despertó una gran excitación. Durante poco
tiempo algunos investigadores entusiasmados esperaban explicar la to­
talidad del cáncer mediante la infección con virus que llevan oncoge­
nes cuya acción podría bloquearse una vez que se identificaran.
Algún tiempo después los investigadores descubrieron que los
oncogenes virales eran copias de genes celulares normales, los p ro ­
tooncogenes, que se incorporaron de manera accidental en las partí­
culas retrovirales. Las versiones virales eran “activadas” de alguna
manera y ello les permitía transformar células infectadas. La mayor
parte de los cánceres del hombre no depende de virus, pero de cual­
quier modo sus protooncogenes residentes se activaron. A finales del
decenio de 1970 se desarrolló una valoración para detectar oncoge­
nes celulares activados. Células de fibroblastos del ratón NIH-3T3
se transfectaron con fragmentos de DNA aleatorios de tumores hu-
► algunas mutaciones afectan la estabilidad de la totalidad del genoma,
a nivel del DNA o cromosómico, e incrementan el índice total de m u­
taciones.
Como los cánceres dependen de estos dos mecanismos, se desarrollan
en etapas, a partir de hiperplasia de tejido o crecimientos benignos, en
tanto que las células de tumores malignos suelen anunciar su inestabili­
dad genómica por sus cariotípos caprichosos (fig. 17-10).
492 I CAPÍTULO DIECISIETE GENÉTICA DEL CÁNCER

manos. Algunas de las células se transformaron y fue factible aislar
el DNA humano causal de las transformadas elaborando una biblio­
teca genómica de fagos y seleccionando para la repetición humana
específica Mu. Los oncogenes identificados en los fragmentos de
transformación incluyeron muchos ya conocidos por estudios vira­
les. Véase Bishop (1983; Lecturas adicionales) para las descripciones
de este trabajo inicial respecto a retrovirus y oncogenes celulares.
17.3.2 Funciones de los oncogenes
El conocimiento funcional de los oncogenes inició en 1983 cuan­
do se descubrió que el oncogen viral v-sis (el prefijo v- denota un
oncogen viral) se derivaba del gen del factor B del crecimiento de­
rivado de plaquetas celular normal (PDGFB). La expresión excesi­
va no controlada de un factor de crecimiento sería una causa obvia
de hiperproliferación celular. En la actualidad se conocen las fun­
ciones de muchos oncogenes celulares (en sentido estricto, pro-
tooncogenes) (cuadro 17-1). Por fortuna resultó que controlaban
justo la clase de funciones celulares que cabría predecir que estaban
alteradas en el cáncer. Es posible distinguir cuatro clases amplias;
► factores de crecimiento secretados (p. ej., SIS)]
► receptores de superficie celular (como ERBB y FMS);
► componentes de sistemas de transducción de señal intracelula-
res (p. ej., la familia RAS y ABL);
► proteínas nucleares de enlace de DNA, inclusive factores de
transcripción (como MYC, JUN)\
► componentes de la red de ciclinas, cinasas dependientes de ci-
clinas e inhibidores de cinasa que rigen la progresión a través
del ciclo celular (como MDM2).
Si los oncogenes se definen como genes que sufren mutaciones ac­
tivadores dominantes en tumores, en la actualidad se conocen un
poco más de 100.
17.3.3 Activación de protooncogenes
Algunas de las mejores ilustraciones de la patología molecular en
acción las proporcionan las diversas formas en que los protoonco-
genes pueden activarse (cuadro 17-2). La activación comprende
una ganancia de función, que puede ser cuantitativa (un incremen­
to en la elaboración de un producto no alterado) o cualitativa (sín­
tesis de un producto modificado sutilmente como resultado de una
mutación, o un producto nuevo a partir de un gen quimérico crea­
do por un reordenamiento cromosómico). Estos cambios son do­
minantes y por lo general sólo afectan un alelo aislado del gen.
Blume-Jensen y Hunter (2001) presentaron ejemplos adicionales
que ilustran los mecanismos que se describen a continuación.
Activación por amplificación
Muchas células cancerosas contienen múltiples copias de onco­
genes con estructura normal. Con frecuencia los cánceres de ma­
ma amplifican ERBB2 y a veces MYC; un gen relacionado
NMYC suele amplificarse en los neuroblastomas y rabdomiosar-
comas en etapa tardía. Es posible que haya cientos de copias ex­
tra. Pueden existir como corpúsculos de cromatina pareados
pequeños, separados de los cromosomas (dim inutos dobles), o in­
serciones en cromosomas normales (regiones que se tiñen d e m a­
nera hom ogénea, RTH). Los acontecimientos genéticos que los
producen pueden ser muy complejos porque suelen contener se­
cuencias derivadas de varios cromosomas distintos (revisado por
Pinkel, 1994). Se observan amplificaciones génicas similares en
células expuestas a regímenes de selección artificial potentes -por
ejemplo, los genes de reductasa de dihidrofolato amplificados en
células seleccionadas para resistencia al metotrexato-. En todos
los casos el resultado es un incremento considerable del nivel de
expresión génica.
La amplificación de oncogenes en tumores puede estudiarse
mediante hibridación genóm ica comparativa (HGQ (Forozan y cois.,
1997). El análisis también revela cualquier región de pérdida o
aneuploidía de alelos, que puede indicar genes supresores de tumor
(véase más adelante). En la prueba de HGC se utiliza una mezcla
de DNA de células normales testigo y tumorales en hibridación
competitiva. Las dos muestras se marcan con fluoros rojo y verde,
mezclados, y se emplean como una sonda de hibridación. Se obser­
va la relación de la señal de hibridación roja con la verde. La HGC
puede realizarse en dos formas:

Cuadro 1 7 -1 . Oncogenes ■virales y celulares.

Enfermedad viral v-onc c-onc Localización Función

Sarcoma simiano v-sis PDGFB 22q13.1 Subunidad Bdel factor de crecimiento derivado de plaquetas
Eritroleucemia de polios v-erbb EGFR 7p12 Receptor del factor de crecimiento epidérmico
Sarcoma felino de McDonough v-fms CSF1R 5q33 Receptor del factor estimulante de colonias de macrófagos
Sarcoma de la rata de Harvey v-ras HRAS 11 p15 Componente de la transducción de señal de la proteina G
Leucemia del raton de Abelson v-abl ABL 9q34.1 Cinasa de tirosina proteínica
Sarcoma 17 aviario v-jun JUN 1p32-p31 Factor de transcripción AP-1

Mielocitomatosis aviaria v-m yc MYC 8q24.1 Factor de transcripción de enlace de DNA

Osteosarcoma del raton v-fos FOS 14q24.3-q31 Factor de transcripción de enlace de DNA

En ocasiones los genes virales se designan v-src, v-m yc, etc., y sus correspondientes celulares c-src, c-m yc, etc. Las formas de los genes c-onc en
células normales se denominan con propiedad protooncogenes. En la actualidad es frecuente ignorar estas distinciones y utilizar sólo el término onco­
genes para los genes normales. Las versiones anormales pueden describirse como oncogenes activados.

Cuadro 1 7 -2 . Cuatro formas de activación de (proto)-oncogenes.
M e ca n ism o de activación
Amplificación
Mutación de punto
Reordenamiento cromosómico que crea un nuevo gen quimérico
Translocación a una región de cromatina con actividad transcripcional
► hibridación genómica comparativa (HGC) estándar (fig. 17-3A)
que hibrida las muestras mezcladas a dispersiones de cromoso­
mas normales en portaobjetos para microscopio (hibridación de
fluorescencia in situ, sección 2.4.3). La relación de la señal de
HFIS roja con la verde se grafica a todo lo largo de cada cromo­
soma y se eliminan regiones en las que la relación se desvía del
1:1 esperado, medido por un intervalo de confianza. Según la di­
rección de la desviación, esto marca regiones de amplificación o
de pérdida de alelos en el tumor. La alteración más pequeña vi­
sible con esta técnica tiene alrededor de 3 Mb;
► el reordenamiento-HGC (fig. 17-3B) utiliza DNA microarregla-
do en lugar de cromosomas para la hibridación. El DNA en cada
punto se hace mediante PCR-DOP (sección 5.2.4) de una clona
BAC a partir de una localización cromosómica definida. Ello
puede ofrecer una resolución mucho más alta, limitada sólo por
el número de BAC en el arreglo. La mejor en la actualidad son
3 000 BAC para una resolución de 1 Mb. Una ventaja adicional
sobre la HGC convencional es que cualquier secuencia amplifica­
da o eliminada se identifica de inmediato a nivel de las secuencias
del DNA, en lugar de localizaciones por bandeo cromosómico.
Activación por mutación de punto
Las tres familias génicas RAS, HRAS, KRAS y NRAS, que median el
señalamiento mediante receptores acoplados a proteína G (Lowy y
Willumsen, 1993), se activan en una gran variedad de tumores. El
enlace de ligandos a los receptores desencadena el enlace de GTP a
la proteína RAS, y GTP-RAS transmite la señal de manera progre­
siva en las células (véase fig. 3-5). Las proteínas RAS tienen activi­
dad de GTP-asa y GTP-RAS se convierte con rapidez en GDP-RAS
inactivo. Las mutaciones de punto activadoras específicas en genes
HAS suelen encontrarse en las células de una diversidad de tumores
que incluye los cánceres de colon, pulmón, mama y vejiga. La pro­
teína RAS mutante tiene una actividad de GTP-asa reducida, de
manera que GTP-RAS se inactiva más lentamente y da lugar a una
respuesta celular excesiva a la señal proveniente del receptor.
Activación mediante una transtocación que crea un gen
quimérico nuevo
Este mecanismo es raro en carcinomas (tumores epiteliales) pero fre­
cuente en tumores hematológicos y sarcomas. El mejor ejemplo que
se conoce es el cromosoma Philadelphia (Ph), un cromosoma acro-
17.3 ONCOGENES 493
Oncogén Tum or
ERBB2 Cáncer de mama, ovario, gástrico, pulmonar de célula no
pequeña, de colon
NMYC Neuroblastoma
HRAS Cáncer de vejiga, pulmón, colon, melanoma
KIT Tumores estromáticos gastrointestinales, mastocitosis
[Many] Véase cuadro 17-3
MYC Translocación al locus de cadena pesada de la inmunoglobulina
por t(8;14) en el linfoma de Burkitt
céntrico pequeño que se observa en 90% de los pacientes con leucemia
mieloide crónica. Este cromosoma es un producto de una transloca­
ción recíproca equilibrada 9;22. El punto de rotura en el cromosoma
9 se encuentra dentro de un intrón del oncogen ABL. La translocación
une la parte 3' de la secuencia genómica ABL con la parte 5' del gen
BCR (del inglés ¿reakpoint dbster región, región de punto de rotura
del grupo,) en el cromosoma 22 y crea un gen de fusión nuevo (Chis-
soe y cois., 1995). Este gen quimérico se expresa para producir una ci-
nasa de tirosina relacionada con el producto ABL pero con propiedades
de transformación anormales (fig. 17-4A).
En la actualidad se reconocen muchos puntos de rotura especí­
ficos de tumor y se identifican muchos oncogenes clonándolos
(cuadro 17-3). En el sitio de red Cáncer Genome Anatomy Project
(Mitelman y cois., 2002) es posible buscar una base de datos de unas
40 000 aberraciones cromosómicas en el cáncer.
Activación por transtocación en una región efe cromatina
con actividad transcripeionaí
El linfoma de Burkitt es un tumor de la niñez frecuente en regio­
nes palúdicas de Africa Central y Papua Nueva Guinea. Se piensa
que los mosquitos y el virus Epstein-Barr desempeñan cierta fun­
ción en la causa, pero la activación del oncogen MYC es un hecho
central. En 75 a 85% de los pacientes (fig. 17-4B) se observa una
translocación cromosómica característica, t(8;l4) (q24;q32). El
resto tiene t(2;8)(pl2;q24) o t(8;22)(q24;ql 1). Cada una de las
translocaciones coloca el oncogen MYC cerca de un locus de inmu-
noglobulina, IG H en 14q32, IG K en 2pl2 o IGL en 22ql 1. A di­
ferencia de las translocaciones específicas de tumor que se muestran
en el cuadro 17-3, las translocaciones del linfoma de Burkitt no
crean genes quiméricos nuevos. Por el contrario, ponen el oncogen
en un ambiente de cromatina que se transcribe de manera activa en
células B que producen anticuerpo. Por lo general el exón 1 (que
no es codificante) del gen MYC no se incluye en el material trans-
locado. Con la supresión de sus controles normales corriente arri­
ba y su colocación en un dominio cromatínico activo, MYC se
expresa en un nivel alto inapropiado. Sin embargo, es posible que
no sea todo lo que sucede. Estas translocaciones se producen por la
acción dirigida en forma errónea de las recombinasas especiales que
participan en el reordenamiento del gen V-D-J de inmunoglobuli-
na (sección 10.6) y a menudo el gen MYC translocado contiene
mutaciones de punto nuevas inducidas como pane del mecanismo
para generar una diversidad de anticuerpos.
494 CAPÍTULO DIECISIETE ¡ GENÉTICA DEL CÁNCER

A) Análisis HGC-AR B) • • O• • • O• • • ••••

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Fig. 17-3. Hibridación genómica comparativa (HGC).

A) HGC crom osom ica. Análisis de HGC de alta resolución de muestras de dos niños dism órficos y con retraso mental cuyos cromosomas bandeados
G parecían normales. La línea amarilla es el trazo de HGC y la línea negra el intervalo de confianza de 99% para una relación 1:1. El primer caso tiene
una deleción nueva pequeña que se confirm ó mediante hibridación de fluorescencia in situ (FISH); el segundo caso tiene una duplicación nueva que
puede observarse en retrospectiva en los cromosomas bandeados G. Imágenes cortesía del doctor Claes Lundsteen, Copenhagen. B) Arreglo-HGC.
Fragmentos de PCR-DOP de 321 BAC manchados en un portaobjetos, que a continuación se híbrido para una mezcla de DNA de una línea de células de
tum or de mama (marcado verde) y DNA de referencia normal (marcado rojo). Los BAC que contienen DNA que se amplifica en el tum or se ven verdes,
los que contienen DNA iluminado en el tum or se ven rojos y los que se encuentran donde el tum or no cambió se ven amarillos. Cada grupo se mancha
por triplicado para permitir variaciones en la eficiencia de la hibridación. Cortesía del doctor J. Veltman, Nijmegen.

Muchos otros reordenamientos cromosómicos que se producen
por el mismo mecanismo colocan uno u otro oncogen en la cercanía
de un gen de mmurioglobulina (IGG) o un gen de receptor de célu­
la T ( TCR) (Sánchez-García, 1997). Estos reordenamientos son ca­
racterísticos de leucemias y linfomas, pero no de tumores sólidos.
1 7 .4 Genes supresores de tum or
17.4.1 El paradigma del retinoblastoma
Stanbridge (1990; véase Lecturas adicionales) describió la base del
conocimiento de los genes supresores de tumor (ST). Un hecho
sobresaliente temprano fue el trabajo de Knudson en 1971 res­
pecto al retinoblastoma (revisado por Knudson, 2001). Es un
cáncer agresivo de la niñez que se desarrolla a partir de retinoblas-
tos, una población pasajera de células que se dividen con rapidez,
se diferencian mal y que, en la analogía del autobús que ya se co­
mentó, conducen de manera peligrosa y por consiguiente se
transforman con relativa facilidad. Alrededor de 40% de los casos
es familiar. Se heredan como un carácter dominante incompleta­
mente penetrante (MIM 180 200). Los casos familiares suelen ser
bilaterales, en tanto que las formas esporádicas siempre son uni­
laterales. Knudson señaló que la distribución por edad de inicio
de casos bilaterales era compatible con una mutación única, en
tanto que los casos esporádicos seguían cinéticas de dos golpes.
Razonó que todos los retinoblastomas incluían dos “golpes”, pe­
ro que en los casos familiares se heredaba un golpe (fig. 17-5). Un
estudio elemental realizado por Cavenee y colaboradores (1983)
comprobó la hipótesis de Knudson y estableció el paradigma pa­
ra las investigaciones de laboratorio de genes supresores de tumor
(ST).
Cavenee y colaboradores tipificaron material tumoral extirpado
por medios quirúrgicos de pacientes con retinoblastoma esporádi-
 17.4 I GENES SUPRESORES DE TUMOR 495

A) 9 22 d e r (9) Ph1 B) 8 14 der (8) der (14)

BCR
- - R - -B C R ABL

IGH
ABL- M Y c - - y - - - - - - - /G H
MYC

II
A
s' h — * i * ii I limn 3' 5'
1 ~2 .“¡T
3'

5' Hi 3' 5'

T.
, C1 C2 C3
3'

I
5— i----- ■ ■ mm » ii mi mi 3'
Gen de fusión 3 2 C1 G2 C3

I
myc IgH

8 .5 kb B C3 R /A B L m R N A

Aumento de la expresión de proteína

MYC con estructural normal
Proteína de fusión p210 (el exón 1 no es codificante)
(cinasa de tirosina con actividad constitucional)

Fig. 17-4. Reordenamientos cromosómicos que activan oncogenes.

A) Activación por cambio cualitativo en t(9;22) en la leucemia mieloide crónica. El gen de fusión BCR-ABL quimérico en el cromosoma Philadelphia
codifica una cinasa de tirosina que no responde a controles normales. Véase Chissone y colaboradores (1995) para mayores detalles. B) Activación por
cambio cuantitativo en t(8;14) en el iinfoma de Burkitt. El gen MYC del cromosoma 8 está translocado en el gen de cadena pesada de inmunoglobulina.
En células B esta región se transcribe de manera activa, lo que conduce a expresión excesiva de MYC.

co, utilizando una serie de marcadores del cromosoma 13 (se sabía
que en ocasiones el retinoblastoma se relacionaba con cambios cro­
mosómicos en 13ql 4). Cuando compararon los resultados en
muestras de sangre y tumor del mismo paciente, observaron varios
casos en los que el DNA constitucional (sanguíneo) era heterocigo-
to para uno o más marcadores, pero al parecer las células tumora-
les eran homocigotas. Razonaron que lo observado era uno de los
"golpes” de Rnudson: pérdida de una copia funcional de un gen su-
presor de tumor. Estudios ulteriores confirmaron esta interpreta­
ción al demostrar que en casos hereditarios siempre se perdía el
alelo de tipo silvestre en esta forma. Mediante la combinación de
análisis citogenéticos con estudios de marcadores de diferentes re­
giones de 13q, Cavenee y colaboradores pudieron sugerir varios
mecanismos para la pérdida (fig. 17-6).
Este trabajo tuvo dos implicaciones mayores. Primero, sugirió
que los cánceres esporádicos y los familiares podían compartir me­
canismos moleculares. Segundo, insinuó dos formas de encontrar
genes ST:
► mapeo y clonación posicional de los genes que causan cánceres
familiares;
► estudio de tumores para pérdidas de material cromosómico es­
pecífico.
El cuadro 17-4 incluye una lista de algunos de los genes ST que se
identificaron por medio de estudios de cánceres familiares raros.
Complicaciones del paradigma del retinoblastoma
En retrospectiva, el retinoblastoma es un ejemplo en extremo pre­
ciso de un mecanismo de dos golpes, tal vez porque, como se men­
cionó, los retinoblastos son células poco comunes. Varios otros
cánceres siguen muy de cerca el ejemplo del retinoblastoma. APC,
NF2y PTC (cuadro 17-4) son ejemplos en los que se identificó un
gen ST mediante la investigación de un cáncer familiar raro que re­
sultó importante en el cáncer esporádico correspondiente, pero no
siempre sucede así.
► Al parecer algunos cánceres siguen diferentes vías evolutivas en
casos familiares y esporádicos. Por ejemplo, BRCA1 sólo se inac­
tiva en 10 a 15% de los cánceres de mama esporádicos y estos tu­
mores forman un subgrupo molecular identificable preciso de
cánceres de mama. La inactivación, cuando ocurre, no se debe a
496 CAPÍTULO DIECISIETE } GENÉTICA DEL CÁNCER

Cuadro 17-3. Genes quiméricos producidos por reordenamientos cromosómicos específicos de cáncer.
Tumor Reordenamiento Gen quimérico Naturaleza del producto quimérico

LMC t(9;22)(q34;q11) BCR-ABL Cinasa de tirosina

Sarcoma de Ewlng t(1 1 ;22)(q24;q12) EWS-FU1 Factor de transcripción

Sarcoma de Ewing (variante) t(21 ;22)(q22;q12) EWS-ERG Factor de transcripción

Melanoma maligno de partes blandas t(12;22)(q13;q12) EWS-ATF1 Factor de transcripción

Tumor de célula redonda pequeña desmoplásico t(1 1 ;22)(p13;q12) EWS-WT1 Factor de transcripción

Liposarcoma t(12;16)(q13;p11) FUS-CHOP Factor de transcripción

LMA t(16;21)(p11;q22) FUS-ERG Factor de transcripción

Carcinoma papilar de la tiroides inv(1)(q21;q31) NTRK1 -TPM3(TRK oncogén) Cinasa de tirosina

Leucemia linfoblastoide aguda precélula B t(1 ;19)(q23;p13.3) E2A-PBX1 Factor de transcripción

LLA t(X;11)(q13;q23) MLL-AFX1 Factor de transcripción

LLA T(4;11)(q21;q23) MLL-AF4 Factor de transcripción

LLA t(9;11)(q21;q23) MLL-AF9 Factor de transcripción

LLA t(1 1 ;19)(q23;q13) MLL-ENL Factor de transcripción

Leucemia promielocítica aguda t(15;17)(q22;q12 PML-RARA Factor de transcripción + receptor de

ácido retinoico

Rabdomiosarcoma alveolar t(2;13)(q35;q14) PAX3-FKHR Factor de transcripción

LMC, leucemia mielolde crónica; LMA, leucemia mielógena aguda; LLA, leucemia linfoblastoide aguda.

Obsérvese cómo el mismo gen puede participar en varios reordenamientos diferentes. Para mayores detalles véase Rabbitts (1994).

Tumor

Célula som ática en una

persona normal p e rs o n a n o rm a l; to d a s la s c é lu la s
s o m á tic a s e n u n a p e rs o n a c o n
re tin o b la s to m a fa m ilia r

Fig. 17-5. Hipótesis de dos golpes de Knudson.

Supóngase que hay un millón de células blanco y que la probabilidad de mutación es 1CT5 por célula. El retinoblastoma esporádico requiere dos golpes
y afectará a una persona en 10 0 00 (106 x 10 ~5 x 10~5 = 10 -4 ), en tanto que la form a familiar sólo necesita un golpe y será muy penetrante, puesto
que (106 x 10“ 5 > 1). Véase Knudson (2001) para una tratamiento más complejo.

los mecanismos cromosómicos que se observan en el retinoblas­
toma (fig. 17-6) sino a metilación del DNA (sección 17.4.3).
► Con frecuencia algunos genes pierden la función de un alelo en
tumores, pero el alelo que se conserva parece por completo fun­
cional. En ocasiones esto se debe a que el segundo alelo es inac-
tivado por metilación, que no se detecta mediante alguno de los
métodos experimentales utilizados, pero algunos casos parecen
ser acontecimientos genuinos de un golpe. Es razonable postular
que hay genes en los que la haploinsuficiencia es suficiente (sec­
ción 16.4.2) para proporcionar una ventaja en el crecimiento.
► Más rara vez, existen algunos casos en los que se observan tres
golpes. En la poliposis adenomatosa familiar (sección 17.5.3’
ciertas mutaciones de la línea germen son “débiles” y confieren
un fenotipo atenuado con menos pólipos. Los adenomas de es­
tos pacientes suelen tener dos mutaciones somáticas además de
la mutación hereditaria. Una mutación somática inactiva el ale­
lo de tipo silvestre. Esto proporciona a las células una ventaja
en el crecimiento, pero adquieren una ventaja adicional por
una deleción cromosómica que elimina el alelo APC de la línea
germinal parcialmente funcional.
 17.4 GENES SUPRESORES DE TUMOR 497

Marcador A 1 - - - - 2
R B -------+
Marcador B 1 -- -- 2

Fig. 17-6. Mecanismos de pérdida del alelo de tipo silvestre en el retinoblastoma.

A) Pérdida de la totalidad del cromosoma por falta de disyunción mitótica. B) Pérdida seguida de duplicación para dar (en este caso) tres copias del
cromosoma Rb. C) Recombinación mitótica proximal al locus Rb (CO, seguida por segregación de ambos cromosomas que llevan Rb a una célula hija (C2);
ésta fue la primera demostración de la recombinación mitótica en humanos, o de hecho en mamíferos. D) Deleción del alelo de tipo silvestre. E) Mutación
de punto patógena del alelo de tipo silvestre (adaptado de Cavenee y cois., 1983). Las figuras inferiores muestran los resultados de la tipificación del DNA
normal (N) y tumoral (T) de los dos marcadores A y B localizados como se muestra. Obsérvense los patrones de pérdida de heterocigosidad.

Cuadro 17-4. Cánceres familiares raros causados por mutaciones del gen supresor de tumor (ST).
Enfermedad MIM num. Localización en el mapa Gen

Poliposis adenomatosa del colon familiar 175100 5q21 APC

Cáncer de colon no polipósico hereditario 120435,12036 2p16,3p21.3 MSH2, MLH1

Cáncer de mama-ovario 113705 17q21 BRCA1

Cáncer de mama (inicio temprano) 600185 13q12-q13 BRCA2

Síndrome de Li-Fraumeni 151623 17p13 TP53

Síndrome de nevo de célula basal de Gorlln 109400 9q22-q31 PTC

Ataxia telangiectasia 208900 11q22-q23 ATM

Retinoblastoma 180200 13q14 RB

Neurofibromatosis 1 (enfermedad de Von Recklinghausen) 162200 17q12-q22 NF1

Neurofibromatosis 2 (schwannomas vestibulares) 101000 22q12.2 NF2

Melanoma familiar 600160 9p21 CDKN2A

Enfermedad de Von Hippel-Lindau 193300 3p25-p26 VHL

Pueden encontrarse referencias de los genes de enfermedades en OMIMbajo el número citado. El cuadro 1 de Futreal y colaboradores (2001) propor­
ciona una lista más larga.
498 CAPÍTULO DIECISIETE GENÉTICA DEL CÁNCER

Fig. 17-7. Cambios genéticos en tumores.

A) Pérdida de heterocigosidad. La muestra de tejido normal (N) es heterocigota para el marcador D8S522 (flechas), en tanto que la muestra de tumor
(T) perdió el alelo superior. Las bandas más altas en el gen son “ bandas de conform ación” , bandas subsidiarias producidas por secuencias de cada
alelo dobladas de modo alternativo. Fotografía cortesía del doctor Nalin Thakker, St. M ary’s Hospital, Manchester, UK. B) In estab ilidad m icro sa télite en
cánceres de colon no pollpósico hereditario. Análisis de secuenciador de fluorescencia de cinco microsatélites en tumores CCNPH. Los trazos negros
provienen de DNA constitucional, los rojos de DNA del tum or del m ism o paciente. Las flechas indican nuevos alelos en los tumores. BAT26 y BAT40
son carreras (A)n, D2S123, D8S255 y D13S175 son repeticiones de dinucleótido (CA)n. Cortesía de Yvonne Wallis, West Midlands Regional Genetics
Laboratory, Birmlngham, UK.

21 carcinomas bucales de célula escam osa ¿ L o c a liz a c io n e s

de TSG?
D 8S264
D 8S262
D 8S518
D 8S277
D 8S265
D 8S552
D 8S511
D 8S549 i
D 8S254
D 8S 261
D 8S280
LP L
D 8S258
D 8S282
D 8S560
D 8S298
D 8S133
D 8S87
\ D 8S283
\ ------ D 8 S 2 5 9
\ | ------ D 8 S 2 5 5
'------ D 8 S 5 3 8

Fig. 17-8. Posibles genes supresores de tumor en el cromosoma 8p.

La rejilla muestra resultados de la tipificación de DNA constitucional y tumoral de una serie de pacientes con tumores bucales, utilizando varios
marcadores (D8S264, etc.) de las localizaciones indicadas en el cromosoma 8p (Wu y cois., 1997). El color rosa indica pérdida de heterocigosidad
(LoH); las marcas verdes, retención; las amarillas, pruebas que proporcionaron resultado equívocos; las grises, pruebas que muestran inestabilidad
microsatélite, y las áreas blancas indican cuando los marcadores no fueron informativos por homocigosidad constitucional. Obsérvese el patrón
complejo de LoH en estos tumores, que es típico de estos estudios. Los datos sugieren la presencia de tres genes ST distintos en 8p.

17.4.2 La selección de pérdida de heterocigosidad
(LoH) se utiliza con amplitud para intentar
identificar las localizaciones de genes
supresores de tumor (ST)
Cavenee y colaboradores (1983) observaron cómo los cambios ge­
néticos somáticos en el retinoblastoma causaban LoH en marcado­
res cercanos al locus RB. Estudios en otros cánceres confirman el
cuadro general, aunque los mecanismos cromosómicos pueden ser
diferentes (Thiagalingam y cois., 2001). Por tanto si se seleccionan
muestras pareadas de sangre y tumor (por lo general tumores es­
porádicos) con marcadores espaciados a través del genoma se tie­
ne la esperanza de descubrir las localizaciones de genes ST (fig.
17-7).
La prueba de LoH ha sido una labor mayor en la investigación del
cáncer durante el último decenio, pero aún se está muy lejos de pre­
guntar si los resultados justifican el esfuerzo. Para obtener resultados
significativos es necesario seleccionar un panel grande de tumores con
marcadores espaciados en forma cercana. Se emplean marcadores mi-
crosatélite muy polimórficos para minimizar el número de casos no
informativos en los que el DNA constitucional es homocigoto para el
marcador o de otro modo puede usarse el arreglo-HGC (fig. 17-3B).
Puesto que las células de cáncer avanzado pueden mostrar LoH en
tanto como una cuarta parte de todos los locus, se requieren muestras
grandes para separar los cambios específicos del fondo general. Los re­
sultados sugieren la presencia de un número muy grande de genes ST
-la figura 17-8 muestra un ejemplo típico- y a pesar de los intentos
para seguir estos estudios mediante clonación posicional se obtiene
una tasa de éxitos baja.
C ontam in ació n Células LoH
dei e stro m a tumorales aparente
\|»TSG1
TSG
\|/TSG2
Fig. 17-9. Una posible trampa en la interpretación de datos de LoH.
El acontecimiento verdadero en este tum or es la deleción homocigota
de TSG. A causa de la amplificación de material estromático
contaminante (líneas pálidas), los datos de LoH muestran retención de
heterocigosidad en el locus TSG, con LoH en dos regiones de flanqueo
(rosa). El patrón sugiere la existencia de dos locus supresores de
tum or falsos, ’PTSGI y 'PTSG2. La situación verdadera se revelaría
mediante hibridación de fluorescencia in situ o con una prueba
¡nmunohistoquímica para el producto del gen TSG.
17.5 I ESTABILIDAD DEL GENOMA ; 499
La figura 17-9 ilustra un error en la interpretación de los datos de
pérdida de heterocigosidad (LoH). Un problema general adicional es
que los tumores suelen tener cariotipos muy anormales con innume­
rables anomalías numéricas y estructurales (fig. 17-10). Casi nunca
se cuenta con información de los cariotipos de los tumores que se uti­
liza en estudios de LoH, pero la presentación de los resultados como
en la figura 17-8 conduce con facilidad a una suposición no preten­
dida de deleciones intersticiales específicas que afectan un cromoso­
ma por otra parte normal. De hecho la LoH es un producto de la
inestabilidad cromosómica y la reparación deficiente de roturas de
DNA de doble cadena que son tan características de células tumora-
les. Es posible que algunas de las pérdidas observadas sean productos
accesorios de patrones específicos de inestabilidad cromosómica, más
que selección para la pérdida de un gen ST.
17.4.3 Con frecuencia los genes supresores de tumor
son silenciados epigenéticamente por metilación
Los genes ST pueden silenciarse por deleción (que se refleja por la
pérdida de heterocigosidad) o mutaciones de punto, pero un tercer
mecanismo muy frecuente es la metilación del promotor (véase sec­
ción 10.4). De manera global el DNA de la célula tumoral es hipo-
metilado en comparación con el DNA de células normales, pero
casi en cada tipo de neoplasia humana se encuentra metilación de
dinucleótidos CpG específicos en los promotores de genes y se re­
laciona con silenciamiento transcripcional inapropiado del gen. Jo­
nes y Baylin (2002) listan muchos ejemplos. En algunos genes ST
la metilación ocurre como una alternativa frecuente a la mutación
de punto, en tanto que en otros (por ejemplo, RASSFlA en 3p21,
HIC1 en 17pl3.3) la metilación es el único mecanismo conocido
para la pérdida de función específica de tumor. Las técnicas están­
dar para selección de mutaciones pasan por alto estos cambios, de
manera que es probable que su importancia aún se subestime.
1 7 .5 Estabilidad del genom a
La inestabilidad del genoma es una característica casi universal de
las células cancerosas. La inestabilidad puede ser de dos tipos:
► inestabilidad cromosómica (INC), la forma más usual. Por lo
general las células tumorales tienen cariotipos notablemente
anormales (fig. 17-10), con múltiples cromosomas extra y fal-
tantes, muchos reordenamientos, etc.;
► inestabilidad microsatélite (MIN), una inestabilidad a nivel
del DNA que se observa en unos cuantos tumores, en especial
algunos carcinomas de colon (fig. 17-7B).
Es probable que la inestabilidad sea necesaria para permitir que una
célula acumule suficientes mutaciones (recuadro 17-1). Algunos au­
tores argumentan que la inestabilidad es sólo un producto accesorio
incidental de la evolución de un tumor y que el número de divisio­
nes celulares en poblaciones epiteliales es suficiente para que se acu­
mule el número necesario de mutaciones, inclusive con tasas estándar
de mutación. Sin embargo, los tumores suelen mostrar INC o INM,
pero no ambas, y esto sugiere que la inestabilidad no es una caracte­
rística al azar, sino un resultado de selección.
17.5.1 Inestabilidad cromosómica
Las múltiples anormalidades cromosómicas que se observan en cé­
lulas tumorales son sobre todo aleatorias, aunque proporcionan
500 CAPITULO DIECISIETE GENETICA DEL CANCER
I I
14 15
Fig. 17-10. Cariotipo multicolor con FISH (M-FISH) de una línea de células derivadas de leucemia mieloide humana.
Obsérvense las numerosas anormalidades numéricas y estructurales (puntas de flecha) reveladas por el pintado cromosómico completo de 24 colores.
Éstas incluyen t(5;15), der(7)t(7;15), der(8)ins(8;11), der(11)t(8;11), t(1 1 ;17) y der(Y)t(Y;12) -la última se muestra mal en esta célula. Imagen cortesía
del doctor Lyndal Karney, Institute of Molecular Medicine, Oxford, UK, de Tosi y colaboradores, © 1999, reimpreso con autorización de Wlley-Liss Inc.,
una subsidiaria de John Wiley & Sons, Inc.
material para una selección más amplia de variantes de crecimien­
to más rápido. Pueden surgir en tres formas.
► Las células tumorales pierden el punto d e control d el huso (Jalle-
palli y Lengauer, 2001; véase más adelante). Es probable que lo
anterior sea el principal origen de muchas anormalidades nu­
méricas.
► Las células tumorales son capaces de proseguir a través del ci­
clo celular a pesar de tener un DNA dañado. Las anormalida­
des cromosómicas estructurales pueden ser un producto
accesorio de intentos de replicación del DNA o de mitosis con
DNA dañado.
► Los tumores también pueden replicarse hasta el punto en que
los telómeros son muy cortos para proteger los extremos de los
cromosomas, lo que conduce a cierta clase de anormalidades
estructurales (véase más adelante).
Punto de control del huso
El punto de control del huso debe prevenir la segregación cromo-
sómica en la mitosis hasta que todos los cromosomas están unidos
de manera correcta a las fibras del huso. El mecanismo molecular
no se comprende bien. Aunque se identifican unos cuantos genes
candidato, se sabe que lo único que suele estar mutado en las célu­
las cancerosas es el gen APCque participa en la poliposis del colon.
El APC codifica una proteína multifamiliar muy grande que tal
vez participe en una diversidad de procesos celulares. En el colon se
observa INC aun adenomas muy tempranos, y las células APC~~
tienen husos mitóticos anormales que conducen a inestabilidad cro-
mosómica.
i
16 17 18
Sistema de señalamiento de daño del DNA
Las células reparan en forma constante todas las clases de daño de
su DNA. La respuesta normal a dicho daño es la detención del ci­
clo celular en tanto el daño se repara y una característica que mu­
chos cánceres comparten es la pérdida de dicho control. Los
sistemas complejos asombrosos que detectan y señalan el daño del
DNA se conservan en gran parte desde la levadura hasta el hombre
(Zhou y Elledge, 2000). Participa una maquinaria multiproteínica
llamada BASC (BRCA1, del inglés associated genom e surveillance
complex: complejo relacionado de vigilancia del genoma) aunada a
un grupo de otras proteínas. Varios genes supresores de tumor bien
conocidos ponen en funcionamiento esta maquinaria:
► ATM es un componente de BASC y se encuentra en una parte
temprana del mecanismo que detecta el daño. Esta proteína muy
grande releva la señal a una diversidad de blancos corriente aba­
jo. La pérdida de la fondón de ATM causa ataxia telangiectasia
(AT, MIM 208 900). Los homocigotos afectados sufren una pre­
disposición a varios cánceres, inmunodeficiencia, inestabilidad
cromosómica y ataxia cerebelosa. Los portadores heterocigotos
de ciertas mutaciones ATM específicas tienen mayor riesgo de
cáncer de mama;
► complejos nibrina con proteínas MRE11 y RAD50. Los com­
plejos forman parte de BASC y tal vez desempeñan también
otras funciones. La falta de nibrina ocasiona el síndrome de ro­
tura de Nijmegen (MIM 251 260). Esta afección se asemeja
mucho a la AT desde el punto de vista clínico, pero incluye mi-
crocefalia y retraso del crecimiento en lugar de ataxia. La clo­
nación del gen NBS se describe en la sección 13.5.2;

► BRCA1, el producto del primer gen que se implica en el cán­
cer de mama familiar (sección 15.6.1), es otra proteína muy
grande con múltiples dominios funcionales que forma parte de
BASC. La proteina BRCA1 también funciona en la recombi­
nación, la remodelación de cromatina y el control de la trans­
cripción (Scully y Livingston, 2000).
► BRCA2 es una proteína que no tiene similitud con BRCA1 pe­
ro comparte muchas funciones. Además de ser la causa de al­
gunos cánceres de mama hereditarios, una clase particular de
mutaciones de BRCA2 ocasiona la forma B/D1 de la anemia de
Fanconi (véase MIM 227 650), un síndrome autosómico rece­
sivo de anormalidades congénitas, insuficiencia progresiva de la
médula ósea, hipersensibilidad celular al daño del DNA y pre­
disposición a cáncer.
Al parecer las células con defectos en estas proteínas son en parti­
cular deficientes para reparar roturas de cadena doble. Es posible
que otros tipos de daño no confíen tan intensamente en la detec­
ción mediante ese sistema para su reparación.
Telómeros y estabilidad cromosomica
Como se comenta en la sección 2.2.5, los extremos de los cromo­
somas humanos están protegidos por una secuencia repetida
(TTAGGG)n, que se conserva por un sistema enzimàtico especial
que contiene RNA, la telomerasa. La telomerasa se encuentra en la
línea germinal humana pero no en la mayor parte de los tejidos so­
máticos y la longitud del telómero declina 50 a 100 pb con cada
generación celular. En cultivo prolongado, las células normales lle­
gan a un punto de envejecim iento en el que dejan de dividirse. Los
fibroblastos deficientes en p53 y la proteina del retinoblastoma
pRb, o que alojan oncoproteínas virales, continúan más allá del en­
vejecimiento y producen crisis. Casi todas las células mueren, pero
las únicas con IO7 o casi que sobreviven muestran anormalidades
cromosómicas mutables, adquirieron telomerasa y se tomaron in­
mortales. Tal vez la crisis represente el punto en que los telómeros
son tan cortos que ya no pueden proteger los extremos cromosómi-
cos contra el reordenamiento.
Por tanto una causa de las anormalidades cromosómicas nota­
bles que se observan en células tumorales puede ser el agotamiento
de telómeros hasta el punto de crisis a través de divisiones celulares
excesivas (Maser y DePinho, 2002). Sin embargo, ello no explica la
inestabilidad constante porque, de una manera u otra, las células
tumorales siempre adquieren la capacidad para conservar sus teló­
meros y replicarse de manera indefinida. Ochenta y cinco a 90%
de los cánceres metastásicos plenamente manifiestos tiene un por­
centaje mayor de telomerasa; el resto utiliza un mecanismo distin­
to. denominado ALT y basado en recombinación.
17.5.2 Reparación de defectos del DNA e inestabilidad
a nivel del DNA
Como se comentó, las células reparan en forma constante el daño
Je su DNA (Hoeijmakers, 2001) y los defectos en la maquinaria de
'r í’aración subyacen a una diversidad de trastornos genéticos con
propensión a cáncer. Los principales defectos son:
► defectos en la reparación de excisión de nucleótidos: las rotu­
ras de cadena única y los enlaces cruzados en el DNA que se
dañaron por radiación ionizante, luz UV o mutágenos quími­
cos deben repararse antes de la siguiente ronda de replicación
17.5 | ESTABILIDAD DEL GENOMA 501
(sección 11.6.1). Se observan defectos en algunas de las en­
zimas de reparación en varios síndromes con propensión a
cáncer, en particular las diversas formas de xerodermia pig­
mentosa (XP; véase MIM 278 700). Los pacientes con XP
son homocigotos para la pérdida hereditaria de mutaciones
funcionales y no son capaces de reparar el daño del DNA
causado por la luz UV. Son en extremo sensibles a la luz so­
lar y desarrollan muchos tumores en la piel expuesta;
► defectos en la reparación de excisión de bases: la reparación de­
fectuosa de la excisión de una base rara vez se observa en cán­
ceres humanos, pero una forma de cáncer de colon se debe a
defectos en la enzima de reparación MYH (Al-Tassan y col.,
2002 );
► defectos en la reparación de roturas de cadena doble: las rotu­
ras de cadena doble se reparan mediante recombinación homo­
loga o unión no homologa de extremos (Hoeijmakers, 2001).
Ambos requieren la maquinaria ATM-NBS-BRCA1-BRCA2
mencionada;
► defectos en la reparación de errores de replicación: se detecta­
ron durante estudios de cáncer de colon, como se describe más
adelante.
17.5.3 Cáncer de colon no polipósico hereditario e
inestabilidad microsatélite
Casi todo el cáncer de colon es esporádico. Los casos familiares co­
rresponden a dos categorías:
► La poliposis adenomatosa familiar (PAF o PAC; MIM 175
100) es un padecimiento autosómico dominante en el que el
colon se cubre con cientos o miles de pólipos. Estos últimos
(adenomas) no son malignos, pero si no se extirpan es casi se­
guro que uno o más de ellos evolucione a carcinoma invasivo.
La causa es una mutación hereditaria en el gen supresor de tu­
mor (APQ (cuadro 17-4).
► El cáncer de colon no polipósico hereditario (CCNPH)
(HNPCC; MIM 120 435, 120 436) también es autosómico
dominante y de alta penetrancia; no obstante, a diferencia de
la FAP, no existe una fase precedente de poliposis. Los genes del
CCNPH se mapearon en dos localizaciones, 2pl5-p22 y
3p21.3.
Estudios de pérdida de heterocigosidad en tumores de CCNPH
arrojaron resultados novedosos e inesperados. En lugar de carecer
de los alelos que se encuentran en el DNA constitucional, los espe­
címenes de tumor al parecer contenían alelos extra, nuevos, de los
marcadores microsatélite utilizados. La figura 17-7B muestra un
ejemplo. La LoH es una propiedad de regiones cromosómicas par­
ticulares, pero la inestabilidad microsatélite (MIN) en CCNPH es
general. Aunque muchos tumores muestran inestabilidad ocasional
de uno o unos cuantos microsatélite (véase, por ejemplo, fig. 17-8),
la inestabilidad de alta frecuencia (definida de manera conveniente
como > 29% de todos los marcadores estudiados, véase Tomlinson
y cois., 2002) define una clase de tumores MIN+con características
clinicopatológicas precisas.
En un ejemplo maravilloso de pensamiento lateral Fishel y cola­
boradores (1993) relacionaron el fenómeno de MIN+con los llama­
dos genes mutadores en K coli y levaduras. Estos genes codifican un
sistema de corrección de errores que controla el DNA recién sinteti­
zado para pares de bases incompatibles o asas pequeñas de inserción-
502 ¡ CAPÍTULO DIECISIETE | GENÉTICA DEL CÁNCER

Cuadro 17-5. Genes relacionados con la reparación del

error de replicación del DNA.
E. co li Humanos Localización % de CCNPH
en el hombre

MutS MSH2 2p16 35%

MSH3 5q11-q12 ¿0%?

MSH6 2p16 5%a

MutL MLH1 3p21.3 60%

MLH3 14q24.3 ¿0%?

PMS2 7p22 Muy baja

aCCNPH atípico de inicio tardío y cáncer endometrial.
Véase Jiricny y IMystrom-Lahti (2000) para detalles.
deleción. Las mutaciones en los genes MutHLS que codifican el sis­
tema de E. coli conducen a un incremento general de 100 a 1 0 0 0 ve­
ces en las tasas de mutación. Fishel y colaboradores clonaron un
C a d e n a recién sin te tiza d a
Fig. 17-12. Genealogía atípica del síndrome de Li-Fraumeni.
Las afecciones malignas típicas del síndrome de Li-Fraumeni incluyen
cáncer de mama bilateral diagnosticado a los 40 años de edad (I-2);
tum or cerebral a los 35 años de edad (11-1); sarcoma de tejido blando
a los 19 años de edad y cáncer de mama a los 33 años (II-3); cáncer
de mama a los 32 años edad (II-5); osteosarcoma a los ocho años de
edad (III-3); leucemia a los dos años de edad (III-4); sarcoma de tejido
blando a los tres años de edad (III-5). 1-1 tuvo cáncer de colon
diagnosticado a los 59 años de edad -s e asume que éste no se relaciona
con el síndrome de Li-Fraumeni-, Genealogía de Malkin (1994).

homólogo humano de uno de estos genes, MutS, y demostraron que

hM utS a (MSH2 + MSH6) se mapea en la localización 2p de uno de los genes de CCNPH y que
estaba mutado constitucionalmente en algunas familias con
CCNPH. En todas se implicaron seis homólogos de los genes de E.
coli en la reparación incompatible humana (Jiricny y Nystrom-Lah­
ti, 2000); véase cuadro 17-5 y figura 17-11.
o c o o o c Los pacientes con CCNPH son constitucionalmente heterocigo-
tos para una mutación de pérdida de función, casi siempre en
MLH1 o MSH2. Sus células normales aún tienen un sistema de re­
Movimiento hM utL a (MLH1 + PM S2) paración funcional incompatible y no muestran el fenotipo MIN+.
impulsado por ATP En un tumor, la segunda copia se pierde por uno de los mecanismos
que se muestran en la figura 17-6. Se observa inestabilidad microsa-
télite en 10 a 15% de los carcinomas colorrectales, endometriales y
del ovario, pero rara vez en otros tumores.

17.5.4 p53 y apoptosis

r
(1) R eg reso E x o n u clea sa
(2) R esin te sis P o lim erasa
F a c to re s d e replicación
Fig. 17-11. Mecanismo de reparación incompatible.
Los errores de replicación pueden producir pares de bases incompatibles
o pequeñas asas de inserción/deleción. Son reconocidas por hMutSa,
un dímero de las proteínas MSH2/MSH6, o en ocasiones por el dímero
MSH2/MSH3 hMutSp. Las proteínas se translocan a lo largo del DNA,
o enlazan el dímero MLH1/PMS2 hM utLa, a continuación ensamblan el
“ reparosoma” completo que retrocede y sintetiza de nuevo la cadena
recién sintetizada. Véase Jiricny y Nystrom-Lahti (2000).
Un contribuyente mayor a la inestabilidad del genoma es la pérdi­
da o la mutación de TP53, el gen que codifica el factor de trans­
cripción p53. Es probable que esta pérdida sea el cambio genético
aislado más frecuente en el cáncer. Esto refleja la importancia cen­
tral de p53, que se resumió como el “guardián del genoma” (Vous-
den, 2000). Como ya se señaló, el ciclo celular se detiene en células
con DNA dañado. Si el daño no es reparable se desencadena apop­
tosis. El p53 desempeña una función crucial en estos procesos. En
condiciones normales los valores de p53 en un célula son bajos por­
que la proteína se degrada con rapidez. Las señales de una gama
completa de sensores celulares de estrés, inclusive los sensores de
daño, conducen a la fosforilación y la estabilización de p53. Ello in­
crementa la transcripción dependiente de p53 de genes, como
p 2 jW A f i/ c i r i inhibe el ciclo celular, y PUMA y PIG3 que con­
trolan la apoptosis. Las células tumorales que carecen de p53 pue­
den continuar replicando DNA dañado y no sufren apoptosis. Sin
 17.6 I CONTROL DEL CICLO CELULAR | 503

embargo, cabe señalar que la pérdida de p53 es un acontecimiento

hasta cierto punto tardío en el desarrollo tumoral (véase por ejem­
plo, la fig. 17-17); es evidente que las etapas más tempranas de la
evolución del tumor no se previenen mediante p53.
Es posible eliminar (knocked out) p53 mediante deleción, muta­
ción o por la acción de un inhibidor como el producto génico
MDM2 (que enlaza p53 y lo marca para su degradación; MDM2
también enlaza pRb, véase más adelante) o la proteína E6 del papi-
lomavirus. TP53 se mapea en 17pl2 y es una de las regiones más
frecuentes de pérdida de heterocigosidad en una gama amplia de tu­
mores. Con gran frecuencia las neoplasias que no pierden TP53 tie­
nen versiones mutadas del mismo. A fin de completar el cuadro de
TP53 como un gen supresor de tumor (ST) se encuentran mutacio­
nes constitucionales en TP53 en familias con el síndrome de Li-
Fraumeni que se hereda en forma dominante (MIM 151 623). Los
miembros de la familia afectados sufren múltiples tumores prima­
rios, que suelen comprender sarcomas de tejido blando, osteosarco-
mas, tumores de mama, cerebro y corteza suprarrenal, y leucemia
(fig. 17-12)
Fig. 17-14. Puntos de control del ciclo celular.

Una serie de controles impide que la célula pase a la fase S o mitosis

17.6 Control del ciclo celu lar
Toda célula tiene tres conductas para elegir en cualquier época: per­
manecer estática, dividirse o morir (apoptosis). Algunas también
tienen la opción de diferenciarse. Las células eligen una de estas op­
ciones en respuesta a señales internas y externas (fig. 17-3A). Los
oncogenes y los genes supresores de tumor desempeñan funciones
fundamentales en la generación y la interpretación de estas señales.
A)
E sta sis
D iferenciación
M itosis
A p o p to sis
B)
S e ñ a le s R e s p u e s ta s
R e s p u e s ta s
Fig. 17-13. Opciones que tiene una célula y forma en que las elige.
A) En respuesta a señales Internas y externas, una célula elige entre
estasis, mitosis, apoptosis y en ocasiones diferenciación. B) Una célula
Imaginaria en la que las señales se enlazan a respuestas mediante
vías lineales no ramificadas de estimulación (-») o inhibición ( h ). Las
células humanas no funcionan como ésta. C) En las células reales las
señales avanzan hacia una red compleja de interacciones parcialmente
redundantes, cuyo resultado final no es fácil predecir por medios
analíticos.
con DNA dañado no reparado, o inicie la anafase de la mitosis hasta
que todos los cromosomas están unidos de modo correcto a las fibras
del huso. Es probable que haya un punto de control de daño del DNA
adicional durante la fase S.
Aunque la vida sería muy simple si la señal y la respuesta se unie­
ran por una vía lineal única (fig. 17-13B), al parecer nunca sucede
así. En lugar de ello la conducta de la célula está controlada por ra­
mificación múltiple, superposición y vías parcialmente redundantes
(fig. 17-13C). Es probable que estas redes complicadas sean necesa­
rias para conferir estabilidad y resistencia a la maquinaria en extre­
mo compleja de una célula. Desde el punto de vista experimental es
muy difícil descubrir el circuito genético preciso de los controles, en
parte por su complejidad y además porque en experimentos de
transfección o knockoutts difícil distinguir los efectos directos de los
indirectos. Se espera que la expresión de microarreglos proporcione
la clave de este problema.
Para células como las cancerosas que deciden dividirse, el pro­
greso a través del ciclo está sujeto a varios puntos de control (fig.
17-14). Los tres principales son:
► el punto de control G1-S: la replicación de DNA se bloquea en
presencia de un daño no reparado del DNA; el daño irrepara­
ble conduce a apoptosis. Tal vez hay un punto de control de
daño adicional independiente dentro de la fase S;
► el punto de control G2-M: el ingreso de las células a la mitosis
se bloquea a menos que la replicación del DNA y la reparación
de cualquier daño estén completas;
► punto de control del huso: se describe en la sección 17.5.1.
17.6.1 Punto de control G1-S
La figura 17-15 muestra parte del circuito de este punto de control.
Se piensa que es particularmente crítico porque está inactivado en
la mayor parte de las células tumorales. Tres genes supresores de tu­
mor fundamentales, RB, TP53 y CDKN2A, son elementos centra­
les en la carcinogénesis y unos de los genes que se alteran con más
frecuencia en células tumorales. Cada uno desempeña una función
504 CAPÍTULO DIECISIETE ¡ GENÉTICA DEL CÁNCER
p16INK4A
■►S
Fig. 17-15. Controles en la progresión del ciclo celular e integridad genómica mediada por los productos génicos fifi, TP53 y CDKN2A (INK4A).
Estos controles forman cuando menos parte del punto de control del ciclo celular G1 -S. Véase Harbour y Dean (2000) para detalles.
en cánceres hereditarios. De hecho es probable que todas las célu­
las tumorales deban inactivar tanto los brazos Rb como p53 del sis­
tema a fin de que las células deriven los controles usuales del ciclo
y eviten estimular apoptosis en respuesta al daño de DNA no repa­
rado o el señalamiento de crecimiento excesivo.
Función de pRb, el producto génico RB
El gen RB se identificó por su participación en el retinoblastoma
(sección 17.4.1), pero se expresa en forma amplia y ayuda a contro­
lar el ciclo de todas las células. En las células normales el producto
génico, una proteína nuclear de 110 kDa, se inactiva por fosforila­
ción y se activa por desfosforilación. El pRb activo (desfosforilado)
enlaza e inactiva el factor E2F de transcripción celular, cuya fun­
ción se requiere para la progresión del ciclo celular (fig. 17-15; pa­
ra mayores detalles véase Harbour y Dean, 2000). Dos a cuatro
horas antes que la célula entre en la fase S, pRb se fosforila. Esto li­
bera la inhibición de E2F y permite que la célula proceda a la fase
S. La fosforilación está regida por una cascada de ciclinas, cinasas
dependientes de ciclinas e inhibidores de la cinasa de ciclina. Varias
oncoproteínas virales (adenovirus E1A, antígeno SV40-T y proteí­
na E7 de papilomavirus humano) se unen y secuestran o degradan
pRb, lo que favorece la progresión del ciclo celular.
Función de p16INK4A y p14ARF, los productos del gen
CDKN2A
El gen notable CDKN2A (antes llamado MTS1 o INK4A) en 9pl3
codifica dos proteínas no relacionadas en términos estructurales (fig.
17-16). Los exones la , 2 y 3 codifican la proteína INK4A o pl6.
Un segundo promotor inicia la transcripción más corriente arriba en
el exón 1(3. El exón 113 se empalma en los exones 2 y 3, pero el mar­
co de lectura se cambia, de manera que una proteína p l4 o ARF (del
inglés Alternative Reading Frame, marco de lectura alternativo) no re­
lacionada en lo absoluto se codifica (el homólogo del ratón es pl9).
Respuesta al
daño del DNA
D año irreparable:
desencadena apoptosis
D año rep arab le:
pausa para reparación
Ambos productos génicos funcionan en el control del ciclo ce­
lular (fig. 17-15). p 16 actúa corriente arriba de la proteína RB pa­
ra regular el punto de control del ciclo celular Gl-S. Las cinasas
dependientes de ciclina inactivan pRb mediante fosforilación, pero
p l6 inhibe la cinasa CDK4/6. Por consiguiente la pérdida de fun­
ción de p 16 conduce a la pérdida de función de RB y a un ciclo ce­
lular inapropiado. El otro producto del gen CDKN2A, p 14, media
la detención de G1 al desestabilizar la proteína MDM2, el produc­
to del oncogén MDM2 que está amplificado en muchos sarcomas
(Pomeranz y cois., 1998). La MDM2 enlaza p53 e induce su degra­
dación. En consecuencia p l4 actúa para conservar el nivel de p53.
La pérdida de función de p l4 conduce a valores muy altos de
MDM2, destrucción excesiva de p53 y por tanto pérdida de con­
trol del ciclo celular.
Aunque algunas familias con melanoma múltiple muestran mu­
taciones hereditarias de CDKN2A, que suelen afectar sólo p l6, son
mucho más frecuentes las mutaciones somáticas. La deleción ho-
mocigota del gen inactiva tanto los brazos RB como p53 del con­
trol del ciclo celular y éste es un acontecimiento muy usual en la
tumorigénesis. Algunos tumores tienen mutaciones que afectan
p l6 pero no p l4 (p. ej., inactivación del promotor l a por metila-
ción). Esos tumores también tienden a poseer mutaciones de p53,
lo que demuestra la importancia de inactivar ambos brazos del sis­
tema de control como se muestra en la figura 17-15.
17.7 In tegración de los datos: vías
y capacidades
Como se comentó al inicio de este capítulo, la genética del cáncer
puede ser muy confusa. Demasiados genes, muchas mutaciones,
una infinidad de combinaciones... cada tumor es único. Pero lo que
todos comparten es que cada neoplasia es el producto de la selección
para un grupo específico de capacidades definibles y que, cuando se
piensa en términos de vías en lugar de genes individuales, sólo hay
 17.7 INTEGRACIÓN DE LOS DATOS: VÍAS Y CAPACIDADES 505

Transcrito Transcrito cm y con focos de carcinoma), para transformarse en carcino­

p14arf p16INK4A
-*■
U)
o>
1 a
9 1ß
psüs Secuencia de Secuencia de
codificación p16 codificación p14 ^
Fig. 17-16. Los dos productos del gen CDKN2A.
El gen (que también se conoce como MTS e INK4A) codifica dos
proteínas no relacionadas por completo. p16INK4A se transcribe de
exones 1a, 2 y 3, y p14ARF de exones 1 p, 2 y 3 -pe ro con un marco
de lectura diferente de los exones 2 y 3 -, Los dos productos génicos
son activos en los brazos RB y p53 del control del ciclo celular
respectivamente, como se muestra en la figura 17-15.
un número limitado de formas para nombrar estas capacidades. Hahn
y Weinberg (2002) intentaron listar todas estas vías y dibujaron un
“mapa de ruta” del cáncer.
17.7.1 Vías en el cáncer colorrectal
El conocimiento de la evolución tumoral se desarrolló mejor en
cánceres colorrectales, porque es posible estudiar todas las etapas
del desarrollo del tumor en el colon resecado de pacientes con po-
liposis adenomatosa familiar. La figura 17-17 muestra estos pasos.
Es posible elaborar esquemas similares pero más rudimentarios pa­
ra otros tumores en los que los datos no son tan abundantes. El es­
quema se basa en una serie de observaciones:
► los carcinomas malignos se desarrollan de epitelio normal del
colon a través de focos crípticos aberrantes microscópicos hasta
crecimientos epiteliales benignos llamados adenomas. Estos úl­
timos pasan por las etapas temprana (< 1 cm de tamaño), in­
termedia (> 1 cm pero sin focos de carcinoma) y tardía (> 1
mas, que por último dan metástasis-,
► en la PAF, una copia de APC en 5q21 está mutada constitucio­
nalmente. Como hecho interesante, las mutaciones hereditarias
rara vez sólo inactivan la proteína APC, por lo general producen
una proteína truncada que ejerce una acción negativa dominan­
te (véase sección 16.4.3). Es evidente que la inactivación simple
de un alelo APC no daría la ventaja de crecimiento necesaria.
Las lesiones detectables más tempranas, los focos crípticos abe­
No traducido
rrantes, carecen por completo de de expresión APC. Alrededor
de una célula epitelial en 10S evoluciona a un pólipo, una tasa
compatible con el acontecimiento determinante de pérdida del
segundo alelo APC,
► alrededor de 50% de los adenomas intermedios y tardíos, pero
sólo cerca de 10% de los tempranos, tiene mutaciones en el on­
cogen KRAS (un relacionado de HRAS, cuadro 17-1). Por con­
siguiente es posible que a menudo se requieran mutaciones de
KRAS para la progresión de adenomas tempranos a interme­
dios;
► alrededor de 50% de los adenomas y carcinomas tardíos mues­
tra pérdida de heterocigosidad 18q. Este hecho es más o menos
raro en adenomas tempranos e intermedios. Parece probable
que el gen importante sea SMAD4 (que también se conoce co­
mo MADH4) en lugar del candidato inicial, DCC (véase Whi-
te, 1998);
► los cánceres colorrectales, pero no los adenomas, muestran una
frecuencia muy alta de pérdida o mutaciones de TP53.
El esquema de la figura 17-17 pretende mostrar la serie más usual
de mutaciones, pero no todos los cánceres de colon siguen esta vía.
Sólo cerca de 60% de estos cánceres tiene mutaciones de APC. Sin
embargo, los tumores que carecen de mutaciones APC suelen te­
ner mutaciones activantes en la catenina |3, el principal blanco
de la acción de APC corriente abajo (Fodde y cois., 2001). Más
adelante en la progresión, los tumores de la PAF tienden a perder
el cromosoma 18q, pero los del CCNPH son cromosómicamente
estables y no pierden 18q. En ambos casos quizás la presión selec­
tiva sea la pérdida del señalamiento beta inhibidor del crecimien­
to por el factor de transformación del crecimiento (TGF). En la

Pérdida o m utación H ip o m e tila c ió n A c tiv a c ió n de Pérdida o m u tació n P é rd id a o m u ta c ió n

de APC en el gen de ST de DNA oncogen KRAS del gen ST en 18q d e TP53 en el ge n d e ST
(5q) (12p) (¿SMAD4?) (17 p)

E p ite lio E p ite lio _ A denom a A denom a , A denom a . C a rc in o m a

n o rm a l h ip e rp ro life ra tiv o te m pra no interm edio tardío

Fig. 17-17. Un modelo para el desarrollo del cáncer de colon en múltiples pasos.
Véase el texto para mayores detalles. Éste es sobre todo un medio para pensar respecto a la form a en que se desarrollan los tumores, más que una
descripción firm e. Es probable que cada cáncer colorrectal se haya desarrollado a través de las mismas etapas histológicas, pero los cambios
genéticos subyacentes son más variados. Según Fearon y Vogelstein (1990), la figura ilustra una secuencia de acontecimientos en particular frecuente.
Smith y colaboradores (2002) dudaron de la validez de este modelo porque, en su serie de 106 tumores, sólo siete tuvieron mutaciones en los tres,
APC, KRAS y p53.
506 CAPÍTULO DIECISIETE GENÉTICA DEL CÁNCER
PAF esto ocurre por pérdida del efector corriente abajo SMAD4
localizado en 18q. En el CCNPH, 90% de los tumores MIN+ tie­
ne mutaciones de cambio de marco en una carrera (A)8 en el gen
del receptor II de TGFji. A menudo los tumores del CCNPH tie­
nen mutaciones de cambio de marco en el gen AXIN2, que codi­
fica otro componente de la vía APC-fi-catenina. Por tanto detrás
de la heterogeneidad de acontecimientos moleculares, hay un cua­
dro mucho más regular de vías que deben inactivarse para que un
tumor se desarrolle.
17.7.2 Un tumor con éxito debe adquirir seis
capacidades específicas
Una revisión importante y muy recomendable de Hanahan y
Weinberg (2002) (véanse Lecturas adicionales) sugiere otra forma
de concebir la evolución de un tumor. Los autores sugieren que los
factores fundamentales en la transición de una célula normal a una
célula cancerosa maligna son la adquisición de seis capacidades es­
pecíficas. La célula debe tornarse:
► independiente de señales externas de crecimiento;
► insensible a señales externas anticrecimiento;
► capaz de evitar la apoptosis;
► apta para la replicación indefinida;
► hábil para la angiogénesis sostenida;
► capaz de invadir y dar metástasis tisulares.
Es posible que las metástasis no sean una capacidad seleccionada de
manera específica. La aptitud para dar metástasis no es claramente
ventajosa para ninguna célula y puede ser un efecto incidental del
desarreglo genómico general de células tumorales avanzadas. Las
otras cinco capacidades resultan de selección específica. Se sabe has­
ta cierto punto poco respecto a la angiogénesis, pero ya se comenta­
ron los sitios de oncogenes activados, la alteración del control del
ciclo celular, la mutación p53 y la reactivación de la telomerasa a fin
de obtener las cuatro primeras de estas capacidades. Cada aptitud
puede adquirirse por una diversidad de cambios genéticos distintos,
pero en cada caso la adquisición requiere ciertas vías específicas pa­
ra activarse o inactivarse. Las capacidades no siempre se adquieren
en el mismo orden en diferentes tumores, pero los requerimientos
para inestabilidad genómica y expansiones clónales sucesivas en eta­
pas intermedias (recuadro 17-1) imponen cierta regularidad en el
proceso.
La primera mutación de la evolución en múltiples pasos de
un tumor es crítica porque debe conferir cierta ventaja para el
crecimiento en una célula por otra parte normal que tiene intac­
tas todas sus defensas. Según la hipótesis d e l cela d or (Kinzler y
Vogelstein, 1996), en una población celular en renovación deter­
minada un gen particular tiene a su cargo la conservación de un
número constante de células. La mutación de un celador conduce
a un desequilibrio permanente entre la división y la muerte celu­
lares, en tanto que las mutaciones de otros genes no tienen efec­
to a largo término si el celador funciona de modo correcto. De
acuerdo con esta teoría, los genes supresores de tumor identifica­
dos en estudios de cánceres mendelianos son los celadores del te­
jido participante: NF2 para células de Schwann, VHL para
células renales, etc. En el caso de la APC tal vez sea importante
que esta proteína no sólo regula el valor de la catenina |3, un con­
trolador principal del crecimiento celular, sino que también pue­
de desempeñar una función fundamental en el punto de control
del huso (sección 17.5.1). Ya se señaló que aun en etapas muy tem­
pranas los adenomas muestran inestabilidad cromosómica. Es fac­
tible que una mutación aislada de APC (del tipo derecho) confiera
ya una ventaja para el crecimiento en el epitelio del colon, en tan­
to que la mutación de un gen aislado BRCA1/2 no proporciona
ventaja al epitelio ductal. Ello explicaría por qué la mutación APC
es tan frecuente en el cáncer de colon esporádico, pero las mutacio­
nes BRCA1/2 son raras en el cáncer de mama esporádico (Lamlum
y cois., 1999). Aún no se aclara con qué tanta frecuencia se ajustan
a la teoría del celador cánceres como los de próstata o pulmón, que
carecen de formas mendelianas.
17.8 ¿Para qué sirve todo este
conocim iento?
A la luz de las ideas expuestas en este capítulo resulta fácil observar
que es disparatado hablar de “una curación del cáncer”. Sin embar­
go, los nuevos conocimientos conducen ya a un progreso impor­
tante en tres áreas: detección, diagnóstico y tratamiento.
► La detección del cáncer presintomático suele basarse en exa­
men físico, estudios (mamografía, etc.), valoraciones bioquímicas
(antígeno específico de próstata) o métodos invasivos (colonos-
copia, etc.). Por razones que aún no aclaran por completo, los
tumores eliminan DNA. Métodos de PCR sensibles pueden
amplificar DNA tumoral de la orina (en el cáncer vesical), las
heces (en el cáncer de colon), la saliva o el esputo (en el cáncer
bucal o pulmonar) o de la sangre en una diversidad de cánceres
(Sidransky, 2002). Por fortuna los estudios de este DNA para
mutaciones en TP53, APC, etc., metilación de promotor espe­
cífica o inestabilidad microsatélite permitirán una detección
más eficaz y no invasiva.
► Como se mencionó al inicio de este capítulo, los métodos
histológicos tradicionales de identificación del tumor y la
asignación de la etapa se complementan cada vez más (pero
no se sustituyen) mediante métodos moleculares (Lakhani y
Ashworth, 2001). Lo anterior registra un mayor avance en
leucemias, en las que la definición de los reordenamientos
cromosómicos proporciona indicadores importantes de pro­
nóstico y tratamiento (véase, por ejemplo, Armstrong y cois.,
2002). Hasta fecha reciente la complejidad de los cambios
en tumores sólidos desafiaba un análisis sencillo, pero el per-
filamiento de la expresión empieza a proveer clasificaciones
útiles de subtipos, una vez más, con implicaciones para el
pronóstico y el tratamiento. La figura 17-18 muestra ejem­
plos de aplicaciones recientes de arreglos de expresión en el
cáncer.
► Los primeros tratamientos basados en el conocimiento de cam­
bios moleculares específicos ya se establecieron. El herceptín,
un anticuerpo monoclonal contra el receptor ErbB2 de cinasa
de tirosina, es una terapéutica eficaz en cánceres de mama que
presentan amplificaciones del gen ERBB2, pero no para los que
carecen de esta característica (De Bono y Rowinsky, 2002).
Gleevec (Imatinib, ST-1571) es un inhibidor específico de la
proteína de fusión BCR-ABL (fig. 17-4A) que logra resultados
notables en leucemia mieloide crónica (Savage y Antman, 2002).
Éstas son las primeras nuevas modalidades de fármacos antican­
cerosos diseñadas a partir del conocimiento de los acontecimien­
tos moleculares en tumores.
 17.8 i ¿PARA QUÉ SIRVE TODO ESTE CONOCIMIENTO? 507

Fig. 17-18. Ejemplos del uso de arreglos de expresión para caracterizar tumores.
A) Identificación del tejido de origen. Los patrones de expresión de 148 genes (hileras) clasifican 100 tumores (columnas) por origen. Pr, próstata; Bl,
vejiga/uréter; Br, mama; Co, colorrectal; Ga, gastroesofágico; Ki, riñón; Li, hígado; Ov, ovario; Pa, páncreas; LA, adenocarcinoma de pulmón; LS,
carcinoma de célula escamosa del pulmón. Rojo = presión génica aumentada, azul = expresión disminuida. Tomado de Su y colaboradores (2001).
Cáncer Research 61, 7388-7393, con autorización de The American Association for Cáncer Research. B) Distinción de dos tipos de linfoma de célula
B grande difuso. El agrupamiento de la expresión génica distingue tumores similares a centro germinal de tumores activados tipo B (barras de color
naranja y azul). La supervivencia a los cinco años en los dos grupos es de 76 y 16%, respectivamente. Reproducido de Alizadeh y colaboradores
(2000), con autorización de Nature Publishing Group. C) Sensibilidad a fármacos quimioterapéuticos. Los perfiles de expresión de 6 817 genes en
60 líneas de células tumorales se correlacionaron con la respuesta a 232 medicamentos. La figura muestra los patrones de expresión génica (hileras)
en 30 líneas celulares (columnas) que predicen sensibilidad o resistencia a un fármaco, la citocalasina D. Tomado de Staunton y colaboradores (2001),
con autorización de National Academy of Sciences, USA. D) Predicción del resultado clínico del cáncer de mama. Los patrones de expresión de
25 000 genes se calificaron en 98 cánceres de mama primarios. La figura muestra perfiles de 70 genes marcadores de pronóstico (columnas) en 78
cánceres (hileras). Todas los pacientes se sometieron a Intervención quirúrgica y radioterapia; las líneas amarillas dividen a los que se predijo (mediante
dos criterios alternativos) que requerían quimioterapia adicional (arriba de la linea) de los que no necesitaban este tratamiento desagradable. Datos
reproducidos de Van’t Veer y colaboradores (2002) con autorización de Nature Publishing Group.
508 CAPÍTULO DIECISIETE GENÉTICA DEL CÁNCER
Lecturas adicionales
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CAPÍTULO DIECIOCHO

Pruebas genéticas en individuos

y poblaciones

Contenido del capítulo

512 CAPÍTULO DIECIOCHO | PRUEBAS GENÉTICAS EN INDIVIDUOS Y POBLACIONES

18.1 Introducción
Los genetistas no tienen el monopolio del diagnóstico basado en
DNA. Por ejemplo, la PCR es una herramienta central de micro­
biólogos y biólogos para identificar patógenos. Hematólogos, on-
cólogos y otros histopatólogos utilizan pruebas de DNA como base
para establecer diagnósticos. Sin embargo, para los propósitos de
este capítulo, las pruebas genéticas se definen como pruebas para
factores mendelianos. Los factores pueden indicar el riesgo de una
persona de desarrollar o transmitir una enfermedad (mendeliana o
no), o emplearse con objeto de identificar a una persona e indicar
su relación con alguien más.
Siempre que sea posible los autores recurrirán a dos de las en­
fermedades mendelianas más frecuentes, fibrosis quística (FQ) y
distrofia muscular de Duchenne (DMD) con el fin de ilustrar los
diversos métodos de pruebas. Ambas incluyen genes grandes con
heterogeneidad alélica extensa, pero además la FQ y la DMD con­
llevan grupos de problemas diagnósticos de DNA bastante diferen­
tes (cuadro 18-1). Entre ellos, muestran muchos de los problemas
relacionados con las pruebas para enfermedades mendelianas. Co­
mo siempre, esta obra se concentrará en los principios y no en los
detalles prácticos. El lector interesado en procedimientos específi­
cos encontrará información respecto a la “mejor práctica” para el
diagnóstico de laboratorio de las enfermedades mendelianas más
usuales en http//:www.cmgs.org. Ésta se acordó en reuniones de
trabajo de consenso de la UK Clinical Molecular Genetics Society.
El libro de Elles y Mountford (véase Lecturas adicionales) describe
métodos de pruebas para una gama más amplia de padecimientos.
Cuando un clínico lleva una muestra de DNA de un paciente a
un laboratorio de pruebas diagnósticas, son tres las posibles pre­
guntas que el laboratorio podría intentar resolver:
► ¿El paciente tiene alguna mutación o algún gen que explicarían
su enfermedad? Esta pregunta es incontestable ahora y lo será
en el futuro. La prueba genética tiene que ser dirigida. Aun si
es posible secuenciar el genoma entero de una persona como
un procedimiento diagnóstico, sin una lista específica de can­
didatos no se tiene un medio para decidir cuál de los varios mi­
llones de diferencias entre las secuencias del DNA de dos per­
sonas podría ser la causa de una enfermedad.
► ¿El paciente tiene alguna mutación en ese gen particular que pu­
diera causar su enfermedad? En la sección 18.3 se estudian las
medidas estándar para responder esta pregunta, en tanto que
en la sección 18.5 se expone una conducta alternativa, el ras­
treo génico.
► ¿El paciente tiene una deleción de tres bases del codón de feni-
lalanina 508 en su gen CFTFS En la sección 18.4 se conside­
ran las circunstancias en que este tipo de preguntas puede
hacerse y los medios paras responderlas.
18.2 Elección del m a te ria l para
pruebas: DNA, RNA o proteínas
El estudio genético casi siempre se efectúa mediante PCR con los
métodos que se describen en la sección 5.2. Las pocas aplicaciones
de Southern blotting comprenden pruebas para reordenamientos o
alteraciones génicas mayores y mutaciones completas en X frágil y
en la distrofia mió tónica (sección 16.6.4). La sensibilidad de la
PCR permite emplear una gran variedad de muestras de tejidos, in­
clusive:
► muestras de sangre: son la fuente de DNA de adultos que más
se utiliza;
► enjuagues o raspados bucales: puesto que no son invasivos, se
prefieren en especial para programas de selección de poblacio­
nes. Los enjuagues bucales proveen suficiente DNA para unas
cuantas docenas de pruebas y por lo general la amplificación
del genoma completo (sección 5.2.4) permite efectuar pruebas
más extensas en una muestra aislada;
► muestras de biopsia de vellosidades coriónicas: constituyen
la mejor fuente de DNA fetal (mejor que los especímenes de
amniocén tesis);

Cuadro 18-1. Contraste genético de la fibrosis quística y la distrofia muscular de Duchenne.

Fibrosis quística Distrofia muscular de Duchenne

Autosómica recesiva Recesiva ligada a X

Mutaciones de pérdida de función Mutaciones de pérdida de función

Gen muy grande: Gen gigante:

DNA genómico, 250 kb DNA genómico, 2 400 kb
27 exones 79 exones
mRNA de 6.5 kb mRNA de 14 kb

Casi todas las mutaciones son cambios de nucleótido único
65% de las mutaciones corresponde a deleciones que incluyen uno o más exones
completos
5% es duplicaciones
30% de mutaciones sin sentido, sitio de empalme, etcétera
Las mutaciones en sentido erróneo son muy raras

Las nuevas mutaciones son en extremo raras Las nuevas mutaciones son muy frecuentes

El mosaicismo no es un problema El mosaicismo es frecuente

Poca recombinación intragénica Punto crítico de recombinación (12% entre marcadores en cualquier extremo del gen)

Las pruebas genéticas en DMD y FQ requieren diferentes grupos de enfoques.


► una o dos células extraídas de embriones en etapa de ocho
células, para el diagnóstico preimplantación después de la fe­
cundación in vitro;
► cabello, semen, etc., para investigaciones criminales;
► especímenes anatomopatológicos archivados, para tipifica­
ción de personas muertas cuando no se guardó DNA o para el
estudio de tumores en busca de cambios genéticos. Sólo se­
cuencias cortas de 250 pb o menos pueden amplificarse con se­
guridad a partir de especímenes de tejidos fijados;
► tarjetas Guthrie: son tarjetas en las que se envía una gota de
sangre seca a un laboratorio a fin de efectuar selección neona­
tal para fenilcetonuria (FCU) en el Reino Unido y en otras par­
tes. Puesto que para la prueba de selección no se usa toda la
gota de sangre, las tarjetas, si se conservan, son fuentes posibles
de DNA de un niño muerto.
El RNA tiene ventajas sobre el DNA, pero es más difícil de
obtener y manejar
La prueba mediante PCR-RT (véase sección 5.2.1) ofrece varias
ventajas cuando es necesario estudiar un gen para mutaciones des­
conocidas. El estudio del DNA suele incluir amplificación y pruebas
de cada exón por separado, y esto puede ser una labor importante
en un gen con muchos exones. Puesto que casi todos los métodos
de selección de mutaciones (cuadro 18-2) permiten estudiar frag­
mentos más grandes que el exón de tamaño promedio, es factible
examinar un producto de la PCR-RT con un número más pequeño
de reacciones. Asimismo sólo la PCR-RT puede detectar con segu­
ridad el empalme aberrante, que a menudo resulta difícil de prede­
cir a partir de un cambio en una secuencia de DNA, o que quizá se
deba a la activación de un sitio de empalme críptico profundo den­
tro de un intrón (véase sección 16.4.1). No obstante, obtener RNA
y trabajar con él es mucho menos cómodo. Las muestras deben ma­
nejarse con gran cuidado y procesarse con rapidez a fin de evitar
que el mRNA se degrade, y quizás el gen de interés no se exprese
en tejidos a los que se accede con facilidad. Además como muchas
mutaciones originan mRNA inestable (véase secciones 11.4.4,
16.4.1), cabe esperar que el producto de la PCR-RT de una perso­
na heterocigota sólo muestre el alelo normal.
Las valoraciones funcionales de proteínas desempeñan una
función en las pruebas genéticas
Una valoración funcional basada en proteínas podría clasificar los
productos de una serie alélica muy heterogénea en dos grupos sim­
ples -funcional y no funcional- lo que, después de todo, es la pre­
gunta esencial en la mayor parte de los diagnósticos. El problema
con las valoraciones funcionales es que son específicas para una
proteína particular. En contraste, la tecnología de DNA es genéri­
ca. Esto tiene ventajas obvias para el laboratorio de diagnóstico y
además fomenta el desarrollo técnico porque cualquier técnica nue­
va puede aplicarse a muchos problemas.
18.3 Estudio de un gen para
m utaciones
En la gran mayoría de las enfermedades, por ejemplo FQ y DMD,
se observa una heterogeneidad alélica extensa (véase sección
18.3 | ESTUDIO DE UN GEN PARA MUTACIONES j 513
16.3.2). Por consiguiente los estudios diagnósticos suelen incluir
investigaciones para mutaciones que pudieran encontrarse dentro o
cerca del (los) gen(es) importante(s). El cuadro 18-2 lista varios mé­
todos útiles y más adelante se describen con brevedad. Para detalles
de laboratorio véase las obras de Cotton, Edkins y Forrest o de Elles
y Mountford (Lecturas adicionales).
La investigación de la totalidad de un gen candidato para variacio­
nes de secuencias en una serie grande de pacientes revelará muchas va­
riantes distintas. Puede ser muy difícil decidir cuál de ellas es patógena
o no (y en consecuencia representa la mutación que se busca). El re­
cuadro 16-5 contiene algunos lincamientos para intentar decidirlo.
18.3.1 Métodos basados en secuenciación
Ahora que los secuenciadores de fluorescencia automatizados cons­
tituyen el equipo estándar de laboratorio, la secuenciación se torna
cada vez más atractiva como el principal medio para buscar una
mutación (fig. 18-1). Otros métodos de examen sirven sobre todo
para reducir la carga de secuenciación al definir el amplicón que de­
be secuenciarse. Conforme la secuenciación se tomó más barata y
sencilla, la necesidad de reducir la carga disminuyó y varios méto­
dos alternativos dejaron de emplearse. En la actualidad se recurre a
las alternativas de secuenciación directa sobre todo porque son rá­
pidas (cromatografía líquida desnaturalizante de alta ejecución,
dHPLC), baratas (polimorfismos de conformación de cadena úni­
ca, SSCP) o proporcionan cierta información especial (prueba de
truncamiento de proteína, PTT, y PCR cuantitativa).
Como la secuenciación genera más datos que otros métodos, el
requerimiento para análisis es mayor. Se cuenta con programas que
informan en forma automática las diferencias entre la secuencia es­
tudiada y una estándar a condición de que la secuencia sea de bue­
na calidad. Esta última es crítica para evitar artefactos y detectar
con seguridad sustituciones de bases en heterocigotos.
Para la secuenciación de DNA genómico, cada exón suele am­
plificarse por separado, con quizá 20 pb de intrón de flanqueo. Es­
to resulta ineficiente porque el tamaño promedio del exón en genes
humanos (145 pb) es bastante menor que las 500 a 800 pb que
pueden leerse en una buena carrera de secuenciación. Las posibles
soluciones comprenden utilizar PCR-RT o PCR de enlace de exón
(PCR meta, Wallace y cois., 1999; fig. 18-2). Más adelante se descri­
be la resecuenciación basada en microarreglos (sección 18.4.1).
18.3.2 Métodos basados en la detección de
compatibilidades erróneas o heterodúplex
Muchas pruebas emplean las propiedades de heterodúplex para de­
tectar diferencias entre dos secuencias. Casi todas las mutaciones
ocurren en la forma heterocigota (aun en padecimientos autosómi-
cos recesivos, es probable que la persona afectada que nace de pa­
dres no consanguíneos sea un heterocigoto compuesto, con dos
mutaciones diferentes). Los heterodúplex pueden formarse me­
diante el simple calentamiento del producto de la prueba de PCR
del heterocigoto a fin de desnaturalizarlo seguido del enfriamiento
lento. Para mutaciones en homocigotos, o ligadas a X en varones,
es necesario añadir cierto DNA de tipo silvestre como referencia.
Varias propiedades de los heterodúplex pueden aprovecharse:
► a menudo los heterodúplex tienen una movilidad anormal en
gel de poliacrilamida no desnaturalizantes (fig. 18-3A, panel
inferior). Se supone que los gel especiales (Hidrolink™,
MDE™) mejoran la resolución. Éste es un método en particu­
514 CAPÍTULO DIECIOCHO PRUEBAS GENÉTICAS EN INDIVIDUOS Y POBLACIONES

Cuadro 1 8 -2 . Métodos para estudiar un gen en busca de mutaciones.

El cuadro resume las ventajas y las desventajas de cada método para su empleo en un servicio de diagnóstico de rutina. Véase sección 18.3 para detalles.

Método Ventajas Desventajas

Southern blot, hibridación a sonda de El único medio para detectar deleciones y reorde­ Laborioso, caro
cDNA namientos mayores Requiere varios p.g de DNA

Secuenciación Detecta todos los cambios Costoso

Caracterización completa de mutaciones

Movilidad de heterodúplex en gel Muy simple Secuencias sólo < 2 0 0 pb

Barato Sensibilidad limitada
No revela la posición del cambio

dHPLC Rápido, rendimiento alto Equipo costoso

Cuantitativo No revela la posición del cambio

SSCP Simple, barato Secuencias sólo < 2 0 0 pb

No revela la posición del cambio

DGGE Sensibilidad alta La elección de los cebadores es fundamental

Cebadores costosos
No revela la posición del cambio

Corte químico de compatibilidad errónea Sensibilidad alta Sustancias químicas tóxicas

Muestra la posición del cambio Experimentalmente difícil

PTT Sensibilidad alta para mutaciones de terminación Sólo mutaciones terminales de cadena
de cadena Costoso, dificultades técnicas
Muestra la posición del cambio Suele requerir RNA

PCR cuantitativa Detecta deleciones en heterocigotos Costoso

Microarreglos Rápido Costoso

Rendimiento alto Gama limitada de genes
Puede detectar y definir todos los cambios

dHPLC, cromatografía líquida desnaturalizante de alta ejecución; SSCR polim orfism o de conformación de cadena única; DGGE, electroforesis en gel de
gradiente desnaturalizante: PTT, prueba de truncamiento de proteína.

lar simple. Si se estudian fragmentos no mayores de 200 pb de lar­
go, es factible detectar inserciones, deleciones y la mayor parte
de las sustituciones de bases únicas (Keen y cois., 1991);
► los heterodúplex tienen perfiles de desnaturalización anormales.
Esto se aprovecha en la cromatografía líquida desnaturalizan­
te de alta ejecución (dHPLC, fig. 18-4A) y la electroforesis en
gel de gradiente desnaturalizante (DGGE, fig. 18-3B). En
ambos casos la movilidad de un fragmento cambia de modo no­
table cuando se desnaturaliza. Estos métodos requieren ajustar­
se a la secuencia particular de DNA en estudio y por tanto son
más adecuados para el análisis rutinario de un fragmento deter­
minado en muchas muestras. La dHPLC proporciona un ren­
dimiento alto, que se adapta bien a su uso. La DGGE requiere
cebadores especiales con una extensión 5' poli (G;C) (una pin­
za GC); véase Sheffield y cois. (1992). Una vez que se optimizan,
estos métodos tienen una sensibilidad alta;
► las bases con compatibilidad errónea en heterodúplex son sen­
sibles a cortes mediante sustancias químicas o enzimas. El de
corte químico de compatibilidad errónea (CCM) (fig. 18-4B)
es un método sensible para detectar mutaciones, con las venta­
jas de que puede analizar fragmentos muy grandes (más de 1 kb
de tamaño) y de que la localización de la compatibilidad errónea
está indicada por el tamaño de los fragmentos generados. Sin
embargo, utiliza sustancias químicas muy tóxicas, en particular
tetróxido de osmio (aunque puede sustituirse por permangana­
to de potasio), y es experimentalmente muy difícil. Una alter­
nativa es el corte enzimàtico de compatibilidades erróneas
(ECM) en el que se recurre a enzimas como la resolvasa de fa­
go T4 o la endonucleasa VII para lograr el mismo resultado sin
las sustancias químicas tóxicas. Por desgracia, la calidad de los
gel producidos deja mucho que desear en manos de la mayoría
de las personas.
De todos estos métodos, la mayor parte de los laboratorios de diag­
nóstico sólo dispone de la dHPLC en la actualidad.
18.3.3 Métodos basados en análisis de conformación
de cadena única
El DNA de cadena única tiende a doblarse y formar estructuras
complejas estabilizadas mediante enlaces intramoleculares débiles,
sobre todo enlaces de hidrógeno de pares de bases. Las movilidades
electroforéticas de estas estructuras en gel no desnaturalizantes no
sólo dependen de la longitud de sus cadenas sino también de sus
conformaciones, que la secuencia de DNA rige. Los SSCP se detec-

A) Paciente
Testigo
B) Testigo
Fig. 18-1. Detección de mutación mediante secuenciación.
A) una sustitución de base en ei exón tres. El pico doble (flecha) muestra
una mutación heterocigota g.332C->T (p.P67L). B) deleción de una
base 3659delC en el exón 19. La secuenciación corriente abajo de la
deleción es confusa y refleja superposición de secuencias de los dos
alelos en este heterocigoto. Los cambios se confirmarían mediante
secuenciación de la cadena inversa. Cortesía del doctor Andrew
Wallace, St Mary’s Hospital, Manchester, Reino Unido.
tan mediante amplificación de las muestras de DNA (que pueden
ser los productos de la PCR-RT), desnaturalización, enfriamiento
con rapidez y cargándolas en un gel de poliacrilamida no desnatu­
ralizante (fig. 18-3A). Los cebadores pueden ser radiomarcados o
bien los productos no marcados detectarse con tinción argéntica. El
patrón preciso de bandeo que se observa depende mucho de los de-
calles de las condiciones. Deben correrse muestras testigo para que
sea posible observar diferencias del patrón de tipo silvestre. Puesto
que el SSCP es muy barato y posee una sensibilidad razonable (al­
rededor de 80%) para fragmentos hasta de 200 pb de largo (Shef-
field y cois., 1993), aún se utiliza con amplitud. Es posible combinar
SSCP y análisis de heterodúplex en un mismo gel, como en la figu­
ra 18-3A. Un SSCP detallado, la huella didesoxi, analiza cada
banda en una escalera de secuenciación por SSCP y se afirma que
tiene una sensibilidad de 100% (Sarkar y cois., 1992).
18.3 í ESTUDIO DE UN GEN PARA MUTACIONES 515
18.3.4 Métodos basados en traducción: prueba de
truncamiento de proteína (PTT)
La PTT (fig. 18-5) es una prueba específica para mutaciones de
cambios de marco, sitio de empalme o sin sentido que originan un
codón de terminación prematuro (Van der Luijt y cois., 1994). El
material de inicio es un producto de la PCR-RT o en ocasiones un
exón grande aislado en DNA genómico, como el exón 15 de 6.5 kb
del gen APC o el exón 10 de 3.4 kb del gen BRCA1. La descompo­
sición de mRNA mediada sin sentido (sección 16.4.1), que en con­
diciones normales impide la producción de una proteína truncada,
no ocurre porque en la valoración no hay empalme de exón con
exón. Las ventajas e inconvenientes de la PTT consisten en que só­
lo detecta ciertas clases de mutación. No sería útil para fibrosis
quística, en la que la mayor parte de las mutaciones no es truncan­
te. Pero las mutaciones en sentido erróneo son raras en la distrofia
muscular de Duchenne (DMD), la poliposis adenomatosa del co­
lon o el cáncer de mama relacionado con BRCA1 y el hallazgo de
cualquiera de estos cambios bien puede ser una coincidencia y no
patógeno. La PTT tiene varias ventajas en estas enfermedades. Ig­
nora sustituciones de bases silenciosas o en sentido erróneo y (co­
mo los métodos de corte de compatibilidad errónea, pero a
diferencia de los SSCP) revela el sitio aproximado de cualquier mu­
tación. Se desarrollaron diversas variantes para obtener resultados
más limpios, que por lo general incorporan un paso de inmunopre-
cipitación -pero la PTT aún es una técnica exigente que no resulta
fácil de efectuar bien.
18.3.5 Métodos para detectar deleciones
La detección de deleciones de homocigotos o hemicigotos es senci­
lla: la secuencia eliminada no se amplifica por PCR. Es importante
considerar explicaciones alternativas para la falta de amplificación:
es posible que se deba a fracaso técnico de la PCR o a una sustitu­
ción de bases en uno de los sitios de enlace del cebador. Las de­
leciones pueden confirmarse con el empleo de cebadores alternativos
o por Southern blotting. Alrededor de 60% de las mutaciones de la
DMD lo constituyen eliminaciones de uno o más exones (véase fig.
16-3). En varones afectados, dos reacciones de PCR multiplex (que
se muestran en la figura 18-6 y una prueba de exones en la parte 5'
del gen) revelarán 98% de las deleciones. En casi todas estas últi­
mas se elimina más de un exón. Es necesario confirmar las delecio­
nes que al parecer afectan exones no contiguos y las de un exón
aislado.
El estudio de mujeres para observar si portan una deleción de
distrofina es más difícil en conjunto e ilustra los problemas especia­
les que las deleciones de uno o más exones completos en heteroci-
gotos implican. Estas deleciones no son detectables cuando el DNA
genómico se amplifica exón por exón y se estudia por medio de se­
cuenciación, análisis heterodúplex o SSCP porque el alelo mutante
no provee un producto. HFIS o HGC-arreglo permiten diagnosti­
car deleciones de tamaño megabase (fig. 17-3). Se requieren alter­
nativas para deleciones a escala de exón. La secuenciación o el
análisis de PTT de productos de la PCR-RT deben captar cual­
quier cosa excepto una deleción génica completa, pero la descom­
posición del mRNA mediada sin sentido puede tornar invisible el
transcrito mutante y en una prueba diagnóstica no siempre es fácil
implementar métodos basados en RNA.
Se cuenta con varios sistemas de PCR cuantitativa que pueden
detectar deleciones heterocigotas en el DNA genómico. La reacción
516 CAPITULO DIECIOCHO PRUEBAS GENÉTICAS EN INDIVIDUOS Y POBLACIONES

Oligo externo O lig o s e n la z a d o re s

^ d e P C R -m e ta ^

a) Exón A

b) E xón A
I Exón C
Exón B

Oligo interno

Exón A
I
Exón B Exón C

I
c)

d) Exón A Exón B Exón C

Fig. 18-2. Principia de la PCR de enlace de exón (PCR meta).

Es una técnica para superar la disparidad entre el tamaño promedio de los exones humanos (145 pb) y el tamaño óptimo del producto para la
secuenciación (500 a 800 pb), en tanto conserva las ventajas de estudiar el DNA genómico. a) Dos a cinco exones (con ca. 20 pb de intrón de flanqueo,
no se muestran para claridad) se amplifican mediante PCR con cebadores que portan enlazadores compatibles específicos en sus extremos 5’ .
b) Conforme los cebadores se agotan, se forman concatámeros, guiados por los enlazadores. c) El concatámero deseado se amplifica en una segunda
ronda de PCR con cebadores diseñados de manera específica, d) El producto puede diseñarse para que tenga cualquier combinación de exones
dispuestos en cualquier orden. Véase Wallace, Wu y Elles (1999).

se limita a la fase exponencial temprana (fig. 5-2) cuando la canti­
dad de producto indica la de la plantilla. La acumulación de pro­
ducto se mide en tiempo real por fluorescencia y se compara con
un estándar interno o paralelo. La señal fluorescente puede ser ge­
nerada por un colorante de enlace específico de DNA de cadena
doble, como SYBR® Verde, o mediante el corte de un oligonucleó-
tido específico de secuencia marcado con un colorante y un apaga­
dor (valoración TaqMan®). Una alternativa a la PCR de tiempo
real es el método de Armour MAPH (hibridación multiplex con
sonda amplificable) (2000) (recuadro 18-1). La MAPH permite un
grado alto de multiplex (pueden compararse dosis de cuando me­
nos 50 secuencias cortas en un solo experimento), no requiere son­
das marcadas en forma especial ni maquinaria costosa, y es bastante
adecuada para desarrollarse en un laboratorio modesto.
Si está segregándose una deleción en una familia, la tipificación
de mujeres para mapear microsatélites dentro de la deleción puede
revelar no maternidad aparente, en la que una madre no transmi­
tió el alelo marcador a su hija a causa de la deleción (fig. 18-7). En
estas familias la “no maternidad” demuestra que una mujer es una
portadora, en tanto que la heterocigosidad (en la hija o la hermana
de una portadora de la deleción) indica que una mujer no es por­
tadora. Se identificaron varios marcadores adecuados para este pro­
pósito en puntos críticos de deleción en los intrones. El método
funciona mejor en familias con un varón afectado en el que la de­
leción puede definirse primero.
18.3.6 Métodos para detectar patrones de metilación
del DNA
La importancia de la metilación del DNA en el control de la expre­
sión génica se describió en la sección 10.4.2. La metilación excesiva
o deficiente de dinucleótidos CpG es un mecanismo patógeno fre­
cuente en el cáncer (sección 17.4.3) y la expresión génica impronta
(sección 16.4.4). Puesto que los productos de la PCR nunca se me­
dian, ninguno de los métodos descritos hasta el momento brinda in­
formación de los patrones de metilación en una muestra de DNA.
Dos métodos principales se utilizan para verificar la metilación:
► Digestión mediante enzima de restricción. La HpaW sólo cor­
ta CCGG no metilado, en tanto que la Msp\ corta cualquier
CCGG sea metilado o no. Por consiguiente los sitios CpG
metilados dan lugar a que las dos enzimas provean diferentes
fragmentos de restricción. De otro modo, una plantilla de
PCR que contiene un CCGG puede digerirse con una Hpall
antes de la amplificación; si el sitio no está metilado, la plan­
tilla se corta y la PCR no producirá producto alguno.
► Secuenciación con bisulfito (Thomassin y cois., 1999). Cuando
se trata DNA de cadena única con bisulfito de sodio, la citosi-
na, pero no la 5-metil citosina (5-MeC), se convierte en uraci-
lo. Después del tratamiento con bisulfito el DNA se amplifica
por PCR (con cebadores compatibles con la secuencia modifi­
cada) y se somete a secuenciación convencional. La citosina y
 18.4 ! PRUEBAS PARA UN CAMBIO DE SECUENCIA ESPECIFICADO j 517

A) B)

1 2 3 4 5 6 7 8

Fig. 18-3. Selección para mutaciones del gen CFTR.

A) heterodúplex y análisis SSCP. El exón 3 se amplificó mediante PCR para DNA genómico. Tras la desnaturalización, las muestras se cargaron en un
gel de poliacrilamida no desnaturalizante. Parte de cada producto se reasoció para proporcionar DNA de doble cadena. Éste corre más rápido en el gel
y da las bandas heterodúplex que se observan en el grupo inferior. El DNA de cadena única corre con más lentitud en el mismo gel (panel superior). Las
hileras 1 y 2 muestran el patrón típico de la secuencia de tipo silvestre. Pueden observarse patrones variantes en las hileras 3 a 8. La secuenciación
reveló mutaciones de G85E, L88S, R75X, P67L, E60X y R75Q respectivamente. Cortesía del doctor Andrew Wallace, St M ary’s Hospital Manchester.
B) electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante. Los exones del gen CFJfí se amplifican mediante PCR en uno o más segmentos y se corren en
geles de poliacrilamida a 9% que contienen un gradiente desnaturalizante de urea y formaldehído. La banda de cualquier amplicón que contiene una
variante de heterocigoto suele cortarse en cuatro subbandas (flechas). En las hileras que se muestran, el sujeto A (hilera izquierda en cada panel) tiene
una variante en el amplicón 6 y el sujeto B (hileras derechas) tiene variantes en los amplícones 17 y 24. La caracterización de las variantes demostró
que el sujeto B era heterocigoto para R1070Q (exón 17). Otras variantes no fueron patógenas. Cortesía del doctor Hans Scheffer, University of
Groningen, Países Bajos.

la 5-MeC en el espécimen original se muestran como timina y
citosina, respectivamente, en la secuencia del producto de la
PCR. Este método requiere controles muy cuidadosos para
proporcionar datos seguros.
1 8 .4 Pruebas para un cam bio de
secuencia especificado
Las pruebas para la presencia o ausencia de un cambio de secuencia
conocido son un problema diferente y mucho más sencillo que el es­
tudio de un gen para la presencia de cualquier mutación. Las mues­
tras pueden genotipificarse siempre mediante secuenciación, pero la
convencional no es un método eficiente si sólo la posición de un nu-
cleótido aislado está controlándose. El cuadro 18-3 resume algunos
de los principales métodos de genotipificación. Las compañías de
biotecnología desarrollaron como equipos muchas variantes de estos
métodos y otros. Las aplicaciones típicas comprenden:
► diagnóstico de enfermedades con heterogeneidad alélica limi­
tada (véase cuadro 18-4);
► diagnóstico en una familia. Quizá se necesiten métodos de
examen de una mutación para definir la mutación familiar,
pero una vez que se caracteriza, por lo general sólo es necesa­
rio estudiar a otros miembros de la familia para esa mutación
particular;
► en investigación, para estudiar muestras testigo. Un problema
usual en la clonación posicional es que un paciente presente un
cambio de secuencia en un gen candidato. A continuación sur­
ge la pregunta, ¿este cambio es patógeno (y confirma que el gen
candidato es el gen de enfermedad) o puede ser un polimorfis­
mo no patógeno? Un método usual consiste en seleccionar un
panel de muestras testigo normales para la presencia del cam­
bio. Collins y Schwartz (2002) consideran el problema del nú­
mero de testigos que deben estudiarse;
► genotipificación de SNP. Aunque el objetivo en este caso no es
encontrar una mutación patógena como en la forma anterior,
el problema es idéntico: estudiar una muestra de DNA para
una variante de secuencia predefinida. La tipificación median­
te SNP es la principal aplicación de los métodos de genotipifi­
cación de rendimiento muy alto (sección 18.4.2).
518 CAPÍTULO DIECIOCHO PRUEBAS GENÉTICAS EN INDIVIDUOS Y POBLACIONES

A)

?
g
CS
O
c
tü
■Q
O
m
n
<

Tiempo (min)

B) Tamaño del fragmento

140 210 280 350 420 49 0 56 0 630 70 0 77 0 84 0 910 98 0 1 0 5 0 1 1 2 0

Fig. 18-4. Examen para mutación.

A) Examen para mutación de DIVID mediante cromatografía líquida desnaturalizante de alta ejecución (dHPLC). El exón 6 del gen de distrofina da un
patrón distinto en un varón afectado (trazo en azul) y un testigo normal (trazo en rojo). La secuenciación reveló la mutación del sitio de empalme
73 8 + IG ^T . Puesto que es un padecimiento ligado a X, en varones la prueba de DNA debe combinarse con una cantidad igual de DNA normal con el fin
de permitir que se formen heterodúplex. Cortesía del doctor Richard Bennett, Children’s Hospital Boston, MA, USA. B) Examen para mutación mediante
corte químico de compatibilidades erróneas. Producto de la PCR meta con fluorescencia que contiene los exones 6 a 10 del gen NF2. Pista superior:
muestra del paciente; se descubre una mutación por empalme heterocigota en el íntrón 6 de 600-3c->g mediante corte por hídroxilamina del producto
de la PCR meta de 1 032 pb en fragmentos de 8 1 3 + 2 3 9 pb. Pista inferior: muestra testigo. Cortesía del doctor Andrew Wallace, St M ary's Hospital,
Manchester, Reino Unido.

18.4.1 Se dispone de muchos métodos simples para
genotipificar una variante especificada
Pruebas para la presencia o ausencia de un sitio
de restricción
Una mutación por sustitución de bases que crea o suprime un sitio
de reconocimiento de una enzima de restricción permite realizar
una prueba directa simple de PCR para la mutación (fig. 7-6). Aun­
que se conocen cientos de enzimas de restricción, casi todas reco­
nocen sitios palindrómicos simétricos y muchas mutaciones de
punto no afectarán esas secuencias. Además los sitios para enzimas
de restricción raras y ocultas no son adecuados para emplearse en
diagnósticos rutinarios porque las enzimas son caras y a menudo de
mala calidad. Sin embargo, en ocasiones puede introducirse un si­
tio de restricción diagnóstico mediante una forma de mutagenesis
de PCR (sección 5.5.3) con el uso de cebadores elegidos con cui­
dado. La figura 18-8 muestra un ejemplo.
 18.4 PRUEBAS PARA UN CAMBIO DE SECUENCIA ESPECIFICADO 519

Segmento de DMD 1EF Segmento de DMD 2CD

Fig. 18-5. Examen de la mutación de DMD mediante la prueba de truncamiento de proteína (PTT).
Una reacción acoplada de transcripción-traducción se utiliza para producir productos polipéptidos marcados codificados para un segmento de mRNA.
Los segmentos que contienen codones de terminación prematura producen polipéptidos truncados. En este caso se usó PCR-RT para examinar la totalidad
del gen de distrofina en 10 segmentos superpuestos en una serie de pacientes con distrofia muscular de Duchenne (DMD). Los polipéptidos de carrera
más rápida identifican segmentos que contienen codones de terminación y el tamaño del producto anormal indica la posición del codón de
detención dentro del segmento. Imagen cortesía del doctor J. T. den Dunnen y D. Verbove (Leiden, Países Bajos); para mayores detalles véase
http://www.dm d.nl.

Fig. 18-6. Selección multiplex para deleciones de distrofina en varones.

A) Productos de amplificación multiplex con PCR de nueve exones, utilizando muestras de 10 niños no relacionados con distrofia muscular de Duchen-
ne/Becker. Los cebadores de la PCR se diseñaron de manera que cada exón, con alguna secuencia de flanqueo de intrón, proporcione un producto de
PCR de tamaño diferente. Cortesía dei doctor R. Mountford, Liverpool Women's Hospital, Reino Unido. B) Interpretación: las líneas sólidas muestran
exones eliminados en forma definitiva; las líneas de guiones indican la posible extensión de la deleción en dirección hacia exones no estudiados. No se
observa deleción en las muestras 7 y 9; estos pacientes pueden tener mutaciones de punto o deleciones de exones que no se examinaron en esta
prueba. Las tamaños de exón y el espaciamiento no están a escala. Compárese con la figura 16-3.
520 i CAPÍTULO DIECIOCHO PRUEBAS GENÉTICAS EN INDIVIDUOS Y POBLACIONES

iRSaltl
Recuadro 18-1. H ibridac ión m ultiplex con sond a am p lificab le (M A P H ) ¡§ i i

Es un método muy versátil para comparar la dosis génica de un número
de secuencias. El DNA genómico del paciente se gotea en un filtro de nai­
lon pequeño ( 2 x 3 m m ) y se híbrida a una mezcla de 40 sondas, cada
una específica para un exón del gen de distrofina. Tras el lavado cuidado­
so, el filtro se coloca en una mezcla de PCR en la que se utiliza un par
aislado de cebadores que se unen a una secuencia que se encuentra al
final de cada sonda. Un cebador puede marcarse con fluorescencia para
realizar el análisis en un secuenciador génico.
Las sondas se diseñan de tal manera que sea posible distinguir los exo-
nes mediante la longitud del producto de la PCR y cuantificarse por el ta­
maño del pico en un secuenciador de fluorescencia o por las intensidades
relativas de bandas en un gel manual. Como todas las sondas se am pli­
fican con el mism o par de cebadores, se evitan los problemas de una am­
plificación desigual que abundan en las PCR multiplex.
Para detalles más amplios de MAPH véanse Armour y colaboradores
(2000) y el sitio de red MAPH www.nott.ac.uk/-pdzjala/m aph/m aph.html

13
. Paciente con duplicaci n

I j J lÜ J I i J i u id II 1a / A k 1 / A A a aAaM Aa Ia a a ¡i a a Aa
B U 41B:34_B0S_041.f*a/

Paciente con deleci n

u L i l i l í l i l i A j l I iÁ á M ÍA Á L A k fi A A A A a L a M L A a li a * AA
B U 45B:42_B06_M5.f» /

Testigo

u J t iíjjj L lIiilJl lili t i hk KAAÁ k 1 A /I A a aLaaa L a a il / * Aa

BB 57B:50_B07_D57.f#a/

Se indican los exones duplicados/elim inados (deleci n)

Uso de MAPH para detectar deleciones y duplicaciones de exones del gen de distrofina.
La comparación de los tamaños de los picos con el trazo testigo permite observar la duplicación de los exones 10 y 13 (y tal vez 11 y 12, que no se
estudiaron en este multiplex) en el trazo superior, y la deleción del exón 18 en el trazo central. Imagen cortesía de los doctores J. T. den Dunnen y S.
White Leiden, Países Bajos; para mayores detalles véase http://www.dmd.nl

A) B)

STR45
Alelo 1 -

Fig. 18-7. Portadores de deleción en una familia con DMD revelados mediante no maternidad aparente.

A) Genealogía. B) Resultados de la tipificación con el marcador intragénico STR45. El niño afectado 111-1 tiene una deleción que incluye STR45 (el carril 7
del gel es el blanco). Su madre II-2 y su tía II-3 no heredaron el alelo de STR45 de su madre 1-2, lo que muestra que la deleción se transmite en la
familia. Al parecer I-2 es homocigoto para este marcador altamente polimórfico (carril 2), pero de hecho es homocigoto. La otra tía II-4 y su hermana III-2
son heterocigotas para el marcador y por tanto no portan la deleción.
 18.4 PRUEBAS PARA UN CAMBIO DE SECUENCIA ESPECIFICADO
Uso de hibridación de oligonucleótido específico de alelo
(ASO)
Bajo condiciones de hibridación adecuadamente rígidas, estas sondas
sintéticas cortas sólo se hibridan con una secuencia compatible a la
perfección (sección 6.3.1). La figura 6-11 muestra el uso de la hibri­
dación dot-blot con sondas de ASO para detectar la sustitución de
base única que causa la enfermedad de células falciformes. Con fines
diagnósticos suele emplearse un procedimiento dot-blot inverso. Por
ejemplo, en una selección para una serie de mutaciones de fibrosis
quística definidas se usaría una serie de ASO específicos para cada
alelo mutante, goteados en una membrana aislada que después se hí­
brida con el DNA de prueba marcado amplificado mediante PCR.
El mismo principio de dot-blot inverso se aplica a una escala
masivamente paralela en chips de DNA. Cientos a miles de sondas
oligonucleótidas de 20 a 25 mer se anclan a un apoyo sólido en po­
siciones definidas (sección 6.4.3). El DNA en estudio se amplifica
por PCR, se marca con fluorescencia y se hibrida al arreglo, solo o
(de preferencia) en competencia con una secuencia de referencia ti­
po silvestre marcada con un color distinto. Cada sonda individual
del chip se comporta como una prueba de ASO para una secuen­
cia específica en el DNA de prueba, pero sobre todo los chips pue­
den explorar toda la secuencia de un gen e informar cualquier
sustitución de bases (fig. 18-9A). Las eficiencias de detección son
excelentes en homocigotos, pero menos seguras en heterocigotos.
Las inserciones sólo se detectan si se diseñaron de antemano oligo-
nucleótidos para detectar una inserción específica.
Una vez preparado todo, los sistemas de chip resultan rápidos y
fáciles de emplear, aunque lejos de ser baratos. Sin embargo, es ne­
cesario definir con anterioridad la gama de mutaciones a detectar y
diseñarlas dentro del chip. Por tanto su principal función en la de­
tección de una mutación puede ser para el examen inicial de mues­
tras a fin de captar las mutaciones frecuentes; para los casos difíciles
se recurre a otros métodos.
Amplificación mediante PCR específica de alelo (prueba
ARMS)
El principio de la ARMS (sistema de amplificación de mutación re­
sistente) se muestra en la figura 5-4. Se llevan a cabo reacciones de
PCR pareadas. En ambas reacciones un cebador (el común) es el
mismo, el otro se presenta en dos versiones un poco diferentes, una
específica para la secuencia normal y la otra específica para la se­
cuencia mutante. Suelen incluirse cebadores testigo adicionales pa­
ra amplificar alguna secuencia no relacionada de cada muestra a fin
de controlar la correcta realización de la PCR. La localización del
cebador común puede elegirse para que proporcione productos de
diferente tamaño para distintas mutaciones, de manera que los pro­
ductos de la PCR de reacciones multiplex forman una escalera en
un gel. Con el diseño cuidadoso del cebador también pueden pre­
pararse cebadores específicos de mutación para que provean pro­
ductos distinguibles. Por ejemplo, pueden marcarse con diferentes
marcadores fluorescentes u otros, o proporcionarse extensiones 5'
de tamaños diversos. La PCR multiplex específica de mutación es
muy adecuada para seleccionar grandes cantidades de muestras pa­
ra un grupo determinado de mutaciones (fig. 18-10).
Valoración de ligadura de oligonucleótido (OLA)
En la prueba de OLA para mutaciones por sustitución de bases se
preparan dos oligonucleótidos que se hibridan a secuencias adya­
I 521
centes en el blanco, con la unión establecida en la posición de la
mutación. La ligasa de DNA no unirá de manera covalente los dos
oligonucleótidos a menos que estén perfectamente hibridados
(Nickerson y cois., 1990). Son posibles varios formatos para la prue­
ba, por ejemplo, una ELISA o, como en la figura 18-11, para aná­
lisis en un secuenciador de fluorescencia.
Minisecuenciación mediante extensión del cebador
La minisecuenciación utiliza el principio de la secuenciación Sanger
(fig. 7-2), pero sólo añade un nucleótido aislado. El extremo 3' del ce­
bador de secuenciación está situado justo corriente arriba del nucleó­
tido a genotipificar. La reacción mixta contiene polimerasa de DNA
aunada a cuatro trifosfatos didesoxinucleótido marcados de manera
distinta (ddNTP). La prueba de DNA actúa como una plantilla para
la adición de un didesoxinucleótido marcado aislado al cebador. De
una manera u otra, el nucleótido añadido al cebador se identifica (p.
ej., corriendo el cebador extendido en un secuenciador de fluorescen­
cia) y ello permite identificar la base en la posición de interés.
La minisecuenciación puede adaptarse con facilidad a un for­
mato basado en arreglos (APEX, extensión de cebador arreglada;
Tonisson y cois., 2002) para revisar la secuencia completa de un gen
en busca de sustituciones de bases en una operación (fig. 18-9B).
18.4.2 Métodos para genotipificación de alto
rendimiento
Las compañías de biotecnología desarrollan múltiples sistemas con
objeto de resolver el desafío de la genotipificación de cantidades
muy considerables de SNP para estudios de relación con enferme­
dades (sección 15.4.5). Weaver (2000) elaboró una lista de un gran
número de tales sistemas. El método genético subyacente suele ser
extensión de un cebador (minisecuenciación), hibridación de oli­
gonucleótido específico de alelo o enlace de oligonucleótido, como
se describió antes, pero formateado para permitir la automatización
y un rendimiento muy alto. Muchos sistemas intentan combinar
esta tecnología genética con los desarrollos en microlíquidos de “la­
boratorio en un chip”. Los ejemplos de otros métodos comprenden
la pirosecuenciacion y la espectrometría de masa (recuadro 18-2).
18.4.3 Pruebas genéticas para enfermedades por
repetición de tripletos
Las repeticiones expandidas que causan múltiples enfermedades neu-
rológicas (cuadro 16-6) incluyen un grupo especial de pruebas espe­
cíficas de mutación (fig. 18-2). En las enfermedades por repetición
de poliglutamina, como la de Huntington (HD), una reacción de
PCR aislada establece el diagnóstico. Algunas de las otras afecciones
por repetición expandida son un poco más difíciles por dos razones.
Las mutaciones completas pueden tener cientos o miles de repeticio­
nes y no se amplifican con facilidad mediante PCR, en especial por­
que la mayor parte de estas repeticiones tiene un contenido alto de
GC. Los alelos normales y premutación proporcionan productos
de PCR limpios, pero en mutaciones completas quizá se requiera
Southern blotting. Además, a diferencia de la HD, las mutaciones
causan sobre todo enfermedad por pérdida de función y algunos indi­
viduos afectados tienen deleciones o mutaciones de punto que podrían
no advertirse con el solo estudio de la repetición. Las distrofias mio-
tónicas son las únicas enfermedades de “expansión grande” que pare­
cen por completo homogéneas desde el punto de vista mutacional.
522 CAPÍTULO DIECIOCHO PRUEBAS GENÉTICAS EN INDIVIDUOS Y POBLACIONES

Cuadro 18-3. Métodos de pruebas para una mutación especificada.

Método Comentarios

Digestión de restricción de DNA amplificado mediante PCR; Sólo cuando la mutación crea o suprime un sitio de restricción natural (fig. 7-6) o uno
verificar el tamaño de los productos en un gel con ingeniería mediante el uso de cebadores de PCR especiales (fig. 18-8)

Hibridación de DNA amplificado mediante PCR a oligonu- Método general para mutaciones de punto especificadas; los arreglos grandes permiten
cleótidos específicos de alelo (ASO) en una dot-blot o un seleccionar para casi cualquier mutación
chip génico

PCR mediante cebadores específicos de alelo (prueba Método general para mutaciones de punto; el diseño del cebador es fundamental (fig.
ARMS) 18-10)
Puede adaptarse a la tecnología de chip
Puede brindar lecturas cuantitativas de tiempo real por medio de tecnología TaqMan

Valoración de ligadura de oligonucleótido (OLA) Método general para mutaciones de punto especificadas (fig. 18-11)

PCR con cebadores localizados en cualquier lado de un La amplificación satisfactoria muestra la presencia de la deleción sospechosa o el reor­
punto de rotura de transtocación denamiento especificado

Revisar el tamaño de la repetición expandida Enfermedades por repetición dinámica (sección 16.6.4)
Las expansiones grandes requieren Southern blots,
las más pequeñas pueden hacerse mediante PCR sola

Pyrosequencing Método de alto rendimiento (recuadro 18-2)

SNAPshot Minisecuenciacíón mediante extensión de cebador (sección 18.4.1)

Espectrometría de masa Método de alto rendimiento (recuadro 18-2)

Cuadro 1 8 -4 . Ejemplos de enfermedades que muestran una gama limitada de mutaciones.

Véase la sección 16.3 para un comentario más amplio de las razones por las que algunas enfermedades muestran una gama limitada de mutaciones en
tanto que otras tienen una heterogeneidad alélica extensa

Entermedad Causa Comentarios

Enfermedad de células falciformes Sólo esta mutación particular produce el fenotipo de p.E6V en el gen HBB
célula falciforme Véase figura 6-11

Acondroplasia Sólo G380R produce este fenotipo particular; tasa Dos cambios distintos, ambos producen
de mutaciones muy alta p.G380R en el gen FGFR3 (fig. 16-9)

Enfermedad de Huntington, distrofia Mutaciones de ganancia de función Repeticiones expandidas inestables

miotóníca Véase sección 16.6.4

X frágil Mecanismo molecular común: expansión de una re­ Véase sección 16.6.4; se observan otras muta­
petición inestable ciones, pero son raras

Enfermedad de Charcot-Marie-Tooth Mecanismo molecular común: recombinación entre Duplicaciones de 1.5 Mb en 17p11.2 (fig.
(HMSN1) repeticiones alineadas de manera errónea 16.8); también ocurren mutaciones de punto

Talasemias a y p La selección para heterocigotos origina que diferen­ Véase fig. 16-2 (talasemía a ) y cuadro 18-5
tes mutaciones ancestrales sean comunes en distin­ (talasemía (3)
tas poblaciones

Enfermedad de Tay-Sachs Efecto fundador en judíos ashkenazis; ventaja de he­ Dos mutaciones HEXA comunes en ashkenazis:
terocigoto antiguo inserción de 4 pb en el exón 11 (73%); sitio de
empalme donador en el exón 11 G-*C (15%)

Fibrosis quística Mutaciones ancestrales comunes en poblaciones Véanse cuadro 18-6 y sección 4.5.3
del norte de Europa, ventaja de heterocigoto antiguo
 18.5 RASTREO GÈNICO | 523

Normal Mutante Producto digerido con Seal

-In tró n -- | --Exón — — Intrón----------------------- N H N M

DNA genómico 5' -- g t g H g ta tt — 3' 5' — GTGffiGTATT — 3'

Cebador de PCR 3'-<f --------- C A T GA — 5' 3 ' < r ---------------- C A T GA— I 5'

Producto de PCR 5' -- G T G A G T A C T l 3' 5 ' --------- G T G T A C T — 3'

Seal

Fig. 18-8. introducción de un sitio de restricción diagnóstica artificial.

Una mutación A->T en el sitio de empalme del intrón 4 del gen FACC no crea ni suprime un sitio de restricción. El cebador de la PCR se detiene un poco
antes de esta base alterada, pero posee una compatibilidad errónea de base única (G en rojo) en una posición no critica que no impide que se hibride a
las secuencias normal y mutante y amplifique ambas. La compatibilidad errónea en el cebador introduce un sitio de restricción AGTACT para Seal en el
producto de la PCR de la secuencia normal. Se muestra el producto digerido mediante Seal de los pacientes homocigoto normal (N), heterocigoto (H) y
homocitogo mutante (M). Cortesía de la doctora Rachel Gibson, Guy’s Hospital, Londres, Reino Unido.

18.4.4 El origen geográfico es una consideración
importante para algunas pruebas
La genética de población de enfermedades recesivas a menudo
está dominada por efectos fundadores o por los efectos de la ven­
taja de heterocigotos. La resultante diversidad limitada de muta­
ciones en una población puede facilitar bastante las pruebas
genéticas. La talasemia ¡3 y la fibrosis quística son ejemplos ade­
cuados. En estos dos padecimientos se describió un número muy
considerable de mutaciones distintas en el gen importante, pero
en cada uno unas cuantas mutaciones explican la mayor parte de
los casos en cualquier población particular. En la talasemia P no
es necesario estudiar el DNA para diagnosticar a portadores o
personas afectadas -la hematología ortodoxa lo efectúa a la per­
fección- pero éste es el método de elección para el diagnóstico
prenatal. Diferentes mutaciones predominan en poblaciones dis­
tintas (cuadro 18-5). A condición de que se cuente con muestras
de DNA de los padres y se conozcan sus orígenes étnicos, casi
siempre es posible encontrar las mutaciones parentales por me­
dio de una combinación pequeña de pruebas específicas, tras las
cuales el feto puede revisarse con facilidad.
En la fibrosis quística, la mutación F508del es la más frecuen­
te en todas las poblaciones europeas y se piensa que su origen es
antiguo. Sin embargo, la proporción de todas las mutaciones que
son F508del varía y por lo general son más altas en el norte y el
oeste de Europa, y más bajas en el sur. Las pruebas para mutacio­
nes de FQ se dividen en dos fases. Primero se busca un número
limitado de mutaciones especificadas, siempre F508del entre ellas,
con los métodos que se describen en la sección 18.4. Como se
muestra en el cuadro 18-6, no hay un límite natural obvio en tér­
minos de disminución de los resultados obtenidos en pruebas
para mutaciones específicas. Cuando esta fase no revela la muta­
ción, entonces, si los recursos lo permiten, puede instituirse una
selección para mutaciones desconocidas con el método que se
describe en la sección 18.3 o, de otro modo, recurrirse al ras­
treo génico (fig. 18-13). El impacto de esta diversidad en las pro­
posiciones para selección de poblaciones se estudia más adelante
(véase fig. 18-18).
Cuando una enfermedad recesiva es particularmente común en
una cierta población, con una frecuencia sorprendente resulta de­
berse a más de una mutación. Un ejemplo es la enfermedad deTay-
Sachs entre judíos ashkenazis, en la que se observan dos mutaciones
HEXA comunes (cuadro 18-4). Es difícil explicar esta situación ex­
cepto si se asume que hubo una ventaja heterocigota sustancial en
alguna época cuando la población fundadora era pequeña.
18.5 R astreo génico
El rastreo génico fue el primer tipo de método diagnóstico de DNA
que se utilizó con amplitud. Emplea el conocimiento de la locali­
zación del locus de la enfermedad en el mapa, pero no el conoci­
miento del gen de la afección real. Por tanto es el único método
disponible para genes que se mapearon pero no se clonaron. Casi
todas las enfermedades mendelianas que constituyen el trabajo dia­
rio del laboratorio de diagnóstico pasaron a través de una fase de
rastreo génico y después a las pruebas directas una vez que los ge­
nes se clonaron. La enfermedad de Huntington, la fibrosis quística
y la distrofia miotónica son ejemplos familiares. Sin embargo, el
rastreo génico puede tener una función aun cuando ya se clonó un
gen. En el ambiente de laboratorio de diagnóstico no siempre es
eficaz para el costo buscar de manera cuidadosa un gen grande con
múltiples exones para encontrar cada mutación. Más aún, ninguno
de los métodos de estudio de mutaciones que se describen en la
sección 18.3 es 100% sensible, de modo que siempre se presentan
casos en los que no es posible encontrar la mutación. En estas cir­
cunstancias el método de selección es el rastreo génico con marca­
dores enlazados. Los requisitos para el rastreo génico son:
1. mapeo adecuado de la enfermedad, de manera que puedan
usarse marcadores que se sabe que están enlazados en forma es­
trecha con el locus de enfermedad;
2. la estructura genealógica y la disponibilidad de muestras deben
permitir determinar la fase (véase a continuación);
3. diagnósticos clínicos confirmados en forma inequívoca y ningu­
na incertidumbre respecto a la localización del gen de enferme­
dad en el mapa.
524 CAPÍTULO DIECIOCHO PRUEBAS GENÉTICAS EN INDIVIDUOS Y POBLACIONES

A) Tipo silvestre AGGTCGTATCCATGCCTTACAGTCCAGG

Mutante A > C AGGTCGTATCCCTGCCTTACAGTCCAGG

Tipo silvestre Mutante

Célula Oligo Compatibilidad Hyb Compatibilidad Hyb
errónea errónea
10A A G G TC G TA T a C aT G C C T T A C 1 + 2 -
10G A G G T C G T A T g C aT G C C T T A C 1 + 2 -
10C A G G T C G T A T C C aT G C C T TA C 0 ++ 1 +
10T AG G T C G T A T tC a T G C C T T A C 1 + 2 -
11A G G T C G T A T C aa T G C C T T A C A 1 + 2 -
11G G G TCG TATCj) aT G C C TTA C A 1 + 2 -
11C G G T C G T A T C C aTG C C TT A C A 0 + i- 1 +

11T G G T C G T A T C aaTG C C TT A C A 1 + 2 -
12A G TC G TA TC C aTG C C TTA C A G 0 ++ 1 +

12G G TC G TA TC C gTG C C TTA C A G 1 + 1 +

12C G TCG TATCC CTG CC TTAC AG 1 + 0 ++

12T G TC G TATC Ct_T G C C TTA C A G 1 + 1 +

13A T C G TAT C C a aG C C TTA C A G T 1 + 2 -
13G TCGTATCCagGCCTTACAGT 1 + 2 -
13C TCGTATCCacGCCTTACAGT 1 + 2 -
13T TCGTATCCaTGCCTTACAGT 0 ++ 1 +

Tipo silvestre Mutante

Célula 10 11 13 10 11 12 13
A
G
C
T

B) Tipo silvestre CTAGTTCGACGAGGTCGTATCCATGCCTTACAGTCCAGG

DNA blanco CTAGTTCGACGAGGTCGTATCCCTGCCTTACAGTCCAGG
Nucleótido añadido
Cebador 1 5' CTAGTTCGACGAGGTCGTA 3' ddT-rojo
Cebador 2 5' TAGTTCGACG AGGTCGTAT 3' ddC-azul
C eb ad o r3 5' AGTTCGACGAGGTCGTATC 3' ddC-azul
Cebador 4 5' GTTCGACGAGGTCGTATCC 3' ddC-azul
Cebador 5 5' TTCGACGAGGTCGTATCCA 3' No se añadió marcador
Cebador 6 5' T C G A C G A G G T C G T A T C C A* ddG-amarillo (v. débil)
Cebador 7 5' CGACGAGGTCGTATCC ATG 3 ddC-azul (débil)
Cebador 8 5' GACGAGGTCGTATCCATGC 3' ddC-azul
C ebador9 5' ACGAGGTCGTATCCATGCC 3' ddT-rojo
Cebador 10 5' CGAGGTCGTATCCATGCCT 3' ddT-rojo
Cebador 11 5' GAGGTCGTATCCATGCCTT 3' ddA-verde

Fig. 18-9. Arreglos de olígonucleótidos para detección de mutación.

A) Principios de la detección de una mutación mediante hibridación. Los olígonucleótidos están arreglados en grupos de cuatro, cada uno de los cuales
corresponde a las cuatro posibles bases en una posición determinada (sombreada). Las compatibilidades erróneas con la secuencia de tipo silvestre se
muestran en el cuadro interior en rojo y las compatibilidades correctas en el cuadro superior en azul. La secuencia mutante tiene una sustitución A-*C
en la posición 12 (rojo). Cuando las secuencias de tipo silvestre o mutante se hibridan al arreglo, el número de compatibilidades erróneas y la potencia
de la hibridación se muestran a la derecha. El cuadro ilustra el aspecto. La figura 7-4 presenta un ejemplo real. B) Principios de un arreglo de minise-
cuenciación. Cada célula del arreglo contiene un oligonucleótido compatible con parte de la secuencia blanco. Los oligos se anclan por sus extremos 5 ’ .
Después de la hibridación a la secuencia blanco se usan como cebadores para la extensión de una base aislada, utilizando PTü didesoxi marcados con
color. Una compatibilidad errónea en el extremo 3 ' impide la extensión; las compatibilidades erróneas de una o dos bases desde el extremo proporcio­
nan una reacción débil.
 18.5 RASTREO GENICO 525

18.5.1 El rastreo gènico incluye tres pasos lógicos

Fig. 18-10. Prueba ARMS multiplex para detectar 29 mutaciones de
fibrosis quística.
Cada prueba se estudia con cuatro reacciones de PCR multiplex espe­
cíficas de mutación (A a D). Dentro de un multiplex cada producto es
de un tamaño diferente. Si una de las 29 mutaciones está presente, se
observa una banda extra. La identidad de la mutación es revelada por
la posición de la banda en el gel y el carril que la contiene. Cada tubo
amplifica también dos secuencias testigo -s o n las bandas superior e
inferior en cada carril del gel-; difieren entre los carriles de tal manera
que cada multiplex lleva su patrón característico propio. Obsérvese que
los alelos normales de mutaciones F508del (banda en el carril B) no se
valoran. Las muestras 1, 2 y 3 no exhiben bandas específicas de muta­
ción. En la muestra 4 las bandas extra en los carriles A y D muestran la
presencia de F508del y 1898+1G ->A respectivamente, que indican que
este DNA proviene de un heterocigoto compuesto. Cortesía del doctor
Michelle Coleman, St. Mary’s Hospital, Manchester, Reino Unido; datos
obtenidos mediante el equipo Elucigene™ de Orchid Biosciences.
El recuadro 18-3 ilustra la lógica esencial del rastreo genico. Puede
aplicarse a enfermedades con cualquier modalidad de herencia.
Siempre existe cuando menos un padre que pudo haber pasado el
alelo de la enfermedad al probando y que pudo o no haberlo hecho
en realidad. El proceso siempre sigue los mismos tres pasos:
1. distinguir los dos cromosomas en el (los) padre(s) importante(s),
es decir, encontrar un marcador enlazado de modo cercano pa­
ra el que hay un heterocigoto;
2. determinar la fase, esto es, averiguar el cromosoma que porta el
alelo de enfermedad;
3. estudiar qué cromosoma recibió la persona que consulta.
La figura 18-13 ilustra un rastreo genico para una enfermedad au-
tosómica recesiva. Las genealogías resaltan la necesidad tanto de
una estructura genealógica apropiada (debe disponerse de DNA del
niño afectado) como de tipos de marcador informativo. Aun si el
niño afectado está muerto y es posible obtener la tarjeta Guthrie
(sección 18.2), puede extraerse suficiente DNA para tipificación
mediante PCR de una gota de sangre seca. En la actualidad la in-
formatividad del marcador no es un gran problema. Con más de
10 000 microsatélites altamente polimórficos mapeados en la to­
talidad del genoma humano, siempre debe ser posible encontrar
marcadores informativos que estén situados cerca del locus de en­
fermedad.

35 40 45 50 55 60 65 70 75 80

Fig. 18-11. Uso de la valoración de ligadura de oligonucleótido para estudiar 31 mutaciones de fibrosis quística conocidas.

Después de la PCR multiplex, se realiza una OLA multiplex. Los oligonucleótidos de ligaduras se diseñan de modo que el tamaño y el color del marcado
permitan distinguir los productos para cada mutación y su contraparte normal. Se observa un producto de ligadura del sitio de mutación de empalme
621 + 1g -»t. La persona puede ser un portador o un heterocigoto compuesto con una segunda mutación que no es una de las 31 detectadas por este
equipo. Cortesía del doctor Andrew Wallace, St. M ary’s Hospital, Manchester, Reino Unido; datos obtenidos por medio del equipo de ABI Biosystems.
526 ; CAPÍTULO DIECIOCHO PRUEBAS GENÉTICAS EN INDIVIDUOS Y POBLACIONES
Recuadro 18-2. Dos m étod o s para la g eno tipificación de alto ren dim iento
Pyrosequencing®. Es un método para examinar tiras muy cortas de se­
cuencias adyacentes a un punto de inicio definido. Su principal aplicación
se da en la tipificación de SNR en la que sólo una de dos bases se se­
cuencia. Pyrosequencing emplea una combinación ingeniosa de enzimas
para acoplar la liberación de pirofosfato, que ocurre cuando se añade
dNTP a una cadena de DNA en crecimiento, con la emisión de luz median­
te luciferasa (Fakhrai-Rad y cois., 2002). El método se desarrolló en un
aparato que puede analizar en form a automática 10 000 muestras al día.
Puesto que la producción es cuantitativa, es posible estimar las frecuen­
cias alélicas de un SNP en un análisis aislado de una muestra mancomu­
nada grande.
(DNA)n dNTP
Polimerasa
(DNA)n+1
Luz
18.5.2 La recombinación establece un límite
fundamental en la precisión del rastreo génico
Como el marcador de DNA que se utiliza para el rastreo génico no
es la secuencia que causa la enfermedad, siempre es posible hacer
una predicción errónea si la recombinación separa la enfermedad y
el marcador. La fracción de recombinación, y por consiguiente la
tasa de error, puede estimarse a partir de estudios de familias me­
diante análisis de enlace estándar (cap. 13). Casi en cualquier afec­
ción debe haber una elección adecuada de marcadores que muestren
menos de 1% de recombinación con el locus de enfermedad. Lo an­
terior se deduce de las observaciones que indican que un nucleótido
en 300 es polimórfico y que los locus separados 1 Mb muestran cer­
ca de 1% de recombinación (sección 13.1.5). En condiciones idea­
les se usa un marcador intragénico, por ejemplo, un microsatélite
dentro de un intrón. Más adelante se menciona el problema espe­
cial del punto crítico de recombinación en la distrofia muscular de
Duchenne.
Nunca puede descartarse una recombinación entre el marcador
y la enfermedad, aun en marcadores enlazados de manera muy es­
trecha, pero es posible reducir en forma considerable la tasa de error
si se emplean dos locus marcadores, situados en lados opuestos del
locus de enfermedad. Con estos marcadores de flanqueo o de
puente, una recombinación entre cualquier marcador y la enferme­
dad también producirá un recombinante de marcador con marca­
dor, que puede detectarse (p. ej., III-l, fig. 18-14). Si se observa un
recombinante marcador con marcador en la persona que consulta,
entonces no es factible efectuar una predicción respecto a la heren­
MALDI-TOF MS (del inglés, matrix-assisted láser desorption/lonization ti-
m e-of-flight mass spectrom etry, espectrometría de masa de tiempo de
vuelo de desorción/ionización con láser asistida por matriz). La espectro­
metría de masa (EM) mide la relación masa:carga de iones mediante su
aceleración en un vacío hacia un blanco y programando su vuelo o m i­
diendo qué tan lejos se desvían los iones por un campo magnético
(véase recuadro 19-7 para detalles más am plios). El problema del uso
de EM en el análisis de moléculas grandes com o DNA o proteínas con­
siste en obtener iones de vuelo libre. La técnica de desorción/ionización
con láser asistida por matriz (DILAM) soluciona este problema al incluir
la macromolécula en una mancha pequeña de una sustancia que absor­
be la luz, que luego se vaporiza con un im pulso láser breve (M onforte y
Becker, 1997). El tiempo de vuelo hacia el blanco es proporcional a la
raíz cuadrada de la relación masa:carga.
Si se aplica al DNA, la técnica puede medir la masa hasta de 20 kDa con
una precisión de ±0.3% . La EM puede utilizarse com o una alternativa
mucho más rápida de la electroforesis en gel para medir oligonucleótidos
hasta de 100 nucleótidos de largo. Las aplicaciones típicas incluyen el
análisis de productos de las reacciones de secuenciación de Sanger o la
calibración de microsatélites. Para oligonucleótidos pequeños, la preci­
sión es suficiente para deducir la composición de bases directamente a
partir de la masa exacta. De otro modo los SNP pueden analizarse me­
diante la extensión del cebador utilizando ddNTP de masa marcada. Las
gotas de DNA a analizar pueden arreglarse en una placa y el aparato
ioniza en form a automática cada gota a la vez. Los sistemas actuales
pueden genotipificar decenas de miles de SNP por día y, com o la Pyro-
secuencing, es posible hacer un fondo común de las muestras para me­
dir en form a directa las frecuencias de alelo.
cia de la enfermedad pero cuando menos se evita una predicción
falsa. A condición de que no se observe un recombinante marcador
con marcador, el único riesgo residual es el de recombinantes do­
bles. La verdadera probabilidad de un recombinante doble es muy
baja a causa de interferencia (sección 13.1.3). Por tanto el riesgo de
error por una recombinación inadvertida es mucho más pequeño
que el de una predicción errónea debida a error humano en la ob­
tención y el procesamiento de las muestras de DNA. Tal vez un
riesgo mayor es la heterogeneidad de locus inesperada, de manera
que el locus de enfermedad verdadero en la familia en realidad es
diferente del locus que se rastrea.
18.5.3 Cálculo de los riesgos en el rastreo génico
A diferencia de las pruebas directas de mutación, el rastreo génico
siempre incluye un cálculo. Los factores que deben considerarse en
la estimación del riesgo final comprenden:
► probabilidad de una recombinación enfermedad con marcador
y marcador con marcador;
► incertidumbre, a causa de estructura genealógica imperfecta o
informatividad limitada de los marcadores respecto a quién
transmitió qué alelo marcador a quién (véase fig. 13-5C para
un ejemplo);
► incertidumbre, en cuanto a que alguien en la genealogía porte
un alelo de enfermedad recién mutado (véase fig. 4-8 para un
ejemplo de este problema en la DMD).
Se dispone de dos métodos alternativos para realizar el cálculo.
 18.5 RASTREO GÉNICO 527

A) C)
EcoR I £ c /X I (C G G )n E coR I

Tam año de
m a rc a d o re s "] □ □ 0 x 1 .9
m - mm m
<2.

(C A G )n
n ú m e ro re p e tid o :
86

55 - i
44 - m m
U m b ra l
3 7 _ -‘ ■:■
34
d e a le lo s
n o rm a le s
16 -4
m m ubi sup
m NM

" ,IB I • * ®
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

B)
J = r°
-o

1 2 3 4 5 6 7

10kb
9kb

Fig. 18-12. Diagnóstico de laboratorio de enfermedades por repetición de trinucleótidos. _______________________________________________ ____
A) Enfermedad de Huntington. Un fragmento del gen que contiene la repetición (CAG)n se amplificó mediante PCR y se corrió en un gel de poliacrila­
mida. Las bandas se revelaron mediante tinción argéntica. La escala muestra los números de repeticiones. Los carriles 1, 2, 6 y 10 son de una perso­
na no afectada; los carriles 3 ,4 , 5, 7 y 8 son de un paciente afectado. El carril 5 es un caso de inicio juvenil; su padre (carril 4) tenía 45 repeticiones
pero ella tiene 86. El carril 9 es un feto afectado, que se diagnosticó antes del nacimiento. Cortesía del doctor Alan Dodge, St M ary’s Hospital, Man-
chester, Reino Unido. B) Distrofia miotónica. Southern b lo t de DNA digerido mediante fc o R I. Las bandas de 9 o 10 kb (flechas) son variantes norma­
les. El abuelo paterno tiene cataratas pero ningún otro signo de distrofia miotónica. Su banda de 10 kb parece ser muy ligeramente expandida, pero no
inambigüa en la prueba de este gel únicamente. Su hijo tiene una banda de 10 kb normal y otra expandida en definitiva; ella padece distrofia miotónica
clásica de inicio en el adulto. Su hijo tiene una expansión masiva y la form a congénita grave de la enfermedad. Cortesía del doctor Simón Ramsden,
St M ary's Hospital, Manchester, Reino Unido. C) X frágil. El DNA de X inactivado en una mujer, y de cualquier X que porta la mutación completa, está
metilado. El DNA se digiere con una combinación de EcoRI y la enzima sensible a metilación £c/XI, se somete a Southern blotted e híbrida a 0x1.9 o
una sonda similar. La X en un varón normal (carril 1) y la X normal activa en una mujer (carriles 2, 3, 4, 6) dan un fragmento pequeño (marcado N).
Los alelos premutación no metilados (P) dan una banda un poco más grande en los carriles 4 y 5 (portadores femeninos de premutación) y el carril 7
(un varón transm isor normal). Las secuencias de X metilado (inactivo) no se cortan con Ec/XI y dan una banda mucho más grande (NM), en tanto que
la secuencia plenamente expandida y metilada da una banda dispersa muy grande (F) por mosaicismo somático. Cortesía del doctor Simón Rams-
dem, St M ary’s Hospital, Manchester, Reino Unido.
528 CAPÍTULO DIECIOCHO PRUEBAS GENÉTICAS EN INDIVIDUOS Y POBLACIONES

Cuadro 18-5. Principales mutaciones de talasemia 3 en diferentes paises.

En cada país son frecuentes ciertas mutaciones por una combinación de efectos fundadores y selección que favorece heterocigotos.

Población Mutación Frecuencia (%) Efei

Efecto clínico

Cerdeña Codón 39 (C -T ) 95.7 ß°

Codón 6 (delA) 2.5 ß°
Codón 76 (del C) 0.7 ß°
Intrón 1-110 (G -A ) 0.5 ß+
Intrón 2-745 (C -G ) 0.4 ß+
Grecia Intrón 1-110 (G -A ) 43.7 ß+
Codón 39 (C -T ) 17.4 ß°
Intrón 1-1 (G—A) 13.6 ß°
Intrón 1-6 (T—C) 7.4 ß+
Intrón 2-745 (C -G ) 7.1 ß+
China Codón 41/42 (deiTCTT) 38.6 ß°
Intrón 2-654 (C -T ) 15.7 ß°
Codón 71/72 (insA) 12.4 ß°
- 2 8 (A—G) 11.6 ß+
Codón 17 (A -T ) 10.5 ß°
Paquistán Codón 8/9 (insG) 28.9 ß°
Intrón 1-5 (G—C) 26.4 ß+
619-pb Deleción 23.3 ß+
Intrón 1-1 (G -T ) 8.2 ß°
Codón 41/42 (deiTCTT) 7.9 ß°
Afroamericanos - 2 9 (A -G ) 60.3 ß+
- 8 8 (C -T ) 21.4 ß+
Codón 24 (T—A) 7.9 ß+
Codón 6 (delA) 0.8 ß°
Datos cortesía del doctor J. Oíd, Weatherall Institute of Molecular Medicine, Oxford, Reino Unido.

Cuadro 18-6. Distribución de mutaciones de CFTR en 300 cromosomas FQ en el noroeste de Inglaterra.

Mutación Exón Frecuencia (%) Frecuencia acumulativa (%)

F508del 10 79.9 79.9

G551D 11 2.6 82.5
G542X 11 1.5 84.0
G85E 3 1.5 85.5
N1303K 21 1.2 86.7
621 + 1G -T 4 0.9 87.6
1898+1 G -A 12 0.9 88.5
W1282X 21 0.9 89.4
Q493X 10 0.6 90.0
1154insTC 7 0.6 90.6
3 8 4 9 + 1 0 kb (C -T ) Intrón 19 0.6 91.2
R553X 10 0.3 91.5
V520F 10 0.3 91.8
R117H 4 0.3 92.1
R1283M 20 0.3 92.4
R347P 7 0.3 92.7
E60X 3 0.3 93.0
Desconocido/privado - 7.0 100

Es probable que F508del y otras cuantas mutaciones hasta cierto punto frecuentes sean antiguas y que se diseminaran a través de selección que favore­
ció a heterocigotos; las otras mutaciones quizá sean recientes, raras y muy heterogéneas. FQ es más homogénea en esta población que en la mayor de las
otras. Véase recuadro 16-2 para la nomenclatura de mutaciones. Datos cortesía del doctor Andrew Wallace, St Mary’s Hospital, Manchester, Reino Unido

Recuadro 18-3. Lógica del rastreo génico
Las tres etapas de la investigación de una enfermedad autosómica dominante de inicio tardío fueron, por una razón u otra, pruebas directas de la im po­
sibilidad de mutación.
A) B)
I 0-rO
ii jtr o -o Ô Ò
2-1
III 1 i- r - Q
o 2-1
111-2 (flecha), que está embarazada, desea una prueba presintomática
para demostrar si heredó el alelo de la enfermedad. El primer paso es
indicar aparte los dos cromosomas de su madre. Se encuentra un
marcador, enlazado cercanamente con el locus de enfermedad, para
el que 11-3 es heterocigoto.
A continuación debe establecerse la fase, es decir, indagar el alelo
marcador en 11-3 que está segregándose con el alelo de enfermedad.
1-2 se tipifica para el marcador. 11-3 debe haber heredado el alelo mar­
cador 2 de la madre que por tanto marca su cromosoma no afectado.
Su cromosoma afectado, heredado de su padre muerto, debe ser el
que porta el alelo marcador 1.
Cálculos bayesianos (véase recuadro 18-4)
El teorema de Bayes constituye un método general para combinar
probabilidades dentro de una probabilidad total final. La teoría y el
procedimiento se muestran en el recuadro 18-4 y en la figura 18-15
se presenta un cálculo como ejemplo. En el libro de Bridge (Lectu­
ras adicionales), que los lectores interesados deben consultar, pue­
de encontrarse un grupo muy detallado de cálculos que abarca casi
todas las situaciones concebibles en el diagnóstico con DNA.
Aunque los cálculos bayesianos proporcionan una respuesta rá­
pida en genealogías simples, pueden tornarse muy complicados en
genealogías más complejas. Pocas personas se sienten por completo
seguras de su capacidad para estudiar una genealogía compleja co­
rrectamente, aunque el intento es un ejercicio mental valioso para
seleccionar o elegir los factores que contribuyen al riesgo final. Una
alternativa es utilizar un programa de análisis de enlace.
Empleo de programas de enlace para calcular riesgos
genéticos
A primera vista puede parecer sorprendente que un programa dise­
ñado para calcular calificaciones lod también calcule riesgos gené­
ticos -pero de hecho ambos se relacionan de modo cercano (fig.
18-16)-. Los programas de análisis de enlace son herramientas pa­
ra un propósito general a fin de calcular la posibilidad de una ge­
nealogía con base en ciertos datos y suposiciones. Para calcular la
posibilidad de enlace se calcula la relación:
18.5 RASTREO GÉNICO 529
C)
2-4
2-4
-D 1-3
2-1 2-1
í c h - a
2-3
1-1
1-3
C. La tipificación de III-2 y de su padre permite averiguar el alelo mar­
cador que recibió de la madre. Si ella es 2-1 o 2-3, es una buena
noticia: heredó el alelo 2 marcador de su madre, que es el alelo de
la abuela materna. SI ella tipifica 1-1 o 1-3, las noticias son malas:
heredó el cromosoma del abuelo paterno, que porta el alelo de en­
fermedad.
Obsérvese que lo importante es el patrón de segregación en la familia
y no el genotipo marcador actual: si III-2 tiene el mism o genotipo mar­
cador, 2-1, que su madre afectada, son buenas y no malas noticias pa­
ra ella.
posibilidad de datosIenlace, fracción de recombinación 8
posibilidad de datos |sin enlace (0 = 0.5)
Con objeto de estimar el riesgo de que un probando porte un gen
de enfermedad, se calcula la relación:
posibilidad de datos |el probando es un portador, fracción de recombinación 0
posibilidad de datos |el probando no es un portador, fracción de recombinación 0
Como en el recuadro 18-4, la línea vertical |significa “supóngase”.
18.5.4 Problemas especiales en la distrofia muscular
de Duchenne
La distrofia de Duchenne implica una gama muy amplia de proble­
mas para el laboratorio de diagnóstico. Por fortuna dos tercios de
las mutaciones son deleciones, que son fáciles de identificar en va­
rones (fig. 18-7) aunque muy desafiantes en mujeres. Es difícil pre­
cisar las duplicaciones en ambos sexos y sin duda se diagnostican
menos. Treinta a 35% de mutaciones en punto implica problemas
importantes. Explorar un gen tan grande (2.4 Mb,79 exones) para
mutaciones de punto es una posibilidad atemorizante y por esta ra­
zón a menudo se utiliza el rastreo génico. Sin embargo, la DMD
presenta problemas especiales para el rastreo génico porque la fre­
cuencia de recombinación es extremo alta a través del gen. Aun los
marcadores intragénicos muestran 5% en promedio de recombina­
ción con la enfermedad. Por consiguiente resulta prudente usar
marcadores de flanqueo, como en la figura 18-14.
530 CAPÍTULO DIECIOCHO PRUEBAS GENÉTICAS EN INDIVIDUOS Y POBLACIONES

A) B)

C) D)

2-1

2-2
-o2-1
50% de posibilidad de homocigoto normal

1-1: homocigoto normal (error =8 2)

2-1: portador (error = 20)
2-2: afectado (error = 4 6)

Fig. 18-13. Rastreo génico para el diagnóstico prenatal de una enfermedad autosómica recesiva.
Cuatro familias tienen un niño afectado con una enfermedad recesiva. El estudio directo de la mutación no es posible (sea porque no se clonó el gen o
porque no fue factible encontrar las mutaciones). A) No se puede establecer un diagnóstico si no se cuenta con una muestra del niño afectado. B) Si to­
das las personas tienen el mismo genotipo heterocigoto para el marcador, el resultado no tiene utilidad clínica. C) Si los padres son homocigotos para el
marcador, no puede hacerse predicción alguna con este marcador. D) Predicción exitosa. Las tasas de error que se muestran son ei riesgo de predecir
un embarazo no afectado cuando el feto está afectado, o viceversa, si el marcador empleado muestra una fracción de recombinación theta (6) con el
locus de enfermedad. Estos ejemplos resaltan la necesidad tanto de una estructura genealógica apropiada (debe disponerse de DNA del niño afectado)
como de tipos de marcador informativos.

Los problemas no terminan ahí. Se observa una frecuencia alta

de mutaciones nuevas. Los cálculos de equilibrio de selección-mu­
tación del recuadro 4-7 muestran que para cualquier padecimiento
recesivo mortal ligado a X (f = 0), un tercio corresponde a mutacio­
nes nuevas. En consecuencia la madre de un niño aislado con
DMD sólo tiene dos de tres posibilidades de ser portadora. Esto
tiene dos consecuencias desafortunadas:
► complica mucho los cálculos del riesgo que son necesarios pa­
ra interpretar los resultados del rastreo génico. El lector intere­
sado debe consultar la obra de Bridge (Lecturas adicionales)
para ejemplo de los cálculos;
► como se muestra en la figura 4-8, el primer portador de una
mutación en una genealogía de DMD suele ser un mosaico
(varón o mujer). Esto origina inclusive más problemas tanto
para estimar el riesgo como para interpretar los resultados de
A :5 A : 5-1
las pruebas directas. B :6 B : 3-7
Estos factores, aunados a un curso clínico en particular inquietan­
te de la enfermedad, el riesgo de recurrencia elevado en familias y
la frecuencia alta de DMD en la población significan que la DMD
quizás aún sea la más difícil de todas las enfermedades para quienes Fig. 18-14. Rastreo génico en la distrofia muscular de Duchenne
proporcionan servicios genéticos. mediante marcadores de flanqueo.
La familia se tipificó para dos polim orfism os A y B que flanquean el lo­
cus de distrofina. III-2 puede heredar DMD sólo si ella tiene una recom­
1 8 .6 Selección de población binación entre el marcador A y DMD, y otra entre DMD y el marcador
B. Si las fracciones de recombinación son eA y eB respectivamente,
La selección de población se deriva de manera natural de la capaci­
entonces la probabilidad de un recombinante doble es del orden de
dad para estudiar en forma directa la presencia de una mutación.
eAeB, que por lo general estará bastante abajo de 1%. 111-1 tiene una re­
Por tradición se establece una distinción entre selección y diagnós­
combinación entre el locus marcador A y DMD.
tico. Una prueba de selección define un grupo de riesgo alto, que

después se somete a una prueba diagnóstica definitiva. Las pruebas
de DNA son muy distintas porque no hay una selección separada
ni pruebas diagnósticas. Sin embargo, las propuestas para introdu­
cir cualquier prueba de selección en la población deben satisfacer
los mismos criterios (cuadro 18-7), sin considerar la tecnología em­
pleada.
18.6.1 Los programas de selección aceptables deben
ajustarse a ciertos criterios
¿Qué logrará la selección?
La función aislada más importante de cualquier programa de selec­
ción es proveer cierto resultado final útil. Es bastante inaceptable in­
dicar de modo inesperado a las personas que tienen el riesgo de algo
desagradable a menos que ese conocimiento les permita realizar al­
go respecto al riesgo. Las propuestas para seleccionar genes que con­
fieren susceptibilidad a cáncer de mama o ataques cardiacos deben
estimarse con rigidez contra este criterio. Las pruebas de predicción
para enfermedad de Huntington podrían aparentar que rompen es­
ta regla -pero sólo se ofrecen a personas que se sabe que tienen un
riesgo alto de HD y que experimentan tal angustia por la incerti-
dumbre que solicitan una prueba de predicción y a pesar de la ase­
soría insisten en que se les indiquen todas las desventajas-.
Como ideal el resultado final útil es el tratamiento, como en
la selección prenatal para fenilcetonuria. El incremento de la vi­
gilancia médica sólo es un resultado final útil si mejora de mane­
ra considerable el pronóstico. Uno de los mayores riesgos de la
selección muy entusiasta es que puede transformar a una persona
sana en una enferma. Un caso especial es la selección para estado
de portador, en la que el resultado final es la posibilidad de evitar
el nacimiento de un niño afectado. Las personas que no desean
aceptar el diagnóstico prenatal y la terminación de embarazos
afectados no considerarían lo anterior un resultado final útil y en
general no deben seleccionarse, aunque algunas parejas valoran el
hecho de saberlo.
Recuadro 18-4. Uso del teorem a de B ayes para co m b in ar p robabilidades
Una exposición formal del teorema de Bayes es:
P(H i|E) = P (H i).P (E |H i)/I[P (H i).P (E |H ¡)]
P(H¡) significa la probabilidad de la iava hipótesis y la línea vertical, “ su­
póngase", de tal manera que P(E | Hi) significa la probabilidad de la evi­
dencia (E), con base en la hipótesis Hi. Es probable que un ejemplo aclare
lo anterior. Los pasos para realizar un cálculo bayesiano son:
a) establecer un cuadro con una columna para cada una de las hipóte­
sis alternativas. Incluir todas las alternativas;
b) asignar una probabilidad previa a cada alternativa. Las probabilida­
des previas de todas las hipótesis deben sumar uno. En esta etapa no
es importante preocuparse por la información exacta a utilizar para
decidir la probabilidad previa, en tanto sea compatible a través de las
columnas. No se estará usando toda la información (de otra manera
no tendría caso efectuar el cálculo porque ya se contada con la res­
puesta) y cualquier información no empleada en la probabilidad pre­
via puede usarse después;
c) con un ítem de la información no incluido en las probabilidades pre­
vias, calcular una probabilidad condicional para cada hipótesis. Pro­
18.6 SELECCIÓN DE POBLACIÓN j 531
Un marco estructural ético para selección
Un comité de distinguidos genetistas, clínicos, abogados y teólogos
estadounidenses discutió los problemas éticos de la selección gené­
tica de la población y se refiere el lector a su informe para encon­
trar un estudio muy detallado (Andrew y cois., 1994). Aunque en la
naturaleza de los problemas éticos no existen soluciones, emergen
ciertos principios:
► Cualquier programa debe ser voluntario y los sujetos tienen
que tomar la decisión de optar ingresar en él.
► Los programas deben respetar la autonomía y la privacidad del
sujeto.
► No debe presionarse a la persona que califica positiva en la
prueba para que tome ningún curso de acción particular. Por
ejemplo, en países con sistemas de cuidados de la salud basados
en seguros no sería aceptable que las compañías de seguros pre­
sionaran a las parejas portadoras para que acepten un diagnós­
tico prenatal y terminen embarazos afectados.
► La información ha de ser confidencial. Aunque esto parecería
obvio, puede ser un problema difícil -a todas las personas les
gustaría pensar que quienes conducen camiones pesados o jets
jumbo se les hicieron pruebas para todos los posibles riesgos-.
Las sociedades con sistemas de cuidados de la salud basados en
seguros tienen problemas particulares respecto a la confiden­
cialidad de los datos genéticos porque las compañías de segu­
ros argumentarían que penalizan a personas con riesgo bajo al
no cargar las primas a personas de riesgo alto.
18.6.2 La especificidad y la sensibilidad miden el
desempeño técnico de una prueba de selección
Los problemas técnicos en la selección de poblaciones son muy
simples en comparación con los problemas éticos. El desempeño de
una prueba puede medirse por su sensibilidad, especificidad y va­
lor de predicción positiva (fig. 18-17).
babilidad condicional es la probabilidad de la información, con base
en la hipótesis, es decir P(E | Hi) [no la probabilidad de que la hipóte­
sis brinde la información, P(Hi| E)]. Las probabilidades condicionales
para las diferentes hipótesis no siempre suman uno;
d) si hay más puntos de información que aún no se incluyeron, el paso
(c) se repite tantas veces com o sea necesario hasta que se emplee
toda la información una vez y sólo una. El resultado final es un núme­
ro de líneas de probabilidades condicionales en cada columna;
e) dentro de cada columna, multiplicar entre sí la prioridad y todas las
probabilidades condicionales. Esto proporciona una probabilidad de
unión, P(Hi), P(E|HÍ). Las probabilidades de unión no necesariamen­
te suman uno a través de las columnas;
f) sí sólo hay dos columnas, las probabilidades de unión pueden usar­
se de modo directo como razones de posibilidades. De otro manera
las probabilidades de unión pueden incrementarse para obtener las
probabilidades finales que suman uno. Ello se realiza mediante la di­
visión de cada probabilidad de unión por la suma de todas las proba­
bilidades de unión, I (P(Hi).P(E j Hi)].
532 CAPÍTULO DIECIOCHO PRUEBAS GENÉTICAS EN INDIVIDUOS Y POBLACIONES

Valor predictivo de una prueba

Tal vez de manera inesperada, los resultados positivos falsos de una
prueba pueden implicar un problema más importante que los ne­
gativos falsos. Aun si es posible eliminarlos después mediante una
prueba diagnóstica, muchas personas se habrán preocupado de mo­
do innecesario por resultados positivos falsos. El cuadro 18-8 mues­
tra que si una prueba tiene una tasa importante de positivas falsas,
entonces el valor de predicción es demasiado bajo excepto cuando
se estudian padecimientos muy frecuentes. En este sentido las prue­
bas de DNA pueden Ser muy adecuadas para la selección de pobla­
ción porque, en comparación con las pruebas bioquímicas que
utilizan umbrales arbitrarios, deben arrojar muy pocos positivos
falsos.

Hipótesis: lll2 es Un portador No es portador

Sensibilidad de una prueba
Probabilidad previa 1/2 1/2 Una prueba debe captar una proporción razonable de su blanco
pretendido (es decir, la sensibilidad debe ser alta). Si bien el va­
Condicional (1): resultado del DNA 0.05 0.95
lor predictivo de las pruebas de DNA parece alentador, la sensi­
Condicional (2): datos de CK 0.7 1 bilidad suele depender del grado de heterogeneidad alélica. A
menos que una enfermedad muestre una homogeneidad ex­
Probabilidad de unión 0.0175 0.475
traordinaria (cuadro 18-4), no resulta práctico hacer pruebas
Probabilidad final 0.0175/0.4925 0.475/0.4925 para toda mutación concebible, en especial en un programa de
= 0.036 = 0.964 selección de población de rendimiento grande. Por lo general
sólo se estudiará un subgrupo de mutaciones. La figura 18-18
ilustra la forma en que la elección de las mutaciones puede afec­
tar el resultado final de un programa de selección de portador
Fig. 18-15. Un cálculo bayesiano del riesgo genético. de fibrosis quística (FQ).
III-2 desea conocer su riesgo de ser un portador de DMD, que afectó a Es claro que el solo estudio de la mutación más común F508del
su hermano 111-1 y a su tío 11-1. La prueba de cinasa de creatinina séri­ no producirá un programa aceptable. Más niños afectados nacerían
ca (un indicador de daño muscular subclínico frecuente en portadores de parejas negativas en el programa de selección de los que se de­
de DMD) dio razones de posibilidades de portador:no portador de tectarían por la selección. Sea o no que este programa resulte eficaz
0.7:1. Un marcador de DNA que muestra un promedio de 5% de re­ para el costo en términos financieros, con toda seguridad sería ina­
combinación con DMD dio los tipos que se muestran. Este cálculo del ceptable desde el punto de vista social. Es difícil definir lo que
riesgo, según los lineamientos que se incluyen en el recuadro 18-4, constituye un programa aceptable. Una sugerencia se enfoca en pa­
proporciona el riesgo global de portador de la paciente de 3.6%. rejas ” (esto es, parejas con un portador conocido y el com­
pañero negativo en todas las pruebas). El compañero aún podría ser
un portador de una mutación rara. Ten Kate sugirió que un progra­
ma de selección aceptable es aquél en el que el riesgo de estas pare­
jas +/— no es más alto que el de la población general antes de la
selección. La selección para FQ de europeos del norte requeriría
una sensibilidad aproximada de 95%.

18.6.3 Organización de un programa de selección

genética
Si se asume que el programa propuesto parece aceptable desde el
punto de vista ético y eficaz para el costo, ¿a quién debe seleccio­
narse? Tres ejemplos destacan algunas de las opciones.

Selección neonatal: selección para fenilcetonuria

Fig. 18-16. Empleo de programas de análisis de enlace para calcu­
lar riegos genéticos.
Con base en la información de cualquiera de dos de estos sujetos,
el programa puede calcular el tercero. Para análisis de enlace, se
proporciona al programa A) y B) y se calcula C). Para calcular riesgos
genéticos, se proporciona al programa B) y C) y se calcula A).
Todos los niños del Reino Unido se someten a pruebas para fenil-
cetonuria unos cuantos días después del nacimiento. Una gota de
sangre de una punción en el talón se reúne en una tarjeta (la tarje­
ta Guthrie) durante una visita a la casa y se envía a un laboratonc
central. El valor sanguíneo de fenilalanina se mide mediante cro­
matografía o por una prueba de crecimiento bacteriano. Ésta es k
prueba de selección. Los niños cuyo valor excede un umbral so"
 18.7 EL PERFIL DE DNA PUEDE UTILIZARSE PARA IDENTIFICAR INDIVIDUOS Y DETERMINAR RELACIONES 533

Cuadro 18-7. Requerimientos para un programa de selección de población.

Requerimiento Ejemplos y comentarios

Un resultado positivo debe conducir a alguna acción útil ► Tratamiento preventivo; por ejemplo, dieta especial para FCU

► Revisión y elección de opciones de reproducción en la selección de portador para FQ

El programa completo debe ser aceptable desde los puntos ► Los sujetos deben optar con consentimiento informado
de vista social y ético
► La selección sin asesoría es inaceptable

► No debe haber presión para terminar embarazos afectados

► La selección no debe considerarse discriminadora

La prueba ha de tener sensibilidad y especificidad altas ► Las pruebas con muchas negativas falsas reducen la confianza en el programa

► Las pruebas con muchas positivas falsas, aun si después se eliminan mediante una
prueba diagnóstica definitiva, pueden crear valores inaceptablemente altos de ansiedad
en personas normales

Los beneficios del programa tienen que superar sus costos ► No es ético utilizar en forma ineficiente presupuestos para cuidados de la salud limitados

llamados para una prueba diagnóstica definitiva. Por último resul­
ta que sólo una proporción pequeña tiene fenilcetonuria. El bene­
ficio que reciben los recién nacidos con el tratamiento dietético
justifica la falta de consentimiento informado (Smith, 1993).
Selección prenatal: selección para talasemia 3
Las pruebas hematológicas convencionales, ya sea antes del matri­
monio o en la clínica antenatal, permiten a los portadores de tala­
semia |3. A las parejas de portador con portador puede ofrecérseles
diagnóstico prenatal mediante análisis del DNA. En el Reino Uni­
do dos grupos étnicos tienen una incidencia alta de talasemia: los
chipriotas y los paquistaníes. Aunque los chipriotas aceptaron con
rapidez la selección, la aceptación ha sido más lenta entre paquista­
níes. La comparación ilustra los complejos problemas sociales que
rodean la selección genética y la importancia del antecedente
cultural (Gilí y Modell, 1998). Como hecho importante, estu­
dios a largo plazo de la comunidad chipriota muestran cómo es
posible medir el éxito de la selección no por las cuentas de fetos
afectados abortados, sino por el número de parejas que tienen fa­
milias normales. Antes de contar con una selección muchas pa­
rejas chipriotas portadoras optaban por no tener niños; ahora
utilizan la selección y tienen familias normales (Modell y cois.,
1984). Es posible que algún día el diagnóstico preimplantación
o los trasplantes de células madre fetales se constituyan en alter­
nativas a la terminación de embarazos afectados cuando menos
para las personas adineradas en países ricos.
Selección de población para portadores: propuestas para
fibrosis quística
En la actualidad es técnicamente factible y merece la pena desde el
punto de vista económico someter a selección a poblaciones del
norte de Europa para detectar portadores de fibrosis quística (FQ).
Las encuestas en el Reino Unido sugieren que la mayor parte de las
parejas de portador con portador optaría por el diagnóstico prena­
tal y valoraría la oportunidad de asegurarse que no tendrán niños
afectados. Este concepto podría cambiar si el tratamiento se torna­
ra más eficaz, por ejemplo, mediante la terapéutica génica.
Si se piensa introducir un programa de selección es necesario
considerar dos grupos de preguntas: ¿cuántas mutaciones debe es­
tudiar el laboratorio? y ¿a quién debe ofrecerse la prueba? El pro­
blema originado por la heterogeneidad alélica ya se comentó (véase
fig. 18-18). En cuanto a quiénes deben seleccionarse, el cuadro 18-9
muestra algunas posibilidades que se consideran en el Reino Uni­
do. La forma de organización del suministro de cuidados de la sa­
lud en cada país determinará de manera natural los límites de las
posibilidades. Resultados preliminares de estudios piloto controla­
dos sugieren que ninguno de los métodos tuvo los efectos negati­
vos (aumento de ansiedad) que se predijeron en ocasiones.
18.7 El perfil de DNA puede utilizarse
para id en tificar individuos y
d eterm in ar relaciones
El término p e r fil d e DNA se refiere al uso general de pruebas de
DNA con el fin de establecer identidad o relaciones. La huella
de DNA se reserva para la técnica inventada por Jeffreys y cois.
(1985) que emplea sondas para múltiples locus. Para mayores
detalles respecto a esta área total, el lector debe consultar el li­
bro de Evett y Weir (1998; véase Lecturas adicionales).
No
A fectad o a fe c ta d 0
+ve en la a b
p ru e b a
-v e en la
p ru eb a c d
S ensib ilid ad d e la p ru e b a = a /(a + c)
E specificidad d e la p ru e b a = d /(b + d)
Valor d e p red icció n po sitiva = a /(a + b)
Fig. 18-17. Sensibilidad y especificidad de una prueba de selección.
534 CAPÍTULO DIECIOCHO PRUEBAS GENÉTICAS EN INDIVIDUOS Y POBLACIONES

Cuadro 18-8. Una prueba que se conduce bien en el laboratorio puede ser inútil para seleccionar población.
Prevalencia del Positivas verdaderas Positivas verdaderas Negativas verdaderas Positivas falsas Valor predictivo
padecimiento en la población detectadas en la población detectadas de la prueba
seleccionada mediante selección seleccionada mediante selección

1/1 000 1 000 990 999 000 9 990 0.09

1/10 000 100 99 999 900 9 999 0.0098

1/100 000 10 10 999 990 10 000 0.001

En un estudio de laboratorio de un grupo de 100 afectados y 100 personas testigo esta prueba hipotética fue 99% precisa: arrojó un resultado positivo
para 99% de positivos verdaderos y uno negativo para 99% de negativos verdaderos. El cuadro muestra los resultados de la selección de un millón de
personas. La vasta mayoría de las personas positivas en la prueba la conforman positivas falsas. Es improbable que esta prueba sea socialmente acep­
table o económicamente viable para ninguna enfermedad mendeiiana (ésta suele afectar a menos de una persona en mil).

18.7.1 Para el perfil suele emplearse una diversidad de
polimorfismos de DNA diferentes
Huella de DNA mediante sondas minisatélite
Estas sondas contienen la secuencia central común de una secuen­
cia repetida esparcida hipervariable GGGCAGGAXG descubierta
por Jeffreys y colaboradores (1985) en el gen de mioglobina. La se­
cuencia se encuentra en muchos minisatélites esparcidos en el ge-
noma en cada uno de los cuales el número de repeticiones tándem
varía entre los individuos. Cuando se hibridan a Southern blots, las
sondas proporcionan una huella de bandas específica del individuo
(fig. 18-19). La huella de DNA revolucionó la práctica forense, pe­
ro en la actualidad es obsoleta a causa de dos problemas:
► el procedimiento Southern blot requiere varios microgramos
de DNA, que corresponden al contenido de tal vez un mi­
llón de células; ■
► no es posible indicar qué pares de bandas en una huella repre­
sentan alelos. Por consiguiente, cuando compara dos huellas de
DNA, el investigador equipara cada banda en forma individual
mediante la posición y la intensidad. La distancia continua­
mente variable a lo largo del gel tiene que dividirse en varias
“secciones”. Las bandas que se encuentran dentro de la misma
sección se consideran compatibles. A continuación, por ejem­
plo, si son 10/10 bandas compatibles, las razones de posibili­
dades de que el sospechoso sea la fuente de la muestra, en lugar
de una persona aleatoria de la población, son 1:pu>, donde p es
la posibilidad de que una banda de una persona aleatoria sea
compatible con una banda determinada (se simplificó al asu­
mir que p es la misma para cada sector e ignorando la necesi­
dad de compatibilidad tanto en la intensidad como en la
posición). Inclusive para p = 0.2, p1 sólo es 10 1. Es imperati­
vo usar los mismos criterios de secciones para juzgar la compa­
tibilidad entre dos perfiles y a fin de calcular p. Los criterios
pueden ser arbitrarios dentro de ciertos límites, pero deben ser
consistentes.
Perfil de DNA mediante marcadores microsatélites
En el perfil de locus único se emplean polimorfismos microsatéli­
tes (sección 9.4.3), por lo general repeticiones de trinucleótidos o
tetranucleótidos que pueden tipificarse mediante PCR. En teoría es
posible tipificar aun una célula aislada que quedó en la escena de
un crimen. Los alelos pueden definirse sin ambigüedad por el nú­
mero de repeticiones precisas, lo que evita el problema de las sec­
ciones. El conocimiento de la frecuencia génica de cada alelo en la
población permite realizar un cálculo exacto de la probabilidad de
paternidad, de que el sospechoso no sea el violador, etc. Los geno­
tipos combinados en 10 a 15 locus muy polimórficos no enlazados
suelen mostrar la suficiente singularidad para que sean definitivos
de una manera u otra. Variaciones menores (VAM) dentro de uni­
dades repetidas de algunos microsatélites hacen posible discriminar
una variedad casi infinita de alelos, de modo que los genotipos en
un locus aislado bastarían para identificar a un individuo (Jeffreys
y col., 1991), pero el método de “tipificación de VAM” aún es un
estudio de investigación.
Uso del cromosoma Y y polimorfismos mitocondriales
El cromosoma Y y los polimorfismos de DNA mitocondrial son en
especial útiles para rastrear relaciones con personas muertas porque
en cada caso un individuo hereda el genotipo completo de un an­
cestro aislado definible. Un ejemplo interesante fue la identifica­
ción de los restos del zar de Rusia y su familia, asesinados por los
bolcheviques en 1917, mediante la comparación de perfiles de
DNA de restos exhumados con familiares distantes vivos (Gilí y
cois., 1994).
18.7.2 El perfil de DNA puede usarse para determinar la
cigosidad de gemelos
En el estudio de caracteres no mendelianos (cap. 15), y en ocasio­
nes en asesoría genética, es importante saber si un par de gemelos
es monocigótico (MC, idéntico) o dicigótico (DC, fraterno). Los
métodos tradicionales dependen de la valoración de la semejanza
fenotípica o del estado de las membranas al nacer (los gemelos con­
tenidos en un corion siempre son MC, aunque lo contrario no es
cierto). Los errores en la determinación de la cigosidad incrementan
en forma sistemática las estimaciones de heredabilidad de caracte­
res no mendelianos, porque gemelos DC muy similares se consideran
de modo erróneo como MC, en tanto que gemelos MC muy dife­
rentes se califican en forma equivocada como DC.
Los marcadores genéticos proporcionan una prueba de cigosi­
dad mucho más segura. Race y Sanger (véase Lecturas adicionales
resumieron la bibliografía extensa, pero hoy en día obsoleta, refe­
rente al uso de grupos sanguíneos para este propósito. El perfil de
DNA es ahora el método de elección. La sonda de huella de Jeffreys
18.7 | EL PERFIL DE DNA PUEDE UTILIZARSE PARA IDENTIFICAR INDIVIDUOS Y DETERMINAR RELACIONES 1 535

10 000 personas seleccionadas

Fig. 18-18. Carta de flujo para la selección de población de fibrosis quística (FQ).
Resultados de la selección de 10 000 personas, 1:23 de las cuales es un portador. Si una persona tiene una prueba positiva, a continuación se estudia
a su cónyuge. Las figuras en negro muestran los resultados del empleo de una prueba que detecta 70% de las mutaciones de FQ (es decir, prueba para
F508del solamente); las figuras en rojo indican los resultados de una prueba con 90% de sensibilidad. Los cuadros de color rosa representan casos que
podrían considerarse éxitos para el programa de selección (sin considerar la acción que tomen después), los cuadros grises representan fracasos. OPN,
diagnóstico prenatal.

Cuadro 18-9. Posibles formas de organizar la selección de población para portadores de fibrosis quística (F Q ).
Grupo estudiado Ventajas Desventajas

Recién nacidos ► Se organiza con facilidad ► Sin consecuencias durante 20 años

► Muchas familias olvidarían el resultado
► No es ético estudiar a niños

Quienes salen de la escuela ► Se organiza con facilidad ► Dificultad para llevarla a cabo éticamente
► Informar a las personas antes que inicien relaciones ► Riesgo de estigmatización de portadores

Parejas de listas de médicos ► La pareja es una unidad de riesgo ► Dificultad para controlar la calidad de la asesoría
► Resaltar la función de los médicos
en la medicina preventiva
► Permitir tiempo para tom ar decisiones

Mujeres en clínicas antenatales ► Se organiza con facilidad ► Efecto de bomba para portadores
► Resultados rápidos ► Quizá no se disponga del compañero
► Presión de tiempo en el laboratorio

Voluntarios adultos ► Pocos problemas éticos ► Mala estructura para asesoría

(“ centro de FQ para quienes pasan” ) ► No dirigida a los que la utilizan apropiadamente
► ¿Uso ineficiente de recursos?
536 CAPÍTULO DIECIOCHO PRUEBAS GENÉTICAS EN INDIVIDUOS Y POBLACIONES

brinda una impresión inmediata: las muestras de gemelos MC se

ven como la misma muestra cargada dos veces y los especímenes de
A) B) O
gemelos DC muestran diferencias. Cuando se utilizan marcadores
O
de locus único, si los gemelos dan los mismos tipos, entonces se M C F1 F2
til
o
X

calcula la probabilidad para cada locus de que los gemelos DC ten­

gan el mismo tipo. Si se tipificaron los padres, se siguen los princi­ O
•w
pios mendelianos; de otra manera debe calcularse la probabilidad O a
co I 1
de que la tipificación de gemelos DC sea la misma para cada posi­ > LLi T- CM rt
ble pareamiento parental y sopesarse con la probabilidad de ese pa-
reamiento calculado a partir de frecuencias génicas en la población.
mS
Las probabilidades resultantes (no enlazadas) para cada locus se
multiplican a fin de proporcionar una probabilidad total P[ de que
los gemelos DC darían los mismos resultados con todos los marca­
dores empleados. La probabilidad de que los gemelos sean MC es
entonces:
Pm = m i [m + ( l - m ^ ! ]
Í * 5
en la que m es la proporción de gemelos en la población que son
MC (alrededor de 0.4 para pares de sexo igual). El apéndice 4 de Vo-
gel y Motulsky (Lecturas adicionales) presenta cálculos de muestra.

18.7.3 El perfil de DNA puede emplearse para descartar

o establecer la paternidad
Excluir la paternidad es muy simple: si el niño tiene un alelo mar­
cador que no se encuentra en la madre ni en el supuesto padre en­
tonces, excluyendo nuevas mutaciones, el presunto padre no es el
biológico. Demostrar la paternidad es imposible en principio -nun-
ca será factible demostrar que no existe otro hombre en el mundo
que pudiera haber dado al niño ese grupo particular de alelos mar­
cadores—.Todo lo que puede hacerse es establecer una probabilidad
de no paternidad que es lo bastante baja para satisfacer a las cortes
y tal vez al posible padre.
Para este propósito suelen utilizarse con amplitud sondas de Fig. 18-19. Usos legal y forense de la huella de DNA.
huella de DNA (fig. 18-19). Como se explicó, las bandas deben
seccionarse según un esquema arbitrario pero consistente con obje­ La huella de DNA revolucionó la práctica forense, aunque ahora ha sido
to de decidir si cada banda no materna en el niño se ajustó o no a superada por el perfil mediante polim orfism os de locus único múltiple.
una banda en el supuesto padre. Los microsatélites de locus único A) Una prueba de paternidad. Se muestran las huellas de la madre (M),
permiten un cálculo más explícito de las razones de posibilidades el niño (C) y dos posibles padres (F1, F2). La huella de DNA de F1
(fig. 18-20). Una serie de 10 marcadores de locus único muy poli- contiene todas las bandas paternas que se encuentran en el niño, en
mórficos no relacionados arroja razones de posibilidades abruma­ tanto que F2 sólo tiene una de las bandas paternas. B) Un caso de vio­
doras que favorecen la paternidad si todas las bandas corresponden. lación. La huella del sospechoso 1 es compatible a la perfección con
la muestra del semen 1 en un frotis vaginal de la victima. Como resul­
tado de esta prueba se hicieron cargos al sospechoso 1 de violación y
18.7.4 El perfil del DNA es un medio potente para las se le encontró culpable. Fotografía cortesía de Cellmark Diagnostics,
investigaciones forenses Abingdon, Oxfordshire, Reino Unido.

El perfil del DNA para propósitos forenses sigue los mismos prin­
cipios de las pruebas de paternidad. Materiales hallados en la esce­
na del crimen (manchas de sangre, cabellos o un frotis vaginal de
una víctima de violación) se tipifican y comparan con una muestra
de DNA del sospechoso. Una de las aplicaciones más potentes del
perfil de DNA es evitar abusos de la justicia al demostrar que un
sospechoso no es el criminal. Si las muestras no corresponden, el sos­
pechoso se descarta sin considerar cualquier prueba circunstancial
que indique lo contrario.
Cuando todos los genotipos corresponden, la corte necesita sa­
ber la razón de posibilidades de que el criminal sea el sospechoso en
lugar de un miembro al azar de la población. Por supuesto las razo­
nes de posibilidades serían muy distintas si la alternativa fuera el
hermano o el gemelo idéntico de un sospechoso. El destino de la
prueba de DNA en las cortes brinda información fascinante respec­
to a la diferencia entre las culturas científica y legal. Supóngase que
el perfil de DNA de un sospechoso es compatible con la muestra
de la escena del crimen. Aún existen cuando menos tres obstáculos
para el uso racional de los datos del DNA:
► El jurado puede no creer, o tal vez elegir ignorar, los datos del
DNA, como sucedió en el juicio de O. ]. Simpson [véase Weir
(1995) para un relato fascinante de este caso]. Quizá decidan
que el DNA incriminador se plantó.
► Un abogado inescrupuloso puede intentar llevar al jurado ha­
cia un argumento de falsa probabilidad, la llamada falacia del
fiscal. Ésta consiste en confundir la probabilidad de que el sos-

_______ _______ I I Padre
I— I supu esto
Ai A 2 A3 A4
A 1A 3
Fig. 18-20. Empleo de marcadores de locus único para una prueba
de paternidad.
Las razones de posibilidades de que el supuesto padre, en lugar de un
miembro aleatorio de la población, sea el verdadero son 1 / 2:q3, donde
q3 es la frecuencia génica de A3. Se utilizaría una serie de n marcado­
res no enlazados y si no se excluyera la paternidad, las razones de po­
sibilidades serían (1/2)n:qA.qB.qc...qN.
pechoso sea inocente, a partir de la compatibilidad, con la pro­
babilidad de un compatible, lo que conduce a considerar que
el sospechoso es inocente. El jurado debe tomar en cuenta la
primera probabilidad y no la segunda. Como se muestra en el
recuadro 18-5, las dos son muy diferentes.
► Pueden surgir objeciones respecto a algunos de los principios
con los que se calcularon las probabilidades basadas en DNA:
a) el principio multiplicativo, de que las probabilidades totales
puedan obtenerse al multiplicar las probabilidades indivi­
Recuadro 18-5. La falacia del fiscal
El perfil de DNA del sospechoso es compatible con una muestra de la es­
cena del crimen. ¿Esto lo hace culpable? Considérense dos probabilida­
des distintas:
► la probabilidad de que el sospechoso sea inocente, con base en la
compatibilidad;
► la probabilidad de una compatibilidad, tomando en cuenta que el sos­
pechoso es inocente.
A partir de la notación bayesiana (recuadro 18-4) con M = compatible,
G = el sospechoso es culpable, I = el sospechoso es ¡nocente, la prime­
ra probabilidad es Pt |M , y la segunda es PM|I. La falacia del fiscal con­
siste en argumentar que la probabilidad importante es PM|I cuando de
hecho es P||M . El cálculo siguiente muestra qué tan diferentes son estas
dos probabilidades.
Si el sospechoso fuera culpable, las muestras necesariamente serían
compatibles: PM | G = 1. Supóngase que los argumentos genéticos de
población dicen que hay una posibilidad de 1 en 10 6 de que una perso­
na seleccionada de modo aleatorio tenga el m ism o perfil que la mues­
tra del crimen: PM|I = 1 0 “ 6. Asúmase que la persona culpable pudo
haber sido uno de 107 varones en la población. Si no existe alguna otra
Lecturas adicionales
B rid g e PJ (1997) The Calculation of Genetic Risks - Worked Exam­
ples in DNA Diagnostics, 2nd Edn. Johns Hopkins University
Press, Baltimore, MD.
C lin ic a l M o le c u la r G e n e tic s S o c ie ty Best Practice Guidelines for
Molecular Genetics Services, http://www.cmgs.org
BIBLIOGRAFÍA 537
duales para cada alelo o locus, depende de la suposición de
que los genotipos son independientes. El cálculo sería erró­
neo si en realidad la población consistiera en grupos de
reproducción aislados, cada uno de los cuales tuviera geno­
tipos que fueran muy constantes dentro de un grupo pero
muy diferentes entre grupos. Este hecho es importante por­
que el principio multiplicativo es el que permite establecer
estas posibilidades excesivamente definidas;
b) para marcadores de un locus aislado, la probabilidad depen­
de de las frecuencias génicas. Los laboratorios de perfiles de
DNA conservan bases de datos de frecuencias génicas, pero
¿éstas se determinaron en un grupo étnico apropiado para
el caso que se estudia?
Si se lleva a extremos, el argumento de la independencia de los geno­
tipos implica que la prueba de DNA podría identificar que el crimi­
nal pertenece a un grupo étnico particular, pero no mostraría qué
miembro del grupo cometió el crimen. Estos problemas son objeto
de discusiones muy extensas, sobre todo en las cortes estadouniden­
ses. El argumento es válido en principio, pero el problema es si en la
práctica implica una diferencia suficiente para que importe. Está cla­
ro que en general no es así. Sería irónico que las cortes, al observar
testigos expertos opuestos que brindan razones de posibilidades de
identificación correcta que difieren un millón de veces (105: 1 com­
parado con 10 :1), decidieran que la prueba de DNA es desesperan-
zadoramente insegura y en lugar de ello confiaran en la identificación
ocular del testigo (razones de posibilidades de identificación correcta
50:50).
prueba que lo implique, sólo es un miembro aleatorio de la población y
la probabilidad previa de que sea culpable (antes de considerar la prue­
ba de DNA) es PG= 1 0 -7 . La probabilidad previa de que sea inocente
es P, = 1 - 1 0 ' 7, = 1.
El teorema de Bayes indica que
P||M = (P|Pm |I)/[(P |P m |I) + (Pg Pm |G)]
= 10~6/( 1 0 ~ 6 + 10 7)
= 1 .0 / 1.1
= 0.9
Ya se vio que
PM11 = 1 0“ 6 ison muy diferentes!
Las cortes se engañan a sí mismas al ignorar la prueba abrumadora de
DNA, pero este cálculo también muestra que la prueba de DNA por sí m is­
ma no podría condenar con seguridad a alguien cuando no existe otra
prueba contra él, a menos que PM 11 fuera bastante menor de 10~6. Es
necesario considerar lo anterior cuando se planea seleccionar a todos los
varones en una ciudad grande para encontrar a un violador.
C o tto n R G H , E d k in s E, F o rre s t S (eds) (1988) Mutation Detec­
tion: a Practical Approach.Oxford: IRL Press.
E lie s R G , M o u n tfo rd R (e d s ) (2003) Molecular Diagnosis of Ge­
netic Diseases, 2nd Edn. Humana Press, Totowa, NJ.
PARTE CUATRO

Nuevos horizontes:
en el siglo XXI

19 Más allá del proyecto del genoma: genómicafuncional, proteómica

y bioinformática 541

20 Manipulación genética de célidas y animales 577

21 Nuevas conductas para el tratamiento de enfermedades 611

CAPÍTULO DIECINUEVE

Más allá d el p royecto d el genom a:

genóm ica fu n cion al, proteóm ica
y bioinform ática

Contenido del capítulo

542 | CAPÍTULO DIECINUEVE I MÁS ALLÁ DEL PROYECTO DEL GENOMA
19.1 G eneralidades de genóm ica
funcional
19.1.1 La información obtenida de la fase estructural
del Proyecto del Genoma Humano es de uso
limitado sin una anotación funcional
El objetivo final de la fase estructural del Proyecto del Genoma
Humano fue proporcionar la secuencia completa del genoma: ]de
todos los tres mil millones de pares de bases de ella! Como se co­
menta en el capítulo 8, en febrero de 2001 se publicaron dos bos­
quejos de secuencias (International Human Genome Sequencing
Consortium, 2001; Venter y cois., 2001) y hacia mediados del año
2003 se dispuso de secuencias terminadas. Aunque es indudable
que constituyen un logro sin paralelo en biología, las secuencias no
son por sí mismas particularmente informativas. En esencia son
apenas cordones largos de las cuatro letras A, C, G y T. Los datos
de las secuencias deben explorarse a fin de extraer información útil
para encontrar la forma en que esta secuencia del genoma ayuda a
construir un ser humano funcional.
Una de las primeras labores posteriores a la secuenciación en
cualquier proyecto de genoma es identificar todos los genes pues­
to que representan las principales unidades funcionales del geno­
ma. En el Proyecto del Genoma Humano se identificaron muchos
genes en estudios previos. Otros se predijeron con base en su es­
tructura, su conservación en otros genomas o en el hecho de que
eran compatibles con marcadores de secuencia expresados (MSE)
(sección 8.3.5). El número exacto de genes humanos aún se des­
conoce, pero casi todas las estimaciones actuales concuerdan en
una cifra cercana a 30 000. Por tanto todavía está muy lejos de en­
samblarse un catálogo génico completo y preciso del genoma hu­
mano. Sin embargo, incluso si se dispusiera de este recurso, no
representaría nada más que una lista de componentes. Puesto que
antes de comenzar a comprender cómo forman estos componen­
tes un ser humano es necesario saber lo que realizan, la siguiente
labor consiste en determinar las funciones precisas de cada uno de
los genes del genoma humano, un proceso que se conoce como
anotación funcional.
19.1.2 Las funciones de genes individuales pueden
describirse a niveles bioquímico, celular
y del organismo completo
En realidad la función de un gen es la función de su(s) producto(s).
Casi todos los genes codifican proteínas, pero una parte muy gran­
de (véase fig. 9-4) elabora moléculas de RNA no codificante. Las
funciones de los productos de los genes humanos pueden clasificar­
se en tres niveles:
► Bioquímico. Por ejemplo, una proteína puede describirse como
una cinasa o una proteína de enlace de calcio. Esto indica poco res­
pecto a su función más amplia en el organismo.
► Celular. Proporciona información acerca de la localización in-
tracelular y las vías biológicas. Por ejemplo, es posible determi­
nar que una proteína se localiza en el núcleo y que se requiere
para reparar el DNA aun si su función bioquímica precisa se
desconoce.
► Organismo. Suele informar dónde y cuándo se expresa un gen, y
su función en la enfermedad. Por ejemplo, el gen HD produce
dos transcritos mayores, uno de los cuales se enriquece en el ce­
rebro y codifica una proteína llamada huntingtina. Las mutacio­
nes que incrementan el número de residuos de glutamina en esta
proteína más allá de un cierto límite causan la enfermedad de
Huntington (sección 16.6.4). Queda por establecer las funciones
bioquímicas y celulares precisas del producto génico en personas
sanas.
Se requiere información a estos tres niveles para obtener un cua­
dro perfecto de la función de los genes humanos. El recuadro 19-1
muestra como ejemplo la clasificación funcional del gen humano pa­
ra la glucocinasa. Un gran adelanto reciente en genómica funcional es
el establecimiento de vocabularios precisos para describir la función
génica a través de todos los genomas. Un ejemplo es el sistema Gene
Ontology (Gene Ontology Consortium, 2000; 2001; véase http://www.
geneontology.org/). Otros sistemas útiles incluyen los que emplea la
Kyoto Encyclopedia of Genes y el más antiguo y empleado de todos,
el sistema Enzyme Commission para la clasificación de enzimas.
19.1.3 Las relaciones funcionales entre los genes
deben estudiarse a niveles del transcriptoma
y el proteoma
Aun si fuera factible identificar y asignar una función a cada gen del
genoma, esto no demostraría la manera en que los productos géni-
cos coordinan las actividades biológicas necesarias para formar un
ser humano vivo. Una situación análoga sería la descripción funcio­
nal detallada de todos los componentes de un vehículo. El perno
sostiene el motor al chasis; éste es parte de la columna de conduc­
ción y éste es un interruptor eléctrico que opera las luces indicado­
ras, pero ¿cómo funciona en realidad el vehículo? Para apreciar el
modo en que las funciones de miles de genes se combinan para ge­
nerar un ser humano deben estudiarse de manera directa los pro­
ductos génicos. Aunque discutible, el gran propósito de la biología
molecular durante los últimos 30 años ha sido determinar las fun­
ciones de los genes y enlazarlos en vías y redes para explicar cómo
funcionan los seres vivientes. Sin embargo, en fecha reciente el en­
foque cambió de la conducta reduccionista del estudio de genes y
sus productos, uno a la vez, a una conducta holística en la que
muchos o de hecho todos los productos génicos se estudian al mis­
mo tiempo. Este análisis global de la función génica es la base de la
genómica funcional.
Un concepto central en genómica funcional es la expresión del
genoma para producir el transcriptoma y el proteoma. El trans­
criptoma es el conjunto completo de mRNA en una célula par­
ticular y representa la producción combinada de transcripción,
procesamiento y recambio de RNA (Velculescu y cois., 1997). Lo
anterior es esencial para definir el proteoma, el conjunto comple­
to de proteínas en una célula particular (Wasinger y cois., 1995).
Es importante reconocer que el transcriptoma y el proteoma son
mucho más complejos que el genoma. Un gen aislado puede pro­
ducir muchos mRNA diferentes mediante empalme alternativo,
uso alternativo del sitio promotor o de poliadenilación y estrate­
gias de procesamiento especiales como la edición de RNA (sección
10.3.3). Las proteínas que se sintetizan a partir de estos mRNA
pueden modificarse de diversos modos, por ejemplo, mediante
corte proteolítico, fosforilación o glucosilación. A diferencia del
genoma, que es idéntico en la mayor parte de las células, el trans­
criptoma y el proteoma son muy variables. La transcripción, el
 19.2 | ANOTACIÓN FUNCIONAL MEDIANTE COMPARACIÓN DE SECUENCIAS
Recuadro 19-1. Función de la glucocinasa
Nombre génico: GCK
Posición en el genoma: 7p15
Nombre de la proteina: glucocinasa
Función bioquímica: cinasa, sustrato de glucosa
Función celular: metabolismo de la glucosa, vía de glucólisis
Función en el organismo: se expresa de manera específica en células be­
ta pancreáticas y hepatocítos, principal regulador de la secreción de in­
sulina controlada por glucosa, las mutaciones con pérdida de función
causan diabetes, las mutaciones con aumento de función pueden produ­
cir hiperinsullnismo.
procesamiento de RNA, la síntesis y la modificación de proteínas
pueden regularse de manera que el transcriptoma y el proteoma
difieren mucho entre los distintos tipos de células y en respuesta a
cambios en su ambiente. El análisis a nivel del transcriptoma o el
proteoma proporciona una imagen inmediata de la célula en ac­
ción, que demuestra la abundancia de todos los RNA y las proteí­
nas bajo un grupo específico de circunstancias. Tanto la
comprensión de las características más importantes del transcrip­
toma y el proteoma en diferentes tipos de células como el estudio
de cómo cambian en la salud y la enfermedad permiten construir
las funciones individuales de los genes dentro de un cuadro mu­
cho más grande.
19.1.4 Las técnicas de análisis de alto rendimiento
y la bioinformática son tecnologías que hacen
capaz la genómica funcional
La genómica funcional se benefició del desarrollo de una gama
completa de estrategias experimentales novedosas para investigar la
función génica a una escala global. En algunos casos se adoptaron
las técnicas que se utilizan en el análisis de alto rendimiento. Por
ejemplo, las técnicas simples de hibridación gen por gen (sección
7.3.2) se sustituyeron con los métodos de arreglo de DNA y mues-
treo de secuencias que pueden emplearse para perfilar la expresión
global. En otros casos se inventaron tecnologías del todo nuevas,
como la selección de interacción mediante el sistema de levadura de
dos híbridos (véase más adelante). Como estos experimentos origi­
nan grandes grupos de datos, el apoyo de la bioinformática es esen­
cial y la revolución genómica funcional recibe el impulso tanto del
desarrollo de nuevos algoritmos y el establecimiento de nuevas ba­
ses de datos como de los adelantos experimentales. La bioinformá­
tica es necesaria para comparar secuencias y estructuras, modelar
estructuras e interacciones, analizar datos de expresión global y
compartir información mediante bases de datos accesibles, fáciles
de usar. Las técnicas bioinformáticas existentes se adaptaron para
nuevos usos (p. ej., los algoritmos de agrupamiento que se emplean
en el análisis filogenédco se modificaron para explorar datos de ex­
presión génica) y se crearon nuevas técnicas para aplicaciones espe­
cíficas (como los algoritmos que buscan en bases de datos de
proteínas con base en los datos de la espectrometría de masa). Es­
tas tecnologías novedosas y sus aplicaciones se comentan en el res­
to de este capítulo.
j 543
Como sucede en muchas proteínas, las funciones bioquímicas y celula­
res de la glucocinasa no muestran su función reguladora importante a ni­
vel de todo el organismo. De hecho en el genoma humano se codifican
varias otras enzimas con actividades bioquímicas y celulares idénticas,
pero cada una tiene un patrón de expresión distinto y una función diferen­
te de nivel más alto. Por el contrario, el patrón de expresión y los datos
de enfermedades indican la Importancia de la glucocinasa en la regula­
ción de la producción de Insulina y los valores de la glucemia, pero no
identifican su actividad bioquímica precisa.
19.2 Anotación funcional m ediante
com paración de secuencias
19.2.1 La comparación de secuencias permite asignar
funciones tentativas a los genes
La anotación funcional mediante la búsqueda de homología
es una extensión del hallazgo de genes
Una diversidad de métodos experimentales puede usarse para de­
tectar genes en el DNA genómico (véase sección 7.2). Sin embargo,
a causa de la gran cantidad de datos de secuencias que se obtuvieron
en los proyectos del genoma, la anotación inicial se realiza con algo­
ritmos de computadora que pueden procesar las secuencias con mu­
cha rapidez. Como se señala en la sección 8.3.5, estos algoritmos
predicen la existencia de genes a partir de los principios iniciales o
identifican secuencias homologas de genes conocidos mediante la
búsqueda en bases de datos. El recuadro 8-7 describe con mayor
amplitud los métodos para efectuar lo anterior.
Los genes homólogos tienen secuencias similares porque se de­
rivan de un ancestro evolutivo común. Una relación evolutiva sue­
le indicar que las dos secuencias no sólo se relacionan en cuanto a
la estructura sino también en la función. Por tanto el medio más
sencillo para asignar una función a un gen nuevo consiste en bus­
car secuencias relacionadas que ya se anotaron. Por lo general las com­
paraciones se realizan a nivel de proteínas porque las secuencias de
aminoácidos están más restringidas en términos evolutivos que las
de nucléotidos, de manera que las comparaciones de secuencias
proteínicas son más sensibles.
La potencia de la anotación funcional basada en la búsqueda
de homología depende de muchos factores, inclusive el grado de
similitud entre la secuencia interrogada y cualquier acierto en la
base de datos, la confiabilidad de la información funcional que ya
se encuentra en las bases de datos y el grado al que la conserva­
ción de la secuencia y la estructura se corresponden con la función
conservada. Una secuencia buscada particular puede proporcionar
varias compatibilidades con diferentes grados de similitud. En al­
gunos casos es posible alinear secuencias compatibles en toda su
longitud, lo que indica que las secuencias sólo variaron por la acu­
mulación de mutaciones de punto (fig. 19-1). Si las secuencias
son muy similares, tal vez representen genes homólogos que de­
sempeñan funciones idénticas en distintas especies y que acumu­
laron mutaciones a causa de la especiación. Como se comenta en
544 | CAPITULO DIECINUEVE MÁS ALLÁ DEL PROYECTO DEL GENOMA
el recuadro 12-3, estos genes se conocen como ortólogos, de los
que los genes de globina (3 de humanos y ovejas podrían ser un
ejemplo. Las anotaciones funcionales basadas en ortólogos pueden
ser muy precisas. Un grado más bajo de similitud indicaría que los
genes son homólogos pero que variaron en términos funcionales.
Estos genes se conocen como patólogos y surgieron por duplica­
ción y divergencia génicas dentro de un genoma (véase recuadro
12-3). Los genes humanos para la mioglobina y la globina P son
ejemplos de parálogos. En estos casos las predicciones funcionales
pueden ser seguras a nivel bioquímico (ambas proteínas son trans­
portadoras de oxígeno) pero tal vez sus funciones específicas a nivel
celular y del organismo sean muy diferentes. Casi siempre mayor si­
militud estructural implica mayor similitud funcional y que la fun­
ción bioquímica está más conservada que la función a nivel celular
y del organismo.
En muchos casos las búsquedas en bases de datos no proporcio­
nan aciertos que son comparables con la secuencia buscada en toda
su longitud. En lugar de ello se identifican alineamientos parciales
en varias proteínas que por otra parte no parecen relacionadas (fig.
19-2). Esto refleja la naturaleza modular de las proteínas y el hecho
de que diferentes dominios proteínicos pueden desempeñar funcio­
nes distintas (sección 12.1.3). Los genes compatibles no variaron só­
lo por la acumulación de mutaciones de punto, sino también por
acontecimientos más complejos, como la recombinación entre ge­
nes y segmentos génicos que condujo al mezclado de exones (sec­
ción 12.1.3). Las proteínas humanas que participan en la
coagulación sanguínea constituyen un ejemplo útil de este proceso
(Kolkman y Stemmer, 2001; véase fig. 12-3).
Q
e m
f ililí "
£ M 9
I M ÍT1
I m
Fig. 19-1. La búsqueda de similitud con una secuencia de proteínas
determinada puede identificar proteínas homologas cuyas secuen­
cias se alinean con la secuencia buscadora (Q) en toda su longitud.
Estas secuencias variaron sólo por la acumulación de mutaciones de
punto, que pueden ser sustituciones de aminoácidos (representadas
por las líneas blancas) o inserciones y deleciones pequeñas. Por lo
general cuanto más divergentes sean el buscador y la respuesta, más
probable es que las funciones estén menos conservadas.
La anotación funcional basada en homología conlleva varios
peligros latentes
El principio de la anotación funcional basada en la búsqueda de
homología consiste en que la estructura conservada siempre indica
preservación de la función. Sin embargo, esta suposición no es se­
gura en varios casos (Orengo y cois., 1999):
► presencia de secuencias de baja complejidad, es decir, secuen­
cias que se encuentran en muchas proteínas con funciones en
extremo diversas. Por ejemplo, dominios transmembrana, do­
minios de dimerización;
► secuencias multifuncionales, esto es, secuencias que efec­
túan diferentes funciones en distintas proteínas. Por ejem­
plo, las secuencias que forman un doblez de hidrolasa oí/(5 se
encuentran tanto en el sitio catalítico de seis clases diferentes de
enzimas como en la molécula de adherencia celular neuro-
tactina;
► incorporación génica, o sea, la adquisición de una función
nueva por un producto génico existente. Por ejemplo, muchas
enzimas que participan en procesos metabólicos generales se in­
corporaron como cristalinas, las proteínas refringentes en el
cristalino del ojo. Aunque esto se logró mediante la simple mo-
I I
lili II
Fig. 19-2. La búsqueda de similitud con una secuencia proteínica
determinada también puede identificar proteínas homologas que
muestran alineaciones parciales con la secuencia interrogante.
En este ejemplo la proteína de búsqueda (Q) comprende tres dominios
distintos que se muestran en colores diferentes. Las respuestas pueden
compartir uno, dos o los tres de estos dominios, pero también poseer
dominios adicionales que no se encuentran en la proteína buscadora
(cuadros rojos). Puede haber duplicaciones de dominio como se observa
en las respuestas primera y tercera. La respuesta final muestra el caso
especial de permutación, en el que el orden de los dominios se cambia.
Esto suele reflejar duplicación de genes seguida de fusión génica y
erosión final. Las mutaciones de punto acumuladas en relación con la
secuencia de interrogación se muestran como líneas blancas.
 19.2 | ANOTACIÓN FUNCIONAL MEDIANTE COMPARACIÓN DE SECUENCIAS [ 545

dificación de sus niveles de expresión, otros mecanismos de
incorporación comprenden el cambio de la forma en que las
proteínas constituyen complejos y modifican su localización
intracelular.
Otro posible peligro de la búsqueda de homología es que las
anotaciones siempre se basan en experimentos e interpretaciones de
otras personas. Sin embargo, todas las bases de datos, sin que im­
porte con qué tanto cuidado se atiendan, incluyen una proporción
importante de errores. Basar la función de un gen nuevo en estos
datos tal vez no sólo sea incorrecto sino que también propaga el
error (Brenner, 1999).
19.2.2 Métodos de búsqueda consenso pueden
extender el número de relaciones homologas
identificadas
Los métodos estándar de búsqueda de homologías que recurren a
algoritmos de la familia BLAST (véanse cuadro 8-2 y recuadro 8-7)
son adecuados para detectar secuencias proteínicas relacionadas de
manera cercana ya sea en toda su longitud o en uno o más domi­
nios. No obstante, estos algoritmos se tornan menos robustos y
muchas relaciones evolutivas pueden no advertirse cuando el grado
de similitud secuencial es menor de 30 a 40%.
Una manera de mejorar la búsqueda de homología consiste en
utilizar un método de búsqueda consenso como PSI-BLAST
(BLAST position-specific iterated, iterado específico de posi­
ción), que emplea una búsqueda reiterativa basada en perfiles de
secuencias (Altschul y cois., 1997). La figura 19-3 ilustra el princi­
pio. El proceso inicia del mismo modo que una búsqueda BLAST
normal pero los aciertos iniciales se combinan en un perfil repre­
sentativo que luego se aplica en una segunda ronda de búsqueda.
Cualquier acierto adicional se combina con el perfil y el proceso
se repite para un número predeterminado de repeticiones o hasta
que no se identifican nuevos aciertos. Está demostrado que este
método identifica tres veces más relaciones evolutivas que la bús­
queda de homología estándar. Es posible obtener una sensibilidad
adicional si se comparan patrones y perfiles generados por la ali­
neación de proteínas relacionadas en forma distante y la deriva­
ción de secuencias típicas cortas conservadas o de perfiles más
largos que corresponden a dominios funcionales (Eddy, 1998). Se
cuenta con varias bases de datos de secuencias secundarias que
contienen secuencias típicas de dominio y perfiles derivados de
las bases de datos de secuencias primarias (cuadro 19-1). Estas ba­
ses de datos pueden explorarse con una secuencia de búsqueda a
fin de identificar dominios proteínicos conservados en secuencias
relacionadas de modo muy distante.
19.2.3 Las similitudes y diferencias entre genomas
indican secuencias conservadas e importantes
desde el punto de vista funcional
Con base en el comentario anterior es obvio que los genes de espe­
cies diferentes relacionados de manera cercana (ortólogos) pueden
utilizarse para asignar funciones bastante precisas a genes no carac­
terizados. Los ortólogos no suelen ser idénticos porque se acumulan
mutaciones separadas en cada linaje evolutivo después del aconteci­
miento de especiación. Por consiguiente el grado de similitud en­
tre ortólogos brinda una medida útil del tiempo evolutivo y puede
emplearse para elaborar árboles filogenéticos (cap. 12). La genó­
mica comparativa aprovecha las similitudes y diferencias entre
genomas para derivar información estructural, funcional y evolu­
tiva (sección 12.3.2). Se basa en el principio de que las similitudes
genéticas entre especies se extienden mucho más allá que el nivel
génico. Cabría esperar que especies relacionadas de modo cercano

Total d e to d a s las s e c u e n c ia s en las b a s e s d e d a to s

Total d e s e c u e n c ia s h o m o lo g as con
el b u s c a d o r (•)
Total d e s e c u e n c ia s h o m o lo g as d e te c ta d a s
m ed ian te b ú s q u e d a BLAST inicial
E xtensión d e relacio n es evolutivas o b te n id a s
d e u n a s e g u n d a b ú s q u e d a BLAST con
un o d e los a c ie rto s originales (+) c o m o
bu scador

Fig. 19-3. P rincipio de PSI-BLAST.

El círculo externo representa el contenido total de la base de datos de secuencias. Un subgrupo de estas secuencias será homólogo a la secuencia de
búsqueda (punto), aunque el grado de relación evolutiva se debilita cuanto más se aleje la secuencia del centro. Mediante BLAST estándar se detectará
un círculo pequeño interno de secuencias relacionadas con el buscador. En PSI-BLAST cada uno de estos aciertos de esta primera búsqueda se reúne
en un perfil que se utiliza en una segunda búsqueda a fin de extender el número de secuencias homologas identificadas. El proceso puede repetirse para
un número predeterminado de rondas de búsqueda o hasta que no se encuentran más aciertos.
546 CAPÍTULO DIECINUEVE MÁS ALLÁ DEL PROYECTO DEL GENOMA

Cuadro 19-1. Bases de datos secundarias de secuencias proteínicas que pueden utilizarse para identificar elementos conserva­
dos y dominios de proteínas. InterPro es un sistema de referencia cruzada importante que permite que cada base de datos se
investigue con un buscador único
Database Contenido URL

PR0SITE Patrones de secuencia relacionados con familias de proteínas y perfiles de http://ca.expasy.org/prosite

secuencia más largos que representan dominios proteínicos completos

PRINTS, BLOCKS Regiones muy conservadas en múltiples alineamientos de familias de proteínas. http://bioinf.man.ac.uk/dbbrowser/PRINTS
Se denominan secuencias típicas en PRINTS y bloques en BL0CKS http://www.blocks.fhcrc.org

Pfam, SMART, ProDom Conjunto de dominios proteínicos http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam

http://www.smart.embl-heldelberg.de/

InterPro Una herramienta de búsqueda que integra la información de otras bases http://www.ebi.ac.uk/interpro
de datos secundarias

tuvieran genes y genom as similares de acuerdo con el grado de si­
militud de la divergencia evolutiva de la especie (Nadeau y San-
koff, 1998). Como las similitudes son aparentes a nivel de
secuencias pero también al nivel grueso de la organización del ge­
noma, a menudo especies relacionadas muestran sintenia conser­
vada (un orden génico conservado).
La sintenia tiene utilidad potencial para el mapeo y la clona­
ción génicos porque la información del mapa de una especie pue­
de utilizarse para localizar y clonar genes de otra. En el genoma
humano, el esfuerzo masivo puesto en la elaboración de mapas
genéticos de alta densidad (cap. 8) reditúa en más de una forma
en la actualidad, puesto que las pruebas de sintenia conservada
entre humanos y otros vertebrados se emplean para mapear y clo­
nar genes equivalentes de otros mamíferos. Es valioso identificar
ortólogos animales de genes de enfermedades humanas porque
puede llevar a comprender por qué los humanos son susceptibles
a ciertas enfermedades y en consecuencia ayudar a prevenirlas y
crear nuevos medicamentos. Por ejemplo, casi ningún mamífero
es susceptible al HIV. La identificación de ortólogos de los genes
humanos que confieren susceptibilidad a la enfermedad (p. ej.,
CCR5, que codifica el correceptor de HIV que se muestra en la
superficie de células T) podría proveer información para trata­
mientos novedosos.
Otra aplicación de la genómica comparativa es la identificación
de elementos génicos reguladores. Como se señala en el capítulo
20, la identificación de los elementos promotores e intensificadores
necesarios para la expresión génica normal es un trabajo laborioso,
que incluye valoraciones de la expresión artificial en células culti­
vadas y animales transgénicos. Un posible inconveniente consiste
en comparar genes ortólogos en especies relacionadas y buscar las
secuencias típicas más conservadas fuera de la región de codifica­
ción del gen. Sólo secuencias con una función muy conservada es­
tarían representadas en ambos genomas, en tanto que otras deben
haber variado de manera significativa durante el tiempo de evolu­
ción (Hardison y cois., 2000; Werner, 2003). A este respecto el pez
soplador japonés Takifugu rubripes constituye un modelo excelen­
te porque aunque tiene el genoma más pequeño de todos los ver­
tebrados (400 MB), contiene alrededor del mismo número de
genes que el genoma humano (Elgar y cois., 1996; Aparicio y cois.,
2002).
19.2.4 La genómica comparativa puede aprovecharse
para identificar y caracterizar genes de
enfermedades en humanos
El uso de la búsqueda de homología para asignar funciones a genes
humanos suele dar por resultado asignaciones funcionales superfi­
ciales como “fosfatasa” o “proteína que abarca la membrana”. La ge­
nómica comparativa puede aprovecharse con objeto de enriquecer
la información obtenida de la búsqueda de homología ya que no
sólo las funciones de proteínas individuales tienden a conservarse
sino también las vías, las redes y los complejos enteros entre geno-
mas relacionados.
Estas similitudes pueden expresarse a nivel del organismo com­
pleto aun en organismos relacionados de modo distante. Por ejem­
plo, se estima que alrededor de 30% de los genes de enfermedades
humanas conocidos tiene homólogos en la levadura. El gen SGS1
de la levadura codifica una helicasa de DNA que es homóloga de
un gen humano, WRN, que muestra defectos en el síndrome de
Werner (MIM 2777000). Ésta es una enfermedad de envejeci­
miento prematuro. Las personas con la enzima defectuosa parecen
normales durante sus primeros años, pero envejecen de manera no­
table en la edad madura y adquieren el aspecto marchito de octo­
genarios hacia los 25 años de edad. Las características frecuentes de
la enfermedad comprenden aterosclerosis, osteoporosis, diabetes y
cataratas. Se piensa que los síntomas de la enfermedad se relacio­
nan en cierta forma con la incapacidad de las células de Werner pa­
ra dividirse en cultivo tantas veces como las células normales, es
decir, ocurre un envejecimiento celular temprano. Aunque es difí­
cil examinar el vínculo entre la actividad de helicasa y el envejeci­
miento celular en humanos, las células de levadura con un gen
SGSI inactivo también muestran envejecimiento acelerado y ofre­
cen la posibilidad de efectuar estudios funcionales de la enferme­
dad de humanos en células de levadura.
La conservación de la función génica entre humanos y anima­
les es aún mayor que entre los humanos y la levadura. Más de
60% de los genes de enfermedades en humanos tiene correspon­
dientes en la mosca y el gusano, lo que revela un núcleo de casi 1
500 familias génicas conservadas en todos los animales. La vía de
señalamiento de insulina está conservada por completo en hu­
manos y nemátodos de manera que los gusanos mutantes con de­
 19.2 ANOTACIÓN FUNCIONAL MEDIANTE COMPARACIÓN DE SECUENCIAS
terioro del señalamiento de insulina son modelos útiles de dia­
betes tipo II. Gracias a sus propiedades similares a microbios,
estas mutantes de nemátodos pueden seleccionarse con miles de
posibles medicamentos para identificar compuestos que norma­
lizan la fisiología de la enfermedad insensible a la insulina. Las
mutantes de C aenorhabditis elegans proporcionan modelos de
muchas otras enfermedades que abarcan trastornos neurológicos,
cardiopatías congénitas y afecciones renales. En el capítulo si­
guiente se considera más a fondo la utilidad de los modelos ani­
males de enfermedad.
19.2.5 Una minoría inflexible de genes resiste
la anotación funcional mediante búsqueda
de homología
El primer genoma de un organismo modelo mayor que se secuen-
ció por completo fue el de la levadura Saccharomyces cerevisiae
(Dujon, 1996). Antes de disponer de las secuencias, solía pensar­
se que la mayor parte de los genes de la levadura se había identi­
ficado por medios experimentales y que la secuencia del genoma
revelaría cuando mucho unos cuantos cientos de genes adiciona­
les. En consecuencia los científicos se sorprendieron cuando en­
contraron que el genoma de la levadura contenía más de 6 000
genes, de los que antes sólo se conocía 30%. La búsqueda de ho­
mología asignó funciones a otro 30% de los genes aunque las
anotaciones variaron mucho en cuanto a su utilidad. Aunque en
algunos casos se identificaron funciones tanto bioquímicas como
celulares, en muchos genes sólo pudieron predecirse funciones
bioquímicas generales. Esto dejó 40% de los genes sin alguna
asignación funcional. Tales genes podrían dividirse en dos catego­
rías (fig. 19-4):
► genes huérfanos. Son genes predichos no equiparables con
ninguna otra secuencia en las bases de datos;
► familias huérfanas. Son genes predichos con homólogos en las
bases de datos, pero los homólogos en sí mismos tienen una
función desconocida.
La inseguridad de las predicciones génicas complica la situación
en el genoma humano. En el genoma de la levadura fue dudoso
menos de 10% de las predicciones génicas, pero la cifra en el ge­
noma humano es mucho mayor: tal vez del orden de 25%. Más
aún, si bien se identificaron muchos genes humanos, quizá la es­
tructura predicha no sea precisa (p. ej., es posible que falten exo­
nes, que existan exones definidos de manera incorrecta y exones
fantasma, o que genes adyacentes se hayan fusionado). Con base
en lo anterior, el resultado final de los proyectos del genoma hu­
mano es sorprendentemente similar a los resultados obtenidos en
el proyecto de la levadura. Con anterioridad se conocía alrededor
de un tercio de los genes de la lista y estaban representados en la
base de datos RefSeq, un conjunto muy depurado de transcritos
de genes humanos. Otro tercio se predijo con base en la homolo­
gía de MSE o de otras secuencias y el tercio restante se predijo
desde el inicio, sólo a partir de criterios estructurales. Algunas de
las predicciones de las últimas categorías serán positivas falsas (p.
ej., compatibilidades con seudogenes y elementos transposables),
547
Fig. 19-4. Distribución de genes de levadura por estado de anotación
en el resultado del proyecto del genoma de Saccharomyces cerevisiae.
En total, 30% de los 6 000 genes se identificó con anterioridad, a 30%
fue factible asignarle funciones mediante la búsqueda de homología,
33% correspondió a huérfanos o miembros de familias huérfanas y
7%, indicado por ??, lo constituían marcos de lectura abiertos dudo­
sos. Las anotaciones funcionales basadas en homología variaron de
informativas por completo (función bioquímica y fisiológica estableci­
da) o informativas en parte (tal vez función bioquímica establecida) a
superficiales (quizá relacionada con el metabolismo de nitrógeno).
en tanto que se omitirán muchos genes a causa de la sensibilidad
baja de los algoritmos de predicción génica iniciales. Casi todos
los genes antes identificados y los que se predijeron con base en
homología se anotaron en términos funcionales cuando menos a
nivel bioquímico, en tanto que una minoría representa familias
huérfanas. Sólo a una proporción pequeña de los genes predichos
mediante métodos iniciales se les asignó una función. Se cree que
alrededor de 60% de los genes humanos contiene dominios pro-
teínicos que están representados en las bases de datos de secuen­
cias secundarias, lo que deja 40% sin asignar. Dentro de esta
categoría se conoce la función de tal vez 10% de los genes, pero
no pertenecen a las familias de proteínas grandes, en tanto que un
tercio de los genes no tiene asignación funcional en lo absoluto y
se trata de huérfanos genuinos.
Para estos genes huérfanos, la búsqueda de homología no
brinda información funcional y las predicciones funcionales de­
ben basarse en pruebas alternativas. Los métodos disponibles pa­
ra anotación funcional comprenden lo siguiente y se estudian en
el resto de este capítulo:
► análisis de perfiles de expresión del mRNA;
► análisis de perfiles de expresión de proteínas;
► comparación de estructuras proteínicas;
► análisis de interacciones de proteínas;
► análisis de fenotipos o fenocopias mutantes en organismos
modelo.
548 CAPÍTULO DIECINUEVE MÁS ALLÁ DEL PROYECTO DEL GENOMA
19.3 Perfil global del mRNA
(transcriptóm ica)
19.3.1 El análisis del transcriptoma revela cómo
los cambios en los patrones de expresión génica
coordinan las actividades bioquímicas de
la célula en la salud y la enfermedad
Los patrones de expresión proveen información accesoria
útil respecto a las funciones de genes individuales y
también pueden destacar relaciones entre ellos
Las anotaciones funcionales basadas en comparaciones secuencia-
les y estructurales pueden ser informativas, pero en muchos casos
sólo sugieren una categoría bioquímica amplia, como “cinasa” o
“proteína de enlace de DNA”. Se requieren experimentos más
amplios para determinar las funciones de los genes a nivel celular
y del organismo completo, así como para investigar la forma en
que las actividades de productos génicos individuales se coordi­
nan. El perfil de expresión de un gen puede revelar mucho acer­
ca de su función en el cuerpo y ayudar a identificar relaciones
funcionales con otros genes. La expresión de muchos genes está
restringida a células específicas o a estructuras en desarrollo y
muestra que los genes tienen funciones particulares en esos sitios.
Otros genes se expresan en respuesta a estímulos externos. Por
ejemplo, podrían encenderse o apagarse en células expuestas a se­
ñales endógenas, como factores del crecimiento o moléculas am­
bientales, por ejemplo, sustancias químicas que dañan el DNA.
En estos casos no es irrazonable suponer que la función de los ge­
nes se relaciona de cierta manera con la percepción de esas seña­
les o la respuesta de las células a las mismas. Es posible que los
genes con perfiles de expresión similares participen en procesos
iguales y por tanto demostrar que un gen huérfano tiene un per­
fil de expresión similar a un gen caracterizado tal vez permita
asignarle una función con base en la “culpa por asociación”. Más
aún, la mutación de un gen puede afectar los perfiles de expresión
de otros, lo que ayuda a relacionar esos genes en vías y redes fun­
cionales. Bien podría ser el caso si el gen mutado codificara un
factor de transcripción ya que la función anormal de este último
influiría en todos los genes que controla.
El análisis del transcriptoma proporciona mayor alcance
para relacionar genes y sus productos dentro de vías
y redes funcionales, así como nuevas oportunidades
para el desarrollo de fármacos
El análisis de expresión suele efectuarse con base gen por gen y
los métodos que se utilizan (p. ej., northern blots, PCR-RT, hi­
bridación in situ, etc.) se opriman para el estudio de genes indi­
viduales (véase sección 7.3). Algunas técnicas son factibles de
una multiplicidad moderada, por ejemplo, es bastante fácil esta­
blecer 10 a 20 PCR, pero el análisis altamente paralelo que in­
cluye cientos o incluso miles de genes resulta imposible a causa
del tiempo necesario para establecer reacciones individuales y por
supuesto del costo de realizarlo. Aun en este caso, las ventajas del
análisis completo del transcriptoma son claras. Por ejemplo, se
desearía buscar genes con patrones de expresión alterada en el as­
ma, la esclerosis múltiple o las enfermedades inflamatorias del
intestino. En lugar de seleccionar unos cuantos genes candidato
a analizar cuya expresión podría afectarse por la enfermedad, es
posible buscar todos los genes al mismo tiempo y por consi­
guiente identificar cada gen aislado cuyo perfil de expresión está
modificado. Aunque algunos de estos genes podrían estar ya bien
caracterizados, quizás otros sean genes huérfanos, lo que permi­
te asignarles funciones tentativas. Este análisis ofrece también
beneficios prácticos e inmediatos. Por ejemplo, los genes que se
incrementan de manera específica en el estado patológico po­
drían representar blancos farmacológicos útiles, en tanto que los
que disminuyen tal vez codifiquen proteínas susceptibles de em­
plearse con fines terapéuticos. El interés por realizar el análisis
global de la expresión génica contribuyó al desarrollo de tecno­
logías novedosas que permiten la vigilancia simultánea de miles
de transcritos y la comparación de su abundancia en diferentes
muestras. Se dispone de dos plataformas principales. Una se ba­
sa en la secuenciación y comprende el muestreo de secuencias de
DNA de poblaciones de cDNA representativas. Éste puede con­
siderarse un sistema abierto porque está abierto para el análisis
el transcriptoma completo. El otro se basa en hibridación e in­
cluye el uso de microarreglos de DNA. Éste puede considerarse
un sistema cerrado porque sólo es posible medir las secuencias
representadas en el arreglo. Es necesario eliminar un mito común
antes de considerar estas tecnologías y el modo en que se utili­
zan. Aunque los métodos de análisis del transcriptoma suelen
describirse como “perfil transcripcional”, es importante recono­
cer que no se mide la tasa de transcripción sino el nivel de mR­
NA en estado constante, que también considera la tasa de
descomposición de mRNA.
19.3.2 El muestreo secuencial directo es un método
estadístico para determinar la abundancia
relativa de diferentes transcritos
El muestreo de genotecas de cDNA permite establecer
perfiles globales de expresión génica
Es probable que el medio más directo para estudiar el transcripto­
ma sea secuenciar en forma aleatoria clonas captadas de genotecas
de cDNA y contar el número de veces que cada secuencia apare­
ce. La abundancia de cada clona representa la abundancia del
transcrito correspondiente en la muestra original. Si se secuencian
suficientes clonas, el análisis estadístico proporciona una guía
gruesa de los valores relativos de expresión génica (Audic y Clave-
rie, 1997). Este enfoque suele usarse para identificar genes que se
expresan diferencialmente pero es laborioso porque se requieren
secuenciaciones a gran escala. Un posible camino corto es tomar
muestras de secuencias muy cortas, que se conocen como caracte­
rísticas de secuencia, y leer muchas de ellas al mismo tiempo. A
fin de aprovechar lo anterior se desarrollaron varias técnicas (re­
cuadro 19-2); la de mayor impacto hasta la fecha es el análisis seria­
do de expresión génica (SAGE), que se discute con más amplitud a
continuación.
 19.3
Recuadro 19-2. Técnicas de m uestreo de secuencias para el análisis global de la expresión génica
Muestreo aleatorio de genotecas de cDNA
Clonas captadas de modo aleatorio se secuencian e investigan contra ba­
ses de datos a fin de identificar los genes correspondientes. La frecuen­
cia con que cada secuencia está representada proporciona una guia
general de la abundancia relativa de diferentes mRNA en la muestra ori­
ginal (Audlc y Claverie, 1997). Es un método muy laborioso, en particu­
lar cuando es necesario comparar varias genotecas de cDNA.
Análisis de bases de datos de marcadores de secuencia expresados
(MSE)
Los MSE son características generadas por la secuenciación de un paso
de clonas de cDNA aleatorias. Si se cuenta con datos de MSE para una
genoteca determinada, es posible estimar la abundancia de diferentes
transcritos determinando la representación de cada secuencia en la base
de datos (p. ej., véase Vasmatzis y cois., 1998). Éste es un método rápi­
do y ventajoso porque puede efectuarse por completo ¡n silico, pero se
basa en la disponibilidad de datos de MSE para muestras importantes.
PCR de exhibición diferencial
Este procedimiento se diseñó para identificar con rapidez secuencias de
cDNA que se expresan de manera diferencial en dos o más muestras
(Liang Y Pardee, 1992). El método no tiene la resolución suficiente para
abordar la totalidad del transcriptoma en una reacción, de manera que se
generan poblaciones de fragmentos de cDNA marcado mediante PCR-RT
con un cebador oligo-dT con un extremo saliente de dos bases y un ce­
bador arbitrario. El empleo de diferentes combinaciones de cebadores
produce fondos comunes de fragmentos de cDNA que representan sub-
fracciones del transcriptoma. A continuación los productos de la amplifi­
cación equivalentes de dos muestras (es decir, productos que se
amplifican con la misma combinación de cebador) se corren lado a lado
en un gel de secuenciación y los cDNA expresados diferencialmente se
revelan mediante diferencias cuantitativas en las intensidades de la ban­
da. Esta técnica se dirige a genes que se expresan de manera diferencial,
El análisis seriado de expresión génica (SAGE) comprende
el muestreo de marcadores de secuencias cortas que están
unidos entre sí en un concatámero largo
La primera técnica de muestreo de secuencias de alto rendimiento
que se desarrolló fue el análisis seriado de expresión génica, o SA­
GE (Velculescu y cois., 1995), que se basa en dos principios:
► un marcador de una secuencia de nucleótidos corta puede iden­
tificar de manera única el transcrito de un gen individual a con­
dición de que tenga una posición definida dentro del transcrito.
Por ejemplo, aunque el número total de genes humanos se
aproxima a 30 000, un marcador de secuencia de sólo 9 pb pue­
de, en principio, distinguir 49 (262 144) transcritos distintos.
En la práctica se utilizan marcadores de secuencia de 12 a 15
pb, que brindan una discriminación aún mayor;
► la concatamerización de los marcadores de secuencia corta per­
mite analizar con eficiencia múltiples transcritos en una forma
seriada. Los marcadores de diferentes transcritos pueden unirse
de manera covalente entre sí dentro de una misma clona y la
clona secuenciarse a continuación para identificar los distintos
marcadores en ella. En una reacción de secuenciación es posible
valorar hasta 100 transcritos diferentes.
PERFIL GLOBAL DEL mRNA (TRANSCRIPTÓMICA) 549
pero los resultados positivos falsos son frecuentes y es necesario recu­
rrir a otros métodos para confirmar los perfiles de expresión predichos.
Análisis seriado de expresión génica (SAGE)
En esta técnica se reúnen características de secuencia muy corta (mar­
cadores de secuencia) de muchos cDNA mediante el aprovechamiento
de las propiedades especiales de enzimas de restricción tipo lis (véanse
texto principal y fig. 19-5). Los marcadores se ligan entre sí para form ar
concatámeros largos y estos últimos se secuencian. La representación
de cada transcrito está determinada por el número de veces que un mar­
cador particular se cuenta. Aunque el SAGE es exigente desde el punto
de vista técnico, es mucho más eficiente que el muestreo estándar de cD­
NA porque permite contar 50 a 100 marcadores en cada reacción de se­
cuenciación (Velculescu y cois., 1995).
Secuenciación de característica masivamente paralela (MPSS)
Como el SAGE, en la técnica de MPSS se utilizan enzimas de restricción
tipo II para reunir marcadores de secuencia corta de muchos cDNA. Sin
embargo, a diferencia del SAGE (en el que los marcadores se clonan en
serie), la MPSS se basa en el análisis paralelo de miles de cDNA fijados
a mícrocuentas en una celdilla de flujo (Brenner y cois., 2000). El princi­
pio del método consiste en utilizar una enzima de restricción de tipo II a
fin de exponer un extremo saliente de cuatro bases en cada cDNA. Hay
16 posibles secuencias de cuatro bases, que se detectan mediante hibri­
dación de un grupo de 16 diferentes oligonucleótidos adaptadores. Cada
adaptador hibrida un oligonucleótido descodificador diferente definido por
un marcador fluorescente específico. El adaptador contiene un sitio para
una enzima de restricción tipo lis, que permite exponer otras cuatro bases y
el proceso se repite. Las imágenes de las microcuentas después de cada
ronda de corte de hibridación permiten leer miles de secuencias de cDNA en
trozos de cuatro nucleótidos. Igual que con el SAGE, el número de veces que
cada secuencia se registra puede usarse para determinar valores relativos
de expresión génica.
Para realizar el análisis de SAGE se extrae primero el poli(A)+R-
NA de la fuente a investigar y se convierte en cDNA mediante un
oligo (dT) cebador biotinilado. Los acontecimientos subsecuentes
se delinean en la figura 19-5. El cDNA se corta primero con una
enzima de restricción como N lalll que corta frecuentemente por­
que tiene un sitio de reconocimiento de 4 pb (ésta se denomina en­
zima de anclaje). Los fragmentos de la terminal 3' liberados, que
están fijados a la biotina, se enlazan a cuentas de estreptovidina. El
cDNA enlazado a estreptovidina se corta en dos fracciones y estas
últimas se ligan por separado en masa a dos adaptadores de oligo­
nucleótidos de doble cadena, A y B. Cada adaptador tiene un ex­
tremo saliente compatible con el generado por la enzima de anclaje
y, justo adyacente a éste, el sitio de reconocimiento de 5 pb para
una enzima de restricción tipo I I , como Fokl. Estas enzimas po­
seen la propiedad poco usual de reconocer una secuencia específica
pero cortar el DNA fuera de esta secuencia un número particular
de pares de bases corriente abajo. Por tanto el corte con esta lla­
mada enzima marcadora genera una secuencia característica cor­
ta, que se define como un marcador SAGE, fijado al adaptador.
Asimismo cada uno de los dos adaptadores contiene el sitio de
reasociación para un cebador de PCR distinto. En la etapa si­
guiente del proceso los dos fondos comunes de marcadores de
adaptador se mezclan y ligan para producir dimarcadores (dos
550 CAPÍTULO DIECINUEVE MÁS ALLÁ DEL PROYECTO DEL GENOMA

marcadores SAGE unidos entre sí) flanqueados a cada lado por
uno de los adaptadores. Luego se utiliza PRC para amplificar estas
moléculas. Los dimarcadores se liberan de los productos de ampli­
ficación cortándolos con la enzima de anclaje original y los dimar­
cadores purificados se ligan entre sí y se clonan. En seguida se
secuencian insertos de los vectores de clonación y esto permite leer
los marcadores en serie. Los niveles relativos de transcritos se dedu­
cen a parrir de la frecuencia con que el marcador ocurre.
En el experimento original, Velculescu y colaboradores (1995)
informaron la recuperación de 840 marcadores de secuencias de
cDNA pancreático. De ellos, 498 representaron 77 transcritos
diferentes y los más abundantes de éstos fueron producidos por
genes que se sabe que tienen función pancreática (p. ej., la procar-
boxipeptidasa Al estaba representada 64 veces y el tripsinógeno
pancreático 2 en 46 ocasiones). La ventaja particular del SAGE es
que los datos son digitales y por tanto es muy fácil comparar las fre­
cuencias del marcador a través de los diferentes experimentos, aun
si se realizaron en distintos laboratorios en épocas diferentes. Se es­
tablecieron varias bases de datos para el depósito y la comparación
de datos del análisis seriado de expresión génica (SAGE). Ahora la
técnica es más útil con las adaptaciones que permiten emplear can­
tidades muy pequeñas de material de inicio (véase Velculescu y Vol-
gelstein, 2000).
19.3.3 Los microarreglos de DNA recurren a
valoraciones de hibridación multiplex
para medir la abundancia de miles
de transcritos en forma simultánea
Aunque los dos tipos principales de microarreglo de DNA
se elaboran de diferentes modos, los principios del análisis
de expresión son similares para cada dispositivo
Los microarreglos de DNA son dispositivos en miniatura en los
que muchas secuencias diferentes de DNA pueden inmovilizarse en
forma de rejilla. Existen dos tipos principales, uno que se elabora
mediante el manchado mecánico de moléculas de DNA en un por­
taobjeto de vidrio recubierto y otro que se produce por la síntesis
de oligonucleótidos in situ (Schena y cois., 1995; Lockhardt y cois.,
1996; véase sección 6.4.3). Ambos dispositivos pueden describirse
como microarreglos, pero un término más específico para el último
es chip oligonucleótido de alta densidad. Hay muchas fuentes
comerciales de arreglos manchados y se dispone de instalaciones in­
ternas para muchos laboratorios. En contraste, los chips de oligo­
nucleótidos de alta densidad sólo los produce la compañía
estadounidense de biotecnología Afíymetrix Inc. y se expenden co­
mo GeneChips (chips génicos).
Aunque manufacturados en formas por completo distintas, los
principios del análisis de expresión son muy semejantes en los dos
dispositivos (Harrington y cois., 2000). El análisis de expresión se
basa en hibridación multiplex utilizando una población compleja
de moléculas de DNA o RNA marcados (fig. 19-6). Para ambos
dispositivos, una población de moléculas de mRNA de una fuente
particular se transcribe en forma inversa en masa para formar una
población compleja representativa de cDNA. En los microarreglos
manchados, la mezcla de la reacción incluye un nucleótido conju­
gado con fluoróforo de tal manera que toda la población de cD­
NA se marque. En los GeneChips, una población de cDNA no
marcado se convierte en un cRNA marcado (RNA complementa­
rio) mediante la incorporación de biotina, que después se detecta
con avidina conjugada a un fluoróforo. A continuación la pobla­
ción compleja de ácidos nucleicos marcados se aplica al arreglo y se
permite que se hibride. Cada carácter o gota individual del arreglo
contiene 106 a 109 copias de la misma secuencia de DNA y por
consiguiente no es probable que se sature del todo en la reacción de
hibridación. Bajo estas condiciones la intensidad de la señal de hi­
bridación en cada blanco del arreglo es proporcional a la abundan­
cia relativa de cDNA o cRNA particular en la mezcla, que a su vez
refleja la abundancia del mRNA correspondiente en la población
fuente original. En consecuencia los valores relativos de expresión
de miles de transcritos diferentes pueden vigilarse en un experi­
mento.
El análisis de expresión con cada tipo de dispositivo es similar
en principio, pero algunas diferencias prácticas importantes refle­
jan la naturaleza de las características en el arreglo (cDNA u oli­
gonucleótidos) y la especificidad de la reacción de hibridación.
En los microarreglos manchados, cada carácter está representado

Fig. 19-5. Selección multiplex de expresión génica mediante el método SAGE.

La base del método es reducir cada molécula cDNA en un marcador de secuencia corta representativa (alrededor de nueve nucleótidos de largo). A
continuación marcadores individuales se unen entre sí (concatamerización) dentro de una clona de DNA larga aislada como se muestra en la parte más
inferior del diagrama, en la que los números que se encuentran arriba de los marcadores de secuencia representan un cDNA específico del que se
derivó el marcador. La secuenciación de la clona proporciona información de los diferentes marcadores de secuencia que pueden identificar la presencia
de secuencias correspondientes de mRNA. Este último se convierte en cDNA por medio de un cebador oligo (dT) con un grupo de biotina unido y
el cDNA biotinilado se corta con una nucleasa de restricción que corta frecuentemente (la enzima de anclaje, AE; en este ejemplo es Nlalll que corta
justo después de G en la secuencia de 4 pb CATG). Luego los fragmentos del extremo 3 ' resultantes que contienen un grupo biotina se recuperan de
modo selectivo enlazándolos a cuentas recubiertas con estreptavidina, separadas en dos fondos comunes y después ligadas en forma individual a uno
de dos enlazadores de oligonucleótidos de doble cadena: A y B. Los dos enlazadores difieren en la secuencia excepto que tienen un extremo saliente
3 ’ CTAG y, adyacente a él, un sitio de reconocimiento común para una nucleasa de restricción tipo lis que servirá como enzima marcadora (EM). En
este ejemplo es Fok\ que reconoce la secuencia GGATG (delineada en un recuadro), pero corta en 9/13 nucleótidos corriente abajo. El corte con Fok\
genera un marcador de secuencia de 9pb de cada mRNA y los fragmentos de los fondos comunes separados pueden unirse entre sí para formar
“dimarcadores” que después se concatenan com o se muestra.
 19.3 ! PERFIL GLOBAL DEL mRNA (TRANSCRIPTÓMICA) ! 551

Sitio EA
P ob lación d e cDNA 1 = ■ =
- AAAAAA ^
-T T T T T T -®
h e te ro g é n e a c o n sitio EA
p a ra n u c le a sa d e - 1
-A A A A A A ^
-T T T T T T -@
restitu ció n e sp ec ífica EA
(enzim a d e anclaje, EA) -A A A A A A ^
-T T T T T T -®
1. C o rte co n enzim a d e anclaje,
p. ej., Nlalll
2. E nlace a c u e n ta s d e e stre p ta v id in a

-A A A A A A
GTAC- -T T T T T T ~ ( B ^

--------A A A A A A
G TAC - --------T T T T T T - ( b ) ^ «

- 2 - aaaaaa
GTAC ------- T T T T T T - ® ^ » e

D ividido en d o s
G GATG CATG Ligada a L igada a GGATG CATG
CCTAC e n la z a d o r' enlazador CCTAC

s
j ^ p . ej., fra g m en to núm . 1
4 p. ej., fra g m en to núm . 3
ET ET
GG ATG CATG- - AAAAAA «G G ATG CATG - - AAAAAA
CCTACG TAC- - TTTTTT- □CCTACGTAC- - TTTTTT

C o rtar con C o rtar con

e n zim a m arc a d o ra , ET
I p. ej., Fok I i enzim a m arc a d o ra , ET
p. ej., Fok l

1
G G ATG C ATG - ■GG ATG C ATG
CCTACG TAC—
I_____ IL
1. Ligar □C C T A C G T A C A A A A A < W \ A
I______ II--------------------------1
EA TAG d e 2. A m plificar co n c e b a d o re s EA TAG d e
9 n u cleó tid o s e sp e c ífic o s p a ra A y B 9 nu cleó tid o s

• GGATG CATG CATGe

aC C T A C G T A C GTAC*

EA DITAG EA
1. C o rtar co n enzim a d e anclaje
2. A islar d im arc ad o re s
3. C o n c aten a r
y 4. C lonar
207 111 3 4 98 37 256 15 321
IE X Z3-............. *
DITAG DITAG DITAG DITAG DITAG

SECUENCIA
552 CAPÍTULO DIECINUEVE MÁS ALLÁ DEL PROYECTO DEL GENOMA

por una especie aislada de cDNA de doble cadena, de varios cien­
tos de pares de bases de largo, que tiene que prepararse mediante
PCR de una genoteca de clonas o un recurso similar (fig. 19-6A).
En el caso de los chips de oligonucleótidos, cada carácter está re­
presentado por un oligonucleótido corto de cadena única, de 20
a 25 nt de longitud, que se sintetiza en el chip durante la manu­
factura. No es necesario conservar una genoteca de clonas porque
los oligonucleótidos pueden sintetizarse con base en cualquier
grupo de secuencias deseado, inclusive las almacenadas en bases
de datos públicas o de patente (fig. 19-6B). Una ventaja de este
procedimiento consiste en que permite captar secuencias de oli­
gonucleótidos para distinguir entre transcritos relacionados de
manera cercana. Con las características del cDNA hay un riesgo
importante de hibridación cruzada entre genes homólogos o va­
riantes de empalme alternativas. Sin embargo, una desventaja es­
triba en que se requiere conocer las secuencias que se eligen para
su inclusión en un chip oligo. Por el contrario, es posible generar
microarreglos de cDNA a partir de clonas anónimas en genotecas
de cDNA. Aunque la especificidad de la hibridación en micro-
arreglos de cDNA es alta gracias a la longitud de la secuencia de
cDNA que representa cada carácter (fig. 19-6C), en los chips de
oligonucleótidos la especificidad de hibridación es más baja. Por
tanto cada gen está representado por 20 oligos diferentes que “ca­
minan” a lo largo de la secuencia (fig. 19-6D). Existen 20 oligos
compatibles a la perfección con la secuencia blanco (compatibi­
lidad perfecta u oligos PM, del inglés perfect match) y 20 que
incluyen una base incompatible (incompatibilidad u oligos
MM, del inglés mismatch) a fin de controlar para hibridación no
específica. Para determinar la señal de un gen particular, las seña­
les de todos los 20 oligos PM se añaden juntas y las señales de to­
dos los 20 oligos MM se restan del total. Los microarreglos de
cDNA también comprenden caracteres de control negativos con
objeto de normalizar para el fondo o hibridación no específica.
Asimismo los dos tipos de dispositivo presentan características de
control positivo, que por lo general representan genes que se ex­
presan de manera constitutiva, como la actina. De otro modo
pueden incluirse genes bacterianos entre las características testigo
y las muestras “hacerse en picos” con cantidades apropiadas de
DNA bacteriano.
La expresión génica diferencial entre muestras puede
demostrarse mediante la comparación a través de arreglos
o por hibridación doble a un arreglo aislado utilizando
poblaciones de cDNA marcadas con diferentes fluoróforos
Uno de los principales obstáculos técnicos en un experimento de aná­
lisis de expresión basado en arreglos es la reproducibilidad de datos
entre arreglos diferentes. Esto es en particular molesto cuando se
requiere realizar análisis comparativos (p. ej., para identificar genes
que se incrementan en la enfermedad) porque se torna confuso si
las diferencias se deben a la variabilidad experimental o a cambios
genuinos en la expresión génica. Este problema se complica cuan­
do los experimentos se efectúan en laboratorios distintos con arre­
glos elaborados por instalaciones diferentes. Se necesitan controles
rígidos a fin de normalizar los datos de expresión para la variación
experimental cruzada.
Una forma en la que los problemas anteriores pueden evitar­
se es hibridar poblaciones de cDNA marcadas con diferentes
fluoróforos al mismo arreglo de manera simultánea. Como se co­
mentó, bajo condiciones no saturantes, la señal de cada carácter
representará la abundancia relativa de cada transcrito en la mues­
tra. Si se utilizan dos muestras, entonces la relación de las seña­
les de cada fluoróforo proporciona una comparación directa de
los valores de expresión entre muestras normalizadas completa­
mente para variaciones en la relación entre señal y ruido inclusi­
ve dentro del arreglo. El arreglo se explora en dos longitudes de
onda de emisión y se recurre a una computadora con objeto de
combinar las imágenes y tornarlas de color falso. Por lo general
un fluoróforo se representa en verde y el otro en rojo. Las carac­
terísticas que representan genes que se expresan de modo diferen­
cial se muestran en verde o en rojo, en tanto que las que indican
genes expresados de manera equivalente se muestran en amarillo
(fig. 19-6C).

Fig. 19-6. Análisis de expresión con microarreglos de DNA.

A) Se producen microarreglos manchados mediante impronta robótica de moléculas de cDNA amplificadas en portaobjetos de vidrio. Cada mancha o
carácter corresponde a un fragmento génico contiguo de varios cientos de pares de bases o más. Oligonucleótidos presintetizados también pueden
mancharse en portaobjetos (no se muestra). B) Se manufacturan chips de oligonucleótidos de alta densidad mediante un proceso de síntesis combina­
toria química dirigida por luz para producir miles de secuencias diferentes en un arreglo muy ordenado en un chip de vidrio pequeño. Los genes están
representados por 15 a 20 pares distintos de oligonucleótidos (PM, perfectamente compatibles y MM, incompatibles) en el arreglo. C) En arreglos man­
chados suelen efectuarse valoraciones de expresión comparativa marcando de manera diferencial dos muestras de mRNA o cDNA con diferentes fluoró­
foros. Éstas se hibridan a caracteres en el portaobjetos de vidrio y después se examinan para detectar ambos fluoróforos de manera independiente. Los
puntos de colores marcados x, y y z en la parte inferior de la imagen corresponden a los genes hipotéticos presentes en concentraciones mayores en
la muestra 1 (x), valores mayores en la muestra 2 (y) y valores similares en las muestras 1 y 2 (z). D) En Affymetrix GeneChips el cRNA biotinilado se
híbrida al arreglo y se tiñe con un fluoróforo conjugado con avidina. La señal se detecta por exploración con láser. Grupos de oligonucleótidos pareados
para genes hipotéticos se encuentran en valores mayores en la muestra 1 (x), valores mayores en la muestra 2 (y) y valores similares en las muestras
1 y 2 (z). Modificado de Harrington y colaboradores (2000) con autorización de Elsevier Science.
 19.3 1 PERFIL GLOBAL DEL mRNA (TRANSCRIPTÓMICA) | 553

A) M icroarreglo d e DNA m an ch a d o B) A rreglo d e o llg o n u cleó tid o s d e a lta d e n sid a d

B a se d e
DNA d a to s p ú b lica I ___
^O — O blea
S elecció n d e se c u e n c ia \ / d e vidrio
' v
A m plificación m ed ia n te PC R / S ln te sls d e oligom ero
Purificación
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A _ _ _ y

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RNA 1 RNA 2 RNA 1 RNA 2
+ flúor ♦ + flúor + biotina ' ♦ + biotina

H ibridar
Lavar
Teñir

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Teñir
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554 CAPÍTULO DIECINUEVE j MÁS ALLÁ DEL PROYECTO DEL GENOMA
19.3.4 El análisis de datos de arreglos de DNA incluye
la creación de una matriz de distancia y
el agrupamiento de puntos de datos relacionados
utilizando algoritmos reiterativos
El análisis de datos de expresión génica en muchas
condiciones diferentes puede mostrar enlaces funcionales
entre genes
Los datos crudos de experimentos de microarreglos son intensi­
dades de señal que deben normalizarse (corregirse para efectos de
fondo y variación interexperimental, véase antes) y revisarse pa­
ra errores causados por contaminantes y valores extrínsecos ex­
tremos (Yang y cois., 200). Los datos se resumen como un cuadro
de intensidades de señal normalizadas en el que las hileras del
cuadro representan genes individuales y las columnas indican di­
ferentes condiciones bajo las que se midió la expresión génica.
En los casos simples, el cuadro tiene dos columnas (p. ej., mues­
tra testigo y muestra de enfermedad) y éstas pueden representar
las intensidades de señal de las dos muestras que se hibridan al
mismo tiempo al arreglo. Sin embargo, no hay un límite teórico
en cuanto al número de condiciones que pueden emplearse.
Por ejemplo, la expresión génica puede estudiarse en una serie
de puntos de tiempo del desarrollo o en una serie de puntos de
tiempo tras el inicio de una infección viral, o cuando células cul­
tivadas se expusieron a una gama de fármacos y otras sustancias
químicas.
La siguiente etapa del análisis comprende el agrupamiento de
genes con perfiles de expresión similares (Altman y Raychaudhu-
ri, 2001; Quackenbush, 2001). Por lo general el análisis es más ri­
guroso cuanto mayores sean las condiciones en las que la
expresión génica se estudia. La figura 19-7 muestra el análisis de
tres genes en tres condiciones. Al inicio los genes A y B parecen
relacionados en términos funcionales porque los perfiles de expre­
sión son similares bajo las condiciones 1 y 2, en tanto que el gen
C parece diferente. Sin embargo, si se consideran las condiciones
C1 C2 C3
A A
B A
Fig. 19-7. Este ejemplo simple muestra la importancia de vigilar el
análisis de expresión gènica en varias condiciones.
Los perfiles de expresión de los genes A y B parecen similares bajo las
condiciones 1 y 2 (es decir, ambos permanecen estáticos), en tanto
que el gen C parece estar disminuido bajo la condición 2. Ello sugiere
que los genes A y B se relacionan funcionalmente y que C es distinto.
Sin embargo, si los perfiles se observan bajo las condiciones 2 y 3, y
se ignora la condición 1, parecería que los genes A y C se relacionan
funcionalmente y que B es diferente. El análisis de las tres condiciones
sugiere que no existe relación entre ninguno de los genes.
2 y 3 en el análisis y se omite la condición 1 ahora parece que las
funciones de los genes A y C se relacionan a expensas del gen B.
Las comparaciones en muchas condiciones ayudan a eliminar re­
laciones falsas que pueden conducir a anotaciones falsas. En tan­
to que el análisis de una matriz simple 3 X 3 puede efectuarse
visualmente, los datos de expresión que incluyen miles de genes y
decenas de condiciones deben examinarse con la ayuda de compu­
tadoras. Se utilizan dos tipos de algoritmo para explorar los datos
de expresión génica: uno en el que se agrupan datos similares en
forma jerárquica y otro en el que los grupos se definen en una
manera no jerárquica.
Agrupamiento jerárquico
El enfoque general del agrupamiento jerárquico consiste en esta­
blecer una matriz de distancia que lista las diferencias en los va­
lores de expresión entre cada par de caracteres en el arreglo. A
continuación se agrupan en forma progresiva los que muestran las
diferencias más pequeñas, expresadas como la función de distan­
cia d. Los métodos de agrupamiento aglomerativo inician con la
clasificación de cada gen representado en el arreglo como un gru ­
p o único (es decir, un grupo que contiene un gen). Se busca la dis­
tancia de matriz, los dos genes con los valores de expresión más
similares (la función de distancia más pequeña) se definen como
vecinos y luego se funden en un grupo único. El proceso se repite
hasta que sólo queda un grupo. La forma en que se calcula el va­
lor de expresión del grupo fusionado para el propósito de compa­
raciones adicionales presenta variaciones.
En el método del vecino más cercano (enlace único), la dis­
tancia se reduce al mínimo. Es decir, donde dos genes i y j se fu­
sionan en un grupo único ij, la distancia entre ij y el siguiente gen
más cercano k se define como el más bajo de los dos valores d(i,k)
y d(j,k). El método de enlace promedio utiliza el promedio entre
d(i,k) y d(j,k). En el método del vecino más lejano (enlace com­
pleto) la distancia se lleva al máximo. Estos métodos generan dendo-
gramas con estructuras diferentes (fig. 19-8). Con menos frecuencia
puede emplearse un algoritmo de agrupamiento divisivo en el que un
grupo aislado que representa todos los genes en el arreglo se corta
progresivamente en grupos separados.
A
B B
C C
D D
Fig. 19-8. Análisis de datos de microarreglos con el uso de los per­
files de expresión hipotéticos de cuatro genes (A a D).
Los métodos de agrupamiento jerárquico producen diagramas de
ramificación (dendrogramas) en los que genes con los perfiles de
expresión más similares se agrupan entre sí, pero métodos de
agrupación alternativos producen dendrogramas con distintas
topologías. El patrón de la izquierda es característico de la topología
producida por el agrupamiento del vecino más cercano (enlace único)
en tanto que el patrón a la derecha es típico de la topología que el
agrupamiento del vecino más lejano produce (enlace completo).
 19.3 | PERFIL GLOBAL DEL mRNA (TRANSCR1PTÓM1CA) j 555
Agrupamiento no jerárquico
Una desventaja del agrupamiento jerárquico es que toma tiempo
y demanda grandes recursos. Como alternativa, los métodos no
jerárquicos dividen los datos de expresión en un cierto número de
agrupamientos predefinidos y por consiguiente el análisis se ace­
lera en forma considerable, en especial cuando el grupo de datos
es muy grande. En el m étod o d e a gru p a m ien to d e m ed ia s k, varios
puntos que se conocen como centros de agrupamiento se definen
al inicio del análisis y cada gen se asigna al centro de agrupamien­
to más apropiado. Con base en la membresía de cada grupo, se
calculan de nuevo las medias, es decir, los centros de agrupamien­
to se recolocan. Después se repite el análisis de manera que todos
los genes se asignan a los nuevos centros de agrupamiento. Este
proceso se repite hasta que la membresía de los diversos agrupa­
mientos ya no cambia. Los mapas de autoorganización son simi­
lares en concepto pero el algoritmo se refina mediante el uso de
una red neural.
19.3.5 Los arreglos de DNA se utilizan para estudiar
la expresión génica global en líneas de células
humanas, biopsias de tejidos y modelos animales
de enfermedad
La comparación de muestras sanas y enfermas puede
emplearse para identificar marcadores de enfermedad
y posibles blancos farmacológicos
Los arreglos de DNA se usan con amplitud para caracterizar el
transcriptoma humano y el estudio de enfermedades tal vez sea la
aplicación práctica más importante de esta tecnología. La compa­
ración de tejido sano y enfermo, representado por líneas celulares,
biopsias de tejido o modelos animales, permite identificar los genes
que se expresan de modo específico en el estado patológico o de
manera especial en el no patológico. Genes individuales específicos
de enfermedad pueden constituir marcadores diagnósticos útiles.
Los genes específicos de enfermedad pueden codificar proteínas cu­
ya presencia o actividad contribuye a los síntomas de la afección y
constituyen posibles blancos para la intervención terapéutica. De
igual forma, si los productos de uno o más genes están ausentes en
la enfermedad, las proteínas en sí mismas pueden representar agen­
tes terapéuticos útiles.
El estudio de McCaffrey y colaboradores (2000) es un ejemplo
informativo de la conducta anterior. Estos investigadores utiliza­
ron GeneChips Affymetrix para comparar los perfiles de expresión
de arterias normales y arterias extirpadas de pacientes con lesiones
ateroescleróticas. Demostraron que un gen particular, EGR1, esta­
ba aumentado cinco veces en el estado patológico. Este gen codi­
fica un factor de transcripción que controla genes que codifican
factores de crecimiento y otras moléculas de señalamiento, mo­
léculas de adherencia celular y proteínas que regulan la coagula­
ción sanguínea. Estas proteínas corriente abajo desempeñan
funciones con implicaciones obvias en el depósito de células abun­
dantes en colesterol en la superficie interna de las arterias y por
tanto EGR1 es un blanco farmacológico útil.
Los análisis multiplex pueden proporcionar perfiles de
transcripción útiles para distinguir enfermedades muy
similares y descubrir nuevas subcategorías de enfermedad
Los marcadores aislados no son útiles para el diagnóstico de todas
las enfermedades, en particular las que se relacionan de modo cer­
cano (p. ej., diferentes tipos de cáncer). En estos casos es posible
emplear arreglos para derivar perfiles transcripcionales de 50 a 100
genes que ofrecen mayor discriminación. Este procedimiento se
denomina predicción d e clase cuando las categorías de la enferme­
dad se conocen. Se espera que los resultados del experimento se
ajusten a un cierto número de categorías definidas con anteriori­
dad y por esta razón el análisis de datos se describe como “super­
visado”.
Un ejemplo de este método es el uso de arreglos para diferenciar
entre leucemia mieloide aguda (LMA) y leucemia linfoblastoide
aguda (LLA). Aunque las enfermedades son similares, responden a
diferentes tratamientos y por consiguiente el diagnóstico correcto es
esencial para el éxito en la terapéutica. Casi siempre se utiliza
una combinación de técnicas, que incluyen detección de marca­
dores proteínicos, tinción diferencial, análisis citogenético e ins­
pección visual de células en frotis sanguíneo. Ninguna de las
pruebas es 100% precisa y en algunos casos pruebas separadas
proporcionan resultados contradictorios. Golub y colaboradores
(1999) usaron arreglos manchados que representaban alrededor
de 7 000 genes humanos para examinar 38 muestras de médula
ósea. Con el algoritmo de mapas de autoorganización comenta­
do identificaron de manera correcta cada muestra como repre­
sentativa de LMA o de LLA con base en el perfil de alrededor de
50 genes.
En algunos casos el perfil de expresión de muestras de enferme­
dad identifica subcategorías de la enfermedad antes desconocidas
(descubrimiento de clase). Como las categorías no se definen al inicio
del experimento, este tipo de análisis se define como “no supervisa­
do”. Por ejemplo, por medio de un microarreglo de cDNA, Aliza-
den y colaboradores (2000) identificaron dos subtipos diferentes de
linfoma no Hodgkin (véase fig. 17-18). Sólo 40% de los pacientes
con esta enfermedad se benefició con el tratamiento farmacológico
y hasta fecha reciente no se conocía una forma de predecir quiénes
responderían a la terapéutica. Sin embargo, al parecer los dos nue­
vos subtipos de la enfermedad corresponden a los tipos del pade­
cimiento que responde y que no lo hace. Asimismo Bittner y
colaboradores (2000) pudieron identificar dos subtipos distintos
de melanoma cutáneo.
Líneas celulares y modelos animales pueden utilizarse
para estudiar perfiles de expresión génica bajo múltiples
condiciones o en múltiples puntos de tiempo
51 bien las biopsias permiten comparar perfiles de expresión géni­
ca en la salud y la enfermedad, las líneas celulares y los modelos
animales ofrecen la mayor versatilidad para estudiar diferentes
condiciones o distintos puntos de tiempo. Por ejemplo, Zhu y co­
laboradores (1998) infectaron fibroblastos de prepucio humano
cultivados con citomegalovirus y analizaron los perfiles de expre­
sión génica en varios puntos de tiempo después de la infección
556 1 CAPÍTULO DIECINUEVE j MÁS ALLÁ DEL PROYECTO DEL GENOMA
utilizando un microarreglo de cDNA que contenía 6 000 genes.
Demostraron que durante la infección estaban incrementados
más de 250 genes, inclusive varios que se sabe que modulan la
respuesta inmunitaria. También usaron líneas celulares para estu­
diar el efecto de los factores de crecimiento y las citocinas (p. ej.,
Der y cois., 1998) y la transfección con oncogenes (como Khan y
cois., 1999). Una extensión de este método es el uso de líneas ce­
lulares humanas a fin de analizar repuestas a fármacos, sustancias
químicas y toxinas. En ocasiones estos experimentos revelan en­
laces funcionales inesperados entre genes. Por ejemplo, Iyer y co­
laboradores (1999) estudiaron el transcriptoma de células con
agotamiento sérico después de la adición de suero fresco y mos­
traron la inducción de diferentes clases de genes en distintos pun­
tos de tiempo después de la revitalización. Los primeros genes
que se expresaron fueron los genes de respuesta de proliferación,
como JU N y FOS, pero en puntos de tiempo posteriores muchos
de los genes inducidos fueron los que participan en la cicatriza­
ción de heridas, como FGF7 y VEGF.
19.4 Proteóm ica
19.4.1 La proteómica comprende el análisis de la
expresión de proteínas y de la estructura
y las interacciones proteínicas
El análisis del proteoma muestra la forma cómo los
cambios en la abundancia de proteínas particulares
coordinan las actividades bioquímicas de la célula
Si bien es muy útil analizar el transcriptoma para caracterizar la fun­
ción génica, no debe olvidarse que los productos finales de la mayor
parte de los genes son proteínas. La proteómica permite estudiar de
modo directo estos productos y ello es importante porque expone dos
limitaciones del análisis del transcriptoma.
Primero, en parte a causa de la regulación postranscripcional,
no todos los mRNA en la célula se traducen, de manera que el
transcriptoma puede incluir productos génicos que no se encuen­
tran en el proteoma. De igual modo las tasas de síntesis y recambio
de proteínas difieren entre los transcritos y por tanto la abundan­
cia de un transcrito no siempre corresponde a un exceso de la pro­
teína codificada (Gygi y cois., 1999b). Por estas razones es posible
que el transcriptoma no represente con precisión el proteoma des­
de los puntos de vista cualitativo o cuantitativo.
Segundo, a menudo la actividad de las proteínas depende de
modificaciones postraduccionales que no pueden predecirse a par­
tir del nivel del transcrito correspondiente. Muchas proteínas se
encuentran en la célula como moléculas inertes, que necesitan ac­
tivarse mediante procesos como corte proteolítico o fosforilación.
En casos en que la variabilidad en la abundancia de una variante
postraduccional específica es importante, ello significa que sólo la
proteómica provee la información necesaria para establecer una re­
lación entre la expresión y la función génicas. Por ejemplo, la pro­
teína de señalamiento estatmina se encuentra en valores altos en
varios cánceres, inclusive leucemias de la niñez, pero sólo la forma
fosforilada de la proteína es un marcador útil de la enfermedad. En
consecuencia es necesario estudiar directamente el proteoma para
comprender por completo las moléculas funcionales presentes en
la célula.
El análisis de la estructura y las interacciones de las
proteínas puede aportar información funcional importante
Como la transcriptómica, la proteómica puede usarse con objeto
de vigilar la abundancia de diferentes productos génicos. Es posible
comparar la expresión de todas las proteínas de la célula entre
muestras relacionadas, lo que permite identificar proteínas con pa­
trones de expresión similares y destacar los cambios importantes
que ocurren en el proteoma, por ejemplo, durante la enfermedad o
la respuesta a estímulos externos particulares. En ocasiones esto se
denomina proteómica de expresión. Sin embargo, otra dimensión
importante de la proteómica es que a menudo permite establecer
las funciones mediante la investigación de las interacciones pro­
teínicas. Las proteínas cumplen sus actividades en las células inte-
ractuando con otras moléculas. Por consiguiente el establecimiento
de interacciones específicas entre proteínas puede ayudar a asignar
funciones individuales y relacionar proteínas dentro de vías y redes.
Es posible derivar más información de interacciones de las proteí­
nas con moléculas pequeñas (que pueden actuar como ligandos,
cofactores, sustratos, moduladores alostéricos, etc.) y ácidos nuclei­
cos. El análisis de interacciones de las proteínas se superpone con el
análisis de su estructura. El conocimiento de la estructura tridi­
mensional de una proteína puede ayudar a predecir interacciones
con otras proteínas y con moléculas más pequeñas, lo que quizá sea
muy útil en el desarrollo de medicamentos eficaces. La compara­
ción de estructuras proteínicas también proporciona un medio adi­
cional para determinar relaciones evolutivas entre genes e investigar
sus funciones.
19.4.2 La proteómica de expresión floreció a través
de la combinación de dos plataformas de
tecnología mayores: la electroforesis en gel
bidimensional (EG2D) y la espectrometría
de masa
El proteoma contiene decenas de miles de proteínas que varían en
abundancia en cuatro o más órdenes de magnitud. Como los áci­
dos nucleicos, las proteínas pueden detectarse e identificarse me­
diante interacciones moleculares específicas, en la mayor parte de
los casos con anticuerpos u otros iigandos como sonda. Sin embar­
go, a diferencia de los ácidos nucleicos, no se dispone de un pro­
cedimiento para clonar o amplificar proteínas raras. Más aún, las
propiedades físicas y químicas de las proteínas son tan diversas que
no es posible utilizar análogos de una metodología universal úni­
ca para hibridación a fin de estudiar el proteoma completo en un
solo experimento. Por tanto, aunque el desarrollo de chips de pro­
teínas como equivalentes directos de microarreglos de DNA des­
pierta un interés importante (recuadro 19-3), en la actualidad se
requieren plataformas de tecnología alternativas para el análisis de
la totalidad del proteoma.
Hoy en día la proteómica de expresión se basa en la tecnolo­
gía de “separación y exhibición”, en la que mezclas proteínicas

Recuadro 19-3. Chips de proteínas
Los microarreglos de DNA son útiles para analizar el genoma completo
porque todas las moléculas de DNA son quimicamente similares y pueden
hibridarse en una valoración. En contraste, las proteínas son muy diversas
desde el punto de vista químico. Algunas son acidas, en tanto que otras
son básicas; algunas son cargadas o polares, mientras que otras son hi­
drófobas y muchas sufren modificación postraduccional que altera aún
más sus propiedades químicas y físicas. Por esta razón es difícil producir
chips de proteínas de verdad “ universales” . Sin embargo, durante los últi­
mos años se lograron muchos adelantos en la tecnología de chips de pro­
teínas que culminaron con la creación de un chip del proteoma completo
para la levadura Saccharomyces cerevisiae (Zhu y cois., 2001). Se descri­
ben varios tipos de chip de proteínas (véase Zhu y Snyder, 2003).
► Chips de anticuerpos. Consisten en grupos de anticuerpos y se em­
plean para detectar y cuantificar proteínas específicas en una mezcla
compleja. Pueden conceptuarse com o dispositivos de inmunovalora-
ción de alto rendimiento en miniatura.
► Chips de antigenos. Son los contrarios de los chips de anticuerpo; es­
tos dispositivos contienen antígenos de proteínas en grupos que se uti­
lizan para detectar y cuantificar anticuerpos en una mezcla compleja.
► Chips de proteínas universales (arreglos funcionales). Pueden
contener cualquier tipo de proteína ordenada en la superficie y usar­
complejas se separan en sus componentes de modo que puedan
captarse rasgos interesantes (p. ej., proteínas que se encuentran en
un espécimen de enfermedad pero no en una muestra sana equi­
parable) para la caracterización más amplia. La separación suele
efectuarse mediante electroforesis en un gel bidimensional
(EG2D), una técnica que se desarrolló hace más de 25 años y que
tiene la potencia de resolver hasta 10 000 proteínas en un solo gel
(Gorg y cois., 2000; Herbert y cois., 2001). Hasta hace pocos años
el principal cuello de botella en la proteómica era la caracterización
de las proteínas separadas, que están representadas por “manchas”
anónimas. Como se comentó, una forma en que las proteínas
pueden identificarse y cuantificarse es usando anticuerpos u otras
sondas específicas. Sin embargo, este método sólo puede aplicar­
se a un número pequeño de proteínas en cualquier experimento
aislado y confía en la disponibilidad de dichas sondas. El adelan­
to científico llegó con el desarrollo de técnicas de anotación basa­
das en espectrometría de masa, que pueden aplicarse a cualquier
proteína e implementarse a gran escala (Griffín y cois., 2001;
Mann y cois., 2001). Ello requiere innovaciones en el diseño de
instrumentos y nuevos métodos bioinformáticos de búsqueda en
bases de datos con información de masa péptida (Aebersold y
Mann, 2003).
La electroforesis en gel bidimensional (EG2D) es la principal
plataforma para la separación de proteínas en proteómica
pero no está exenta de limitaciones
Se conocen muchos métodos distintos para separar proteínas y
todos explotan las propiedades químicas o físicas particulares que
difieren de una proteína a otra, por ejemplo, masa, tamaño, car­
ga, solubilidad y afinidad por diferentes ligandos. Como cabría es­
perar, la resolución es mayor cuanto más propiedades se utilicen
19.4 I PROTEÓMICA j 557
se para detectar y caracterizar interacciones específicas proteína-
proteína y proteína-ligando. Es posible recurrir a varios métodos de
detección, que incluyen marcado de proteínas en solución o detección
de cambios en las propiedades de superficie del chip, esto es, me­
diante resonancia de plasmón de superficie. Esta categoria compren­
de arreglos de lectina, que se emplean para detectar y caracterizar
glucoproteinas.
► Chips de captura de proteínas. No contienen conjuntos de proteínas
o proteínas ordenadas sino otras moléculas que interactúan con pro­
teínas como agentes de captura amplios o específicos. Los ejemplos
Incluyen aptámeros de oligonucleótidos y chips que contienen polí­
meros moleculares im prontos como agentes de captura específicos,
o los chips de proteínas de patente manufacturados por compañías
como BIAcore Inc. y Ciphergen Biosystems Inc., que utilizan agentes
de captura amplios basados en la diferenciación de sustancias quími­
cas superficiales para simplificar las mezclas proteínicas complejas.
► Arreglos en solución. La última generación de chips de proteínas se
liberó del formato de arreglo bidimensional para incrementar su flexi­
bilidad y capacidad de manejo. Estos dispositivos pueden basarse,
por ejemplo, en microesferas codificadas o nanopartículas de oro co­
dificadas con barras.
en cualquier técnica de separación. El principio de la EG2D con­
siste en separar proteínas con base en su carga y masa, y cada se­
paración se realiza en una dimensión diferente (Gorg y cois., 2000;
Herbert y cois., 2001). Una muestra compleja de proteínas se car­
ga en un gel de poliacrilamida desnaturalizante y se separa en la
primera dimensión mediante enfoque isoeléctrico. En esta técni­
ca las proteínas migran en un gradiente de pH hasta que llegan a
su punto isoeléctrico (la posición en que su carga es neutral con
respecto al pH local). El procedimiento estándar consiste en pre­
parar un g e l d e g r a d ien te d e p H in m oviliz a d o ( GPI), en el que
se fijan grupos amortiguadores a la matriz de poliacrilamida, que
impiden que se mezclen y tornen inestables durante las carreras en
el gel largo. A continuación el gel se equilibra en el detergente do-
desilsulfato sódico, que se enlaza de manera estoiquiométrica a la
estructura básica de las proteínas desnaturalizadas y confiere una
carga negativa masiva que cancela con efectividad cualquier dife­
rencia de carga entre proteínas individuales. Por tanto la separa­
ción en la segunda dimensión depende de la masa de la proteína;
las proteínas más pequeñas se mueven con mayor facilidad a tra­
vés de los poros del gel. Luego el gel se tiñe y las proteínas se des­
cubren como un patrón de manchas (fig. 19-9).
Aunque la EG2D tiene una resolución alta y es la técnica que
más se emplea en proteómica para separar proteínas, su utilidad tie­
ne varias limitaciones en cuanto a representación, sensibilidad, re-
producibilidad y conveniencia (sobre todo en términos de su
adecuación para la automatización). Varias clases de proteínas están
menos representadas en gel estándares, inclusive proteínas muy bá­
sicas, proteínas con mala solubilidad en amortiguadores acuosos y
proteínas de membrana. Quizá sea necesario fraccionar antes la
muestra proteínica y usar diferentes detergentes y amortiguadores
para extraer distintas clases de proteínas a fin de separarlas con efec­
tividad. La sensibilidad de la EG2D depende del límite de detección
558 CAPÍTULO DIECINUEVE MÁS ALLÁ DEL PROYECTO DEL GENOMA

PH b ajo pH bajo
r --------^
- ------------------------------------------------------- >

o*

o
Equilibrar en SDS
o Transferir el gel de enfoque a gel SDS
Aplicar cam po eléctrico ortogonal
o
Aplicar cam po eléctrico --------------------------------------------- ►
--
© — m

© < #

r • •
*— " - -
pH alto pH alto

Fig. 19-9. Principio de la electroforesis en gel bidimensional.

Una mezcla compleja de proteínas se carga en el extremo básico de un gel de isoelectroenfoque (a menudo un gel en tubo o una tira premoldeada, que
comprende una matriz de poliacrilamlda con un gradiente de pH inmovilizado). Un campo eléctrico se aplica a través del gel y las proteínas migran hacia
sus puntos isoeléctricos, donde el valor pl equivale al pH circundante y la carga neta es cero. Esto separa las proteínas con base en su carga (las
proteínas ácidas se muestran en rojo y las básicas en amarillo, con sombras de naranja que indican proteínas con valores pl intermedios). Aunque el gel
tamiza las proteínas según su tamaño, las carreras largas en el gel aseguran que todas las proteínas lleguen a sus puntos isoeléctricos y el sistema se
equilibra. A continuación el gel de enfoque se equilibra en SDS, que se enlaza con una relación de masa constante con todas las proteínas desnaturalizadas
y se fija a un poliacrilamida SDS estándar. Luego las proteínas se separan con base en el tamaño (indicado por círculos de diámetros diferentes) y las
más pequeñas de éstas migran más allá a través del gel que las más grandes.

para proteínas muy escasas y esto se abordó con el desarrollo de
reactivos de tinción muy sensibles conocidos como colorantes SY-
P R O que pueden detectar manchas proteínicas en límites de nano-
gramos. También la resolución del gel influye la sensibilidad
porque es difícil detectar manchas que representan proteínas esca­
sas cuando las que representan proteínas abundantes las ocultan.
Estos problemas pueden tratarse mediante fraccionamiento previo
para eliminar proteínas abundantes y simplificar la muestra inicial
que se carga en el gel, e incrementando la resolución de la separa­
ción. En el último caso es posible aumentar la distancia de separa­
ción con el uso de gel de formato muy grande, pero una alternativa
más conveniente consiste en emplear gel zoom para isoelectroen­
foque, es decir, un gel con un límite de pH muy reducido (fig. 19-
10). Las imágenes obtenidas de gel zoom pueden unirse entre sí en
una computadora para analizar el proteoma completo.
Una de las principales limitaciones de la EG2D radica en que
no es muy adecuada para la automatización, que el análisis de al­
to rendimiento de muchas muestras requiere. Fue necesario crear
programas de computadora para el reconocimiento y la cuantifi-
cación de las manchas, algoritmos que pueden comparar manchas
proteínicas a través de múltiples gel y robots que pueden captar
manchas interesantes y procesarlas para espectrometría de masa
(EM). Muchas de las dificultades que la EG2D presenta pueden
abordarse mediante el desarrollo de métodos de separación alter­
nativos basados en cromatografía líquida de alta presión multidi-
mensional (CLAP). Estos métodos son más rápidos y sensibles,
no demandan el teñido de proteínas, permiten una cuantificación
más precisa, pueden resolver proteínas que están menos represen­
tadas en la EG2D y son mucho más fáciles de automatizar e in­
tegrar con el análisis corriente abajo. Aunque carecen del aspecto
visual de los gel teñidos, es posible que los métodos de cromato­
grafía líquida desplacen la EG2D como la principal plataforma
para la separación de proteínas en proteómica (Lesney, 2001;
Wang y Hanash, 2003).
La espectrometría de masa es el único método universal
para la anotación de alto rendimiento de proteínas anónimas
La espectrometría de masa (EM) se utiliza para determinar las
masas precisas de moléculas en una muestra o anilato particula­
res. El principio de la anotación proteínica mediante EM es el uso
de masas moleculares precisas como términos de búsqueda para
explorar bases de datos (Mann y cois., 2001; Aebersold y Mann,
2003). Éste puede completarse más rápido que el método de anota­
ción alternativa, la secuenciación directa de proteínas mediante
degradación Edman, y es fácil automatizarlo para analizar mues­
tras de alto rendimiento. Es importante cuando se considera la ne­
cesidad de procesar miles de manchas de un gel 2D o cientos de
fracciones de CLAP.

24 cm
Fig. 19-10. Potencia de resolución de gel con límite de pH estrecho.
Ambas imágenes representan proteínas de hígado de ratón separadas
mediante electroforesis en gel bidímensíonai y tinción argéntica para
revelar puntos de proteínas individuales. La imagen superior es un gel
de límites de pH amplios (pH 3 a 12) en tanto que la inferior es un
gel de límite de pH estrecho, que reúne las proteínas en los limites de
pH 5 a 6. Obsérvese que en el gel de límites más amplios casi todas
las proteínas se agrupan en la parte medía, lo que señala el hecho
de que los valores pl de la mayor parte de las proteínas se encuentra
en los límites de 4 a 7. Reproducido de Orengo y colaboradores (2002)
Bioinformatics. Publicado por BIOS Scientlflc Publishers.
Hasta fecha reciente no era factible aplicar la EM a moléculas
candes, como proteínas y ácidos nucleicos, porque se rompían
;n fragmentos aleatorios durante el proceso de ionización. Los
métodos de a u to io n iz a ció n , como la desorción/ionización con
.¿ser asistida por matriz (DILAM) y la ionización por electropul-
verización (IEP) (véase recuadro 19-4), permiten ionizar estas
moléculas sin fragmentarlas (fig. 19-11). Las masas de proteínas,
o con más frecuencia los fragmentos péptidos derivados de ellas
19.4 j PROTEÓMICA 559
mediante digestión con proteasas, pueden utilizarse para identifi­
car las proteínas correlacionando las masas determinadas de ma­
nera experimental con las predichas a partir de secuencias de
bases de datos. Hay tres formas diferentes de anotar una proteína
por medio de EM (fig. 19-12):
► Huella de masa péptida (HMP). Una mezcla de una proteí-
na simple (casi siempre una mancha aislada de un gel 2D) se
digiere con tripsina a fin de generar un conjunto de péptidos
trípticos. Éstos se someten a DILAM-EM con un analizador
de tiempo de vuelo (TDV) (recuadro 19-4), que regresa un gru­
po de espectros de masa. Estos espectros se emplean como un
buscador de indagación contra la base de datos SWISS-PROT.
El algoritmo de indagación efectúa digeridos virtuales de tripsi­
na de todas las proteínas en la base de datos y calcula las masas
de los péptidos trípticos predichos. Después intenta equiparar
estas masas predichas con las determinadas por medios experi­
mentales.
► Búsqueda de fragmento iónico. Se recurre a este método si
la HMP no tiene éxito. Dos fragmentos péptidos trípticos se
analizan mediante espectroscopia de masa tándem (EM/EM;
recuadro 19-4), durante la cual los péptidos se rompen en
fragmentos aleatorios. Los espectros de masa de estos frag­
mentos pueden usarse para buscar contra bases de datos de
MSE (marcadores de secuencia expresados), que no pueden
buscarse con datos de HMP porque los péptidos intactos sue­
len ser muy grandes. Cualquier acierto en MSE puede em­
plearse luego en una búsqueda BLAST a fin de identificar
posibles homólogos de longitud completa. Un algoritmo espe­
cializado llamado MS-BLAST es útil para manejar las caracte­
rísticas de secuencia corta obtenidas de iones de fragmentos
péptidos.
► Secuenciación nueva de escaleras péptidas. En esta técni­
ca los fragmentos péptidos generados por EM/EM se arre­
glan dentro de un grupo anidado que difiere de longitud en
un aminoácido aislado. La comparación de las masas de es­
tos fragmentos con tablas estándar de aminoácidos permite
deducir la secuencia del fragmento péptido nuevo, aun cuan­
do no se disponga de una secuencia precisa comparable en la
base de datos. El método de secuenciación nueva se compli­
ca en la práctica por la presencia de dos series de fragmentos,
uno anidado en la terminal N y el otro anidado en la termi­
nal C. Las dos series pueden distinguirse mediante la fijación
de marcadores de masa diagnósticos a cualquier extremo de la
proteína.
En un método general la HMP se intenta primero y si no tiene éxi­
to, suelen probarse otros métodos menos precisos. La HMP es más
adecuada para analizar proteomas simples como el proteoma de la
levadura, que muestran pocas variantes de empalme y modificacio­
nes postraduccionales. El análisis del fragmento iónico es más per­
tinente para analizar proteomas complejos y el algoritmo puede
modificarse para considerar las masas de modificaciones postraduc­
cionales conocidas. Sin embargo, resulta imposible explicar todas
las variantes a nivel secuencia! (p. ej., polimorfismos) o de modifi­
cación proteínica (como glucanos complejos). En estos casos la se­
cuenciación nueva puede proporcionar características de secuencia
560 j CAPÍTULO DIECINUEVE MÁS ALLÁ DEL PROYECTO DEL GENOMA

V ía s d e p é p tid o s io n iz a d o s
R e fle c to r

Fig. 19-11 Principio de EM DILAM-TDV.

El analifo (por lo general un conjunto de fragmentos de péptidos trípticos) se mezcla con un compuesto matriz y se coloca cerca de la fuente de un
láser. El láser calienta los cristales de analito/matriz y ocasiona la expansión del analito hacia la fase gaseosa sin fragmentación importante. A
continuación los iones viajan a través de un tubo de vuelo hacia un reflector, que los dirige a un detector. El tiempo de vuelo (el tiempo necesario para
que los iones lleguen al detector) depende de la relación carga/masa y permite registrar la masa de cada molécula en el analito.

H u e lla d e m a s a
p é p tid a
In c o m p a tib ilid a d
LG M DG YR e x a c ta
G IS IA N W M C L A K L is o z im a h u m a n a
W ESGYNTR

* D ig e s tió n p o r
« A tr¡Psina -V S t L iso zim a h u m an a
L iso zim a d e o ve ja
L a c to a lb ú m in a d e rata

C o n ju n to d e a c ie r to s
de M SE

G IS L A N
G IS L A N W
G IS L A N W M
E s c a le ra
G IS L A N W M C p é p tid a
G IS L A N W M C L
G IS L A N W M C L A
G IS L A N W M C L A K

Fig. 19-12. Anotación de proteínas mediante espectrometría de masa.

Muestras de proteínas individuales (p. ej., manchas de gel 2D) se digieren con tripsina, que corta en el lado terminal C de residuos de Usina (K) o de
arginina (R) en tanto el siguiente residuo no sea prolina. Los péptidos trípticos pueden analizarse como moléculas Intactas mediante DILAM-TDV y las
masas utilizarse como buscadores de indagación contra las bases de datos de proteínas. Se recurre a algoritmos que toman secuencias proteínicas, las
cortan con la misma especificidad de corte que la tripsina y comparan las masas teóricas de estos péptidos con las masas experimentales obtenidas
por espectrometría de masa. Como ideal, las masas de varios péptidos deben identificar la misma proteína original, en este caso la lisozima humana. Es
posible que no haya aciertos si la proteína no se encuentra en la base de datos o, con más probabilidad, se halla sujeta a modificación postraduccional
o artefactual durante el experimento. En estas circunstancias puede emplearse espectrometría de masa tándem-ESI para fragmentar los iones. Las
masas de los fragmentos iónicos pueden usarse para buscar en bases de datos MSE y obtener compatibilidades parciales, que quizá conduzcan a la
anotación correcta. De otra manera es posible recurrir a masas de escaleras péptidas para determinar secuencias proteínicas nuevas.
 19.4 j PROTEÓMICA 561

Recuadro 19-4. Espectrometría de masa en proteómica

ESPECTRÓMETRO DE MASA ANALIZADORES DE MASA

Un espectrómetro de masa tiene tres componentes. El ionizador que
convierte el analito en iones en fase de gas y los acelera hacia el anali­
zador de masa, que separa los iones según su relación masa/carga en
su camino al detector iónico, que registra el impacto de iones individua­
les y lo presenta como un espectro de masa del analito.
Métodos de ionización blanda
La ionización de moléculas grandes sin fragmentación y degradación se
conoce como ionización blanda. En proteómica se utilizan con amplitud
dos de estos métodos. La desorción/ionización láser asistida por matriz
(DILAM) comprende mezclar el analito (los péptidos trípticos derivados
de una muestra particular de proteínas) con un compuesto de matriz que
absorbe la luz en un solvente orgánico. La evaporación del solvente pro­
duce cristales de analito/matriz, que se calientan mediante un pulso cor­
to de energía láser. La desorción de la energía láser com o calor origina la
expansión de la matriz y el analito hacia la fase de gas. A continuación el
analito se ioniza y se acelera hacia el detector. En la ionización de elec-
tropulverización (IEP), el analito se disuelve y la solución se impulsa a
través de un capilar estrecho. Una diferencia de potencial, aplicada a tra­
vés de la abertura, ocasiona que el analito emerja com o una pulverización
fina de partículas cargadas. Las gotitas se evaporan conforme los iones
penetran en el analizador de masa.
Los dos tipos más simples de analizador de masa que se usan en pro­
teómica son los analizadores cuadrupolo y de tiempo de vuelo (TDV).
Un analizador cuadrupolo consiste en cuatro varillas de metal, que están
conectadas eléctricamente en pares y llevan voltajes opuestos que el
operador puede controlar. El espectro de masa se obtiene al variar la di­
ferencia de potencial que se aplica a través de la corriente iónica, lo que
permite que los iones de diferentes relaciones masa/carga se dirijan al
detector. Un analizador de tiempo de vuelo mide el tiempo que los iones
necesitan para viajar a través de un tubo de vuelo hasta el detector, un
factor que depende de la relación masa/carga.
ESPECTROMETRÍA DE MASA TÁNDEM (EM/EM)
Comprende el uso de dos o más analizadores de masa en serie. Se des­
criben varios instrumentos EM/EM que incluyen los dispositivos cuadru­
polo triple y el híbrido cuadrupolo/tiempo de vuelo. Los analizadores de
masa están separados por una celdilla de colisión que contiene gas Iner­
te y ocasiona que los iones se disocien en fragmentos. El primer analiza­
dor selecciona un ion péptido particular y lo dirige hacia la salida de
colisión, donde se fragmenta. El segundo analizador obtiene un espectro
de masa para los fragmentos. Estas dos funciones pueden combinarse
en instrumentos más complicados, com o los analizadores de atrapa­
miento de iones y el ciclotrón iónico de transformación Fourier.

factibles de utilizar como buscadores para indagación a fin de iden­

tificar secuencias homologas en las bases de datos.

La espectrometría de masa (EM) también puede emplearse

para analizar proteínas que se expresan de modo diferencial
El objetivo de muchos experimentos proteómicos es identificar
proteínas cuya abundancia difiere de manera significativa a tra­
vés de dos o más muestras. Una forma en que puede lograrse
consiste en examinar gel 2D e identificar manchas que muestran
variación cuantitativa; se cuenta con varios paquetes de progra­
mas de computadora para ayudar en estas investigaciones com­
parativas. Una alternativa consiste en marcar proteínas de dos
muestras diferentes mediante conjugación con Cy3 y Cy5, y se­
rrarlas en el mismo gel (véanse Patten y Beecham, 2001; Rabi­
l a d , 2002; fig. 9-13). Este método, que se conoce como
ílectroforesis en gel de diferencia (EGDI), aprovecha el mis-
—o principio que la expresión génica diferencial con microarre-
ijos de DNA que se comenta en la sección 19.3.3. Otra forma
— de abordar el problema es marcar proteínas de diferentes
s con marcadores de afinidad codificados con isótopos
MACI: Gygi y cois., 1999a; Sechi y Oda, 2003). Una espectro- Fig. 19-13. Demostración del principio de electroforesis en gel de
mnria de masa puede distinguir y cuantificar con facilidad dos diferencia.
¿ciñas del mismo compuesto marcadas de modo isotópico que Muestras idénticas de proteínas de la bacteria Erwinla carotovora se mar­
k b químicamente idénticas y pueden copurificarse. En conse- caron con Cy3, y Cy5, pero en la muestra Cy5 el pico se Incrementó con
^-jinria se creó un método de MACI que utiliza un derivado yo- ocho veces las concentraciones normales de dos proteínas de estudio,
a:ac«am ida biotinilado con objeto de marcar de manera mioglobina y conalbúmina. Las proteínas que abundan por igual en las
circova mezclas de proteínas en sus residuos de cisteína. El muestras aparecen en amarillo porque las señales Cy3 y Cy5 tienen la
Trjir^dor de biotina permite la purificación de afinidad de los misma intensidad en la imagen superpuesta. Las tres ¡soformas de conal­
jccndos de cisteína marcados después de proteólisis con tripsi- búmina y las dos ¡soformas de mioglobina, con mayor abundancia en la
■ l El reactivo MACI se encuentra en las formas “pesada” (d8) población marcada con Cy5, aparecen como puntos rojos. Reproducido
» "Sgera” (dO) marcadas isotópicamente, que pueden emplearse de Lilley y colaboradores (2001), con autorización de Elsevier Science.
562 | CAPÍTULO DIECINUEVE MÁS ALLÁ DEL PROYECTO DEL GENOMA
para marcar de modo diferencial fondos celulares bajo condicio­
nes distintas (p. ej., salud y enfermedad). Tras el marcado, las
células se combinan y lisan, y las proteínas se aíslan de manera
que ambas muestras experimentan pérdidas por purificación
iguales. Las intensidades de isótopos se comparan para péptidos
conforme penetran en el espectrómetro de masa. Si son equiva­
lentes, entonces no ocurrió aumento o disminución y la proteína
no tiene un interés inmediato. Cuando las intensidades difieren se
efectúa un cambio en la expresión proteínica y la proteína es de in­
terés. La cantidad de las dos formas se mide y la forma dO se frag­
menta del péptido y se identifica mediante búsqueda en base de
datos.
19.4.3 La proteómica de expresión se usa para estudiar
cambios en el proteoma relacionados con
enfermedad y toxicidad
La proteómica puede revelar marcadores de enfermedad
y posibles blancos farmacológicos no identificados por
análisis del transcriptoma
La abundancia variable de proteínas específicas en muestras sa­
nas y patológicas, o en las que representan la progresión de la
enfermedad, puede ayudar a descubrir marcadores útiles y nue­
vos blancos farmacológicos. Por ejemplo, se identificaron varias
proteínas que se expresan en valores anormales en el cáncer de
mama, inclusive ANCP (antígeno nuclear de células en prolifera­
ción, un componente de la polimerasa de DNA) y varias proteí­
nas de choque por calor (Franzen y cois., 1996). Asimismo se
demostró que estas últimas se incrementan en el cáncer colorrec-
tal, en tanto que la enzima ciclooxigenasa 2 y la proteína de enla­
ce de ácidos grasos disminuyen de modo significativo (Stulik y
cois., 1999). Varios marcadores, que comprenden tipos diferentes
de queratina, se expresan conforme el cáncer vesical progresa de
la etapa temprana de epitelio transicional al carcinoma de célula
escamosa plena. Estos pueden usarse como marcadores para valo­
rar el grado de diferenciación y por tanto graficar la progresión de
la enfermedad. Sin embargo, cabe señalar que es necesario tener
cuidado durante la manipulación de las muestras porque las can­
tidades diminutas de proteínas extraídas de las manchas en gel
2D se contaminan con facilidad con cabello y piel, ¡que también
son ricos en queratina!
Aunque las aplicaciones de la proteómica y la transcriptómica
de expresión son similares, la proteómica tiene la ventaja de que
muestrea las moléculas funcionales existentes de las células y consi­
dera modificaciones postraduccionales. Ya se mencionó la estatmina
como un ejemplo -esta proteína de señalamiento está incrementa­
da en la leucemia infantil, pero sólo la forma fosforilada se relacio­
na con la enfermedad—. La proteómica también ofrece ventajas
para analizar líquidos corporales, que no contienen mRNA. Por
ejemplo, Celis y colaboradores (2000) mostraron que una proteína
llamada psoriasina está aumentada en la orina de pacientes con
cáncer vesical y puede emplearse como marcador diagnóstico tem­
prano de la enfermedad.
La toxicoproteómica ayuda a establecer la base de las
respuestas adversas a fármacos
Como se comenta en el capítulo 21, las personas tienen diferen­
tes reacciones a los fármacos a causa de variaciones polimórficas
tanto en los receptores de los mismos como en las enzimas y las
proteínas de transporte que determinan la forma en que los me­
dicamentos se absorben, metabolizan y excretan. La proteómica
puede desempeñar una función importante en la predicción y la
investigación de respuestas adversas a fármacos al indicar cambios
en el proteoma que se observan después del tratamiento farmaco­
lógico. Si se considera que los fármacos son moléculas que inte-
ractúan directamente con proteínas y modifican su conducta,
muchas respuestas a ellos no afectarán la abundancia de mRNA y
en consecuencia no ejercerán un efecto en el transcriptoma.
Como ejemplo considérese el medicamento inmunosupresor
ciclosporina A. Este fármaco se utiliza de manera amplia para
prevenir el rechazo después de injertos o trasplantes de órganos,
sobre todo en niños. Uno de los principales efectos secundarios
de la ciclosporina A es la toxicidad renal, que casi 40% de los pa­
cientes experimenta. La toxicidad se acompaña de pérdida urinaria
de calcio y produce calcificación de los túbulos renales. El análisis
protéomico de riñones de rata, y después de humanos, de indivi­
duos no tratados y de quienes recibieron ciclosporina A mostró
una diferencia notable en la concentración de una proteína parti­
cular, la proteína de enlace de calcio calbindina (Aaicher y cois.,
1998). Esta proteína fue mucho menos abundante en los riñones
de humanos y ratas tratados con ciclosporina A y de inmediato
sugirió el mecanismo nefrotóxico de la ciclosporina A. Como he­
cho interesante la calbindina no se agota en monos tratados con
ciclosporina A y por tanto no sufren los mismos efectos farmaco­
lógicos adversos que los humanos. En consecuencia el estudio de
la forma en que los monos metabolizan la ciclosporina A puede
conducir a identificar un mecanismo para evitar la toxicidad en
humanos.
19.4.4 Las estructuras de las proteínas proveen
información funcional importante
Es posible que la estructura de una protema se conserve
aun cuando las secuencias divergieron hasta el grado en
que ya no es posible reconocer una relación homologa
Al inicio de este capítulo se señaló cómo secuencias similares de
proteínas suelen tener estructuras similares y por consiguiente
funciones similares. La función de la proteína (o por ende un do­
minio) depende de su estructura terciaria, que también se cono­
ce como su doblez. Éste forma los sitios de enlace, los dominios
de interacción y las bolsas catalíticas que desempeñan la activi­
dad bioquímica de la proteína. Dentro de estas estructuras, un
número pequeño de residuos de aminoácidos puede ser indis­
pensable para algunas reacciones químicas específicas, por ejem­
plo, residuos dentro del sitio activo de una enzima que
reaccionan con el sustrato. Sin embargo, la mayor parte de los
aminoácidos de una proteína tiene una función estructural y

ayuda a mantener estos residuos críticos en las posiciones correc­
tas. Por tanto la evolución actúa sobre todo en la estructura de
una proteína y no en sus secuencias, y suelen tolerarse muchos
cambios a nivel secuencial en tanto el doblez se conserve. El re­
sultado global es que durante la evolución la estructura de la pro­
teína se conserva mejor que las secuencias.
La consecuencia práctica de la conservación estructural consis­
te en que la comparación de estructuras proteínicas puede revelar
relaciones evolutivas distantes y por tanto ayudar a asignar funcio­
nes a proteínas no caracterizadas inclusive cuando todo trazo de si­
militud secuencial desapareció. Un ejemplo es la caracterización de
AdipoQ, una proteína de función inicialmente desconocida que los
adipocitos secretan. El análisis estructural de esta proteína muestra
una relación clara y sin ambigüedad con la familia del factor de ne­
crosis tumoral (TNF) de las quimiocinas y en consecuencia señala
que la AdipoQ también es una proteína de señalamiento. La figu­
ra 19-14 muestra la relación estructural entre AdipoQ y TNF-a,
junto con un alineamiento secuencial múltiple de cinco miembros
de la superfamilia basado en las estructuras conservadas (Shapiro y
Scherer, 1998).
Se dispone de algoritmos para comparar estructuras
proteínicas a nivel de pares
El ejemplo comentado sugiere que un medio más o menos direc­
to para anotar cualquier gen huérfano sería obtener la estructura
de la proteína hipotética codificada y compararla con las estructu­
ras conocidas en una forma análoga a la comparación de secuen­
cias. A fin de lograrlo, se requeriría obtener la estructura de la
proteína hipotética (recuadro 19-5) y utilizar recursos bioinfor-
máticos para comparar esta estructura con estructuras proteínicas
conocidas. El mayor depósito de estructuras proteínicas es el Pro-
tein Databank (PDB) del Research Collaboratory of Structural
Biology at Rutgers University (http://www.rcsb.org). Los datos se
guardan como expedientes planos con las coordenadas de posi­
ción de cada átomo en forma tubular. Esto se conoce como for­
mato de expediente PDB.
Varios programas de computadora de acceso libre en Internet
convierten expedientes de PDB en modelos tridimensionales (p.
q , Rasmol, MolScript, Chime). Más aún, está escrito un número
;rm de de algoritmos que permiten comparar estructuras proteíni-
íSillitoe y Orengo, 2002). Por lo general funcionan con base en
■ o de dos principios, aunque algunos programas más recientes
¿rd - -han elementos de ambos:
i
► comparación intermolecular: las estructuras de dos proteínas
K superponen y el algoritmo intenta minimizar la distancia en-
□c ios átomos superpuestos (fig. 19-15A). La función que se
— 73 para medir la similitud entre las estructuras suele ser la
i-aróción media de la raíz cuadrada (DMRC), que es la raíz
r_iirada de la distancia cuadrada promedio entre átomos equi-
íuentes (fig. 19-15A). La DMRC disminuye conforme las es-
■nacmras proteínicas se tornan más similares y es de cero si dos
r ~jcruras idénticas se superponen. Los ejemplos de estos algo-
nrmos comprenden Comp-3D y ProSup;
19.4_[ PROTEÓMICA j 563
► comparación intramolecular: las estructuras de dos proteínas
se comparan lado a lado y el algoritmo mide las distancias in­
ternas entre átomos equivalentes dentro de cada estructura, e
identifica lincamientos en los que estas distancias internas son
más cercanamente compatibles (fig. 19-15B). Un ejemplo de
este algoritmo es DALI. Entre los algoritmos que emplean am­
bos métodos se encuentran COMPARER y VAST.
La genómica estructural (proteómica estructural) pretende
resolver las estructuras de un grupo representativo
de proteínas que cubren el espacio doblado
El genoma humano contiene cerca de 30 000 genes, pero muchos
de ellos pueden agruparse en familias (parálogos) con secuencias si­
milares. Como se señaló, secuencia similar implica una estructura
similar y por tanto es probable que los diferentes miembros de ca­
da familia génica codifiquen proteínas con el mismo doblez. Aun
las familias génicas que no muestran homología secuencial impor­
tante pueden codificar proteínas con estructuras similares, como se
comentó antes para AdipoQ y la familia de TNF. Si se toma en
cuenta la complicación de múltiples proteínas de dominio, se es­
tima que existen menos de 1 000 dobleces proteínicos diferentes.
Esto significa que si una proteína representativa de cada familia
de dobleces puede resolverse en términos estructurales, quizá sea
factible anotar todos los genes huérfanos con el uso de datos es­
tructurales.
Varios programas piloto se iniciaron alrededor del mundo a fin
de resolver estructuras proteínicas a una escala global como intento
de cubrir “el espacio doblado” y obtener las estructuras de un grupo
representativo de proteínas (Brenner, 2001; Norin y Sundstrom,
2002; Zhang y Kim, 2003). En la mayor parte de estos proyectos el
análisis cristalográfico con rayos X de alto rendimiento se realiza con
la técnica de dispersión anómala de m ultilongitud de onda (DAM)
(véanse recuadro 19-5 y Heinemann y cois., 2001). Un tema que es­
tos programas comparten es un efecto de embudo, en el que una
proporción de proteínas se pierde en la etapa de análisis. Por cada
25 proteínas que se expresan, sólo cinco proporcionan cristales y
apenas una genera datos de difracción útiles. Aunque algunos de los
programas se concentran en proteínas humanas o patógenas con im­
portancia para las enfermedades, casi todos incluyen proteínas de
bacterias con genomas pequeños (p. ej., Haemophilus influenzae) o
de termófilos (como M ethanococcus jannaschii, Methanobacterium
thermoautotrophicum). Ello se debe a que las bacterias con genomas
pequeños también tienen proteomas pequeños pero deben contener
aún representantes de todas las familias proteínicas, en tanto que las
proteínas de termófilos deben ser más estables cuando se expresan en
E. coli. La producción de estos programas piloto sugiere que alrede­
dor de 70% de las proteínas hipotéticas contiene dobleces conocidos
y en teoría podrían anotarse con base en los datos estructurales, en
tanto que 30% incluye dobleces por completo nuevos cuyas funcio­
nes se desconocen. Las complicaciones abarcan la dificultad para es­
tablecer definiciones rigurosas de estructuras proteínicas y el “efecto
de muñeca rusa”, en el que se observa una gama continua de estruc­
turas intermedias entre distintos tipos de dobleces. Estos problemas
se discuten en el recuadro 19-6.
564 j CAPÍTULO DIECINUEVE | MÁS ALLÁ DEL PROYECTO DEL GENOMA

A)

B) A A' B' B C D
------ ► -----► ------► ---- ► ------------- ► -------------►
A C R P 30 AYMYRSAFSVGLETRVTV PNVPIRFTKIFYNQQN HYDGSTGKFYCNIPGLYYFSYHITV YMKDVKVSLFKK
C 1qA G ATQ KVAFSALRTINSPLR PNQ VIRFEKVITNANE NYEPRNGKFTCKVPGLYYFTYHASS RGNLCVNLVRK
T N F a RTPSDKP VAHWANPQAEGQ LQWLNRRANALLANGV ELRD N Q LW P S E G LY LIY SQVLFKGQGCP S T H V L L T H T IS R IA V
TN Fp TLKP AAHLIGDPSKQNS LLWRANTDRAFLQDGF SLSN NSLLVPTSGIYFVYSQW FSGKAYSPKATSSPLYLAHEVQLFSS
C D 40L GDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQW AEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTF CSNREASSQAPFIASLCLKSPG

A A' B' B C D

E----------------------------------------- F G H
----------------► ---------------- ► -----------► --------------- ►
A C R P 30 DKAVLFTYDQYQ EKNVDQASGSVLLHLEVGDQVWLQVYGDGDHNGLYADNVNDSTFTGFLLYHDTN
C1 qA GRDSMQKW TFC D YAQ NTFQ VTTG G W LKLEQ EE W H LQ A TD KN S LLG IEG AN S IFTG FLLFP D M D A
T N F a SYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPW YEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQV Y FG 11AL
T N F |3 QYPFHVPLLSSQKMVY PGLQEPWLHSMYHGAAFQLTQGDQLSTHTDGIPHLVLSPSTV FFGAFAL
C D 40L RFERILLR AAN TH S SAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFT S FGLLKL
-------------------- ► ------------------ ► --------- ► ----------- ►
E F G H

Fig. 19-14. Anotación funcional basada en la similitud estructural en la que no es posible detectar homología de secuencia.
A) Comparación de un diagrama en listón de AdípoQ y TNFa. La similitud estructural es equivalente a la que se observa dentro de la familia de TNF. B)
Alineación de secuencia basada en la estructura entre varios miembros de la familia TNF (CD40L, TNFa y TNFa) y dos miembros de la familia C1q
(c1qA y AdípoQ). Los residuos altamente conservados (que se encuentran en cuatro de las proteínas por lo menos) están sombreados y las flechas
indican regiones de cadena 0 en las proteínas. Puesto que la similitud de secuencia entre las proteínas AdipoQ y TNF es baja (p. ej., 9% de identidad
entre AdipoQ y TNFa), las búsquedas BLAST no identificarían una relación. Sin embargo, la alineación estructural muestra patrones de residuos
conservados que podrían emplearse para reconocer miembros nuevos de la familia entre genes huérfanos (véase sección 19.2.2). Reproducido de
Shapiro y Scherer (1998) con autorización de Elsevler Science.
 19.4 j PROTEÓMICA j 565

A) B)

dm rc = x/ í

Fig. 19-15. Comparación de estructuras proteínicas; los círculos representan átomos C a en cada residuo de aminoácido y las líneas indican la vía
de la estructura básica polipéptida en el espacio.
A) La comparación intermolecular incluye la superposición de estructuras de proteínas y el cálculo de las distancias entre átomos equivalentes en las
estructuras superpuestas (se presentan como flechas bidireccionales). Estas distancias se usan para calcular la raíz cuadrada media de la desviación
(DMRC), con la fórmula que se muestra (R es la DMRC, d es la distancia entre el par /th de átomos Ca superpuesto y N es el número total de átomos
alineados). Un valor de DMRC pequeño computado en muchos residuos es evidencia de una estructura terciaria conservada significativamente. B) La
comparación intermolecular comprende el análisis lado a lado con base en distancias comparativas entre átomos equivalentes dentro de cada estructura
(se muestran como líneas de guiones codificados por color).

19.4.5 Existen muchas maneras distintas para estudiar
interacciones de proteínas individuales
La función de una proteína puede no ser obvia aun después de un
estudio amplio de su secuencia, estructura y perfil de expresión. En
estos casos podría tener ventajas identificar las proteínas con que
interactúa de manera específica, en especial si resultan ser proteínas
bien estudiadas cuyas funciones se conocen. Por ejemplo, si se de­
muestra que una proteína nueva y no caracterizada interactúa con
otras proteínas necesarias para el empalme de RNA, entonces es
probable que la nueva proteína participe en el mismo proceso. De
este modo pueden relacionarse proteínas dentro de redes funciona­
les en la célula.
Se cuenta con un gran número de métodos para estudiar las
interacciones de proteínas individuales, entre ellos técnicas gené­
ticas, bioquímicas y físicas (véase Phizicky y Fields, 1995). En
tanto que sólo es posible aplicar métodos genéticos a organismos
modelo como Drosophila y levaduras, métodos bioquímicos y fí­
sicos pueden aplicarse directamente a células humanas. Un méto­
do bioquímico clásico es la cromatografía de afinidad, en la que
una proteína señuelo particular se inmoviliza en la matriz de apo­
yo de una columna de cromatografía y se añade el lisado celular.
Las proteínas que interactúan con el señuelo quedan retenidas en
la columna en tanto que otras proteínas se eliminan por lavado.
Las proteínas que interactúan pueden eludirse si la concentración
salina del amortiguador se incrementa. Otro método bioquímico
es la coinmunoprecipitación, una técnica en la que anticuerpos
específicos para una proteína señuelo particular se añaden en for­
ma directa al lisado celular y ocasionan la precipitación del com­
plejo de anticuerpo y proteína señuelo. Cualquier proteína que
interactúa con el señuelo se coinmunoprecipita. Tanto la croma­
tografía de afinidad como la coinmunoprecipitación pueden em­
plearse para aislar complejos proteínicos enteros, lo que permite
identificar los diferentes componentes mediante EM (sección
19.4.2). Ésta es una de las principales plataformas tecnológicas en
proteómica de interacción. Se usa en forma amplia para caracte­
rizar complejos proteínicos como ribosomas, complejos que pro­
mueven la anafase, el complejo de poro nuclear y los complejos de
señalamiento, y en fecha reciente se aplicó a una escala genómica
(p. ej., Gavin y cois., 2002; Ho y cois., 2002; véase fig. 19-16). Las
interaciones específicas con cada complejo pueden estudiarse me­
diante enlace cruzado químico.
566 j CAPITULO DIECINUEVE [ MÁS ALLÁ DEL PROYECTO DEL GENOMA
Recuadro 19-5. Determinación de estructuras de proteínas
RECONOCIMIENTO DE LAS ESTRUCTURAS PROTEÍNICAS MEDIANTE
CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X
La cristalografía de rayos X aprovecha el hecho de que los rayos X son
dispersados, o difractados, de cristales de proteínas y la naturaleza de la
dispersión depende de la organización de los átomos dentro del cristal.
Los rayos X difractados pueden interferir de manera positiva o negativa
entre sí, lo que genera patrones llamados reflexiones en un detector.
Imagen de difracción de rayos X de una fosfatasa proteinica
Cortesía de Daniela Stock, MRC Laboratory of Molecular Biology,
Cambridge, Reino Unido.
A partir de estos datos es posible elaborar mapas de densidad electróni­
ca mediante una función matemática conocida como transformación
Fourier. Cuanto más datos se utilicen en la transformación Fourier, más
refinado y preciso es el modelo estructural resultante. La determinación
estructural precisa requiere un cristal bien ordenado que difracte con po­
tencia los rayos X. Esto puede ser un cuello de botella Importante en la
determinación estructural porque es en extremo difícil desarrollar crista­
les de proteínas, aun con la disponibilidad de estaciones de cristalización
automatizadas, que permiten llevar a cabo miles de reacciones en para­
lelo bajo condiciones ligeramente distintas. Aunque para el análisis es­
tructural puede emplearse una fuente convencional de rayos X, se
prefieren las fuentes de radiación de sincrotrón porque producen rayos
X de mucho mayor intensidad.
La elaboración de mapas de densidad electrónica a partir de datos de di­
fracción se basa en tres tipos de información: la longitud de onda de los
rayos X incidentes (que ya se conoce) y la am plitud y la fase de los ra­
yos X dispersados. No obstante, sólo la amplitud de la dispersión puede
determinarse con base en el patrón de reflexiones. La fase debe calcular­
se por medio de experimentos de difracción adicionales con cristales
isomorfos, es decir, cristales de la misma estructura pero que Incorpo­
ran átomos más pesados que producen patrones de difracción alternati­
vos. El medio estándar para lograrlo consiste en sumergir los cristales en
una solución salina de un metal pesado de manera que los átomos de es­
te último se difundan al interior de los espacios antes ocupados por el
solvente. Los átomos de metal difractan los rayos X con mayor potencia
que los átomos de luz que suelen encontrarse en las proteínas. La com ­
paración de las reflexiones generadas por varios cristales isom orfos dife­
rentes (un proceso denominado reemplazo múltiple de isomorfos)
permite estudiar las posiciones de los átomos pesados y deducir la fase
de difracción en el cristal no sustituido.
Técnicas alternativas aprovechan el fenómeno de dispersión anómala,
en el que se generan distintos patrones de difracción cuando átomos de
metal en un cristal proteinico son golpeados por rayos X cuya longitud de
onda es cercana a su límite de absorción. La magnitud de la dispersión
anómala varía con la longitud de onda de los rayos X incidentes, de m o­
do que un tipo de cristal que contiene metal a varias longitudes de onda
distintas puede bombardearse y obtenerse diferentes patrones de difrac­
ción a partir de los cuales se calcula la fase de dispersión. Ésta es la ba­
se de técnicas como SIRAS (restitución isomorfa única con dispersión
anómala) y MAD (dispersión anómala de longitud de onda múltiple).
En la última técnica la proteína se expresa en bacterias y se incorpora el
aminoácido sustituido por el metal selenometionina. En cada caso las di­
ferencias en las intensidades de las reflexiones causadas por la disper­
sión anómala son muy pequeñas, de modo que las fuentes de radiación
de sincrotrón y un registro preciso de la reflexión son esenciales. Por úl­
tim o el mapa de densidad electrónica se elabora hacia un modelo estruc­
tural. Ello requiere una pieza de Información más crucial — la secuencia
de aminoácidos— porque es difícil distinguir cadenas laterales de am i­
noácidos sólo con datos de difracción.
RECONOCIMIENTO DE ESTRUCTURAS DE PROTEÍNAS MEDIANTE
ESPECTROSCOPIA DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
Algunas proteínas no pueden cristalizarse, pero es posible utilizar espec­
troscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) para conocer sus
estructuras si son hasta cierto punto pequeñas. Aunque hasta fecha re­
ciente la técnica se limitaba a proteínas de 15 kDa o menos, adelantos en
el análisis de datos permiten ahora estudiar proteínas hasta de 100 kDa
de tamaño. La técnica aprovecha el hecho de que algunos núcleos ató­
micos tienen la propensión a cambiar entre estados de giro magnético en
un campo magnético aplicado cuando se exponen a ondas de radio de
una cierta frecuencia. Cuando los núcleos regresan a sus orientaciones
originales, emiten ondas de radio que pueden medirse. La frecuencia de
las ondas de radio emitidas depende del tipo de átomo y su contexto quí­
mico. Por ejemplo, los núcleos de hidrógeno en un grupo metilo produci­
rán una señal distinta a la de un anillo aromático. La variación de la
naturaleza de las ondas de radio aplicadas permite asimismo determinar
qué tan cerca se encuentran entre sí en el espacio dos núcleos, inclusive
si no están unidos por enlaces químicos covalentes. Esto se conoce co­
mo efecto nuclear Overhauser (ENO).
A partir de un espectro de RMN bidimensional, que incluye información
de ENO, es factible estudiar los núcleos que están unidos entre sí de ma­
nera covalente y cuáles se encuentran juntos en el espacio. En combina­
ción con la secuencia de aminoácidos de la proteína, lo anterior permite
elaborar una lista de restricciones de distancia que describe primero los
elementos estructurales secundarios de la proteína (éstos tienen relacio­
nes de distancia muy específicas, véase sección 1.5.5) y a continuación
posibilita el desarrollo de modelos de la estructura terciaria. Por lo gene­
ral diversas variantes de la estructura terciaria se ajustan a los datos de
distancia igual de bien, de modo que éstos se depositan como un ensam­
ble de modelo en lugar de una estructura precisa, como en el caso de la
cristalografía de rayos X.
PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA PROTEINICA
Aunque la tecnología para resolver estructuras de proteínas está muy
adelantada, aún es un proceso de labor intensiva y costoso. Un método
alternativo aunque un poco menos preciso consiste en predecir las es­
tructuras proteinlcas con métodos de bioinformática (Jones, 2000). En la

Recuadro 19-5. Determinación de estructuras de proteínas (co n tin u ació n )
actualidad es posible predecir estructuras secundarias en proteínas hipo­
téticas con bastante precisión pero las estructuras terciarias requieren
una estructura de plantilla en la que el modelo pueda basarse.
La estructura secundarla de una proteína puede predecirse de acuerdo
con la propensión de ciertos aminoácidos a ocurrir en estructuras secun­
darias particulares. Algunos aminoácidos, como el glutamato, tienen una
propensión helicoidal (es decir, son más abundantes en hélices a). Otros,
como la valina, muestran una propensión a cadenas (o sea, abundan más
las cadenas y hojas 0). La glicina y la prolina son poco usuales porque
rara vez se encuentran en estructuras secundarias. De hecho suelen ha­
llarse en los extremos de hélices y cadenas, y al parecer actúan como
“terminadores estructurales” . La presencia de un cordón de residuos con
propensión helicoidal o de cadena indica con firmeza la presencia de es­
ta estructura en la proteína. Sin embargo, las predicciones de la estruc­
tura secundaria basadas en proteínas únicas no son seguras porque hay
ejemplos individuales de todos los aminoácidos que aparecen en todos
los tipos de estructuras secundarias. Las alineaciones múltiples pueden
eliminar esta incertidumbre al identificar bloques de residuos conserva­
dos que apoyan la formación de hélices o cadenas. Los algoritmos más
complicados, com o PSI-PRED (Jones, 2000), utilizan alineaciones m últi­
ples y también incorporan información evolutiva y estructural de bases de
datos para incrementar la exactitud de sus predicciones.
19.4.6 Selección de interacción de alto rendimiento
con métodos basados en genotecas
Sería útil si los métodos de selección de interacción de alto rendi­
miento proporcionaran un enlace directo entre las proteínas y los
genes que las codifican. Esto se abordó mediante el desarrollo de
métodos basados en genotecas para selección de interacciones.
Aunque en principio cualquier genoteca de expresión de cDNA es­
tándar podría seleccionarse con un señuelo proteínico en lugar de
una sonda de DNA, en la práctica resulta laborioso porque la mis­
ma genoteca debe seleccionarse muchas veces a fin de caracterizar
las interacciones de diferente señuelos. Dos tecnologías nuevas se
usan para seleccionar interacciones proteínicas y se comentan a
continuación.
La selección de interacciones mediante la exhibición de
fago incluye la separación y la búsqueda de interacciones
entre proteínas señuelo inmovilizadas en los fosos de platos
de microtítulo y proteínas interactuantes que se expresan en
la superficie del bacteriófago recombinante
La exhibición de fagos es una forma de clonación de la expresión
en la que fragmentos extraños de DNA se insertan en un gen de
proteína de recubrimiento de bacteriófago (véanse sección 5.6.2 y
Burton, 1995). El gen recombinante puede expresarse después co­
mo una proteína de fusión, que se incorpora en el virión y se mues­
tra en la superficie del fago (fig. 19-17). El fago de fusión se
enlazará a cualquier proteína que interactúa con el componente ex­
traño que aparece en su superficie. La selección de interacción se
19.4 | PROTEÓMICA i 567
Las estructuras terciarias son mucho más difíciles de predecir que las secun­
darias porque son millones de millones las diferentes formas en las que cual­
quier cadena lineal determinada de aminoácidos podria doblarse. Si se
incorporan suficientes moléculas del solvente en el modelo para que sea rea­
lista, el sistema se torna muy complejo para su estudio sin cierto conoci­
miento de la conducta de proteínas conocidas. Por esta razón los métodos
de predicción ab initio no tienen un uso práctico. Sin embargo, si se dispo­
ne de la estructura de una proteina relacionada de manera cercana, puede
usarse como una plantilla para formar un modelo estructural de la secuen­
cia que se busca. Esto se conoce como modelado comparativo o modelado
de homología y suele actuar si las dos secuencias muestran > 25% de iden­
tidad. Relaciones más distantes pueden modelarse mediante asociación, en
la que la secuencia de una proteína hipotética se compara con las del Protein
Data Bank como intento para encontrar dobleces compatibles. A menudo es
posible encontrar dobleces comparando el núcleo proteínico, que está muy
conservado, pero las asas externas son en extremo variables. Tal vez puedan
encontrarse asas similares en otras proteínas mediante un llamado algorit­
mo de ahorro de partes. Por consiguiente el modelo estructural se elabora
como una serie de piezas de secuencias compatibles con estructuras cono­
cidas. El paso final tanto en el modelado de asociación como en el compara­
tivo es el refinamiento del modelo, que comprende mover cadenas laterales
a fin de evitar colisiones y minimizar la energía libre total de la estructura.
realiza creando una genoteca de exhibición de fagos en la que cada
proteína del proteoma se muestra en la superficie del fago. Luego
los fosos de placas de microtítulo se cubren con las proteínas señue­
lo de interés y la genoteca de exhibición de fago se coloca con pi­
petas en cada foso. El fago con proteínas que interactúan en su
superficie permanecerá unido a la superficie del foso, en tanto que
los que tienen proteínas que no interactúan se eliminan por lavado.
Una ventaja particular de la técnica es que el fago conservado, que
muestra las proteínas de interacción, puede eludirse de los fosos y
emplearse para infectar E. coli, lo que resulta en la amplificación
masiva de la secuencia de cDNA correspondiente, que luego pue­
de obtenerse y usarse para identificar las proteínas que interactúan
buscando en bases de datos. Las desventajas de la exhibición de fa­
go incluyen el formato de valoración in vitro y el hecho de que só­
lo es posible mostrar secuencias péptidas cortas en la superficie del
fago sin alterar su ciclo de replicación. Estas dos características de
la técnica pueden impedir que ocurran interacciones específicas.
Además de la selección de interacción, la exhibición de fago
también es útil para varias otras aplicaciones que comprenden:
► ingeniería de anticuerpos. La exhibición de fago proporciona
una fuente alternativa potente de anticuerpos (entre ellos anti­
cuerpos humanizados). Puede evitar la inmunización y aun la
tecnología de hibridoma (Winter y cois., 1994; véase sección
21.3.4);
► ingeniería general de proteínas. La exhibición de fago es un
coadyuvante potente de programas de mutagénesis aleatorias
como un medio para seleccionar variantes deseadas de la geno-
teca de mutantes.
568 | CAPÍTULO DIECINUEVE MÁS ALLÁ DEL PROYECTO DEL GENOMA

REB1 S T 0! TF<
RNR2
HHF2

RAD53 RP03

RRP43 « a m a
oumanRP» SHE4
» DIS3 _ _ _ _
SAM1
RRP45 SRP1
SKI7

;NM05 GCN1

ECM16

CTR9

Fig. 19-16. Red de interacciones proteinicas en la levadura descubierta durante el análisis sistemático de complejos proteínicos
por espectrometría de masa.
La gráfica representa la compleja red de proteínas de la levadura, establecida mediante enlace de complejos que comparten cuando menos una proteína
(los complejos que comparten más de nueve proteínas se omitieron con fines de claridad). En el dibujo superior las funciones celulares de los complejos
individuales se codifican por colores como sigue: rojo, ciclo celular; verde oscuro, señalamiento; azul oscuro, transcripción, conservación del DI\IA y la
estructura cromatínica; rosa, proteína y transporte de RNA; naranja, metabolismo de RNA; verde claro, síntesis y recambio de proteínas; pardo, polaridad
y estructura celulares; violeta, metabolismo intermedio y de energía; azul claro, biogénesis y tránsito en la membrana. El dibujo inferior es un ejemplo de
un enlace complejo (TAP-C212) con otros dos complejos (TAP-C77 y TAP-C110) mediante componentes compartidos (las líneas rojas indican interacciones
físicas conocidas). Según Gavin y colaboradores (2002) Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of proteín complexes.
Nature 41 5 ,1 4 1 -1 4 7 con autorización de Nature Publishing Group and Cellzome AG.
 19.4 PROTEÓMICA 569

Fago tipo silvestre

¿Q ué proteínas ¡nteractúan
con la proteina X? Insertar fragm entos génicos que
codifican interactores candidatos
en el gen de cubierta proteínica

Proteínas presa exhibidas

en la superficie del fago

GENOTECA DE EXHIBICION
DE FAGO

Aplicar PROTEINA X a la superficie

de una m em brana o foso de microtítulo
Mezclar

Recuperar fago enlazado, secuenciar y caracterizar inserto gènico extraño.

Fig. 19-17. El principio de la exhibición de fago como se aplica a la selección de interacción de alto rendimiento (para el principio general, véase
fig. 5-22).
Las proteínas señuelo, para las que se buscan interactores, pueden inmovilizarse en la superficie de fosos de microtítulos o membranas. Todas las otras
proteínas del proteoma se expresan luego en la superficie de bacteriófagos, mediante clonación dentro de un gen de la proteína de cubierta del fago, para
crear una genoteca de exhibición de fagos. A continuación los fosos o las membranas se inundan con la genoteca de fagos. Para cualquier proteína
señuelo determinada (X), el fago que lleva las proteínas que ¡nteractúan se retendrá, en tanto que las que muestran proteínas que no interactúan se
eliminarán por lavado. El fago enlazado puede eludirse con un amortiguador muy salino y utilizarse para infectar E. coli, lo que produce una gran cantidad
de partículas de fago que contienen la secuencia de DNA de la proteína de interacción.

El sistema de levadura de dos híbridos tiene el rendimiento
más alto de cualquier tecnología de selección de interacción
e incluye el ensamble de un factor de transcripción funcional
de componentes separados
El método de genoteca que más se utiliza para seleccionar la interac­
ción es el sistema de levadura de dos híbridos, también denomina­
do sistema de atrapamiento de interacción (Fields y Sternglanz,
1994). Además de identificar proteínas que se unen a una proteína
en estudio, este método también puede emplearse para delinear do­
minios o residuos cruciales para la interacción. Las proteínas que in­
teractúan físicamente se detectan por su capacidad para ensamblar
un factor de transcripción activo y por consiguiente activar un gen
rastreador, un marcador seleccionable, o ambos. La clave del méto­
do de dos híbridos es la observación de que los factores de trans­
cripción comprenden dos dominios separados: un dominio de
unión de DNA y un dominio de transactivación. En casi todos los
factores de transcripción naturales, los dominios de unión y activa­
ción de DNA son parte del mismo polipéptido (véase sección
10.2.4). Sin embargo, también puede ensamblarse un factor de
transcripción activo a partir de dos proteínas interactuantes que por­
tan dominios separados. El objeto del sistema de dos híbridos y las
técnicas derivadas es utilizar una proteína blanco como señuelo para
reconocimiento específico mediante una proteína de interacción que
se fusiona con un componente del factor de transcripción necesario.
Para implementar el sistema de dos híbridos se emplean méto­
dos estándar de DNA recombinante con objeto de producir un gen
de fusión que codifica la proteína señuelo en estudio acoplada al
570 | CAPÍTULO DIECINUEVE MÁS ALLÁ DEL PROYECTO DEL GENOMA
Recuadro 19-6. Clasificación estructural de proteínas
La anotación funcional basada en estructuras de las proteínas demanda
un sistema riguroso y estandarizado para clasificar diferentes estructu­
ras. Se cuenta con varios esquemas de clasificación jerárquica que divi­
den las proteínas primero en clases generales con base en la proporción
de varias estructuras secundarias que contienen y después en grupos ca­
da vez más especializados basados en la forma en que estas estructuras
están dispuestas (Pearl y Orengo, 2002). Estos esquemas se implemen-
tan en bases de datos como SCOP (Structural Classi!¡catión ofProteins),
CATH (Class, Architecture, Topology, Homologous superfamily) y FSSP
(Fold classi!ication based on Structure-Structure alignment ofP roteins).
Estas bases de datos difieren en el modo en que las clasificaciones se ela­
boran. Por ejemplo, el sistema FSSP se implemento a través de compara­
ciones estructurales automatizadas por completo utilizando el programa
DALI. CATH es semiautomàtico y emplea comparaciones automáticas que
se depuran en forma manual. SCOP es un esquema de clasificación ma­
nual y se basa tanto en relaciones evolutivas como en criterios geométri­
cos. No sorprende que la misma proteína pueda clasificarse de manera
diferente cuando se usan esquemas alternativos (Hadley y Jones, 1999).
a lfa b e ta a lfa -b e ta
lis tó n o v e ja ro llo p r o p u ls o r 4
h e m o p e x in a
1hxn
1hxn
1hxn
Ejemplo de clasificación estructural jerárquica en la base de datos CATH
dominio de enlace de DNA de un factor de transcripción (fig. 19-
18). Las células transformadas con este gen se aparean a células
transformadas con una genoteca de genes de fusión en la que las se­
cuencias de cDNA están acopladas a la secuencia de codificación
del dominio de transactivación (constructos [formaciones] pre­
sa). Las células blanco también se modifican por ingeniería para
que lleven un gen rastreador, un gen marcador seleccionable, o am­
bos, que se activan por medio del factor de transcripción de ensam­
ble. Las interacciones se prueban en las células de levadura diploide
resultantes. Si el señuelo y la presa no interactúan, los dos dominios
del factor de transcripción permanecen separados y los genes mar­
cadores se inactivan. No obstante, si el señuelo y la presa interac­
túan, el factor de transcripción se ensambla y los genes marcadores
se activan después facilitando la identificación visual, la propaga­
Aunque hay un acuerdo general amplio en los niveles superiores de la je­
rarquía, surgen problemas cuando se buscan clasificaciones más detalla­
das porque ello depende de los umbrales que se utilizan para reconocer
grupos de dobleces en los diferentes esquemas de clasificación.
Los problemas adicionales que originan confusión en la clasificación es­
tructural de proteínas incluyen:
► los llamados superdobleces, que se encuentran en muchas proteínas
con estructuras terciarias diversas. Es necesario distinguir entre es­
tructuras homologas (que se derivan de un ancestro evolutivo co­
mún) y estructuras análogas (que evolucionaron por separado pero
convergieron);
► variaciones en la estructura de dobleces entre diversos miembros de
la mism a familia protefnica, que puede conducir a la falta de recono­
cimiento de relaciones homologas;
► el efecto de muñeca rusa, que describe un continuo de estructuras
entre grupos de dobleces. La asignación de una estructura a una ca­
tegoría particular se torna entonces muy subjetiva.
pocos SS
ción selectiva, o ambas, de la célula de levadura que contiene pro­
teínas de interacción. A partir de estas células es posible identificar
la secuencia de cDNA del constructo señuelo.
La selección de levadura de dos híbridos se desarrolló para ana­
lizar proteínas individuales (señuelos únicos), pero en los últimos
años esta técnica se aplica en una escala cada vez mayor, culminan­
do con estudios exhaustivos de todas las 40 000 000 de interaccio­
nes proteínicas posibles en la levadura (Uetz y cois., 2000; Ito y cois..
2000, 2001). Se emplean dos variantes de esta técnica: una en la que
se producen grupos definidos de señuelo y presa, y se cruzan de ma­
nera sistemática (método de matriz), y otra en la que la presa o tan­
to el señuelo como la presa se representan por fragmentos de cDNA
aleatorios (método aleatorio de genoteca) (fig. 19-19). El métodc
de matriz es exhaustivo y sistemático, pero menos confiable que e¡
 19.4 PROTEÓMICA | 571

Recuadro 19-6. Clasificación estructural de proteínas (co n tin u ació n )

1 tadC

1 cg2a 1 rlr

Efecto de m uñeca rusa

Cuatro proteínas que muestran variación estructural continua en el espacio doblado. Cada una de las proteínas comparten cuando menos 74 residuos es­
tructuralmente equivalentes con su vecino más cercano, pero las dos proteínas del extremo sólo mostraron 54 residuos estructuralmente equivalentes
cuando se compararon en forma directa. Clave: 1cg2 A, carboxipeptidasa G2; 1tadC, transducina-K; 1tph1, ¡somerasa de fosfato de triosa; 1rlr, proteína
R1 de reductasa de oligonucleótido. Basado en Domínguez y colaboradores, 2000, FEBS Letters 476,9 8-1 02, figura 2.

de genoteca porque cada proteína del proteoma está representada
por una formación aislada que debe producirse por separado me­
diante PCR. El método de genoteca implica menos trabajo y ofrece
ventajas porque cada presa está representada por múltiples clonas
superpuestas. Ello reduce la posibilidad de negativas falsas porque se
dispone de las mismas formaciones señuelo y también reduce el gra­
do de positivas falsas porque los aciertos independientes con dife­
rentes formaciones que representan la misma presa incrementan el
nivel de confianza que se atribuye a cualquier interacción detectada.
Sin embargo, en general los resultados de selecciones a gran escala
deben interpretarse con cautela ya que se producen resultados posi­
tivos y negativos falsos a causa de una diversidad de factores (véase
Legrain y cois., 2001 para una revisión). Si bien la mayor parte de los
estudios globales de dos híbridos se dirige a microbios, un progra­
ma piloto reciente demostró que la técnica también es aplicable a
proteomas de mamíferos (Suzuki y cois., 2001).
Además de los sistemas básicos de dos híbridos, se cuenta con
métodos derivados con aplicaciones más especializadas. Abarcan los
siguientes:
► El sistema de un híbrido, que se utiliza para detectar interac­
ciones entre proteínas y secuencias específicas de DNA o RNA.
572 | CAPÍTULO DIECINUEVE MÁS ALLÁ DEL PROYECTO DEL GENOMA

PR IN C IPIO
U n fa c t o r d e tra n s c rip c ió n tie n e
XI d o s d o m in io s fu n c io n a le s
' .... ^

¿ Q u é p ro te ín a s in te ra c tú a n
c o n la p ro te in a X ?

P R Á C T IC A ^
...u n d o m in io q u e s e e n la z a a D N A ... y un d o m in io
q u e a c tiv a tra n s c rip c ió n
Estos dominios deben llevarse entre si para activar un gen

E n o tra s c e p a s d e le v a d u ra , e x p re s a r
T O D A S L A S O T R A S P R O T E ÍN A S
c o m o h íb rid o s c o n el d o m in io d e
a c tiv a c ió n tra n s c rip c io n a l.
E s to p ro d u c e u n a g e n o te c a d e P R E S A S
En u n a c e p a d e levadura,
e x p re s a r la P R O T E ÍN A X
c o m o un híbrido co n el
d o m in io d e e n la c e d e DNA.
Éste es el S E Ñ U E L O
C ru z a m ie n to s is te m á tic o

G e n o te c a d e c e p a s d e “d o s h íb rid o s ” q u e e x p re s a n el s e ñ u e lo y u n a p r e s a p a rtic u la r

P o lim e ra s a
. de RNA

X x T ^ ______ ^
L a p ro te in a A in te ra c tú a
c o n la P R O T E ÍN A X
S e c u e n c ia r y c a ra c te r iz a r el
v fw iA A , g e n p a r a P R O T E ÍN A A

Si el se ñ u elo y la p re s a no in te rac tú an , Si el se ñ u elo y la p re s a in te rac tú an ,

el g en en es tu d io no se a c tiv a el g en en es tu d io se a c tiv a

Fig. 19-18. Principio y práctica del sistema de levadura de dos híbridos.

Por lo general los factores de transcripción comprenden dos dominios funcionalmente independientes, uno para enlace de DNA y otro para activación
transcripcional. Éstos no tienen que estar unidos entre sí de manera covalente, pero pueden ensamblarse para formar una proteína dimérica. Este principio
se aprovecha para identificar interacciones proteínicas. Las proteínas señuelo se expresan en una cepa de levadura como una fusión con un dominio de
enlace de DNA y las presas candidato se expresan en otra cepa como fusiones con un dominio de transactivación. Cuando las dos cepas se aparean,
sólo se ensamblan factores funcionales de transcripción si el señuelo y la presa interactúan. Esto puede detectarse mediante la inclusión de un gen
rastreador activado por el factor de transcripción híbrido. A pesar de la simplicidad del principio, la técnica es propensa a problemas de seguridad y
reproducibilidad. Surgen positivas falsas a causa de autoactivación espontánea (el señuelo o la presa pueden activar el gen rastreador por sí mismas),
señuelos y presas adherentes (proteínas que interactúan de manera específica con muchas otras) e interacciones irrelevantes (interacciones al azar
entre proteínas que nunca se encontrarían entre sí bajo circunstancias normales, como las que suelen encontrarse en compartimientos separados).
Pueden surgir negativas falsas ocasionadas por errores de la PCR en el producto elaborado y por condiciones fisiológicas (la valoración se realiza en el
núcleo, de manera que es posible que las proteínas y otros compartimientos no se doblen o ensamblen en form a apropiada).

► Los sistemas de tres híbridos, que se emplean para estudiar in­
teracciones proteínicas más complejas, aun interacciones que
comprenden tanto RNA como proteínas (señuelo y gancho).
► El sistema de dos híbridos inverso, que se usa para detectar la
alteración de interacciones de proteínas transformando la leva­
dura con un gen suicida que es activado por el factor de trans­
cripción ensamblado de forma correcta.
► El sistema de corte de ubiquitina, en el que las interacciones
proteínicas unen entre sí las dos mitades de la proteína ubiquiti­
na. La interacción puede vigilarse probando la degradación de la
proteína señuelo por ubiquitina o mediante la liberación de una
proteína funcional como un factor de transcripción.
► El sistema de incorporación SOS, en el que se incorporan a la
membrana las proteínas que interactúan y completan una vía de
señalamiento esencial. La proteína señuelo se fija a la membra­
na plasmática de una célula de levadura que carece de actividad
CDC25; los 25 mutantes de levadura cd c no son viables pero
pueden rescatarse mediante SOS ortólogo humano en tanto la
 19.4 PROTEÓMICA | 573

A) B) S e ñ u e lo G e n o te c a d e fra g m e n to s d e pres a
P re sa P1 P2 P3 P4 P5
Señuelo B1
B1 B2 CO-'-'
B2 B3
< n !(3 2 >
<n>
B3
B4
B5

P re sa P1 P 2 P 3 P 4 P5 P ro teín as
Señuelo
B1 a □ □ □ □
F ra g m e n to s
B2 B □ H □ □ se le c c io n a d o s
B3 □ □ □ □ □ (presa)
B4 □ □ ■ □ ■
B5 ■ □ □ □ ■ D o m in io d e
in te ra c c ió n

Fig. 19-19. Métodos de selección de matriz y de genoteca para elaborar mapas de interacción de proteínas a gran escala.
A) M étodo de m atriz. El mism o conjunto de proteínas (1 a 5) se utiliza como señuelo (B1 a B5) y como presa (P1 a P5). Los resultados pueden
dibujarse en una matriz. Los autoactivadores (p. ej., B4) y las proteínas presa “ adherentes” (p. e j„ P2 interactúa con muchos señuelos) se identifican y
descartan. El resultado final se resume como una lista de interacciones que pueden ser heterodímeros (p. ej., B2 a P3) u homodímeros (como B5 a
P5). B) M étodo de selección de genoteca. Identifica el dominio de interacción para cada proteína presa que interactúa con un señuelo determinado.
Las proteínas presa adherentes se identifican como fragmentos de proteínas que suelen seleccionarse a pesar de la proteína señuelo. Reproducido de
Legraín y colaboradores (2001) con autorización de Elsevier Science.

proteína esté localizada en la membrana. Pueden valorarse me­
diante la expresión de una genoteca de presas como híbridos
SOS. Este sistema es útil para estudiar las interacciones de fac­
tores de transcripción, que autoactivarían el gen rastreador en
un sistema convencional de dos híbridos.
► Los sistemas de dos híbridos de mamíferos, que pueden valorar
interacciones entre proteínas con modificaciones postraduccio-
nales auténticas.
19.4.7 El desafió de la proteómica de interacción es
ensamblar un mapa de interacción funcional
de la célula
Los datos de interacción de proteínas proporcionan información
funcional útil y, en la escala de la extensión del proteoma, quizá
permitan que todas las proteínas en las células se liguen dentro de
vías y redes funcionales. La asimilación y la presentación de estos
datos es importante y con este propósito en mente se establecieron
varias bases de datos (cuadro 19-2). Estos datos se derivan sobre
todo de EM a gran escala y de selecciones de dos híbridos, pero es
posible que exista una cantidad muy considerable de datos relacio­
nados respecto a interacciones de proteínas individuales “ocultos”
en la bibliografía científica si se retroceden muchos años (véanse
las líneas azules en la fig. 19-16). La extracción de esta informa­
ción y su integración con la obtenida de experimentos recientes
de alto rendimiento serán un desafío. Como hecho relevante, se
desarrollaron varias herramientas bioinformáticas para rastrear en
!¿ bibliografía e identificar palabras clave que indiquen interac­
ciones proteínicas de manera que los analizadores humanos pue­
dan escrutar bases de datos de interacción (Xenarios y Eisenberg,
2001).
Un segundo problema consiste en que no es simple representar
redes de interacción de proteínas, por lo que un desafío importan­
te es la presentación clara de los datos (fig. 19-16). Sin embargo,
como cabría esperar, proteínas con una función general similar (p.
ej., transporte de membrana, reparación de DNA, metabolismo de
aminoácidos) tienden a interactuar más entre sí y no con proteí­
nas no relacionadas en términos funcionales. En consecuencia es
posible simplificar mapas complejos, como se muestra en la figu­
ra 19-20, si las proteínas relacionadas funcionalmente se agrupan
en focos que representan procesos celulares básicos. Cabe señalar
que estos procesos en sí mismos están enlazados en varias formas,
por ejemplo, las proteínas que controlan la estructura de la croma-
tina tienen más interacciones con las que participan en la repara­
ción y la recombinación de DNA que las que se relacionan con el
metabolismo de aminoácidos y la degradación de proteínas. Este
tipo de presentación permite mostrar interacciones proteínicas
de manera jerárquica y también proporciona un punto de refe­
rencia que abre la posibilidad de determinar interacciones nue­
vas. Tres cuartas partes de todas las interacciones proteínicas
ocurren dentro del mismo grupo de proteínas funcionales, en
tanto que la mayor parte de las otras tiene lugar con grupos fun­
cionales relacionados. Una interacción inesperada entre proteí­
nas que participan en procesos no relacionados debe considerarse
con sospecha y estudiarse mediante valoraciones genéticas, bio­
químicas y físicas.
574 | CAPÍTULO DIECINUEVE ¡ MÁS ALLÁ DEL PROYECTO DEL GENOMA

Cuadro 19-2. Selección de bases de datos que incluyen información sobre interacciones de proteínas
Base de datos y comentarios URL

Biomolecular Interaction Network Database (BIND) http://www.bind.ca

Lista de interacciones individuales proteina-proteina, vías y complejos.
También una lista de interacciones de proteínas con otras moléculas.

Database o í Interacting Proteins (DIP) http://dip.doe-mbi.ucla.edu

Lista de varios miles de interacciones proteina-proteina.

Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Un recurso extenso sobre vías de señalamiento y http://www.genome.ad.jp/kegg/
metabólicas que también incluye una sección dedicada a la estructura de proteínas complejas.

M e ta b o lis m o d e a m in o á c id o s
M e io s is
F u s ió n d e D e g r a d a c ió n . M it o s is -
m e m b ra n a \ d e p ro te ín a
S ín te s is d e D N A

R e c o m b in a c ió n

E s tru c tu ra
c e lu la r

D o b le z d e la p ro te ín a

T ra n s lo c a c ió n d e p ro te in a

E s tré s c e lu la r
M e ta b o lis m o d e
á c id o s g ra s o s
y e s te ró le s lip id o s
M e ta b o lis m o d e \ T ra n s c rip c ió n P o l I
c a rb o h id r a to s T ra n s c rip c ió n P o l III

Fig. 19-20. “Mapa de interacción de grupo funcional” simplificado del proteoma de la levadura.

Los datos se derivan de un mapa complejo de interacciones Individuales, obtenido principalmente de selecciones de dos híbridos. Cada línea Indica que
hay 15 o más interacciones entre las proteínas de los grupos conectados. Las conexiones con menos de 15 interacciones no se muestran porque
ocurre un número pequeño de interacciones entre casi todos los grupos y a menudo tienden a ser falsas, es decir, basadas en resultado positivos falsos.
Sólo se Incluyeron proteínas de levadura con anotación completa y se sabe que muchas proteínas pertenecen a varias clases funcionales. Reproducido
de Tucker y colaboradores (2001) con autorización de Elsevíer Science.

19.4.8 La información de interacciones proteínicas con
ligandos pequeños puede mejorar el conocimiento
de los procesos biomoleculares y proveer una
base racional para el diseño de fármacos
Además de las interacciones proteina-proteina (véase antes) y las de
proteína-ácido nucleico, las proteínas interactúan con un gran nú­
mero de moléculas pequeñas que funcionan como ligandos, sustra­
tos, cargas (en proteínas de transporte), cofactores y moduladores
alostéricos. En todos los casos estas interacciones ocurren porque la
superfìcie de la proteína y la molécula de interacción son comple­
mentarias en cuanto a forma y propiedades químicas, lo que signifi­
ca que el enlace conduce a una reducción de la energía libre. La base
del diseño de fármacos es la identificación de moléculas que interac­
túan de modo específico con proteínas blanco y cambian sus activi­
dades en las células. Casi todos los fármacos actúan a nivel de proteí­
nas y al hacerlo interactúan con la proteína, y alteran su actividad de
una manera fisiológicamente benéfica. Los efectos secundarios rela­
cionados con los fármacos suelen reflejar interacciones inespecíficas
con otras proteínas que producen acciones perjudiciales. Cuanto más
se aprende respecto a la estructura y las interacciones de las proteínas
con moléculas pequeñas, más información puede utilizarse para di­
señar fármacos con mayor eficacia y especificidad.
Es posible investigar interacciones de proteína y ligando me­
diante la selección de alto rendimiento de un gran número de
compuestos químicos, pero la cantidad de trabajo puede reducir­
se si se intenta primero modelar estas interacciones para definir
compuestos guia adecuados. Si la estructura de la proteína blanco
se conoce (véase antes), puede recurrirse a programas de computadora
denominados algoritmos de atraco a fin de seleccionar bases de

datos de estructuras químicas e identificar posibles ligandos de in­
teracción con base en su complementariedad. Estos algoritmos in­
tentan fijar moléculas pequeñas dentro de sitios de enlace a partir
de información de restricciones estéricas y energías de enlace. Los
ejemplos incluyen AUTODOCK, LIGIN y GRAMM. Las bases
de datos clínicos pueden seleccionarse no sólo con un sitio de en­
lace (búsqueda de interacciones moleculares complementarias) sino
también con otro ligando (búsqueda de interacciones moleculares
idénticas). Este proceso de diseño racional de fármacos condujo
a la producción de varios medicamentos bien conocidos, como re-
lenza y captopril.
19.5 Resumen
Los proyectos de genoma producen grandes cantidades de datos
de secuencias que deben explorarse por medio de computadoras
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[ BIBLIOGRAFÍA j 575
para identificar genes y elementos reguladores. Una vez que se
dispone de los genes, es necesario determinar sus funciones y có­
mo interactúan los diversos productos génicos entre sí. En este
capítulo se comentó la forma en que el análisis de secuencias y es­
tructural puede utilizarse para obtener alguna información res­
pecto a la función de las proteínas y cómo el desarrollo de
tecnologías de alto rendimiento para el análisis del transcriptoma
y proteoma ayuda a relacionar estas funciones entre sí. Un com­
ponente de la genómica funcional que aún no se aborda es el uso
de mutantes para estudiar funciones génicas. Puesto que ello in­
cluye la modificación genética de células y animales, el tema se
pospuso hasta el siguiente capítulo, que considera el modo en que
la manipulación de genes puede emplearse para estudiar la fun­
ción y la regulación génica, y construir modelos de enfermedades
humanas.
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CAPÍTULO VEINTE

M anipulación gen ética d e células

y anim ales

Contenido del capítulo

578 ¡ CAPÍTULO VEINTE MANIPULACIÓN GENÉTICA DE CÉLULAS Y ANIMALES
20.1 G eneralidades de la tecnología
de tran sferen cia gènica
Las células cultivadas y los animales experimentales se aprovechan
con amplitud como sistemas modelo para estudiar los aspectos
bioquímicos, fisiológicos y del desarrollo en la salud y la enferme­
dad en humanos. En épocas recientes estos estudios se beneficia­
ron de manera importante de la tecnología de transferencia
gènica, que permite introducir secuencias específicas de DNA en
el genoma de células animales (transgénesis). Antes de contar
con las técnicas de transferencia gènica, la única forma en que la
genética de las células y los animales podía alterarse era mediante
mutagénesis, un proceso que comprende el uso de radiación o sus­
tancias químicas potentes para generar modificaciones aleatorias
en el genoma.
Una de las ventajas que la tecnología de transferencia gènica
ofrece consiste en que permite añadir secuencias de DNA nuevas
preparadas in vitro al genoma. Estas secuencias adicionales pueden
ser genes que otorgan nuevas funciones {ganancia d e función) o ele­
mentos que inhiben la expresión de genes endógenos (pérdida de
función). En otro nivel, la tecnología de transferencia gènica permi­
te modificar el genoma en una form a precisa y predeterm inada, de
manera que pueden diseñarse mutaciones e introducirse en genes
particulares in vivo (envío dirigido de genes). Aunada a métodos
complicados para regular la expresión de genes, la tecnología de
transferencia gènica incrementa mucho la capacidad para estudiar
y controlar el modo en que los genes funcionan y para elaborar mo­
delos de enfermedades en ratones.
La transferencia gènica a células de mamíferos cultivadas se do­
cumentó por primera vez al inicio del decenio de 1960, cuando se
observó que las células humanas captaban e incorporaban DNA
genómico fragmentado de su medio de cultivo (Szybalska y Szy-
balski, 1962). Aunque se requirió algún tiempo para descubrir los
factores que rigen la transferencia de DNA, la introducción de
DNA en muchos tipos de células ya era un procedimiento rutina­
rio hacia principios del decenio de 1970. Casi al mismo tiempo se
produjeron los primeros animales transgénicos. Éstos contienen
la misma secuencia de DNA adicional en cada célula y se generan
extendiendo los principios de la transferencia gènica a células que
contribuyen a la línea germinal de los animales. Los primeros ani­
males transgénicos fueron ratones que contenían parte de la se­
cuencia de DNA SV40 (virus simiano 40), producidos mediante
la simple inyección de DNA en las cavidades del blastocele de em­
briones antes de la implantación (Jaenisch y Mintz, 1974). Desde
entonces se desarrollaron procedimientos seguros para la modifi­
cación genética de ratones y muchas otras especies, inclusive orga­
nismos modelo invertebrados (moscas de la fruta y nematodos) así
como peces, ranas, aves, ratas y varios mamíferos domésticos y ga­
nado. En fecha más reciente tuvo un impacto mayor otro método
experimental que comprende la manipulación genética de anima­
les. En 1997 se anunció una nueva era en genética cuando se pu­
blicó el primer éxito en la clonación de mamíferos (Wilmut y
cois., 1997). Esto incluyó la transferencia del núcleo de una célula
adulta al interior de un oocito enucleado (transferencia nuclear
de células somáticas) y luego la tecnología se aplicó como una vía
alternativa para la producción de animales modificados genética­
mente.
En la primera parte de este capítulo se describen los principios
y métodos de la transferencia gènica, y las estrategias para la mani­
pulación genética de animales. En el resto del capítulo y en el 21 se
comenta la forma en que se aplican estos métodos, dirigidos a las
siguientes áreas de investigación biomédica.
► Estudio de la expresión y la función génicas (el presente ca­
pítulo). Las células de animales cultivadas se emplean con am­
plitud para investigar la función génica y la regulación de la
expresión de genes. La razón para ello es simple: las células ani­
males proporcionan el fondo genético correcto y un contexto
bioquímico para el estudio de genes de animales. Este contex­
to no puede duplicarse con precisión mediante sistemas expe­
rimentales in vitro. La capacidad para añadir genes o eliminar
o alterar en forma selectiva genes específicos en animales pro­
porciona una base potente para el análisis funcional en el con­
texto del organismo completo.
► Aplicaciones en genómica funcional (este capítulo). Es posi­
ble estudiar las funciones génicas a una escala global mediante
la creación de genotecas mutantes insercionales de la extensión
del genoma, genotecas de atrapamiento de genes y el desarro­
llo de técnicas de knockdown de genes de alto rendimiento ba­
sadas en la interferencia de RNA (sección 20.2.6). Estas
técnicas se aplican a una gama de animales modelo desde el ne-
matodo Caenorhabditis elegans\v3&xiL el ratón, y también a célu­
las humanas en cultivo; complementan las diversas estrategias
genómicas funcionales y se estudian en el capítulo 19.
► Creación de modelos de enfermedad (este capítulo). La na­
turaleza proporcionó algunos modelos animales de enfermeda­
des y otros se generaron mediante mutagénesis aleatoria, pero
no d e una manera predeterminada. La tecnología de transferen­
cia génica permite crear genotipos mutantes específicos en ani­
males y en consecuencia incrementa la posibilidad de semejar
enfermedades humanas a niveles genético y fenotípico. En una
extensión más limitada, también posibilita modelar la patogé­
nesis en células cultivadas.
► Producción de proteínas recombinantes (cap. 21). Las cé­
lulas cultivadas y los animales transgénicos se utilizan como
“biorreactores” para producir proteínas recombinantes. Los
sistemas de mamíferos muestran ventajas particulares para
producir proteínas humanas terapéuticas porque las proteí­
nas recombinantes experimentan modificación postraduc-
cional auténtica.
► Desarrollo del potencial para terapéutica génica (cap. 21).
Es posible que la transferencia de genes a células humanas per­
mita corregir o mejorar defectos genéticos.
20.2 Principios de la tran sferen cia
génica
20.2.1 La transferencia génica puede utilizarse para
nuevas secuencias de DNA funcionales en
células animales cultivadas, en forma
pasajera o estable
La transferencia génica se emplea para añadir genes nuevos y fun­
cionales a células animales, lo que a menudo significa que las célu­
las adquieren la capacidad de expresar una o más proteínas nuevas.
Ello se describe como ganancia de función. La secuencia adicional
de DNA se conoce como transgen, aunque puede contener uno,
dos o incluso más genes reales. En ocasiones se denomina “DNA
 20.2 j PRINCIPIOS DE LA TRANSFERENCIA GENICA | 579
extraño” pero es erróneo porque resulta perfectamente aceptable in­
troducir copias extra de un gen endógeno y en realidad este méto­
do puede ser muy útil para estudiar la función génica. Es posible
aplicar de manera general, y se prefiere, el término alternativo
“DNA exógeno”. Los transgenes pueden introducirse en células
cultivadas por medio de una diversidad de métodos de transporte
virales y no virales, que se resumen en el recuadro 20-1.
El destino del transgen es importante. En algunos casos se con­
serva de manera pasajera en las células huésped, en tanto que en
otros se constituye en una parte permanente del genoma. El desti­
no del transgén depende de las propiedades del virus cuando la
transferencia génica mediada por virus se usa. Algunos sólo son
adecuados para expresión pasajera, mientras que otros son capaces
de causar infecciones latentes y la expresión del transgen a largo
término puede ser posible. Los retrovirus son inusuales porque
una copia de DNA del genoma viral se integra en el genoma del
huésped poco después de una infección. Por consiguiente es posi­
ble recurrir a retrovirus recombinantes para crear líneas celulares
transformadas de modo estable.
La introducción de DNA mediante transfección en células de
animales cultivadas casi siempre se realiza en forma de plásmidos
bacterianos que no pueden replicarse en animales. Aunque es po­
sible que una gran proporción de las células capte el DNA al
principio, poco después se descompone y cualquier expresión
transgénica es pasajera. La longevidad del plásmido depende de la
calidad del DNA y la línea de células huésped. El DNA de plásmi­
dos de buena calidad persiste uno a dos días en un gran porcenta­
je de células, pero en algunos casos tal vez dure mucho más (p. ej.,
el DNA plásmido puede permanecer hasta 80 h en la línea
HEK293). En una proporción muy pequeña de células transfecta-
das, parte del DNA plásmido se integra en el genoma y produce
una transformación estable. Éste es un acontecimiento tan raro
que deben emplearse estrategias de selección potentes a fin de
identificar las transformaciones estables. La estrategia general con­
siste en incluir un gen marcador seleccionable en el plásmido o
cotransfectar las células con dos plásmidos, uno que contiene el
transgén primario y otro que comprende un marcador selecciona-
ble. El gen con el marcador estable confiere a las células una pro­
piedad que les permite sobrevivir en presencia de un agente
selectivo, como un antibiótico, que destruye células no transforma­
o s (recuadro 20-2). En esta forma pueden obtenerse líneas celu-
u es transformadas de modo estable.
De manera alternativa pueden transfectarse células con un vec­
tor plásmido que contiene un origen de replicación viral, en cuyo
ciso el transgen se conserva y replica episómicamente. En algunos
it-iores, el origen facilita la replicación rápida, incontrolable, del
rem id o , lo que conduce a valores pasajeros altos del transgén, pe-
*: i continuación destruye las células. Se observa así en células
I OS transfectadas con plásmidos que portan un origen de replica-
no n SV40. En contraste, los vectores que contienen el origen de re-
r-lició n latente del virus Epstein-Barr (EBV) se conservan en un
z __nero moderado de copias y, si se incluyen marcadores seleccio-
tiz.es apropiados, pueden usarse para obtener líneas de células
—-.'Tormadas en forma estable.
En resumen, pueden utilizarse métodos de aporte génico tanto
«cates como no virales para introducir nuevos genes en células ani-
mius de manera pasajera o estable. La transformación estable pue-
ie -C-crarse mediante integración retroviral, conservación episómica
i .¿30 término de un vector de replicación o integración de DNA
a: «epíicante en uno de los cromosomas de la célula huésped.
20.2.2 La producción de animales transgénicos requiere
la transferencia génica estable a la línea germinal
Aunque los métodos antes comentados resultan adecuados para la
transformación de células en un plato de cultivo, es más difícil exten­
der esta tecnología a animales completos. Es imposible introducir de
manera uniforme DNA en todas las células de un animal adulto. Por
consiguiente, para producir un animal por completo transgénico
(uno que contiene el mismo transgén en el mismo contexto en cada
célula), éste debe desarrollarse a partir de un cigoto transgénico. Esto
se logra mediante la transferencia génica estable a la línea germ inal y
puede efectuarse en una de dos formas (fig. 20-1):
► Directa, mediante la introducción selectiva de DNA en células
germinales, los gametos derivados de las mismas o en el huevo
justo después de la fecundación. Si el DNA se integra antes de
la primera división del cigoto, cada célula resultante del animal
contendrá el mismo transgen.
► Indirecta, por medio de introducción no selectiva de DNA en
el embrión antes que la línea germinal se forme. En esta etapa
las células embrionarias son totipotentes, o cuando menos plu-
ripotentes, lo que significa que pueden formar cualquiera de
los tipos de células del embrión en desarrollo. Como el DNA
se integra después de la primera división del cigoto, sólo algu­
nas de las células del embrión incorporarán el transgen. Sin
embargo, si esas células contribuyen a la línea germinal del em­
brión se producirán gametos transgénicos y la generación sub­
secuente de animales será transgénica.
El cuadro 20-1 resume los métodos de transferencia génica en ani­
males y en seguida se comentan en detalle.
La transferencia génica directa a células precursoras de la
línea germinal es el procedimiento estándar para producir
moscas de la fruta transgénicas
La introducción de DNA en células germinales puede ser un medio
muy útil para acceder a esta línea celular porque conduce a la produc­
ción de gametos transgénicos. Este método no se emplea en mamífe­
ros ya que, aunque las células germinales primordiales de mamíferos son
hasta cierto punto íaciles de aislar, cultivar y transfectar, resulta difícil
inducir las células modificadas para que contribuyan a la línea germi­
nal cuando se reintroducen en un animal huésped. Sin embargo, la
modificación directa de células germinales es el método rutinario pa­
ra producir moscas de la fruta transgénicas. En Drosophila melanogas-
ter la integración cromosómica eficiente se logra con secuencias de un
elemento transposable que se conoce como elemento P. El transgen se
inserta entre las dos secuencias terminales del elemento P y luego
se inyecta en el polo plasmático de un embrión joven, que es el sitio
donde se encuentran los núcleos del polo celular (células precursoras
de la línea germinal). La enzima transposasa que se requiere para la
transposición del elemento P se suministra mediante la inyección con­
currente de un plásmido y esto facilita la integración aleatoria del
transgen en el genoma de uno o más de los núcleos del polo celular.
Sólo una copia del transgen suele incorporarse.
El DNA puede mezclarse con espermatozoos o núcleos de
estos últimos e introducirse en huevos no fecundados
La modificación directa de gametos es otra forma de generar ani­
males transgénicos. Se diseñaron dos métodos muy distintos: apor-
580 i CAPÍTULO VEINTE I MANIPULACIÓN GENÉTICA DE CÉLULAS Y ANIMALES
Recuadro 20-1. Métodos de transferencia génica a células animales en cultivo
Cuatro clases generales de metodología de transferencia genica pueden
aplicarse a células animales cultivadas, pero las que más se utilizan son la
transducción y la transfección. Pueden emplearse variaciones de estos mé­
todos a fin de introducir DNA en células humanas in vivo (sección 21.5).
► TRANSDUCCIÓN. Es una transferencia génica mediada p o r virus, es
decir, el DNA extraño se empaca dentro de una partícula viral. Los vi­
rus animales evolucionaron en varias formas para introducir su DNA
o RNA en células y por esta razón muchos virus se aprovechan co­
mo vectores de transferencia génica. Incluyen:
a) virus que facilitan la expresión transgénica pasajera de alto nivel,
por ejemplo, adenovirus, virus Sindbis, virus del Bosque Semliki,
virus de vaccinia, baculovirus (en células de insectos, que apo­
yan la replicación de baculovirus);
b) virus que se conservan en un estado episómico latente y facilitan
la expresión transgénica estable a largo plazo, com o virus Eps-
tein-Barr, virus del herpes simple, baculovirus (células de mamí­
feros, que no apoyan la replicación de baculovirus);
c) virus que se integran en el genoma y pueden usarse para trans­
form ación estable permanente, por ejemplo, retrovírus, virus ade-
norrelacionados.
► TRANSFECCIÓN. Comprende el uso de artimañas químicas o físi­
cas a fin de inducir a las células para que capten DNA del medio de
cultivo y por último el DNA encuentra su camino al núcleo. Cabe se­
ñalar que, en sistemas bacterianos, transfección se refiere a la cap­
tación de DNA viral (fago) desnudo en tanto que transform ación
denota la captación de DNA plásmido genómíco desnudo. En célu­
las animales transfección denota la captación de cualquier DNA
desnudo en tanto que transform ación suele referirse a un cambio
estable y permanente del genotipo si se utiliza en el contexto de
transferencia génica. Existen numerosos métodos de transfección
diferentes que incluyen:
a) transfección química. Cuando se mezcla DNA con cloruro de cal­
cio en presencia de un amortiguador de fosfato se forma un pre­
cipitado de fosfato de calcio y DNA fino. Éste se asienta en la
membrana plasmática de células cultivadas y es captado por en-
docitosis. El DNA también puede form ar complejos solubles con
otras sustancias químicas, entre ellas DEAE-dextrán (dietilami-
noetil-dextrán) o el detergente polibreno. Las células que no se re­
cubren con fosfato del calcio pueden responder mejor a estas
alternativas;
b) transfección mediada por liposomas (fig. 21-8). El DNA puede
encapsularse en vesículas lípidas artificiales conocidas como lipo­
somas que se fusionan con la membrana plasmática y depositan
su carga en el citosol. Es posible incrementar la eficiencia de la
transfección si el liposoma se deriva de envolturas virales, que a
menudo contienen proteínas que fortalecen la fusión con la mem­
brana. Éstas vesículas se denominan virosomas. De otra manera
pueden emplearse membranas celulares reales como vehículo de
transporte. Ésta es la base de la fusión del protoplasto, en la que
protoplastos bacterianos cargados con DNA se centrifugan en cé­
lulas de mamíferos cultivadas y la fusión con las mismas se indu­
ce utilizando políetilenglicol (PEG). Una técnica similar recurre a
eritrocitos fantasma (eritrocitos sin hemoglobina);
te de DNA mediado por espermatozoo e integración mediada por
enzima de restricción.
El aporte de DNA mediado por espermatozoo aprovecha el
hecho de que la cabeza de los espermatozoos se enlaza de modo es-
c) lipofección. A diferencia de la transfección mediada por liposo­
mas, en la que el DNA se encapsula en una vesícula lípida, la //'-
pofección comprende la formación de un complejo DNA-lípido
(lipoplex) que es captado con eficiencia por endocitosis. Por
consiguiente la lipofección tiene más en común con la transfec­
ción química que la transfección mediada por liposoma. En fecha
más reciente se popularizaron vehículos de transporte génico ba­
sados en polímero catiónico Ipoiiplexos). Son tan eficientes co­
mo lo lipoplexos pero tienen la ventaja de que pueden utilizarse
con polímeros específicos para modificar las propiedades físicas
del vehículo de transporte. Está demostrado que en algunos ca­
sos es factible form ar complejos con propiedades diferentes a
distintas temperaturas, lo que permite la liberación controlada de
DNA (Yokayama, 2002). Esto podría tener gran utilidad para la
transferencia génica in vivo a sitios particulares en el cuerpo
(cap. 2 1);
d) electroporación. En este método se someten células a un pulso
eléctrico breve que ocasiona la aparición de poros pasajeros, de
tamaño de nanómeros, en la membrana plasmática. Sí el DNA es­
tá presente en la solución amortiguadora a una concentración su­
ficiente, se captara a través de estos poros;
e) endocitosis mediada por receptor (lig. 21-9). En este método se
fija DNA al ligando de un receptor de superficie celular que se re-
cicla mediante endocitosis. El DNA se libera durante el procesa­
miento del receptor. En circunstancias normales el endosoma que
contiene el complejo receptor-ligando-DNA se fusiona con un li-
sosoma y el DNA se degrada, pero esto puede evitarse medíante
la inclusión de péptidos adenovirales en el complejo de transfec­
ción ya que éstos alteran endosomas. Este método puede usarse
para dirigirse a tipos de células específicos con base en su espe­
cificidad de receptor.
TRANSFERENCIA DIRECTA. Comprende la introducción física direc­
ta de DNA en las células. El ejemplo obvio es la microinyección, que
en ocasiones se usa en células cultivadas que son resistentes a otros
métodos de transferencia génica pero suele aplicarse a huevos, cigo­
tos o embriones tempranos de animales. Otro método de transferen­
cia directa es el bombardeo de partículas, que incluye la aceleración
de microproyectíles recubiertos con DNA a alta velocidad hacia el in­
terior de las células. Aunque puede emplearse en células cultivadas,
es un procedimiento de elección para la transfección de células en
cortes de tejidos y también puede aplicarse a la transferencia génica
in vivo (sección 21.5.4).
TRANSFERENCIA GÉNICA BACTERIANA. Por lo general comprende
el uso de bacterias ínvasoras, vivas, que se lisan dentro de la célula
animal y liberan su cargamento de DNA (Higgins y Portnoy, 1998).
En el caso de las especies de Salmonella ocurre lisis en una vesícu­
la fagocítica, en tanto que en otras especies (p. e j„ Listeria m onocy-
togenes y Shigeila flexneri) la lisis ocurre después que la bacteria
escapa de la vesícula. Asim ism o las bacterias pueden unirse a la su­
perficie celular y transferir DNA a través de un pilo. En Agrobacte-
rium tumefaciens se utiliza este método para transferir DNA a plantas
y también puede infectar células de animales cultivadas (Kunik y
cois., 2001).
pontáneo a DNA in vitro. Por tanto se utilizan espermatozoos co­
mo vehículos para transporte aunque e l gen om a d e l gam eto en s:
m ismo no se m odifica. La IICE (inyección intracitoplásmica de
espermatozoos) es un tratamiento para la infecundidad que con-
 20.2 ¡ PRINCIPIOS DE LA TRANSFERENCIA GÉNICA I 581
Recuadro 20-2. M arcadores seleccionabies para células animales
CATEGORÍAS DE GEN MARCADOR SELECCIONABLE
Un gen marcador seleccionable confiere una propiedad que permite que
las células transformadas establemente sobrevivan y crezcan en presen­
cia de un agente particular que destruye o restringe el crecimiento de las
células no transformadas. Esto se conoce como selección positiva por­
que se seleccionan células con base en que portan el gen marcador (son
positivas para el gen marcador). La selección positiva es esencial para
aislar las muy pocas células en un plato de cultivo que se transformaron
de manera estable durante la transfección con DNA no replicante. Las cla­
ses principales de gen marcador seleccionable son dos: marcadores se-
leccionables endógenos y marcadores seleccionabies dominantes,
► Los marcadores seleccionabies endógenos son genes que se en­
cuentran en el genoma de las células huésped. Por consiguiente la
selección sólo puede aplicarse a células que carecen de una copia
funcional de ese gen. Un ejemplo es el gen TK que la enzima cinasa
de tim id ina codifica. Esta enzima convierte la timidina libre en mo-
nofosfato de tim idina como parte de la vía de salvamento de nu-
cleósidos. En circunstancias normales la vía de salvamento no es
esencial porque también pueden sintetizarse nucleótidos de timidina
nuevos a partir del monofosfato de uridina. Sin embargo, la célula se
torna dependiente de la actividad de TK si la vía nueva se bloquea con
el inhibidor am inopterina. Por tanto si las células T K ' (que carecen
de un gen TK funcional) se desarrollan en un medio HAT (que contie­
ne aminopterina y timidina), sólo las células transformadas en forma
estable con un gen marcador TK son capaces de sobrevivir.
► Los marcadores seleccionabies dominantes no se encuentran en el
genoma de la células huésped y confieren una propiedad por comple­
to nueva, como la resistencia a antibióticos. La ventaja de estos mar­
cadores consiste en que pueden emplearse en cualquier tipo de célula,
es decir, no se requieren mutantes. Por ejemplo, el neogén de £ coli
codifica la enzima fosfotransferasa de neomicina. Ésta inactiva anti­
bióticos aminoglucósidos como G418 y permite que las células trans­
formadas establemente se seleccionen mediante la sola adición de
G418 al medio de cultivo.
siste en inyectar cabezas de espermatozoos en el citoplasma del óvu­
lo. La IICE se emplea para introducir cabezas de espermatozoos re­
cubiertas con DNA plásmido en huevos de mamíferos. En el
primero de estos experimentos se fijaron espermatozoos de ratón en
plásmidos que contenían el gen para la proteína verde fluorescente
(PVT) y se inyectaron en oocitos aislados. Casi todos los huevos in­
yectados mostraron actividad de PVF, pero sólo 20% produjo rato­
nes transgénicos, lo que sugirió que el transgén no se integró en el
genoma celular en la mayor parte de los casos (Perry y cois., 1999).
La misma técnica se aplicó en monos rhesus; no obstante, aunque
varios embriones mostraron actividad de PVF pasajera, no se en­
contró que alguno fuera transgénico.
La integración mediada por enzima de restricción (IMER)
es él método establecido para producir ranas transgénicas. A dife­
rencia de la transferencia génica mediada por espermatozoos, el ge­
noma del gameto se modifica durante el procedimiento de
transferencia. Se aíslan núcleos de espermatozoos, se descondensan
v se mezclan con DNA plásmido. Después se tratan con cantidades
limitadas de una enzima de restricción para introducir muescas. En
seguida los núcleos descondensados se trasplantan en huevos no fe­
cundados, donde las muescas se reparan y se produce la integración
GENES MARCADORES AMPLIFICABLES
Si el agente selectivo que se elige es un inhibidor competitivo del produc­
to del gen marcador, entonces puede recurrirse a la selección gradual
para amplificar el gen marcador y lograr una expresión transgénica de al­
to nivel. Este sistema funciona porque el locus transgénico en células
transform adas establemente suele contener múltiples copias tándem
del marcador seleccionable y del transgen primario. Si la concentración del
agente selectivo se incrementa, se seleccionan las células con los núme­
ros de copias más altos porque expresan el marcador a los valores más
altos. Estas células pueden experimentar acontecimientos de recombina­
ción que incrementan de modo adicional el número de copias y median­
te el aumento progresivo de la presión de selección se seleccionan
células con arreglos transgénicos amplificados masivamente. La amplifi­
cación es un proceso aleatorio y el transgen primario se coamplifica jun­
to con el gen marcador. Un ejemplo de este marcador es el gen del ratón
dhrf, que codifica la enzima reductasa de dlhidrofolato. Ésta puede am­
plificarse mediante selección gradual con el inhibidor competitivo meto-
trexato.
GENES MARCADORES CONTRASELECCIONABLES
Un marcador contraseleccionable confiere una propiedad que destruye
células transformadas de manera estable, en tanto permite que las no
transformadas sobrevivan. Esto se conoce com o selección negativa
porque las células se seleccionan con base en que carecen del gen mar­
cador (son negativas para el gen marcador). Estos marcadores son útiles
para ablación celular si se expresan bajo el control de promotores restrin­
gidos. También se emplean para identificar tipos particulares de modifi­
cación genética, por ejemplo, para diferenciar entre los acontecimientos
de envío dirigido de genes y los de integración aleatoria en células ME
(sección 20.2.4). Algunos marcadores contraseleccionables destruyen
células en forma directa (p. ej., ricino, toxina diftérica), en tanto que otros
requieren la presencia de un agente selectivo (p. ej., puede usarse TK pa­
ra selección negativa en presencia de análogos tóxicos de timidina como
ganciclovir).
del DNA plásmido en el genoma. El procedimiento de transferen­
cia debe completarse con rapidez porque los núcleos son muy frá­
giles (Kroll y Amaya, 1996).
La microinyección de DNA en el huevo fecundado es un
medio establecido para producir ratones transgénicos y
se usa para la valoración de expresión pasajera en peces
y anfibios
Aunque se producen ratones transgénicos mediante la inyección de
DNA en el citoplasma de los huevos fecundados, una técnica más
eficiente, y ya establecida, consiste en introducir DNA directamen­
te en el pronúcleo masculino justo después de la fecundación. La
figura 20-2 muestra el método. El transgen microinyectado se inte­
gra de manera aleatoria en el DNA cromosómico, por lo general en
un sitio y como múltiples copias (no es raro encontrar 50 copias o
más como concatámeros cabeza a cola). El transgen puede integrar­
se de inmediato, en cuyo caso el ratón resultante es transgénico. Sin
embargo, es más usual que el DNA se integre después de una a dos
divisiones celulares y en estas circunstancias el ratón resultante es
un mosaico que contiene células tanto transformadas como no
582 CAPÍTULO VEINTE j MANIPULACIÓN GENÉTICA DE CÉLULAS Y ANIMALES

Fig. 20-1. Múltiples vías por las que es posible producir ratones genéticamente modificados.
Los cuadros unidos por líneas interrumpidas muestran el ciclo de vida del ratón y representan todas las etapas en que es posible efectuar una modificación
genética: células germinales, gametos, cigoto, blastocisto y adulto. La parte inferior de la figura muestra otro ratón como una fuente de células donadoras
para transferencia nuclear y procedimientos de trasplante celular. Las flechas rojas indican el ingreso de DNA exógeno. Las flechas gruesas señalan los
métodos de transferencia génica que más se utilizan en ratones.

Cuadro 20-1. Transferencia génica a animales: resumen de blancos y métodos para transformar la línea germinal
Células blanco Método

Células germinales Transfección de células germinales primordiales cultivadas (mamíferos)

Inyección en el embrión en el sitio de desarrollo de la célula germinal (Drosophila)

Espermatozoos Fijación de DNA a cabezas de espermatozoos (mamíferos)

Introducción de DNA en núcleos de espermatozoos descondensados (Xenopus)

Huevo/cigoto Microinyección en el citoplasma del huevo (aves, anfibios, peces, C. elegans)

Mlcroinyección pronuclear (mamíferos)
Transferencia retroviral (mamíferos, primates)
Transferencia nuclear

Blastocisto Microinyección en el blastocele (mamíferos)

Transferencia de células ME (ratón)
Transferencia retroviral (mamíferos, aves)

Células ME (seguidas p o r transferencia celular) Transfección: adición transgénica

Transfección: envío dirigido de genes
Transferencia retroviral

Células somáticas (seguidas p o r transferencia nuclear) Transfección: adición transgénica

Transfección: envío dirigido de genes
Transferencia retroviral
 20.2 PRINCIPIOS DE LA TRANSFERENCIA GÉNICA 583

transformadas. Cuando las células transformadas contribuyen a la
línea germinal, el transgén se pasa a la generación de ratones si­
guiente y esto puede verificarse mediante PCR, Southern blotting o
una prueba para expresión de transgen. La transmisión a la línea
germinal puede lograrse hasta en 40% de huevos de ratón microin-
yectados. Por desgracia, aunque la técnica se aplica a otros mamífe­
ros, la tasa de transmisión es mucho más baja (< 1%). Ello se debe
en parte a la dificultad para manejar los huevos y en otra a las tasas
de supervivencia más bajas.
La microinyección también se utiliza para introducir DNA en
huevos de peces y anfibios pero, a diferencia de lo que ocurre en ma­
míferos, este DNA tiende a persistir en estado episómico y experi­
mentar replicación extensa. El DNA plásmido inyectado puede
incrementarse 50 a 100 veces en las etapas tempranas del desarro­
llo. Se piensa que esto indica que no ocurre transcripción durante
el desarrollo temprano de peces y anfibios, de manera que hay una
acumulación extensa de enzimas y proteínas necesarias para la
replicación del DNA. La consecuencia es que es posible usar los
huevos de peces y ranas como sistemas de expresión pasajera. Sin
embargo, parte del DNA se integra y, si la transmisión a la línea
germinal se establece, entonces pueden producirse líneas transgéni-
cas. Aunque este método no se aplica en ranas por los intervalos de
generación prolongados, es el procedimiento estándar para produ­
cir peces transgénicos.
Aunque la transferencia génica retrovirai se emplea para
producir mamíferos y aves transgénicos, su principal
aplicación es crear mosaicos en el desarrollo
Es posible transferir genes a células no seleccionadas de embriones
muy tempranos utilizando vectores retrovirales porque después de la
infección una copia de DNA del vector se integra de modo estable
en el genoma del huésped. La infección de embriones de ratón an­
tes de la implantación mediante retrovirus murinos recombinantes
o inyección de retrovirus en embriones de ratón postimplantación
temprana ocasiona la transformación estable de algunas células y por
tanto la producción de mosaicos que pueden originar descendencia
transgénica. Se logran resultados similares en pollos por medio de
retrovirus aviario. No obstante, a causa de varias limitaciones de la
transferencia génica retrovirai (la cantidad limitada de DNA extra-

P ro n ú cleo P ro núcleo

Fig. 20-2. Desarrollo de ratones transgénicos mediante microinyección pronuclear.

Se construyen pipetas de vidrio muy finas con equipo especializado: una, la pipeta de sostén, tiene un diámetro que puede ajustarse a parte de un oocito
'ecundado y por consiguiente conservarlo en su sitio, en tanto que la pipeta de microinyección posee una punta muy fina que se utiliza para perforar el
Docto y después el pronúcleo m asculino (porque es más grande). A continuación una solución acuosa del DNA de deseado se lleva directamente
dentro del pronúcleo con la pipeta. Las clonas de DNA Introducidas pueden integrarse en el DNA cromosómlco en muescas y form ar transgenes, que
suelen contener múltiples coplas de cabeza a cola. Después de extraer la micropipeta, los oocitos sobrevivientes se reimplantan en los oviductos de
* -rubras adoptivas seudogestantes (que se aparearon con un macho vasectomizado; el acto de apareamiento puede iniciar cambios fisiológicos en la
• í'- b ra que estimulan el desarrollo de ios embriones implantados). Los ratones recién nacidos que resultan del desarrollo de los embriones implantados
revisan mediante PCR en cuanto a la presencia de la secuencia de DNA deseada (Gordon, 1992).
584 CAPÍTULO VEINTE MANIPULACIÓN GENÉTICA DE CÉLULAS Y ANIMALES
ño que puede incorporarse y la tendencia de los transgenes retrovi-
rales a sufrir silenciamiento) esta técnica no se utiliza con amplitud
para generar ratones o aves transgénicos. Por el contrario, se prefie­
re para producir mosaicos que pueden usarse para estudiar la expre­
sión y la función génicas en el desarrollo de vertebrados. En fecha
más reciente la inyección de retrovirus recombinantes en el espacio
perivitelino de oocitos aislados permitió producir ganado transgéni-
co (Chan y cois., 1998) y el primer primate transgénico obtenido al­
guna vez, un mono rhesus llamado ANDi (Chan y cois., 2001).
La transfección de células madre embrionarias permite
producir ratones transgénicos
Las células madre embrionarias (ME) de ratón se derivan de em­
briones de 3-5 a 4.5 días poscoito y surgen de la masa celular inter­
na del blastocisto (véase recuadro 20-3). Las células ME pueden
cultivarse in vitro y es fácil transfectarlas con los métodos que se
describen en el recuadro 20-1. Sin embargo, permanecen pluripo-
tentes y contribuyen extensamente a todos los tejidos de un ratón,
inclusive la línea germinal, cuando se reinyectan en un blastocisto
huésped y se reimplantan en una madre adoptiva seudogestante. El
embrión en desarrollo es una quimera que contiene dos poblacio­
nes de células derivadas de diferentes cigotos, los del blastocisto y
las células ME implantadas. Éste difiere del mosaico en que las cé­
lulas pueden ser genéticamente distintas pero derivadas del mismo
cigoto (fig. 4-10). Si el blastocisto y las células ME se derivan de ra­
tones con diferentes colores de pelambre, la descendencia quiméri­
ca puede identificarse con facilidad por sus pelajes en parches. La
transmisión del transgén a la línea germinal también puede confir­
marse seleccionando la descendencia de apareamientos entre qui­
meras (por lo general machos) y hembras con un pelambre de color
recesivo al de la cepa de la que las célula ME se derivaron (véase fig.
20-3).
Una de las ventajas de las células ME radica en que pueden
mantenerse de manera indefinida en cultivo y por tanto tienen to­
das las conveniencias relacionadas con las células cultivadas. Es po­
Recuadro 20-3. Aislamiento y manipulación de células madre em brionarias de mamíferos
El embrión propiamente dicho de mamíferos se deriva de la masa de cé­
lulas internas (MCI) de un blastocisto (sección 3.7.3). Evans y Kaufman
(1981), y Martin (1981) aislaron por primera vez las células madre (ME)
embrionarias de ratón de blastocistos. El procedimiento consiste en co­
locar un embrión preimplantación de 4.5 días (blastocisto) en una mono-
capa de células nutrientes, que proporcionan tanto una matriz para la
fijación como factores proteínicos secretados que inhiben la diferencia­
ción de células ME recién formadas. Tras la fijación del blastocisto, las
células de la MCI proliferan. En un tiempo apropiado la MCI se extrae fí­
sicamente con una micropipeta, se dispersa en grupos pequeños de cé­
lulas y se siembran nuevas células nutrientes. Las colonias se examinan
al microscopio para buscar la morfología caracteristlca. A continuación
se captan, dispersan en células únicas y se siembran de nuevo en capas
nutrientes. Por último las células con una morfología uniforme pueden
aislarse y establecerse líneas celulares. El término célula M E' se intro­
dujo para diferenciar estas células madre derivadas de embriones de las
células del carcinoma embrionario (CE), que se derivaron de teratocarci-
nomas. En general las células ME tienen un potencial de desarrollo me­
nos restringido que las células del carcinoma embrionario (CE). Las dos
clases de células son pluripotentes y las células ME pueden originar to­
dos los tipos de células adultas, inclusive las de la línea germinal. Sin em­
sible transformar millones de células con técnicas de transfección
simples y verificar la modificación genética deseada en la etapa de
cultivo celular con marcadores seleccionables como neo (recuadro
20-2). En contraste, los otros procedimientos comentados requie­
ren el procesamiento manual de huevos o embriones individuales,
de manera que sólo es posible efectuar un número pequeño de ex­
perimentos. Además, como no hay forma de seleccionar los huevos
y los embriones transformados, la integración del transgen debe ve­
rificarse en los ratones resultantes. Sin embargo, la mayor ventaja
de las células ME es su propensión a la recorribinación homóloga,
que permite la modificación genética mediante el envío dirigido de
genes (sección 20.2.5). En fecha reciente se derivaron líneas de cé­
lulas ME de pollos y humanos (véanse recuadro 20-3 y comentario
en la sección 21.3.3), pero aún no es posible derivar líneas de célu­
las ME seguras, vigorosas, a partir de mamíferos domésticos.
La transferencia nuclear puede emplearse para producir
mamíferos domésticos modificados genéticamente, pero su
tasa de éxito es muy baja
Las principales técnicas útiles para generar ratones transgénicos
(microinyección pronuclear y transfección de células ME) no son
eficientes o prácticas en la mayor parte de otros mamíferos. Por
esta razón se desarrollaron métodos alternativos basados en la tec­
nología de transferencia nuclear, que consiste en reemplazar
el núcleo de un oocito con el núcleo de una células somática, que el
oocito reprograma después y se torna capaz de recapitular la totali­
dad del desarrollo a pesar del estado diferenciado de la célula dona­
dora.
La tecnología no es nueva en sí misma. Se ha recurrido a ella por
más de 50 años para generar anfibios clonados y ha permitido pro­
ducir mamíferos clonados a partir de células embrionarias desde fi­
nales del decenio de 1980. En 1995 se demostró por primera vez
que era factible clonar mamíferos a partir de núcleos de células cul­
tivadas (Campbell y cois., 1996) y el primer mamífero clonado a
partir de una célula adulta se produjo en 1997 (Wilmut y cois.,
bargo, no son totipotentes en el mism o sentido que el oocito fecundado:
si se implantan en un útero no son capaces de originar un embrión. En al­
gunos casos se informa que las células CE contribuyen a la línea germi­
nal en quimeras, pero cuando se inyectan células ME de ratón en un
blastocisto aislado de una cepa diferente y se implantan en una madre
adoptiva seudogestante contribuyen a quimeras y en particular a la línea
germinal en una form a más consistente. Esta propiedad es la que ha he­
cho que las células ME de ratón sean tan valiosas para la investigación.
No obstante, cabe señalar que las células ME que se utilizan para formar
con éxito quimeras de línea germinal se derivan de una cepa de ratón ais­
lada (129) en combinación con una cepa de embrión huésped única
(C57BIV6). En esta combinación, las células ME son vigorosas y contri­
buyen a la línea germinal.
Los investigadores buscaron durante muchos años células ME en otros
mamíferos y aunque éstas se aislaron de varias otras especies además
del ratón, el gran éxito en la formación de quimeras de línea germinal en
el ratón no fue paralelo. En fecha reciente se aislaron células madre em­
brionarias humanas del blastocisto (Thomson y cois., 1998) y se deriva­
ron de células germinales primordiales (Shamblott y cois., 1998). Las
aplicaciones médicas potenciales de las células ME humanas y las impli­
caciones éticas de su uso se comentan en el capítulo 2 1 .
 20.2 PRINCIPIOS DE LA TRANSFERENCIA GÈNICA ¡ 585

129
B lasto cisto
a islad o
a *

C élu las ME cu ltiv ad as

M asa d e célu las
in te rn a s
Envío dirigido
d e g e n e s o inserción
I d e tra n sg e n
R eim plantar Iny ectar d en tro
en m ad re
a d o p tiv a de la cavidad del
^ 3 blastocisto de una
C 57B 10/J cepa de ratón diferente
C 57B 10/J C élu las ME m o d ificad as
g e n é tic a m e n te

Q uim era

A paream iento

Ratón
que contiene
(heterocigoto)
modificación
genética en todas
las células
nucleadas

Fig. 20-3. Células ME modificadas genéticamente para transferir DNA extraño o mutaciones específicas en la línea germinal del ratón.

Se cultivaron células de la masa celular interna después de extirpar los oviductos y aislar blastocistos de una cepa de ratón adecuada (129). Estas células
madre embrionarias (ME) retienen la capacidad de diferenciarse en distintos tipos de tejidos en el ratón adulto. Las células ME pueden modificarse
genéticamente cuando están en cultivo mediante la inserción de DNA extraño o por la introducción de una mutación sutil. Las células ME modificadas
pueden inyectarse luego en blastocistos aislados de otra cepa de ratón (p. ej., C57B10/J, que tiene un color de pelambre negro que es recesivo al color
agutí de la cepa 129) y después implantarse en una madre adoptiva seudogestante de la misma cepa que el blastocisto. El desarrollo subsecuente del
blastocisto introducido produce una quimera que contiene dos poblaciones de células (inclusive células de la linea germinal) que se derivan de cigotos
diferentes (por lo general lo evidencia la presencia de placas de pelambre de diferentes colores). El retrocruzamiento de quimeras puede producir
ratones que son heterocigotos para la modificación genética. El interapareamiento subsecuente de mutantes heterocigotos genera homocigotos.

1997). La figura 20-4 resume el procedimiento que siguieron Wil-
mut y colaboradores. En el experimento original sólo 29 de un to­
tal de 434 oocitos se desarrollaron hasta la etapa transferible y sólo
uno de ellos se desarrolló hasta el término —la famosa oveja conoci­
da como Dolly (véase fig. 20-4B)-. El éxito en la clonación de ani­
males adultos forzó a aceptar que las modificaciones del genoma
que en alguna época se consideraban irreversibles pueden revertir­
se y que es posible reprogramar los genomas de células adultas me­
diante factores oocitarios para tornarlas totipotentes de nuevo. Es
indudable que la clonación de animales, en especial la de ratones,
beneficiará la investigación del control de la expresión génica du­
rante el desarrollo y los procesos básicos de la diferenciación somá­
tica, la mutación somática y los procesos del envejecimiento y la
reparación (Wakayama y cois., 1998). En el capítulo 21 se estudian
los beneficios médicos prácticos y las implicaciones éticas de la clo­
nación de animales y humanos, pero por el momento el método só­
lo se considera como otra forma de generar animales transgénicos.
El hecho esencial es que si el núcleo donador se obtiene de una cé­
586 CAPITULO VEINTE MANIPULACIÓN GENÉTICA DE CÉLULAS Y ANIMALES
lula que se transfectó y contiene un transgen adicional, entonces el
animal que se desarrolla a partir del oocito manipulado será trans-
génico. Esto lo demostraron por primera vez Schnieke y colabora­
dores (1997) quienes transfectaron fibroblastos de oveja cultivados
con el gen humano para factor de coagulación sanguínea IX y pro­
dujeron una oveja transgénica clonada llama Polly que contenía la
proteína recombinante en su leche. De igual forma se produjeron
ovejas clonadas a partir de células somáticas cultivadas cuyo geno-
ma se alteró mediante el envío dirigido de genes (véanse más ade­
lante y McCreath y cois., 2000).
20.2.3 El control de la expresión transgénica es una
consideración importante en cualquier
experimento de transferencia génica
La presencia de un transgen en una célula o animal transgénico no es
suficiente por sí misma para producir un producto funcional. A fin
de que lo anterior ocurra, el transgén también debe expresarse. Por
consiguiente el control de la expresión génica tiene una importancia
fundamental en la tecnología de transferencia génica. La expresión
transgénica se regula mediante las secuencias que se encuentran en el
elemento de expresión y, cuando el transgen se integra, también por
factores intrínsecos al genoma del huésped. En general el aspecto más
importante del diseño del constructo es la estructura del promotor,
que se comenta más adelante. Sin embargo, la expresión robusta re­
quiere asimismo un sitio de poliadenilación y tal vez otras considera­
ciones, como la optimación del sitio de inicio de la traducción y la
inclusión de una señal dirigida a proteínas adecuada.
El promotor transgénico define los patrones espacial y
temporal básicos de la expresión
Los experimentos de transferencia génica en líneas celulares suelen be­
neficiarse del uso de promotores constitutivos muy activos, que dan
lugar a que el transgen se exprese en forma potente y constante. Estos
promotores suelen derivarse de virus, que evolucionaron para expre­
sar sus genes en muchos tipos de células diferentes. Los elementos re­
guladores que más se utilizan en células de mamíferos comprenden el
promotor e intensificador temprano SV40, el promotor e intensifica-
dor de repetición terminal larga (RTL) del virus del sarcoma de Rous
y el promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano. Mu­
chos vectores de expresión disponibles en el comercio los incluyen.
En animales transgénicos, a menudo es deseable la expresión del
transgen en tejidos o etapas particulares del desarrollo. De igual
forma, en líneas celulares quizá sea necesario restringir la expresión
del transgen a etapas particulares del ciclo celular o encender el
transgen sólo cuando la célula se diferencia. El patrón de expresión
deseado puede lograrse mediante el enlace del transgen a un pro­
motor específico de célula o especifico de etapa apropiado. Por
ejemplo, el gen de enolasa específico de neurona sólo se expresa en
neuronas maduras. Un elemento regulador corriente arriba de 1.8 kb
de largo es suficiente para conferir la expresión del transgen específi­
co de neurona en ratones transgénicos e incrementar la expresión es­
pecífica del transgen en neuroblastos cultivados en diferenciación
(Forss-Petter y cois., 1990; Sakimura y cois., 1995).
El control máximo de la expresión del transgen tanto en líneas ce­
lulares como en animales lo ejercen promotores inducibles, que
pueden encenderse y apagarse por el control del aporte de un ligan­
do químico particular. Por lo general con este ligando se modifican
las estructuras de los factores de transcripción que estos promotores
regulan. Se utilizan varios promotores inducibles de manera natural
que incluyen el promotor de metalotioneína del ratón y el promotor
de RTL del virus del tumor mamario del ratón, ambos inducibles
mediante dexametasona (una hormona sintética). Además el promo­
tor de metalotioneína puede inducirse mediante iones de metales pe­
sados, como Zn2+. El ligando inductor puede añadirse al medio de
células cultivadas y administrarse a los animales en el agua que be­
ben. Por lo general las “fugas”, es decir, un valor de expresión de fon­
do alto, y los valores hasta cierto punto bajos de inducción
obstaculizan el uso de estos promotores endógenos. También pueden
ocurrir efectos indeseables originados por la coactivación de genes
endógenos que responden al mismo ligando y en animales transgéni­
cos es posible que las tasas de captación y eliminación del ligando en
distintos órganos sean diferenciales. Sin embargo, en fecha más re­
ciente se desarrollaron sistemas prometedores que utilizan compo­
nentes heterólogos. Por ejemplo, el operón E, coli tet es la base de la
expresión inducible regulada por tetraciclina (fig. 20-5A) que permi­
te la producción de líneas celulares transformadas muy inducibles y
de animales transgénicos (véase Saez y cois., 1997). Se diseñaron otros
sistemas basados en el operón de £ coli lac y la hormona de Drosop-
hila ecdisona. De manera alternativa la expresión inducible puede lo­
grarse mediante dimerización inducida químicamente (DIQ), en
la que un factor de transcripción funcional se ensambla a partir de
dos componentes en presencia de un ligando equivalente (Belshaw y
cois., 1996). Una desventaja de todos estos sistemas de expresión es
que la inducción ocurre a nivel de la transcripción, de manera que
puede haber un retraso importante antes que una respuesta a la in­
ducción se observe y un retraso similar entre la eliminación del estímu­
lo inductor y el regreso al estado basai. Cuando la inducción y la
descomposición rápidas son esenciales, se cuenta con sistemas indu­
cibles que actúan a nivel de las proteínas. En uno de estos sistemas el
transgen blanco se expresa como una fusión con el receptor de estro­
geno, que en condiciones normales se secuestra en un complejo inac­
tivo con Hsp90 (fig. 20-5B). En presencia de estrògeno, o su análogo
tamoxifeno, el receptor de estrògeno se libera y la proteina a la que
está fusionado puede activarse (Littlewood y cois., 1995).
Los efectos de la posición y la estructura del locus influyen
la expresión de transgenes integrados
Una observación frecuente es que los animales transgénicos deriva­
dos de manera independiente que llevan el mismo elemento trans­
génico no siempre muestran el mismo nivel o patrón de expresión
del transgen. Esto se debe a que la integración transgénica ocurre
de manera aleatoria, por lo que tanto la posición como la estructu­
ra del locus transgénico varían. Los efectos de la posición se origi­
nan por la influencia de elementos reguladores locales y la
estructura de la cromatina. Por ejemplo, el transgén puede integrar­
se cerca de un intensificador que modifica su patrón de expresión
o dentro de un dominio de heterocromatina que suprime la expre­
sión por completo. Es posible que la estructura del locus transgéni­
co también influya en la expresión. Por ejemplo, si dos copias del
transgen se disponen como una repetición invertida, entonces pue­
de generarse RNA en horquilla que conduce a interferencia del
RNA (véase sección 20.2.6). Varios otros aspectos de la estructura
del locus pueden desencadenar defensas celulares contra DNA in­
vasor y conducir a silenciamiento transgénico por metilación nue­
va del DNA. Estos fenómenos son menos evidentes en líneas
celulares transformadas porque éstas se seleccionan con base en su
capacidad para expresar con potencia un gen marcador.
 20.2 ¡ PRINCIPIOS DE LA TRANSFERENCIA GENICA | 587

A)

Células d e glándula m am aria

d e oveja d e 6 a ñ o s d e edad
Aislar oocitos ovulados

Aislar y cultivar
las células

Eliminar
crom osom as
Cultivar en m edio
sin suero

O ocito
“renucleado”

Transferir a oveja adoptiva <r

B)
Fig. 20-4. La oveja Doily fue el resultado final del primer intento exi­
toso de clonación de mamíferos a partir de células adultas.
A) estrategia experimental seguida por Wilmut y colaboradores (1997).
Los núcleos donadores se derivaron de una línea celular establecida de
células de glándula mamaria adulta. La transferencia nuclear se realizó
mediante la fusión de células somáticas individuales con oocitos nuclea-
dos con detención en metafase II. Las células donadoras se privaron de
suero antes de utilizarlas, lo que las forzó a salir del ciclo celular y entrar
en un estado de latencia que se conoce como G0 en el que sólo ocurre
una transcripción mínima. Puesto que en condiciones normales los hue­
vos se fecundan mediante espermatozoos sin actividad transcripcional
cuyos núcleos tal vez son “programados” portadores de transcripción y
otras proteínas de cromatina disponibles en el huevo, el núcleo G0 puede
representar el estado basal ideal para la reprogramación. Cabe señalar
que en otros experimentos de clonación se usaron diferentes estrategias
para introducir el núcleo donador en el huevo. Por ejemplo, en la clona­
ción de ratones adultos exitosa publicada por Wakayama y colaboradores
(1998) se recurrió a una aguja muy fina para tomar el núcleo de la célula
donadora con contaminación mínima por citoplasma de la misma. La cé­
lula donadora se microinyectó rápidamente, pero con mucha suavidad,
dentro del oocito enucleado. B) Dolly con su primera cria, Bonnie. Foto­
grafía original proporcionada por el Roslin Institute.
588 | CAPÍTULO VEINTE MANIPULACIÓN GENÉTICA DE CÉLULAS Y ANIMALES
Los efectos de la posición pueden bloquearse con
elementos reguladores que actúan de manera dominante
y elementos transgénicos grandes
Casi todos los transgenes son secuencias de cDNA controladas por
elementos reguladores cortos. Cada vez es más evidente que en tan­
to que estos elementos definen los requerimientos mínimos para la
expresión y la función génicas, no proporcionan el complemento
total de secuencias necesario para la expresión génica robusta en un
contexto genómico. Se comprobó que ciertos elementos regulado­
res actúan como interruptores maestros para establecer dominios
de cromatina abiertos y proteger los genes de la influencia de ele­
mentos reguladores y de la estructura de la cromatina en dominios
vecinos. Con frecuencia estos elementos se hallan dentro de intro-
nes y en sitios distantes. Por consiguiente es posible evitar los efec­
tos de la posición mediante la incorporación de estos elementos en
transgenes o por constructos genómicos grandes como transgenes
en lugar de cDNA mínimos.
Resulta difícil definir con precisión los elementos que estable­
cen dominios de cromatina, pero algunos, como los elementos
limítrofes, las regiones de fijación de matriz y las regiones de con­
trol del locus, suelen usarse con cierto éxito en transgenes (sec­
ción 10.5). A fin de estudiar estos efectos de largo alcance con
mayor precisión e investigar la expresión y la regulación de genes
humanos en el contexto de sus elementos reguladores de acción
cis, fue necesario establecer condiciones que permitieran trans­
ferir moléculas de DNA grandes. Los principales adelantos in­
cluyen:
► desarrollo de ratones transgénicos YAC (Lamb y Gearhart,
1995). El primer informe que se publicó describió ratones
transformados con un YAC de 670 kb que contenía el gen de
fosforribosiltransferasa de hipoxantina y guanina humano
{HPRT) (Jakobovits y cois., 1993). Esta técnica es útil para
modelar enfermedades humanas causadas por desequilibrios
de dosis a gran escala (sección 20.4.5) y tiene otras aplicacio­
nes, como la producción de anticuerpos humanos auténticos
en ratones (Méndez y cois., 1997; para un método general,
véase la fig. 20-6). Es posible producir transgénicos YAC
mediante fusión celular, microinyección o transfección con
liposomas;
► el desarrollo de ratones transcromosómicos (Tomizuka y cois.,
1997). Éstos contienen cromosomas humanos o fragmentos
cromosómicos y se generan mediante transferencia génica me­
diada por microcélulas (recuadro 8-4).
20.2.4 La transferencia génica también es útil para
producir mutaciones definidas y alterar la
expresión de genes endógenos
Hasta la fecha la tecnología de transferencia génica se consideró só­
lo desde la perspectiva de añadir funciones a célula animales. Otra
forma en la que esta tecnología puede emplearse, y tal vez sea su
mayor contribución a la investigación biomédica, es para suprimir
o alterar de manera selectiva las funciones de genes endógenos. Es­
to no sólo es un medio potente para investigar la función génica
(sección 20.3.2) sino también una vía útil para crear modelos de
enfermedades que simulan con precisión las enfermedades corres­
pondientes en humanos (sección 20.4.4). Las formas en que la
transferencia génica puede usarse para modificar la función de ge­
nes endógenos son tres:
► Envío dirigido de genes. Este método recurre a la recombina­
ción homologa para reemplazar una secuencia de un gen endó­
geno con una secuencia relacionada y por consiguiente
introduce una mutación definida en un sitio preseleccionado
del genoma. A menudo esta técnica se emplea sólo para alterar
genes con un casete insercional grande, lo que genera mutacio­
nes nulas que se conocen como k nock outs génicos. Sin em­
bargo, las estrategias modificadas permiten formas más
complicadas de manipulación genética, inclusive la introduc­
ción de mutaciones sutiles y el reemplazo de un gen con otro.
► Inhibición de la expresión génica. En este método se utiliza
la metodología de transferencia génica estándar a fin de añadir
una nueva secuencia de DNA a la célula. No obstante, en lu­
gar de codificar una proteína que confiere una nueva función
en la célula, el producto de este transgén sólo funciona para in­
hibir la expresión de un gen endógeno. Estos productos géni­
cos, que comprenden RNA antisentido, RNA de doble cadena,
RNA de interferencia pequeño, ribosomas, anticuerpos y pro­
teínas dominantemente de interferencia, también pueden in­
troducirse en forma directa en lugar de expresarse a partir de
un transgen, aunque en este caso los efectos son pasajeros en
lugar de permanentes.
► Mutagénesis insercional. En este método el transgén se integra
(de modo aleatorio) en un gen existente y suprime su función.
Como el envío dirigido de genes, esta técnica altera la función
génica al introducir una mutación, pero en este caso esta última
no es definida ni se dirige (blanco) a un sitio particular. Es po­
sible identificar mutaciones en genes específicos mediante selec­
ción a gran escala (sección 20.3.3).
20.2.5 El envío dirigido de genes permite producir
animales que portan mutaciones definidas en
todas las células
El envío dirigido de genes incluye la recomblnación
homologa in vivo entre un gen endógeno y una secuencia
de DNA exógeno contenida en un vector de envío dirigido de
genes
Las interacciones entre el DNA introducido en células animales y
el genoma del huésped suelen ocasionar la integración aleatoria del
DNA exógeno en sitios de muescas y roturas cromosómicas preexis­
tentes. Sin embargo, si el DNA exógeno semeja de cerca un gen en­
dógeno, puede ocurrir una interacción distinta en la que las
secuencias exógenas y endógenas se alinean y experimentan recom­
binación homologa. Este proceso, que se conoce como envío di­
rigido de genes, permite crear mutaciones definidas en sitios
preseleccionados en el genoma huésped. Por tanto puede conside­
rarse como una forma de mutagénesis artificial in vivo dirigida a un
sitio (en oposición a los diversos métodos de mutagénesis in vitro
dirigida a un sitio que se describen en las secciones 5.5.2, 5.5.3).
La recombinación homologa es un proceso muy raro en células
de mamíferos y ocurre con una frecuencia cercana a IO4 a 105 ve­
ces menor que la integración aleatoria. La frecuencia de la recom­
binación homologa depende tanto de la longitud de la región de
homología (la parte del vector de envío dirigido de genes que se ali­
nea con el gen endógeno) como del grado de similitud con el gen
blanco. Por tanto, la clona de DNA introducida, que se modificó
para incluir la mutación deseada, suele ser una secuencia larga que
 20.2 ! PRINCIPIOS DE LA TRANSFERENCIA GENICA 589

A)
tetR

T etraciclina o doxiciclina

"( T *R #

TetR G en b lan co G en b lan co

P tetO P tetO

-------------------------------------------------------------------- ►
B)
ER X

INACTIVO

ER-X ACTIVO

Fig. 20-5. Sistemas de expresión inducible.

A) Sistema básico de expresión inducible por tetraciclina. La expresión constitutiva del represor Tet de E. coli (TetR) inactivará cualquier transgen blanco
que contenga la secuencia del operador tetO, a la que el represor se enlaza. Sin embargo, en presencia de tetraciclina o su análogo doxiciclina, la con­
formación estructural del represor se altera y ya no puede enlazarse más al operador, lo que ocasiona que el gen se desreprima. Nótese que los efectos
de toxicidad que reflejan la expresión constitutiva de alto nivel del represor limitan el uso de este sistema en algunas células. Para resolver este problema
se desarrollaron sistemas más complicados en los que el represor Tet se convirtió en un activador (el sistema tTA) o en los que el enlace depende de la
tetraciclina en lugar de ser abolido por ella (el sistema tTA inverso). Véase Saez y cois. (1997) para una revisión de estos sistemas. B) Sistema de expresión
inducible por estrógenos. Una proteina (X) expresada como una fusión con el receptor de estrògeno (RE) suele ser inactiva porque se secuestra en un
complejo con la proteina de choque por calor 90 (Hsp90). Sin embargo, en presencia de estrògeno la proteína de fusión se libera del complejo y la
actividad de la proteina X se restablece. Éste es un sistema ventajoso porque la inducción es muy rápida y sólo requiere la disociación de un complejo
proteínico y no la transcripción seguida de síntesis de proteínas.
590 CAPÍTULO VEINTE i MANIPULACIÓN GENÉTICA DE CÉLULAS Y ANIMALES

1. A islar YAC q u e c o n tie n e n s e c u e n c ia s d e 4. C ruzar e s to s ra to n e s c o n la c e p a DI

IgH h u m an o y lo cu s d e c a d e n a IgK q u e tie n e lo cu s d e
( = ) IgH ( « ) e IgK ( t = ¡ ) e n d ó g e n o s
knocked out m ediante envío dirigido de genes
2. P erm itir q u e los YAC d e c a d a lo cu s e x p erim en ten
reco m b in ació n h o m o lo g a e n c élu la s d e levadura
p a ra g e n e ra r YAC co n in se rto s g ra n d e s yK2 x DI

■*+- -+ >

v j d c
P o r ejem plo, IgH d e YAC h u m an o d e 1 Mb
5. C ru zar yH2; DI c o n yK2; DI
3. F u sio n ar e sfe ro p la sto s d e c élu la s d e lev ad u ra
q u e c o n tie n e n IgYAC g ra n d e c o n c élu la s ME d e rató n
H acer
l
tra n sg é n ic o s

R ató n c o n tra n slo c u s Ig h u m a n o s ú n ico s

Fig. 20-6. Uso de transgenes YAC para producir un ratón con un repertorio de anticuerpos humanos.

Los YAC que contienen secuencias Ig se obtienen seleccionando genotecas de YAC con sondas de Ig apropiadas. La recuperación de YAC con insertos
comparativamente pequeños implicó la necesidad de construir en form a artificial YAC más grandes mediante recombinación homologa en células de le­
vadura. Se crearon esferoplastos mediante el tratamiento de las células de levadura de manera que la pared celular se desprenda, lo que tom a las célu­
las más accesibles a fusión celular. Véase Méndez y cois. (1997) para detalles más amplios del procedimiento para construir estos ratones.

es isogénica con el DNA genómico de la célula huésped. Aun en
este caso la frecuencia de acontecimientos genuinos de recombina­
ción homologa es muy baja y puede ser difícil identificarla contra
un fondo mensurable de integraciones aleatorias. La estrategia que
se sigue para identificar las células en que el envío dirigido de ge­
nes se efectuó depende del diseño del constructo (fig. 20-7). Hay
dos tipos de constructos:
► Los vectores de inserción, que se dirigen al locus de interés
mediante un acontecimiento aislado de recombinación recí­
proca, que causa la inserción del vector completo (fig. 20-7A).
► Los vectores de reemplazo, que están diseñados para reempla­
zar parte de la secuencia del gen cromosómico con una secuen­
cia homologa del DNA introducido (fig. 20-7B). Esto puede
ocurrir como resultado de una recombinación recíproca doble
o por conversión génica.
En ambas estrategias un segmento grande de DNA vector que con­
tiene el gen marcador neo se introduce en el locus blanco, lo que
produce una alteración y la generación de un alelo nulo (k nock out
génico). Sin embargo, esto quizá no siempre sea deseable. Si se re­
quiere una mutación más sutil pueden usarse varias técnicas de re­
combinación en dos pasos. La figura 20-8 muestra la estra tegia d e
“g o lp e a r y c o r r e r ” que se aplica a vectores de inserción y la estra ­
teg ia d e “m a rca r e in terca m b ia r” que se emplea con vectores de
reemplazo.
Es posible producir animales modificados genéticamente
mediante el envío dirigido de genes en células ME o
somáticas utilizadas como donadores para transferencia
nuclear
El envío dirigido de genes mediante recombinación homologa se lo­
gró por primera vez en células somáticas híbridas humano/ratón
cultivadas (Smithies y cois., 1985) y desde entonces se demostró en
células somáticas de diversos mamíferos. Sin embargo, la aplicación
más importante del envío dirigido de genes incluye las células ME
de ratón, que son en particular accesibles a la técnica porque expe­
rimentan recombinación homologa a una frecuencia comparativa­
mente alta (aunque mucho más baja aún que la frecuencia de
integración aleatoria). La combinación poco usual y muy benéfica
de tres características -facilidad de cultivo y transfección, propen­
sión a la recombinación homologa y pluripotencia- significa que es
muy directo usar células ME para producir ratones que contienen
la misma modificación genética en cada célula (Capecchi, 1989;
Melton, 1994). Una vez que se dispone de células ME blanco, el
método general que se sigue para obtener ratones es el mismo que
se muestra en la figura 20-3. Estos ratones se describen como “mo­
dificados genéticamente” o “de envío dirigido” en lugar de transgé­
nicos porque no siempre contienen algún DNA exógeno. De hecho
es posible producir ratones de envío dirigido que contienen una mu­
tación de punto aislada en una posición definida con antelación.
 20.2 1 PRINCIPIOS DE LA TRANSFERENCIA GÈNICA j 591

A) B)

X neo X
P un to d e m
linearización con
región ho m o lo ga P un to d e
linearización fuera
M arcador tk no inco rp o rad o d e la región

i i
m ed ian te reco m b inación ho m o lo ga ho m o lo ga

b c b j c d J--------- b d e__ f

Fig. 20-7. El envío dirigido de genes medíante recombinación homologa puede activar genes en un locus predeterminado dentro de una célula intacta.

A) M étodo de inserción de vector. El DNA vector introducido (rojo) se corta en un sitio único dentro de una secuencia casi idéntica o relacionada de
manera cercana a parte del gen endógeno blanco (azul). Puede ocurrir recombinación homologa (X) si toda la secuencia del vector (inclusive el gen
marcador neo, que confiere resistencia al antibiótico G418) se inserta dentro del locus blanco. Sin embargo, los acontecimientos de envío dirigido
genuinos serán raros y en la mayor parte de las células resistentes a G418 el vector se habrá integrado al azar. Debe utilizarse una valoración de PCR
para diferenciar entre los acontecimientos de envío dirigido de genes y de integración aleatoria, con cebadores diseñados para asociarse estratégicamente
en el vector y el gen blanco. B) M étodo de reem plazo de vector. En este caso el gen neo está contenido dentro de la secuencia homologa del gen
endógeno y el vector se corta en un sitio único fuera de la región de homología. Puede resultar una recombinación doble o un acontecimiento de
conversión génica (XX) en sustitución de secuencias internas dentro del gen blanco mediante secuencias homologas del vector, inclusive neo. Una vez
más ios acontecimientos de integración aleatoria son más frecuentes pero el método de reemplazo del vector facilita una estrategia de selección doble
más complicada en la que un segundo marcador, un marcador contraseleccionable, tk (que confiere sensibilidad al ga nciclovir), se coloca fuera de la
región de homología. El segundo marcador se incorporará en el genoma por integración aleatoria pero no por recombinación homologa. Por tanto es
probable que las células que son resistentes tanto a G418 como a ganciclovir se aborden (blanco) en forma correcta. Las letras indican el orden lineal
dentro del gen y no representan exones.

Aunque por lo general el procedimiento de envío dirigido de
genes en células somáticas tiene una eficiencia muy baja, hace po­
co tiempo se emplearon fibroblastos fetales con modificaciones por
envío dirigido como donadores para transferencia nuclear (sección
20.2.2). Esto dio lugar a la creación de una gama de mamíferos
modificados genéticamente. El informe inicial describió ovejas con
un nuevo gen introducido en el locus COL 1 A l (McCreath y cois.,
2000) y en fecha más reciente dos grupos informaron la produc­
ción de cerdos con alteraciones por envío dirigido en el gen para
o¡-l,3-galactosiltransferasa (Dai y cois., 2002; Lai y cois., 2002). Es­
ta enzima decora proteínas con grupos carbohidrato que no se en­
cuentran en primates y constituye uno de los principales factores
que originan el rechazo de órganos en trasplantes de órganos de
cerdo a humanos.
20.2.6 La recombinación específica de sitio posibilita la
inactivación génica condicional y la ingeniería
cromosómica
gido y las enzimas recombinasa proporcionarse condicionalmente
porque los genes que codifican estas enzimas pueden expresarse ba­
jo el control de promotores regulados o inducibles. A la fecha se
utiliza más el sistema de recombinación Cre/orP del bacteriófago
P l, en particular en ratones modificados genéticamente. La fun­
ción natural de la recombinasa Cre (causa recombinación) es me­
diar la recombinación entre dos secuencias loxV, que tienen 34 pb
de largo y comprenden dos repeticiones invertidas de 13 pb sepa­
radas por un espaciador central asimétrico de 8 pb (fig. 20-9). Si los
dos sitios loxP se hallan en la misma orientación, la secuencia inter­
media se corta a continuación. Cuando se encuentran en orienta­
ciones opuestas, la secuencia intermedia se invierte. Por tanto el
sistema Cre-/arP se aplica en varias formas, que comprenden inte­
gración de transgenes específica de sitio, activación e inactivación
condicional de transgenes y deleción de genes marcadores indesea­
bles. Sin embargo, las aplicaciones más importantes tal vez sean la
inactivación génica condicional y la ingeniería cromosómica, que se
comentan más adelante (véase Lobe y Nagy, 1998).

Varios bacteriófagos y también bacterias y levaduras muestran

sistemas de recombinación específica de sitio. Cada sistema com­
prende un mínimo de dos componentes: una secuencia de recono­
cimiento específica corta en la que la recombinación ocurre y una
enzima recombinasa que reconoce la secuencia y efectúa la reacción
de recombinación cuando se encuentran dos copias de la secuen­
cia. La potencia de la recombinación específica de sitio radica en
que los sitios de reconocimiento pueden modificarse con facilidad
mediante ingeniería dentro de transgenes o vectores de envío diri­
Inactivación génica condicional
Algunos genes son críticos en etapas tempranas del desarrollo y los
experimentos simples de knockout no suelen ser útiles porque la
muerte sobreviene pronto durante la etapa embrionaria. A fin de
abordar este problema se desarrollaron métodos para inactivar el
gen blanco sólo en células predeterminadas, seleccionadas, del ani­
mal o en una etapa particular del desarrollo. En consecuencia el
animal puede sobrevivir y el efecto de la mutación k nock out con-
592 CAPÍTULO VEINTE i MANIPULACIÓN GENÉTICA DE CÉLULAS Y ANIMALES
b c* d~l----- M utación
Fig. 20-8. Introducción de mutaciones sutiles mediante envío dirigido de genes.
A) En la estrategia de “ golpear y c o rre r” que se utiliza con vectores de inserción la mutación sutil se encuentra en el primer constructo blanco y la re­
combinación intracromosómica conduce a la eliminación del gen marcador y la estructura básica del vector. B) En la estrategia de “ m a rca r e in te r­
c a m b ia r" que se aplica a vectores de reemplazo se emplea un segundo constructo blanco para reemplazar la mutación introducida por el primero. El
segundo constructo incorpora un marcador contraseleccionable fuera de la región de homología para evitar la integración aleatoria.
dicional estudiarse en un tejido o tipo celular de interés. Un ejem­
plo inicial de este método lo publicaron Gu y colaboradores (1994)
e implicó el knockout condicional de polimerasa (3 de DNA, una
enzima esencial para el desarrollo embrionario. El procedimiento
de envío dirigido de genes reemplazó un exón esencial del gen en­
dógeno con un segmento gènico homólogo flanqueado por secuen­
cias loxP. Después los ratones portadores de esta mutación de envío
dirigido se aparearon con una cepa de ratones que llevaba un gen
transgénico Cre bajo control de un promotor específico de linfoci-
tos T. La descendencia de la cruza que contenía ambos transgenes
se identificó y sobrevivió hasta la vida adulta. El producto Cre só­
lo se expresó en células T y eliminó el exón esencial e inactivó el
gen (véase el método en la fig. 20-10). Una ventaja general de este
procedimiento es que pueden utilizarse ratones transgénicos Cre
una y otra vez para diferentes experimentos. Sin importar el gen en­
dógeno que es flanqueado por sitios loxP, los ratones transgénicos
Cre descritos puede emplearse para alterar ese gen en las células T.
De igual forma se generaron transgénicos Cre con muchas aplica­
ciones en los que es factible inducir la expresión Cre mediante te­
traciclina y en los que Cre se expresa de manera constitutiva como
una fusión con el receptor de estrògeno y se activa a nivel de la pro­
teina mediante tamoxifeno (sección 20.2.3; Fiel y cois., 1996).
Ingeniería cromosómica
Otro adelanto reciente importante es una estrategia de ingeniería
cromosómica en células ME que se basa en el envío dirigido de ge­
nes secuencial y la recombinación Cre-/oxP. El envío gènico dirigido
se usa para integrar sitios loxP en las localizaciones cromosómicas
deseadas y después se recurre a la expresión pasajera de la recombi-
nasa Cre para mediar un reordenamiento cromosomico selecciona­
do (Ramírez-Solís y cois., 1995; Smith y cois., 1995; fig. 20-11). Las
estrategias de ingeniería cromosómica de este tipo ofrecen la posibi­
lidad excitante de crear líneas nuevas de ratones con anormalidades
cromosómicas específicas para estudios genéticos. El envío dirigido
de genes múltiple y los pasos de selección en células ME que se uti­
lizan en los métodos de ingeniería cromosómica anteriores pueden
evitarse por medio del procedimiento nuevo de Herault y colabora­
dores (1998). Este método de recombinación meiótica por envío di­
a b c d e f
C neo j
S e g u n d a ron da
d e tran sc o lo c ac ió n
i
— la b c d e* f 1—
rigido aprovecha el pareamiento de cromosomas homólogos que
ocurre de manera natural durante la meiosis en la primera división
celular. Se diseña un transgen para que exprese recombinasa Cre
bajo control de un promotor Sycp 1 (el gen Sycp 1 codifica parte
del complejo sinaptonemal que facilita el cruzamiento). Como re­
sultado, se produce recombinasa Cre en espermatocitos del macho
durante las etapas cigotena a paquitena cuando el pareamiento
cromosomico ocurre.
20.2.7 Las estrategias transgénicas pueden usarse
para inhibir la función de genes endógenos
Si bien es indudable que el envío dirigido de genes constituye el
medio más directo y preciso para manipular la actividad génica en
células y animales transgénicos, una limitación importante radica
en que este método sólo puede aplicarse en forma rutinaria a rato­
nes y moscas de la fruta. Por consiguiente se crearon otros métodos
de inhibición génica que tienen una aplicación más general (cuadro
20-2). Estos métodos son diversos, pero se consideran en conjunto
porque todos interfieren en alguna forma con la expresión o la fun­
ción génicas sin alterar la secuencia de DNA d el gen blanco. En oca­
siones se describen como procedimientos de k nock out funcional
porque generan fenocopias del genotipo mutante correspondiente.
Es posible inhibir la expresión génica dirigiéndose a mRNA
específicos para destrucción
Puesto que el RNA es el puente entre genes y proteínas, la destruc­
ción o la inactivación selectiva de transcritos de genes específicos
ATAACTTCGTATA > GCATACAT< TATACGAAGTTAT
Fig. 20-9. Estructura de la secuencia de reconocimiento lo x R
Obsérvese que la secuencia central de 8 pb que está flanqueada por las
repeticiones invertidas de 13 pb es asimétrica y confiere orientación.
 20.2 i PRINCIPIOS DE LA TRANSFERENCIA GÉNICA i 593

A)

Envío dirigido d e R atón con locu s blanco R atón tran sg én ic o co n gen

g e n e s en células ME flan q u ead o p o r sitio s loxP Cre e n la za d o a un pro m oto r
loxP M lox P e sp ecífico d e célula, P

E xpresión d e Cre
e sp ec ífica d e tejido /célula

i S eleccio n ar célu las ME

tipo 1

lox P

Deleción específica de tejido o célula de A en el locus blanco

Fig. 20-10. El envió dirigido de genes puede usarse con el sistema de recombinación Cre-/oxP a fin de inactivar un gen en un tipo de célula deseado.
A) Ilustración de un método de recombinación homologa estándar con células ME de ratón, en las que se introducen tres sitios loxP junto con un
marcador M en un locus A blanco (por lo general un gen pequeño o un exón interno cuya eliminación podría causar una mutación de cambio de marco).
La transfección subsecuente de un gen de recombinasa Cre y la expresión pasajera de este gen dan por resultado recombinación entre los sitios loxP
introducidos para proporcionar diferentes productos. Los recombinantes tipo 1 se emplean para generar ratones en los que el locus está flanqueado por
sitios loxR Estos ratones pueden aparearse con ratones transgénicos desarrollados con anterioridad B) que llevan un constructo integrado que consiste
en el gen de recombinasa Cre enlazado a un promotor específico de tejido. La descendencia que contiene tanto el locus blanco flanqueado por loxP
como el gen Cre expresa el gen Cre en el tipo de célula deseado y la recombinación resultante entre los sitios toxP en estas células ocasiona la
inactivación del locus A blanco específica de tejido.

deben permitir producir knockouts funcionales. Varias maneras per­
miten dirigirse a mRNA específicos para inactivación y al parecer
todas incluyen la formación de una molécula de mRNA que es de
doble cadena cuando menos en parte. Ciertos genes son regulados
por RNA antisentido endógenos que se conocen como RNA tem­
porales pequeños (stRNA, véase sección 9.2.3). Al parecer éstos
actúan enlazándose al transcrito e inhibiendo el procesamiento de
mRNA o la síntesis de proteínas. Por tanto una estrategia de inhi­
bición génica inicial fue la introducción de RNA antisentido o de
oligonucleótidos antisentido en las células. Los efectos inhibido­
res pasajeros se observan después de la introducción directa de es­
tas moléculas pero es posible lograr una inhibición permanente
mediante la transformación de células, o animales, con un trans­
gen antisentido que sintetiza en forma constitutiva RNA antisen­
tido. Este hecho lo demostraron por primera vez Katsuki y colabo­
radores (1988) en ratones, quienes tuvieron éxito en la reducción
del valor de proteína básica de mielina a 20% del normal por me­
dio de la expresión de un cDNA antisentido contra el gen de pro­
teína de mielina y la producción consecuente de una fenocopia del
mutante shiverer. El RNA antisentido también suele expresarse con
el uso de un promotor inducible a fin de regular el crecimiento de
células en cultivo (Sklar y cois., 1991).
Al inicio se supuso que el efecto del RNA antisentido era es-
toiquiométrico (es decir, se requiere una molécula antisentido pa­
ra bloquear la traducción de un transcrito y después se destruyen
ambos). Por consiguiente debe ser posible una inhibición más po-
594 | CAPÍTULO VEINTE i MANIPULACIÓN GENÉTICA DE CÉLULAS Y ANIMALES

A ) 1. Uso d e envío dirigido d e genes secuencial para B) 1. U so d e l e n vío d irig id o d e g e n e s s e c u e n c ia l

introducir el sitio loxP (► ) m ás un gen m arcad or [m] ) p a ra in tro d u cir el sitio lo x P m á s un g e n m a rc a d o r
dentro d e dos localizaciones d esead as en diferentes d e n tro d e d o s lo c a liza c io n e s d e s e a d a s q u e fla n q u e a n
crom osom as la región c ro m o s ó m ic a a elim in a r ( v w )
CEN TEL
TEL = Q » M i! 12 CEN
CEN TEL ■TEL
TEL-

2. P e rm itir q u e o c u rra “re c o m b in a c ió n ”

2. E x p o n e r los c ro m o s o m a s q u e c o n tie n e n lo x P in tra c ro m o s ó m ic a en p re s e n c ia d e
a re c o m b in a s a C re re c o m b in a s a C re

CEN CEN
=►@2 = 12
X
=
TEL
CEN
■15 TEL

=W mü- ■ 12/15
+
* 1 5 /1 2 TEL TEL

Fig. 20-11. La ingeniería cromosómica puede realizarse por medio de sistemas Cre-/oxR

A) Uso de inserción dirigida de sitios loxP para facilitar una translocación cromosómica. Véase Smith y colaboradores (1995) para un ejemplo práctico.
B) Uso de la inserción dirigida de sitios loxP para permitir el modelado de una microdeleción mediante recombinación intracromosómica. Véase Ramírez-
Solís y colaboradores (1995) para un ejemplo práctico y otros ejemplos de recombinaciones intracromosómicas.

tente si la molécula inhibidora se recicla, de manera que muchos
transcritos se destruyan antes que se degrade por sí misma. Ésta
es una ventaja percibida de las ribozimas, enzimas de RNA que
segmentan catalíticamente moléculas de RNA (sección 21.6). Se
diseñaron constructos en los que se incorpora un centro catalíti­
co de ribozima dentro de un transgen antisentido para facilitar la
destrucción de transcritos específicos. Estos constructos se utili­
zan mucho en líneas celulares, en especial para estudiar la inhibi­
ción de oncogenes y combatir la infección por HIV (véase Welch
y cois., 1998), pero sólo se expresan de manera infrecuente en ra­
tones transgénicos. Un ejemplo útil es la inhibición dirigida de
glucocinasa de mRNA específicamente en células (3 pancreáticas
mediante la expresión de un transgen de ribozima de glucocinasa
antisentido controlado por el promotor de insulina, lo que crea
un modelo de diabetes (Efrat y cois., 1994). En fecha reciente se
desarrollaron ribozimas cuya actividad puede controlarse por mo­
dulación alostérica (llamadas maxizimas) y se usaron para inhibir
de modo condicional la expresión génica (Kuwabara y cois., 2000;
Famulok y Verma, 2002).
Como hecho sorprendente, al parecer en la mayor parte de los ca­
sos los constructos de ribozima no se desempeñan mejor que los
RNA antisentido correspondientes que carecen del centro catalítico
ribozima, lo que sugiere que el RNA antisentido puede tener un
efecto más potente de lo que cabría predecir sólo por el enlace estoi-
quiométrico. Un indicio respecto a la base de este fenómeno es la ca­
pacidad, en algunos casos, del RNA en sentido que se expresa en
células de mamíferos para inhibir la expresión de un gen endógeno
correspondiente, un fenómeno que se conoce como cosupresión
(Bahramian y Zabl, 1999). La cosupresión está bien documentada
en plantas y parece que incluye la formación de especies aberrantes
de RNA que son parcialmente de doble cadena. Las investigaciones de
la capacidad del RNA antisentido y el RNA en sentido para silen­
ciar genes en el nematodo C. elegans condujeron a descubrir un fe­
nómeno nuevo denominado interferencia por RNA en la que la

Cuadro 2 0 -2 . Resumen de métodos para interferir con la expresión génica endógena sin mutación del gen blanco
Interferencia a nivel del RNA Interferencia a nivel de la proteína

RNA antisentido Dominantes negativos

Oligonucleótidos antisentido Anticuerpos, intracuerpos

Ribozimas o maxizimas Aptámeros, intrámeros

Desoxirribozimas

RNA en sentido (cosupresión)

dsRNA (interferencia por RNA)

siRNA (interferencia por RNA)

 20.3 i USO DE LA TRANSFERENCIA GÉNICA PARA ESTUDIAR IA EXPRESIÓN Y LA FUNCIÓN GÉNICAS i 595
introducción simultánea de RNA en sentido y antisentido corres­
pondiente a un gen particular condujo a un silenciamiento genico po­
tente, de larga duración y muy específico (Fire y cois., 1998). La
interferencia por RNA es un mecanismo de defensa celular muy
conservado, que también se observa en células de mamíferos (los hu­
manos entre ellos). Se estimula por la presencia de RNA de doble
cadena (dsRNA) y origina la degradación de mRNA de cadena
única que tiene la misma secuencia que la molécula inductora.
El mecanismo de interferencia por RNA es complejo y com­
prende la degradación de la molécula de dsRNA en dúplex cortos,
de unos 2 1 a 2 5 p b d e largo, mediante una endonucleasa específi­
ca de dsRNA llamada Dicer (fig. 20-12). Los dúplex cortos se co­
nocen como RNA de interferencia pequeño (siRNA). Estas
moléculas se enlazan con el mRNA correspondiente y ensamblan
una endonucleasa de RNA específica de secuencia denominada
complejo silenciador inducido por RNA (CSIR) que muestra
una eficacia extraordinaria y reduce el mRNA de la mayor parte de
los genes a valores no detectables. Cabe destacar que se sabe que la
misma enzima Dicer procesa los RNA temporales pequeños antes
comentados que interfieren con la expresión de genes endógenos.
En la actualidad se identifican moléculas de RNA similares, que se
supone que tienen funciones reguladoras endógenas, en muchos
otros organismos, aun en los humanos, y se describen como micro-
RNA (mi RNA, véase sección 9.2.3). Se cree que las diferentes ac­
tividades de los micro-RNA (bloqueo de la traducción) y los RNA
de interferencia pequeños (degradación catalítica) pueden reflejar
la estructura de sus precursores y las enzimas que los procesan an­
tes de Dicer. Los micro-RNA son de cadena única y derivan de dú­
plex imperfectos que abultan y forman asas, en tanto que los
siRNA son de doble cadena y suelen derivarse de dúplex perfectos
(Pasquinelli, 2002, Voinet, 2002). Es posible que ocurra cierta in­
teracción entre estas vías (fig. 20-12).
El RNA de interferencia puede emplearse tanto en células como
en embriones porque es un fenómeno sistèmico -al parecer los siRNA
son capaces de moverse entre células de manera que el dsRNA que
se introduce en una parte del embrión puede ocasionar silencia­
miento en la totalidad del mismo—. Del mismo modo que se in­
troduce dsRNA directamente en células (mediante transfección) o
embriones (por inyección u otros métodos), es posible expresar
transgenes dobles para los RNA en sentido y antisentido o un
constructo de repetición invertida que genera RNA en horquilla
que actúa como sustratos para Dicer.
La introducción o expresión de moléculas largas de dsRNA es
adecuada para el silenciamiento gènico en la mayor parte de los
mímales, en embriones de mamíferos y en líneas celulares embrio-
- arias. Sin embargo, la respuesta de interferón, que es una res-
ruesta general (no específica de secuencia) a moléculas de dsRNA
unos 30 pb de largo, oculta los resultados de la interferencia por
RNA en células de mamíferos adultos. Este problema suele evitar­
se mediante la administración directa de siRNA sintetizados en for-
—; química o enzimàtica, o por la expresión de minitransgenes, por
: general basada en genes endógenos que producen RNA peque­
ro? p. ej., el gen U6 snRNA). Durante los tres últimos años la in-
jcrferencia por RNA emergió de una oscuridad relativa para
invertirse en el medio disponible más prometedor para el análisis
-;onal de alto rendimiento en células y animales (véase más ade-
¿z-ii , y en la actualidad promete formar la base de una nueva cla-
* completa de agentes terapéuticos (sección 21.6). Tuschl y
: --j-.i.-ct '2002) presentan una revisión general útil de la interfe-
por RNA y sus aplicaciones.
La función génica también puede bloquearse a nivel de
proteínas
Aun si un transcrito sobrevive y se traduce, es posible bloquear la
función génica a nivel de las proteínas y el resultado es una fenoco­
pia de pérdida de función. Si el producto del gen endógeno blanco
funciona como un multímero, quizá sea factible producir una ver­
sión mutante dominante negativa del gen que puede expresarse a
valores altos en la célula o en animales transgénicos. En este caso las
copias funcionales de la proteína se secuestrarán dentro de comple­
jos inactivos. Este método se aplica de manera amplia para blo­
quear funciones de receptores porque muchos de ellos funcionan
como dímeros (p. ej., Amaya y cois., 1991).
De otro modo puede ser posible expresar un anticuerpo que re­
conoce la proteína blanco y la neutraliza. La inactivación funcional
puede lograrse mediante la introducción directa de anticuerpos en
la célula o el animal, o por expresión del anticuerpo de un trans-
gén, en cuyo caso suele denominarse intracuerpo (Richardson y
Marasco, 1995). También pueden enlazarse oligonucléotidos de
DNA o RNA a proteínas e inhibir su actividad en una forma espe­
cífica. Estas se conocen como aptámeros, o si se expresan dentro
de la célula, intrámeros (Famulok y cois., 2001).
20.3 Uso de la tran sferen cia génica
para estudiar la expresión y la
función génicas
20.3.1 La expresión y la regulación génicas pueden
investigarse por medio de genes rastreadores
Uno de los primeros usos de las líneas de células transformadas y de
organismos transgénicos fue el análisis de la regulación génica,
que es la identificación de las secuencias necesarias para atributos
específicos de la expresión génica. La regulación génica puede in­
vestigarse mediante el estudio de la forma en que la deleción de di­
ferentes segmentos de DNA corriente arriba del gen, o en ocasiones
en el primer intrón, afecta su expresión. Es claro que el sistema más
apropiado para estudiar la expresión de genes humanos son las cé­
lulas de humanos, y una forma lógica de proceder es la introduc­
ción de constructos que contienen diferentes cantidades de
secuencias de DNA de flanqueo seguida del análisis de la expresión
génica. Sin embargo, esto deja el problema de la manera de seguir
la expresión del gen humano introducido en presencia de un ho­
mólogo endógeno que quizá se exprese en la misma célula. A fin de
abordar este problema las posibles secuencias reguladoras se clonan
en un vector comente arriba de un gen rastreador, un gen que pro­
duce una proteína que puede detectarse y cuantificarse con una va­
loración simple (recuadro 20-4).
La figura 20-13 muestra el método general paia mapear elemen­
tos reguladores en líneas celulares. El empleo de diferentes líneas celu­
lares, algunas de las cuales expresan el gen endógeno correspondiente,
puede aportar evidencias de elementos promotores que posibilitan la
expresión génica en líneas celulares permisivas y la impiden en líneas
celulares no permisivas. Asimismo es posible localizar elementos para
expresión génica inducible valorando diferentes constructos promoto­
res en la misma línea celular en presencia o ausencia de inducción. El
estudio de los patrones de expresión del rastreador en animales trans­
génicos permite realizar un análisis más refinado de la expresión géni­
ca específica de células ya que identifica elementos que controlan la
596 CAPÍTULO VEINTE i MANIPULACIÓN GENÉTICA DE CÉLULAS Y ANIMALES

A) B) I I II IIII II III III II III

i i i i iiI Ii j .........
iii 1
< rd e -’

Dicer Dicer i
I
5 '-p l l l l l l l O H -3' 5 ' p i n r n r 0 H "3
3 '-H 0 111: - LL P-5' siRNA
stRNA/miRNA
I

3 '-H O tt \ / m m p-5 ' te s É

i i i i 11 i i i i 11 i 11 i i i i i i i i i i i pjm An 5 ' - p T r m ^ O H -3'
3'-H O 1 1 I I LLL P -5'
mRNA 1-------y------ 1
3'UTR
Sitio co m p lem en tario i
OH-3'
..........i i i i i ..........................................
.1.11 AAA...An
Inhibición d e mRNA
trad u cc ió n
i
.................I I I I I I I I I I I ULLLLL
C o rte endon ucleolítico

Fig. 20-12. Comparación de las vías stRNA (miRNA) y siRNA en C. elegans.

Mediante el reconocimiento de tipos específicos de RNA precursores, las proteínas relacionadas com o ALG-1/ALG-2 y RDE-1 pueden influir parcialmen­
te en el procesamiento por medio de DICER. A) Se piensa que el stRNA (miRNA), que es de cadena única, forma pares de bases de manera imperfecta
con la UTR 3 ' del mRNA, lo que reprime el inicio de la traducción. B) El siRNA, que es de doble cadena y tiene un extremo saliente 3 ' de dos nucleótí-
dos, se incorpora dentro del complejo de silenciamiento inducido por RNA (CSIR). El siRNA sirve como guía para CSIR y, en el pareamiento de bases
perfecto, el mRNA blanco se corta en la parte media del dúplex formado con el siRNA. Es posible que los miRNA que se parearon en forma perfecta
con su blanco se incorporen en el CSIR. Modificado de Voinet (2000) con autorización de Elsevier Science.

expresión génica en tipos de células o etapas del desarrollo particula­
res. Sin embargo, deben obtenerse resultados similares con varias lí­
neas transgénicas derivadas de manera independiente a fin de evitar la
interpretación errónea de patrones de expresión causados por efectos
de posición (véase sección 20.2.3).
20.3.2 La función génica puede investigarse generando
mutaciones con pérdida de función y ganancia
de función, y fenocopias
Las funciones génicas no siempre se establecen mediante
la alteración o la inhibición debida a redundancia genética
Cuando es posible realizar estudios a nivel celular, la interferencia
por RNA se considera el método de elección para generar efectos de
pérdida de función (sección 20.2.6). Las funciones de varios genes
ya se establecieron mediante interferencia por RNA en cultivos de
células de mamíferos, entre ellos el gen que codifica la proteína
de selección vacuolar TsglOl, que se demostró que es esencial para
la gemación del HIV (Garrus y cois., 2001). Tuschl y Borkhardt
(2002) citan muchos otros ejemplos, inclusive el análisis de genes
que participan en la división celular, la mediación del DNA, el se­
ñalamiento de células y el paso a través de la membrana. El medio
más directo para estudiar la función de un gen en el contexto de un
organismo completo es el envío dirigido de genes (sección 20.2.4).
En muchos casos estas mutaciones son en extremo informativas y
pueden revelar muchos datos de la función génica. En la actualidad
se efectúan tantos experimentos de knockout génico en ratones, que se
establecieron bases de datos en Internet para catalogar todos los re­
sultados con base en el fenotipo (cuadro 20-3). No obstante, en un
número sorprendentemente grande de casos las mutaciones knoc­
kout parecen tener muy poco efecto fenotípico. Lo anterior puede
deberse a re d u n d an cia genética, que es la presencia de otro gen ca­
paz de desempeñar la función del gen inactivado. Como resultado,
en ocasiones se requieren knockouts de dos o aun tres genes para de­
terminar las funciones precisas de algunos genes.
Un ejemplo informativo se refiere a los genes MyoD y Myf-'j,
que se expresan temprano en el desarrollo del ratón. Los cDNA
clonados correspondientes a estos dos genes tienen una gran capa­
cidad para inducir la expresión de proteínas específicas de músculo
en muchas líneas celulares distintas. Como ambos genes codifican
factores de transcripción, al parecer son candidatos excelentes para
reguladores miogénicos. Sin embargo, resultó sorprendente que
cuando se produjeron mutaciones knockout, en ninguno de los ca­
sos se observó un fenotipo notable. Al parecer el desarrollo muscu-
 20.3 USO DE LA TRANSFERENCIA GÉNICA PARA ESTUDIAR IA EXPRESIÓN Y LA FUNCIÓN GÉNICAS I 597
Recuadro 20-4. Genes rastreadores para células animales
Los genes rastreadores codifican proteínas que pueden detectarse y
cuantificarse mediante valoraciones simples y no costosas. Es posible
emplearlos para observar y medir la eficiencia de la transferencia y la ex­
presión génicas, e investigar la localización de proteínas intracelulares.
Varios genes rastreadores se usan en animales.
El gen cat del transposón £ coli Tn9 codifica la enzima acetiltransfera-
sa de cloranfenicol, que transfiere grupos acetilo de acetil-CoA al anti­
biótico cloranfenicol. Se utiliza un formato de valoración estándar in vitro
(Gorman y cois., 1982). Se mezclan lisados celulares con cloranfenicol
marcado con 14C, se incuban y luego se separan mediante cromatografía
de capa delgada. La actividad de CAT se determina midiendo las cantida­
des relativas de cloranfenicol acetilado y sin acetilar con un contador fos-
forimager o de centelleo.
El gen lacZ de E. coli codifica la enzima galactosidasa (3, que descom­
pone lactosa y compuestos relacionados. Se dispone de varios sustratos
derivativos especializados que incluyen ONPG, que origina un producto
amarillo soluble y se usa para valoraciones colorimétricas in vitro, y X-gal,
que da lugar a un precipitado azul y se emplea en valoraciones in situ
(Hall y cois., 1983). Este gen se utiliza con mayor amplitud con X-gal co­
mo un marcador histológico para mostrar patrones de expresión génica
en animales transgénicos. El gen gusA de E. coli, que codifica la enzima
glucuronidasa (3, puede emplearse de manera similar.
El gen luc de la mosca de fuego americana (Photinus pyralis) codifica
la enzima luciferasa, que cataliza la oxidación de luciferina en una reac­
ción que requiere oxígeno, ATP y iones magnesio (de Wet y cois., 1987).
La reacción libera un destello luminoso cuya intensidad es proporcional
lar fue normal en ratones knockout MyoD y se retrasó un poco en
ratones knockoutMyf-b (Rudnicki y cois., 1992). Tiempo después se
demostró que los genes tienen funciones equivalentes y cada uno
puede compensar por completo la ausencia del otro. De hecho en
ratones normales los dos factores de transcripción reprimen mutua­
m ente los genes, de manera que el knockout de un gen ocasiona un
incremento compensador en la expresión del otro. El fenotipo me­
nor de ratones knockout m y fb refleja el inicio un poco más tempra­
no de la expresión. Los knockout dobles muestran una ausencia
catastrófica de desarrollo muscular y los ratones mutantes mueren
justo después de nacer a causa de asfixia.
Las funciones génicas pueden establecerse mediante
experimentos de ganancia de función si la dosis, la
actividad o la distribución del producto génico son críticas
Cuando las mutaciones con pérdida de función o fenocopias no
son informativas, pueden ser útiles células transformadas y anima­
les transgénicos que muestran ganancias de función que afectan el
mismo gen. Los genes MyoD y Myf-'b constituyen un caso pertinen­
te. Se sabía que estos genes codificaban reguladores importantes del
desarrollo muscular por sus efectos en células cultivadas. De igual
forma se identificaron muchos oncogenes y se les asignaron funcio­
nes con base en que pueden ocasionar la proliferación incontrola­
ble de células cultivadas. La ganancia de función puede generarse
mediante la expresión excesiva de un producto génico normal o la
expresión de una versión mutante del gen hiperactiva. En animales
transgénicos también pueden ser útiles los experimentos de ganan­
cia de función. Un ejemplo clásico se refiere al gen Sry, que se de­
mostró de manera concluyente que es un determinante mayor del
al valor de actividad de la enzima. Esto puede detectarse con un lumi-
nómetro o un contador de centelleo y la valoración es más de 100
veces más sensible que las valoraciones convencionales con CAT, ga­
lactosidasa (3 o glucuronidasa 3 . Puesto que la señal luminosa emitida
también disminuye con rapidez, la luciferasa puede ser útil para vigilar
los cambios rápidos en los valores de expresión génica. En contraste,
CAT, galactosidasa |3 y glucuronidasa (3 son proteínas muy estables, de
manera que pueden determinar con eficiencia cuándo se enciende un
gen, pero persisten después que se apaga. Los genes de luciferasa de
otros organismos tienen actividades un poco diferentes y las reaccio­
nes liberan luz a distintas longitudes de onda, lo que permite la vigilan­
cia simultánea de varios genes.
El gen glp de la medusa Aequoria victoria codifica la proteína verde
fluorescente (PVF), un marcador bioluminescente que emite una fluo­
rescencia verde brillante cuando se expone a luz azul o ultravioleta
(Ikawa y cois., 1999). La actividad de PVF se mide cuantificando la emi­
sión de luz, pero a diferencia de la luciferasa, la proteína no requiere
un sustrato y puede emplearse para valorar los procesos celulares en un
tiempo real. Las proteínas de fusión de PVF se utilizan mucho para es­
tudiar la localización de proteínas en la célula y el tránsito de proteínas
al interior de las células y entre las mismas. Una gama de variedades
de PVF es útil para el marcado doble y también se dispone de proteí­
nas fluorescentes de otros colores. Una proteína fluorescentes mutan-
te que cambia de fluorescencia verde a roja con el tiempo puede
aplicarse a la caracterización de la expresión génica temporal (Terskikh
y cois., 2000).
desarrollo masculino por su expresión en ratones transgénicos con
dos cromosomas X. Estos ratones, que la naturaleza pretende que
sean hembras, resultaron varones (Koopman y cois., 1991). Otro ti­
po de ganancia de función es la expresión ectópica, en la que un
transgén se expresa fuera de los dominios espacial o temporal nor­
males del gen endógeno correspondiente. Existen muchos ejemplos
útiles de este método que incluyen genes del desarrollo. Por ejem­
plo, los genes Hox que se expresan fuera de sus dominios normales
alteran la formación normal de patrones del embrión y generan de­
fectos en las extremidades y el esqueleto (Burke, 2000).
Los experimentos de expresión ectópica también pueden ser
útiles para demostrar redundancia genética. Por ejemplo, los genes
engrailed En-1 y En-2 del ratón son genes contenedores de homeo-
box que al parecer desempeñan funciones cruciales en la formación
del cerebro. El mutante knockout En-1 mostró anormalidades cere­
brales importantes como se esperaba, pero de manera sorprenden­
te, los knockout En-2 sólo tuvieron defectos menores. La expresión
En-1 inicia 8 a 10 h antes que la de En-2, lo que sugiere que la pro­
teina En-1 compensa la falta de En-2 en knockouts En-2. A fin de
valorar la posibilidad de redundancia funcional, Hanks y colabora­
dores (1995) emplearon una variante del procedimiento knockout
que se conoce como knock-in génico, en el que el constructo blan­
co contenía el gen En-2 dentro de una región de homología de En-1
(inclusive los elementos reguladores normales En-1). El objetivo
fue reemplazar la secuencia de codificación En-1 endógena con la de
En-2 para producir ratones con dos genes En-2, uno expresado en la
misma forma que En-1 en embriones normales (véase fig. 20-14).
Puesto que el ratón knockout En-1 resultante tuvo un fenotipo nor­
mal, se demostró que el gen En-2 knocked-in desempeñaba funcio­
nes equivalentes a las de En-1 (Hanks y cois., 1995).
598 CAPÍTULO VEINTE MANIPULACIÓN GENÉTICA DE CÉLULAS Y ANIMALES

-170
(*• +11 (A
+ ( ATG)

SR Q PO NM L K J I HG F E D C B A

A ctivida d relativa de luciferasa (%)

-211 -9
H n = 6

-1 0 5 - 9 n
— H JA 7 = 3
-2 7 9 -6 4
-------1n = 5
--E f—
-2 7 9 -1 4 4
H n =4
--O
-2 7 9 -2 0 2
-4 ] n = 4

P ro m o to r m e n o r —| n = 12

Fig. 20-13. Análisis de deleción de la región promotora del gen del factor VIII humano.
Si todos los elementos necesarios para la expresión del gen humano están presentes, habrá una expresión de alto nivel del gen rastreador cuando el
constructo se transfecta en un tipo apropiado de célula humana cultivada. A continuación puede elaborarse una serie de constructos de deleción progre­
sivos mediante enzimas de restricción o la enzima exonucleasa III de E. cotí que digiere desde el extremo 3' del DNA de doble cadena. De otro modo
puede diseñarse una serie de productos de amplificación de PCR cubriendo las regiones de interés y luego clonados en un vector de expresión apropia­
do. Las barras de la izquierda indican secuencias de tamaño variable corriente arriba del gen del factor VIII humano (F8). Los cuadros de la parte supe­
rior señalan secuencias corriente arriba que se piensa que son sitios de unión de proteínas. Los cuadros de la derecha indican el nivel de actividad de
luciferasa en relación con la secuencia Intacta, con base en n experimentos de replicación. A partir de la actividad de luciferasa observada en las dife­
rentes clonas de expresión, el mapa de deleción muestra que todos los elementos necesarios para la actividad máxima del promotor se localizan en la
región de -2 7 9 a - 6 4 , que incluye sitios de enlace de proteínas B, C y D. Reproducido de Figueiredo y Brownlee (1995) con autorización de The Ame­
rican Society for Biochemistry and Molecular Biology.

20.3.3 Los análisis de la función génica a gran escala
por mutagénesis insercional e interferencia
sistemática del RNA son partes fundamentales
de la genómica funcional
Los experimentos descritos se diseñaron para investigar la expresión
y la función génicas en forma individual. Sin embargo, como se co­
menta en el capítulo 19, la inmensa cantidad de información de se­
cuencias y la lista al parecer interminable de genes no caracterizados
que resultó de los proyectos del genoma determinan que hoy en día
sea necesario estudiar las funciones de los genes a escala de la exten­
sión d el genoma. La mutagénesis de saturación se usó para análisis
funcional durante muchos años y estos estudios se basaron en el
empleo de radiación o mutágenos químicos potentes, como la etil-
nitrosourea (ENU) y el etilmetanosulfonato (EMS), para generar
poblaciones de mutantes que representaban cada gen en el genoma.
Hasta fecha reciente era usual dirigirse a aspectos bioquímicos, fisio­
lógicos o del desarrollo específicos de la especie en investigación y la
mayor parte de los mutantes se descartaba. Sin embargo, en los úl­
timos años el cambio de enfoque de estudios de genes individuales
a la genómica funcional modificó el concepto fundamental y en la
actualidad se realizan programas de mutagénesis en toda la exten­
sión del genoma con el fin de reunir tantos mutantes que afectan
tantos procesos biológicos como sea posible. El objetivo final es en­
samblar una genoteca de mutantes amplia como un recurso central
para todos los investigadores. Por ejemplo, los primeros programas
de mutagénesis con ENU en toda la extensión del genoma en rato­
nes comprendieron la selección de una cifra pasmosa de 40 000 lí­
neas de ratones para fenotipos con importancia médica, inclusive
bioquímica clínica, alérgica, inmunológica, respuesta a estímulos fi­
siológicos, defectos del desarrollo y la conducta (Hrabe de Angelis y
Balling, 1998; Hrabe y Angelis y cois., 2000; Nolan y cois., 2000).
Estos programas se encuentran en curso y los resultados se actualizan
con regularidad en los sitios de red que se listan en el cuadro 20-3.
Los mutágenos químicos y la radiación tienden a inducir muta­
ciones de punto. Si bien éstas pueden ser “realistas” porque repre­
 20.3 j USO DE LA TRANSFERENCIA GÉNICA PARA ESTUDIAR LA EXPRESIÓN Y LA FUNCIÓN GÉNICAS
Cuadro 2 0 -3 . Recursos en Internet para transgénesis y mutagénesis de mamíferos, y trampas génicas en animales y selecciones
de RNAi a gran escala
Recurso
Ratones transgénicos y recursos de mutagénesis dirigida
Jackson Laboratory, base de datos de ratones mutantes por envío dirigido de genes
TBASE, base de datos de ratones mutantes transgénicos y por envío dirigido
de genes, conservados por el Jackson Laboratory
Base de datos de knockout génico Frontiers en Science
Base de datos de knockout del ratón BioMedNet
Recursos de mutagénesis con ENU en ratones
Mutagénesis con ENU en el proyecto de genoma humano alemán
Base de datos de mutagénesis con ENU, MRC mutabase
Recursos de trampas génicas (para ratón y Drosophila,)
German Gene Trap Consortion
Lexicon Genetics
Proyecto Berkeley del genoma de Drosophila
Recursos de interferencia por RNA en C. eiegans
Información generai
RNAi
sentan los tipos de mutaciones que causan muchas enfermedades
en humanos, un problema importante es que la identificación de
los cambios estructurales precisos en el DNA de un animal mutan-
te aislado suele requerir un método de clonación posicional labo­
rioso. La alternativa consiste en utilizar la transferencia génica
como un método de mutagénesis. En este caso el mutágeno es una
secuencia de DNA insercional, un transgen por cualquiera otro
nombre, que ocasionalmente se integra en un gen preexistente y lo
altera. Esta estrategia tiene una ventaja importante sobre la muta-
génesis por radiación y la química: deja un marcador de secuencia
en el locus que se muta. Como resultado, es posible la caracteriza­
ción molecular rápida del locus mutado (recuadro 20-5). En Dro­
sophila se utilizan elementos P como mutágenos insercionales y se
introducen de modo directo en la línea germinal (sección 20.2.2).
La células ME proveen un medio para introducir estas mutaciones
en el ratón, ya que puede emplearse la integración aleatoria de se­
cuencias de DNA a fin de recuperar inserciones en cualquier nú­
mero de genes. No obstante, como sólo alrededor de 3% del
genoma del ratón está representado por genes, la mayor parte de los
acontecimientos de inserción aleatorios no causa alteración génica.
El método de atrapamiento génico se diseñó para incrementar
la posibilidad de recuperar inserciones en genes (Evans y cois.,
1997). El principio básico es que el transgen contiene un gen ras­
treador defectuoso o un marcador seleccionable que sólo se expre­
sa si el constructo se inserta dentro de un gen. Por ejemplo, el
transgen puede comprender un gen rastreador con un sitio aceptor
de empalme corriente arriba. Si éste se integra dentro de un gen,
se comporta como un exón adicional. Cuando el gen interrumpido se
transcribe, el gen rastreador transcrito se empalma a los exones co­
rriente arriba y, cuando se traduce, debe conservar su actividad ras­
599
URL
http://jaxmice.jax.org/index.shtml
http://tbase.jax.org
http://www.bioscience.org/knockout/knochome.htm
http://biomednet.com/db/mkmd
http://www.gsf.de/ieg/groups/enu-mouse.html
http://www.mgu.har.mrc.ac.uk/mutabase
http:/tikus.gsf.de
http://www.lexgen.com/omnibank/omnibank.htm
http://www.fruitfly.0rg/p disrupt/index.html
http://www.wormbase.org
http://www.rnai.org
treadora. La ventaja de este método es que el gen rastreador se
expresa en el mismo patrón que el gen interrumpido, aun en el es­
tado heterocigoto, de modo que puede obtenerse información res­
pecto al gen (su perfil de expresión) aun si la interrupción es letal
en sí misma en el estado homocigoto. Una desventaja radica en que
la expresión del rastreador se basa en la expresión del gen interrum­
pido, por lo que si el gen no se expresa tampoco el rastreador lo
hace. Este problema se abordó mediante la expresión del gen ras­
treador a partir de su promotor (constitutivo), pero haciendo que
la poliadenilación dependa del gen circundante (véase fig. 20-15).
Tal enfoque se aplicó a gran escala y un informe reciente describe
la alteración y la identificación de secuencias de 2 000 genes en cé­
lulas madre embrionarias de ratón (Zambrowicz y cois., 1998). Se
encuentran en curso dos iniciativas importantes en ratones, una or­
ganizada por el Germán Gene Trap Consortium, cuyo fin es produ­
cir y caracterizar 20 000 líneas de genes atrapados (Wiles y cois.,
2000), y otra establecida por la compañía estadounidense Lexicón
Genetics. En ambos casos se mantienen bases de datos de secuencias
de flanqueo insertadas. Pueden consultarlas los investigadores que
deseen identificar un gen interesante en sus experimentos si desean
obtener líneas de ratones en las que ese gen se inactivo. También se
encuentra en curso un programa de atrapamiento génico en Dro-
sophila (Berkeley Drosophila Genome Project, véase Spradling y cois.,
1995, 1999), que no sólo considera la alteración génica mediada
por elemento P, sino también la activación génica mediada por ele­
mento P. El último método (marcado de activación, recuadro 20-5)
comprende el uso de elementos P que incorporan un promotor po­
tente dirigido que ve hacia afuera. Una vez integrados, estos cons-
tructos activarán cualquier gen endógeno adyacente. Esto permite
utilizar la mutagénesis insercional para generar mutaciones tanto
600 i CAPÍTULO VEINTE I MANIPULACIÓN GENÉTICA DE CÉLULAS Y ANIMALES

T ran scrip ció n

PA
n*
-j |---------i-------/ w w w \ G en En-1
's endógeno

loxP lóxP
-) neo M Z 3 -------------b-------------Û V e c to r
knock-in
E n-2

T ran scrip ció n

pA
-----------*■
loxP loxP
ÍK > C Z > 1 . _ /W v N ^ v V \

P ro m o to r
En-1

Fig. 20-14. El método knock-in génico reemplaza la actividad de un gen cromosómico por la de un gen introducido.
El gen En-1 que se muestra en la parte superior tiene dos exones y las secuencias de codificación se muestran con cuadros llenos. También se seña­
lan su sitios promotor (P) y de polladenilación (pA). El vector del gen blanco (“vector knock-in” ) contiene secuencias del gen En-1 clonado que com­
prenden una secuencia corriente arriba a que alberga el promotor En-1 y un segmento interno b que abarca el extremo 3' del exón 1, el intrón único y
la secuencia de codificación 5' del exón 2. La secuencia de codificación del gen En-2 separa estas dos secuencias. Dos casetes marcadores incluyen
un gen de cinasa de timidlna (tk) y un gen de resistencia a neomicina (neo), ambos impulsados por un promotor de cinasa de fosfoglicerato (que se
elige porque la cinasa de fosfoglicerato se expresa en células ME). El gen neo está flanqueado por secuencias loxP. El resultado del procedimiento diri­
gido al blanco es el reemplazo de las secuencias endógenas a y b pero la secuencia de codificación 5 ' del gen En-1 se elimina. El gen En-2 knocked-
in es controlado porel promotor En-1 (Hanks y cois., 1995). Nótese que el término “knock-in" también se aplica a cualquier procedimiento en el que
un gen endógeno se inactiva por inserción de un nuevo gen que después se expresa, aun si el último tiene como fin servir como un gen rastreador co­
mo iacZ.

Recuadro 20-5. Vectores complicados utilizados para mutagénesis insercional

Cualquier secuencia de DNA puede usarse como un vector de inserción y
en tanto la secuencia no se encuentre ya en el genoma huésped, emplear­
se como marcador para identificar el gen interrumpido en hibridación sim­
ple o en valoraciones basadas en reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Sin embargo, la inclusión de ciertas características adicionales
puede añadir funcionalidad a los vectores de inserción y revelar Informa­
ción adicional respecto al gen interrumpido y su producto, o inclusive ayu­
da a clonar secuencias de flanqueo que rodean el inserto.
Atrapamiento génico. El vector de inserción incluye un gen rastreador
como IacZ corriente abajo de un sitio aceptor de empalme, de manera
que el gen rastreador sólo se expresa si el vector se integra dentro de
un gen. Una variante del atrapamiento génico, también llamada atrapa­
miento de promotor, comprende un gen rastreador virgen sin un promo­
tor. Éste sólo se activa si se inserta corriente abajo de un promotor
activo (Evans y cois., 1997). En ambos casos la expresión del gen ras­
treador depende del gen interrumpido. La ventaja es que el gen rastrea­
dor (que puede aportar información funcional) simula el patrón de
expresión del gen interrumpido pero la desventaja consiste en que los
genes no expresados no tienen expresión de rastreador. Esta restricción
puede eliminarse expresando el gen rastreador de un promotor consti­
tutivo pero tornando la poliadenilación dependiente del gen interrumpi­
do (Zambrowicz y cois., 1998).
Atrapadores intensificadores. El vector de inserción incluye un gen ras­
treador como IacZ corriente abajo de un promotor mínimo (por lo general
una caja TATA) que sólo apoya la transcripción de fondo propia. Cuando
el constructo se integra dentro de la influencia de un intensifícador endó­
geno, el gen rastreador simula la expresión del gen controlado por ese ¡n-
tensificador (O’Kane y Gehring, 1987). Por la distancia larga en que los
intensificadores pueden actuar, esta estrategia rara vez es útil para iden­
tificar genes, pero los intensificadores específicos de células pueden
aprovecharse para otros propósitos, como el control de la expresión Cre
(véase sección 20.2.5) o la activación de un marcador seleccionable ne­
gativo para ablación celular (recuadro 20-2).
Marcadores de activación. El vector de inserción contiene un promotor
potente que ve hacia afuera. Si el elemento se integra adyacente a un gen,
ese gen será activado por el promotor, lo que tal vez genere un fenotipo
de ganancia de función a través de expresión tópica o excesiva (Rorth y
cois., 1998).
Rescate de plásmido. El vector de inserción contiene el origen de repli-
cación y el marcador de resistencia a antibióticos de un plásmido bacte­
riano. Esto significa que si el DNA genómico de la línea de inserción
transgénica se digiere con una enzima de restricción, se diluye y circula
por medio de ligasa de DNA, el inserto y sus secuencias de flanqueo in­
mediatas formarán un plásmido funcional. Si todo el conjunto de círculos
de DNA genómico en masa se utiliza a fin de transformar bacterias, sólo
las células que contienen el plásmido sobrevivirán. Ésta es una forma rá­
pida de clonar e identificar las secuencias génicas que rodean el sitio de
inserción (Perucho y cois., 1980).
20.4 j CREACIÓN DE MODELOS DE ENFERMEDAD MEDIANTE TRANSFERENCIA GÉNICA Y TECNOLOGÍA.. . I 601

de ganancia como de pérdida de función. El cuadro 20-3 presenta
las fuentes de Internet para todos los programas anteriores.
La interferencia por RNA (sección 20.2.6) es otro método
que puede ser útil para la anotación funcional de alto rendimien­
to. Hasta ahora este método de k n ock -dow n génico sólo se apli­
có a escala global en el nematodo C. elegans, pero mostró un gran
potencial en células de mamíferos y quizá sea el único adecuado
para la anotación rápida y directa de genes humanos, cuando
menos aquellos cuyas funciones pueden determinarse a nivel ce­
lular. Se llevaron a cabo varios experimentos a gran escala en C.
elegans que comprendieron la síntesis de miles de moléculas de
dsRNA y su administración sistemática a gusanos por microin-
yección, remojamiento o alimentación (Gonczy y cois., 2000;
Maeda y cois., 2001; Fraser y cois., 2000). En fecha más reciente se
realizó una selección heroica en la que se generaron casi 17 000
cepas bacterianas, que expresaba cada una un dsRNA diferente,
lo que representa 86% de los genes del genoma de C. elegans
(Kamath y cois., 2003). Más de 10% de esos gusanos mostró
fenocopias letales reproducibles de infertilidad, crecimiento o
desarrollo.
20.4 C reación de m odelos
de enferm edad m ediante
tran s fe re n c ia génica y tecnología
de envío dirigido de genes
Los modelos de enfermedades en humanos tienen importancia cru­
cial en la investigación médica. En particular los modelos animales
permiten realizar el examen detallado de la base fisiológica de la en­
fermedad y ofrecen un sistema de evidencias de primera línea para es­
tudiar la eficacia de tratamientos novedosos antes de efectuar pruebas
clínicas en humanos. Los cultivos celulares constituyen un recurso al­
ternativo aunque más limitado para el modelado de enfermedades,
sobre todo en términos de investigar los efectos bioquímicos de la en­
fermedad y la respuesta a fármacos. Aunque para muchos trastornos
individuales en humanos no se cuenta con un buen modelo animal,
se dispone de algunos modelos animales representativos de todas las
clases principales de afecciones en humanos: enfermedades determi­
nadas genéticamente, afecciones causadas por agentes infecciosos,
cánceres esporádicos y padecimientos autoinmunitarios (véanse Lei-

T ran scrip ció n

pA
—►
P E1 E2 E3 j íT G en d e la c é lu la h u é s p e d
__________ / V v V W S A

SD
•H I-
P r o m o to r P ro m o to r+
P o lia d e n ila c ió n + P o lia d e n ila c ió n -

In te g ra c ió n del tra n s g e n

1 y e x p re s ió n d e m R N A

E1 a, b
1. | | |[ I A A A A A A ...A /1 S e le c c ió n p o r a c tiv id a d d e l g en ra s tre a d o r

c E3 E4
2- I ... 8 |[ l A A A A A A ...A n S e le c c ió n m e d ia n te el g en m a rc a d o r

Fig. 20-15. El atrapamiento génico usa un transgen de expresión defectuosa para seleccionar acontecimientos de integración cromosómica que
ocurren dentro de un gen o cerca del mismo.
Se muestra un gen de un espécimen de célula huésped con los cuatro exones (E1 a E4) en la parte superior junto con su promotor (P) y la señal de po-
liadenilación (pA). También se muestran dos posibilidades para un vector de atrapamiento clínico. El transgen 1 incluye un gen rastreador que carece de
un promotor. Tiene dos secuencias exónicas a y b, una señal de poliadenilación (pA) y una secuencia corriente arriba que contiene una secuencia
aceptora de empalme (AE). En este ejemplo el transgen 1 se integra en el intrón 1 del gen de la célula huésped. Durante la transcripción del promotor
endógeno la secuencia aceptora de empalme ayudará a que los exones del transgén se empalmen con la secuencia del primer exón del gen endógeno,
lo que produce un transcrito de fusión. La selección se basa en que este transcrito tiene una actividad funcional rastreadora (véase Evans y cois., 1997).
El transgen 2 tiene un gen marcador (resistencia a fármacos, p. ej., /V-acetiltransferasa de puromicina) aunado a un promotor que funciona en células
madre embrionarias (ME) (casi siempre un promotor de cinasa de fosfoglicerato) y una secuencia donadora de empalme corriente abajo, pero carece
de una señal de poliadenilación. De nuevo la integración tiene como fin permitir la expresión pero en esta ocasión del promotor del transgen, y la se­
cuencia donadora de empalme ayuda a que el transcrito de RNA se empalme a exones huéspedes corriente abajo.
602 CAPÍTULO VEINTE MANIPULACIÓN GENÉTICA DE CÉLULAS Y ANIMALES

terycols., 1987; Darling y Abbott, 1992; Clarke 1994; Bedell y cois.,
1997). Algunos modelos animales de enfermedades en humanos se
originaron en forma espontánea; otros se produjeron de manera arti­
ficial por diversas vías (cuadro 20-4). hasta hace poco tiempo la ma­
yor parte de modelos de enfermedades en animales disponibles la
constituían los que surgieron de modo espontáneo o que se indujeron
en forma artificial mediante mutagénesis aleatorias. En fecha más re­
ciente las tecnologías de envío dirigido de genes y transgénicas pro­
porcionaron medios directos para obtener modelos de enfermedades
en animales y celulares, y las mutaciones dirigidas en el ratón son par­
ticularmente valiosas. Es de interés que cada vez sea más claro que los
fenotipos de enfermedad debidos a mutaciones comparables en hu­
manos y ortólogos de ratón con frecuencia muestran diferencias con­
siderables (sección 20.4.6).
20.4.1 Modelado de la patogénesis de enfermedades y
tratamiento farmacológico en cultivos de células
Muchos aspectos de la patogénesis de una enfermedad tienen un
componente celular que puede estudiarse con efectividad ex vivo.
Los ejemplos abarcan los defectos de reparación del DNA de la xe-
rodermia pigmentosa y la anemia de Fanconi, las características de
envejecimiento celular prematuro del síndrome de Werner, la desor­
ganización citoesquelética que se observa en la neurofibromatosis y,
por supuesto, la proliferación incontrolable del cáncer. Cuando estos
fenotipos están presentes, es más fácil desarrollar modelos celulares
que animales porque los defectos de ganancia de función pueden mo­
delarse mediante la simple transferencia de un transgén dominante
que causa la enfermedad dentro del tipo de célula apropiado, en tan­
to que los modelos de pérdida de función hoy día pueden desarro­
llarse con eficiencia mediante interferencia por RNA. Los modelos
celulares pueden basarse en líneas de células humanas y en muchos ca­
sos no se requiere un modelo artificial porque es posible aislar células
de individuos con la enfermedad correspondiente. Desde luego los
animales son más apropiados porque proporcionan un contexto de
organismo completo, necesario para estudiar las enfermedades sin fe­
notipo celular apreciable (p. ej., temblor esencial). Sin embargo, para
muchas enfermedades pueden utilizarse modelos celulares como una
primera línea de investigación que permite seleccionar muchos com­
puestos básico e identificar fármacos candidatos prometedores que se
estudian en modelos animales en una etapa posterior.
20.4.2 Puede ser difícil identificar modelos de
enfermedad en animales generados de manera
espontánea o inducidos por mutagénesis
aleatoria
Modelos espontáneos de enfermedad en animales
Los fenotipos humanos mutantes, en especial los que se relacionan
con síntomas de enfermedad obvios, se sujetan a un escrutinio in­
tenso: casi todos los individuos que sufren un trastorno que re­
quiere asesoría médica. Si presentan un fenotipo no descrito con
anterioridad su caso bien puede referirse a expertos que a menudo
documentarán el fenotipo en la bibliografía médica. Con base en la
motivación de los individuos afectados y sus familias, los médicos
y los investigadores médicos interesados, y el tamaño grande de la
población para selección (la población global total actual es de más
de 6 000 millones de individuos), el proceso de selección es nota­
blemente eficaz para fenotipos humanos mutantes. En contraste,
muchos fenotipos de enfermedades en animales no se registran. Só­
lo un porcentaje pequeño de la población animal es cautiva y el re­
gistro de fenotipos mutantes espontáneos depende en gran parte
del examen de colonias de animales desarrolladas con fines de in­
vestigación y, en menor grado, poblaciones de ganado y mascotas.
Sólo es probable que destaquen mutantes con anomalías externas
obvias. A pesar de la dificultad para identificar mutantes espontá­
neas en animales, varios fenotipos animales se describieron como
probables modelos de enfermedades humanas (véase cuadro 20-5
para algunos ejemplos). En algunos casos el fenotipo mutante ani­
mal es bastante similar al fenotipo clínico correspondiente, pero
otros muestran una divergencia considerable a causa de las diferen­
cias de especie en las vías bioquímicas del desarrollo (véase Erickson,
1996; Wynshaw-Boris, 1996). Además las diferencias fenotípicas
pueden dar por resultado diferentes clases de mutación en locus or­
tólogos.

Cuadro 2 0 -4 . Clases de modelos animales de enfermedad

Proceso Ejemplos Comentarios

A) Espontáneo Mutación de línea germinal -> trastorno hereditario

B) Intervención artificial o
generada artificialmente
Mutación somática -» cáncer
Apareamiento selectivo para obtener cepas
genéticamente susceptibles a enfermedad
Infectar cepas de animales con el patógeno
microbiano importante
Manipular el ambiente para inducir enfermedad sin Por ejemplo, la inyección de pristane, un aceite
causar mutación coadyuvante sintético, en la dermis de ratas produce
un modelo de artritis
Mutagénesis in vivo con un mutágeno potente como rayos X Se establecieron programas de mutagénesis química
o mutágenos químicos potentes como etilnitrosourea (ENU) grandes para producir ratones mutantes y peces
cebra (sección 20.4.2)
Modificación genética de células en huevos fecundados o Secciones 20.1 a 20.3
células de embrión temprano y apareamiento subsecuente de
animales (tecnologías transgénica y de envío dirigido de genes)
20.4 j CREACIÓN DE MODELOS DE ENFERMEDAD MEDIANTE TRANSFERENCIA GÉNICA Y TECNOLOGÍA.. . 603

Cuadro 20-5. Ejemplos de mutantes espontáneas en animales

Mutante en animales Características fenotípicas y patogénesis molecular

Ratón N0D Diabético, pero sin obesidad. Simula la diabetes mellitus dependiente de insulina humana
Ratón mdx Distrofia muscular ligada a X debida a mutaciones en el gen de distrofina del ratón.
El mutante original mdx tiene una mutación sin sentido pero el fenotipo es mucho más
leve que el de la distrofia muscular de Duchenne (DMD)
Perro hemofílico La mutación en sentido erróneo en el gen canino del factor IX causa pérdida completa de
función. El homólogo humano es la hemofilia B
Conejo hiperlipidémico hereditario de Watanabe (WHHL) Hiperlipidémico como resultado de la deleción de cuatro codones del gen de receptor de
lipoproteína de baja densidad (LDLR)\ el homólogo humano es la hipercolesterolemia
familiar
Cerdos ateroescleróticos Hipercolesterolemia notable. Actividad de receptor de LDL normal pero apolipoproteínas
variantes, inclusive apolipoproteína B
Ratón Splotch Pigmentación anormal; la superposición fenotípica con el síndrome de Waardenburg
sugiere que es un modelo animal para esta enfermedad, lo que se confirmó medíante la
identificación de mutaciones en genes homólogos humano y murino PAX
Pez damisela NF Neurofibromas extensos sugieren que pudo ser un homólogo de la neurofibromatosis
tipo 1 en humanos

Mutagénesis aleatoria por sustancias químicas y radiación una diversidad de razones, los que se relacionan más de cerca con el
hombre, los grandes monos, no son muy útiles para constituir mo­
Los métodos clásicos para producir mutantes en animales incluye­
delos de enfermedades. En su lugar, otros mamíferos, en especial los
ron exposición controlada a sustancias químicas mutágenas o a do­
ratones, se emplean con amplitud a fin de modelar enfermedades de
sis altas de rayos X. Con estos métodos se obtuvieron grandes
humanos (recuadro 20-6). En los modelos de enfermedades en ani­
cantidades de Drosophila y ratones y, como se comentó, se llevaron
males que se inducen de manera artificial por exposición a sustancias
a cabo selecciones mutágenas eficientes a gran escala tanto en rato­
químicas mutágenas o radiación, o que se originan de manera espon­
nes como en peces cebra (que ofrecen ciertas ventajas como un
tánea, no existe un control artificial, o es muy pequeño, sobre el
modelo animal; véase recuadro 20-6). Sin embargo, un problema
fenotipo resultante y a menudo la identificación de un modelo de en­
importante de las mutaciones inducidas por sustancias químicas o
fermedad en animales es casual. La gran ventaja de los modelos de
radiación es que en esencia se generan en forma aleatoria. Para
enfermedades en ratones transgénicos/envío dirigido de genes consis­
identificar un fenotipo mutante de interés es necesario realizar una
te en que pueden desarrollarse a voluntad modelos de enfermedades es­
selección laboriosa para mutantes mediante el examen cercano de
pecíficas. A condición de que se disponga de las clonas génicas
los fenotipos después de la mutagénesis. Los fenotipos mutantes
importantes, que incluyen genes mutantes en algunos casos, pueden
descritos en estos estudios, lo mismo que las mutantes espontáneas,
producirse ratones con una alteración deseada en un gen blanco se­
muestran una predisposición clara a fenotipos con anormalidades
leccionado. De esta manera es posible modelar todas las principales
externas obvias, que se atribuye a la facilidad para identificarlos. No
clases de enfermedades, trastornos hereditarios, cánceres, trastornos
obstante, el empleo de estos métodos permitió crear varios mode­
infecciosos y afecciones autoinmunitarios (cuadro 20-6; Smithies,
los importantes de enfermedades humanas.
1993; Clarke, 1994; Bedell y cois., 1997). En casi todos los casos se
recurre a métodos transgénicos/envío dirigido de genes para modelar
20.4.3 Los ratones tienen una gran utilidad como trastornos génicos únicos pero cada vez más se intenta producir
modelos animales de enfermedades humanas en modelos de ratones con enfermedades genéticas complejas, como la
gran parte porque pueden crearse mutaciones enfermedad de Alzheimer, la ateroesclerosis y los efectos de la hiper­
específicas en un locus predeterminado tensión esencial (Petters y Sommer, 2000).

Se describen fenotipos de enfermedades producidas de manera es­

pontánea y artificial en una gama amplia de especies animales con di­
ferentes potenciales para modelar enfermedades en humanos. Los
invertebrados, como Drosophila y C. elegans, y aun las células de le­
vadura, pueden proporcionar ciertos modelos de enfermedad útiles,
que reflejan la existencia de algunas proteínas y vías muy conservadas
durante toda la evolución (véase sección 3.9.2). Vertebrados distan­
tes en términos evolutivos como el pez cebra ofrecen también ciertas
ventajas como organismos modelo y se usan para modelar ciertas en­
fermedades en humanos (recuadro 20-6). Aunque cabría esperar que
los mamíferos proveyeran mejores modelos de enfermedades, por
20.4.4 Es posible modelar mutaciones con pérdida de
función mediante envío dirigido de genes y
mutaciones con ganancia de función por
expresión de genes mutantes dominantes
Modelado de mutaciones de pérdida de función en ratones
mediante envío dirigido de genes
Se piensa que muchos fenotipos de enfermedades, en esencia todos
los trastornos que se heredan en forma recesiva y muchos de heren­
604 CAPÍTULO VEINTE MANIPULACIÓN GENÉTICA DE CÉLULAS Y ANIMALES
Cuadro 20-6. Ejemplos de modelos de enfermedades humanas en ratones transgénicos o de envío dirigido de genes
Enfermedad humana o fenotipo anormal Gen
Fibrosis quística CFTR
Talasemia ß HBB (globina-ß)
Hípercolesterolemia y ateroesclerosis Genes de apolipoproteína,
por ejemplo, APOE
Enfermedad de Gaucher GBA
Síndrome de X frágil FMR1
Síndrome de Gerstmann-Sträussler- Gen de proteina prión (PRNP)
Scheinker (GSS)
Ataxia espinocerebelosa tipo 1 (AEC1) SCA1 (ataxina)
Enfermedad de Alzheimer APP (proteína precursora
de amiloide-ß)
cia dominante, se deben a pérdida de función génica. El medio más
sencillo para modelar una enfermedad por trastornos génicos úni­
cos de este tipo es preparar un ratón knockout. El primer paso con­
siste en aislar el gen ortólogo del ratón y utilizar un segmento del
mismo para knockout el gen endógeno en células ME de ratón me­
diante el envío dirigido de genes (sección 20.2.4). Después de in­
yectar las células ME modificadas genéticamente en el blastocisto
de una madre adoptiva, a fin de continuar el desarrollo, se obtienen
ratones fundadores con la mutación dirigida en una proporción
mensurable de sus células germinales. Estos ratones pueden apa­
rearse entre sí y la descendencia seleccionarse en cuanto a la presen­
cia de la mutación deseada y la existencia del alelo de tipo silvestre
por medio de valoraciones de PCR de células obtenidas de hemo­
rragias de la cola. El fenómeno de envío dirigido de genes preten­
de crear un alelo nulo (que carece por completo de expresión
génica), pero en ocasiones el resultado puede ser una m u ta ción co n
fu g a y el alelo mutante conserva cierta expresión génica. Por ejem­
plo, algunos de los productos génicos normales pueden obtenerse
mediante empalme aberrante que “brinca” el segmento de DNA in­
sertado. Esto explicaría las diferencias en la gravedad de los modelos
de ratón de fibrosis quística descritos por Snouwaert y colabo­
radores (1992), y Dorin y colaboradores (1992). Asimismo pueden
ocurrir variaciones en el fenotipo a causa de genes modificadores por
el uso de distintas cepas de ratones (véase sección 20.4.6).
Modelado de mutaciones de ganancia de función mediante
la expresión de un gen mutante dominante
Este diseño experimental general se utiliza con frecuencia aunado a
la técnica de microinyección pronuclear de transferencia génica. La
enfermedad a modelar debe ser alguna en la que la presencia de un
DNA introducido sea suficiente por sí misma para inducir patogé­
nesis y puede incluir mutaciones de ganancia de función heredita­
rias y cánceres esporádicos causados por oncogenes. Para modelar
estos trastornos es necesario clonar un gen mutante o diseñar uno
mediante mutagénesis in vitro si se requiere. Luego el gen mutante
se inserta como un transgen, por ejemplo, por microinyección en
oocitos fecundados. Como no es necesario que el gen mutante in­
troducido se integre en una localización específica, son suficientes
Método para construir el modelo
inactivación insercional mediante envío dirigido de genes
Inactivación insercional mediante envió dirigido de genes
Inactivación insercional mediante envío dirigido de genes
Inactivación insercional mediante envío dirigido de genes
Inactivación insercional mediante envío dirigido de genes
Integración del gen prión de ratón mutante
Integración del gen de ataxina humana mutante con repetición de
tripletos expandida
Integración de cDNA de APP mutante de longitud completa bajo
control de un promotor de factor de crecimiento derivado de plaquetas
genes mutantes humanos aunque en algunos casos se emplean ge­
nes mutantes de ratón. Los dos ejemplos siguientes ilustran este
método.
► Un ejemplo inicial tuvo como fin valorar si la sustitución de una
leucina que se encuentra en el codón 102 en un gen de proteí­
na prión en un paciente con síndrome de Gerstmann-Strauss-
ler-Scheinker (GSS) era patógena. Se diseñó por medios
artificiales una mutación equivalente en un gen de proteína
prión de ratón clonado y el gen mutante se inyectó después en
oocitos fecundados con objeto de producir ratones transgéni-
cos. Estos últimos mostraron neurodegeneración espontánea,
que simulaba la que se observa en el síndrome humano (Hsiao
y cois., 1990). Una variedad de otros experimentos en los que se
usaron transgenes de proteína prión han sido muy útiles para
comprender los priones (Gabizon y Taraboulos, 1997).
► Las repeticiones de tripletos expandidas que causan trastornos
neurodegenerativos (véase sección 16.6.4) constituyen otro
tipo de mutación con ganancia de función. La ataxia espino-
cerebelosa tipo 1 (AEC, en inglés SCA1) es un trastorno de
herencia dominante que resulta de la expansión inestable de una
repetición del tripleto CAG en el gen de ataxina. Se caracteriza
por degeneración de las células de Purkinje del cerebelo, las
vías espinocerebelosas y algunas neuronas del tallo encefálico.
Se produjeron ratones transgénicos mediante la introducción
de uno de dos transgenes derivados de un promotor específi­
co de células de Purkinje: el gen de ataxina humano normal
(SCA1) y un gen de ataxina mutante que contenía una repe­
tición CAG expandida. Aunque los dos tipos de transgén se
expresaron, sólo los ratones con el alelo expandido desarrolla­
ron ataxia y degeneración de células de Purkinje, lo que con­
firmó la hipótesis de ganancia de función (Burright y cois.,
1995).
Modelado de cánceres humanos en ratones
También se dedican grandes esfuerzos a construir modelos de cán­
ceres en ratones (véase Ghebranious y Donehower, 1998; Macleod
yjacks, 1999).
20.4 1 CREACIÓN DE MODELOS DE ENFERMEDAD MEDIANTE TRANSFERENCIA GÉNICA Y TECNOLOGÍA.. .
Recuadro 20-6. Potencial de animales para el modelado de enfermedades en humanos
Los primates deben proporcionar ios mejores modelos animales de enfer­
medades humanas porque se relacionan de manera muy cercana con el
hombre (véase sección 12.4.2). Los humanos y los grandes monos mues­
tran similitudes de desarrollo, anatómicas, bioquímicas y fisiológicas exten­
sas. Sin embargo, es costoso crear primates y el tamaño de las poblaciones
en cautiverio es muy pequeño. También influye la sensibilidad pública. Si
bien en principio algunos se oponen a toda experimentación en animales,
quienes piensan que se justifica en interés de la investigación médica sue­
len sentirse más cómodos con la experimentación en animales de laborato­
rio pequeños como ratones y ratas. Más importante aún, los primates no
son muy adecuados para la experimentación; tienen una vida comparativa­
mente larga y son menos fecundos que los roedores, y por consiguiente es
más difícil organizar experimentos de crianza. Con base en el rápido desa­
rrollo de métodos terapéuticos novedosos para una gama de trastornos
humanos (véase cap. 21), el retraso prolongado necesario para realizar ex­
perimentos de pruebas entre primates promovió el estudio de modelos alter­
nativos.
Los ratones son los modelos animales de enfermedad humana que más
se utilizan. Son pequeños y pueden mantenerse en colonias de crianza
hasta cierto punto baratas. Tienen un periodo de vida corto (-2 a 3
años), un tiempo de generación breve (-3 meses) y son prolíficos (una
hembra promedio producirá cuatro a seis camadas de seis a ocho
crías). Puesto que se aparean con facilidad, es posible arreglar proble­
mas de apareamiento complejos para producir cepas endogámicas re-
combinantes y cepas congénicas (Taylor, 1989; véase recuadro 14-2),
y su tiempo de generación y periodo de vida cortos significan que los
efectos de la transmisión de una mutación patógena pueden vigilarse
con cierta facilidad a través de varias generaciones. Como resultado, la
genética de un ratón de laboratorio se estudió de manera extensa duran­
te decenios y se registraron los fenotipos de muchas mutantes (Lyon y
Searle, 1989). La mayor parte de estas mutantes se originó de modo es­
pontáneo dentro de colonias de crianza. Unas cuantas también se pro­
dujeron en forma artificial, al inicio mediante mutagénesis con rayos X o
sustancias químicas pero cada vez más por mutagénesis de envío diri­
gido de genes e insercional. El mapeo con cruzamiento retrógrado inter-
especifico (Avner y cois., 1988; véase recuadro 14-2) y la disponibilidad
de numerosos marcadores polim órficos (se mapearon alrededor de
- 9 000 marcadores de repetición de dinucleótidos) facilitan el mapeo
de las mutantes de ratón. Puesto que las regiones sintónicas de los geno-
mas del ratón y humano están bien documentadas (véase fig. 12-11), es­
ta información es útil para identificar trastornos genuinamente homólogos
por gen único en el ratón y el hombre.
Las ratas son comparativamente grandes y más accesibles para expe­
rimentos fisiológicos, farmacológicos y conductuales, en especial en
estudios cardiovasculares y neuropsiquiátricos. Tienen un tiempo de ge­
neración más prolongado (11 semanas) y las colonias de crianza son
más costosas. Algunas clases de trastornos humanos (p. ej., hiperten­
sión y trastornos conductuales) no tienen buenos modelos en ratones y
por tanto se basan en modelos en ratas. Se construyeron mapas genéti­
cos y físicos densos del genoma de la rata y en fecha muy reciente se
obtuvo la secuencia del genoma (véase sección 8.4.4).
► Ganancia de función. La enfermedad se debe a la activación
inapropiada de un protooncogén y puede modelarse mediante
el desarrollo de un ratón transgénico. El oncogén apropiado se
introduce en el genoma del ratón por integración transgénica
simple.
► Pérdida de función. La enfermedad se debe a la inactivación
de un gen supresor de tumor y puede modelarse mediante la
605
El pez cebra constituye el modelo ideal del desarrollo de vertebrados ya
que se desarrolla en forma externa, tiene embriones robustos como las
ranas y un intervalo de generación similar al de los ratones pero produce
40 veces más descendencia en el mismo periodo, y los embriones son
transparentes como los de Drosophila y C. elegans. La genética del pez
cebra muestra avances: desde mediados del decenio de 1990 se efectua­
ron selecciones de mutantes a gran escala, la tecnología de transferencia
génica es rutinaria y en la actualidad se cuenta con mapas genéticos y fí­
sicos densos además de recursos de marcador de secuencia expresado
(MSE). Los genomas del pez cebra y del hombre muestran un grado mo­
derado de sintenia. Muchos de los fenotipos mutantes identificados en
selecciones genéticas del pez cebra semejan estados patológicos huma­
nos y proporcionan modelos de enfermedad útiles sobre todo en las
áreas de trastornos hemopoyéticos, enfermedades cardiovasculares y
afecciones renales. Por ejemplo, el gen sauternes es el ortólogo del pez
cebra del ALAS2 humano, que codifica sintasa de aminolevulinato 8, la
primera enzima en la biosintesis de hem. El mutante del pez cebra prove­
yó el primer modelo animal de anemia sideroblástlca congénita, que es
causada por la pérdida de función de ALAS2 (Brownlie y cois., 1998). De
forma similar el gen drácula es el ortólogo del pez cebra del FECH huma­
no, que codifica ferroquelatasa, la última enzima de la biosintesis de hem.
La mutación proporciona un modelo para la protoporfiria eritropoyética
(Childs y cois., 2000). En fecha reciente se revisaron otros modelos (Doo-
ley y Zan, 2000). Los genomas del pez cebra y humano muestran ciertas
similitudes aunque, a causa de la divergencia evolutiva considerable en­
tre humanos y peces cebra, cabe esperar que la importancia de las mu­
tantes del pez cebra para enfermedades en el hombre se limite a
trastornos que afectan vías que están muy conservadas. Se produjeron
varios mutantes de pez cebra que son buenos modelos de enfermedades
humanas y por consiguiente pueden usarse para estudiar fármacos can­
didatos, inclusive modelos de enfermedad de Alzheimer, trastornos de la
biosintesis de hem, cardiopatías congénitas, enfermedad poliquística del
riñón y cáncer.
Aunque los invertebrados y las levaduras están separados de los hu­
manos por millones de años de evolución, aún se conserva un núcleo
de genes y vías esenciales. Por consiguiente los organismos simples
como la levadura Saccharomyces cerevisiae y el nematodo Caenor-
habditis elegans constituyen modelos útiles de algunas enfermedades,
cuando menos en cuanto a que proporcionan un sistema de prueba pa­
ra fármacos, aun si no el fenotipo total no tiene importancia particular.
Por ejemplo, la vía de señalamiento de insulina está conservada por
completo entre humanos y nematodos, por lo que estos últimos pue­
den emplearse como modelos para la diabetes. De igual forma es po­
sible modelar en levaduras enfermedades que afectan funciones
celulares muy elementales (como los defectos de la helicasa del DNA
en el síndrome de Bloom). Cabe destacar que tanto la levadura como
C. elegans pueden manipularse como microorganismos y en conse­
cuencia seleccionarse en lotes con grupos de compuestos básicos y
fármacos candidatos.
creación de ratones knockout por envío dirigido de genes. Por
ejemplo, varios modelos se generaron a través de la activación
de los homólogos del ratón de los genes TP53 y RB1 pero
los fenotipos sólo muestran una similitud amplia con los feno­
tipos humanos correspondientes, el síndrome de Li-Fraumeni
y el retinoblastoma respectivamente (véase también sección
20.4.6).
606 [ CAPÍTULO VEINTE ¡ MANIPULACIÓN GENÉTICA DE CÉLULAS Y ANIMALES
20.4.5 La atención se dirige cada vez más al uso de
animales transgénicos para modelar trastornos
complejos
Modelado de trastornos cromosómicos
Se cuenta con pocos modelos de ratón de trastornos cromosómicos
humanos. En algunos casos esto se debe a la conservación insufi­
ciente de sintenia entre las dos especies. Con base en el ejemplo del
síndrome de Down (trisomla 21), el cromosoma 21 humano com­
parte una región sinténica grande con el cromosoma 16 del ratón
(véase fig. 12.11), pero los ratones con trisomía 16 no son mode­
los adecuados del síndrome de Down porque mueren in útero. De
hecho no cabría esperar que el ratón con trisomía 16 fuera un buen
modelo de trisomía 21 humana porque los dos cromosomas no son
por completo equivalentes. Los genes en las 2 a 3 Mb distales del
cromosoma 21 humano tienen ortólogos en los cromosomas 17 y
10 del ratón, y algunos genes en el cromosoma 16 del ratón tienen
ortólogos en cromosomas distintos del cromosoma 21 humano. Pa­
ra producir un modelo más adecuado de síndrome de Down en el
ratón la atención se dirigió a la región crítica del síndrome de
Down en 21q21.3-q22.2 (que se dedujo de la observación de los
fenotipos de pacientes con síndromes de Down raro con trisomía
21 parcial). Dentro de esta región, el gen del m inicerebro humano
en 21q22.2 puede ser un locus que contribuye de manera impor­
tante a los defectos de aprendizaje relacionados. Los ratones trans­
génicos en los que un YAC de 180 kb contiene el gen de
m inicerebro humano de 100 kb pero aparentemente ningún otro
gen desarrollan defectos del aprendizaje (Smith y cois., 1997). Ree-
ves y colaboradores (1995) mostraron que un ratón con trisomía 16
segmentaria, Ts65Dn, obtenida mediante los métodos estándar de
ratones radiados presentó déficit de aprendizaje y conducta. Kola y
Hertzog (1998) discuten otros modelos producidos en fecha más
reciente. Cabe esperar que los esfuerzos futuros para modelar tras­
tornos cromosómicos aprovechen el envío dirigido de genes utili­
zando Cre-ZoxP. Como se describe en la sección 20.2.5, este sistema
ofrece un gran potencial para la ingeniería del genoma y puede
usarse a fin de preparar translocaciones cromosómicas en posi­
ciones definidas o en cromosomas preseleccionados. También cabe
esperar que los YAC transgénicos sean importantes en la investiga­
ción de la expresión excesiva de genes en otros trastornos cromosó­
micos y en afecciones que se deben a dosis génicas aberrantes en
regiones grandes, como la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth
tipo 1A, causada por expresión excesiva como resultado de una
duplicación de 1.5 Mb en la región del gen PMP22 (véase fig.
16-8).
Modelado de enfermedades complejas
El enfoque en genética humana se desplaza cada vez más a la com­
prensión de la patogénesis de enfermedades genéticas complejas co­
mo ateroesclerosis, hipertensión esencial y diabetes. Estos trastornos
tienen una causa compleja con múltiples componentes genéticos y
ambientales. Aunque ya se obtuvieron ciertos modelos valiosos de
animales para algunos de estos trastornos, se espera que en el futuro
los métodos de envío dirigido de genes proporcionen modelos adi­
cionales que se requieren con urgencia (Smithies y Maeda, 1995).
En tanto se identifiquen genes adecuadamente prometedores que
participan en la patogénesis, entonces pueden utilizarse experimen­
tos de endogamia para obtener distintas combinaciones de genes de
enfermedad entre sí y puede valorarse el efecto de los diferentes
fondos genéticos en distintas cepas de ratones y de diferentes fac­
tores ambientales. Es posible que este método no sea tan atemo­
rizante como parece porque se considera cada vez más que
muchos fenotipos de enfermedades complejas se deben sobre to­
do a la combinación de unos cuantos genes de susceptibilidad
mayor. Por ejemplo, un modelo digénico de espina bífida oculta
se generó de manera casual en la descendencia obtenida de la cru­
za de un ratón heterocigoto para la mutación Patch (Pdgfrb-, recep­
tor de factor de crecimiento derivado de plaquetas) con un ratón
homocigoto para la mutación ondulada (Pax-1) (véase Helwig y
cois., 1995). En otros casos estos modelos digénicos pueden sugerir
posibles tratamientos. Por ejemplo, el cruzamiento de ratones mu­
tantes rds (que muestran degeneración retiniana) con ratones trans­
génicos que expresan Bcl-2 (que protege las células de la apoptosis)
condujo a una disminución de la degeneración de la retina (Nir y
cois., 1000).
20.4.6 Una variedad de diferencias entre el humano y
el ratón puede dificultar la construcción de
modelos de enfermedades humanas en ratones
No es raro que los modelos de enfermedad en ratones espontá­
neas o generadas de manera artificial muestren fenotipos que son
muy distintos a los trastornos humanos correspondientes. Por
ejemplo, el envío dirigido de genes para inactivar varios genes su-
presores de tumor en ratones a menudo produce modelos decep­
cionantes en ratones como en los knockout de TP53 y RB1
(retinoblastoma). Suelen presentarse problemas para lograr el
tipo de mutación deseada, por ejemplo, por la posibilidad de ex­
presión con fu ga en knockouts antes comentada, o quizá la expre­
sión de un transgen se afecte por diversos factores como los
efectos de la posición que se señalan en la sección 20.2.3 que cau­
san un fenotipo inesperado. Sin considerar estas posibilidades,
existen varias áreas en las que cabría esperar que las diferencias en­
tre ratones y humanos resultaran en fenotipos de enfermedad di­
vergentes para mutaciones en genes ortólogos (Erickson 1989,
1996: Wynshaw-Boris, 1996).
► D iferen cia s en las vías bioq u ím icas. Aunque por lo general
las vías bioquímicas en mamíferos se conservan bien, se cono­
cen algunas diferencias entre las vías de humanos y ratones. Al
parecer la retina humana depende mucho de la función preci­
sa del producto del gen RB1, pero no las retinas de otros verte­
brados. Como resultado, no se describen mutantes espontáneas
de retinoblastoma en ratones y esta afección no es una caracte­
rística de ratones knockout R bl. Sin embargo, en fecha recien­
te se demostró que R bl es necesario para el desarrollo normal
de la placenta en el ratón. Los ratones knockout muestran una
proliferación excesiva de células trofoblásticas y una alteración
importante de la arquitectura normal del laberinto placentario
que origina disminución de la vascularización y transporte pla­
centario reducido (Wu y cois., 2003). Otro ejemplo lo propor­
cionarían las vías de degradación de gangliósido. En tanto que
las mutaciones en el gen humano HEXA, que codifica hexosa-
minidasa, producen el trastorno de depósito lisosómico grave,
enfermedad de Tay-Sachs, la inactivación de Hexa ortólogo del
ratón causa la acumulación anormal de gangliósido en neuro­
nas sin los déficit de neuronas motoras o del aprendizaje que se
observan en humanos (Wynshaw-Boris, 1996).

► D iferen cia s en la s vía s d e l d esa rrollo. Las diferencias en las
vías del desarrollo de humanos y ratones no se comprenden
bien pero cabe esperar que sean importantes para algunos sis­
temas orgánicos, como el cerebro.
► T iem po absolu to. Es posible que la enorme diferencia entre los
periodos de vida promedio de ratones y humanos dificulte mu­
cho modelar en ratones ciertos trastornos del hombre en los
que la enfermedad tiene un inicio tardío.
► D iferen cia s en e l fo n d o gen ético . Esto refleja la importancia de
los genes modificadores. Casi todas las poblaciones humanas son
exogámicas. Sin embargo, las cepas de laboratorio de ratones
son muy endogámicas. Con frecuencia un fenotipo particular
puede variar de manera notable en diferentes cepas de ratones
por las diferencias en sus alelos en otros locus (genes modifica­
dores), que pueden interactuar con el locus de interés. Un
ejemplo útil de la importancia del fondo genético es el ratón
M in neoplasia intestinal múltiple,) que se generó mediante
mutagénesis de ENU y dio por resultado mutaciones en el gen
del ratón Apc. Las mutaciones en el gen humano ortólogo,
APC, causan poliposis adenomatosa del colon y cánceres coló-
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I BIBLIOGRAFÍA [ 607
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lo adecuado para estos trastornos. No obstante, el fondo gené­
tico modifica notablemente el fenotipo del ratón Min. Por
ejemplo, el número de pólipos en el colon en ratones que por­
tan APCMm depende mucho de la cepa de ratón. Se observa una
variabilidad fenotípica similar en familias humanas en las que
diferentes miembros de la misma familia pueden tener fenoti­
pos de tumor muy distintos aunque posean mutaciones idénti­
cas en el gen APC. Aunque parte de la variabilidad podría
deberse a factores ambientales, la participación de genes modi­
ficadores se sospecha con firmeza. El ratón Min proporciona un
sistema genético bien definido para mapear e identificar genes
modificadores (Dietrich y cois., 1993; MacPhee y cois., 1995).
La reciente conclusión de las secuencias del genoma del ratón y la
rata identificó varios genes humanos que al parecer no tienen co­
rrespondientes en roedores. Los ejemplos incluyen el gen seudoau-
tosómico SHO X (cuyas deficiencias sustentan el síndrome de
Leri-Weill y pueden contribuir en forma significativa al síndrome
de Turner; véase Clement-Jones y cois., 2000) y el gen del síndro­
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CAPÍTULO VEINTIUNO

Nuevas conductas para

el tratam iento de enferm edades

Contenido del capítulo

21.1 El tratam iento de una enfermedad genética y la terapéutica

genética de una afección no son lo mismo 612
21.2 Tratamiento de anormalidades genéticas 612
21.3 Uso del conocimiento genético para mejorar los tratamientos
existentes y desarrollar nuevas terapéuticas convencionales 612
21.4 Principios de la terapéutica génica 618
21.5 Métodos para insertar y expresar un gen en una célula
o tejido blanco 619
21.6 Métodos para reparar o inactivar un gen patógeno
en una célula o tejido 627
21.7 Algunos ejemplos de intentos de terapéutica génica humana 628

Recuadro 21-1 Informe del Panel de los NIH de 1995 sobre terapéutica génica
(informe Orkin-Motulsky) 621

Recuadro 1 de ética Ética de la clonación humana 616

Recuadro 2 de ética Terapéutica con línea germinal y tratamiento génico somático 619
Recuadro 3 de ética Diseño de niños 62 2
612 CAPÍTULO VEINTIUNO i NUEVAS CONDUCTAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES
2 1. 1 El tra ta m ie n to de una enferm edad
genética y la te ra p éu tic a genética
de una afección no son lo m ism o
Al llegar al final de este libro, un capítulo sobre el tratamiento de­
be considerar de forma razonable dos temas bastante diferentes:
► Tratamiento de una enfermedad genética
► Terapéutica genética de una afección
Esta última tiene a su vez varias facetas:
► Genotipificación de individuos para predecir su patrón de res­
puestas favorables y adversas a los tratamientos farmacológicos.
► Uso del conocimiento de la genética y la biología celular para
reconocer nuevos blancos para el desarrollo de fármacos.
► Empleo del conocimiento sobre genética y biología celular pa­
ra desarrollar terapéuticas basadas en células.
► Uso de técnicas genéticas para producir fármacos, vacunas y
otros agentes para el tratamiento de enfermedades.
► Empleo directo de las técnicas genéticas para el tratamiento de
la enfermedad.
Estos temas representan la mayor parte de la investigación médica
del siglo XXI. Se requerirían varios libros, escritos por grupos de ex­
pertos, para hacer justicia a esta área tan inmensa; así pues, sólo se
proporcionan revisiones muy sucintas de los primeros temas de la
lista, antes de concentrarse en el último: el uso de las técnicas ge­
néticas para el tratamiento de una enfermedad. En los recuadros de
ética se comentan de forma breve algunos asuntos éticos relevantes
suscitados por estos adelantos.
21.2 Tratam ien to de anorm alidades
genéticas
Se ha difundido de forma errónea la idea de que si una enfermedad
es genética su tratamiento es imposible. En realidad, no existe en lo
absoluto alguna conexión entre la causa y la posibilidad de tratar
una afección. Un niño profundamente sordo debe recibir los auxi­
liares para la audición o un implante coclear con base en sus sínto­
mas y la situación de la familia, sin importar si la pérdida de la
audición es genética o no. La terapéutica médica ortodoxa dirigida
a aliviar los síntomas de la anormalidad es tan aplicable a enferme­
dades genéticas como a cualquiera otra.
Sin embargo, es cierto que para muchos padecimientos genéti­
cos los tratamientos existentes no son satisfactorios. En una encues­
ta realizada hace 20 años (Costa y cois., 1983) se estimó que la
terapéutica mejoró la capacidad de reproducción sólo en 11% de
los trastornos mendelianos, la adaptación social en 6% y sólo en
15% prolongó el periodo de vida al normal (de quienes tenían una
longevidad reducida). Sin duda, las cifras serían mucho mejores en
la actualidad, pero no de manera notable.
Los errores innatos del metabolismo son el mejor subgrupo
candidato de enfermedades mendelianas para terapia convencional.
El conocimiento bioquímico detallado proporciona muchos posi­
bles puntos de ingreso para intervenir, entre ellos los siguientes:
► Limitación de sustrato. Todas las personas conocen el éxito de
los tratamientos dietéticos con la fenilcetonuria (aunque inclu­
so en pacientes tratados de modo satisfactorio, el desarrollo cog­
noscitivo es en promedio la mitad de una desviación estándar
abajo del normal). Otros errores innatos más responden igual
de bien a la terapéutica dietética.
► Restitución de un producto deficiente, como la hormona ti­
roidea para lactantes con hipotiroidismo congénito.
► Uso de vías alternativas para eliminar metabolitos tóxicos.
Los tratamientos son variables, desde la hemorragia simple co­
mo una terapéutica muy eficaz para la hemacromatosis hasta al
uso del benzoato para incrementar la excreción de nitrógeno en
pacientes con trastornos del ciclo de la urea.
► Utilización de inhibidores metabólicos, como el fármaco
NTBS que bloquea la vía de la tirosina y mejora en gran medi­
da el pronóstico de la tirosinemia tipo 1 (Lindstedt y cois.,
1992).
Treacy, Valle y Scriver comentan de forma detallada estos ejemplos
y muchos otros más y su capítulo se recomienda a los lectores inte­
resados en esta área (véase las lecturas adicionales). Aún es cierto
que a pesar de muchos trabajos, relativamente pocas anomalías ge­
néticas tienen tratamientos del todo satisfactorios y de ahí el énfa­
sis en las conductas novedosas que se describen más adelante, que
se aplican por igual a todas las enfermedades, genéticas o no.
21.3 Uso del conocim iento genético
para m ejorar los tratam ien to s
existentes y desarrollar nuevas
te ra p éu tic as convencionales
21.3.1 La farmacogenética promete incrementar la
efectividad de los medicamentos y reducir
los efectos secundarios peligrosos
Rara vez los fármacos son eficaces en la totalidad de los pacientes a
quienes se prescriben. Por ejemplo, entre las clases de medicamen­
tos indicados más a menudo:
► 15 a 35% de los individuos no reacciona a los bloqueadores be­
ta o sólo de forma inadecuada.
► 7 a 28% de los enfermos no muestra respuesta, o es inapropia­
da, a los inhibidores de la enzima conversora de angiotensina.
► 9 a 23% de los individuos responde de manera inadecuada a los
inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina.
► 20 a 50% de las personas reacciona de modo inadecuado a los
antidepresivos tricíclicos.
En algunos casos (en especial en enfermedades psiquiátricas), los
pacientes con el mismo diagnóstico clínico pueden tener en reali­
dad distintos trastornos, de los cuales sólo uno responde a un agen­
te determinado. Sin embargo, en la mayor parte de estas personas
las fluctuaciones de la respuesta dependen de diferencias en la ab­
sorción, distribución, metabolismo y eliminación de los medica­
mentos y la variabilidad de los receptores blanco.
 21.3 | USO DEL CONOCIMIENTO GENÉTICO PARA MEJORAR LOS TRATAMIENTOS EXISTENTES.
Estas variaciones individuales dependen en buena medida de
combinaciones de polimorfismos comunes en un número limitado
de genes. Comparada con los problemas de hallar factores genéti­
cos de susceptibilidad en anormalidades comunes (cap. 15), la
identificación de las variedades subyacentes de las reacciones indi­
viduales a medicamentos es un problema mucho más fácil de tra­
tar. La investigación puede enfocarse en un área definible de la
bioquímica y es factible revisar in vitro muchas hipótesis. Por con­
siguiente, parecería factible la quimérica prescripción específica para
individuos. Se utilizaría cierto tipo de equipo basado en chips en el
consultorio clínico para genotipificar al sujeto para unos cuantos
cientos de polimorfismos comunes. Los resultados determinarían
los medicamentos que serían seguros y eficaces en su caso. Los pe­
simistas aducirían que a las compañías farmacológicas no les inte­
resa asegurar que sus medicamentos sólo se indiquen en los casos
en que pueden actuar (aunque tienen un interés muy notorio en
evitar que se prescriban cuando pueden causar un efecto secunda­
rio peligroso). En promedio, cuestan unos 800 millones de dólares
y se requieren 10 a 15 años para desarrollar un compuesto desde el
indicio inicial hasta colocar el fármaco en el mercado, además de
que muchos agentes prometedores fracasan después en el proceso
por reacciones adversas en una minoría de individuos.
Se conocen algunos ejemplos de variantes genéticas que afec­
tan las reacciones a los medicamentos (cuadro 21-1). Estos efectos
pueden tener una importancia clínica real. Las dosis de isoniacida
apropiadas para acetiladores rápidos tienen el riesgo de causar una
neuropatía periférica en acetiladores lentos. Los pacientes con las
variantes R144C o I359L del gen CYP2C9 pueden sufrir anticoa­
Cuadro 21-1. Ejemplos de variaciones genéticas que afectan la respuesta a medicamentos
Véase Wolf y colaboradores (2000) para más detalles.
Enzima/proteína Variante
Transferasa de N-acetilo Acetiladores lentos
Metiltransferasa de tiopurina Actividad baja
Citocromo P-450 CYP2D6 Actividad baja (inactiva mutaciones)
Actividad ultraelevada
(amplificación génica en tándem)
Citocromo P-450 CYP2C9 Actividad baja
Citocromo P-450 CYP2C19 Actividad baja
Receptor adrenérgico (3 ADRB2 Varios PNU (aún no es claro cuáles
son Importantes)
Receptor ERBB2 Aumentado en algunos cánceres
de mama
ND, datos no disponibles.
613
gulación excesiva y hemorragia si reciben la dosis estándar de sos­
tén de warfarina. Un “metabolizador deficiente” CYP2D6 tal vez
no obtenga beneficio con analgésicos que contienen codeína, pero
si se prescribe nortriptilina quizá requiera una dosis diaria de sólo
10 a 20 mg, en tanto que un metabolizador ultrarrápido podría
necesitar 500 mg al día. Wolf y colaboradores (2000) notificaron
que en los individuos sometidos a medicamentos psiquiátricos,
que son sustratos de CYP2D6, se observan reacciones farmacoló­
gicas adversas en los enfermos con mutaciones que inactivan el gen
CYP2D6.
21.3.2 Las compañías farmacéuticas realizan grandes
inversiones en genómica para identificar nuevos
blancos farmacológicos
Se afirma que la enorme diversidad de medicamentos en el merca­
do sólo actúa hoy en día a través de unos 400 blancos. La investi­
gación genómica expandió en inmensa proporción el número de
posibles blancos disponibles para investigar por compañías farma­
céuticas; desde unos cuantos cientos hasta hace 10 años tal vez
50 000 en la actualidad. De hecho, la superabundancia de posibles
blancos es casi una perturbación para las compañías de biotecno­
logía. Puede utilizarse la interferencia por RNA (sección 20.2.6)
para identificar genes en los que un medicamento inhibidor pro­
duciría un efecto útil, antes de investigar la selección a gran esca­
la tal vez necesaria para reconocer posibles inhibidores. A largo
término se tiene la esperanza de que surjan de este esfuerzo clases
de fármacos por completo nuevos.
Frecuencia en Ejemplos de
la población fármacos afectados
60% (europea caucásica) Isoniacida, procainamida, sulfonamidas
20% (oriental)
(baja) 6-mercaptopurina, azatioprina
6% (europea caucásica) Falta de activación:
1% (oriental) codeína
2-7% (europeos caucásicos) Inactivación lenta:
fármacos psiquiátricos, como nortriptilina,
clozapina, haloperidol, imipramina, mianserina;
fármacos cardiovasculares, como propranolol.
0.2% ? Ibuprofeno, warfarina, tolbutamida
4% (europea caucásica) Mefenitoina, proguanilo
23% (oriental)
ND Reacciones variables al albuterol en asma
--- Herceptina (es eficaz sólo cuando está
aumentado ERBB2)
614 | CAPÍTULO VEINTIUNO ! NUEVAS CONDUCTAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES
También son importantes los estudios genómicos o proteómi-
cos de microorganismos patógenos como guías para el desarrollo de
nuevas vacunas o tratamientos. Los patógenos microbianos figuran
en particular en la lista de prioridades para secuenciaciones del ge-
noma (véase recuadro 8-8) y de ellos un notable estudio reciente es
el del parásito del paludismo Plasmodium falciparum (Gardner y
cols., 2002). Se analizan secuencias para identificar enzimas especí­
ficas del patógeno, no del huésped, que podrían ser blancos para
inhibidores o enzimas faltantes que tornan al parásito vulnerable a
la interferencia con el aporte de un nutrimento esencial. Las pro­
teínas de virulencia o los productos génicos que se expresan tem­
prano en una infección son blancos prometedores para fármacos.
Pueden identificarse mediante estudios de ordenamiento de expre­
sión y por comparación del contenido de genes o la expresión gé-
nica en cepas virulentas y no virulentas. Se utilizan medidas
proteómicas (como MALDI-TOF MS; véase recuadro 19-4) para
reconocer proteínas en la superficie de células patógenas que po­
drían ser blancos para vacunas.
21.3.3 Los tratamientos basados en células prometen
transformar el potencial de los trasplantes
Los tratamientos basados en células pueden considerarse como ex­
tensiones naturales de los métodos vigentes de trasplante, pero los
adelantos en el conocimiento de las células madre ofrecen la espe­
Células ME Células madre multipotentes
pluripotentes específicas de tejido
Fig. 21-1. Células madre.
Todas las células madre pueden renovarse por sí mismas y dar lugar a una progenie más diferenciada. Las células madre embrionarias (ME) pueden
producir todos los tipos de células somáticas y de la línea germinal del organismo; las células madre restringidas a tejidos tienen un potencial más
limitado. En la actualidad, existen controversias en cuanto a que las células madre restringidas a tejidos puedan transdiferenciarse en una célula característica
de un tejido diferente y en qué grado.
ranza de extender de forma radical la gama actual de opciones. En
teoría, las posibilidades son interminables -cualquier tejido u órga­
no dañado o gastado podría renovarse o crearse de nueva cuenta
con células madre apropiadas y éstas podrían someterse a cualquier
clase de manipulación genética por adelantado-. Daley (2002) pro­
porciona una valoración juiciosa de la forma en que pueden con­
cretarse estas esperanzas a mediano plazo.
Las células madre pueden definirse como células que se autorre-
nuevan y además dan lugar a una progenie diferenciada (véase sec­
ción 3.3). Es probable que se encuentren en todas las etapas del
desarrollo y todos los tejidos. Existe un gradiente de células madre
embrionarias (células ME), que tienen el potencial de producir to­
da la línea germinal y de células somáticas de un organismo, hasta
las células madre multipotenciales pero restringidas a tejidos (fig.
21-1). Desde hace muchos años se estudian las células ME de ra­
tón, pero el aislamiento de células ME humanas que efectuaron
Thomson y colaboradores en 1998 impulsó la terapéutica con cé­
lulas madre en la investigación médica y también en el debate éti­
co. Este último deriva del método de producción de las células ME,
que de modo inevitable comprende la destrucción de un embrión
humano temprano. Para conocer diversos argumentos, véase la se­
rie de cartas publicada en el New England Journal o f M edicine
(2002;346:1619-1622), que cobraron relevancia tras la revisión de
Weissman (2002). Quienes se oponen al uso de células ME suelen
sugerir que no es necesario emplearlas, dado que las células madre
Células musculares diferenciadas
Células diferenciadas del
sistema hematopoyético
Células neurales diferenciadas
Células de la línea germen
Células diferenciadas de forma
terminal
 21.3 I USO DEL CONOCIMIENTO GENÉTICO PARA MEJORAR LOS TRATAMIENTOS EXISTENTES. . . j 615

adultas restringidas a tejidos pueden funcionar igual de bien. Otros
arguyen que pocas de las líneas de células madre adultas disponi­
bles están bien caracterizadas y que su potencial de crecimiento y
diferenciación es muy limitado para que constituyan un sustituto
adecuado de las células madre embrionarias (ME).
Las líneas actuales varían de manera considerable en cuanto a la
proporción de crecimiento en cultivo y la gama de células diferen­
ciadas que pueden producir. Cabe preguntarse hasta qué grado
pueden transdiferenciarse las células madre restringidas a tejidos si
se hace migrar un tejido diferente y se adquieren las propiedades de
las células madre de dicho tejido. Existen muchas afirmaciones, pe­
ro pocas se han formulado con rigor. Como herramientas de inves­
tigación, son muy importantes las células madre de todas las clases.
Pueden permitir la identificación de los factores que controlan la
posible diferenciación y la forma de llevarla a cabo. Si eso conduce
a una capacidad de controlar y canalizar la diferenciación, podrían
emplearse células madre para una gama casi ilimitada de ingeniería
tisular y reparación de tejidos.
El uso de células madre obtenidas de un donador aún deja el
problema del rechazo del trasplante. Este inconveniente podría so­
lucionarse con el uso de la tecnología de trasplante nuclear que pro­
dujo a Dolly la oveja. Se reemplazaría el núcleo de un oocito por
otro del receptor del trasplante y células ME aisladas del blastocis-
to resultante (fig. 21-2). En teoría, sería factible utilizar estas célu­
las para producir células madre, tejidos o incluso órganos
completos para trasplante sin ningún riesgo de rechazo. Este proce­
dimiento se denomina clonación terapéutica y es el tema de una aca­
lorada controversia ética y política (véase el recuadro 1 de ética).
21.3.4 Proteínas recombinantes y vacunas
Es posible producir proteínas recombinantes mediante
clonación de expresión en microorganismos o ganado
transgénico
Muchas proteínas terapéuticas que se extraían con anterioridad de
fuentes animales o humanas pueden elaborarse como proteínas re-
combinantes mediante clonación de expresión (Russell y Clarke,
1999). En la sección 5.6 se describen las técnicas y problemas de la
clonación de expresión. La insulina humana recombinante se ex­
pendió por primera vez en 1982 y en el cuadro 21-2 se incluyen va­
rios ejemplos subsecuentes. El uso de proteínas recombinantes
evita muchos de los problemas de seguridad de los productos ex­
traídos en forma natural. Muchos hemofílicos contrajeron sida por
factor VIII humano contaminado con HIV y algunos niños murie­
ron por enfermedad de Creutzfeldt-Jakob después de inyecciones
de hormona del crecimiento extraída de glándulas hipófisis de ca­
dáveres humanos.
Las bacterias son los huéspedes más simples para clonación de
expresión. Es posible desarrollar grandes volúmenes de cultivos y
pueden definirse y controlarse los medios para evitar la contamina­
ción. Sin embargo, los polipéptidos que se producen en bacterias
no son idénticos a las proteínas humanas naturales. Casi todas las
proteínas humanas terapéuticas están glucosiladas y las bacterias no
reproducen los patrones humanos de glucosilación. Por esta razón
hay un interés creciente en los sistemas de expresión de mamíferos.
Éstos pueden ser cultivos celulares, pero una alternativa atractiva la
representan los animales transgénicos. Por ejemplo, podría fusio-

Célula somática de donador

C lo n a c ió n re p ro d u c to ra

O o c ito

B la s to c is to
C élu la s d ife re n c ia d a s
p a ra tra s p la n te

C lo n a c ió n te ra p é u tic a

Fig. 21-2. Clonaciones reproductora y terapéutica.

En ambos procedimientos se trasplanta el núcleo de una célula somática del donador a un oocito enucleado, que a continuación se estimula para desa­
rrollarse hasta la etapa de blastocisto. Para la clonación reproductora se implanta el blastocisto en un útero con la esperanza de que se desarrolle hasta
un niño. La clonación reproductora humana está prohibida en la mayor parte de los países. Para la clonación terapéutica se extraen células ME de la
masa celular interna del blastocisto, que a continuación se destruye. Las células ME se utilizan como una fuente de células donadoras clonadas o, en
potencia, de tejidos u órganos. Hay controversias sobre la clonación terapéutica humana porque incluye la destrucción de un embrión humano. El em­
brión podría ser alguno sobrante de una clínica de fecundación in vitro (FIV) o crearse de manera especial para este propósito.
616 CAPÍTULO VEINTIUNO NUEVAS CONDUCTAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES
narse un gen humano clonado con un gen de oveja, cabra o cerdo
que exprese una proteína para la leche e insertarse en la línea ger­
minal del animal. Esto lleva a la idea del pharming. Se conservarían
rebaños de animales transgénicos que producen una proteína hu­
mana deseada a un valor alto en su leche (Velander y cois., 1997).
De manera alternativa, podría inducirse que pollos transgénicos
pusieran huevos ricos en un producto deseado.
Asimismo son cada vez más comunes las plantas transgénicas.
Las plantas no replican patrones de glucosilación específicos de se­
res humanos, pero tienen muchas ventajas para clonación de expre­
sión en términos de costo y seguridad. Por ejemplo, hay un enorme
interés en producir cepas de arroz mediante ingeniería para contra­
rrestar la deficiencia de vitamina A, que es un problema de salud
pública importante cuando menos en 26 países de África, Asia y
América Latina (Ye y cois., 2000).
Anticuerpos elaborados de forma genética por ingeniería
Los reordenamientos génicos complicados de los linfocitos B (sec­
ción 10.6) proporcionan a todas las personas un repertorio enorme
de diferentes anticuerpos como un sistema de defensa contra innu­
merables antígenos extraños. Las moléculas de anticuerpo actúan
como adaptadores: tienen sitios de enlace para antígeno extraño en
el extremo variable (V) y sitios de enlace para moléculas efectoras
en el extremo constante (C). El enlace de un anticuerpo puede ser
M ■
R ecu ad ro i ck é tic a . Etica de ia clonacion humana
Los argumentos sobre la ética de la clonación humana deben diferenciar la clo­
nación reproductora de la terapéutica, incluso si la decisión final es que ambos
tipos no son éticos. Las legislaciones en muchos países han considerado
proyectos que buscan suprimir todo tipo de clonación, o bien establecer una
diferencia entre clonación reproductora (proscrita) y terapéutica (permitida).
La clonación reproductora se dirige a producir un niño clonado. Las ob­
jeciones para la clonación reproductora se basan en tres hechos: uno
práctico, uno de principios y otro mal concebido.
► El argumento práctico destaca la baja tasa de éxito de todos los ex­
perimentos de clonación de mamíferos y, por consiguiente, el hecho
de que muchos animales clonados que nacen tendrán anormalidades de
importancia, tal vez porque los procedimientos actuales no repro-
graman con seguridad las modificaciones epigenéticas de la célula
donadora (Dean y cois., 2001). Éste es un hecho simple y, desde lue­
go, cualquier intento de clonación reproductora humana en el estado
actual de conocimientos sería notablemente inmoral. Los adelantos
posteriores del conocimiento podrían eliminar esta objeción, aunque
aún no se aclara de qué forma podria saberse sin llevar a cabo los ex­
perimentos no éticos.
► El argumento de principios señala que los seres humanos deben va­
luarse por sí mismos y no tratarse como instrumentos para lograr un
propósito. Se acepta del todo este argumento, pero cabría preguntar
por qué no se aplica en la misma medida a padres ambiciosos que
deciden que su niño de tres años se convierta en un campeón de te­
nis o un violinista virtuoso.
► El argumento mal concebido considera las clonas como sólo indivi­
duales en parcial medida o tal vez no del todo humanas. Gran parte
suficiente por sí mismo para neutralizar ciertas toxinas y virus, pe­
ro más a menudo el anticuerpo enlazado desencadena al sistema de
complemento y la destrucción mediada por células.
Los anticuerpos terapéuticos que se producen de modo artifi­
cial están diseñados para ser monoespecíficos. Por tradición, éstos
eran anticuerpos m onoclonales (Acm) secretados por hibridomas,
células inmortalizadas producidas mediante la fusión de linfoci­
tos B que liberan anticuerpo de un ratón o una rata inmunizados
con células de un tumor inmortal de linfocitos B de un ratón. Los
hibridomas se propagan como clonas individuales, cada una de las
cuales puede proporcionar una fuente permanente y estable de un
Acm único. Infortunadamente, el potencial terapéutico de los Acm
que se producen en esta forma es limitado. Aunque es posible pro­
ducir Acm de roedores contra patógenos y células humanas, tienen
una vida media corta en el suero humano y pueden activar la pro­
ducción de anticuerpos humanos antirroedor. Además, sólo algu­
nas de las diferentes clases pueden estimular funciones efectoras
humanas.
Estos problemas pueden tratarse mediante ingeniería de anti­
cuerpo. Diferentes exones de los genes de inmunoglobulina codifican
distintos dominios de la molécula de anticuerpo. Por consiguiente,
el mezclado de exones a nivel del DNA permite construir anticuer­
pos con combinaciones novedosas de dominios proteínicos. Las
aplicaciones iniciales de la ingeniería de anticuerpos produjeron
anticuerpos humanizados (fig. 21-3) en los que se reemplaza una
de la ansiedad - y asimismo del ironía- sobre la clonación reproduc­
tora se debe a idear un cuadro de clonas como cierta clase de zom-
bis programables. Es muy extraño, ya que todos conocen las clonas
y saben perfectamente que son por entero humanas e individuales.
Las clonas con ingeniería serian incluso menos idénticas que los ge­
melos MZ, ya que es muy probable que el donador seria un multimi­
llonario de edad avanzada obsesionado por lograr una falsa
inmortalidad, en tanto que la clona sería 60 años más joven y nace­
ría en un ambiente por completo diferente. Para citar un ejemplo tri­
llado: incluso si alguien tuviera éxito para clonar a Hitler, no hay nada
que lleve a imaginar una clona para exterminar judíos.
Los argumentos en favor de la clonación reproductora se basan en los casos
en los que sólo hay una opción para que una pareja tenga niños -por ejem­
plo, si una mujer tuvo un trastorno mitocondrial grave podria embarazarse
con un oocito donado (que proporcionada las mitocondrias) dentro del que
se transplantó el núcleo de una de las células somáticas del compañero-.
La clonación terapéutica (fig. 21-2) comprende la producción de células
madre embrionarias en las que el núcleo procede de una célula somática de
donador. Esto se lleva a cabo para proporcionar al donador una fuente de cé­
lulas, tejidos u órganos trasplantares compatibles. En este caso, el debate
ético es más complicado. Muchas personas objetan la idea de crear un em­
brión específico para este propósito o incluso utilizar embriones sobrantes
de las clínicas de fecundación in vitro. Otras personas que se oponen se re­
fieren a una “pendiente deslizable” : sí se permite la clonación terapéutica,
quizá será imposible evitar que operadores inescrupulosos llevaran los em­
briones clonados a programas de clonación reproductora. Quienes propo­
nen lo contrario, arguyen que si la clonación terapéutica es la única forma
de curar enfermedades devastadoras seria inmoral no proceder.
 21.3 [ USO DEL CONOCIMIENTO GENÉTICO PARA MEJORAR LOS TRATAMIENTOS EXISTENTES... j 617

Cuadro 21-2. Ejemplos de productos farmacéuticos obtenidos mediante clonación de expresión

Producto Tratamiento de

Insulina Diabetes
Hormona del crecimiento Deficiencia de hormona del crecimiento
Factor VIII de coagulación sanguínea Hemofilia A
Factor IX de coagulación sanguínea Hemofilia B
Interferón a Leucemia de células piliformes; hepatitis crónica
Inferferón p Esclerosis múltiple
Interferón y Infecciones en pacientes con enfermedad granulomatosa crónica
Glucocerebrosidasa Enfermedad de Gaucher
Activador del plasminógeno tisular Trastornos trombóticos
Hormona estimulante de granulocitos y macrófagos Neutropenia consecutiva a quimioterapia
Leptina Obesidad
Eritropoyetina Anemia

parte mayor o menor del Acm del roedor por el equivalente hu­
mano. Por último, se elaboraron anticuerpos que sólo llevan las re­
giones determ inantes d e com plem entaridad (RDQ del Acm del
roedor -son las secuencias hipervariables del sitio de unión de an-
tígeno (fig. 21-3B)-. Adelantos más recientes evitaron la produc­
ción de hibridomas mediante la tecnología de exhibición de fago
(Hoogenboom y cois., 1998; sección 5.6.2). Estos sistemas permi­
ten elaborar combinaciones innovadoras de dominios de anticuer­
po. Una clase muy prometedora de derivados de anticuerpos es la
de los fragm entos variables de cadena única (Fvcu; fig. 21-3Q. És­
tos tienen casi toda la especificidad de enlace de un Acm, pero en
un polipéptido no glucosilado único que puede elaborarse a gran
escala en células bacterianas, de levadura o incluso de plantas (Stó-
ger y cois., 2000). Hudson (1999) revisó muchas de las moléculas
promisorias por ingeniería relacionadas con anticuerpos que han
comenzado a valorarse en estudios clínicos.
Los adelantos relacionados se encaminan a simular la especifi­
cidad de enlace de anticuerpos en diferentes contextos. Pueden
emplearse genes de anticuerpo con ingeniería para producir anti­
cuerpos intracelulares no secretados (intracuerpos) con el fin de
enlazar moléculas específicas dentro de una célula (Marasco,
1997). Los intracuerpos pueden ser útiles si el mero acto de enla­
ce inhibe el blanco. Ello puede ser una propiedad en extremo útil
ya que, a diferencia de las moléculas pequeñas, los intracuerpos no
se limitan a dirigirse a clases de proteínas específicas (cinasas, cana­
les de iones, etc.). Más aún, los intracuerpos pueden usarse para

P é p tid o e n la z a d o r

C)
A n tic u e rp o d e fra g m e n to
v a ria b le d e c a d e n a ú n ic a (Fvcu)

Fig. 21-3. ingeniería de anticuerpos.

A) Los anticuerpos monoclonaies (Acm) comunes son anticuerpos monoespecificos de roedores sintetizados mediante hibridomas y que se preparan
tras fusionar células B de ratones o ratas inmunizadas con células de un tumor inmortal de linfocitos B de ratón. Los seres humanos pueden producir
anticuerpos antirroedores que neutralizan a los Acm. B) Este problema puede minimizarse mediante ingeniería del Acm de tal manera que toda la mo­
lécula sea de origen humano excepto las regiones hipervariables determinantes de la complementaridad (RDC) que determinan la especificidad. C)
Fvcu son cadenas polipéptidas únicas modificadas por ingeniería. Según sea la longitud del enlazador, conectan su blanco como monómeros : .
trímeros. Los multímeros enlazan su blanco con mayor potencia que los monómeros.
618 i CAPÍTULO VEINTIUNO ¡ NUEVAS CONDUCTAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES
transportar moléculas efectoras que pueden activar funciones es­
pecíficas cuando ocurre el enlace de antígeno. Es probable que el
mejor ejemplo de lo anterior sea la fusión de la caspasa 3 a intra-
cuerpos (Tse y Rabbits, 2000). Se prepararon intracuerpos conju­
gados con caspasa 3 contra cada molécula proteínica separada de
una enfermedad acompañada de proteína de fusión como bcr-abl.
En células cancerosas, ambos intracuerpos enlazan la proteína de
fusión, lo cual hace posible que se dimerice la caspasa 3 y por con­
siguiente desencadena apoptosis selectiva de células que contienen
la proteína de fusión.
Una alternativa de los anticuerpos recombinantes es el uso de
péptidos cortos como compañeros de enlace para proteínas blanco
específicas (Hoppe-Seyler y Butz, 2000). De hecho, pueden aban­
donarse por completo las interacciones de proteina con proteína en
favor de moléculas de DNA o RNA (aptámeros). Las ventajas fun­
damentales del empleo de DNA o RNA son la capacidad para am­
plificar DNA y producir la molécula deseada a gran escala. A partir
de un fondo común grande de oligonucleótidos aleatorios, se utili­
zan rondas repetidas de selección y amplificación para aislar molécu­
las que enlazan e inhiben una proteína blanco con afinidad similar a
anticuerpos convencionales (White y cois., 2000).
Vacunas modificadas de modo genético mediante ingeniería
Puede aplicarse la tecnología de DNA recombinante a antígenos y
anticuerpos. Es posible incapacitar microorganismos patógenos
mediante modificación genética de tal manera que pueda emplear­
se con seguridad una vacuna viva atenuada. Podrían usarse plan­
tas modificadas de modo genético para producir vacunas
comestibles. Es posible llevar a cabo cambios para que un antíge­
no mejore su visibilidad para el sistema inmunitario, de tal forma
que produzca una respuesta mayor. En la actualidad se encuentran
en estudios clínicos muchas vacunas de DNA o RNA. De manera
característica, son plásmidos diseñados para expresar un antíge­
no de un patógeno o un tumor a una concentración alta después
de administrarse por inyección intramuscular (Reyes-Sandoval y
Erti, 2001).
En esta sección se proporcionó una revisión general y breve
de la muy amplia gama de aplicaciones del conocimiento y las
técnicas genéticas en investigación médica y farmacéutica; a con­
tinuación se comentan con mayor detalle las posibilidades de in­
tervenciones genéticas directas en procesos patológicos mediante
terapéutica gènica.
21.4 Principios de la terapéutica gènica
El tratamiento gènico incluye la modificación genética directa de
células del paciente para lograr un objetivo terapéutico. Hay distin­
ciones básicas en los tipos de células modificadas y la variedad de la
modificación efectuada.
► La terapéutica gènica de linea germinal produce una modifica­
ción transmisible permanente. Esto podría lograrse si se modifica­
ra un gameto, un cigoto o un embrión temprano. El tratamiento
de línea germinal se suprimió en muchos países por razones éticas
(véase el recuadro 2 de ética).
► La terapéutica gènica de células somáticas se enfoca en mo­
dificar células o tejidos específicos del paciente en una forma li­
mitada al propio enfermo. Todos los estudios clínicos y
protocolos sobre terapia gènica actuales se basan en la terapéu­
tica de célula somática.
Las células somáticas podrían modificarse en varias formas dife­
rentes (fig. 21-4).
► La suplementación gènica (llamada asimismo aumento gèni­
co) se dirige a proporcionar una copia funcional de un gen de­
fectuoso. Es posible utilizar esta modalidad para el tratamiento
de padecimientos con pérdida de función (sección 16.4) en los
que el proceso patológico resulta de la falta de función actual de
un gen. La fibrosis quística sería un candidato típico. No es ade­
cuada para padecimientos con pérdida de función en los que ya
se llevó a cabo un daño irreversible, por ejemplo a través de cier­
ta falla en el desarrollo embrionario. La terapéutica del cáncer
incluiría la suplementación gènica para incrementar la reacción
inmunitaria contra un tumor o reemplazar un gen supresor de
tumor defectuoso.
► La restitución gènica es más ambiciosa: el objetivo es reempla­
zar un gen mutante por una copia que funciona de modo co­
rrecto o corregir una mutación in situ. Se requiere el reemplazo
gènico para enfermedades con ganancia de función en las que el
gen mutante residente efectúa una función errónea.
► La inhibición dirigida de expresión gènica es en particular im­
portante en enfermedades infecciosas en las que las funciones
esenciales del patógeno son los objetivos. Puede usarse también
para silenciar oncogenes activados en el cáncer, amortiguar res­
puestas indeseables en afecciones autoinmunitarias y tal vez silen­
ciar un alelo mutante con ganancia de función en un trastorno
hereditario.
► La destrucción dirigida de células específicas es una aplica­
ción particular para el tratamiento del cáncer.
Las expectativas sobre la terapéutica gènica siguieron un curso
fluttuante durante los últimos 15 años ya que a ciclos de optimis­
mo excesivo le siguieron brotes de pesimismo desbordado. Un im­
portante informe de los US National Institutes of Health de 1995
intentó inyectar bases reales (recuadro 21-1). Desde entonces se
observó un crecimiento optimista (que sólo se alteró por la muerte
de Jesse Gelsinger) suscitado de nueva cuenta por el tratamiento
con éxito de niños con inmunodeficiencia combinada grave y ate­
nuado una vez más por las noticias de un primer niño y a continua­
ción un segundo que desarrollaron leucemia, casi con certeza como
resultado del tratamiento (más adelante se describen más detalles
de todos estos acontecimientos). Tal vez una causa de dichas reac­
ciones exageradas es la confusión sobre las escalas de tiempo natu­
rales de este trabajo. Debido a que muchas veces pueden iniciarse
pruebas diagnósticas en el transcurso de semanas tras clonarse un
gen, tal vez las personas esperan que el tratamiento no se retrase de­
masiado, en tanto que en realidad el desarrollo de un fármaco sigue
un lapso de décadas.
Desarrollar la terapéutica gènica práctica es un proceso que lle­
vará mucho tiempo; de manera adicional, informes del éxito del
 21.5 I MÉTODOS PARA INSERTARY EXPRESAR UN GEN EN UNA CÉLULA O TEJIDO BLANCO I 6 19
progreso desencadenan preocupaciones éticas centradas alrededor
de la idea de “diseñar niños” (véase el recuadro 3 de ética). No obs­
tante, muchos laboratorios académicos y comerciales trabajan ar­
duamente en esta área y se han aprobado más de 600 protocolos de
estudios clínicos relacionados con terapéutica génica. En la figura
21-5 se muestran estadísticas de la base de datos de estudios clíni­
cos conservada en www.wiley.co.ulc/genetherapy/clinical. El libro
de Templeton y Lasic (lecturas adicionales) comenta más a fondo
muchos de los temas que se exponen en el resto de este capítulo.
21.5 Métodos para insertar y expresar un
gen en una célula o tejido blanco
21.5.1 Es posible transferir genes a células receptoras
en el laboratorio (ex vivo) o dentro del cuerpo
del paciente (in vivo)
La transferencia génica ex vivo comprende la transferencia de genes
clonados al interior de células desarrolladas en cultivo. Se seleccionan
lÉ É t tH
La terapéutica génica con linea germinal supone llevar a cabo un cambio
genético que pueda transmitirse a través de las generaciones. Con toda
probabilidad, esto se haría mediante la manipulación genética de un em­
brión antes de la implantación, pero podría ocurrir como un producto ac­
cesorio de un tratamiento dirigido a células somáticas que afectó de forma
incidental las células germinales del individuo. La terapéutica con células
somáticas trata sólo ciertas células del cuerpo del sujeto sin tener efecto
alguno en la línea germinal. Por razones sólo técnicas, en la actualidad la
terapéutica con línea germinal no es una opción real e incluso habrá pro­
blemas éticos cuando se resuelvan los problemas técnicos y en muchos
países la ley prohíbe la manipulación genética de la línea germinal.
► En favor de la terapéutica de línea germinal se argumenta que resuel­
ve el problema en un solo paso y para siempre. ¿Por qué dejar en los
descendientes de la persona el riesgo de una enfermedad si podría
eliminarse también éste?
► El principal argumento contra la terapéutica de línea germinal señala
que estos tratamientos sólo son experimentales. No es posible prever
todas las consecuencias y el riesgo se reduce al mínimo al asegurar
que sus efectos se limitan al paciente tratado. Esto implicaría que una
vez que se cuente con experiencia suficiente en terapéutica somática,
será ético proceder a la terapéutica con línea germinal. Sin embargo,
por fortuna, el tratamiento inicial se lleva a cabo con el consentimien­
to informado, pero las generaciones ulteriores no tienen elección. Es­
to conduce a la responsabilidad de no imponer ideas o productos
personales en generaciones futuras de tal manera que, con base en
este argumento, la terapéutica de línea germinal nunca será ética.
El argumento en favor debe formularse contra el fondo genético de la po­
blación. Las ecuaciones que se establecen en la sección 4.5 son muy im­
portantes en este caso; además, existe un argumento práctico sólido que
señala que no se requiere la terapéutica de línea germinal.
► En padecimientos recesivos la persona afectada lleva sólo una propor­
ción muy pequeña de los genes enfermos; la gran mayoria se encuen­
tra en heterocígotos sanos. La ecuación de Hardy-Weinberg proporciona
la relación de portadores y afectados en una población como sigue:
las células que se transformaron de forma satisfactoria, se expanden
mediante cultivo celular in vitro y a continuación se restiruven al pa­
ciente. Para evitar el rechazo por el sistema inmunitario. siempre que
es posible se utilizan las células del enfermo (células autólogasy fig.
21-6). Este método se emplea en células que son accesibles para ex­
tracción inicial y que pueden inducirse para injertarse v sobrevivir
por un tiempo prolongado después de la restitución. Los ejemplos
incluyen células del sistema hemopoyético, células de la piel, etc.
La transferencia génica in vivo es la única opción en tejidos en
los que no es posible cultivar células del receptor in vitro en canti­
dades suficientes (p. ej., células cerebrales) o en los casos en que no
es posible implantar otra vez con eficiencia en los pacientes células
cultivadas. El blanco tisular es una consideración importante. El
vector de la transferencia génica puede colocarse de forma directa
dentro del tejido blanco o inyectarse en la circulación general y di­
señarse de tal manera que sólo lo capte el tipo de célula deseado.
Debido a que no existe una forma de seleccionar y amplificar célu­
las que captaron y expresaron el gen extraño, el éxito de este méto­
do depende de la eficiencia general de la transferencia y expresión
génicas.
2pq:tf, en la que q es la frecuencia del alelo de enfermedad y p = 1 -q .
Puesto que cada portador tiene una copia del alelo de enfermedad en
tanto que cada persona afectada posee dos, la proporción de alelos de
enfermedad que se encuentran en la persona afectada es 2qz/(2pq +
2q2) que se simplifica a q. Por consiguiente, para una enfermedad rece­
siva que afecta a una persona en 10 000 (qr2 = 1/10 0000, q = 0.01),
sólo 1% de los alelos de la enfermedad se halla en la persona afectada.
Evitar o no que un sujeto afectado transmita sus genes patológicos
(mediante terapéutica de línea germinal o por la opción más drástica
de la esterilización como precio del tratamiento) tiene muy poco efec­
to en la frecuencia de la afección en generaciones futuras.
► En trastornos dominantes de penetrancia completa, todos los alelos
de la enfermedad los lleva la persona afectada y para los recesivos li­
gados a X la proporción es 1/3. Pero el sueño de eliminar estas en­
fermedades de una vez y para siempre de la población fracasa debido
a las ecuaciones del recuadro 4-7, que muestran que la mayor parte
de las enfermedades dominantes o ligadas a X importantes se con­
serva en la población en gran parte por mutación recurrente.
► Una tercera objeción, y convincente, es que la terapéutica de línea germi­
nal no es necesaria. Es muy probable que las parejas candídatas tuvieran
trastornos mendelianos dominantes o recesivos (riesgo de recurrencia de
50 y 25%, respectivamente). Si estuvieran disponibles seis embriones
de fecundación in vfro (FIV) de la pareja, parecería una locura seleccionar
a los afectados y someterlos a un procedimiento incierto, en lugar de tan
sólo seleccionar el 50 o 75% de los no afectados para reimplantarios.
El argumento que señala que la terapéutica somática implica menos ries­
gos que la terapia de línea germinal parece incontrovertible. En particular,
en la terapéutica de linea germinal no podrían utilizarse los vectores no in­
tegrantes más seguros. Convence menos el argumento general de que no
es ético imponer las elecciones personales a generaciones futuras. Tal
vez sea cierto, pero en verdad esto siempre se lleva a cabo. Seria más fá­
cil considerar este argumento con seriedad si los gobiernos mostraran la
misma preocupación para no imponer un cambio de clima o sobrepobla-
ción masiva en generaciones futuras.
620 I CAPÍTULO VEINTIUNO í NUEVAS CONDUCTAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES

A)
Terapéutica de au m ento gènico
Gen X
rv /\B B - A _ rv

^ ©©©
Células enfermas Fenotipo normal
(aumento del producto gènico X)

B) C orrección dirigida de la m utación gènica

Gen X
-'"x/xBB/vrv

©©©
Células enfermas
(gen X mutante)
I Fenotipo normal
(mutación génica
□E Gen
corregido
corregida para restablecer
m el gen funcional)

C)
Inhibición dirigida de la expresión génica

m
e je
Ollgonucleótido
antisentldo, siRNA, ▼ ,' '•
ribozima, Células enfermas / 'w r-A A A A ( ) ( ) ( )
etc. que contienen el gen Inhibición — -o -
mutante o 'f ' Bloqueo de la
perjudicial m NI IC expresión del gen
I ■ I patógeno

D)
Destrucción directa d e células enferm as
Toxina génica

Células enfermas Células destruidas por toxina expresada

Gen profármaco
AA^AA.

“* • © © © ^ O o o
Células enfermas Células destruidas
Fármaco por el fárm aco

Fig. 21-4. Procedimientos de terapéutica génica.

Véase el texto para más detalles. siRNA, RNA pequeño de Interferencia, véase sección 21.6.
 21.5 | MÉTODOS PARA INSERTARY EXPRESAR UN GEN EN UNA CÉLULA O TEJIDO BLANCO j 621
21.5.2 Pueden diseñarse vectores para integrarse
en los cromosomas de la célula huésped o
permanecer como episomas
Para lograr la expresión génica por tiempo prolongado, sería acon­
sejable al parecer integrar el gen extraño dentro de un cromosoma
de la célula huésped -de preferencia una célula madre-. A conti­
nuación se replica el vector siempre que se divide la célula hués­
ped o sus hijas. Sin embargo, la integración conlleva ciertos
problemas y riesgos. La integración de la mayor parte de los vec­
tores ocurre en sitios aleatorios y es diferente en distintas células
del individuo. El ambiente cromosómico local puede tener efectos
impredecibles en la expresión del vector -tal vez nunca se exprese,
lo haga a un nivel indeseablemente bajo o se exprese por un tiempo
corto y a continuación se silencie de modo irreversible—. Peor aún,
la integración puede alterar la expresión de genes endógenos. El
punto de inserción podría ocurrir en la secuencia de un gen endó­
geno, que conduciría a la inactivación insercional de dicho gen. La
mayor preocupación es que la inserción de un vector muy expresa­
do puede activar a un oncogen adyacente, algo similar a la activa­
ción de M YC en el linfoma de Burkitt (fig. 17-4S); en realidad,
esto es lo que al parecer sucedió en dos de los niños tratados con
éxito de inmunodeficiencia combinada grave (Check, 2002,
2003). En apariencia, cuando menos en una de las 10 células T
modificadas en cada uno de los dos niños, una inserción retroviral
aleatoria activó al oncogén LM02. Poco tiempo después del trata­
miento había 50 diferentes sitios de inserción entre las células T
del paciente, pero al final esta clona única superó a todas las otras
y condujo a una forma nueva de leucemia de célula T. A menos
que esto sea el resultado de algún aspecto evitable del vector o el
protocolo utilizado en estos casos particulares, es probable que es­
ta experiencia conduzca a un rechazo general de vectores que se in­
tegran de forma aleatoria como medios para la terapéutica génica.
Como se muestra en la figura 21-55, eso sería un inconveniente
notorio para todo el campo.
Por todas estas razones, parece probable que los vectores que
permanecen como episomas extracromosómicos se constituyan en
Recuadro 21-1. Informe del Panel de los NIH de 1995 sobre terapéutica génica (informe Orkin-Motulsky)
Los NIH convocaron a una reunión para valorar el estado actual y promi­
sorio de la terapéutica génica y emitir recomendaciones sobre la investi­
gación futura patrocinada por los NIH en esta área. El informe se notificó
en diciembre de 1995 (www4.od.nih.gov/oba/rac/panelrep.htm). Entre
los hallazgos cabe señalar los siguientes:
► La terapéutica génica somática es un progreso lógico y natural de la apli­
cación de la ciencia biomédica fundamental de la medicina y ofrece un
potencial extraordinario, a largo plazo, para el tratamiento y corrección
de enfermedades humanas, incluidos los trastornos hereditarios y ad­
quiridos, cáncer, sida, etcétera.
► Si bien las expectativas y promesas de la terapéutica génica son
considerables, en la actualidad aún no se demuestra de modo defi­
nitivo la eficacia clínica en ningún protocolo de terapéutica génica, a
pesar de afirmaciones anecdóticas de éxitos terapéuticos y el inicio
de más de 100 protocolos aprobados.
los medios principales para la terapia génica. Su desventaja es la li­
mitada duración de la expresión génica. Si se dividen de forma ac­
tiva las células blanco, los episomas tienden a diluirse a medida que
crece la población celular. Por consiguiente, no existe la posibilidad
de lograr una curación permanente y quizá se requieran tratamien­
tos repetidos. Para algunos propósitos, por ejemplo destruir células
de cáncer o combatir una infección aguda, ello no es un problema
porque no se requiere expresión a largo plazo. Más aún, si algo an­
da mal, un gen no insertado es autolimitante en una forma en que
no lo es el gen insertado en un cromosoma.
21.5.3 Los virus son los vectores utilizados con más
frecuencia para la terapéutica génica
Ningún sistema de transferencia génica es ideal; todos tienen sus li­
mitaciones y ventajas. Sin embargo, los vectores para transferencia
génica empleados de manera más regular son los virus de mamífe­
ros por su gran eficiencia de transducción a células humanas. La fi­
gura 21-5-8 muestra que casi en 70% de los protocolos aprobados
se usan vectores virales. Se han desarrollado varios sistemas virales
diferentes (véase la revisión de Kay y cois., 2001).
Vectores oncorretrovirales
Los retrovirus son virus RNA que poseen una transcriptasa inversa
que les permite sintetizar una copia de cDNA de su genoma. Los
retrovirus llevan un complejo nucleoproteínico (complejo de prein-
tegración) al interior del citoplasma de las células infectadas. Este
complejo transcribe de modo inverso el genoma viral RNA y en se­
guida integra el cDNA resultante en un sitio aleatorio único en un
cromosoma de la célula huésped. La integración requiere que el
cDNA retroviral tenga acceso a los cromosomas del huésped y só­
lo es capaz de llevarlo a cabo cuando se disuelve la membrana nu­
clear durante la división celular. Por esta razón, estos retrovirus sólo
pueden infectar células en división. Eso limita las posibles células
blanco; algunas células blanco; importantes, como las neuronas ma­
duras, nunca se dividen. Sin embargo, la propiedad de transducir
► Aún existen problemas de consideración en todos los aspectos bási­
cos de la terapéutica génica. Las principales dificultades a nivel bási­
co incluyen escasez en todos los vectores de transferencia génica
actuales y un conocimiento inadecuado de la interacción biológica de
estos vectores con el huésped.
► Conceder demasiado valor a los resultados de laboratorio y estudios
clinicos por investigadores y sus patrocinadores -sean académicos,
federales o industriales- condujo al error y la amplia percepción de
que la terapéutica génica tiene más éxito y está más desarrollada
de lo que en realidad está. Esos cuadros imprecisos amenazan la con­
fianza en la integridad del campo y pueden obstaculizar el progreso
a la aplicación exitosa de la terapéutica génica para enfermedades
humanas.
Casi todas las observaciones son pertinentes en la actualidad, aunque te
habido una curación definitiva (véase sección 21.7.1).
622 | CAPÍTULO VEINTIUNO ¡ NUEVAS CONDUCTAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES
Recuadro 3 de ética. Diseño de niños
La frase publicitaria “diseño de niños” incluye dos grupos de preocupa­
ciones:
► Las personas utilizarán la fecundación in vitro y el diagnóstico preim-
plantación para seleccionar embriones con ciertas cualidades desea­
das y rechazar el reslo aun si son normales. Esto contrasta con el uso
del mismo procedimiento para evitar el nacimiento de un niño con
una enfermedad grave.
► Las personas usarán las tecnologías terapéuticas que se describen
en este capítulo, no para el tratamiento de enfermedades sino para el
mejoramiento genético, es decir, dotar a personas normales desde
el punto de vista genético de cualidades superiores.
El primer caso ya existe en forma de selección del sexo antes de la implan­
tación y unos cuantos casos de gran publicidad en los que una pareja bus­
có asegurar que su siguiente niño pudiera proporcionar un trasplante
compatible para salvar la vida de un niño enfermo. Los casos actuales in­
cluyen un trasplante de células madre de sangre del cordón. Esto no perju-
dicaria al niño (seria diferente si se propusiera donar un riñón). A menudo
se sugiere que estos casos son el inicio de una pendiente en deslizamien­
to que conducirá inevitablemente a demandas para especificación más ex­
tensa del genotipo del niño -com o lo resume la frase “diseñador de niños” .
Esto es erróneo. Seleccionar para fines de compatibilidad HLA significa ele­
gir sólo uno de cada cuatro embriones. Casi todos los procedimientos de
fecundación in vitro (F1V) producen sólo un puñado de embriones y por lo
A ) P ro to c o lo s p o r e n fe rm e d a d
■ i C á n c e r (n = 4 0 3 ), 6 3 .4 %
IM E n fe rm e d a d e s m o n o g é n ic a s (n = 78), 1 2 .3 %
f I E n fe rm e d a d e s in fe c c io s a s (n = 41), 6 .4 %
I l E n fe rm e d a d e s v a s c u la re s (n = 51), 8 .0 %
ü O tra s e n fe rm e d a d e s (n = 12), 1 .9 %
E 3 M a rc a d o g é n ic o (n = 49 ), 7 .7 %
I I V o lu n tario s sa n o s (n = 2), 0 .3 %
Fig. 21-5. Estudios clínicos de terapéutica gènica.
A) Distribución por enfermedad. B) Distribución por vector. Las figuras incluyen todos los protocolos aprobados para estudios clínicos terminados, e n .
curso o pendientes, incluidos en la lista de diciembre del 2002. Reproducido con autorización a partir de www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical.
general se implantan dos a tres para maximizar la posibilidad de éxito. La
selección en múltiples criterios no es consistente con contar con suficien­
tes embriones para implantar. De manera más general, la naturaleza dotó a
la humanidad de un método simple y muy aceptable de hacer niños, algo
muy eficaz para la gran mayoria de las parejas, y es difícil imaginar que la
mayor parte de las personas lo abandone en favor de un procedimiento len­
to y prolongado, desagradable e invasivo que cuesta una fortuna y tiene
una tasa de éxito baja.
El mejoramiento genético es un problema difícil o así será una vez que se
tenga alguna idea de los genes mejorables. Por una parte, se presupone
que los padres hacen todo lo que pueden para proporcionar a sus niños un
buen inicio en la vida; por la otra, las opciones disponibles sólo para los in­
dividuos ricos se consideran como la compra de una ventaja injusta,
cuando menos en Gran Bretaña. Tal vez, por fortuna, aún parece lejano el
momento de identificar los genes adecuados, incluso si se dispusiera de las
técnicas. Los intentos para producir animales mejorados en sentido gené­
tico no han sido un éxito y en algunos casos se han observado fracasos
espectaculares (véase Gordon, 1999). A largo plazo, las posibilidades de­
ben ser Inmensas y con toda seguridad habrá muchos problemas éticos di­
fíciles de afrontar. Un signo de que las personas aún no piensan en forma
realista sobre ello es que siempre colocan a la inteligencia en la parte su­
perior de su lista de atributos deseables: ¿estas personas nunca han com­
parado los estilos de vida de los profesores y los jugadores de fútbol?
B) P ro to c o lo s p o r v e c to r
■ R e tro v iru s (n = 21 7), 34.1 %
E l A d e n o v iru s (n = 1 7 1 ), 2 6 .9 %
□ L ip o fe c c ió n (n = 77), 12.1 %
□ D N A d e s n u d o /p lá s m id o (n = 70 ), 1 1 .0 %
V irus p o x (n = 39), 6.1 %
□ V irus a d e n o rre la c io n a d o s (n = 15), 2 .4 %
□ R N A d e tra n s fe re n c ia (n = 6), 0 .9 %
im V irus del h e rp e s s im p le (n = 5), 0 .8 %
g g O tro s (n = 11), 1 .7 %
1 1 N /C (n = 25), 3 .9 %
 21.5 | MÉTODOS PARA INSERTAR Y EXPRESAR UN GEN EN UNA CÉLULA O TEJIDO BLANCO 623

Gen X
clonado

Fig. 21-6. Terapéutica génica in vivo y ex vivo.

Siempre que es posible, se extraen células del paciente, se modifican en el laboratorio y se devuelven al enfermo (terapéutica génica ex vivo; flechas
verdes). Esto permite tratar sólo las células apropiadas y pueden revisarse estas últimas antes de restituirse para comprobar que se logró el cambio
deseado. En muchos tejidos no es posible y es necesario modificar las células dentro del cuerpo del paciente (terapéutica génica in vivo\ flecha azul).

sólo células en división puede resultar una ventaja en el tratamiento del
cáncer. Las células cancerosas que se dividen de manera activa en un te­
jido que habitualmente no se divide, como el cerebral, pueden infec­
tarse en forma selectiva y destruirse sin un riesgo mayor para las células
normales.
Dada la capacidad de los retrovirus nativos para transformar cé­
lulas, es crucial tratar mediante ingeniería los vectores de la tera­
péutica génica de tal manera que se elimine esta posibilidad. Se ha
puesto un gran ingenio en el diseño de sistemas que pueden pro­
ducir sólo virus incapacitados de manera permanente. En condicio­
nes normales, los retrovirus tienen tres unidades de transcripción,
gag, p o ly env y un elemento psi RNA de acción cis reconocido por
proteínas virales que empacan el RNA en partículas infecciosas. En
el vector se reemplazan gag, p o l y en v por el gen terapéutico, con
una capacidad máxima de clonación de 8 kb. Este vector se empa­
ca en una célula especial que puede contribuir a las funciones gag,
p o l y env necesarias, pero que no contiene un genoma retroviral in­
tacto (fig. 21-7).
Los retrovirus son muy eficientes para transferir DNA al inte­
rior de las células y en casi todos los estudios clínicos iniciales de
terapéutica génica se usaron vectores retrovirales. Sin embargo, la
preocupación cada vez mayor sobre el riesgo de mutagénesis inser-
cional ha desplazando el énfasis principal hacia vectores no inte­
grantes.
Vectores adenovirales
Los adenovirus son virus DNA que causan infecciones benignas
de las vías respiratorias superiores en seres humanos. Pueden
producirse en títulos altos (mucho mayores que los retrovirus) y
transducirse de forma eficiente a células en división y las que no
se dividen. El genoma lineal del DNA de doble cadena perma­
nece sin integrarse como un episoma dentro del núcleo celular.
Como se explicó, esto tiene ventajas en la seguridad y desventa­
jas en la expresión obtenida a corto plazo. Al igual que en los
vectores retrovirales, los adenovirales están incapacitados y sólo
confían en el empacamiento celular para proporcionar funciones
vitales. El genoma de adenovirus es relativamente grande y los
diferentes vectores tienen secciones variables de deleción del ge­
noma (Yeh y Perricaudet, 1997). Todos los vectores “sin intesti­
no” eliminaron genes virales y pueden acomodar hasta 35 kb de
DNA terapéutico.
El gran problema con los vectores adenovirales es su inmuno-
genicidad (Kafri y cois., 1998). Aunque se ha administrado con se­
guridad una vacuna viva de adenovirus de replicación competente
a varios millones de reclutas del ejército estadounidense durante
varias décadas (para protección contra infecciones adenovirales na­
turales), en varios estudios clínicos de terapéutica génica constitu­
yeron un problema las reacciones inmunitarias indeseables. Jesse
Gelsinger murió en septiembre de 1999, dos días después de reci­
bir 6 X 1013 partículas adenovirales recombinantes por inyección
intrahepática en un estudio clínico de fase I de terapéutica génica
para deficiencia de transcarbamilasa de ornitina. Los pacientes en
otros estudios clínicos sufrieron reacciones inflamatorias menores
pero de consideración. Más aún, debido a que estos vectores no se
integran, la expresión génica es de corto término. Los adenovirus
recombinantes de primera generación empleados en estudios clí­
nicos de terapéutica génica de fibrosis quística mostraron que la
624 CAPÍTULO VEINTIUNO NUEVAS CONDUCTAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES

A) G e n o m a retroviral 5 'h

V gag pol env

B) G e n o m a d e l v e c to r 5 ' |--------- — li------------------ P " I -------- 1 3 '

V G en te ra p é u tic o

C ) C é lu la d e e m p a c a m ie n to M

G e n o m a s d e l v e c to r

P ro teín as
g a g /p o l

A ^ A ^
P ro te ín a s en v
N ú c le o

Fig. 21-7. Preparación y empacamiento de un vector retroviral de terapéutica génica.

Se eliminan los genes gag, pol y env del genoma retroviral y se reemplazan por el gen terapéutico. Se conserva la secuencia psi; ésta la reconocen pro­
teínas virales para ensamble de RNA en una partícula viral. Las células empacadas proporcionan las funciones de gag, pol y env, pero los genes se en­
cuentran en moléculas separadas y no hay secuencia psi. Esto se lleva a cabo para reducir al mínimo el riesgo de producir virus de replicación
competentes. Los genomas virales recombinantes se empacan en partículas virales infecciosas, pero de replicación deficiente, que brotan de la célula y
se recuperan del sobrenadante. Reimpreso con autorización de Somia y Verma (2000), Nature Review Genetics, © 2000 Macmillan Magazines Ltd.

expresión transgénica declinó después de unas dos semanas y fue
insignificante alrededor de cuatro semanas después. Sería necesa­
rio repetir la administración para sostener la expresión, que sólo
podría exacerbar la reacción inmunitaria. Es posible que los vecto­
res adenovirales encuentren su principal aplicación en los casos en
que se requiere un valor alto de expresión pero transitorio, por
ejemplo para destruir células cancerosas.
Virus vectores adenorrelacionados
Los virus adenorrelacionados (AAV) son virus DNA de cadena úni­
ca no patógenos que dependen de la coinfección por un virus cola­
borador adeno o herpes para replicarse. El AAV humano no modi­
ficado se integra en el DNA cromosómico en un sitio específico en
19ql3.3-qter. Ésta es una propiedad muy conveniente que propor­
ciona la ventaja de expresión a largo plazo sin el riesgo de mutagé-
nesis insercional que es un gran problema con los retrovirus.
Infortunadamente, la especificidad de integración la proporciona la
proteína viral rep y el gen rep se elimina en los vectores utilizados
para transferencia génica. Como en otros sistemas, las funciones
necesarias para producir partículas virales (incluido rep) las sumi­
nistra una célula de empacamiento. Se ha observado deleción del
96% del genoma de AAV en vectores basados en AAV. Esto propor­
ciona un grado elevado de seguridad porque los vectores recombi-
 21.5 MÉTODOS PARA INSERTAR Y EXPRESAR UN GEN EN UNA CÉLUIA O TEJIDO BIANCO | 625

nantes no contienen genes virales. Sin embargo, el genoma AAV es
muy pequeño e incluso estos vectores con deleciones muy altas só­
lo pueden incluir insertos hasta de 4.5 kb.
Lentivirus
Son retrovirus especializados que tienen el útil atributo de infec­
tar células que no se dividen (Vigna y Naldini, 2000). Al igual
que otros retrovirus, se integran en los cromosomas del huésped
en forma aleatoria y permiten la posibilidad de expresión génica
a largo plazo pero con todas las implicaciones de seguridad que
conlleva la integración. El HIV humano es la base de la mayor
parte de los vectores lentivirales y, de manera comprensible, cau­
sa nerviosismo por el riesgo de generar de manera inadvertida la
replicación del virus competente. El genoma de HIV es más com­
plejo que el gag, p o ly env de los retrovirus estándar (véase fig. 21-
13) y se dedicó mucho trabajo a eliminar genes innecesarios y
generar líneas de empacamiento en tanto se conserva la capacidad
de infectar células que no se dividen. Los vectores que se autoin-
activan proporcionan un elemento adicional de seguridad (Mi-
yoshi y cois., 1998).
Virus del herpes simple como vectores
Los vectores HSV son trópicos para el sistema nervioso central
(SNC). Son virus complejos con un genoma de DNA de doble ca­
dena de 152 kb que contiene cuando menos 80 genes. Pueden es­
tablecer infecciones latentes durante toda la vida en ganglios
sensoriales en los que existen como elementos extracromosómicos
no integrados. Podría aprovecharse el mecanismo de latencia para
permitir la expresión a largo plazo de los genes transferidos, que se
diseminarían por fortuna a través de una red sináptica. Sus princi­
pales aplicaciones serían el aporte de genes al interior de neuronas
para el tratamiento de enfermedades como la de Parkinson y tumo­
res del sistema nervioso central. La capacidad del inserto es cuando
menos de 30 kb. Los vectores prácticos se encuentran aún en una
etapa inicial de desarrollo (Fink y Glorioso, 1997).
21.5.4 Los sistemas vectores no virales evitan muchos
de los problemas de inseguridad de los virus
recombinantes, pero las tasas de transferencia
génica son casi siempre bajas
En el laboratorio es relativamente fácil llevar DNA extraño al inte­
rior de las células y algunos de los métodos tienen posibilidades en
terapia génica si se demuestra que no es posible resolver los proble­
mas de seguridad de los sistemas virales. Sin embargo, en la actua­
lidad todos adolecen de una tasa baja de transferencia génica y
duración de la expresión corta.
Liposomas
Los liposomas son vesículas sintéticas que se forman de manera es­
pontánea cuando se mezclan ciertos lípidos en solución acuosa. Por
ejemplo, los fosfolípidos pueden formar vesículas de doble capa que
simulan la estructura de membranas biológicas, con los grupos fos­
fato hidrofílicos en la parte exterior y las colas lipídicas hidrofóbicas
en la interior. El DNA por transferir se empaca in vitro con los lipo­
somas y se utilizan de modo directo para transferencia génica a un
tejido blanco in vivo (fig. 21-8). Los liposomas catiónicos tienen

A) Lípido
A gua

C)

T ran sferir

C élu la b la n co N ú cleo

Fig. 21-8. Uso de liposomas para el aporte de genes in vivo.

A) Los liposomas son vesículas sintéticas que se forman de manera espontánea en solución acuosa cuando se mezclan ciertos lípidos. Pueden llevar
una carga de superficie positiva (catiónica) o negativa (aniónica), según sea la química de los lípidos utilizados. B) Se transporta el cargamento de DNA
dentro de liposomas aniónicos o se une a la superficie de liposomas catiónicos. C) El transporte de DNA ocurre cuando se fusiona un liposoma con la
membrana plasmática de una célula.
626 I CAPÍTULO VEINTIUNO ! NUEVAS CONDUCTAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES

una carga de superficie positiva y enlazan DNA en el exterior; los li-
posomas amónicos poseen una carga de superficie negativa y se for­
man con el DNA en el interior. La cubierta lipídica permite que
sobreviva el DNA in vivo, se enlace a células y se endocite en el in­
terior de éstas. Los liposomas catiónicos son los empleados más a
menudo en experimentos de transferencia génica (véase Huang y Li,
1997, para referencias). A diferencia de los vectores virales, es fácil
preparar los complejos de DNA y lípido y no hay límite en cuanto
al tamaño del DNA que se transfiere. Sin embargo, la eficiencia de
transferencia génica es baja y el DNA introducido no está diseñado
para integrarse en el DNA cromosómico. Como resultado, cual­
quier expresión de los genes insertados es transitoria.
Inyección directa o bombardeo de partículas
En algunos casos es posible inyectar de manera directa DNA con
una jeringa y aguja dentro de un tejido blanco, como el músculo.
Por ejemplo, este método se consideró para la distrofia muscular de
Duchenne. En los estudios iniciales se investigó la inyección intra­
muscular de un gen de distrofina en un modelo de ratón, mdx (Ac-
sadi y cois., 1991). Debido al enorme tamaño del gen de distrofina
natural, se usó un minigén que comprendía el cDNA de la distro­
fina ajustado con secuencias reguladoras para asegurar una expre­
sión de alto nivel, como un promotor viral potente. En un método
alternativo de inyección directa se utilizan técnicas de bombardeo
de partículas (biolística o “pistola de genes”): se recubren con DNA
pelotitas de metal y se disparan con una pistola especial dentro de
las células. Con este método simple y seguro en términos compa­
rativos, se tuvo éxito en la transferencia génica a varios tejidos dife­
rentes. Sin embargo, con cualquiera de estos métodos de inyección
directa es muy mala la eficiencia de la transferencia génica y no se
integra de forma estable el DNA inyectado. Esto puede implicar
menos problemas en tejidos como el músculo, que no prolifera con
regularidad y en el cual puede continuar la expresión del DNA in­
yectado durante varios meses.
Endocitosis mediada por receptor
En este método se acopla el DNA por transferir a una molécula
blanco que puede enlazarse a un receptor de superficie celular espe­
cífico, lo cual induce endocitosis y transferencia del DNA al interior
de la célula. Por ejemplo, los hepatocitos depuran asialoglucopro-
teínas del suero mediante receptores en su superficie celular. Una
asialoglucoproteína que se enlaza de manera covalente a polilisi-
na enlaza de modo reversible DNA por una interacción electros­
tática entre la polilisina de carga positiva y el DNA de carga
negativa. Si se administra el complejo en el hígado por infusión a
través de las vías biliares o del lecho vascular, los hepatocitos lo
captan de forma selectiva. En un método más general se utiliza el
receptor de transferrina que se expresa en muchos tipos de célu­
las, pero es relativamente abundante en células en proliferación y
hematopoyéticas (fig. 21-9).
En condiciones normales, las sustancias que se internalizan en
esta forma se llevan a lisosomas y es necesario proporcionar cierto
mecanismo de escape para que el DNA llegue al núcleo celular.
Una posibilidad es transferir de manera concurrente adenovirus o
proteínas de éstos, que alteran de modo específico el endosoma
temprano y permiten que escape el contenido. La eficiencia de la
transferencia génica puede ser alta, pero el método no está diseña­
do para permitir la integración de los genes transferidos.

Fig. 21-9. Transferencia génica a través de endocitosis mediada por receptor.

Después de enlazar el ligando, se invagina la membrana plasmática y a continuación se pellizca, con lo cual deja el complejo de receptor-ligando en una
vesícula intracelular, el endosoma. El ligando podría ser un adenovirus que lleva un gen terapéutico, como se muestra en este caso, o DNA terapéutico
enlazado a alguna otra molécula para la que la célula blanco posee un receptor específico. En condiciones normales, los endosomas se dirigen a lisoso­
mas para degradación. Para expresarse, el DNA extraño debe escapar de alguna manera del endosoma, antes que suceda lo anterior, y llegar al núcleo.
Los adenovirus alteran de manera específica los endosomas y permiten un escape eficiente.
 21.6 MÉTODOS PARA REPARAR O INACTIVAR UN GEN PATÓGENO EN UNA CÉLULA O TEJIDO
21.6 Métodos para re p arar o in activar
un gen patógeno en una célula
o tejido
Los métodos que se describieron en la última sección tienen co­
mo fin, de una manera u otra, insertar un gen deseado dentro de
una célula o tejido blanco y hacer que se exprese a un nivel y por
algún tiempo apropiados para el problema clínico particular. No
obstante, algunos problemas requieren una conducta diferente.
Los padecimientos originados por ganancia d e fu n ció n de un gen
(sección 16.5) o un efecto dom inante negativo (sección 16.4.3) no
se benefician de esta forma de tratamiento. Si el problema es un
gen residente que actúa de un modo perjudicial, la única solución
es eliminar o inactivar el gen agresor. Los ejemplos típicos son pa­
decimientos mendelianos dominantes (además de los secundarios
a haploinsuficiencia, sección 16.4.2), oncogenes activados en célu­
las cancerosas y reacciones inmunitarias inapropiadas en enferme­
dades autoinmunitarias. También sería factible tratar enfermedades
infecciosas al inhibir un gen o un producto génico específico del
patógeno.
Para lograr lo anterior se intentan varias medidas. Puede des­
truirse el gen agresor o prevenir su expresión mediante disminución
de la transcripción, destrucción del transcrito o inhibición del pro­
ducto proteínico. Cualquiera que sea el método empleado, debe lle­
varse al interior de la célula blanco alguna clase de agente o vector y
hacer que funcione ahí. A este respecto, los problemas del aporte y
expresión eficientes son similares a los descritos en la sección ante­
rior. En afecciones dominantes u oncogenes activados existe el pro­
blema adicional de diseñar un agente que ataque de manera selectiva
el alelo mutante sin afectar el alelo normal. Esta área se considera la
segunda onda de la terapéutica génica. Los estudios actuales a este
respecto se dirigen a demostrar el principio siguiente: es probable
que los tratamientos prácticos sólo se desarrollen una vez que se ob­
serve que funcionan de modo satisfactorio las terapéuticas de au­
mento de genes.
21.6.1 Reparación de un alelo mutante mediante
recombinación homologa
En muchas técnicas de ingeniería genética estándar en organismos
inferiores se utiliza la recombinación homologa para reemplazar
una secuencia por otra, de tal manera que es natural considerar su
uso para reparar un gen mutante patógeno. En la recombinación
homologa de fragmento pequeño se usa uno de los métodos están­
dar para llevar un dúplex de DNA de 400 a 800 pb, que contiene
la secuencia de tipo silvestre dentro de la célula blanco (Goncz y
cois., 2001). Se han publicado pruebas del principio, pero ha resul­
tado difícil lograrlo con la eficiencia suficiente para que sea útil des­
de el punto de vista terapéutico.
21.6.2 Inhibición de la traducción mediante
oligonucleótidos antisentido
Los oligonucleótidos antisentido (de manera característica de 12 a
30 nucleótidos de largo) pueden inhibir la traducción de mRNA
62^
complementario mediante la formación de un dsRNA o una hé­
lice doble de DNA-RNA (Galderisi y cois., 1999). En algunos or­
ganismos, como el nematodo C. elegans, se convierte con eficiencia
el dsRNA en moléculas de RNA de interferencia pequeñas (siR-
NA), que inactivan transcritos homólogos por el mecanismo mal
comprendido pero muy eficiente de iRNA (véase más adelante).
En los seres humanos no sucede al parecer lo anterior. Las célu­
las humanas no tienen, o en escasa medida, la enzima Dicer ne­
cesaria para elaborar siRNA. En lugar de ello, el dsRNA o el
DNA-RNA se descomponen mediante RNA-asa de H. Esta en­
zima degrada el RNA pero no la cadena de DNA de un dúplex
RNA-DNA, lo cual permite en consecuencia que las moléculas
de DNA antisentido se comporten en forma semicatalítica. La
molécula antisentido suele modificarse de forma química para
tornarla más resistente a nucleasas celulares. Enlaces fosforotioa-
to sustituyen enlaces fosfodiéster o se emplean ácidos nucleicos
péptidos cuando se reemplaza la totalidad de la estructura básica
de azúcar fosfato con un marco estructural péptido sintético re­
sistente a la nucleasa. Esto conlleva la desventaja de toxicidad
inespecífica y asimismo el vector antisentido debe sintetizarse en
forma química y exógena, en tanto que los oligos antisentido no
modificados pueden producirse en el interior de la célula de un
plásmido apropiado. Los oligos antisentido tienen efectos bas­
tante impredecibles. En algunos casos se silencia con eficiencia y
de manera específica el gen blanco, pero con frecuencia hay po­
co efecto o acciones inespecíficas. Los dsRNA mayores de unos
30 pb de largo suelen inducir la producción de interferón, que
conduce a una supresión general de la traducción. En 1998, el
primer medicamento antisentido que llegó al mercado fue el vi-
vatreno, un DNA modificado por fosforotioato para el trata­
miento de infecciones por citomegalovirus en pacientes con sida.
21.6.3 Destrucción o reparación selectiva de mRNA
por una ribozima
En el transcurso de los años se descubrió un número cada vez mayor
de casos en que las moléculas de RNA funcionan como enzimas (n-
bozimas, véase Doudna y Cech, 2002). Por ejemplo, participan RNA
catalíticos en telomerasas (que actúan en el DNA), en el empalme in-
trón-exón (por acción en el RNA) y como la transferasa de peptidilo
de ribosomas (actúa en polipéptidos). Las moléculas de RNA tienen
muchas propiedades que las tornan aptas para actuar como enzimas.
Forman una diversidad de estructuras tridimensionales por virtud de
las cuales pueden enlazarse de forma específica a DNA, RNA o mo­
léculas proteínicas y tienen muchos grupos hidroxilo y amino poten­
cialmente reactivos.
Los terapeutas génicos se interesan sobre todo en las ribozimas
que cortan RNA blanco en una forma específica de secuencia. En la
naturaleza, los RNA de autocorte generan cadenas de la longitud del
genoma mediante el corte específico de sitio de concatámeros en vi­
rus RNA que se replican mediante un mecanismo circular en enro­
llamiento. Los ejemplos naturales incluyen las ribozimas en cabeza de
martillo (40 nt), horquilla (70 nt), HDV (virus delta humano, 90 nt
y VS (satélite Varkud; 160 nt) (Doudna y Cech, 2002). Las ribozi­
mas en cabeza de martillo pueden convertirse mediante ingeniería
genética en enzimas de corte trans muy versátiles, cuya secuencia de
628 CAPÍTULO VEINTIUNO NUEVAS CONDUCTAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES
RNA blanco puede especificarse al ajustar la ribozima en secuen­
cias complementarias (fig. 21-10). Tal y como ocurre con los oligo-
nucleótidos antisentido (véase antes), la ribozima puede tornarse
resistente a nucleasas en la célula mediante modificación química,
pero a continuación debe suministrarse de modo exógeno en lugar
de producirse por transcripción natural dentro de una célula blan­
co transfectada. Los primeros estudios clínicos de fase I de ribozi-
mas se iniciaron en 1998 y se encuentran en curso estudios clínicos
de fase II en los que se utilizan ribozimas dirigidas al mRNA del re­
ceptor VEGF para inhibir la angiogénesis en tumores de mama y
colorrectales (Sullenger y Gilboa, 2002).
Debido a que la especificidad de las secuencias de las ribozimas
está controlada por pareamientos de bases que se comprenden bien,
pueden diseñarse con facilidad para degradar de manera específica
un mRNA mutante en una enfermedad dominante, en tanto dejan
intacto el transcrito de tipo silvestre. De manera más ambiciosa, se
diseñaron ribozimas para reparar transcritos mutantes mediante
reacciones de transempalme en las que se corta una secuencia mu-
tanre predeterminada del mRNA y se reemplaza por la secuencia de
tipo silvestre (Sullenger y Gilboa, 2002). Se ha demostrado que to­
das estas ideas actúan en sistemas experimentales, pero aún es ne­
cesario determinar si pueden desarrollarse terapéuticas prácticas.
21.6.4 Inhibición selectiva del alelo mutante mediante
interferencia por RNA (iRNA)
Ésta es la técnica que ha suscitado mayor atención en la actualidad.
Como se describe en la sección 20.2.6, es posible inhibir de mane­
ra específica y muy eficiente la expresión génica en una gran varie­
dad de organismos mediante RNA de interferencia pequeños
(siRNA). Son RNA de doble cadena de 21 a 23 nt con terminales
5’ fosforiladas y extremos salientes 3' 2-nt. En muchos organismos
se cortan con eficiencia dsRNA más largos en siRNA mediante la
enzima Dicer. Esto no actúa en células humanas, pero es posible
5 '---------- X XX XX XX X XX X iG U C l x x x x x x x x x x x x - AAAAAAAA 3'
3' YYYYYYYYYYYCA YYYYYYYYYYYY 5'
qc .gV ga
A* U Gu Componente
G 'C catalítico
G *C
A G
GU
Fig. 21-10. Empleo de una ribozima en cabeza de martillo de corte
trans para destruir un mRNA mutante.
Las ribozimas en cabeza de martillo naturales son autocortantes. Para
los propósitos de la terapéutica génica, se separa la cadena que con­
tiene el sitio por cortar (blanco) de la cadena catalítica (la ribozima por
ingeniería). Al diseñar la ribozima con la secuencia (YYYY..) comple­
mentaria del blanco (XXXX...) es posible dirigirse de modo específico a
cualquier RNA deseado.
generar siRNA en estas últimas mediante la transcripción de vecto­
res de DNA adecuados. Se diseñan los transcritos de tal manera que
puedan retroceder para formar horquillas en asa con vástago. El
vastago es de 19 a 29 pb y está diseñado para ajustarse al blanco y
el asa es de 6 a 9 nt. En la actualidad, el iRNA es un medio de la­
boratorio muy eficiente para crear fenotipos con pérdida de fun­
ción. Menos claro es si resulta factible desarrollarlo para un medio
práctico de tratamiento, aunque la posibilidad es estimulante.
21.7 Algunos ejem plos de intentos
de te ra p é u tic a génica hum ana
En la figura 21-5^4 se muestran los 600 protocolos de terapéutica gé­
nica aprobados, 63% para el cáncer y sólo 12% para trastornos mo-
nogénicos. Otro 6 % corresponde a enfermedades infecciosas y 8 %
a padecimientos vasculares. A continuación se proporcionan revisio­
nes generales breves y algunas referencias sobre el progreso de la te­
rapéutica génica en varias áreas importantes. A pesar del limitado
número de estudios clínicos, las enfermedades monogénicas siempre
ocupan un sitio primordial en la agenda de la terapéutica génica y el
primer éxito definitivo se logró en esa área.
21.7.1 El primer éxito definitivo: curación d.e la
inmunodeficiencia combinada grave ligada a X
Desde la década de 1990, muchas publicaciones notificaron el in­
tento exitoso para tratar la inmunodeficiencia combinada grave
(IDCG) autosómica recesiva. Se transfectaron ex vivo linfocitos T
de un niño afectado con deficiencia de desaminasa de adenosina
con un vector retroviral que contenía un gen ADA funcional, se
expandieron en cultivo y se restituyeron al paciente. Más adelan­
te, otros enfermos recibieron un tratamiento similar, hasta con 10
a 12 terapéuticas por individuo. Varios sujetos refirieron mejorías
clínicas notables. Sin embargo, ninguno de los pacientes dejó de
recibir tratamiento con un preparado enzimàtico, lo que determi­
nó que sea incierta la magnitud de la mejoría atribuida a la tera­
péutica génica.
El primer éxito indudable se consiguió en un padecimiento
relacionado, IDCG ligada a X (Cavazzana-Calvo y cois., 2000;
véase fig. 21-11). Una vez más, el tratamiento fue ex vivo con el
uso de un vector retroviral que codificaba la cadena 7 c del gen re­
ceptor de citocina IL2R. Se incubaron durante tres días células de
médula ósea que expresaban CD34, un marcador de células ma­
dre hematopoyéticas, con el vector retroviral, con lo cual aumen­
tó en este lapso cinco a ocho veces de número y a continuación
se regresaron al paciente (fig. 21-11). Nueve de los 11 enfermos
tratados se curaron y pudieron llevar una vida normal (Hacein-
Bey-Abini y cois., 2002). No obstante, como se mencionó, dos de
ellos desarrollaron después leucemia, casi con certeza como resul­
tado de la activación insercional del oncogén LM 02 (Check,
2002, 2003). Se suspendieron en poco tiempo a nivel mundial
todos los estudios clínicos que incluían transducción retroviral de
grandes fondos comunes de linfocitos, mientras no se compren­
dieran del todo estos acontecimientos trágicos; al momento de es-
 21.7 ALGUNOS EJEMPLOS DE INTENTOS DE TERAPÉUTICA GÉNICA HUMANA 629

C é lu la s m a d re C D 3 4 + e n riq u e c id a s m e d ia n te V e c to r retroviral q u e lle va el

a n tic u e rp o co n c u e n ta s m a g n é tic a s g en re c e p to r d e c ito c in a yc

A s p ira c ió n d e 3 0 -1 5 0 mi Infusión d e 1 4 -3 8 m illo n e s T ra n s d u c ir cé lu la s en b o ls a d e p lá stic o

d e m é d u la ó s e a b a jo d e cé lu la s p o r kg d e p e so d u ra n te tre s días; las cé lu la s se
a n e s te s ia g e n eral co rp o ral m u ltip lic an c in co a o c h o v e ce s.

Fig. 21-11. Terapéutica génica de la enfermedad por inmunodeficiencia combinada grave ligada a X (IDCG-X).
Éste es el primer éxito claro de la terapéutica génica. De 11 niños de uno a 11 meses de edad que se trataron en el Necker-Enfants Malades Hospital,
París, nueve se curaron. Véase Hacein-Bey-Abini y colaboradores (2002). Infortunadamente, dos de los nueve desarrollaron con posterioridad una for­
ma de leucemia, casi con seguridad como resultado de la activación del oncogen LM02 por la inserción cercana del vector retroviral.

cribir este libro, aún no es posible precisar cuántos de ellos se su­
perarán alguna vez.
21.7.2 Intentos de terapéutica génica para la fibrosis
quística
Entre las enfermedades mendelianas, la fibrosis quística debería ser
una de las más susceptibles a la terapéutica génica. El problema se
debe a la falta del canal de cloruro codificado por CFTR, sobre to­
do en el epitelio de las vías respiratorias. Estudios de pacientes con
alelos CFRT parcialmente activos sugieren que sería suficiente 5 a
10% de la cantidad normal para producir una buena respuesta clí­
nica. Esto evitaría cuando menos la progresión de la enfermedad y
revertiría algunos efectos secundarios. El aporte génico específico
de tejido podría llevarse a cabo mediante un inhalador en aerosol.
Se han publicado cuando menos 18 estudios clínicos de terapéuti­
ca génica para fibrosis quística (FQ) (Davies y cois., 2001). En los
estudios clínicos iniciales se usaron adenovirus, que infectan de ma­
nera natural células pulmonares que no se dividen. A dosis altas, es­
tos virus indujeron en ocasiones reacciones inflamatorias y, en
especial después de la muerte de Jesse Gelsinger consecutiva a ade­
novirus (véase antes), en la actualidad se consideran con cierta cau­
tela. En cuatro de los cinco estudios clínicos más recientes se
emplearon liposomas o virus adenorrelacionados (AAV). Varios es­
tudios clínicos demostraron transferencia génica y expresión por
tiempo breve, pero es claro que todos estos estudios se encuentran
bastante lejos de la posibilidad de aplicación clínica.
Un problema de consideración es la barrera física de moco y
glucocálix que cubre las células epiteliales de las vías respiratorias,
en particular en los pulmones infectados de pacientes con fibrosis
quística. Pueden llevarse agentes de terapéutica génica al interior de
las vías respiratorias, pero se necesitan vehículos más complicados
para permitir la transducción eficiente de células epiteliales. Asi­
mismo, un problema es la transfección de las células correctas. Los
adenovirus tienden a infectar células basales del epitelio, en tanto
que los grados más altos de expresión natural de CFTR se observan
en glándulas submucosas. Como ideal, deben enviarse células ma­
dre porque las células epiteliales de superficie tienen un periodo de
vida de sólo 120 días, de tal manera que sería necesario repetir la
administración repetida con todos los problemas consiguientes de
la reacción inmunitaria.
630 CAPÍTULO VEINTIUNO i NUEVAS CONDUCTAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES

21.7.3 Intentos de terapéutica génica para la distrofia
muscular de Ouchenne
Estudios de mujeres portadoras de la distrofia muscular de Duchen-
ne (DMD) y pacientes con la distrofia muscular de Becker, menos
grave, mostraron que en enfermos con DMD sería benéfico restituir
alrededor de 20% de la expresión normal del gen de la distrofina. Sin
embargo, la terapéutica génica para DMD afronta el doble problema
del enorme tamaño del gen de la distrofina (2.4 Mb) y de llevarlo a
las células de los músculos esquelético y cardiaco. Véase Chamberlain
(2002) para una revisión del progreso. Incluso el cDNA es muy gran­
de, de 14 kb, para muchos vectores. Con base en la observación de
un sujeto que experimentó una deleción de los exones 17 a 48 del
gen de la distrofina (46% de la secuencia de codificación), pero que
sólo sufría distrofia de Becker leve, se preparó un minigen de 6.3 kb
que pudo ajustarse en vectores adenovirales y retrovirales. Es impor­
tante no desencadenar reacciones inmunitarias de mediación celular;
el uso de un promotor específico de músculo para llevar el transgen
ayuda a minimizar este problema. Los virus adenorrelacionados mos­
traron una buena persistencia en el músculo, cuando menos en rato­
nes sanos, y también los plásmidos son vehículos prometedores. Pa­
ra el éxito del tratamiento es preciso llevar los vectores no sólo al in­
terior del músculo esquelético, sino también al corazón y el
diafragma y hasta la fecha aún no se resuelve este problema. Un mé­
todo alternativo consiste en incrementar la expresión de utrofina
(MIM 128240), una molécula parecida a la distrofina que en condi­
ciones normales enlaza el complejo de actomiosina a la membrana de
la célula muscular justo en la unión neuromuscular. Un locus auto-
sómico separado codifica la utrofina y permanece intacto en niños
con distrofia muscular de Duchenne.
También se intentó en la DMD la terapéutica celular median­
te el trasplante de mioblastos en músculos de niños afectados. En
algunos estudios el paciente ocasional mostró ciertas fibras muscu­
lares positivas a distrofina, pero en ningún enfermo se observó me­
joría clínica. Se afirma que las células madre administradas mediante
trasplante de médula ósea pueden ser capaces de migrar a los mús­
culos y actuar como células madre musculares (Ferrari y cois., 1998).
Si se confirma, ello ofrece una esperanza real de tratamiento de la
DMD mediante los métodos que curaron la inmunodeficiencia
combinada grave.

Cuadro 2 1 -3 . Ejemplos de estudios clínicos de terapéutica génica para el cáncer

Se trata sobre todo de estudios de fase 1 (seguridad básica); en esta etapa del desarrollo, casi ninguno de los estudios clínicos tiene como fin beneficiar en
términos clínicos a los pacientes. Véase la base de datos de estudios clínicos de los NIH (www4.od.nih.gov/oba/rac/clinicaltrial.htm) para un examen amplio.

Trastorno Células alteradas Medidas de terapéutica génica

Cáncer de ovario Células tumorales Inyección intraperitoneal de retrovirus o adenovirus que codifican p53 de longitud completa o cDNA de
BRCA1, con la esperanza de restablecer el control del ciclo celular

Cáncer de ovario Células tumorales Inyección de adenovirus que codifica un anticuerpo scFv a ErbB2; se espera inactivar una señal de
crecimiento

Melanoma maligno Linfocitos que Extraer LIT del tumor extirpado y expandirlos en cultivo; infectar los LIT ex vivo con un vector retroviral que
infiltran el tumor expresa el factor de necrosis tumofal a e introducirlos en el paciente. Se espera que los LIT se dirijan a
las células tumorales restantes y el TNF a las destruya. Véase la figura 21- 4 f para el principio

Diversos tumores Células tumorales Transfectar células tumorales con un retrovirus que expresa un antígeno de superficie celular, por ejemplo
HLA-B7, o una citocina, como IL-12, IL-4, GM-CSF o IFN -y. Se espera que esto incremente la
inmunogenicidad del tumor, de tal manera que lo destruya el sistema inmunitario del huésped. Con
frecuencia se efectúa ex vivo mediante células tumorales radiadas en proporción letal. Véase la figura
21- 4 f para el principio

Cáncer de próstata Células dendríticas Tratar células dendríticas autólogas con un antígeno tumoral o cDNA que expresa el antígeno para cebarlas
e inducir una mejor reacción inmunitaria a las células tumorales. Véase la figura 21-4 f para el principio

Glioma maligno Células tumorales Inyectar un retrovirus que expresa cínasa de timidina (TK) o desaminasa de citosina (CDA) en el tumor.
(tumor cerebral) Sólo se infectan las células tumorales en división, no las células cerebrales circundantes que no se
dividen. A continuación, tratar con ganciclovir (las células positivas a TK lo convierten en fosfato de gcv
tóxico) o 5-fluorocitosina (las células positivas a CDA lo convierten en 5-fluoruracilo). Se destruyen de
forma selectiva células infectadas con virus (en división). Véase la figura 21-12

Tumores de cabeza Células tumorales Inyección de adenovirus 0NYX-015 mediante ingeniería en el tumor. El virus sólo puede replicarse en
y cuello células con deficiencia de p53, de tal manera que lisa de manera selectiva células tumorales. Este
tratamiento fue eficaz cuando se combinó con quimioterapia sistémica.

LIT, M ocitos infiltrantes de tumor; TNF, factor de necrosis tumoral; IL, interleucína; GM-CSF, factor estimulante de granulocitos y macrófagos; IFN, interferón.
 21,7 ¡ ALGUNOS EJEMPLOS DE INTENTOS DE TERAPÉUTICA GÉN1CA HUMANA ! 631

21.7.4 Terapéutica génica para el cáncer

Más de 60% de todos los protocolos de estudios clínicos de tera­
péutica génica aprobados se enfoca en el cáncer (fig. 21-5). En el
cuadro 21-3 se incluye una lista de varios ejemplos, que se eligie­
ron para ilustrar la gama de métodos. Pueden mencionarse los si­
guientes:
► Suplementación génica para restaurar la función de genes supre-
sores de tumor.
► Inactivación génica para prevenir la expresión de un oncogen
activado.
► Manipulación genética de células tumorales para desencadenar
Im plantación estereo táctica guiada por resonancia
apoptosis. de células productoras d e vector (CPV) en
tum ores del S N C in situ
► Modificación de células tumorales para tornarlas más antigéni-
cas, de tal manera que el sistema inmunitario destruya el tumor.
B)
► Modificación de células dendríticas para incrementar una reac­
ción inmunitaria específica de tumor.
► Uso de virus oncolíticos manipulados por ingeniería para des­
truir de modo selectivo células tumorales.
► Modificación genética de células cancerosas para que éstas, pe­
ro no las células no tumorales circundantes, conviertan un pro­
fármaco no tóxico en un compuesto tóxico que las destruya (fig.
21- 12).
Células productoras d e ve cto r dentro del tum or

21.7.5 Terapéutica génica para las enfermedades

infecciosas: HIV
H IV-l, como el patógeno viral más importante en seres huma­
nos, es el blanco de enormes esfuerzos de investigación en toda
rama importante de la ciencia médica. Ha sido relevante la ma­
nipulación genética en dos áreas. Gran parte del trabajo se cen­
tra en intentos para desarrollar vacunas modificadas de forma
genética por ingeniería; además, muchos investigadores consi­ Células tum orales infectadas con retrovirus,
deran la manipulación genética de las células huésped para tor­ pero no las células norm ales
narlas resistente al HIV. En la base de datos de los NIH de
estudios clínicos (www4.od.nih.gov/oba/rac/clinicaltrial.htm)
D)
se halla una lista de casi 40 protocolos de estudios clínicos que
incluyen transferencia génica y que se enviaron entre 1992 y
2001. Casi todos son similares en principio al método que curó
la IDCG-X. Se transfectan células madre hematopoyéticas con
un gen del que se tiene la esperanza de que inhiba la replicación
de HIV, por lo general en un vector retroviral, y se devuelven las
células tratadas al paciente. Debido a que la principal anomalía
del Sida es la infección y destrucción de linfocitos, éste es un
medio natural para tratar de impedir que evolucione la infec­ El ganciclovir destruye las células infectadas
ción por HIV a sida.
El HIV es un retrovirus. La partícula viral madura consiste en Fig. 21-12. Terapéutica génica in vivo para tumores cerebrales.
dos copias idénticas del genoma RNA de cadena única, aunadas a
Se modifica por ingeniería un retrovirus para producir la cinasa de timidina
algunas proteínas de centro, incluidas en una envoltura de gluco-
del virus del herpes simple (HSV-TK). Se inyectan las células productoras
proteínas virales y lípidos captados de la membrana de la célula
del vector (CPV; azul) en el tumor cerebral. Debido a que los retrovirus in­
huésped cuando germina el virus (fig. 21-13). Al igual que los ge­
fectan células en división, infectan las células tumorales (rosa) pero no el
nes g a g ,p o ly en v que comparten todos los retrovirus, la replicación
tejido cerebral normal circundante (verde). Se administra por vía intraveno­
de HIV requiere las proteínas reguladoras Tat y Rev. Estas últimas,
sa el profármaco no tóxico ganciclovir (gcv). En las células TK+ se convier­
y las secuencias de RNA viral a las que se enlazan (TAR y RRE),
te el gcv en trifosfato de gcv muy tóxico y se destruyen las células.
632 ¡ CAPÍTULO VEINTIUNO ! NUEVAS CONDUCTAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES

Fig. 21-13. Ciclo de vida del virus HIV-1. Éste es un retrovirus con un genoma RNA.
Al igual que otros retrovirus, son genes gag, pol y env. Una transcriptasa inversa hace una copia de DNA que se integra como un provirus dentro de los
cromosomas del huésped. Se empacan mRNa y proteínas virales en partículas de virus que brotan de la membrana de la célula huésped. A diferencia
de los retrovirus simples, el HIV-1 codifica dos proteínas reguladoras, Tat y Rev, que enlazan las secuencias TAR y RRE, respectivamente, en el genoma
viral y son esenciales para la replicación del virus. Éstos son los principales blancos de la terapéutica génica de HIV.

son los blancos de elección para muchos de los intentos de tornar
resistentes los linfocitos a HIV. Las medidas incluyen las siguientes:
► Uso de RNA antisentido. Se han elaborado retrovirus que co­
difican RNA antisentido a TAR, mRNA tat y rev superpuestos
y mRNA p o l y env.
► Empleo de RNA decodificante. Un retrovirus que se dirige a
la expresión de alto nivel de un transcrito que contiene la se­
cuencia RRE podría secuestrar toda la proteína Rev y evitar la
replicación de HIV.
► Utilización de mutantes dominantes negativos. Algunos vec­
tores retrovirales codifican una proteína Rev mutante, RevMIO.
Ésta enlaza el RRE pero no ensambla después los complejos
multiproteínicos necesarios para que salga el RNA del núcleo.
► Uso de ribozimas. Varios grupos prepararon retrovirus que co­
difican ribozimas. RRz2 es una ribozima en cabeza de martillo
dirigida contra la región reguladora tat, también se emplea otro
tipo, la ribozima en horquilla, para cortar el genoma de HIV.
► Empleo de intracuerpos. Se han usado retrovirus que codifi­
can anticuerpos intracelulares scFv (véase sección 21.3.4) para
intentar inactivar las proteínas reguladoras Tat o Rev o la gluco-
proteína de recubrimiento gpl60.
En las etapas iniciales de la infección por HIV se observa un recam­
bio masivo de linfocitos, a medida que el sistema inmunitario lu­
cha por destruir las células infectadas. Si la reacción inmunitaria
fuera bastante más eficaz, tal vez podría contenerse a los virus en
esa etapa. Además de los esfuerzos para desarrollar vacunas, tam­
bién existen trabajos dedicados a modificar las células T de tal mo­
do que destruyan células infectadas con mayor eficiencia. Se han
diseñado retrovirus para que las células T CD8+expresen un recep­
tor de célula T quimérico que dirija su respuesta citotóxica a célu­
las infectadas por HIV.
Pueden consultarse pormenores de estos métodos en la base de
datos de los NIH incluida en la sección “enfermedades infecciosas”
(iclick en Scientific Abstract para cualquier protocolo de interés). In

vitro, las células manipuladas muestran con frecuencia una gran re­
sistencia a la infección por HIV in vivo se demostraron injertos de
médula ósea a largo plazo (varios meses o hasta uno a dos años) en
unos cuantos estudios clínicos. Hay que preguntar si es posible que
ocurra el injerto a un grado suficiente para proporcionar un fondo
Lecturas adicionales
Base de datos de los NIH de estudios clínicos de terapéutica
génica: www4.od.nih.gov/oba/rac/clinicaltriai.htm
Base de datos Wiley de protocolos de terapéutica génica
aprobados: www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical
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BIBLIOGRAFÍA 633
común de linfocitos resistentes a HIV de utilidad clínica. El injer­
to de alto grado podría lograrse tras destruir primero la médula
existente del paciente con sustancias químicas citotóxicas y radia­
ción, si bien llevarlo a cabo en un sujeto con sida sería una medida
desesperada.
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Nota: además de este glosario general, también hay cuatro glosarios especializados:
► Glosario de métodos de PCR, recuadro 5-1, pág. 124
► Glosario de hibridación de ácido nucleico,
recuadro 6-3, pág. 168
Siempre que es posible, se hace referencia a una figura, recuadro o sección del texto que ilustra o aclara el tema. Las palabras en itálicas se
refieren a entradas adicionales en el glosario o referencias de figuras y recuadros.
Acción Cis (de un factor regulador): control de la actividad del
gen sólo cuando es parte de la misma molécula de DNA o del
cromosoma como el factor regulador. Compárense factores regu­
ladores d e acción trans que pueden controlar sus secuencias
blanco prescindiendo de su localización en el cromosoma.
A cción trans: (de un factor regulador) afecta la expresión de todas
las copias del gen blanco, prescindiendo de la localización cro-
mosómica. Los factores reguladores de acción trans suelen ser
proteínas que pueden difundirse a sus sitios blanco.
Alelo nulo: alelo mutante que no produce productos.
Alelos: formas alternativas del mismo gen.
Amnios: una de las cuatro membranas extraembrionarias de
mamíferos. Véase recuadro 3-8.
Amplificación del genoma total: método de PCR que utiliza
cebadores altamente degenerados que pueden amplificar un
número muy grande de secuencias aleatorias diseminadas a
través del genoma. Puede utilizarse para permitir pruebas
repetidas de DNA de una célula, por ejemplo, en la tipificación
de un espermatozoo aislado (sección 11.5.4).
Análisis de par de hermanos: véase Análisis d e p a r d e hermanos
afectados.
Análisis de par de hermanos afectados (PHA): forma de análisis
de enlace no param étrico basado en la medición de haplotipos que
comparten hermanos que padecen la misma enfermedad. Véase
figura 15-3.
Análisis de segregación: metodología estadística para inferir mo­
dos de herencia.
Aneuploidía: constitución cromosómica con uno o más cromoso­
mas extra o ausencia de un grupo euploide completo.
Animal transgénico: un animal en el cual el DNA extraño (un
transgén) introducido artificialmente se incorpora de manera
estable dentro de la línea germinal. Véanse figuras 20-2, 20-3.
Anneal: véase recuadro 6-3.
Anticipación: tendencia al incremento de la gravedad de un
padecimiento en generaciones sucesivas. Suele deberse a sesgo de
valoración (véase sección 4.3.3), pero se ve realmente con m uta­
ciones dinám icas (sección 16.6.4).
Anticodón: secuencia de tres bases en una molécula de tRNA que
forma pares de bases con el codón de mRNA. Véanse figuras 1-
7B y 1-20.
Anticuerpo monoclonal (Acm): anticuerpos puros con especifici­
dad única, producidos mediante tecnología de hibridoma, a
diferencia de los anticuerpos policlonales que se producen por
inmunización. Véase recuadro 7-4.
Antimorfo: alelo con un efecto negativo dominante.
G losario
► Glosario de genómica, recuadro 8-1, pág. 209
► Glosario de grupos filogenéticos metazoarios,
recuadro 12-5, pág. 386
Apoptosis: muerte célular programada.
Aptitud (a): en poblaciones genéticas, una medida del éxito en la
transmisión de genotipos a la generación siguiente. Llamada
asimismo aptitud biológica o aptitud reproductiva, siempre se
encuentra entre 0 y 1.
Archaea: procariotas de célula única que se asemejan superficial­
mente a las bacterias, pero con características moleculares que
indican un tercer reino de vida. Véase recuadro 12-4.
ARMS (Sistema de amplificación de mutación resistente): PCR
específica de alelo. Véanse figu ra 5-4 y 18-10.
Asociación: tendencia de dos caracteres (enfermedades, alelos mar­
cadores, etc.) a ocurrir juntos en frecuencias no aleatorias. La
Asociación es una observación estadística simple, no un fenó­
meno genético, pero en ocasiones puede ser causado por dese­
quilibrio de enlace. Véase sección 15.4.
Asociación alélica: véase Desequilibrio d e enlace.
Atrapamiento de exón: técnica para detectar secuencias dentro de
un DNA genómico clonado que son capaces de empalmarse a
exones dentro de un vector especializado. Véase figu ra 7-10.
Autocigosidad: en una persona endogàmica, hom ocigosidad para
alelos idénticos por descendencia.
Autosoma: cualquier cromosoma aparte de los cromosomas del
sexo, X y Y.
BAC (cromosoma bacteriano artificial): plásmido recombinante
en el que pueden propagarse insertos hasta de 300 kb de largo
en células bacterianas. Véase sección 5.4.3.
Biomètrica: estudio estadístico de caracteres cuantitativos.
Bivalente: la estructura de cuatro filamentos que se observa en la
profase I de la meiosis, que comprende dos cromosomas
homólogos en sinapsis. Véase figu ra 2-11.
BLAST: familia de programas que buscan bases de datos de
secuencia para compatibilidades con una secuencia problema.
Véase recuadro 7-3.
Blastocisto: etapa muy temprana del desarrollo embrionario en la
que el embrión consiste en una pelota hueca de células con un
compartimiento interno lleno de líquido, el blastocele.
Bloqueo de haplotipo: variante particular de un segmento
polimorfico extendido de DNA cromosomico (típicamente 10-
100 kb) que se encuentra en muchos miembros de una
población y se supone que representa una variante ancestral.
Véanse recuadro 12-6 y sección 15.4.3.
Bootstrapping: método estadístico diseñado para revisar la pre­
cisión de un árbol evolutivo construido a partir del análisis de
secuencia comparativa. El método incluye numerosos ciclos de
636 1 GLOSARIO
reemplazo de algunos de los datos de secuencia original por
submuestras aleatorias obtenidas de los datos originales y calcu­
lando nuevamente en cada ciclo la posibilidad de que el árbol
original sea correcto. Véase figu ra 12-18.
Buscador del genoma: programa que proporciona una interfaz
gráfica para interrogar bases de datos del genoma. Véase sección
8.3.6.
Calificación lod (z): medida de la posibilidad de enlace genético
entre locus. El log (base 10) de las posibilidades de que se enla­
cen los locus (con la fracción recombinante 0) en lugar de que
no estén enlazados. Para caracteres mendelianos una califi­
cación lod mayor de + 3 indica enlace; uno menor de -2 es una
prueba contra enlace. Véanse recuadro 13-3, figu ra 13-7.
Caminata de cromosoma: aislamiento de secuencias adyacentes a
una clona en el cromosoma caracterizado mediante genotecas
genómicas de selección para clonas que se superponen parcial­
mente.
Cap: grupo químico especializado que añaden las células para blo­
quear el extremo 5’ del mRNA. Véase figu ra 1-17.
Carácter dicotòmico: una característica como la polidactilia que
tienen algunas personas y otras no -en comparación con una
característica continua, por ejemplo, el peso, que tienen todas las
personas, pero en diferente grado-.
Característica continua: una característica, como el peso, que
tienen todas las personas, pero en un grado diferente -en com­
paración con un carácter dicotòm ico como la polidactilia, que
tienen algunas personas y otras no-.
Cariotipo: estrictamente, significa un resumen de la constitución
cromosomica de una célula o una persona, como 46, XY. Sin
embargo, con frecuencia el término se utiliza laxamente para
indicar una imagen que muestra los cromosomas de una célula
seleccionados en orden y dispuestos en pares, como en la fig u ­
ra 2-14.
cDNA (DNA complementario): DNA sintetizado por la enzima
transcriptasa inversa utilizando mRNA como una plantilla, sea
experimentalmente (véanse figuras 4-8 y 6-5) o in vivo (véanse
figuras 7-13 y 14-18).
Cebador: oligonucleótido corto, con frecuencia de 15 a 25 bases
de largo, con pares de bases específicamente para una secuencia
blanco a fin de permitir que una polimerasa inicie la síntesis de
un filamento complementario.
Célula madre: célula que puede actuar como un precursor para
diferenciar células, pero que retiene la capacidad de autorreno-
varse. Véase sección 3.4.3.
Célula somática: cualquier célula del cuerpo, excepto los gametos.
Células germinales (o gametos): las células espermatozoo y
óvulo.
Células germinales primordiales: células en el embrión y el feto
que dan lugar finalmente a las células de la línea germinal.
Células madre embrionarias: véase Células ME.
Células ME (madre embrionarias): células pluripotenciales
indiferenciadas derivadas del embrión. Un instrumento clave
para manipulación genética. Véanse Sección 3.4.5, figuras 21-
1, 20-3.
CentiMorgan (cM): unidad de distancia genética. Los locus sepa­
rados 1 cM tienen una probabilidad de recombinación del 1%
durante la meiosis. Véase la figu ra 13-4 para la relación entre
distancias genéticas y físicas.
centiRay (cR): véase recuadro 8-1.
Centrómero: la constricción primaria de un cromosoma que sepa­
ra el brazo corto del brazo largo, y el punto en el que se unen
fibras en huso para tirar de las cromátides a fin de separarlas
durante la división celular. Véase sección 2.3.2.
Chip de DNA: véase M icroordenación.
Cigoto: óvulo fecundado.
Citoesqueleto: andamiaje interno de filamentos de proteínas que
existe dentro de las células, con funciones crucialmente impor­
tantes en la regulación de la forma celular, el movimiento de la
célula y el transporte celular. Véase recuadro 3-2.
Clona: véase recuadro 8-1.
Clonación de sustracción: método de clonación de secuencias de
DNA que se encuentran en una muestra de DNA y no existen
en una segunda muestra, por lo general similar. Se utiliza para
seleccionar cDNA específico de tejido mediante sustracción
contra una genoteca de cDNA expresados ubicuamente, o para
clonar un gen eliminado (deleción) en un paciente con una
enfermedad mediante sustracción contra DNA normal.
Clonación posicional: clonación de un gen del que sólo se conoce
su localización cromosómica.
Clonación terapéutica: método propuesto para el tratamiento de
una enfermedad utilizando células desarrolladas mediante el
trasplante de núcleos de células del paciente en células ME
humanas. Véase figu ra 21-2.
Codón: un tripleto nucleótido (estrictamente en el mRNA pero,
por extensión, en el DNA genómico de codificación) que
especifica un aminoácido o una señal de detención de traduc­
ción.
Codón de terminación: codón UAG (ámbarj, UAA (ocre) o UGA
(ópalo) en un mRNA (y por extensión, en un gen) que señala
el extremo de un polipéptido.
Coeficiente de selección: posibilidad de fracaso de la reproduc­
ción para un cierto genotipo en relación con el genotipo de
mayor éxito. Véase sección 4.5.2.
Compensación de dosis: cualquier sistema que iguala la cantidad
de producto elaborado por genes que se encuentran en diferentes
números. En mamíferos, describe el mecanismo de activación de
X que asegura cantidades iguales de productos génicos codifica­
dos por X en células XX y XY. Véase figu ra 10-26.
Complejidad: complejidad de un genoma es la longitud total o la
proporción de secuencias únicas. En un genoma o una muestra
se encuentran muchas veces secuencias de complejidad baja.
Complementación: dos alelos se complementan si combinados
restablecen el fenotipo de tipo silvestre (véase recuadro 4-2).
Normalmente, los alelos sólo se complementan si se encuentran
en locus diferentes, aunque ocurren algunos casos de com ple­
mentación interalélica.
Complementariedad de bases: véase recuadro 6-3.
Conservación de sintenia: cuando se comparan mapas genéticos
de dos organismos, se conserva la sintenia si dos o más locus
que están localizados en el mismo cromosoma en un organismo
se encuentran juntos en un cromosoma en el otro.
Constitucional: genotipo, anormalidad o mutación que se encon­
traba en el óvulo fecundado, y por consiguiente se encuentra en
todas las células de una persona, distinto a un cambio somático.
Contig: lista o diagrama que muestra una disposición ordenada de
fragmentos clonados superpuestos que contienen en conjunto
la secuencia de un filamento de DNA originalmente continuo.
Conversión génica: intercambio genético sin reciprocidad que
ocurre de manera natural, en el que se altera una secuencia de

un filamento del DNA de tal manera que se torna idéntico a la
secuencia de otro filamento de DNA. Véase figu ra 11-10.
Cordado: véase recuadro 12.5.
Corion: una de las cuatro membranas extraembrionarias de los
mamíferos. Véase recuadro 3-8.
Cortador raro: nucleasa de restricción que corta DNA con poca
frecuencia porque la secuencia que reconoce es grande, contiene
uno o más CpGs, o ambos. Los ejemplos son NoA, SacII y
BssHll. Véase cuadro 4-1.
Cresta neural: grupo altamente versátil de células que dan lugar a
parte del sistema nervioso periférico, los melanocitos, cierto
hueso y músculo, la retina y otras estructuras. Las células de la
cresta neural se forman durante la neurulación como una
población específica de células que surgen a lo largo de los már­
genes laterales de los pliegues neurales y a continuación se
desprenden de la placa neural y migran a muchos sitios especí­
ficos en todo el cuerpo. Véase figu ra 3-16A.
Cromátide: desde el extremo de la fase S del ciclo celular (fig. 2-1)
hasta la anafase de la división celular, los cromosomas consisten
en dos cromátides hermanas. Cada una contiene una doble
hélice completa y las dos son copias exactas una de la otra.
Cromátide hermana: dos cromátides que se encuentran dentro de
un cromosoma aislado y unidas por un centrómero. Las cromá­
tides que no son hermanas se encuentran en cromosomas dife­
rentes pero homólogos.
Cromosoma marcador: cromosoma anormal extra sin origen
identificado.
Cruzamiento desigual (CDI): recombinación entre secuencias no
alélicas en cromátides que no son hermanas de cromosomas
homólogos. Véase Figura 11-7.
Dedo de cinc: elemento polipéptido que se estabiliza por la unión
de un átomo de cinc y confiere a las proteínas capacidad para
unirse específicamente a secuencias de DNA. Se encuentra
comúnmente en factores de transcripción. Véase figu ra 10-8.
Descomposición de mRNA mediada sin sentido: mecanismo
celular que degrada moléculas de mRNA que contienen un
codón de terminación prematuro (> 50 nt corriente arriba de
la última unión de empalme). Véase sección 11.4.4.
Desequilibrio de enlace: asociación estadística entre alelos particu­
lares en locus separados pero enlazados, que resulta normal­
mente de un haplotipo ancestral particular común en la
población estudiada. Un medio importante para mapeo de alta
resolución. Véanse figuras 13-10, 15-6y recuadro 15-2.
Deslizamiento de replicación: error en la replicación de una
secuencia de DNA repetida en tándem que da por resultado
que el filamento nuevo sintetizado tenga unidades repetidas
extra o menos comparado con la plantilla. Véase figu ra 11-5.
Desnaturalización: disociación de filamentos complementarios
para proporcionar DNA, RNA, o ambos, de filamento único.
Deuterostomas: véase recuadro 12-5.
DGGE (electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante):
método para detectar mutaciones mediante electroforesis de
productos de la PCR a través de geles que contienen un gradi­
ente de un desnaturalizante. Véase figu ra 18-3B.
dHPLC (cromatografía líquida desnaturalizante de alta ejecu­
ción): método para detectar mutaciones basado en las
propiedades de heterodúplex, capaz de alta sensibilidad y
rendimiento. Véase figu ra 18-4.
GLOSARIO [ 637
Diferenciación: proceso por el cual las células se especializan v se
comprometen a formar finalmente tipos específicos de células
maduras.
Digestión parcial: digestión, por lo general de DNA, mediante
una enzima de restricción, que se detiene antes que se havan
cortado todas las secuencias blanco. El objeto es producir frag­
mentos superpuestos. Véase figu ra 5-9.
DILAM: desorción/ionización láser asistida por matriz. Método
espectrométrico de masa que se utiliza comúnmente para iden­
tificar DNA o moléculas proteínicas. Véase recuadro 19-4.
Dinucleótido CpG: la secuencia 5 'CG 3' dentro de una molécu­
la de DNA más larga. Los dinucleótidos CpG son blancos para
un sistema específico de metilación d el DNA en mamíferos que
es importante para controlar la expresión génica.
Diploide: que tiene dos copias de cada tipo de cromosoma, la cons­
titución normal de la mayor parte de las células somáticas hu­
manas.
Dirigido a genes: modificación dirigida de un gen en una célula o
un organismo. Véanse figuras 20-7, 20-8, 20-10.
Disomía uniparental: célula u organismo en el cual las dos copias
de un par de cromosomas particular derivan de un padre. Según
el cromosoma relacionado, puede ser patogénica o no. Véanse
sección 2.5.4., recuadro 16-6.
Distal (de cromosomas): colocados comparativamente distantes
del centrómero.
Distancia genética: distancia en un mapa genético, definida por
fracciones de recombinación y la fu n ción de mapeo, y que se
mide en centiMorgans. Véase sección 13.1.
Distribución Hardy-Weinberg: la relación más simple entre fre­
cuencias génicas y frecuencias de genotipo que se encuentra en
una población bajo ciertas condiciones. Véase sección 4.5.
DNA codificante: DNA que codifica la secuencia de aminoácidos
de un polipéptido (o en ocasiones un RNA maduro funcional
que no especifica un polipéptido).
DNA minisatélite: un ordenamiento de tamaño intermedio (típi­
camente 0.1-20 kb de largo) de secuencias de DNA cortas
repetidas en forma de tándem. Véase recuadro 7-2. El DNA
minisatélite hipervariable es la base de la huella digital d e DNA
y muchos marcadores VNTR.
DNA recombinante: híbrido de DNA construido artificialmente
que contiene secuencias enlazadas de manera covalente con orí­
genes diferentes, por ejemplo, un vector con un inserto.
DNA repetitivo: secuencia de DNA que se encuentra en muchas
copias idénticas o similares en el genoma. Las copias pueden
repetirse o dispersarse en tándem.
DNA satélite: originalmente describía una fracción de DNA que
forma bandas menores separadas en la centrifugación de gradi­
ente de densidad por su composición poco común de bases. El
DNA está compuesto de ordenamientos muy largos de secuen­
cias de DNA repetidas en tándem. Véase sección. 9.4.1.
Dominante: en genética humana, cualquier carácter que se expre­
sa en un heterocigoto. Véase asimismo semidominante.
Duplicación segmentaria: existencia de bloques de secuencia de
DNA muy altamente relacionados en diferentes cromosomas o
en más de un sitio en un cromosoma. Véase figuras 12-12, 12-13-
Ectodermo: una de las tres capas germinativas del embrión. Se for­
ma durante la gastrulación en las células del epiblasto (véase fig.
3-15) y origina el sistema nervioso y los epitelios externos (véase
recuadro 3-5).
638 GLOSARIO
Edición de RNA: proceso natural en el cual ocurren cambios
específicos postranscripcionalmente en la secuencia de bases de
una molécula de RNA. Rara vez se observa en genes humanos.
Véasefigu ra 8-16.
Efecto fundador: frecuencia alta de un alelo particular en una
población porque esta última deriva de un número pequeño de
fundadores, uno o más de los cuales llevaba ese alelo.
Electroporación: método de transferencia de DNA a células in
vitro, utilizando un pulso breve de alto voltaje.
Elementos de respuesta: secuencia localizada por lo general a una
distancia corta corriente arriba de promotores que hacen que la
expresión génica responda a ciertas sustancias químicas en el
ambiente celular. En el cuadro 10-4 se encuentra una lista de
varios ejemplos.
Elementos límite: secuencias que definen los límites de dominios
de cromatina regulados coordenadamente en cromosomas.
Véase recuadro 8-2.
Empalme (sp licin gh normalmente em palme d e RNA en el cual se
eliminan las secuencias de RNA transcritas de intrones de un
transcrito primario y se empalman entre sí los transcritos de
exones en el mismo orden lineal que los exones (véanse figuras
1-14, 1-16). Es importante una forma de em palme d e DNA para
ensamblar inmunoglobulina productiva y genes receptores de
células T en linfocitos B y T, respectivamente (véanse figuras
10-28, 10-29).
Empalme (sp licin g) alternativo: uso natural de diferentes grupos
de secuencias de unión de empalme para formar más de un
producto a partir de un gen aislado. Véase sección 10.3.2,
recuadro 10-4.
Empalme de RNA: véase Empalme.
Endodermo: una de las tres capas germinativas del embrión. Se
forma durante la gastrulación a partir de células que migran
fuera de la capa del epiblasto (fig. 3-15). Véase el recuadro 3-5
para derivados del endodermo embrionario.
Endogamia: matrimonio con un familiar sanguíneo. El término es
comparativo, ya que finalmente todas las personas están rela­
cionadas. El coeficiente de endogam ia es la proporción de genes
de una persona que son idénticos p o r descendencia.
ENEC (elemento nuclear entremezclado corto): clase de familias
de secuencias de DNA moderada a altamente repetidas, de la
cual la que se conoce mejor en humanos es la familia repetida
Alu. Véanse cuadro 9-15 y figuras 9-7, 9-8.
ENEL: demento nuclear entremezclado ¿irgo. Clase de secuencias
de DNA repetidas que constituyen alrededor de 20% del geno­
ma humano (cuadro 9-15). Algunos son elementos transpos-
ables activos. Véanse figuras 9-17, 9-18.
Enlace: tendencia de caracteres (fenotipos, alelos marcadores, etc.)
a cosegregarse en una genealogía porque sus determinantes se
encuentran juntos entre sí en un cromosoma particular.
Epiblasto: capa de células del embrión en etapa previa a la gastru­
lación que dará lugar a las tres capas germinativas del embrión
propiamente dicho, aunado al ectodermo y el mesodermo
extraembrionarios. Compárese con hipoblasto.
Epigenético: heredable (de la célula madre a la célula hija, o en
ocasiones del padre al hijo), pero no producido por un cambio
en la secuencia del DNA. La m etilación d el DNA es el mecanis­
mo epigenético mejor comprendido.
Episoma: cualquier secuencia de DNA que puede existir en forma
extracromosómica autónoma en la célula. Suele utilizarse para
describir formas de DNA autorreplicantes y extracromosómicas.
Epitopo: parte de un antígeno con el cual reacciona un anticuerpo
particular.
Especificidad: en pruebas, una medida del desempeño de una
prueba. Especificidad = (1 - tasa de positivas falsas), véase fig u ­
ra 18-17.
Espliceosoma: complejo ribonucleoproteínico que se utiliza en el
em palme (splicing) de RNA.
EST (marcado de secuencia expresada): véase recuadro 8-1.
Estadísticas bayesianas: rama de la estadística que forma la base
de estimación de mucho riesgo genético. Véase recuadro 18-4,
figu ra 18-15.
Estratificación: existencia de grupos diferenciados genéticamente
dentro de una población que se supone es homogénea.
Estructura secundaria: regiones de un ácido nucleico o una pro­
teína de filamento único/una molécula polipéptida en las que
ocurre la unión química entre nucleótidos o aminoácidos espa­
ciados distantemente que da por resultado estructuras comple­
jas. Con frecuencia, la estructura secundaria se debe a la unión
de hidrógeno intrafilamentaria (figuras 1-7, 1-24).
Eucromatina: fracción del genoma nuclear que contiene DNA
activo transcripcionalmente y que, a diferencia de la heterocro-
matina, adopta una conformación relativamente extendida.
Eugénica: “mejoramiento” de una población mediante el
apareamiento selectivo de los “mejores” tipos (eugénica positi­
va), o la prevención de tipos “indeseables” por apareamiento
(eugénica negativa).
Euploidía: estado de poseer uno o más grupos completos de cro­
mosomas con ninguno extra o faltante; el opuesto de aneu-
ploidía.
Exclusión alélica: mecanismo por el cual se expresa sólo uno de los
dos alelos de la inmunoglobulina en linfocitos B, o alelos de
receptor de célula T en linfocitos T. En forma más general,
cualquier mecanismo que ocurre de manera natural que causa
la expresión de un alelo solamente. Véase recuadro 10-4.
Exhibición de fago: método de expresión de clonación en el que
se insertan genes extraños en un vector fago y se expresan para
dar polipéptidos que se exhiben en la superficie (cubierta pro-
teínica) del fago.
Exhibición diferencial: véase recuadro 5-1.
Exón: segmento de un gen representado en el producto del DNA
maduro. Los exones individuales pueden contener DNA de
codificación, DNA no codificante (secuencias no traducidas), o
ambos, véanse figuras 1-14, 1-19.
Expresión constitutiva: estado en el cual un gen es activo en for­
ma permanente. Las mutaciones que dan por resultado una
expresión constitutiva inapropiada suelen ser patógenas.
Expresión monoalélica: expresión de sólo una de las dos copias de
un gen en una célula, por inactivación de X, impresión u otro
cambio epigenético, o debido al reordenamiento génico que se
lleva a cabo con los genes de inmunoglobulina y del receptor de
célula T. Véase recuadro 10-4, para ejemplo.
Expresión variable: extensión o intensidad variable de signos
fenotípicos en personas con un genotipo determinado. Véase,
por ejemplo, la figu ra 4-5C.
Extremo romo: fragmento de DNA que no tiene extensiones de
filamento único.
Extremos adherentes (terminales cohesivas): proyecciones cortas
de filamento único de una molécula de DNA de doble filamen­
to que se forman típicamente por digestión de ciertas enzimas
de restricción. Pueden asociarse moléculas Can con extremos

adherentes complementarios y a continuación unirse de manera
covalente utilizando ligasa d e DNA para formar moléculas de
DNA recombinante. Véanse figuras 4-3, 4-4.
Familia multigénica: grupo de locus relacionados evolutivamente
dentro de un genoma, cuando menos uno de los cuales puede
codificar un producto funcional. Véase sección 9.3.
Familias CEPH: grupo de familias reunido por el Centre d ’Etude
du Polymorphisme Humain (Centro de estudio de polimorfismo
humano) en París para ayudar en la producción de mapas
estructurales marcador-marcador.
Farmacogenética: estudio de la influencia de genes alelos indivi­
duales en el metabolismo o la función de fármacos.
Farmacogenómica: uso de recursos del genoma (secuencias del
genoma, perfiles de expresión, etc.) a fin de identificar blancos
para nuevos fármacos.
Fase (de marcadores enlazados): relación (acoplamiento o recha­
zo) entre alelos en dos locus enlazados. Si el alelo A l se encuen­
tra en el mismo cromosoma físico que el alelo B l, están en
acoplamiento; si se encuentran en diferentes homólogos
parentales, están en rechazo. Véase figu ra 13-6.
Fase (del ciclo celular): las fases G l, S, G2, M y Go (véasefig . 2-1).
Fase (de un intrón): término utilizado para clasificar intrones en
secuencias de codificación según la posición en la que inte­
rrumpen el mensaje (véase recuadro 12-2).
Fenotipo: características observables de una célula o un organismo,
incluyendo el resultado de cualquier estudio que no sea una
prueba directa del genotipo.
Fibra de cromatina: arrollamiento de 30 mm de DNA e histonas
que se piensa representa la conformación básica de la cromati­
na. Véast figu ra 2-3.
Filamento antisentido (filamento plantilla): filamento de DNA
de un gen que utiliza la polimerasa de RNA como una planti­
lla para la síntesis de mRNA, durante la transcripción. Véase
figura 1-12.
Filamento guía: en la replicación del DNA, el filamento que se
sintetiza en forma continua {véase figu ra 1-9).
Filamento plantilla: en la transcripción, el filamento de DNA que
forma pares de bases con el transcrito de RNA naciente. Véase
figu ra 1-12.
Filamento retardado: en la replicación del DNA, el filamento que
se sintetiza como fragmentos Okazaki (véase figu ra 1-9).
Filamento de sentido: filamento de DNA de un gen cuya secuen­
cia es complementaria al filamento de la plantilla (antisentido)
e idéntico a la secuencia de RNA transcrita (excepto que el
DNA contiene T en tanto que el RNA contiene U). Las
secuencias génicas mencionadas siempre son del filamento de
sentido en la dirección 5'~* 3’. Véase figu ra 1-12.
Filamentos complementarios: se dice que dos filamentos de áci­
do nucleico son complementarios en secuencia si pueden for­
mar suficientes pares de bases para generar una estructura de
doble filamento estable.
Filogenia: clasificación de organismos según la relación evolutiva
percibida. Véanse figuras 12-22 a 12-24.
Fracción de recombinación: para un par de locus determinado, la
proporción de meiosis en que están separados por recombi­
nación. Suele indicarse como 0. Los valores 0 varían entre 0 y
0.5. Véase sección 13.1.
Frecuencia génica: proporción de todos los alelos en un locus que
son el alelo en cuestión. Véase la sección 4.5. Realmente sig­
GLOSARIO 639
nifica frecuencia de alelos, pero en la actualidad está muy bien
establecido el uso de frecuencia génica para poder cambiarse.
Fusión céntrica: véase Fusión robertsoniana.
Fusión robertsoniana: reordenamiento cromosómico que con­
vierte dos cromosomas acrocéntricos en uno metacéntrico o
submetacéntrico. Véase figu ra 2-21. En ocasiones llamada
fusión céntrica, aunque el punto de intercambio se encuentra en
realidad en el brazo corto próxima! y no en el centrómero.
Gastrulación: proceso altamente dinámico que comprende la con­
versión del embrión de dos capas anterior a la gastrulación (que
consiste en epiblasto más hipoblasto) en otro que incluye las tres
capas germinativas: ectodermo, mesodermo y endodermo.
Gen candidato: en clonación posicional, un gen de localización
cromosómica apropiada que se sospecha es el gen originario de
una enfermedad. La sospecha se estudiaría buscando muta­
ciones en pacientes.
Gen de fusión (híbrido): gen que contiene la secuencia de codifi­
cación de dos genes diferentes, por lo general creado mediante
cruzamiento desigual (fig. 9-17) o translocaciones cromosómi-
cas (fig. 18-7A).
Gen modificador: gen cuya expresión puede influir un fenotipo y
que resulta de la mutación en otro locus. Véase sección 16.6.3.
Gen reportero: gen que se utiliza para estudiar la capacidad de una
secuencia corriente arriba unida a él para causar su expresión.
Las posibles secuencias reguladoras de acción cis pueden
acoplarse a un gen reportero y transfectarse a células adecuadas
para estudiar su función. Alternativamente, los animales trans-
génicos (y otros organismos) se preparan con frecuencia con un
gen reportero no promotor integrado aleatoriamente en los cro­
mosomas, de tal manera que la expresión del reportero marca la
presencia de un promotor eficiente. Véase recuadro 20-4.
Gen supresor de tumor (GST): gen cuya función normal es
inhibir o controlar la división celular. Típicamente, en tumores
están inactivados los GST. Véase sección 17.4.
Genes hox: subgrupo de genes homeobox que están organizados
en racimos y tienen funciones importantes en la paternidad
anterior y posterior. Véanse figuras 3-10 y 3-12.
Genoma: grupo total de diferentes moléculas de DNA de un
organelo, una célula o un organismo. El genoma humano con­
siste en 25 moléculas de DNA distintas, la molécula de DNA
mitocondrial, aunada a 24 diferentes moléculas cromosómicas
de DNA. Cf, transcriptoma, proteoma.
Genómica funcional: análisis de la función génica a gran escala,
llevando a cabo análisis paralelos de expresión/función génicas
para grandes números de genes, incluso todos los de un genoma.
Genoteca de DNA: véase recuadro 8-1.
Genoteca de expresión: genoteca de cDNA clonados en un vector
que les permite expresarse. Véase sección 5.6.
Genotipo: constitución genética de un individuo, sea en su totali­
dad o en un locus específico.
Grupo de células híbridas: conjunto de células híbridas somáticas
o híbridas p o r radiación que se utiliza para mapeo físico.
Haploide: describe una célula (típicamente un gameto) que sólo
tiene una copia aislada de cada cromosoma (p. ej., los cromo­
somas 23 en espermatozoos y óvulos humanos).
Haploinsuficiencia: un locus muestra haploinsuficiencia si la pro­
ducción de un fenotipo normal requiere más producto génico
que la cantidad que produce una copia aislada. Véanse sección
16.4.2, cuadro 16-2.
640 | GLOSARIO
Haplotipo: serie de alelos que se encuentran en locus enlazados en
un mismo cromosoma.
Hemicigoto: que sólo tiene una copia de un gen o una secuencia
de DNA en células diploides. Los varones son hemicigotos para
la mayor parte de los genes en los cromosomas sexuales. Las
deleciones que ocurren en un autosoma producen hemicigosi-
dad en varones y mujeres.
Herencia: proporción de la razón de una característica que se debe
a causas genéticas. Véase recuadro 4-4.
Herencia matrilineal: transmisión solamente por la madre, pero a
los niños de cualquier sexo; patrón de herencia mitocondrial.
Véase figu ra 4-4.
Hermanos: hermanos o hermanas.
Heterocigosidad media: de un marcador, la posibilidad de que
una persona seleccionada aleatoriamente sea heterocigota. Una
medida de la utilidad del marcador para análisis de enlace (véase
sección 11.2.2).
Heterocigoto: individuo que tiene dos alelos diferentes en un
locus particular.
Heterocigoto compuesto: personas con dos alelos mutantes dife­
rentes en un locus.
Heterocromatina: región cromosómica que permanece altamente
condensada durante todo el ciclo celular y no muestra pruebas,
o muy pocas, de expresión génica activa. La heterocromatina
constitutiva se encuentra en los centrómeros y algunas otras
regiones (para lo cual véase fig. 2-15).
Heterodúplex: DNA de doble filamento en el cual hay cierta
desigualdad entre los dos filamentos. Importante en la detec­
ción de mutaciones -véase sección 18.3-.
Heterogeneidad alélica: existencia de muchos alelos que causan
diferentes enfermedades en un locus. La situación es la pre­
dominante en casos de enfermedades causadas por pérdida de
función de un gen -véase, por ejem ^ o , figura 16-1-.
Heterogeneidad de locus: determinación de la misma enfermedad
o fenotipo por mutaciones en locus diferentes. Un problema
común en mapeo de enfermedades genéticas. Véanse secciones
4.2.4, 16.7.2.
Heteroplasmia: mosaicismo, por lo general dentro de una célula
aislada, para variantes mitocondriales de DNA. Véanse sec­
ciones 4.2.5, 11.4.2.
Hibridación de fluorescencia in situ (FISH): hibridación in situ
utilizando una sonda de DNA o RNA marcada con fluorescen­
cia. Una técnica fundamental en genética molecular moderna
-véanse figuras 2-17, 2-18-.
Hibridación genómica comparativa (HGC): uso de hibridación
de fluorescencia in situ competitiva para detectar regiones cro-
mosómicas que están amplificadas o eliminadas, especialmente
en tumores. Véase figu ra 17-3.
Hibridación in situ : forma de hibridación molecular en la que el
ácido nucleico blanco (DNA) está desnaturalizado dentro de las
preparaciones cromosómicas (hibridación cromosómica in situ) o
inmovilizado el RNA dentro de las células de cortes de tejidos
en un portaobjetos para microscopio (hibridación tisular in situ
-créase fig. 6-15) o dentro de la totalidad de los embriones (hi­
bridación in situ d e m ontaje total -véase fig. 7-15).
Hibridación in situ de montaje total: véase Hibridación in situ.
Híbrido de célula somática: célula construida artificialmente for­
mada por la fusión de dos tipos diferentes de células somáticas,
en especial células de distintas especies. Los células híbridas
humano-roedor han resultado medios valiosos para mapeo.
Véase recuadro 8-4.
Híbrido por radiación: en mapeo físico humano, una célula de
roedor que contiene múltiples fragmentos pequeños de cromo­
somas humanos. Producido mediante fusión con una célula
humana radiada letalmente. Los grupos híbridos por radiación
muestran un mapeo muy rápido de SSM. Véase figu ra 10-4).
Hipermorfo: alelo que produce una cantidad o actividad mayor de
producto.
Hipoblasto: capa de células embrionarias antes de la gastrulación
que da lugar al endodermo extraembrionario.
Hipomorfo: alelo que produce una cantidad o actividad reducida
de producto.
Hipótesis de dos golpes: teoría de Knudson indicativa de que los
cánceres hereditarios requieren dos mutaciones sucesivas para
afectar una célula aislada. Véase figu ra 18-5.
Hipótesis de un gen-una enzima: hipótesis planteada por Beadle
y Tatum, en 1941, que indica que la principal acción de cada
gen era especificar la estructura de una enzima. Muy impor­
tante históricamente, pero hoy en día sólo se considera como
parte de la gama de funciones de los genes.
Homocigoto: individuo que tiene dos alelos idénticos en un locus
particular. Con propósitos clínicos, una persona suele describirse
como homocigoto AA si tiene dos alelos que funcionan nor­
malmente, u homocigoto aa cuando presenta dos alelos patogéni­
cos en un locus, prescindiendo de que los alelos sean de hecho
completamente idénticos a nivel de la secuencia de DNA. La
homocigosidad para alelos idénticos p o r descendencia se denomi­
na autocigosidad.
Homología de secuencia: medición de la similitud de las secuen­
cias de dos ácidos nucleicos o dos polipéptidos.
Homólogos (cromosomas): las dos copias de un cromosoma en
una célula diploide. A diferencia de las cromátides hermanas,
los cromosomas homólogos no son copias entre sí; uno se
heredó del padre y el otro de la madre.
Homólogos (genes): dos genes o más cuyas secuencias están rela­
cionadas significativamente por una relación evolutiva cercana,
sea entre especies (ortólogos) o dentro de una especia (parálogos).
Homoplasmia: célula u organismo que tiene todas las copias del
DNA mitocondrial idénticas. Cf. heteroplasmia.
Huella digital de DNA: método actualmente obsoleto para iden­
tificar a una persona con propósitos legales o forenses basado en
sondeos Southern blot con una sonda minisatélite hipervaria-
ble. Véase figu ra 18-19.
Identidad por descendiente (IPD): alelos en un individuo o en
dos personas que se sabe son idénticos porque ambos se
heredaron de un ancestro común demostrable.
Identidad por estado (IPE): alelos que parecen idénticos, pero
pueden ser o no idénticos p o r descendiente porque no hay una
fuente común demostrable. Véase figu ra 15-2.
Impresión (impronta): determinación de la expresión de un gen
por su origen parental. Véanse sección 10.5.4. y recuadro 16-6.
Inactivación de X (lionización): inactivación de uno de los dos
cromosomas X en las células de mamíferos hembra por una for­
ma especializada de impronta genética.. Véase Sección 10.5.6.
Inestabilidad microsatélite: fenómeno característico de ciertas
células tumorales en el cual, durante la replicación del DNA, el
número de copias repetidas de microsatélites está sometido a
cambios aleatorios. Se abrevia INM, IMS o ERR (error de repli­
cación). Véase figu ra 17-7.
Intensificación genética: posible aplicación de tecnologías de
genética molecular para modificar un fenotipo humano normal

en cierta forma que se considere benéfica. Véase recuadro d e éti­
ca 3, en el capítulo 21.
Intensificador: grupo de elementos de secuencia corta que estimu­
lan la transcripción de un gen y cuya función no depende
críticamente de su posición u orientación precisa. Véase
recuadro 10-2.
Intensificador de empalme: secuencia (que puede ser exónica o
intrónica) que incrementa la posibilidad de que un sitio poten­
cial de empalme cercano se utilice realmente. Véanse secciones
11.4.3 y 16.4.1.
Intercambio de cromátide hermana (ICH): acontecimiento de
recombinación que incluye cromátides hermanas. Debido a que
estas últimas son duplicados una de la otra, estos intercambios
no deben tener ningún efecto a menos que sean desiguales. Sin
embargo, un incremento de la frecuencia de ICH indica daño
del DNA.
Intercambio desigual de cromátides hermanas (IDCH): recom­
binación entre secuencias no alélicas en cromátides hermanas
de un cromosoma aislado. Véase Figura 11-7.
Interfase: todo el tiempo del ciclo celular en el que no se está divi­
diendo una célula.
Interferencia: en meiosis, tendencia de un cruzamiento a inhibir
un cruzamiento adicional dentro de la misma región de los cro­
mosomas. Véase sección 13.1.3.
Intrón: DNA no codificante que separa exones vecinos en un gen.
Durante la expresión génica, se transcriben intrones al RNA,
pero a continuación se eliminan las secuencias del intrón del
pre-mRNA mediante empalme (splicing). Véase figu ra 1-14.
Puede clasificarse según el mecanismo de empalme (véase
recuadro 12-1) o, si se separan secuencias de codificación del
DNA, por su localización precisa dentro de codones. (Véase
recuadro 12-2).
Inversión paracéntrica: inversión de un segmento cromosomico
que no incluye el centròmero. Véase figu ra 2-20.
Inversión pericéntrica: inversión de un segmento cromosomico
que incluye el centròmero. Véase figu ra 2-20.
Isla CpG: tira corta de DNA, con frecuencia < 1 kb, que contiene
dinucleótidos CpG n o mediados frecuentes. Las islas CpG tienden
a marcar los extremos 5’ de los genes. Véase recuadro 9-3.
Isocromosoma: cromosoma simétricamente anormal, que consiste
en dos brazos idénticos, que normalmente son el brazo corto o
el brazo largo de un cromosoma normal.
Isoformas/isozimas: formas alternas de una proteína o una enzima.
Isogénico: dos o más organismos o células que tienen genotipos idén­
ticos. Por ejemplo, diferentes ratones que pertenecen a una cepa
endogàmica particular, por ejemplo, C57B10/J, son isogénicos.
Knock-down: inhibición dirigida de la expresión de un gen medi­
ante, por ejemplo, el uso de RNA antisentido o si RNA para
unirse a transcritos de RNA.
Knock-out condicional: mutante por ingeniería que causa pérdi­
da de la función de un gen bajo ciertas circunstancias (p. ej.,
aumento de la temperatura), o en algunas células, pero no en
otras. Véase sección 20.2.6.
Lectura de pruebas: mecanismo enzimàtico por el cual se identi­
fican y corrigen los errores de replicación del DNA.
Ligadura: formación de un enlace 3'- 5' fosfodiéster entre nucleó-
tidos en los extremos de dos moléculas (ligadura intermolecular)
o los dos extremos de la misma molécula (ligadura intramolecu­
lar, ciclización).
GLOSARIO I 641
Linaje: serie de células que se origina de una célula progenitora.
Línea germinal: las células germinales y las células que les dan
lugar; otras células del cuerpo constituyen el soma.
Liposoma: vesícula lípida sintética que se utiliza para transportar una
molécula de interés al interior de una célula. Véase figu ra 21-8.
Locus: localización cromosómica única que define la posición de
un gen individual o la secuencia de DNA.
Locus de carácter cuantitativo (LCC): locus importante para
determinar el fenotipo de un carácter continuo. En la sección
15.6.8 se comenta la investigación sobre el LCC subyacente a la
obesidad humana.
Manifestación de heterocigoto: portador femenino de un padeci­
miento recesivo enlazado a X que muestra algunos síntomas
clínicos, posiblemente por inactivación de X sesgada. Véase sec­
ción 4.2.2.
Mapa genético: véase recuadro 8-1.
Mapeo de autocigosidad: para trastornos autosómicos recesivos
incluye la búsqueda de grandes genealogías endogámicas para
locus en los que todos los individuos afectados son autocigotos
para el mismo alelo. Véase figu ra 13-8.
Mapeo de exclusión: mapeo genético con resultados negativos,
demostrativo de que el locus en cuestión no se mapea en una
localización particular. Especialmente útil para excluir un posi­
ble gen candidato sin la labor de selección de mutación.
Mapeo de (unción: ecuación matemática que describe la relación
entre la fracción de recombinación y la distancia genética. El
mapeo de función depende de la extensión a la cual la interferen-
cia impide recombinantes dobles cercanos. Véase sección 13.1.3.
MAPH: hibridización multiplex con sonda amplificable: método
para detectar deleciones o duplicaciones de exones. Véase
recuadro 18-1.
Marcador (cromosoma): cromosoma extra de origen no identifi­
cado.
Marcador (genético): cualquier carácter m endeliano polimórfico
que puede utilizarse para seguir un segmento cromosómico a
través de una genealogía. Los marcadores genéticos suelen ser
polimorfismos de DNA. Véase recuadro 13-1.
Marcador de DNA: véase M arcador (genético).
Marcadores polimórficos: véase recuadro 8-1.
Marco de lectura: durante la traducción, la forma en que se lee la
secuencia continua del mRNA como una serie de codones
tripletos. Para cualquier mRNA hay tres posibles marcos de
lectura y el marco de lectura correcto se establece por el
reconocimiento correcto del codón de inicio AUG.
Marco de lectura abierto (MLA): secuencia de DNA significati­
vamente larga en la que no hay codones de terminación, cuan­
do menos en uno de los posibles marcos de lectura. Son
factibles seis marcos de lectura para un DNA dúplex porque
cada filamento puede tener tres marcos de lectura.
Masa celular interna: grupo de células localizado dentro del blas-
tocisto que dará lugar al embrión propiamente dicho. Véase
figura 3-13.
Matriz extracelular: sustancia parecida a un retículo que se
encuentra dentro del espacio extracelular y se asocia con la
membrana basal de la superficie celular. Proporciona un
andamiaje al cual se adhieren las células y sirve para promover
la proliferación celular.
Meiosis informativa: en análisis de enlace, una meiosis es infor­
mativa si los genotipos en la genealogía permiten decidir si es
642 GLOSARIO
recombinante o no (para un par de locus determinado). Véase
recuadro 13-2.
Mendeliano: de un patrón de genealogía, que se ajusta a uno de los
patrones arquetípicos que se muestran en la figu ra 4-2. Un
carácter dará un patrón de genealogía mendeliana si está deter­
minado en la localización de un cromosoma, prescindiendo de
que el determinante sea o no un gen en el sentido de los genetis­
tas moleculares.
Mesodermo: una de las tres capas germinativas del embrión. Se
forma durante la gastrulación por células que migran fuera del
epiblasto. Véanse figu ra 3-15 y recuadro 3-5 para derivados del
mesodermo embrionario.
Metafase: etapa de la división celular (mitosis o meiosis) en la que
los cromosomas están contraídos al máximo y alineados en el
plano ecuatorial (placa de metafase) de una célula. Véanse fig u ­
ras 2-10, 2-11, 2-15.
Metazoarios: animales multicelulares en oposición a protozoarios
unicelulares.
Mediación de DNA: en el contexto del DNA humano, casi siem­
pre significa conversión de citosina (por lo general en un dinu-
cleótido CpG) en una 5-metilcitosina.
Microdeleción: deleción cromosomica muy pequeña para obser­
varse al microscopio (típicamente < 3 Mb).
Microordenación: una ordenación miniatura de diferentes secuen­
cias de DNA u oligonucleótidos en una superficie de vidrio que
se pretende utilizar en una valoración de hibridación. La secuen­
cia pueden ser moléculas de DNA preformadas que se deposi­
taron utilizando automatización o secuencias de oligonucleótidos
que se sintetiza in situ para hacer un chip de DNA.
Micro-RNA (miRNA): moléculas cortas (22 nt) de RNA codifi­
cadas dentro de genomas normales que tienen un sitio en la regu­
lación de la expresión génica y también pueden ser de
estructura cromatínica. En ocasiones, se denominan RNA tem­
poral pequeño (stRNA, del inglés, tem poral pequeño, RNA).
Véanse figuras 9-6, 20-12.
Microsatélite: tramo pequeño (por lo general menos de 0.1 kb) de
repeticiones tándem de una secuencia de DNA muy simple, por
lo general 1.4 bp, por ejemplo (CA)n. Con frecuencia polimor­
fica, proporcionó el medio principal para el mapeo genético
durante la década de 1990. En ocasiones también se describe
como polimorfismo RTS (repetición tándem simple) o RSS
(repetición de secuencia simple). Véanse figuras 7-7, 7-8.
Microtúbulos: cilindros huecos largos constituidos por polímeros de
tubulina que forman parte del citoesqueleto (véase recuadro 3-2).
Minisecuenciación: método para detectar variantes de secuencia
en una posición predefinida mediante la secuenciación de tan
sólo uno o dos nucleótidos corriente abajo de un cebador. Se
utiliza con frecuencia en un formato de microordenamiento.
Veassfigu ra 18-9B.
Molécula reportera: molécula cuya presencia se detecta fácilmente
(p. ej., una molécula fluorescente) que está unida a una secuencia
de DNA que se desea vigilar. Véase, por ejemplo, la figura 6-7.
Mosaico: individuo que tiene dos o más líneas de células genética­
mente diferentes derivadas de un solo cigoto. Las diferencias
pueden ser mutaciones de punto, cambios cromosómicos, etc.
Véast figu ra 4-10.
Mosaico germinal (gonadal o gonosómico): individuo con un
subgrupo de células de la línea germinal que llevan una
mutación que no se encuentra en otras células de dicha línea.
Véase figu ra 4-9.
Multifactorial: una característica determinada por alguna combi­
nación no especificada de factores genéticos y ambientales. Cf,
poligénica.
Mutación de cambio de estructura: mutación que altera el mar­
co de lectura traduccional normal de un mRNA añadiendo o
eliminando varias bases que no son múltiplos de tres.
Mutación dinámica: repetición expandida inestable que cambia
de tamaño entre el padre y el hijo. Véase sección 16.6.4.
Mutación knock-in: mutación dirigida que reemplaza la actividad
de un gen por la de un gen introducido (por lo general un ale­
lo). Véase figu ra 20-14.
Mutación knock-out: inactivación dirigida de un gen dentro de
una célula intacta.
Mutación de punto: mutación que causa una alteración pequeña
en la secuencia de DNA en un locus. El significado es un poco
impreciso: cuando se compara con las mutaciones cromosómi-
cas, el término mutación de punto podría utilizarse para
incluir cambios muy grandes (pero submicroscópicos) dentro
de un gen aislado, en tanto que cuando se discuten mutaciones
en un locus aislado, normalmente las mutaciones de punto sig­
nifican sustitución, inserción o deleción sólo de un nucleótido
aislado.
Mutación de sentido erróneo: sustitución de un nucleótido que
da por resultado el cambio de un aminoácido. Véase recuadro
11-3.
Mutación sin sentido: mutación que ocurre dentro de un codón
y que lo cambia a un codón de detención. Véase recuadro 11-3.
Mutación silenciosa (sinónimo): mutación que cambia un codón
pero no altera el aminoácido codificado. Véase recuadro 11-3.
Estas mutaciones pueden tener aún efectos en el empalme o la
estabilidad del mRNA.
Mutagénesis dirigida por sitio: producción de un cambio especí­
fico predeterminado en una secuencia de DNA. Puede hacerse
in vitro en DNA clonado (secciones 5.5.2 y 5.5.3) o in vivo
mediante recombinación homologa (sección 20.2.6).
Mutagénesis insercional: mutación (por lo general abolición de la
función) de un gen por inserción dentro del mismo de una
secuencia de DNA no relacionada.
Negativo dominante (antimorfo): gen mutante cuyo producto
puede inhibir la función del producto del gen tipo silvestre en
heterocigotos. Véase, por ejemplo, figu ra 16-4.
Neomorfo: alelo con actividad o producto nuevo.
No disyunción: falta de separación (desunión) de cromosomas
(cromátides hermanas en la mitosis o la meiosis II; homólogos
en par en la meiosis I) en la anafase. La principal causa de anor­
malidades cromosómicas numéricas. Véase sección 2.5.2.
No paramétrico: en análisis de enlace, un método que no depende
de un modelo genético específico, como el análisis de pares de
hermanos afectados.
No penetrancia: situación en la que una persona que lleva un ale­
lo que normalmente causa un fenotipo dominante no muestra
ese fenotipo. Un efecto de otros locus genéticos o del ambiente.
Un error en la asesoría genética. La figu ra 4-5B muestra un
ejemplo.
Northern blot: moléculas de membrana que llevan RNA que se
fraccionaron de tamaño mediante electroforesis en gel y se uti­
lizan como blanco para la valoración de hibridación. Se utiliza
para detectar los tamaños de transcritos de un gen de interés en
un conjunto de tejidos adultos o fetales. Véase figura 5-13.

Notocordio: estructura flexible parecida a un bastón que forma el
eje de apoyo del cuerpo en cordados y vertebrados simples y en
embriones de vertebrados más complejos.
Nucleosoma: unidad estructural de cromatina. "Véase figu ra 2-3.
Número MIM: número en el catálogo de un gen o carácter
mendeliano, en la lista de la base de datos OMIM.
Oligogénico: carácter determinado por un número pequeño de
genes que actúan juntos.
Oligonucleótido enlazador (adaptador): oligonucleótido de
doble filamento que puede ligarse a una molécula de DNA de
interés, diseñado para contener alguna característica deseable,
por ejemplo, un sitio de restricción favorable.
Oligonucleótido específico de alelo (OEA): oligonucleótido sin­
tético, típicamente ca. 20 nt de largo, cuya hibridación a su
secuencia blanco puede alterarse por una incompatibilidad de
un par de bases aislado bajo condiciones adecuadas. Los OEA
se utilizan como sondas de hibridación específicas de alelo
(véase fig. 6-11), o como cebadores específicos de alelo en la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Véase ARMS.
Oligonucleótidos degenerados: serie de oligonucleótidos sinteti­
zados en paralelo que proporcionan la flexibilidad del nucleóti-
do en ciertas posiciones de éste. Cuando se utilizan como
sondas de hibridación o fragmentos precursores de PCR
pueden hibridar a una familia de secuencias o amplificarla.
OMIM: (del inglés, Qn-line Afendelian /nheritance in Afán).
Herencia mendeliana en el hombre en línea, la base de datos
central de genes humanos y caracteres mendelianos (http:
//www3.ncbi.nlm.nih.gov/omim/. Los números M IM son los
números índice para entradas en OMIM.
Oncogen: gen relacionado con el control de la proliferación celu­
lar que cuando se activa en exceso puede ayudar a transformar
una célula normal en otra tumoral. Véase cuadro 17-1.
Originalmente, se utilizó la palabra sólo para las formas acti­
vadas del gen y el gen celular normal se denominó proto-
oncogen, pero esta distinción no se reconoce ampliamente en la
actualidad.
Ortólogo: uno de un grupo de genes homólogos en diferentes
especies (p. ej., PAX3 en humanos y Pax3 en ratones). Véase
recuadro 12-3.
Palíndrome: una secuencia de DNA como ATCGAT que es igual
cuando se lee en la dirección 5,—* 3' en cada filamento. Por
ejemplo, el reconocimiento DNA-proteína mediante enzimas de
restricción se basa con frecuencia en secuencias palindrómicas.
Par erróneo de filamento deslizado: véase Deslizamiento de repli-
cación.
Paradoja de valor C: falta de una relación directa entre el con­
tenido de DNA en las células de un organismo (el valor C) y la
complejidad del mismo.
Parálogo: uno de un grupo de genes homólogos dentro de una
misma especie. Véase recuadro 12-3.
Parámetrico: en análisis de enlace, un método como un análisis de
calificación lod estándar, que requiere un modelo genético
estrechamente especificado.
Pareo: matrimonio entre personas de fenotipo o genotipo similar
(p. ej., las personas altas tienden a casarse con personas altas, los
individuos sordos tienden a casarse con individuos sordos;
algunas personas prefieren casarse con familiares). El pareo
puede producir una distribución que no se corresponde con la
de Hardy-Weinberg de genotipos en una población.
¡ 643
PCR de tiempo real: véase recuadro 5-1.
PCR-Alu: véase recuadro 5-1.
PCR-TI (PCR de transcriptasa inversa): véase recuadro 5-1.
Penetrancia: frecuencia con la cual se manifiesta un genotipo en sí
mismo en un fenotipo determinado.
Pérdida de heterocigosidad (PeH]: homocigosidad o hemicigosi-
dad en un tumor u otra célula somática cuando el genotipo cons­
titu cion al es heterocigoto. Prueba del cambio genético
somático. Véase figu ra 17-6, 17-7.
Perfil de DNA: uso de genotipos en una serie de locus polimórfi-
cos para reconocer a una persona, por lo general con propósitos
legales o forenses. Véase sección 18.7.
Perfil de expresión: obtención de un cuadro amplio del genoma
de niveles de mRNA, normalmente mediante análisis de micro-
ordenación del cDNA celular total (fig. 17-18, 19-8). Véase
asimismo SAGE.
Pintado cromosómico: marcado de un cromosoma completo con
fluorescencia mediante un procedimiento de PISH en el que la
sonda es una combinación de muchas secuencias diferentes de
DNA de un cromosoma aislado.
Plasticidad: véase Transdiferenciación.
Pliegues: módulos de estructuras proteínicas tridimensionales.
Casi todas las estructuras proteínicas están formadas por un
repertorio limitado de pliegues que se comparten entre muchas
proteínas. Véase sección 19.4.4.
Pluripotente: estrictamente, significa la capacidad para dar lugar a
muchos tipos de células diferentes, pero no a todos los que
puede originar el cigoto. Se dice que el cigoto y las células
inmediatas que origina son totipotenciales, pero la diferen­
ciación por la etapa de blastocisto significa que las células de la
masa celular interna son pluripotenciales en lugar de totipoten­
ciales.
PNU (polimorfismo de nucleótido único): cualquier variación
polimórfica en un nucleótido aislado. Los PNU incluyen RFLP,
pero también otros polimorfismos que no alteran ningún sitio
de restricción. Aunque menos informativos que los
microsatélites, los PNU son más factibles de calificación automa­
tizada a gran escala.
Poliadenilación: adición de residuos típicamente 200 A al extremo
3’ de un mRNA. La cola poli (A) es importante para estabilizar
mRNA. Véase figu ra 1-18.
Poligénico: carácter determinado por la acción combinada de va­
rios locus genéticos. La teoría poligénica matemática (véase sec­
ción 4.4) asume que hay demasiados locus, cada uno con un
efecto pequeño.
Polimorfismo: estrictamente, existencia de dos o más variantes
(alelos, fenotipos, variantes de secuencia, variantes de estructura
cromosómica) a frecuencias importantes en la población. Los
usos más laxos entre genetistas moleculares incluyen 1)
cualquier variante de secuencia que se encuentra a una frecuen­
cia > 1% en una población, 2) cualquier variante de secuencia
no patogénica, prescindiendo de la frecuencia.
Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción
(RFLP): marcador genético que consiste en tamaños variables
de fragmentos de restricción alélica que resultan de un polimor­
fismo de secuencia de DNA. Véase recuadro 7-2. Los RFLP se
valoraron originalmente mediante Southern blotting (fig. 7-5A),
pero en la actualidad por lo general con PCR (fig. 7-6).
Polimorfismo de repetición tándem de número variable
(VNTR): microsatélites, minisatélites y DNA satélite son orde-
 namientos de secuencias repetidas en tándem que con frecuen­
cia varían entre las personas en el número de unidades repeti­
das. Véase recuadro 7-2. El término VNTR se utiliza con
frecuencia para indicar específicamente minisatélites.
Polimorfismo repetido de secuencia simple: véase Microsatélite.
Polimorfismo TCR (polimorfismo tándem corto repetido):
véase Microsatélite.
Poliploide: que tiene múltiples grupos de cromosomas como resul­
tado de un acontecimiento genético anormal (p. ej., triploidía
constitucional o en mosaico, tetraploidía, etc.) o programado
(como algunas plantas y ciertas células del cuerpo humano son
naturalmente poliploides).
Promotor: combinación de elementos de secuencia corta, normal­
mente justo corriente arriba de un gen, a la que se une la
polimerasa de RNA a fin de iniciar la transcripción del gen.
"Véase figu ra 1-13.
Promotor inducible: un prom otor cuya actividad puede cambiar
para que actúe o se suprima por un agente externo. Véase fig u ­
ra 20-5A.
Prosecuenciación: método de patente para revisar secuencias muy
cercanas a un punto de inicio definido previamente. Véase
recuadro 18-2.
Proteína de fusión: producto del gen de fusión natural o por inge­
niería: una cadena polipéptida aislada que contiene secuencias
de aminoácidos que normalmente son parte de dos o más
polipéptidos separados. Véase recuadro 20-2.
Proteoma: grupo total de diferentes proteínas en una célula, tejido
u organismo. Cf, genom a, transcriptoma.
Protooncogen: véase Oncogen.
Protostomas: véase recuadro 12-5.
Proximal (de cromosomas): colocado comparativamente cerca del
centròmero.
Prueba de desequilibrio de transmisión (PDT): prueba estadís­
tica de asociación alélica. Véase Recuadro 15-3.
Prueba de truncación de proteínas (PTP): método de selección
para mutaciones de cadena terminal expresando artificialmente
un alelo mutante en un sistema acoplado de transcripción-tra­
ducción. Véase figu ra 17-9, figu ra 18-5.
Punto caliente: secuencia asociada con una frecuencia anormal­
mente alta de recombinación o mutación.
Quiasma: manifestación física de recombinación meiótica como se
observa al microscopio. Véase figu ra 13-3.
Quimera: organismo derivado de más de un cigoto. Véase figura
4-10.
RACE-AREC: véase recuadro 5-1.
Rastreo gènico: predicción de genotipos dentro de genealogías uti­
lizando marcadores de enlace a fin de rastrear un segmento cro­
mosomico. En ocasiones se denomina Prueba indirecta. Véase
recuadro 18-3.
Recesivo: un carácter es recesivo si sólo se manifiesta en homoci-
gotos.
Recombinación no homologa: recombinación entre secuencias
que no tienen homología o con homología local limitada. Una
causa mayor de inserciones y deleciones a nivel genético o cro­
mosomico. Véanse, por ejemplo, figuras 11-7, 16-2.
Recombinante (análisis de enlace): persona que hereda de un
padre una combinación de alelos que resulta de un cruzamien­
to durante la meiosis. Véase figu ra 13-1.
Redundancia genética: ejecución de la misma función en parale­
lo por genes en más de un locus, de tal manera que la pérdida
de mutaciones funcionales en un locus no causa una pérdida
total de la función.
Región de control de locus (RCL): extensión de DNA que con­
tiene elementos reguladores que controlan la expresión gènica
en un grupo de genes que puede estar localizado decenas de
kilobases lejos. Véase figura 10-23.
Región nucleolar organizadora (RNO): los tallos satélite de los
cromosomas humanos 13, 14, 15, 21 y 22. Las RNO contienen
ordenamientos de genes de DNA ribosómico y pueden teñirse
selectivamente con plata. Cada RNO forma un nucleolo en la
telofase de la división celular; los nucléolos se fusionan en la
interfase.
Regiones no traducidas (RNT 5’, RNT 3’) : regiones en el extre­
mo 5' del mRNA antes del codón de inicio de traducción de
AUG, o en el extremo 3' después del codón de detención UAG,
UAA o UGA. Véase figu ra 1-19.
Regiones seudoautosómicas: regiones en cada punta de los cro­
mosomas X y Y que contienen genes homólogos X-Y. Debido a
la recombinación X-Y, los alelos en estas regiones muestran un
modo de herencia aparentemente autosómico. Véase figura 12-
15.
Relación de segregación: proporción de la descendencia que here­
da un gen o carácter determinado de un padre.
Remplazo genico: terapéutica gènica que consiste en reemplazar
un gen endógeno defectuoso con una versión que funciona de
manera correcta. Véase figu ra 21-4.
Reparación incompatible: proceso enzimàtico natural que reem­
plaza un nucleótido de par erróneo en un dúplex de DNA (más
probablemente se encuentra por un error en la replicación del
DNA) a fin de obtener un par de bases de Watson-Crick per­
fecto.
Repetición Alu: secuencia de DNA no codificante altamente
repetitiva que se encuentra en genomas de primates.
Replicón: cualquier ácido nucleico que es capaz de autorreplicarse.
Muchos vectores de clonación utilizan replicones extracro-
mosómicos (como en el caso de plásmidos). Oros emplean
replicones cromosómicos, sea de manera directa (p. ej., en los
vectores cromosómicos de levadura artificial), o indirecta, per­
mitiendo la integración en el DNA cromosomico.
Rescate de trisomía: sobrevivencia de un embrión inicialmente
trisómico porque una falta de disyunción mitótica al azar pro­
duce una célula disómica que se constituye en el progenitor de
la totalidad del feto. Puede dar por resultado disomia uni-
parental.
Retrotransposón (retroposón): un elemento de DNA transpo-
sable que se transpone mediante un intermedio de RNA. Los
retroposones codifican una transcriptasa inversa que actúa en el
transcrito de RNA para hacer una copia de cDNA, que a con­
tinuación se integra en el DNA cromosomico en un sitio dife­
rente. Véase recuadro 7-4, figuras 7-17, 7-18.
Retrovirus: virus RNA con función de transcriptasa inversa, que
permite copiar el genoma de RNA del cDNA antes de inte­
grarse en los cromosomas de una célula huésped.
RFLP: véase Polimorfismo de longitud d e fragm entos de restricción.
Ribozima: molécula RNA catálitica natural o sintética. Véase fig u ­
ra 21-10.
Riesgos empíricos: riesgos calculados a partir de datos de encues­
tas y no de la teoría genética. La asesoría genética en la mayor

parte de los padecimientos no mendelianos se basa en riesgos
empíricos. Véase sección 4.4.4.
RNA antisentido: transcrito complementario de un mRNA nor­
mal, formado utilizando el filamento que no es modelo (planti­
lla) de un gen. Los RNA antisentido que ocurren naturalmente
son reguladores importantes de la expresión génica.
RNAi (RNA de interferencia): uso de siRNA para knock down
(pero rara vez abolir completamente) la expresión de genes
específicos. Un medio potente para estudiar la función de los
genes.
siRNA (RNA de interferencia pequeño); RNA de doble filamen­
to de 21 a 23 nt que suprime específicamente la función de su
mRNA homólogo. Véanse sección 20.2.7 y figu ra 20-2.
tRNA supresor: molécula de RNA de transferencia mutante con
sustitución de un nucleótido en el anticodón. Muestra una
especificidad de codificación alterada y es capaz de trasladar un
codón sin sentido (o de sentido erróneo). Véase recuadro 5-3.
SAGE (análisis seriado de expresión génica): método de p erfil de
expresión basado en secuenciación. Véase figu ra 19-5■
Satélite (en el cromosoma): proyección pedunculada que se
encuentra variablemente en los brazos cortos de cromosomas
acrocéntricos humanos (13,14,15,21,22).
Secuencia de señal (secuencia guía): secuencia de unos 20
aminoácidos en la terminal N de un polipéptido que controla
su destino dentro o fuera de la célula. Véase sección 1.5.4.
Secuenciación de bisulfito: método para detectar patrones de
metilación de DNA. Véase sección 18.3.6.
Secuenciación en escopetazo: secuenciación de fragmentos de
DNA que se han generado aleatoriamente de una clona grande
o un genoma completo. Véase figu ra 8-3.
Segmentación química de incompatibilidades (CCM): método
de exploración de fragmentos de DNA de tamaño kilobase para
mutaciones. Véase cuadro 18-2, figu ra 18-4B.
Selección de cDNA: método basado en hibridación para recupe­
rar clonas genómicas que tienen contrapartes en una genoteca
de cDNA. Véase figu ra 7-11.
Semidominante: un alelo que, en el heterocigoto, produce un
fenotipo intermedio (pero no necesariamente a la mitad) entre
el tipo silvestre y el homocigoto. Un término que se utiliza
ampliamente en genética de ratones pero que es mejor evitar,
cuando menos en genética humanan, ya que dominancia es una
propiedad de un carácter y no de un alelo.
Sensibilidad de dosis: propiedad de un gen en la que un cambio
en el número de copias produce un fenotipo anormal.
Sesgo de valoración: proporciones deformadas de fenotipos en un
grupo de datos causado por la forma en que se reúnen los casos.
Véase sección 15.2.1.
Seudogen: secuencia de DNA que muestra un grado alto de
homología de secuencia con un gen funcional no alélico pero
que no es funcional en sí mismo.
Silenciador: combinación de elementos de secuencia de DNA
cortos que suprimen la transcripción de un gen. Véase recuadro
10- 2 .
Sincitio: célula que contiene múltiples núcleos como resultado de
ciclos de replicación del DNA sin división celular o por fusión
de múltiples células (como en el caso de las células de fibra
muscular).
Síndrome de aneuploidía (o aneusomía) segmentaria: véase
Síndrome de gen contiguo.
645
Síndrome de gen contiguo (aneuploidía segmentaria): síndrome
causado por deleción de un grupo contiguo de genes, varios de
los cuales, o la totalidad de ellos, contribuyen al fenotipo. Véase
sección 16.8.1.
Sintenia: presencia de locus en el mismo cromosoma (sinténicos).
Los locus sinténicos no necesariamente están enlazados: locus
suficientemente separados en el cromosoma se seleccionan alea­
toriamente, con 50% de recombinantes.
Sistema Cre-lox: técnica para generar deleciones cromosómicas
predefinidas. Cre es un gen bacteriófago P1 cuyo producto
facilita la recombinación entre secuencias loxP. Se denomina así
porque crea ^combinación. Véanse figuras 20-10, 20-11.
Sistema de dos híbridos: véase Sistema de levadura de dos híbridos.
Sistema de levadura de dos híbridos: un sistema importante para
identificar y purificar proteínas que se unen a una proteína de
interés. Véase figu ra 19-18.
Sitio aceptor de empalme (splice)-. la unión entre el extremo 3’ de
un intrón y el inicio del exón siguiente. Secuencia de consenso
ynnyagR (y = pirimidina, R = purina; caso de arriba = exón).
Véase figu ra 1-15.
Sitio donador de empalme: unión entre el extremo de un exón y
el inicio (extremo 5’) del intrón corriente abajo. Secuencia de
consenso (C/A)ACgíragt (r = purina; caso de arriba = exón).
Véase figu ra 1-15.
Sitio de empalme (splice) críptico: secuencia en el pre-mRNA
con cierta hemología a un sitio de empalme. Los sitios de
empalme crípticos pueden utilizarse como sitios de empalme
cuando está alterado éste o después de una mutación de susti­
tución de bases que aumenta la semejanza con un sitio de
empalme normal. Véanse figuras 11-12, 11-13.
Sitio de rama: en el procesamiento del mRNA, una secuencia bas­
tante mal definida (consenso CTRAY; R = purina, Y = pirimi­
dina) localizada 10 a 50 bases corriente arriba del aceptor de
empalme que contiene la adenosina en la cual se forma el inter­
mediario de empalme lazo. Véase figu ra 1-15.
Sitio de secuencia /«arcado (SSM): cualquier pieza única de DNA
para la cual se ha diseñado una valoración de PCR específica, de
tal manera que es posible estudiar fácilmente la presencia o
ausencia de cualquier muestra de DNA. Véase recuadro 10-3.
Sitios de hipersensibilidad de DNAsa I: regiones de la cromatina
que son digeridos rápidamente por la DNAsa I. Se piensa que
son secuencias de control de largo alcance importantes. Véase
sección 10.5.2.
Sobredominante: fenotipos que muestran ventaja de heterocigoto.
Un término que se utiliza en genética de población.
Somitas: bloques discretos de mesodermo segmentario que estable­
cerán la organización segmentaria del cuerpo originando la
mayor parte del esqueleto axil (incluyendo la columna verte­
bral), los músculos voluntarios y parte de la dermis de la piel.
Sonda: fragmento de DNA o RNA conocido (o un conjunto de
diferentes fragmentos conocidos) que se utiliza en una valo­
ración de hibridación a fin de identificar secuencias de DNA o
RNA relacionadas muy de cerca dentro de una mezcla comple­
ja de ácidos nucleicos, que se comprende muy poco. En las valo­
raciones de hibridación estándar se marca la sonda, pero en las
valoraciones de hibridación inversa se marca el blanco (véase
recuadro 6-4).
Southern blot: transferencia de fragmentos de DNA de un gel
electroforético a una membrana de nylon o nitrocelulosa (fil­
tro), en preparación para una valoración de hibridación. Véase
figu ra 5-12.
SSCP o SSCA: polimorfismo o análisis de conformación de fila­
mento único, un método que se utiliza comúnmente para la
selección de mutaciones de punto. Véase figu ra 18-3 A.
STS: vcase recuadro 8-1.
Suplementación génica (o aumento): terapéutica génica en la que
se introduce un gen funcional en las células del paciente sin
manipular ninguno de los genes endógenos. Adecuado para
corregir la pérdida de fenotipos funcionales. Véase figura 21-4.
Sustitución conservadora: mutación que causa el reemplazo de
un codón por otro codón que especifica un aminoácido dife­
rente, pero que está relacionado en las propiedades químicas
con el aminoácido original.
Sustitución sinónima (silenciosa): sustitución que reemplaza un
codón por otro que codifica el mismo aminoácido. Véase
Recuadro 9-2.
Telómero: estructura especializada en las puntas de los cromoso­
mas. Consiste en una ordenamiento de repeticiones tándem
cortas (TTAGGG)n en humanos, que forman un asa cerrada y
protegen el extremo del cromosoma.
Temperatura de fusión (Tf): véase recuadro 6-3.
Tiempo de coalescencia: en genética de población, el número de
generaciones anteriores al ancestro común más reciente. Véase
recuadro 12-6.
Trampa génica: método para seleccionar las inserciones transgéni-
cas que han ocurrido en un gen.
Trampa intensificadora: técnica para identificar genes que se
expresan con fuerza en un organismo.
Transcriptasa inversa: enzima que puede formar un filamento de
DNA utilizando una plantilla de RNA. Se utiliza para hacer
genotecas de cDNA (fig. 4-8) y para PCR-TI (sección 20.2.4).
La transcripción inversa es una parte esencial del ciclo de vida
retroviral (fig. 18-2) pero, hasta donde se sabe, no del metabo­
lismo celular normal.
Transcriptoma: grupo total de transcritos de RNA diferentes en
una célula o tejido. Cf. genom a, proteoma.
Transdiferenciación: (o plasticidad): posible capacidad de las
células que parecen estar comprometidas a un tipo particular de
diferenciación para derivarse hacia otra vía de diferenciación.
Transducción: transferencia génica mediada por virus. Véanse
Recuadro 19-1 y Recuadro d e ética 1 en el capítulo 21.
Transfección: captación de DNA por células eucariotas (el equiva­
lente de transformación en bacterias, pero esta palabra tiene un
significado diferente para células eucariotas. Véase asimismo
captación de DNA de plásmido por células bacterianas. Véase
Recuadro 19-1.
Transformación (de una célula): 1, captación por una célula bac­
teriana com petente de DNA de peso molecular alto desnudo del
ambiente; 2, alteración de las propiedades de crecimiento de
una célula eucariota normal como un paso hacia la evolución a
una célula tumoral.
Transgén: gen exógeno transfectado al interior de una célula de un
animal o una planta. Puede presentarse en algunos tejidos
(como en las terapéuticas génicas en el hombre) o en todos los
tejidos (p. ej., en ingeniería de línea germinal, como en el
ratón). Los transgenes introducidos pueden ser episómicos y
expresarse en forma pasajera, o integrarse en los cromosomas de
la célula huésped.
Transición: sustitución nucleótida G <=» A (purina por purina) o
C o T (pirimidina por pirimidina).
Translocación: transferencia de regiones cromosómicas entre cro­
mosomas que no son homólogos. Véase figura 2-21.
Transposición duplicativa (o copia o replicativa): transposición
de la copia de una secuencia de DNA, en tanto permanece en
su sitio la original.
Transposón: elemento genético móvil —véase figu ra 9-17—.
Transversión: sustitución de un nucleótido de purina por pirimi-
dina o viceversa.
Triploidía: de una célula, tener tres copias del genoma; de un
organismo, estar constituido por células triploides.
Trisomía: presencia de tres copias de un cromosoma particular, por
ejemplo, trisomía 21.
Trofoblasto (= trofoectodermo): capa externa de células polari­
zadas en el blastocisto (véase fig. 3-13) que evolucionará para
formar el corion, el componente embrionario de la placenta.
Unidad de transcripción: tira de DNA que se transcribe en forma
natural en una operación aislada para producir un transcrito
primario único. En los casos directos, una unidad de transcrip­
ción es lo mismo que un gen.
Valor p en la extensión del genoma: pruebas para enlace o aso­
ciación, la probabilidad en la hipótesis nula de observar la
estadística en cuestión en cualquier parte en una selección de la
totalidad del genoma (cf valor p en la extensión d e punto). Véase
sección 15.3.4.
Valor p del punto sensato: en análisis de enlace, la probabilidad
en la hipótesis nula de exceder el valor observado de la estadís­
tica en una posición determinada en el genoma. Cf. valor de p
en la extensión d el genoma. Véase sección 15.3.4.
Valoración de ligadura de oligonucleótidos (OLA): método para
detectar un cambio de secuencia definido previamente. Véase
figu ra 18-11.
Vector: ácido nucleico capaz de replicarse y conservarse por sí mis­
mo dentro de una célula huésped y que puede utilizarse para
conferir propiedades similares en cualquier secuencia enlazada
covalentemente a él.
Ventaja heterocigota: situación en que la heterocigosidad de una
persona para una mutación tiene una ventaja en la reproduc­
ción sobre ambos homocigotos. Llamada en ocasiones sobre-
dominancia. La ventaja heterocigota es la razón por la que
siguen siendo comunes varias enfermedades recesivas graves.
Véase recuadro 4-8.
Western blotting: proceso en el cual se fracciona el tamaño de pro­
teínas en un gel de poliacrilamida y a continuación se trans­
fieren a una membrana de nitrocelulosa para sondar con un
anticuerpo. Véase figu ra 20-9.
YAC (cromosoma artificial de levadura): vector capaz de propa­
gar insertos de una megabase o más en células de levadura.
Véase figu ra 5-17.
YAC transgénico: ratón transgénico en el cual el transgén es un
YAC completo que permite estudiar los efectos reguladores de
las secuencias que rodean al gen seleccionado. Véase sección
20.2.3.
Zoo-blot: Southern blot que contiene muestras de DNA de una
gama de diferentes especies. Véase figu ra 7-9.

Acondrogénesis II, 485
Acondrogénesis tipo IB, 476
Acondroplasia, 95, 468, 483, 522
Adenoma, 504, 505
ADRPL (atrofia dentadorrùbrica
palidoluisiana), 481
Agammaglobulinemia, véase Inmunodefìciencia
Alagille, sindrome, 472, 484, 486
Albinismo ocular, 479
Alzheimer, enfermedad, 443, 454, 482, 605
modelo animal, 603
Anemia, sideroblástica, 605
congenita, 605
Angelman, síndrome, 299, 302-3, 342, 343,
473, 476, 486
Aniridia, 95, 299
Apert, síndrome, 328, 483
Aracnodactilia contractural congenita, 424
Artritis, 602
Ataxia telangiectasia, 347, 497, 500
Atelosteogénesis, 11,476
Ateroesclerosis, 604
análisis de microordenación, 554
Atrofìa muscular espinal, 470
Atrofìa muscular espinobulbar, 106, 479
tipo 1, 604, 606
tipo 11,481
tipo 17, 481
tipo 6, 481
tipo 7, 481
tipo 8, 481
Batten, enfermedad, 202
Beckwith-Wiedemann, síndrome, 109,
302-3, 473
Bethlem, miopatia de, 96
Bloom, síndrome, 605
Branquio-oto-renal, síndrome, 432
Cáncer bucal, 490, 498, 506
Cáncer de colon no polipósico, hereditario,
498, 502, 505
Cáncer colorrectal, 493, 501, 502, 505, 562
marcadores, 562
Cáncer de endometrio, 502
Cáncer gástrico, 493
Cáncer de mama, 452, 493, 497, 506, 562
BRCA1 en cáncer esporádico, 495, 506
Cáncer medular de la tiroides, 479
Cáncer del ovario, 452, 493, 497, 630
Cáncer de pulmón, 493, 506
Cáncer, terapéutica génica, 629
modelación en ratones, 604
Cáncer de tiroides, 496
Cáncer de la vejiga, 493, 506, 562
marcadores, 562
Cardiopatia coronaria, 229
CCNPH, véase Cáncer de colon no polipósico
hereditario
Ceguera a los colores, 118
Chagas, enfermedad, 229
Charcot-Marie-Tooth, enfermedad, 105, 474,
479, 480, 522, 606
Indice de enferm edades
Cilios inmóviles, síndrome, 63
Cockayne, síndrome, 347
Cólera, 229
Colestasis intrahepática benigna, 411-412
Colitis seudomembranosa, 229
Colitis ulcerosa, véase Enfermedad inflamatoria
del intestino
Condrodistrofìa metafìsaria de Jansen, 475
Craneosinostosis coronal de Muencke,
síndrome, 483
Creutzfeldt-Jakob, enfermedad, 479, 482
Crohn, enfermedad, véase, Enfermedad
inflamatoria del intestino
Crouzon, síndrome, 483
Cutis girata (Beare-Stevenson), 484
Darier-White, enfermedad, 422
Defecto del tubo neural, riesgo de recurrencia,
116
Deficiencia de hormona del crecimiento, 617
Denys-Drash, síndrome, 328
Di George, síndrome, véase Velocardiofacial,
síndrome (SVCF)
Di George/VCF, síndrome, 342, 343, 486
Diabetes mellitus, 415
deficiencia de cinasa de glucosa, 543
DIMJ (diabetes de inicio en la madurez del
joven), 457
modelo utilizando ribozimas, 595
mutantes de C. elegans importantes, 547
tipo 1 (dependiente de insulina), 455, 603,
617
tipo 2, 457
Displasia campomélica, 299, 429
Displasia distròfica, 476
Displasia ectodérmica hipohidrótica, 104
Displasia epifisaria múltiple, 476
Displasia espondiloepifìsaria, 483, 485
Displasia mesomélica de Langer, 384
Displasia tanatofórica, 109, 484
Distrofìa miotónica, 107, 480, 522, 542
Distrofìa muscular de la cintura de las
extremidades, 470
Distrofia muscular, clonación génica, 420, 427
Duchenne/Becker, 106, 446, 484
estimación del riesgo, 530
mutaciones nuevas, 109, 118, 529
patología molecular, 469, 470, 472
pruebas genéticas, 515, 518, 519, 520
síndrome de gen contiguo, 484
terapéutica génica, 629
Distrofia muscular faríngea, 481
Distrofia muscular fascio-escápulo-humeral, 105
Down, síndrome, 486, 606
Ehlers Danlos, síndrome, 470, 478, 485
Enanismo de Laron, 95
Enfermedad de célula I, véase Mucolipidosis II
Enfermedad granulomatosa crónica, 420, 484
Enfermedad inflamatoria del intestino, 458,
461
Enfermedad poliquística del riñón, 420
Epilepsia, mioclono juvenil, 481
Esclerosis múltiple, 617
Esclerosis tuberosa, 415
Espina bífida, 606
Esquizofrenia, 415, 438, 443, 459
Estenosis aórtica supravalvular, 472, 486
Estenosis pilórica, 116
Ewing, sarcoma de, 496
Exostosis hereditaria múltiple, 96
Exostosis múltiple, 472
Falciformes, células, anemia de, 418, 522
Fanconi, anemia de, 347, 433, 501, 602
Feminización testicular, síndrome, véase
Insensibilidad a andrógenos
Fenilcetonuria, 418, 531
tratamiento, 612
Fibrosis quística, 512, 412, 466, 479, 604
clonación, 421
detección de mutación, 430
mapeo, 405, 411, 415
modelo de ratón, 604
mutaciones típicas, 528
patología molecular, 466, 467
pruebas genéticas, 517, 523, 525
riesgo de recurrencia, 116
selección de una población, 531
terapéutica génica, 618, 628
ventaja del heterocigoto, 118
Friedreich, ataxia de, 480
Gaucher, enfermedad, 604, 617
Gerstmann-Stráussler (GSS), síndrome, 604,
606
Gorlin, síndrome de, 497
Grupo sanguíneo O, 106, 108
Hemocromatosis, 612
Hemofilia, 344
Hemofilia A, 344, 470, 617
detección de mutación, 430
como resultado de transposición, 344
Hemofilia B, 603, 617
Hemoglobinopatías, 462, 466, 469
Hipercolesterolemia, 604
Hiperplasia suprarrenal congénita, 96
Hiperplasia tiroidea, 475
Hipocondroplasia, 483
Hirschsprung, enfermedad, 95, 328, 420, 424,
442, 454, 478, 479
Holt-Oram, síndrome, 95
Hombre puerco espín, 104
Huntington, enfermedad, 102, 107, 109, 476,
521, 522, 542, 544
desequilibrio de enlace, 447
edad de inicio, 118
ganancia de función, 468
patología molecular, 479
pruebas genéticas, 521, 527, 531
Incontinencia pigmentaria, 109
Infertilidad, masculina por deleciones grandes,
342
648 ÍNDICE DE ENFERMEDADES

Inmunodeficiencia, 482 Neuropatía tomaculosa, 472, 478, 479 Smith Magenis, síndrome, 342, 343, 486
combinada grave, 621, 628 Nijmegen, rotura de, síndrome, 345, 413, Sordera, véase Pérdida de la audición
Insensibilidad a andrógenos, 479 414, 500 Sotos, síndrome, 426, 431
síndrome, 93 Stickler, síndrome, 483, 485
Insomnio familiar mortal, 479 Obesidad, 460
Interferon, respuesta de, 595 Oídos pilosos, 104 Talasemia, 469, 475, 522, 523
Osteodistrofia hereditaria de Albright, 479 modelo de ratón, 606
Jackson-Weiss, síndrome, 481 Osteogénesis imperfecta, 476, 478, 483, 484 mutaciones típicas, 528
Jervell y Lange-Nielsen, síndrome, 477 selección de población, 533
PAF, véase Poliposis adenomatosa familiar Tay-Sachs, enfermedad, 522, 523, 606
Kallmann, síndrome, 384, 607 Paladar hendido, 115 Teratomas del ovario, 302
Kennedy, enfermedad, véase Atrofia muscular Parálisis periódica, 479 por diploidía materna, 57
espinobulbar Paramiotonía congenita, 476, 479 Tirosinemia, 612
Kniest, síndrome, 483, 485 Parkinson, enfermedad, 482, 625 Tos ferina, 229
Pelizaeus-Merzbacher, enfermedad, 328 Tracoma, 229
Langer-Giedon, síndrome, 486 Pérdida de la audición, 105 Trastorno de pánico debido a deleciones
Leber, neuropatía óptica hereditaria de, 186, 482 DFNB3, 434 grandes, 342
Leishmaniasis, 229
DFNB9, 433 Treacher Collins, síndrome, 431
Lepra, 229 mitocondrial, 107 Trico-rino-faríngeo, síndrome, 472
Leri-Weill, síndrome, 384
recesiva, 411, 412 Tripanosomosis, africana, 229
Lesch-Nyhan, síndrome, 478
Peste, 229 americana, 229
Leucemia linfoblastoide aguda (LLA), 555
Pfeiffer, síndrome, 483, 484 Tuberculosis, 229
Leucemia, linfoblástica, 496
Piebaldismo, 95 Tumores glómicos, 108, 109
mielógena aguda, 496
Pólipos de colon, 607 Turner, síndrome, 607
mieloide, 493, 500, 506
Poliposis adenomatosa del colon, véase
mieloide crónica, 476
Poliposis adenomatosa familiar Usher, síndrome, 105, 484
uso de virus, 491
viral, 492 Poliposis adenomatosa familiar, 111, 496, 497, tipo II, 96
Leucemia mieloide aguda (LMA), 555 501,505,515
Li-Fraumeni, síndrome, 497, 502, 605 modelo de ratón, 606 Velocardiofacial, síndrome (SVCF), 486
Lime, enfermedad, 229 Prader-Willi, síndrome, 299, 302-3, 342, 343, Von Hippel-Lindau, enfermedad, 388,
Linfoma, 491 473 497
de Burkitt, 493 Protoporfiria, 606 Von Recklinghausen, enfermedad, véase
Pubertad precoz, 475 Neurofibromatosis I
Machado-Joseph, enfermedad, 481
Marfan, síndrome, 424, 433 Rabdomiosarcoma alveolar, 478, 479, 492, 496, WAGR, síndrome, 486
Mastocitosis, 493 605 Waardenburg, síndrome, 601
Maullido de gato, síndrome, 486 Raquitismo, resistente a vitamina D, 428 tipo 1, 102, 107, 108, 433, 467,
McCune-Albright, síndrome, 475, 476, 479 Retinitis pigmentosa, 432 478, 479
Melanoma, 493, 497, 504, 630 Retinoblastoma, 494, 497, 605 tipo 2,4 11 ,42 0
Metabolismo, errores innatos, 612 mecanismo de dos golpes, 494 tipo 4, 420
Miller-Dieker, síndrome, 486 modelo de ratón, 606 Werner, síndrome, 96, 546, 548, 602
Modelo de progresión, 504 Rett, síndrome, 328 Williams Beuren, síndrome, 342, 343, 486
Mucolipidosis II, 482 Reversión del sexo, 474 Wolf-Hirschhorn , síndrome, 486
Romano-Ward, síndrome, 477
Nefronoftisis juvenil familiar, debida a Rubinstein-Taybi, síndrome, 486 X frágil, síndrome, 107, 118, 418, 468, 522,
deleciones grandes, 343 527, 604
Neoplasia endocrina múltiple, 478, 479 Seudoacondroplasia, 481 modelo de ratón, 604
Neuroblastoma, 492 Seudohermafroditismo, 96 patología molecular, 480
Neurofibromatosis tipo 1, 479, 497, 602 Sida, terapéutica gènica, 631 Xerodermia pigmentosa, 345, 501, 602
Neurofibromatosis tipo 2, 328, 497, 518 Simpolidactilia, 481 XYY, síndrome, 102
 genetico véase la fig. 1-22 para revisar diversos códigos mitocondriales):

P rim era base

SegLoO a Dase U C A G

II uuu AUU GUU

O O O O
c c c c
O > o c
Fen
uuc AUC lie GUC
Leu Val
UUA AUA GUA
Leu
UUG AUG M et GUG

C UCU CCU ACU GCU

UCC CCC ACC GCC
S er Pro T re A la
UCA CCA ACA GCA
UCG CCG ACG GCG

A UAU 1 _ CAU AAU GAU

His Asn Asp
UAC/ T 'r CAC AAC GAC
UAASTO P CAA AAA GAA
G in Lis Gli
UAG STO P CAG AAG GAG

G CGU AGU GGU

UGU1 Cis S er
UGC J QS CGC AGC GGC
Arg Gli
UGA STOP CGA AGA GGA
Arg
U G G Trp CGG AGG GGG

Códigos de una letra para aminoácidos

A alanina C cisterna D ácido aspártico E ácido glutámico F fenilalanina
G glicina H histidina I isoleucina K lisina L leucina
M metionina N asparagina P prolina Q glutamina R arginina
S serina T treonina V valina W triptófano Y tirosina
X codón de detención

Información complementaria
En las páginas indicadas puede encontrarse información sobre los temas siguientes.

Bases de datos electrónicas y recursos de URL (véase asimismo Uso inteligente de internet, pág. xxix)
Proyectos del genoma Pág. 236
Centros de secuencia del genoma Cuadro 8-4, pág. 235
Organismos modelos Pág. 236
Base de datos sobre mutación Pág. 348
Secuencias de nucleótidos y proteínas Cuadro 8-2, pág. 222
Otros proyectos del genoma de metazoarios Cuadro 8-4, pág. 235

Genes humanos y estadísticas sobre gcnomas Recuadro 9-5, pág. 255

Nomenclatura en seres humanos

Cromosomas Recuadro 2-3, pág. 49
Anormalidades cromosómicas Recuadro 2-4, pág. 53
Genes y secuencias de DNA Recuadro 8-2, pág. 212
Mutaciones Recuadro 16-2, pág. 463
Símbolos de genealogía Figura 4-1, pág. 102

Filogenias
Fiiogenia^ticariota Figura 12-22, pág. 380
: .jogen; de metazoarios Figura 12-24, pág. 382
Filos; :iia de vertebrados Figura 12-23, pág. 381

m jo k s de tejidos de capas germinativas Recuadro 3-5, pág. 75

 r\

13.3
13.2
13.1

11.3
112r 11.23
13.1
13.2 11.2 1 \W
13.3 11:1
11.2
12
13

23.1
23.2
23.3 22.1
22.2
31.1 22.3
31.2
31.3 23.1
32
33.1
33.2
33.3
34
35.1
35.2
35.3

15.5
15.4
15.3
15.2
15.1
13.3
13.2
12.3
12.2
12.1
11:1 11.2

H 21.1
21.1
21.2
21.2 21.3
22.1
21.3 22.2
22.1
22.2 22.3
22.3
23.1 23
25.1 23.2
25.2 24.1
25.3 24.2
26.1 24.31 , 26.1
26.2 24.32 \ 26.2
26.3 24.33 26.3

10 11 12 15

ii.i
ii.i 11.3
11.2 11.2 C lave:
11:1
11.21 ^ C entróm ero
11.22
11.23 - rD N A
E3 H etero crom atina
no centrom érica

16

Patrones de bandeo de cromosomas humanos

 a genética molecular humana se revisó y actualizó a la luz de los descubrimientos
L consecutivos del Proyecto del Genoma Humano. A medida que entramos en la era
posgenoma, este libro proporciona un enlace entre los textos elementales y la bibliografía
sobre investigación, de tal manera que las personas sin demasiadas bases sobre el tema
pueden apreciar y leer las últimas investigaciones.

• La primera sección incluye material básico sobre la estructura y función del DNA,
cromosomas, células y desarrollo, análisis de genealogía y técnicas básicas utilizadas
en un laboratorio.

• La segunda com enta los diversos proyectos de secuenciación del genoma y las
informaciones que proporcionan sobre la organización, expresión, variación y evolución
del genoma humano.

• La tercera se enfoca en el mapeo, identificación y diagnóstico de causas genéticas de

enfermedades mendelianas, complejas y oncológicas.

• En la cuarta parte se analizan los horizontes más amplios de la genómica funcional,

proteómica, bioinformàtica, modelos animales y terapéutica.

• Se incluye un glosario extenso.

Se organizaron por completo las secciones sobre enfermedades complejas y el capítulo

de proyectos del genoma. Destaca también una nueva sección sobre filogenètica molecular
y la introducción de recuadros de ética para comentar algunas de las implicaciones del
nuevo conocimiento. El presente libro permite explicar los principios y no proporcionar
gran número de hechos. Es fácil consultar los acontecimientos relevantes, sobre todo
a través de internet, y se proporcionan referencias necesarias. Las bibliografías al final
de cada capítulo tienen un propósito más didáctico; con frecuencia se citan revisiones
en lugar del primer artículo sobre un tema y se han elegido referencias de revistas de
fácil acceso. Antes que todo, la obra refleja la sensación de una investigación de rápido
movimiento que lleva a continuar la travesía del descubrimiento hacia nuestro genoma.

ERRNVPHGLFRVRUJ

Me McGraw-Hill The M c G ra w -H ill Companies

H¡ifw Interamericana

V isite nuestra página WEB

www.mcgraw-hill-educacion.coni