Efek Glukosa terhadap Percepatan Penuaan

melalui G Protein-Ditambah Reseptor Glukosa pada Fisi Ragi

Antoine E. Roux, Alexandre Leroux, Manal A. Alaamery, Charles S. Hoffman, Pascal

Chartrand Gerardo Ferbeyre, Luis A. Rokeach

Departemen Biokimia, Universite 'de Montre' al, Montre 'al, Que'bec, Kanada, Departemen
Biologi, Boston College, Chestnut Hill, Massachusetts, Amerika Serikat

Kutipan: Roux AE, Leroux A, Alaamery MA, Hoffman CS, Chartrand P, et al. (2009) Efek
Pro-Aging Glukosa Signaling melalui G-Protein Ditambah Glukosa

Reseptor di Fisi ragi. PLoS Genet 5 (3): e1000408. doi: 10.1371/journal.pgen.1000408

Editor: Susan K. Dutcher, Washington University School of Medicine, Amerika Serikat

Diterima 24 September 2008, yang diterima 5 Februari 2009; Diterbitkan 6 Maret 2009

Copyright: 2009 Roux et al. Ini adalah artikel akses terbuka didistribusikan di bawah
persyaratan Lisensi Creative Commons Attribution, yang memungkinkan penggunaan tak
terbatas, distribusi, dan reproduksi dalam media apapun, asalkan penulis asli dan sumber
dikreditkan.

Pendanaan: Karya ini didanai oleh Institut Penelitian Kesehatan Kanada (CIHR) hibah IAP-
79713 dan GI MOP-89702 untuk LAR. GF dan PC didukung oleh beasiswa dari'' Fond de
Recherche en Sante 'du Que'bec'' (FRSQ). CSH didukung oleh NIH hibah r01 GM46226.
Para penyandang dana tidak memiliki peran dalam desain penelitian,

pengumpulan data dan analisis, keputusan untuk mempublikasikan, atau penyusunan naskah.

Bersaing Minat: Para penulis telah menyatakan bahwa tidak ada kepentingan bersaing ada.

E-mail: p.chartrand @ umontreal.ca (PC); g.ferbeyre @ umontreal.ca (GF); luis.rokeach @

umontreal.ca (LAR)
Abstrak (abstract)

Glukosa adalah karbon utama untuk sumber energi pada prokariota, eukariota
uniseluler, dan metazoa. Namun, kelebihan glukosa telah dikaitkan dengan beberapa
penyakit, termasuk diabetes dan proses yang kurang dipahami yaitu penuaan. Sebaliknya,
membatasi glukosa (yaitu, pembatasan kalori) memperlambat penuaan dan penyakit yang
berkaitan dengan usia pada sebagian besar spesies. Memahami mekanisme yang membatasi
glukosa terhadap rentang hidup itu penting bagi setiap upaya untuk mengendalikan penuaan
dan berkaitan dengan usia penyakit. Di sini, kita menggunakan ragi Schizosaccharomyces
pombe sebagai model untuk mempelajari regulasi rentang hidup kronologis oleh glukosa.
Pertumbuhan S. pombe karena berkurangnya konsentrasi glukosa sehingga meningkatkan
rentang hidup dan ketahanan stres oksidatif sebagaimana dilaporkan sebelumnya untuk
banyak organisme lain. Anehnya, hilangnya reseptor glukosa Git3, G protein-coupled
reseptor, juga meningkatkan rentang hidup dalam kondisi di mana konsumsi glukosa tidak
terpengaruh. Hasil ini menunjukkan peran glukosa dalam jalur peraturan rentang kehidupan.
Dalam perjanjian, aktivasi konstitutif dari subunit Ga bertindak hilir Git3 mempercepat
penuaan di S. pombe dan menghambat efek pembatasan kalori. Sebuah efek pro-penuaan
serupa glukosa dan didokumentasikan dalam mutan heksokinase, yang tidak dapat
memetabolisme glukosa, karena itulah yang terkena konstitutif sinyal glukosa. Efek pro-
penuaan sinyal glukosa pada rentang kehidupan berkorelasi dengan peningkatan oksigen
reaktif spesies dan penurunan resistensi stres oksidatif dan laju respirasi. Demikian juga, efek
anti-penuaan dari kedua kalori pembatasan dan mutasi Di Git3 disertai dengan peningkatan
respirasi dan produksi oksigen reaktif yang lebih rendah. Secara keseluruhan, data kami
menunjukkan peran penting sinyal glukosa melalui jalur Git3/PKA untuk mengatur rentang
hidup S. Pombe.

Ringkasan

Glukosa merupakan sumber karbon utama yang memasuki jalur metabolisme.

Glukosa akhirnya menghasilkan ATP untuk memasok energi yang diperlukan untuk
biosintesis sel dan tuntutan fungsional . Bukti substansial mendukung gagasan bahwa
kelebihan glukosa bertindak sebagai faktor pro - penuaan dan patogen. Secara konsisten ,
menurunkan asupan glukosa dalam diet atau pembatasan kalori meningkatkan harapan hidup
di banyak spesies , dari ragi dan mamalia. Penelitian yang dilakukan pada Saccharomyces
Cerevisiae telah bermanfaat untuk mengungkap peran pengederaan nutrisi dalam umur
panjang . Mutasi menghalangi aksi gen yang mengendalikan gizi pada jalur peningkatan
rentang replikatif kehidupan ( RLS ) . Eksperimen, pembatasan kalori ( CR ) dicapai dengan
mengurangi konsentrasi glukosa dalam S. cerevisiae. Dengan kondisi tersebut , sel-sel ragi
menunjukkan peningkatan baik mereka rentang hidup replikatif dan CLS mereka. Oleh
karena itu kemungkinan bahwa nutrisi , dan lebih khususnya jalur sinyal glukosa adalah
pengatur utama dari efek pembatasan kalori pada penuaan. Sejatinya mitokondria
memungkinkan ragi untuk beradaptasi terhadap metabolisme energi dan nutrisi yang
tersedia , dan sangat penting untuk kontrol umur panjang.

Dalam penelitian ini , kami berharap untuk menentukan apakah glukosa dalam
metabolisme atau ekstraseluler sinyal glukosa bertanggung jawab atas peraturan rentang
hidup . Kami menemukan bahwa glukosa lingkungan menurunkan CLS di S. pombe secara
dosis, tergantung dan ini Efek yang menirukan dalam sel kekurangan reseptor Git3p glukosa,
G protein - coupled receptor ( GPCR ) yang menandakan adanya glukosa dalam medium
melalui cAMP / PKA jalur. Knockout S. gen heksokinase pombe ( hxk1 dan hxk2 ) , yang
diperlukan untuk menyalurkan glukosa ekstraseluler ke dalam glikolisis , tidak
memperpanjang CLS di S. pombe . Pengurangan ekstraseluler glukosa atau mutasi dari
reseptor glukosa Git3p menyelamatkan penuaan secara fenotipe. Secara keseluruhan , data
kami menunjukkan bahwa sinyal glukosa merupakan jalur utama dalam efek pro – penuaan
glukosa dalam fisi ragi.

Bahan dan Metode

1. Pernyataan etika

Penelitian ini dilakukan sesuai dengan prinsip-prinsip yang dinyatakan dalam

Deklarasi Helsinki .

2. Media dan Tegangan Ragi

MM mengacu pada Edinburgh Minimal Menengah yang dilengkapi oleh adenin ,

urasil , leusin dan / atau histidin 75 mg.L21 ( A , U , L , H ) . SMC mengacu pada media
sintetis dilengkapi dan terdiri dari MM ditambah adenin , urasil , leusin dan / atau histidin
444 mg L21 ( A , U , L , H ). Ekstrak ragi lengkap dan menengah ( YEC ) , terbuat dari
ekstrak ragi 5 g.L21 ( BD , Difco ) ditambah dengan 222 mg.L21 dari adenin , urasil , leusin
dan histidin , dan glukosa 2 % kecuali dinyatakan lain. Semua budaya diinkubasi pada 30uC
dalam berputar inkubator shaker pada 250 rpm ( New Brunswick instrument ) .

3. Triple mutan Dhxk1 Dhxk2 Dgit3 diperoleh pertama

Membangun Dhxk1 Dgit3 KO ganda ( SP14373 ) setelah kawin mutan tunggal Dhxk1
(SP14313 ) dan Dgit3 ( SP14105 ) . Hasil Dhxk1 Dgit3 strain disilangkan dengan Dhxk2
pREP41_Hxk2 (SP14405 ) dan tegangan haploid Dhxk1 Dhxk2 Dgit3 tanpa plasmid diisolasi
seperti yang dijelaskan sebelumnya untuk Dhxk1 Dhxk2

4. Kronologis Hidup Tes Span dan Kelangsungan Hidup

Protokol untuk pengukuran CLS dengan menghitung CFU telah dijelaskan

sebelumnya, kecuali bahwa estimasi pertama jumlah sel hidup ditunda . Sel yang mencapai
maksimal density dipanen , serial diencerkan dan berlapis 24 jam dan 48 jam setelah densitas
optik stabil dan maksimal , yang jumlah yang lebih tinggi dari sel-sel hidup dari dua sampel
adalah dianggap sebagai awal dari CLS kurva (yaitu , kelangsungan hidup 100 % ) . Setiap
uji diulang setidaknya tiga kali . Semua analisis CLS dilakukan di YEC AULH 222 mg L21.
Jumlah sel-sel hidup per ml dihitung dengan plating pengenceran sampel dari budaya seperti
dijelaskan di atas diterima bahwa gliserol YEC padat ini digunakan .

5. In vivo Pewarnaan ROS oleh DHR 123 dan DHE

Analisis mikroskop epifluorescence dilakukan menggunakan Nikon Eclipse E800

terbalik yang dilengkapi dengan mikroskop Nikon_60 DIC H ( 1,4 NA ) lensa dan
Photometrics CoolSNAP kamera CCD fx . Gambar diperoleh dengan menggunakan gerak-
gambar kamera CCD CoolSnapFX 12 ( Photometrics , Tucson , AZ , USA ) bit dan dianalisis
dengan UIC metamorf software ( Molekuler Perangkat Corporation, Downington , PA ,
USA) . Persentase ROS - sel positif diukur dengan dihydrorodhamine 123 ( DHR 123 ,
Sigma ) .

6. Oksigen dan Glukosa Tes Konsumsi

 Konsumsi oksigen diukur dalam budaya tumbuh sel konsentrasi antara OD595 0,8
dan 1,5 . Sel dikultur dalam YEC ke OD diberikan, dan kemudian budaya diencerkan dalam
sendiri menengah jika OD595 lebih besar dari 1,5 , atau terkonsentrasi dalam sendiri
menengah dengan sentrifugasi jika OD595 kurang dari 0,8 . Tujuannya adalah untuk
mengukur respirasi budaya dengan konsentrasi yang sama dan dalam medium yang tepat di
mana sampel diambil . Konsentrasi glukosa diukur pada supernatan budaya di BPO berbeda
mengikuti protokol yang diberikan dalam QuantichromTM Glukosa Assay Kit dari bioassay
SystemsH . Hasil yang disajikan adalah rata-rata dari tiga independen budaya .

7. Tes b - galaktosidase

Aktivitas b - galaktosidase , dinyatakan dari reporter fbp1 - lacZ , ditentukan seperti

yang dijelaskan sebelumnya kecuali bahwa budaya ditumbuhkan dalam YEC ke fase
eksponensial akhir (OD595 9 glukosa 2 % , dan OD595 2 glukosa 0,2 % ) . CHP1229
ditanam hanya OD595 5.5 sesuai dengan akhir fase eksponensial .

8. Stres oksidatif Kelangsungan Hidup dan Re - Pertumbuhan pada Gliserol pelat

Sel dikultur dalam glukosa YEC 2 % atau 0,2 % menjadi stasioner fase , dan dipanen
24 jam setelahnya . Kultur terdilusi menjadi OD595 0,5-0,8 dalam air dan diserahkan ke
berbagai oksidatif guncangan di 30uC . Kemudian , sel dicuci dua kali dengan 1 mL air dan
serial diencerkan sepuluh kali lipat empat kali.

9. Analisis Membran Potensial Mitokondria oleh Arus cytometry

Membran mitokondria potensial ( Dym ) diukur dengan DiOC6 ( Probe Molekuler ) .

Tegangan ragi ditumbuhkan per- malam 10 mL YEC menggunakan 50 tabung mL dengan
setengah topi sekrup untuk membiarkan gas pertukaran. Selanjutnya , 50 mL volume ini
diencerkan dalam 0,95 mL 16 PBS dan aliran cytometry analisis dilakukan seperti dijelaskan
di atas .

10. Real Time PCR Kuantitatif

RNA total yang terbalik dituangkan dalam volume akhir 100 mL menggunakan
Kapasitas Tinggi cDNA Lookup Transkripsi Kit dengan primer acak ( Terapan Biosystems ,
Foster City , CA ) sebagai dijelaskan oleh pabrik . Sampel ditranskripsi terbalik yang
disimpan pada 220uC . Sebuah referensi RNA ( referensi Manusia RNA total , Stratagen , Ca
) juga dituangkan dalam cDNA . Reaksi PCR untuk 384 format baik pelat dilakukan
menggunakan 2 mL sampel cDNA ( 50 ng ) , 5 mL Express qPCR SUPERMIX ( Invitrogen )
, 2 mM primer masing-masing dan 1 mM dari probe total volume 10 ml .

11. RNA Ekstraksi

5 mL kultur fase diam ( hari 1 ) itu resuspended dalam 300 mL guanidinium

isothiocyanate Solusi ( Guanidinium isothiocyanate ) 4 M , Natrium Sitrat 25 mM , pH 7,0 , b
– mercaptoethanol 1 M ) di 2 tabung tutup sekrup mL . 0,3 mL bebas RNAse manik-manik
ditambahkan dan vortexed 4 kali 30 detik dengan Bead Beater . Semua homogenat
dipindahkan ke 2 mL Tahap Lock Tabung ( PLG ) (Qiagen ) . 26 mL Natrium Asetat 2 M (
pH 4,0 ) adalah ditambahkan ke sampel , tutup tabung PLG dan campuran sebentar . 260 mL
fenol jenuh air ditambahkan ke sampel , topi PLG tersebut tabung , dan aduk rata. 75 mL
kloroform : Isoamyl Alkohol ( 49:1 ) ditambahkan ke sampel dalam sama PLG 2 ml tabung
dan aduk oleh diulang inversi lembut . Integritas RNA diperiksa pada 1,5 % gel agarosa
elektroforesis dengan RNA pemuatan penyangga ( Qiagen ) .

12. Nomor aksesi

Kode dalam kurung mengacu pada proyek genom pombe nomenklatur git3 +

( SPCC1753.02c ) ; gpa2 + git8 + ( SPAC23H3.13c ) ; hxk1 + ( SPAC24H6.04 ) ; hxk2 + (

SPAC4F8.07c ) ; fbp1 + ( SPBC1198.14c ) ; SOD1 + ( SPAC821.10c ) ; sod2 + (
SPAC1486.01 ) ; gpx1 + ( SPBC32F12.03c ) ; top1 + ( SPBC1703.14c ) ; disebutkan
namanya saluran klorida ( SPBC1703.14c )
Hasil (Results)

Jalur glukosa yang terlibat dalam fisi ragi umur panjang. Ketersediaan glukosa
dirasakan melalui dua jalur utama dalam fisi ragi, jalur Git3/PKA dan represi jalur glukosa.
Masing-masing jalur tersebut mengatur fungsi mitokondria. Pada saat ini, kami menekankan
pentingnya sinyal Git3/PKA yang tergantung pada umur panjang serta represi jalur glukosa
dan efek metabolik glikolisis. Sinyal Git3/PKA menghambat respirasi mitokondria, respon
stres oksidatif dan mempromosikan pembentukan ROS dan fenotipe pro-aging. Garis
terputus-putus merupakan homologi terhadap S. cerevisiae. Tanda tanya mewakili
kemungkinan peran mitokondria dalam penuaan selain produksi ROS.