REVISI

LAPORAN PRAKTIKUM
KULTUR JARINGAN TUMBUHAN
Subkultur Kalus Daun Mengkudu (Morinda citrifolia L.) dan Umbi Wortel
(Daucus carota).

Disusun oleh :

Cindy Yong Kurnia Putri (150801578)

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI
FAKULTAS TEKNOBIOLOGI
UNIVERSITAS ATMA JAYA YOGYAKARTA
2017
 REVISI

KREDIT NILAI LAPORAN

PRAKTIKUM KULTUR JARINGAN TUMBUHAN

Judul : Subkultur Kalus Daun Mengkudu (Morinda citrifolia L.) dan Umbi Wortel
(Daucus carota).
KRITERIA NILAI STANDAR NILAI ACC

COVER dan JUDUL

I. PENDAHULUAN
10
a. LATAR BELAKANG
b. TUJUAN PRAKTIKUM
II. TINJAUAN PUSTAKA 20
III. METODE
a. ALAT & BAHAN 15
b. CARA KERJA
III. HASIL & PEMBAHASAN 35
IV. KESIMPULAN & SARAN 10
DAFTAR PUSTAKA 10
LAMPIRAN
JUMLAH 100

Nama : Cindy Yong Kurnia Putri

NPM : 150801578
Golongan :B

Mengetahui,
Asisten

Hermanto
 REVISI

I. PENDAHULUAN

a. Latar Belakang
Teknik kultur jaringan merupakan cara perbanyakan klonal tanaman yang
memiliki beberapa keunggulan, diantaranya perbanyakan klon secara cepat,
menghasilkan keseragaman genetik, bibit yang baik dan bebas penyakit, serta
dapat digunakan untuk penyimpanan plasma nutfah. Kultur jaringan dapat
dilakukan melalui organogenesis maupun embriogenesis somatik, dimana
merupakan proses dimana sel somatik berkembang membentuk tumbuhan baru
melalui tahap perkembangan embrio spesifik. Fungsi penyimpanan plasma
nutfah tanaman untuk melestarikan keanekaragaman genetik tanaman untuk
digunakan di masa yang akan datang. Penyimpanan secara in vitro dilakukan
melalui penyimpanan jangka pendek (cara pemeliharaan dengan melakukan
pemindahan tanaman (subkultur) secara rutin pada media baru agar tanaman
tersebut tetap hidup), jangka pendek dan menengah (cara pemelihataan dengan
cara memperlambat pertumbuhan dengan memanipulasi suhu, memberi zat
penghambat tumbuh (paclobutrazol, asam absisat (ABA), ancymidol),
mengurangi garam-garam anorganik (unsur makro) dan ZPT yang bersifat
promotor (auksin, giberelin, sitokinin), serta menggunakan regulator osmotik
(sorbitol, manitol)) serta jangka panjang (cara kriopreservasi dimana proses
metabolisme dari sel, jaringan maupun organ yang disimpan dihentikan
sehingga tidak ada proses pertumbuhan) (Minarsih dkk., 2016).
Pada kultur jaringan menginduksi terbentuknya kalus merupakan langkah
yang penting. Kalus diharapkan dapat memperbanyak dirinya secara terus
menerus. Kalus adalah suatu kumpulan sel amorphous (tidak berbentuk atau
belum terdiferensiasi) yang terjadi dari sel – sel jaringan yang membelah diri
secara terus menerus secara in vitro atau di dalam tabung dan tidak
terorganisasi sehingga memberikan penampilan sebagai massa sel yang
bentuknya tidak teratur. Secara in vivo, kalus pada umumnya terbentuk pada
bekas luka akibat serangan infeksi mikro organisme seperti Agrobacterium
 REVISI

tumefaciens, gigitan atau tusukan serangga dan nematoda. Kalus juga dapat
terbentuk sebagai akibat stress (George dan Sherrington, 1984).
Subkultur adalah pemindahan kalus/ plantlet dari medium lama ke dalam
medium baru yang dilakukan secara aseptis di dalam entkas atau Laminar Air
Flow (LAF) sedangkan overplanting adalah pemindahan plantlet kecil dari
medium lama ke dalam medium baru yang dilakukan secara aseptis di dalam
entkas atau Laminar Air Flow (LAF). Pada dasarnya subkultur kita
memisahkan, memotong, membelah dan menanam kembali eksplan yang telah
tumbuh sehingga jumlah tanaman akan bertambah banyak. Tujuannya adalah
supaya kultur tetap mendapatkan unsur hara atau nutrisi untuk
pertumbuhannya. Setiap Tanaman memiliki karakteristik dan kecepatan
tumbuh yang berbeda-beda sehingga cara dan waktu subkultur juga berbeda-
beda (Hendaryono dan Wijayani, 1994).
Wortel (Daucus carota) memiliki umur pertumbuhan pendek sekitar 70-
120 hari dan dapat tumbuh dengan bantuan hormon secara optimal pada
konsentrasi 1 ppm-2 ppm. Mengkudu (Morinda citrifolia) memiliki daun
berbentuk bulat telur sampai lanset dengan lebar 8-15 cm dan panjang 10-20
cm serta tepi daun bergelombang, ujung daun lancip, pangkal daun berbentuk
pasak, ukurannya 0,5-25 cm, urat daun menyirip, warna daun hijau mengilap,
dan tidak berbulu. Eksplan dari daun mengkudu membentuk kalus selama 4
hari, dari tangkai daun selama 7 hari dan kelopak bunga selama 6 hari karena
daun memiliki morfologi yang tipis sehingga memudahkan sel-sel
penyusunnya untuk menyerap unsur hara dari media (Noviati dkk., 2014).

b. Tujuan
1. Mengetahui cara melakukan subkultur kalus daun mengkudu (Morinda
citrifolia L.)
2. Mengetahui cara melakukan subkultur kalus umbi wortel (Daucus carota).
3. Mengetahui perbedaan sifat kalus friable dan kompak dari hasil subkultur
4. Mengetahui hasil akhir subkultur kalus daun mengkudu (Morinda citrifolia
L.) selama 14 hari pada botol 1 dan 2.
 REVISI

5. Mengetahui hasil akhir subkultur kalus umbi wortel (Daucus carota)

selama 14 hari pada botol 1 dan 2.
 REVISI

II. TINJAUAN PUSTAKA

Kultur jaringan tumbuhan merupakan salah satu teknik perbanyakan

tumbuhan yang menggunakan sel atau organ atau jaringan tumbuhan dengan cara
membudidayakan suatu jaringan tumbuhan menjadi tumbuhan kecil yang
mempunyai sifat seperti induknya. Teori totipotensi sel ditemukan oleh Scheiden
dan Schwann bahwa kemampuan setiap sel, dari mana saja sel tersebut diambil,
apabila diletakan dalam lingkungan yang sesuai akan dapat tumbuh menjadi
tanaman yang sempurna. Embriogenesis somatik adalah proses dimana sel somatik
(haploid bahkan diploid) berkembang membentuk tumbuhan baru melalui tahap
perkembangan embrio yang spesifik tanpa melalui fusi gamet (Hendaryono &
Wijayani 1994). Penyimpanan secara in vitro dilakukan melalui penyimpanan
jangka pendek (cara pemeliharaan dengan melakukan pemindahan tanaman
(subkultur) secara rutin pada media baru agar tanaman tersebut tetap hidup), jangka
pendek dan menengah (cara pemelihataan dengan cara memperlambat
pertumbuhan dengan memanipulasi suhu, memberi zat penghambat tumbuh
(paclobutrazol, asam absisat (ABA), ancymidol), mengurangi garam-garam
anorganik (unsur makro) dan ZPT yang bersifat promotor (auksin, giberelin,
sitokinin), serta menggunakan regulator osmotik (sorbitol, manitol)) serta jangka
panjang (cara kriopreservasi dimana proses metabolisme dari sel, jaringan maupun
organ yang disimpan dihentikan sehingga tidak ada proses pertumbuhan) (Minarsih
dkk., 2016).Manfaat kultur biji untuk konservasi tanaman yang terancam punah,
dapat menghembat biaya pengadaan bibit suatu tanaman dan biaya transportasi dan
dapat menyediakan bibit dalam jumlah banyak dengan waktu yang singkat
sedangkan kelemahan kultur biji adalah biaya yang relatif lebih besar untuk
pengadaan laboratorium, dibutuhkan keahlian khusus untuk mengerjakannya dan
tanaman yang dihasilkan berukuran kecil dengan kondisi aseptik (Gunawan, 1995).
Prinsip kultur jaringan tumbuhan adalah perbanyakan tumbuhan secara vegetatif
dan dilakukan secara aseptis (Hadioetomo, 1993).
Menurut Minarsih dkk. (2016), kelebihan teknik kultur jaringan adalah
memperbanyak tanaman yang sulit diperbanyak secara konvensional dalam waktu
 REVISI

singkat, perbanyakannya tidak membutuhkan tempat yang luas, bibit lebih sehat
dan dapat dilakukan sepanjang tahun tanpa mengenal musim. Kelemahan teknik
kultur jaringan tumbuhan adalah dibutuhkan biaya besar untuk pengadaan
laboratorium dan dibutuhkan keahlian khusus untuk mengerjakannya. Selain itu,
tanaman yang dihasilkan berukuran kecil dengan kondisi aseptik, terbiasa
dilingkungan hidup dengan kelembaban tinggi dan relatif stabil sehingga perlu
perlakuaan khusus setelah aklimatisasi.
Eksplan adalah bagian atau bahan tanaman yang akan dikultur dalam proses
kultur jaringan tumbuhan. Pemilihan eksplan harus pada bagian tanaman muda dan
mudah tumbuh (jaringan meristem), contohnya adalah daun muda, ujung batang
dan keping biji. Prinsip sterilisasi eksplan yaitu mensterilkan eksplan dari berbagai
mikroorganisme namun eksplan tidak ikut mati. Eksplan jaringan muda memiliki
tingkat keberhasilan tinggi karena memiliki sel yang aktif membelah, mudah
menghasilkan tunas bahkan akar adventif lebih cepat dan dinding sel tipis (belum
terjadi penebalan lignin dan selulose) sebagai penyebab kekakuan sel (Manullang
dkk., 2006). Keuntungan menerapkan kultur kalus adalah dapat memproduksi
metabolit sekunder yang dapat diinisiasi secara cepat dan dalam waktu yang
singkat, perbanyakan tanaman dilakukan secara cepat walaupun membutuhkan
eksplan sedikitpun, mendapatkan tanaman yang bebas penyakit karena dilakukan
secara aseptis dan eksplan yang steril sehingga memiliki responsibilitas tinggi
(meristematik) namun kerugian subkultur yaitu memerlukan skill subkultur yang
teliti dan cermat pada praktikan (Santoso dan Nursadi, 2004).
Kalus adalah suatu kumpulan sel amorphous (tidak berbentuk atau belum
terdiferensiasi) yang terjadi dari sel bahkan jaringan yang membelah diri secara
terus menerus dan berproliferasi secara in vitro atau di dalam tabung dan tidak
terorganisasi sehingga memberikan penampilan sebagai massa sel yang bentuknya
tidak teratur. Proliferasi jaringan ini dapat dilakukan secara tidak terbatas dengan
cara melakukan subkultur sepotong kecil jaringan kalus pada medium yang segar
dengan interval waktu yang teratur. Kalus dapat diperoleh dari bagian tanaman
seperti akar, batang dan daun dimana penelitian pembentukan kalus pada jaringan
terluka pertama kali dilakukan oleh Sinnott pada tahun 1960. Pembentukan kalus
 REVISI

pada jaringan luka dipacu oleh zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin endogen.
Kultur kalus merupakan pemeliharaan bagian kecil tanaman dalam lingkungan
buatan yang steril dan kondisi yang terkontrol (Dodds dan Roberts, 1983).
Tujuan kultur kalus adalah untuk memperoleh kalus dari eksplan yang
diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali, memperbanyak klon
tanaman melalui pembentukan organ dan embrio, meregenerasi varian – varian
genetika, mendapatkan tanaman bebas virus, sebagai sumber untuk produksi
protoplas, sebagai bahan awal untuk kreopreservasi. memproduksi metabolit
sekunder dan biotransformasi. Kalus mempunyai pertumbuhan yang abnormal dan
berpotensi untuk berkembang menjadi akar, tunas dan embrioid yang nantinya akan
dapat membentuk plantlet. Sel-sel pada kalus dapat mengalami diferensiasi
(reverse dari sel-sel hidup yang telah terdiferensiasi menjadi tidak terdiferensiasi,
atau dengan kata lain menjadi meristematik kembali) dan dediferensiasi (langkah
awal bagi perbanyakan vegetative dengan teknik kultur in vitro karena merupakan
dasar terjadinya primordia tunas dan akar) (Santoso dan Nursadi, 2004).
Menurut Rusdianto dan Indrianto (2012), 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid
(2,4-D) adalah herbisida sistemik yang umum untuk digunakan dalam mengontrol
gulma yang tumbuh dalam tanaman pertanian. 2,4-D dikenal sebagai salah satu
jenis auksin sintetik yang penting sebagai salah satu senyawa yang masuk ke dalam
grup hormon auksin, maka 2,4-D dapat bekerja maksimum untuk pembelahan dan
pembesaran sel serta pembentukan akar stek bila diberikan dalam konsentrasi
rendah. 2,4-D juga berfungsi sebagai zat pengatur tumbuh yang bila digunakan
dalam konsentrasi rendah akan merangsang dan menggiatkan pertumbuhan
tanaman.
Warna kalus digunakan sebagai salah satu indikator baik tidaknya kualitas
kalus. Kualitas kalus yang baik memiliki warna hijau sedangkan warna terang
bahkan putih memiliki kondisi kalus yang cukup baik. Apabila warna kalus
semakin gelap menjadi coklat maka pertumbuhan kalus menjadi menurun.
Pentingnya kultur kalus adalah untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi
dan ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali. Kalus memiliki tingkat mutasi yang
lebih besar dibandingkan dengan tunas. Kultur kalus digunakan untuk memperoleh
 REVISI

tanaman bebas virus, regenerasi varian genetika, embriogenesis somatik dan

menghasilkan senyawa metabolit sekunder. Pembentukan kalus pada eksplan
dimana secara fisiologi dipengaruhi oleh perubahan genetik pada sel tanaman oleh
auksin. Keberhasilan akan tercapai apabila kalus atau sel yang digunakan bersifat
embriogenik yang dicirikan oleh sel yang berukuran kecil, sitoplasma padat, inti
besar, vakuola kecil-kecil dan mengandung butir pati (Yelnititis, 2012).
Kalus memiliki sifat yang berbeda-beda dimana memiliki 2 sifat yaitu
meremah (friable) dan padat (compact). Kultur meremah memiliki ciri-ciri yaitu
memiliki sel-sel penyusunnya berukuran kecil, sel-sel dengan ruang antar sel yang
banyak, tekstur lunak dan berikatan longgar yang dapat dihasilkan melalui
subkultur berulang pada perlakuan yang sama atau dikombinasikan dengan zat
pengatur tumbuh yang lain maupun pada perlakuan yang berbeda. Kalus remah
mempunyai penampilan visual terbaik yang dihasilkan dari tahap perbanyakan
kalus yang digunakan sebagai eksplan. Tekstur kalus kompak memiliki ciri-ciri
bentuknya rapat dan padat serta sulit untuk dipisahkan (Kherasani dkk., 2017).
Kalus dengan tekstur meremah akan menghasilkan metabolit sekunder lebih
sedikit dibandingkan dengan kalus dengan tekstur kompak. Perbedaan struktur
kalus menimbulkan adanya perbedaan kemampuan dalam produksi metabolit
sekunder. Metabolit sekunder yang dihasilkan dari kultur kalus biasanya lebih
banyak jenisnya, karena seringkali timbul zat-zat alkaloid atau senyawa-senyawa
lain yang sangat berguna untuk pengobatan. Perbedaan jenis kalus tergantung pada
komposisi media pengkulturan khususnya pada zat pengatur tumbuh dan jenis
eksplan yang digunakan (Sugiyarto dan Kuswandi, 2014).

Gambar 1. Kalus yang memiliki sifat meremah (Yelnititis, 2012).

Gambar 2. Kalus yang memiliki sifat kompak (Sugiyarto dan Kuswandi, 2014).
 REVISI

Subkultur adalah metode pada kultur jaringan tumbuhan dengan

memindahkan eksplan/ kalus dari medium lama ke medium yang baru secara
aseptis. Subkultur bertujuan untuk mendapatkan unsur hara dan nutrisi untuk
pertumbuhannya. Hal-hal yang memicu untuk melakukan subkultur adalah
tanaman mulai kekurangan dan kehilangan unsur hara, tanaman sudah memenuhi
botol kultur, tanaman sudah lama didalam botol kultur menyebabkan laju
pertumbuhan berkurang, eksplan memerlukan media dengan susunan yang baru
agar dapat mengalami diferensiasi lebih lanjut dan media didalam botol sudah
mengering. Pada tanaman yang diperbanyak dengan kultur biji, kultur embrio, baik
pada embrio somatik maupun embrio mikrospora serta multifikasi tunas, maka
subkultur dapat dilakukan dengan memisahkan anakan tanaman dari koloninya
(Hendaryono dan Wijayani, 1994).
Menurut Suryowinoto (1985), teknik subkultur dalam kultur jaringan
dibedakan menjadi 2 macam yaitu subkultur dengan medium padat (kalus
diletakkan pada medium padat yang baru) dan subkultur dengan medium cair (kalus
diletakkan dalam medium cair yang baru dalam botol yang berbeda atau medium
lama diambil dan ditambahkan medium baru dalam botol yang sama). Waktu
optimum untuk menghasilkan subkultur yang baik berkisar antara 1-2 minggu,
sedangkan medium optimum yang digunakan adalah medium air kelapa karena
dengan penambahan air kelapa dalam media kultur dapat membantu mendorong
pertumbuhan, baik pertumbuhan planlet, daun, dan akar. Eksplan atau kalus yang
sudah waktunya dipindahkan ke dalam media kultur yang baru harus segera
dilaksanakan dan tidak boleh sampai terlambat.
Subkultur yang terlambat dapat menyebabkan pertumbuhan eksplan atau
kalus tersebut akan terhenti atau mengalami pencoklatan atau bahkan
terkontaminasi oleh jamur atau bakteri. Keadaan eksplan yang demikian
kemungkinan untuk diselamatkan kecil sekali karena spora jamur atau bakteri dapat
menyebar dengan sangat cepat. Apabila eksplan atau kalus tersebut sudah
disubkultur pada media kultur yang baru maka dalam jangka waktu 2-3 minggu,
eksplan tersebut baru akan mengalami pencoklatan, nekrosis, ataupun mati.
Tahapan yang dilakukan dalam proses subkultur yaitu media dibuat terlebih dahulu
 REVISI

sebelum kegiatan subkultur dilakukan, ruang penabur dan alat yang digunakan
disterilkan terlebih dahulu, kalus yang akan disubkultur dikeluarkan dari dalam
botol dan diletakkan diatas cawan petri, eksplan dibersihkan dari media, eksplan
dipotong-potong dan dipindahkan ke media yang paling baru serta ditutup dengan
alumunium foil dan plastic wrap. Umur fisiologis eksplan berpengaruh terhadap
kemampuannya untuk beregenerasi. Jaringan tanaman yang masih muda yang
meristematik lebih mudah beregenerasi dibandingkan dengan jaringan yang sudah
tua (Gunawan, 1995).
Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan kalus antara lain bahan
sterilisasi, kandungan unsur kimia dalam media, hormon yang digunakan, substansi
organik yang ditambahkan dan terang gelapnya saat inkubasi, fisiologi jaringan
tanaman sebagai eksplan, lingkungan tumbuh yaitu keadaan fisik tempat kultur
ditumbuhkan dan genotipe dari sumber bahan tanam itu sendiri. Dalam kultur kalus
sel atau irisan jaringan tanaman yang disebut eksplan secara aseptik diletakkan dan
dipelihara dalam media padat atau media cair yang cocok dan dalam keadaan steril.
Dengan demikian sebagian sel pada permukaan irisan akan mengalami proliferasi
dan membentuk kalus. Sterilisasi secara fisik digunakan untuk eksplan yang keras
bahkan berdaging yaitu dengan membakar eksplan diatas lampu spiritus sebanyak
tiga kali untuk menghindarkan biji tersebut dari agen kontaminan. Sterilisasi
digunakan untuk menghindari eksplan bahkan kalus dari kontaminan. Sterilisasi
secara kimiawi dapat dengan alkohol yang merupakan denaturan protein
(antimikrobial) dan kadar 70% umum dipakai untuk sterilisasi. Bahan lain adalah
Natrium hipoklorit (NaOCl) (clorox) dimana memiliki pH yang tidak stabil, bersifat
toksik, namun tidak merusak jaringan (Ardiansyah dkk, 2014).
Menurut Gamborg dan Phillips (1995), fase pertumbuhan kalus dibagi
menjadi lima yaitu fase lag (sel eksplan bahkan kalus mengalami pembelahan), fase
eksponensial (laju pembelahan sel kalus berada pada puncaknya), fase linear
(pembelahan sel mengalami perlambatan dan ekspansi sel meningkat), fase
deselerasi (laju ekspansi dan perlambatan meningkat) dan fase stasioner (ukuran
dan jumlah sel tetap). Kalus yang diberikan fase istirahat diharapkan
pertumbuhannya tidak terlalu cepat yang dicerminkan dengan perubahan bobot
 REVISI

basah yang rendah. Pertumbuhan yang lambat menyebabkan kandungan unsur hara
pada media tumbuh tidak cepat menurun sehingga subkultur dapat dilakukan lebih
lama. Penyebab kematian kalus adalah kontaminasi (bisa disebabkan oleh bakteri
dan jamur), pencoklatan pada kalus, kandungan nutrisi medium yang menurun.
Kalus berukuran 1-2 mm adalah yang terbaik untuk dipindahkan ke medium
regenerasi, sedangkan jika kurang dari 1 mm akan sulit beregenerasi / mati
(Minarsih dkk., 2016).
Menurut George dan Sherrington (1984), eksplan batang, akar dan daun
menghasilkan kalus yang heterogen dengan macam sel. Sel heterogen dari jaringan
yang kompleks menunjukkan pertumbuhan yang berbeda. Sel heterogen berasal
dari materi asal yang heterogen pula, atau dapat terjadi karena massa kultur yang
panjang melalui subkultur yang berkali-kali. Perubahan yang terjadi dapat
merupakan aberasi kromosom, endo-reduplikasi yang menghasilkan poliploid,
amplifikasi gen, jumlah gen untuk suatu sifat tertentu per genome haploid
bertambah, hilangnya suatu gen (delesi), mutasi gen dan transposisi urutan DNA
(DNA sequences transposition).
Mengkudu (Morinda citrifolia) memiliki daun berbentuk bulat telur sampai
lanset dengan lebar 8-15 cm dan panjang 10-20 cm serta tepi daun bergelombang,
ujung daun lancip, pangkal daun berbentuk pasak, ukurannya 0,5-25 cm, urat daun
menyirip, warna daun hijau mengilap, dan tidak berbulu. Eksplan dari daun
mengkudu membentuk kalus selama 4 hari, dari tangkai daun selama 7 hari dan
kelopak bunga selama 6 hari karena daun memiliki morfologi yang tipis sehingga
memudahkan sel-sel penyusunnya untuk menyerap unsur hara dari media. Semakin
luas permukaan irisan eksplan maka kalus yang terbentuk semakin banyak serta
kalus yang terbentuk apabila telah mengalami luka bekas irisan yang memiliki ciri-
ciri yaitu eksplan bengkak dan muncul agregat sel berwarna putih (Noviati dkk.,
2014).
Pemotongan eksplan daun mengkudu dilakukan dengan 2 epidermis yaitu
abaksial dan adaksial. Jumlah stomata bagian abaksial (bawah) lebih banyak
dibandingkan dengan bagian adaksial (atas). Pada bagian adaksial (atas) terdapat
lapisan kutikula yang tebal dan menutupi stomata sehingga ‘menghalangi terjadinya
 REVISI

proses transpirasi yang mengakibatkan kerapatan stomata pada bagian abaksial

lebih besar dari kerapatan stomata pada bagian adaksial. Pertumbuhan eksplan
menjadi kalus pada daun dapat tumbuh optimal pada konsnetrasi sekitar 3-4 ppm
Kondisi kalus daun mengkudu yang disubkultur yang berkembang dengan
baik adalah putih kekuningan dan bersifat friable (remah) (Mulyani, 2006).
Semakin lama kalus ditanam pada media perlakuan, warnanya semakin coklat
tua hingga coklat kehitaman dan muncul kalus muda yang berwarna kuning bening
(yellowish) dengan tesktur kompak karena kalus yang dikulturkan semakin tua serta
memiliki kandungan fenol tinggi sehingga mudah teroksidasi fenol tersebut
menjadi kuinon fenolik. Penambahan ion Ca2+ dan Cu2+ pada kalus mengkudu
menyebabkan terjadinya interaksi antara kedua ion tersebut maupun dengan ion-
ion lainnya sehingga kompetisi antar ion terjadi sehingga memicu kalus untuk
mengabsorbsi ion-ion lain secara berlebih guna mensubstitusi kekurangan akan
salah satu ion yang dibutuhkan karena terdapat sifat antagonisme dari kedua ion
tersebut, yaitu adanya penghambatan penyerapan salah satu ion apabila ion satunya
dalam kondisi berlebih maupun sebaliknya (Ariningsih dkk., 2013).
Wortel (Daucus carota) memiliki umur pertumbuhan pendek sekitar 70-120
hari dan dapat tumbuh dengan bantuan hormon secara optimal pada konsentrasi 1
ppm-2 ppm. Pembentukan kalus ditentukan sumber eksplan, komposisi nutrisi pada
medium dan faktor lingkungan eksplan yang berasal dari jaringan meristem
berkembang lebih cepat dibanding jaringan dari sel-sel berdinding tipis dan
mengandung lignin sehingga eksplan umbi wortel ini menjadi kriteria eksplan yang
tepat untuk pembentukan kalus terutama untuk komposisi media yang sudah
ditambahkan ZPT tertentu untuk menginduksi kalus. Sterilisasi eksplan wortel
dapat dilakukan dengan cara dibakar pada lampu spiritus pada bagian luar serta
diambil bagian dalam untuk dijadikan eksplan dan eksplan harus dikupas terlebih
dahulu agar mencegah kegagalan induksi kalus sehingga sel-sel akan terangsang
untuk tumbuh (Mulyani, 2006).
Pemotongan eksplan dilakukan melalui 2 cara yaitu pemotongan pada bagian
korteks dan bagian empulur. Empulur berada dipusat batang adalah jaringan
parenkim yang terdapat diantara berkas vaskuler pada stele. Korteks terdiri dari
 REVISI

banyak sel dan tersusun berlapis-lapis, dinding selnya tipis dan mempunyai banyak
ruang antarsel untuk pertukaran gas. Pada bagian korteks kinerja pertumbuhan
eksplan lebih cepat dibandingkan dengan empulur karena memiliki banyak dinding
sel dan ruang antar sel untuk pertukaran senyawa (Mulyani, 2006). Kalus yang
dihasilkan memiliki warna yang bervariasi yang tergantung dari eksplan
wortelnya seperti pada wortel orange memiliki kalus berwarna orange
kekuningan bahkan berwarna kuning keputihan dimana perbedaan warna
dapat disebabkan karena stress oleh lingkungan disekitar eksplan maka akan
menghasilkan beberapa pigmen yang meningkatkan ekspresi karotenoid
(auksin) bahkan menghambat pigmen karotenoid (sitokinin) serta bersifat
friable (remah) (Rusdianto dan Indrianto, 2012).
Apabila kalus tidak disubkultur maka mengakibatkan beberapa hal
seperti nutrisi telah habis, terhambatnya difusi nutrien, terjadi penguapan air
pada media sehingga konsentrasi elemen tertentu akan meningkat didalam
media) dan pertumbuhan metabolit toksik bagi pertumbuhan kalus.
Penyimpanan kalus pada pencahayaan yang baik dan dalam suhu 24̊C dan
diperlukan penyimpanan dalam jangka panjang (kriopreservasi). Apabila
kalus terlalu banyak disubkultur maka terjadi keanekaragaman sel dan
penurunan kualitas. Apabila kalus disubkultur maka kalus dapat
berkembang lebih baik dan bersifat friable dan kalus akan terbantu oleh
nutrisi dari medium baru dengan komposisi yang sama. Hal-hal yang harus
diperhatikan dalam subkultur adalah kalus yang digunakan harus berumur
3-8 minggu dengan diameter 2-3 cm yang dipotong menjadi 4-8 bagian dan
ditanam pada media baru, dilakukan sebelum kalus berwarna coklat, keadaan
morfologi kalus tumbuh dengan baik dan optimal, kalus memiliki
pertumbuhan yang cepat dan warna pucat serta lunak, penyimpanan kalus
pada pencahayaan yang baik dengan lampu LED dalam suhu 24̊C serta
disimpan dalam lingkungan yang aseptis dan steril (Noviati dkk., 2014).
Menurut Suryowinoto (1988), penggunaan enkast dan LAF digunakan
sebagai ruang penabur untuk melakukan kultur baik kalus bahkan eksplan serta
untuk sterilisasi bahan yang digunakan. Sterilisasi enkast dengan formalin tablet
 REVISI

yang diletakkan pada cawan petri. Prinsip dari enkast yaitu pengukuran secara
aseptis berdasarkan berkurangnya kontaminasi mikroorganisme dalam sistem
tertutup dengan mengalirkan udara ke dalam lemari penabur melalui saringan besar.
Cara penggunaan enkast yaitu larutan alkohol dan tissue dimasukkan dalam entkas
dan disterilkan dengan cara menyemprotkan alkohol ke semua bagian entkas
kecuali bagian yang terdapat cawan petri berisi formalin dan dilap menggunakan
tissue. Enkast dijenuhkan dengan larutan alkohol selama 30 menit (Widarto, 2000).
Menurut Santoso dan Nursandi (2004), LAF (Laminar Air Flow) merupakan
meja steril untuk melakukan inokulasi atau penanaman yang digunakan dalam
persiapan bahan medium, memasukkan medium bahkan pemindahan medium dari
suatu cawan ke cawan lain. Prinsip dari LAF yaitu penaseptisan suatu ruangan
berdasarkan aliran udara keluar dengan kontaminasi udara yang diminimalkan.
Alat-alat yang akan digunakan selama pelaksanaan kerja dimasukkan ke dalam
LAF dan dijenuhkan setelah disterilisasi (Wijayanto, 2011).
Menurut Sandra (2002), sterilisasi adalah segala kegiatan dalam kultur
jaringan harus dilakukan di tempat yang steril (Laminar Air Flow) dan
menggunakan alat-alat yang juga steril. Teknisi yang melakukan kultur jaringan
juga harus steril. Prinsip dari sterilisasi eksplan adalah mensterilkan eksplan dari
berbagai mikroorganisme, tetapi eksplannya tidak ikut mati.
Medium dapat mengalami kontaminasi yang mengakibatkan kegagalan
dalam kultur jaringan yang berasal dari spora jamur dan bakteri yang membentuk
bagian alami dari atmosfer. Kontaminasi bakteri memiliki ciri-ciri kalus berwarna
kecoklatan, medium menjadi coklat, medium mengkilat dan sedikit cair serta
menutupi seluruh permukaan medium serta eksplan yang telah ditanam. Ciri-ciri
kontaminasi jamur adalah munculnya selaput bening yang membayang pada media
kemudian berubah menjadi putih kekuningan, kalus lebih kering dan terdapat garis
seperti benang berwarna putih seperti terbentuknya hifa. Kontaminasi yang terjadi
akibat bakteri dapat menyebabkan pembusukan, biasanya ditandai dengan
keluarnya lendir dan bau busuk pada medium. Tingkat kontaminasi permukaan
yang berbeda dilihat dari jenis tanaman (ada pula tanaman yang menghasilkan
banyak cairan atau getah menyebabkan tanaman tersebut terserang oleh agen
 REVISI

kontaminan), bagian tanaman yang digunakan (semakin lembab bagian tanaman

yang digunakan maka semakin banyak pula agen kontaminan dan mudah
mengalami kontaminasi), morfologi tanaman (semakin banyak lekukan pada
tanaman tersebut semakin banyak agen kontaminan yang ada), lingkungan tumbuh
tanaman (lingkungan yang kurang mendukung maka tingkat kontaminasi tinggi),
musim waktu pengambilan tanaman (semakin lama musim yang dialami tidak
sesuai tanaman tidak tumbuh dengan maksimal dan akan menimbulkan tumbuhnya
agen kontaminan disekitar tanaman), umur tanaman (semakin tua umur tanaman
maka semakin mudah layu dan mudah terdapat agen kontaminan) dan kondisi
tanaman (semakin kuat kondisi tanaman maka semakin sedikit agen kontaminan
yang ada) (Herawan dan Na’iem, 2006).
Menurut Susilowati dan Listyawati (2001), kontaminasi berasal dari
kontaminan eksternal baik berupa jamur maupun bakteri yang tumbuh di dalam
jaringan tanaman (internal). Kontaminasi adalah terdapatnya senyawa atau
organisme asing dalam suatu media dimana kinerja dalam kultur harus steril dan
aseptis agar dapat terhindar dari kontaminasi dan dapat meningkatkan kinerja
pertumbuhan eksplan secara optimal. Sumber kontaminasi berasal dari organisme
kecil yang masuk ke media, alat yang tidak steril dan lingkungan kerja yang kotor
dimana gejala yang ditimbulkan seperti tumbuhnya hifa jamur pada permukaan
media.
Menurut Hendaryono dan Wijayani (1994), medium MS (Murashige dan
Skoog, 1962) dengan pH 5,5-5,8 merupakan medium yang digunakan karena
mengandung garam nitrat dengan konsentrasi yang lebih tinggi dibanding media
lain. Keuntungan menggunakan medium MS adalah kandungan nitrat, kalium dan
ammoniumnya yang tinggi dan jumlah hara anorganik layak untuk memenuhi
kebutuhan banyak sel tanaman dalam kultur. Komposisi pada medium MS adalah:
 REVISI

Gambar 3. Komposisi medium yang digunakan untuk kultur jaringan tumbuhan

(Chawla, 2002).
 REVISI

III. METODE

A. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum adalah LAF (Laminar Air
Flow), kertas payung, botol kultur, alumunium foil, plastic wrap, timbangan
analitik, kertas saring, sarung tangan, masker, jas lab, tisu, label, blade, enkast,
pinset, petridisk, scalpel, bunsen, korek api. Bahan-bahan yang digunakan
dalam praktikum adalah alkohol 70%, kalus mengkudu, kalus wortel dan
medium MS dengan hormon 2,4 D.

B. Cara kerja
1. Sterilisasi ruang penabur (LAF)
Tombol lampu dinyalakan dan pintu LAF dibuka (tidak perlu terlalu
lebar). Tangan praktikan disemprot dengan alkohol dan tisu serta alkohol
70% dimasukan kedalam laminar air flow (LAF). Meja LAF disemprot
dengan alkohol 70% dan dikeringkan (di lap) dengan tisu secara searah
menuju bagian luar LAF. Pintu LAF ditutup dan tombol lampu dimatikan.
Alat (pinset, skalpel, enkast, LAF (Laminar Air Flow), tisu, plastic wrap,
alumunium foil, dan cawan petri), kalus mengkudu, kalus wortel, medium
MS dengan hormon 2,4 D dan alat serta bahan lain yang dibutuhkan
dimasukkan ke dalam ruang penabur. Tombol UV dan blower dinyalakan
selama 30 menit untuk dijenuhkan dan ruang penabur siap untuk
digunakan.
2. Sterilisasi ruang penabur (enkast)
Enkast disemprotkan dan dibersihkan dengan alkohol 70%. Alkohol
70% tidak diperkenankan kontak langsung dengan tablet formalin yang
terletak diujung dalam enkast. Alat (scalpel, blade, pinset dan cawan petri),
medium MS, kalus mengkudu, kalus wortel dan alat serta bahan lain yang
dibutuhkan dimasukkan ke dalam ruang penabur. Ruang penabur siap
digunakan.
 REVISI

3. Pemilihan kalus dan subkultur kalus daun mengkudu

Alat dan bahan yang diperlukan disiapkan dan dimasukkan didalam
ruang penabur terlebih dahulu. Kalus daun mengkudu dipilih yang paling
baik. Apabila kalus berukuran besar, bagian kalus daun mengkudu
dipotong dengan scalpel dan blade dengan ukuran 1 cm hingga terbagi
menjadi beberapa bagian. Bagian kalus yang sudah dipotong, ditanam
dalam medium yang baru searah dengan pertumbuhan kalus daun
mengkudu pada medium sebelumnya.
Kalus dimasukkan kedalam botol kultur dengan konsentrasi medium
MS disertai hormon 2,4 D dengan konsentrasi 1 ppm masing-masing
sebanyak dua kalus didalam satu botol kultur. Botol kultur ditutup dengan
alumunium foil dan plastic wrap dan botol diinkubasi didalam ruang
inkubasi yang diamati selama 14 hari. Hasil yang diperoleh diamati dan
dicatat parameter yang diamati berupa kontaminasi dan respon tumbuh
berupa morfologi (warna kalus, sifat kalus (friable/ kompak) serta hasil
kalus yang diperoleh didokumentasi).
4. Pemilihan kalus dan subkultur kalus umbi wortel
Alat dan bahan yang diperlukan disiapkan dan dimasukkan didalam
ruang penabur terlebih dahulu. Kalus umbi wortel dipilih yang paling baik.
Apabila kalus berukuran besar, bagian kalus umbi wortel dipotong dengan
scalpel dan blade dengan ukuran 1 cm hingga terbagi menjadi beberapa
bagian. Bagian kalus yang sudah dipotong, ditanam dalam medium yang
baru searah dengan pertumbuhan kalus umbi wortel pada medium
sebelumnya.
Kalus dimasukkan kedalam botol kultur dengan konsentrasi medium
MS disertai hormon 2,4 D dengan konsentrasi 1 ppm masing-masing
sebanyak dua kalus didalam satu botol kultur. Botol kultur ditutup dengan
alumunium foil dan plastic wrap dan botol diinkubasi didalam ruang
inkubasi yang diamati selama 14 hari. Hasil yang diperoleh diamati dan
dicatat parameter yang diamati berupa kontaminasi dan respon tumbuh
 REVISI

berupa morfologi (warna kalus, sifat kalus (friable/ kompak) serta hasil
kalus yang diperoleh didokumentasi).
 REVISI

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Kultur jaringan tumbuhan merupakan salah satu teknik perbanyakan tanaman

dengan membudidayakan suatu jaringan tumbuhan menjadi tumbuhan kecil yang
mempunyai sifat seperti induknya. Teori totipotensi sel adalah kemampuan setiap
sel, dari mana saja sel tersebut diambil, apabila diletakan dalam lingkungan yang
sesuai akan dapat tumbuh menjadi tanaman yang sempurna. Penyimpanan secara
in-vitro dilakukan melalui penyimpanan jangka pendek, pendek dan menengah dan
panjang dimana salah satunya penyimpanan jangka pendek merupakan pemindahan
kalus dari medium kecil ke medium baru. Keuntungan menerapkan kultur kalus
adalah dapat memproduksi metabolit sekunder yang dapat diinisiasi secara cepat
dan dalam waktu yang singkat, perbanyakan tanaman dilakukan secara cepat
walaupun membutuhkan eksplan sedikitpun, mendapatkan tanaman yang bebas
penyakit karena dilakukan secara aseptis dan eksplan yang steril sehingga memiliki
responsibilitas tinggi (meristematik) (Santoso dan Nursadi, 2004).
Eksplan adalah bagian atau bahan tanaman yang akan dikultur dalam proses
kultur jaringan tumbuhan. Pemilihan eksplan harus pada bagian tanaman muda dan
mudah tumbuh (jaringan meristem), contohnya adalah daun muda, ujung batang
dan keping biji. Kalus adalah suatu kumpulan sel amorphous (tidak berbentuk atau
belum terdiferensiasi) yang terjadi dari sel bahkan jaringan yang membelah diri
secara terus menerus dan berproliferasi secara in vitro atau di dalam tabung dan
tidak terorganisasi sehingga memberikan penampilan sebagai massa sel yang
bentuknya tidak teratur. Kultur kalus merupakan pemeliharaan bagian kecil
tanaman dalam lingkungan buatan yang steril dan kondisi yang terkontrol. Tujuan
kultur kalus adalah untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi dan
ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali, memperbanyak klon tanaman melalui
pembentukan organ dan embrio, meregenerasi varian–varian genetika,
mendapatkan tanaman bebas virus, sebagai sumber untuk produksi protoplas,
sebagai bahan awal untuk kreopreservasi. memproduksi metabolit sekunder dan
biotransformasi (Dodds dan Roberts, 1983).
 REVISI

Kualitas kalus yang baik memiliki warna hijau sedangkan warna terang
bahkan putih memiliki kondisi kalus yang cukup baik. Apabila warna kalus
semakin gelap menjadi coklat maka pertumbuhan kalus menjadi menurun.
Keberhasilan akan tercapai apabila kalus atau sel yang digunakan bersifat
embriogenik yang dicirikan oleh sel yang berukuran kecil, sitoplasma padat, inti
besar, vakuola kecil-kecil dan mengandung butir pati (Yelnititis, 2012).
Kalus memiliki sifat yang berbeda-beda dimana memiliki 2 sifat yaitu
meremah (friable) dan padat (compact). Kultur meremah memiliki ciri-ciri yaitu
memiliki sel-sel penyusunnya berukuran kecil, sel-sel dengan ruang antar sel yang
banyak, tekstur lunak dan berikatan longgar yang dapat dihasilkan melalui
subkultur berulang pada perlakuan yang sama atau dikombinasikan dengan zat
pengatur tumbuh yang lain maupun pada perlakuan yang berbeda. Kalus remah
mempunyai penampilan visual terbaik yang dihasilkan dari tahap perbanyakan
kalus yang digunakan sebagai eksplan. Tekstur kalus kompak memiliki ciri-ciri
bentuknya rapat dan padat serta sulit untuk dipisahkan (Kherasani dkk., 2017).
Subkultur adalah metode pada kultur jaringan tumbuhan dengan
memindahkan eksplan/ kalus dari medium lama ke medium yang baru secara
aseptis. Subkultur bertujuan untuk mendapatkan unsur hara dan nutrisi untuk
pertumbuhannya. Hal-hal yang memicu untuk melakukan subkultur adalah
tanaman mulai kekurangan dan kehilangan unsur hara, tanaman sudah memenuhi
botol kultur, tanaman sudah lama didalam botol kultur menyebabkan laju
pertumbuhan berkurang, eksplan memerlukan media dengan susunan yang baru
agar dapat mengalami diferensiasi lebih lanjut dan media didalam botol sudah
mengering. teknik subkultur dalam kultur jaringan dibedakan menjadi 2 macam
yaitu subkultur dengan medium padat (kalus diletakkan pada medium padat yang
baru) dan subkultur dengan medium cair (kalus diletakkan dalam medium cair yang
baru dalam botol yang berbeda atau medium lama diambil dan ditambahkan
medium baru dalam botol yang sama). Waktu optimum untuk menghasilkan
subkultur yang baik berkisar antara 1-2 minggu (Suryowinoto, 1985).
Subkultur yang terlambat dapat menyebabkan pertumbuhan eksplan atau
kalus tersebut akan terhenti atau mengalami pencoklatan atau bahkan
 REVISI

terkontaminasi oleh jamur atau bakteri. Apabila eksplan atau kalus tersebut sudah
disubkultur pada media kultur yang baru maka dalam jangka waktu 2-3 minggu,
eksplan tersebut baru akan mengalami pencoklatan, nekrosis, ataupun mati. Ukuran
kalus yang paling baik antara 1-2 mm , sedangkan jika kurang dari 1 mm akan sulit
beregenerasi / mati (Minarsih dkk., 2016).
Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan kalus antara lain bahan
sterilisasi, kandungan unsur kimia dalam media, hormon yang digunakan, substansi
organik yang ditambahkan dan terang gelapnya saat inkubasi, fisiologi jaringan
tanaman sebagai eksplan, lingkungan tumbuh yaitu keadaan fisik tempat kultur
ditumbuhkan dan genotipe dari sumber bahan tanam itu sendiri. Sterilisasi
digunakan untuk menghindari eksplan bahkan kalus dari kontaminan. Sterilisasi
secara kimiawi dapat dengan alkohol yang merupakan denaturan protein
(antimikrobial) dan kadar 70% umum dipakai untuk sterilisasi. Sterilisasi secara
fisik digunakan untuk eksplan yang keras bahkan berdaging yaitu dengan
membakar eksplan diatas lampu spiritus sebanyak tiga kali untuk menghindarkan
biji tersebut dari agen kontaminan (Ardiansyah dkk, 2014).
Menurut Rusdianto dan Indrianto (2012), 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid
(2,4-D) adalah herbisida sistemik yang umum untuk digunakan dalam mengontrol
gulma yang tumbuh dalam tanaman pertanian. 2,4-D dikenal sebagai salah satu
jenis auksin sintetik yang penting sebagai salah satu senyawa yang masuk ke dalam
grup hormon auksin, maka 2,4-D dapat bekerja maksimum untuk pembelahan dan
pembesaran sel serta pembentukan akar stek bila diberikan dalam konsentrasi
rendah. 2,4-D juga berfungsi sebagai zat pengatur tumbuh yang bila digunakan
dalam konsentrasi rendah akan merangsang dan menggiatkan pertumbuhan
tanaman.
Menurut Gamborg dan Phillips (1995), fase pertumbuhan kalus dibagi
menjadi lima yaitu fase lag (sel eksplan bahkan kalus mengalami pembelahan), fase
eksponensial (laju pembelahan sel kalus berada pada puncaknya), fase linear
(pembelahan sel mengalami perlambatan dan ekspansi sel meningkat), fase
deselerasi (laju ekspansi dan perlambatan meningkat) dan fase stasioner (ukuran
dan jumlah sel tetap). Penyebab kematian kalus adalah kontaminasi (bisa
 REVISI

disebabkan oleh bakteri dan jamur), pencoklatan pada kalus, kandungan nutrisi
medium yang menurun. Apabila semakin luas permukaan irisan pada daun
mengkudu (Morinda citrifolia) maka kalus yang terbentuk semakin banyak serta
kalus yang terbentuk apabila telah mengalami luka bekas irisan yang memiliki ciri-
ciri yaitu eksplan bengkak dan muncul agregat sel berwarna putih. Kondisi kalus
daun mengkudu yang disubkultur pada media mempunyai tekstur yang kompak
berair dengan warna kecoklatan. Semakin lama kalus ditanam pada media
perlakuan, warnanya semakin coklat tua hingga coklat kehitaman dan muncul kalus
muda yang berwarna kuning bening (yellowish) dengan tesktur kompak karena
kalus yang dikulturkan semakin tua serta memiliki kandungan fenol tinggi sehingga
mudah teroksidasi fenol tersebut menjadi kuinon fenolik (Noviati dkk., 2014).
Tekstur kalus pada wortel (Daucus carota) pada umumnya yaitu berbentuk
agak kompak kemudian menjadi meremah (friable) lalu membentuk remah
berwarna putih bahkan kekuningan yang kemudian akan menjadi embrio somatik.
Kontaminasi bakteri memiliki ciri-ciri kalus berwarna kecoklatan, medium menjadi
coklat, medium mengkilat dan sedikit cair serta menutupi seluruh permukaan
medium serta eksplan yang telah ditanam. Ciri-ciri kontaminasi jamur adalah
munculnya selaput bening yang membayang pada media kemudian berubah
menjadi putih kekuningan, kalus lebih kering dan terdapat garis seperti benang
berwarna putih seperti terbentuknya hifa (Herawan dan Na’iem, 2006). Medium
MS (Murashige dan Skoog, 1962) dengan pH 5,5-5,8 merupakan medium yang
digunakan karena mengandung garam nitrat dengan konsentrasi yang lebih tinggi
dibanding media lain. Keuntungan menggunakan medium MS adalah kandungan
nitrat, kalium dan ammoniumnya yang tinggi dan jumlah hara anorganik layak
untuk memenuhi kebutuhan banyak sel tanaman dalam kultur (Hendaryono dan
Wijayani, 1994).
Pada perlakuan subkultur kalus daun mengkudu (Morinda citrifolia), alat dan
bahan yang diperlukan disiapkan dan dimasukkan didalam ruang penabur terlebih
dahulu agar tetap menjaga kesterilan alat, bahan serta ruang penabur yang akan
digunakan. Kalus daun mengkudu dipilih yang paling baik agar pertumbuhan kalus
berjalan secara optimal. Apabila kalus berukuran besar, bagian kalus daun
 REVISI

mengkudu dipotong dengan scalpel dan blade dengan ukuran 1 cm hingga terbagi
menjadi beberapa bagian karena apabila kalus berukuran terlalu besar bahkan
terlalu kecil maka kalus tidak beradaptasi dengan medium baru dengan optimal
sehingga kalus mati. Bagian kalus yang sudah dipotong, ditanam dalam medium
yang baru searah dengan pertumbuhan kalus daun mengkudu pada medium
sebelumnya agar pertumbuhan kalus dapat berjalan dengan optimal dan dapat
masuk ke tahap pertumbuhan selanjutnya yaitu planlet.
Kalus dimasukkan kedalam botol kultur dengan konsentrasi medium MS
disertai hormon 2,4 D dengan konsentrasi 1 ppm masing-masing sebanyak dua
kalus didalam satu botol kultur. Botol kultur ditutup dengan alumunium foil dan
plastic wrap dan botol diinkubasi didalam ruang inkubasi yang diamati selama 14
hari agar tetap menjaga kesterilan pada botol kultur dan dapat mengamati
pertumbuhan kalus dengan baik. Hasil yang diperoleh diamati dan dicatat parameter
yang diamati berupa kontaminasi (berwarna coklat atau orange kecoklatan atau
orange bahkan orange kekuningan) dan respon tumbuh berupa morfologi (warna
kalus, sifat kalus (friable/ kompak) serta hasil kalus yang diperoleh didokumentasi).
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, didapatkan hasil berupa tabel 1.
berikut:
Tabel 1. Hasil subkultur kalus daun mengkudu (Morinda citrifolia) selama 14 hari
Tanggal Botol Konsentrasi Kontaminasi Morfologi
pengamatan kultur
28 1 1 ppm Tidak ada Kalus berwarna orange
September kecoklatan
2017 2 1 ppm Tidak ada Kalus berwarna orange
3 Oktober 1 1 ppm Tidak ada Kalus berwarna orange
2017 kecoklatan
2 1 ppm Tidak ada Kalus berwarna orange
5 Oktober 1 1 ppm Tidak ada Kalus berwarna orange
2017 kecoklatan
2 1 ppm Tidak ada Kalus berwarna orange
10 Oktober 1 1 ppm Tidak ada Kalus berwarna orange
2017 kecoklatan
2 1 ppm Tidak ada Kalus berwarna orange
 REVISI

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan dari Tabel 1, dapat terlihat

bahwa pada botol 1 saat pengamatan tanggal 28 September 2017, 3 Oktober 2017,
5 Oktober 2017 dan 10 Oktober 2017 dengan menggunakan medium MS dengan
hormon 2,4D dengan konsentrasi 1 ppm memiliki hasil kalus berwarna orange
kecoklatan dan tidak mengalami kontaminasi. Botol 2 saat pengamatan tanggal 28
September 2017, 3 Oktober 2017, 5 Oktober 2017 dan 10 Oktober 2017 dengan
menggunakan medium MS dengan hormon 2,4D dengan konsentrasi 1 ppm
memiliki hasil kalus berwarna orange dan tidak mengalami kontaminasi.
Berdasarkan parameter kontaminasi dapat terlihat bahwa pada setiap botol
kultur (botol 1 dan botol 2), dilihat bahwa botol 1 dan botol 2 tidak mengalami
kontaminasi sehingga dapat terlihat bahwa proses sterilisasi dan penanaman
didalam medium dilakukan secara optimal dan penanganan bahkan proses
sterilisasi eksplan sebelum menjadi kalus ditangani dengan baik sehingga dapat
menghasilkan kalus yang baik pula. Kalus tidak perlu disterilisasi karena sudah
disterilkan sejak awal penanaman eksplan berlangsung namun hanya ditangani
secara aseptis agar terhindar dari agen kontaminan disekitar lingkungan kultur.
Sterilisasi digunakan untuk menghindari eksplan bahkan kalus dari kontaminan
dimana prinsip dari sterilisasi eksplan adalah mensterilkan eksplan dari berbagai
mikroorganisme, tetapi eksplannya tidak ikut mati. Kondisi bahan eksplan serta
hasil kalus yang diperoleh, kondisi lingkungan, alat-alat yang digunakan, keadaan
ruangan kondisi ruang penabur dan cara kerja praktikan dalam mengkulturkan kalus
dapat terlaksana dengan baik dan hasil yang optimal (Sandra, 2002).
Berdasarkan parameter morfologi yang telah dilakukan dapat terlihat bahwa
pada botol 1 memiliki kalus berwarna orange kecoklatan dari awal pengamatan
hingga akhir pengamatan sedangkan pada botol 2 memiliki kalus berwarna orange
dari awal pengamatan hingga akhir pengamatan selama 14 hari. Hal ini tidak sesuai
dengan teori menurut Yelnititis (2012) bahwa warna kalus digunakan sebagai salah
satu indikator baik tidaknya kualitas kalus. Kualitas kalus yang baik memiliki
warna hijau sedangkan warna terang bahkan putih memiliki kondisi kalus yang
cukup baik. Apabila warna kalus semakin gelap menjadi coklat maka pertumbuhan
kalus menjadi menurun. Pentingnya kultur kalus adalah untuk memperoleh kalus
 REVISI

dari eksplan yang diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali. Faktor
yang mempengaruhi pembentukan kalus berwarna coklat dan coklat kekuningan
disebabkan karena nutrisi pada medium lama sudah habis untuk pertumbuhan kalus,
kalus pada medium lama tidak cepat diganti dengan medium baru sehingga nutrisi
pada medium lama sudah kekurangan hingga habis untuk pertumbuhan kalus dan
menyebabkan pertumbuhan dan perkembangan kalus tidak berjalan dengan
optimal. Selain itu, penyebab lainnya adalah proses kultur kurang baik sejak mulai
dari pemilihan eksplan, kinerja praktikan yang kurang aseptis serta peralatan dan
ruang kultur yang kurang steril yang selanjutnya proses pertumbuhan dan
perkembangan kalus tidak berjalan dengan baik.
Menurut Ariningsih dkk., (2013) bahwa kondisi kalus daun mengkudu yang
disubkultur pada media mempunyai tekstur yang kompak berair dengan warna
orange bahkan orange kekuningan hingga putih. Semakin lama kalus ditanam pada
media perlakuan, warnanya semakin coklat tua hingga coklat kehitaman karena
kalus yang dikulturkan semakin tua serta memiliki kandungan fenol tinggi sehingga
mudah teroksidasi fenol tersebut menjadi kuinon fenolik sehingga durasi waktu
dalam proses pertumbuhan eksplan menjadi kalus untuk pemindahan dari medium
lama ke medium yang baru terlalu lama menyebabkan kalus berwarna orange
kecoklatan. Pembesaran kalus disebabkan karena kebutuhan akan unsur-
unsur medium pada kalus atau bagian tanaman tercukupi serta keadaan kalus
yang masih dalam usia muda sehingga memiliki jaringan yang aktif membelah
dan mampu memperbanyak diri pada media agar baru yang telah digunakan.
Kalus yang dihasilkan dari kedua botol kultur yang berisi kalus mengkudu
tersebut memiliki sifat kompak. Ciri-ciri sifat kompak pada kalus adalah bentuknya
rapat dan padat serta sulit untuk dipisahkan (Kherasani dkk., 2017). Kalus dengan
tekstur meremah akan menghasilkan metabolit sekunder lebih sedikit dibandingkan
dengan kalus dengan tekstur kompak. Perbedaan struktur kalus menimbulkan
adanya perbedaan kemampuan dalam produksi metabolit sekunder. Metabolit
sekunder yang dihasilkan dari kultur kalus biasanya lebih banyak jenisnya, karena
seringkali timbul zat-zat alkaloid atau senyawa-senyawa lain yang sangat berguna
untuk pengobatan. Perbedaan jenis kalus tergantung pada komposisi media
 REVISI

pengkulturan khususnya pada zat pengatur tumbuh dan jenis eksplan yang
digunakan (Sugiyarto dan Kuswandi, 2014).

Gambar 4. Hasil akhir pengamatan kalus mengkudu (Morinda citrifolia)

selama 14 hari (Dokumentasi Pribadi, 2017).
Pada perlakuan subkultur kalus umbi wortel (Daucus carota), dapat
dilakukan dengan alat dan bahan yang diperlukan disiapkan dan dimasukkan
didalam ruang penabur terlebih dahulu agar tetap menjaga kesterilan alat, bahan
serta ruang penabur yang akan digunakan. Kalus umbi wortel dipilih yang paling
baik agar pertumbuhan kalus berjalan secara optimal. Apabila kalus berukuran
besar, bagian kalus umbi wortel dipotong dengan scalpel dan blade dengan ukuran
1 cm hingga terbagi menjadi beberapa bagian karena apabila kalus berukuran terlalu
besar bahkan terlalu kecil maka kalus tidak beradaptasi dengan medium baru
dengan optimal sehingga kalus mati. Bagian kalus yang sudah dipotong, ditanam
dalam medium yang baru searah dengan pertumbuhan kalus umbi wortel pada
medium sebelumnya agar pertumbuhan kalus dapat berjalan dengan optimal dan
dapat masuk ke tahap pertumbuhan selanjutnya yaitu planlet.
Kalus dimasukkan kedalam botol kultur dengan konsentrasi medium MS
disertai hormon 2,4 D dengan konsentrasi 1 ppm masing-masing sebanyak dua
kalus didalam satu botol kultur. Botol kultur ditutup dengan alumunium foil dan
plastic wrap dan botol diinkubasi didalam ruang inkubasi yang diamati selama 14
hari agar tetap menjaga kesterilan pada botol kultur dan dapat mengamati
pertumbuhan kalus dengan baik. Hasil yang diperoleh diamati dan dicatat parameter
 REVISI

yang diamati berupa kontaminasi (berwarna coklat atau orange kecoklatan atau
orange bahkan orange kekuningan) dan respon tumbuh berupa morfologi (warna
kalus, sifat kalus (friable/ kompak) serta hasil kalus yang diperoleh didokumentasi).
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, didapatkan hasil berupa tabel 2.
berikut:
Tabel 2. Hasil subkultur kalus umbi wortel (Daucus carota) selama 14 hari
Tanggal Botol Konsentrasi Kontaminasi Morfologi
pengamatan kultur
28 1 1 ppm Tidak ada Tidak ada respon
September 2 1 ppm Tidak ada Tidak ada respon
2017
3 Oktober 1 1 ppm Kontaminasi Friable
2017 jamur
2 1 ppm Tidak ada Friable, bulat-bulat
kecil, berwarna orange
kekuningan
5 Oktober 1 1 ppm Kontaminasi Kontaminasi jamur
2017 jamur (tidak dapat pengamatan
secara morfologi)
2 1 ppm Tidak ada Friable, bulat-bulat
kecil, berwarna orange
kekuningan bahkan
terdapat warna hijau
sedikit
10 Oktober 1 1 ppm Kontaminasi Kontaminasi jamur
2017 jamur (tidak dapat pengamatan
secara morfologi)
2 1 ppm Tidak ada Friable, bulat-bulat
kecil, berwarna orange
kekuningan bahkan
terdapat warna hijau
sedikit
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan dari Tabel 2, dapat terlihat
bahwa pada botol 1 pengamatan tanggal 28 September 2017, 3 Oktober 2017, 5
Oktober 2017 dan 10 Oktober 2017 dengan medium MS 2,4 D konsentrasi 1 ppm
yaitu tidak ada kontaminasi dan tidak ada respon perubahan warna bahkan sifat
kalus; kontaminasi jamur dan friable; kontaminasi jamur dan tidak dapat diamati
secara morfologi karena botol kultur sudah dikeluarkan dari ruang kultur serta
kontaminasi jamur dan tidak dapat diamati secara morfologi karena botol kultur
 REVISI

sudah dikeluarkan dari ruang kultur. Pada botol 2 pengamatan tanggal 28

September 2017, 3 Oktober 2017, 5 Oktober 2017 dan 10 Oktober 2017 dengan
konsentrasi 1 ppm yaitu tidak ada kontaminasi dan tidak ada respon perubahan
warna bahkan sifat kalus; tidak ada kontaminasi dan friable, bulat-bulat kecil serta
berwarna orange kekuningan; tidak ada kontaminasi dan friable, bulat-bulat kecil,
berwarna orange kekuningan serta terdapat warna hijau sedikit; tidak ada
kontaminasi dan friable, bulat-bulat kecil, berwarna orange kekuningan serta
terdapat warna hijau sedikit.
Berdasarkan parameter kontaminasi dapat terlihat bahwa pada setiap botol
kultur (botol 1 dan botol 2), dilihat bahwa botol 1 pada tanggal 28 September tidak
ada kontaminasi namun pada tanggal 3 Oktober 2017 kalus mengalami
kontaminasi. Pada botol 2 tidak mengalami kontaminasi sehingga dapat terlihat
bahwa proses sterilisasi dan penanaman didalam medium dilakukan secara optimal
dan penanganan bahkan proses sterilisasi eksplan sebelum menjadi kalus ditangani
dengan baik sehingga dapat menghasilkan kalus yang baik pula. Kalus tidak perlu
disterilisasi karena sudah disterilkan sejak awal penanaman eksplan berlangsung
namun hanya ditangani secara aseptis agar terhindar dari agen kontaminan disekitar
lingkungan kultur. Sterilisasi digunakan untuk menghindari eksplan bahkan kalus
dari kontaminan dimana prinsip dari sterilisasi eksplan adalah mensterilkan eksplan
dari berbagai mikroorganisme, tetapi eksplannya tidak ikut mati. Kondisi bahan
eksplan serta hasil kalus yang diperoleh, kondisi lingkungan, alat-alat yang
digunakan, keadaan ruangan kondisi ruang penabur dan cara kerja praktikan dalam
mengkulturkan kalus dapat terlaksana dengan baik dan hasil yang optimal (Sandra,
2002).
Pada botol 1 mengalami kontaminasi sejak tanggal 3 Oktober 2017
mengalami kontaminasi jamur yang dapat terlihat bahwa terdapat hifa disekitar
eksplan, eksplan lebih kering dan terdapat garis-garis seperti benang berwarna
putih. Hal ini sesuai dengan teori menurut Herawan dan Na’iem (2006) bahwa ciri-
ciri kontaminasi jamur berupa eksplan lebih kering dan terdaat garis seperti benang
berwarna putih seperti terbentuknya hifa. Kontaminasi akibat bakteri bahkan jamur
dapat disebabkan karena kesalahan pada saat penanaman eksplan, sterilisasi media
 REVISI

yang kurang aseptis, saat pembuatan media tidak sesuai dengan prinsip aseptis
sehingga masih ada hifa yang tertinggal pada eksplan (kontaminasi jamur) dan
muncul lendir hingga eksplan berwarna kecoklatan (kontaminasi bakteri).
Menurut Susilowati dan Listyawati (2001), kontaminasi adalah terdapatnya
senyawa atau organisme asing dalam suatu media dimana kinerja dalam kultur
harus steril dan aseptis agar dapat terhindar dari kontaminasi dan dapat
meningkatkan kinerja pertumbuhan eksplan secara optimal. Sumber kontaminasi
berasal dari eksplan, organisme kecil yang masuk ke media, alat yang tidak steril,
dan lingkungan kerja yang kotor dimana gejala yang ditimbulkan seperti
tumbuhnya hifa jamur pada permukaan media maupun kalus. Kontaminasi pada
kalus didalam medium disebabkan karena kurang optimal dari proses inkubasi dan
kurangnya aseptis pada penyediaan medium dan kalus yang akan ditanam dengan
steril, peralatan yang digunakan kurang steril, kinerja praktikan dala melakukan
subkultur kurang optimal sehingga ada kemungkinan kurang rapatnya penutupan
botol kultur dengan alumunium foil dan plastic wrap sehingga agen kontaminan
dapat mengkontaminasi hasil subkultur tersebut (Mulyani, 2006).
Berdasarkan parameter morfologi yang telah dilakukan dapat terlihat bahwa
pada botol 1 dan botol 2 tanggal 28 September 2017 tidak ada kontaminasi dan
tidak ada respon pertumbuhan kalus hasil dari subkultur dimana kalus tersebut
mengalami adaptasi pada medium baru sehingga belum terlihat respon
pertumbuhan secara signifikan. Pada botol 1 tanggal 3 Oktober 2017 mengalami
kalus bersifat friable dan tanggal 5 Oktober 2017 serta 10 Oktober 2017 tidak
diamati pertumbuhan dan perkembangan kalus kembali karena proses subkultur
yang terjadi didalam botol kultur tersebut terhambat dengan adanya kontaminasi
jamur. Pada botol 2 tanggal 3 Oktober 2017 hingga 10 Oktober 2017 mengalami
perubahan morfologi kalus secara signifikan yaitu kalus memiliki sifat friable,
bulat-bulat kecil, berwarna orange kekuningan hingga terdapat sedikit warna hijau
pada kalus. Hal ini sesuai dengan teori menurut Rusdianto dan Indrianto (2012)
bahwa proses tekstur kalus dari eksplan wortel yaitu berbentuk agak kompak
kemudian menjadi meremah (friable) lalu membentuk remah berwarna orange
 REVISI

kekuningan menjadi embrio somatik hingga berwarna hijau dan akan tumbuh
menjadi tunas dan dapat mengalami proses planlet.
Kalus yang dihasilkan pada botol 2 memiliki hasil yang baik akibat dari
proses kultur mulai dari pemilihan eksplan, praktikan yang aseptis serta dibantu
oleh peralatan dan ruang kultur yang steril yang selanjutnya dapat mengalami
proses pertumbuhan selanjutnya yaitu menjadi planlet. Pada botol 1 mengalami
kontaminasi jamur dengan ciri-ciri munculnya selaput bening yang membayang
pada media kemudian berubah menjadi putih kekuningan, kalus lebih kering dan
terdapat garis seperti benang berwarna putih seperti terbentuknya hifa sehingga
pengamatan tidak dapat dilanjutkan selama 14 hari namun pengamatan dihentikan
hingga tanggal 3 Oktober 2017.
Kalus yang dihasilkan dari botol 2 yang berisi kalus umbi wortel tersebut
memiliki sifat friable yang memiliki ciri-ciri yaitu sel-sel penyusunnya berukuran
kecil, sel-sel dengan ruang antar sel yang banyak, tekstur lunak dan berikatan
longgar yang dapat dihasilkan melalui subkultur berulang pada perlakuan yang
sama atau dikombinasikan dengan zat pengatur tumbuh yang lain maupun pada
perlakuan yang berbeda. Kalus dengan tekstur meremah akan menghasilkan
metabolit sekunder lebih sedikit dibandingkan dengan kalus dengan tekstur
kompak. Metabolit sekunder yang dihasilkan dari kultur kalus biasanya lebih
banyak jenisnya, karena seringkali timbul zat-zat alkaloid atau senyawa-senyawa
lain yang sangat berguna untuk pengobatan. Perbedaan jenis kalus tergantung pada
komposisi media pengkulturan khususnya pada zat pengatur tumbuh dan jenis
eksplan yang digunakan (Sugiyarto dan Kuswandi, 2014).

(a) (b)
 REVISI

Gambar 5. Hasil akhir pengamatan kalus wortel (Daucus carota) selama 14 hari
(a) dan hasil pengamatan kalus wortel yang mengalami kontaminasi pada tanggal
3 Oktober 2017 (Dokumentasi Pribadi, 2017).
Kontaminasi pada saat proses subkultur ditandai dengan adanya lendir
berwarna putih susu pada permukaan eksplan atau medium yang disebabkan
karena beberapa faktor seperti proses subkultur kalus kurang aseptis dan
penggunaan alat yang kurang steril. Eksplan yang tidak disterilisasi dengan
baik dan benar maka serangga bahkan mikroorganisme lain masuk kedalam
jaringan hingga masuk kedalam botol kultur. Selain kontaminasi bakteri,
kalus juga dapat terserang kontaminasi jamur yang ditandai dengan adanya
hifa disekitar kalus bahkan medium (Hendaryono dan Wijayani, 1994).

Gambar 6. Hasil pengamatan kontaminasi pada subkultur kalus wortel pada

kelompok 2 (Dokumentasi Pribadi, 2017).
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam subkultur adalah kalus yang
digunakan harus berumur 3-8 minggu dengan diameter 2-3 cm yang dipotong
menjadi 4-8 bagian dan ditanam pada media baru, dilakukan sebelum kalus
berwarna coklat, keadaan morfologi kalus tumbuh dengan baik dan optimal,
kalus memiliki pertumbuhan yang cepat dan warna pucat serta lunak,
penyimpanan kalus pada pencahayaan yang baik dengan lampu LED dalam
suhu 24̊C serta disimpan dalam lingkungan yang aseptis dan steril. Apabila
kalus tidak disubkultur maka mengakibatkan beberapa hal seperti nutrisi
telah habis, terhambatnya difusi nutrien, terjadi penguapan air pada media
sehingga konsentrasi elemen tertentu akan meningkat didalam media) dan
pertumbuhan metabolit toksik bagi pertumbuhan kalus. Penyimpanan kalus
pada pencahayaan yang baik dan dalam suhu 24̊C dan diperlukan
penyimpanan dalam jangka panjang (kriopreservasi). Apabila kalus terlalu
 REVISI

banyak disubkultur maka terjadi keanekaragaman sel dan penurunan

kualitas. Apabila kalus disubkultur maka kalus dapat berkembang lebih baik
dan bersifat friable dan kalus akan terbantu oleh nutrisi dari medium baru
dengan komposisi yang sama.
 REVISI

V. KESIMPULAN DAN SARAN

a. Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa:
1. Kalus daun mengkudu dipilih yang paling baik. Apabila kalus berukuran
besar, bagian kalus daun mengkudu dipotong dengan scalpel dan blade
dengan ukuran 1 cm hingga terbagi menjadi beberapa bagian. Kalus
dimasukkan kedalam botol kultur dengan konsentrasi medium MS
disertai hormon 2,4 D dengan konsentrasi 1 ppm masing-masing
sebanyak dua kalus didalam satu botol kultur. Botol kultur ditutup
dengan alumunium foil dan plastic wrap dan botol diinkubasi didalam
ruang inkubasi yang diamati selama 14 hari. Hasil yang diperoleh
diamati dan dicatat parameter yang diamati berupa kontaminasi dan
respon tumbuh berupa morfologi (warna kalus, sifat kalus (friable/
kompak) serta hasil kalus yang diperoleh didokumentasi).
2. Kalus umbi wortel dipilih yang paling baik. Apabila kalus berukuran
besar, bagian kalus umbi wortel dipotong dengan scalpel dan blade
dengan ukuran 1 cm hingga terbagi menjadi beberapa bagian. Kalus
dimasukkan kedalam botol kultur dengan konsentrasi medium MS
disertai hormon 2,4 D dengan konsentrasi 1 ppm masing-masing
sebanyak dua kalus didalam satu botol kultur. Botol kultur ditutup
dengan alumunium foil dan plastic wrap dan botol diinkubasi didalam
ruang inkubasi yang diamati selama 14 hari. Hasil yang diperoleh
diamati dan dicatat parameter yang diamati berupa kontaminasi dan
respon tumbuh berupa morfologi (warna kalus, sifat kalus (friable/
kompak) serta hasil kalus yang diperoleh didokumentasi).
3. Ciri-ciri kalus meremah adalah sel-sel penyusunnya berukuran kecil,
sel-sel dengan ruang antar sel yang banyak, tekstur lunak dan berikatan
longgar yang dapat dihasilkan melalui subkultur berulang pada
perlakuan yang sama atau dikombinasikan dengan zat pengatur tumbuh
 REVISI

yang lain maupun pada perlakuan yang berbeda. Tekstur kalus kompak
memiliki ciri-ciri bentuknya rapat dan padat serta sulit untuk dipisahkan
4. Pada botol 1 subkultur kalus daun mengkudu dengan menggunakan
medium MS dengan hormon 2,4D dengan konsentrasi 1 ppm memiliki
hasil kalus berwarna orange kecoklatan dan tidak mengalami
kontaminasi sedangkan pada botol 2 memiliki hasil kalus berwarna
orange dan tidak mengalami kontaminasi.
5. Pada botol 1 subkultur kalus umbi wortel dengan medium MS 2,4 D
dengan konsentrasi 1 ppm yaitu kontaminasi jamur dan tidak dapat
diamati secara morfologi karena botol kultur sudah dikeluarkan dari
ruang kultur sedangkan pada botol 2 yaitu tidak ada kontaminasi dan
friable, bulat-bulat kecil, berwarna orange kekuningan serta terdapat
warna hijau sedikit.
b. Saran
Pada praktikum pembuatan medium dan sterilisasi medium ini berjalan
dengan baik dan lancar. Proses pengajaran lebih mudah dipahami, jelas dan tidak
terlalu cepat untuk menjelaskan.
 REVISI

DAFTAR PUSTAKA

Ardiansyah, R., Supriyanto., Wulandari, A. S., Subandy, B. dan Fitriani, Y. 2014.

Teknik sterilisasi eksplan dan induksi tunas dalam mikropropagasi tembesu
(Fagraea fragrans ROXB). Jurnal Silvikultur Tropika 5(3):167-173.

Ariningsih, I., Solichatun. dan Anggarwulan, E. 2013. Pertumbuhan kalus dan

produksi antrakuinon mengkudu (Morinda citrifolia L.) pada media
murashige-skoog (MS) dengan penambahan ion Ca2+ dan Cu2+. Jurnal
Biofarmasi 1(2): 39 – 43.

Chawla, H. S. 2002. Introduction of Plant Biotechnology 2nd edition. Science

Publisher, USA.
Dodds, J. H. dan Robert, L. W. 1983. Experiment in Plants Tissue Culture.
Cambridge University Press, London.

Gamborg, O. L. dan Phillips, G. 1995. Plant Cell, Tissue and Organ Culture.
Springer-Verlag Berlin Heidelberg, New York.
George, E. F. dan Sherrington, P. D. 1984. Plant Propagation by Tissue Culture.
Exergetice Ltd, England.
Gunawan, L. W. 1995. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. PAU Bioteknologi
Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Hendaryono, D. P. D. dan Wijayani, A. 1994. Teknik Kultur Jaringan Pengenalan

dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif-Modern. Kanisius,
Yogyakarta.

Hendaryono, D. P. S. dan Wijayani, A. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Kanisius,

Yogyakarta.
Herawan, T dan M. Na’iem. 2006. Pengaruh jenis media dan konsentrasi zat
pengatur tumbuh terhadap perakaran pada kultur jaringan cendana (Santalum
album Linn.). Jurnal Agrosains 19(2): 103-109.

Kherasani, I., Prihastanti, E. dan Haryanti, S. 2017. Pertumbuhan kalus eksplan

rimpang jahe merah (Zingiber officinale Rosc.) pada berbagai konsentrasi
sukrosa secara in-vitro. Jurnal Anatomi dan Fisiologi 2(1):43-49.

Manullang, I. N., Ellok, D. S. dan Suswantini, N. 2006. Respon pertumbuhan jahe

putih (Zingiber officinale var. officinale) secara in-vitro pada media
murashige-skoog dengan penambahan NAA dan BAP. Jurnal Budidaya
Pertanian 2(1): 88-97.
 REVISI

Minarsih, H., Suharyo., Riyadi, I. dan Ratnadewi, D. 2016. Pengaruh jumlah

subkultur dan media sub-optimal terhadap pertumbuhan dan kemampuan
regenerasi kalus tebu (Saccharum officinarum L.). Jurnal Menara
Perkebunan 84(1):28-40.
Mulyani, S. E. S. 2006. Anatomi Tumbuhan. Kanisius, Yogyakarta.

Noviati, A., Nurchayati, Y. dan Setiari, N. 2014. Respon pertumbuhan dan produksi
senyawa antioksidan pada kalus Hibiscus sabdariffa L. dari eksplan yang
berbeda secara in-vitro. Jurnal Sains dan Matematika 22(1): 25-29.

Rusdianto. dan Indrianto, A. 2012. Induksi kalus embriogenrik pada wortel

(Daucus carota L.) menggunakan 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D).
Jurnal Bionature 13(2): 136-140.

Sandra, E. 2002. Kultur Jaringan Anggrek Skala Rumah Tangga. Agro Media
Pustaka, Jakarta.
Santoso, U. dan Nursandi, F. 2004. Kultur Jaringan Tanaman. UMM Press,
Malang.

Sugiyarto, L. dan Kuswandi, P. C. 2014. Pengaruh 2,4 diklorofenoksiasetat (2,4-D)

dan benzyl aminopurin (BAP) terhadap pertumbuhan kalus daun binahong
(Anredera cordifolia L.) serta analisis kandungan flavonoid total. Jurnal
Penelitian Saintek 19(1):23-30.

Suryowinoto, M. 1988. Budidaya Jaringan dan Manfaatnya. UGM Press,

Yogyakarta.

Susilowati, A. dan Listyawati, S. 2001. Keanekaragaman jenis mikroorganisme

sumber kontaminasi kultur in-vitro di sub-lab biologi laboratorium MIPA
pusat UNS. Jurnal Biodiversitas 2(1): 110-114.

Widarto, L. 2000. Perbanyakan Tanaman dengan Biji, Stek, Cangkok, Sambung,

Okulasi dan Kultur Jaringan. Kanisius, Yogyakarta.

Wijayanto, T. 2011. Produksi bibit jeruk keprok (Citrus reticulata) dan jeruk siam
(Citrus sinensis) secara in-vitro yang bebas penyakit CVPD di sulawesi
tenggara. Jurnal Agriplus 21(2):136-142.

Yelnititis. 2012. Pembentukan kalus remah dari eksplan daun ramin (Gonystylus
bancanus Miq. Kurz). Jurnal Pemuliaan Tanaman Hutan 6(3): 181-194.

Yusnita. 2003. Kultur Jaringan Cara Memperbanyak Tanaman Secara Efisien.

Agromedia Pustaka, Jakarta.
 REVISI

LAMPIRAN

Gambar 6. Hasil pengamatan kalus daun mengkudu pada tanggal 28 September

2017 (Dokumentasi Pribadi, 2017).

Gambar 7. Hasil pengamatan kalus daun mengkudu pada tanggal 3 Oktober 2017
(Dokumentasi Pribadi, 2017).

Gambar 8. Hasil pengamatan kalus daun mengkudu pada tanggal 5 Oktober 2017
(Dokumentasi Pribadi, 2017).
 REVISI

Gambar 9. Hasil pengamatan kalus umbi wortel pada tanggal 3 Oktober 2017
(Dokumentasi Pribadi, 2017).

Gambar 10. Hasil pengamatan kalus umbi wortel pada tanggal 5 Oktober 2017
(Dokumentasi Pribadi, 2017).