Estudo sobre a

fotodegradação de
xantenos aplicados à
terapia fotodinâmica
Exame de qualificação de doutorado – Vinicius Granatto Camargo
 Introdução

▪ As propriedades terapêuticas da luz já são conhecidas por milhares de anos.

▪ Civilizações egípcias, chinesas e indianas usavam a luz para tratar doenças como a
psoríase, o vitiligo e até mesmo o câncer de pele.
▪ Nos tempos atuais, sabe-se que a combinação da luz e certos compostos químicos
podem induzir a morte celular.
▪ Experimentos para testar diferentes combinações entre estes compostos químicos e
a luz levaram à terapia fotodinâmica moderna (da língua inglesa, PDT).
 Introdução
▪ A PDT emprega dois compostos não tóxicos individualmente que são combinados
para induzir efeitos em células e tecidos. O efeito induzido é dependente do oxigênio
do meio.

Oxigênio do meio
Fotosensibilizador
(Estado excitado)
Radicais livres,
oxigênio singleto

Luz Fotosensibilizador
(Estado fundamental) Toxicidade celular
 Introdução
Fotosensibilizador
(Estado Fund.)

Reação I Luz
Reação II

Fotosensibilizador
Radicais (Estado Exc.)
Oxig.
Sing.
Oxig.
Substrato Substrato
Sing.
Oxig.
Produtos da
oxididação
Produtos da
oxididação
 Introdução
▪ As duas reações citadas ocorrem simultaneamente e dependem do tipo de sensibilizador, da
concentração do substrato e oxigênio e da afinidade entre o sensibilizador e o substrato.
▪ Na PDT o fotosensibilizador pode ser administrado de várias formas, como injeção intravenosa
ou aplicação direta na pele. Entretanto isto afeta a sua biodistribuição.
▪ Devido à alta reatividade e curto tempo de vida das espécies reativas do oxigênio, apenas
células próximas à área de produção são diretamente afetadas, ou seja, reações ocorrem
exclusivamente no local onde a luz é absorvida pelo fotosensibilizador. Portanto, a resposta
biológica ao fotosensibilizador ocorre apenas em regiões particulares do tecido que foram
expostas à luz.
 Introdução

▪ Alguns fatores influenciam diretamente na eficiência da PDT. Um exemplo é a

localização de um tumor por parte do fotosensibilizador. O que faz com que
pesquisadores busquem cada vez mais evoluir a seletividade dos
fotosensibilizadores.
▪ Outros fatores que são influentes são a permeabilidade vascular, a difusão
intersticial, tamanho da molécula, carga, propriedades hidrofílicas ou hidrofóbicas
do composto e outras propriedades fisiológicas.
▪ O intervalo entre a administração do fotosensibilizador e a exposição de luz é
outro fator que determina a eficiência da PDT e diferentes intervalos levam a
diferentes mecanismos de destruição e diferentes consequências.
 Cinética de fotodegradação

▪ A fotodegradação é um processo dinâmico no qual fluoróforos sofrem uma destruição

química fotoinduzida devido à exposição à luz.
▪ Este fenômeno foi empregado como base para diversas técnicas, embora o
mecanismo da fotodegradação em objetos biológicos fosse desconhecido.
▪ Grande parte do conhecimento existente sobre a fotodegradação vem da
espectroscopia, já que neste caso fluoróforos estão livres em solução, em um
ambiente bem controlado.
▪ Na microscopia, as moléculas do fluoróforo estão quimicamente ligadas a outros alvos
de interesse, nos quais o microambiente é muito complexo e tendem a ser diferentes
em cada caso.
 Cinética de fotodegradação

▪ Embora os mecanismos de fotodegradação sejam pouco conhecidos na microscopia e

seu microambiente seja complexo, processos de primeira ordem (exponencial única)
são utilizados como base para a fotodegradação em muitas técnicas de microscopia.
▪ Embora seja empregado este tipo de processo, muitos dados experimentais fogem de
uma função de exponencial única.
▪ Este fato resultou em um questionamento sobre quando processos fotoquímicos teriam
comportamentos diferentes dos descritos pela função de exponencial única em
condições microscópicas. Fazendo com que uma melhor compreensão deste tópico se
tornasse importante para à aplicação deste fenômeno nas técnicas de microscopia.
 Decaimento e fotodegradação

▪ Decaimento e fotodegradação são dois processos

fotoinduzidos diferentes.
▪ Devido à excitação de luz, os fluoróforos absorvem fótons e
passam por uma transição eletrônica de seu estado singleto
fundamental para um estado singleto excitado.
▪ O número de fluoróforos que absorvem a energia
proveniente dos fótons e transitam para o estado singleto
excitado atinge um valor máximo e então retornam para o
estado fundamental via emissão de fluorescência,
conversão interna sem radiação ou cruzamento
intersistema.
 Decaimento e fotodegradação

▪ O decaimento se refere ao efeito composto destes três

processos após o fluoróforo ser exposto à luz.
▪ O tempo de decaimento é intrínseco do fluoróforo, sendo
assim independente da intensidade de excitação. Este tempo é
da ordem de nanosegundos.
▪ O processo de fotodegradação é aquele no qual o número total
de moléculas no estado fundamental é reduzido via destruição
fotoquímica permanente, sendo o efeito cumulativo da perda
de fluoróforos em cada ciclo de excitação-emissão ao longo do
tempo, estas moléculas degradadas não voltam a participar do
ciclo.
 Cinética de população

▪ No caso ideal, sem fotodegradação, a cinética de população de cada estado

energético é descrita por meio das equações:

d
dt
[ N S (t)] = -ka N S (t) + kd N S* (t) + k1 N T * (t)
d dé d
d é
N (t) ù = k N (t) - (k + k )N (t) dt
[ N S (t) ] =
dt ê
ë
N
S*
(t) ù
ú
û
=
dt
é N (t) ù = 0
ë T û
*

dt êë S úû
* a S d isc S *

d
é N * (t) ù = kisc N * (t) - k1 N * (t)
dt ë T û S T
 Cinética de população

▪ O sistema de equações anterior pode ser resolvido e suas soluções são:

ka k1
N S* =
k1 ( ka + kd + kisc ) + ka kisc
N S (t) + N S* (t) + N T * (t) = 1 ka kisc
N T* =
k1 ( ka + kd + kisc ) + ka kisc
ka ( k1 + kisc )
N S = 1-
k1 ( ka + kd + kisc ) + ka kisc
 Cinética de população

▪ Na prática, a fotodegradação ocorre e as moléculas sofrem uma destruição

fotoquímica permanente enquanto elas estão no estado excitado singleto ou
tripleto. Neste caso, o estado estacionário não mantém a relação anterior para as
taxas de variação do número de população em cada estado energético:

d dé d
dt
[ N S (t) ] ¹ 0; ê
dt ë
N S*
(t) ù
ú
û
¹ 0; é N * (t) ù ¹ 0;
dt ë T û
 Cinética de população

▪ Em princípio, processos biomoleculares entre uma molécula do corante no estado

singleto excitado e uma molécula de outra espécie poderia ocasionar uma
fotodegradação do corante. Entretanto, não haviam muitas evidências deste fato no
caso da fluoresceína.
▪ Estudos apontaram que o estado singleto excitado não era ordinariamente
responsável para à atividade fotoquímica da fluoresceína, e ainda que as moléculas
de oxigênio não exerciam nenhum efeito mensurável no estado singleto excitado
para os xantenos.
▪ Já para o estado tripleto excitado, estudos mostraram que havia a existência de um
“quenching” desse estado, que inicialmente era povoado exclusivamente por
transição do estado singleto excitado.
 Cinética de população

▪ Também foi concluído que o número de população do estado tripleto excitado

diminuía de acordo com dois mecanismos:
1. Reações entre uma molécula no estado tripleto excitado com outra molécula
neste mesmo estado ou com uma molécula no estado fundamental.
2. Reações entre uma molécula no estado tripleto excitado com uma molécula de
oxigênio.

▪ Estes mecanismos foram chamados de corante-corante (do inglês, dye-to-dye, D-

D) e corante-oxigênio (do inglês, dye-to-oxygen, D-O).
Cinética de população
 Cinética de fotodegradação

▪ Para compreender a fotodegradação da fluoresceína, todos as reações

fotoquímicas listadas anteriormente devem ser consideradas. O modelo que as
incorpora é descrito pelo conjunto das seis equações diferenciais acopladas a
seguir:
d
éë N S ( t ) ùû = éë kd + N S* ( t ) + k1 NT * ( t ) + k2 N T * ( t )
2
d
dt é N * ( t ) ù = ka N S ( t ) - é kd N * ( t ) + kisc N * ( t ) ù
dt ë S û ë S S û
+k3 N T * ( t ) N S ( t ) + k6 N T * ( t ) N X ( t ) + k7 N T * ( t ) N R ( t )
d
+ k8 N T * ( t ) N O2 ( t ) ùû - éë ka N S ( t ) + k5 N T * ( t ) N S ( t ) ùû é N X ( t ) ùû = k4 N T * ( t ) + k5 NT * ( t ) N S ( t ) + k9 N T * ( t ) N O2 ( t )
dt ë

d d
é N * ( t ) ù = kisc N * ( t ) - é k1 N * ( t ) + k2 N 2 * ( t ) é N R ( t ) ùû = k4 N T * ( t ) + k5 N T * ( t ) N S ( t )
dt ë T û S ë T T
dt ë
+k3 N T * ( t ) N S ( t ) + 2k4 N T2 * ( t ) + k5 NT * ( t ) N S ( t )
d
+k6 N T * ( t ) N X ( t ) + k7 N T * ( t ) N R ( t ) + k8 NT * ( t ) N O2 ( t ) é NO ( t ) ù = -k9 N T * ( t ) NO2 ( t )
dt ë 2 û
+ k9 NT * ( t ) N O2 ( t ) ùû
 Abordagem experimental – Fluoresceína livre
em solução

▪ Uma solução de fluoresceína foi preparada (100nM, Ph 7.6) e separada em três

cubetas:
1. Amostra de controle.
2. Amostra saturada de oxigênio.
3. Amostra desoxigenada (por meio de bombeio de argônio).
▪ A amostra 2 e 3 foram expostas a uma fonte de luz contínua por 90 min.
▪ A intensidade de fluorescência foi medida antes da primeira exposição e
posteriormente em intervalos de 15 min em um espectrofotômetro.
 Resultado experimental - Fluoresceína livre em
solução
▪ O bombeio de argônio na solução e, consequentemente, a remoção do oxigênio
reduziu a taxa de fotodegradação, mas não a inibiu completamente, indicando
que a foto-oxidação não é o único processo envolvido na fotodegradação.
 Simulação - Fluoresceína livre em solução

▪ A simulação do processo de fotodegradação da fluoresceína livre em solução foi

feito configurando as condições iniciais apropriadas e analisando a variação do
número de população de cada estado energético ao longo do tempo.
Simulação - Fluoresceína livre em solução
Resultado experimental – fluoresceína ligada
(microscopia)
 Simulação – fluoresceína ligada (microscopia)

▪ No caso em que o fluoróforo está ligado ou encapsulado em um volume, a noção de

concentração não é válida.
▪ Foram utilizados grânulos fluorescentes para simular esta situação. Estes grânulos
possuíam 9µm de diâmetro e uma densidade de revestimento de em média 2 × 10
de moléculas de fluoróforos.
▪ Assumindo uma distribuição homogênea das moléculas do fluoróforo na superfície
do grânulo, a distância intermolecular seria comparável à uma solução de
fluoresceína de 10mM. E assim, as condições iniciais próprias para este caso
puderam ser definidas.
Simulação – fluoresceína ligada (microscopia)
 Considerações preliminares

▪ Na fotoquímica, a perda irreversível de fluorescência devido às reações entre

moléculas de oxigênio e moléculas do corante tem sido objeto de estudo em
numerosos trabalhos. Sendo reconhecido que a foto-oxidação pode não ser o único
fator responsável pela perda irreversível de fluorescência.
▪ Deve haver pelo menos um outro processo gerador de fotodegradação que é
independente do oxigênio.
▪ Como o mecanismo D-O consiste apenas em uma reação pseudo-unimolecular, o
comportamento da degradação é de um processo de exponencial única na ausência
de todas as reações D-D.
▪ Os resultados das simulações mostraram que este comportamento exponencial é
exclusivo para quando as reações D-O são predominantes.
 Considerações preliminares

▪ Em baixas concentrações de fluoresceína (ex: soluções) as reações são

dominadas pelo mecanismo D-O. Na microscopia, as moléculas não podem se
difundir livremente e as moléculas fotodegradadas são produto de reações D-D.
Quando as reações D-D são artificialmente suprimidas, as moléculas degradadas
são produtos exclusivamente de reações D-O, e a curva cinética é descrita por
uma exponencial única.
▪ Este fato sugere que reações D-D são a fonte do desvio do comportamento de
exponencial única da fotodegradação.
 Análises posteriores

▪ Uma vez que ficou claro que o processo de fotodegradação não segue um
comportamento de exponencial única e que isto é resultado das reações induzidas
entre os estados tripleto-tripleto e tripleto-fundamental (reações D-D), foi de interesse
prover uma evidência direta do papel do estado de tripleto excitado no processo de
fotodegradação.
▪ Para este tipo de estudo vários quenchers de radicais foram empregados, por
exemplo a mercaptoetilamina (MEA ou cisteamina).
▪ Assim, uma busca afim de validar a hipótese de que fosse reduzido o tempo de vida
do estado tripleto minimizando a perda na rede de moléculas no estado fundamental
para o estado tripleto excitado, haveria uma diminuição na fotodegradação.
Resultados
 Resultados – curvas de fotodegradação da
fluoresceína
 Novamente o bombeio de argônio reduziu a fotodegradação, demonstrando que há uma participação do
oxigênio no processo de fotodegradação.
 O MEA foi o único composto efetivo em inibir a fotodegradação sem reduzir a intensidade de
fluorescência.
 Resultados – curvas de fotodegradação da
fluoresceína

▪ Uma redução na
fotodegradação também
pôde ser observada na
presença do MEA para
medidas de microscopia.
 Resultados - especetro de luminescência da
Eosina
▪ O espectro de luminescência da eosina apresentou
dois picos largos. O primeiro centrado em 540nm
está relacionado com a fluorescência do corante, já
o segundo centrado em 680nm está relacionado
coma fosforecência.
▪ Quando a solução está saturada de oxigênio, a
população no estado de tripleto é extinta pelo
oxigênio.
▪ A população no estado tripleto aumenta conforme o
oxigênio é extinto da solução devido ao bombeio de
argônio.
▪ Quando o MEA é adicionado à solução a
população do estado tripleto decresce com o
aumento da concentração do MEA.
▪ Nem o oxigênio ou o MEA afetam a intensidade de
fluorescência.
 Considerações finais

▪ Foi concluído que o MEA protege a fluoresceína de fotodegradação, porém

existe uma diferença no grau de proteção em relação a fluoresceína livre em
solução ou ligada.
▪ Logo, no caso de moléculas de fluoresceína em solução, teremos mais
acessibilidade do MEA em todas as direções, enquanto que moléculas
quimicamente ligadas à alvos celulares são menos acessíveis.
▪ Consequentemente, esta é a razão de vermos uma menor eficiência da proteção
do MEA em relação a fotodegradação da fluoresceína na microscopia.
 Considerações finais

▪ Em solução, a concentração de MEA é muito superior a baixa concentração de

fluoresceína, e tanto as moléculas do corante quanto do quencher estão livres para
se difundir. Nestas condições as reações entre o MEA e a fluoresceína no estado de
tripleto competem com o oxigênio. Como a concentração de MEA é muito maior do
que a de oxigênio, a competição é favorecida para o MEA.
▪ Na microscopia, como as moléculas estão imobilizadas e devido a menor distância
intermolecular, há uma maior probabilidade de reações D-D ocorrerem.
▪ Portanto, as reações entre o MEA e a fluoresceína competem com as reações D-O e
D-D.
 Considerações finais

▪ Devido a similaridade entre as reações de fotodegradação entre a eosina e a

fluoresceína, a eosina foi utilizada para estudar os efeitos do MEA na população
do estado tripleto excitado.
▪ Foi concluído que os efeitos do MEA no estado tripleto da eosina não são
oriundos da remoção do oxigênio residual pelo MEA, mas sim de uma direta
interação entre o MEA e o estado tripleto.
▪ As reações D-Q ficaram dominantes, ou seja, este resultado demonstrou que
tanto as reações D-O e D-Q afetou a população do estado tripleto da eosina.
 Considerações finais

▪ Podemos sumarizar os mecanismos de fotodegradação da fluoresceína em

condições experimentais específicas da seguinte forma:
 Perspectivas futuras
▪ Vimos que o estado tripleto excitado da fluoresceína desempenha um papel importante na
fotodegradação e que o mecanismo de fotodegradação é parcialmente explicado pelo acúmulo da
fluoresceína neste mesmo estado.
▪ Vimos também que a extinção deste estado sem ocasionar uma mudança na rede no estado
fundamental reduz a fotodegradação.
▪ Também observamos que os mecanismos que são predominantes para a fotodegradação são
extremamente dependentes da concentração do corante e do quencher.
▪ Em análises futuras, buscamos continuar estudando os mecanismos de fotodegradação por meio
da ação de corantes e quenchers como os utilizados nos trabalhos estudados, porém por meio da
técnica de lente térmica, que nos permitirá trabalhar em regimes de concentrações em que outras
técnicas de espectroscopia ou microscopia não permitem.
 Referências bibliográficas
▪ SONG, L. et al.Influence of the triplet excited state on the photobleaching
kinetics of fluorescein in microscopy. Biophysical Journal, vol. 70, 2959-2968.
▪ SONG, L. et al. Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative
fluorescence microscopy. Biophysical Journal, vol. 68, 2588-2600.