Anda di halaman 1dari 47

PETUNJUK PRAKTIKUM

BIOKIMIA I

OLEH:
TIM BIOKIMIA

LABORATORIUM KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA
TATA TERTIB PRAKTIKUM
LABORATORIUM KIMIA
FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA

A. Bila hendak praktikum, praktikkan diwajibkan :


1. Datang tepat waktu. Keterlambatan 15 menit tanpa alasan yang sah dianggap tidak
hadir dan tidak diizinkan mengikuti praktikum.
2. Menyiapkan laporan awal, bagan prosedur percobaan dan laporan praktikum.
3. Menyimpan tas pada tempat yang telah disediakan (dibawah meja kerja).
4. Mengisi form kehadiran tiap kali mengikuti praktikum.
5. Membawa alat-alat yang diperlukan selama praktikum berlangsung (handuk kecil,
untuk lap, gunting, lem, korek api, sabun cuci tangan).
6. Meminjam dan memeriksa ulang alat kaca yang diperlukan selama praktikum kepada
laboran, jika terdapat ketidaklengkapan dan kerusakan, maka praktikan diberikan
waktu minimal satu jam untuk menukarnya.

B. Selama praktikum berlangsung, praktikan diwajibkan :


1. Berpakaian sopan dan memakai jas laboratorium.
2. Tidak makan, minum, dan merokok di dalam laboratorium.
3. Tidak bercanda dan bertindak yang dapat menimbulkan kecelakaan terhadap orang
lain.
4. Tidak mereaksikan sembarang bahan kimia tanpa ada petunjuk praktikum yang jelas
dan tanpa seizin dosen dan asisten dosen.
5. Tidak membuang sampah atau bahan sisa percobaan ke dalam wastafel.
6. Menjaga kebersihan, ketertiban, dan keamanan laboratorium secara bersama.

C. Setelah praktikum selesai, praktikan diwajibkan :


1. Mencuci dan membersihkan semua alat kaca yang digunakan selama praktikum
dengan sabun cair/tepol yang telah disediakan.

i
2. Memeriksa kembali kelengkapan dan keutuhan alat yang dipinjam kemudian
mengembalikannya kepada laboran.
3. Memberihkan meja praktikum masing-masing tanpa mengandalkan mahasiswa yang
piket.
4. Lapor diri apabila selama praktikum memecahkan alat kaca.
5. Menyerahkan data/laporan sementara kepada asisten dosen untuk di paraf oleh
dosen pembimbing.
6. Meninggalkan laboratorium dengan seizin dosen pembimbing atau asisten dosen.

Jakarta, Agustus 2014


Kepala Laboratorium Kimia

Drs. Zulhipri, M.Si.


NIP. 19580703 198903 1 001

ii
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I

DAFTAR ISI

TATA TERTIB PRAKTIKUM i


DAFTAR ISI iii
I. UJI KUALITATIF ASAM AMINO 1
1. Uji Nitroprusida 2
2. Uji Sistin 3
3. Kromatografi Kertas Asam Amino 4

II. UJI KUALITATIF PROTEIN 7


1. Pengendapan dengan Logam 8
2. Pengendapan dengan Garam 9
3. Pengendapan dengan Alkohol 10
4. Uji Koagulasi 10
5. Denaturasi Protein 11
6. Uji Sulfur dalam Protein 11

III. UJI KUALITATIF KARBOHIDRAT 13


1. Uji Anthrone 13
2. Uji Pikrat 14
3. Uji Fearon 15

4. Uji Foulger 16
5. Uji Iodine 17
6. Uji Asam Musat 18
IV. UJI KUALITATIF LIPID 20
1. Isolasi Lipid 20
2. Emulsi 21
3. Tes Kelarutan 22
4. Uji Penyabunan 23
5. Uji Peroksida 24
6. Uji Busa (untuk Sabun) 24

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman iii
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/20007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I

7. Uji Pengendapan (untuk Sabun) 25


8. Uji Aklorein 25
9. Tes Fosfat 26
10. Uji Ketidak Jenuhan 26
11. Uji Salkowski untuk Kolesterol 27
12. Uji Liebermann - Burchard untuk Kolesterol 28

V. ENZIM 29
1. Isolasi Enzim Polifenol Oksidase 30
2. Penentuan Aktivitas Enzim Polifenol Oksidase 31
3. Penentuan Kadar Protein Enzim Kasar 31

4. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Polifenol Oksidase 32


5. Pengaruh Konsentrasi Substrat terhadap Aktivitas Polifenol Oksidase 33
6. Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Polifenol Oksidase 33
7. Pengaruh Waktu Inkubasi terhadap Aktivitas Polifenol Oksidase 34
8. Pengumpulan Air Liur 35
9. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Enzim Saliva 35
10. Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Enzim Saliva 35
11. Pengaruh Inhibitor terhadap Aktivitas Enzim Saliva 36

VI. DNA 37
1. Isolasi DNA dari Buah dan Sayur 38
2. Analisis Sampel DNA 39
3. Elektroforesis 39

4. Analisis Restriksi Plasmid DNA 39

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman iv
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/20007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN I

UJI KUALITATIF ASAM AMINO

UJI KUALITATIF ASAM AMINO

I. TUJUAN

Mengetahui karakteristik asam amino melalui tes kualitatif.

II. TEORI SINGKAT

Asam amino adalah molekul organik dengan massa molekul rendah (antara 100-200)
yang mengandung setidaknya satu gugus karboksil (COOH) dan satu gugus amino (NH2)
dan merupakan suatu komponen penting untuk biosintesis protein. Di dalam protein
terdapat sekitar 20 asam amino. Semuanya merupakan suatu α-amino dengan pengecualian
untuk prolin dan hidroksiprolin. Variasi yang terjadi antar asam-asam amino terletak pada
gugus R atau rantai sampingnya (Gambar 1.1). Dari pengetahuan sifat kimia gugus R, sifat
suatu asam amino dapat diramalkan, sebaliknya, pengetahuan tentang sifat asam amino
akan membantu dalam mengidentifikasi gugus R.

H O
gugus N C C gugus
α-amino H O H α-karboksil
H

Gambar I.1. Stuktur Umum Asam Amino. Bagian asam amino ditunjukan dalam kotak
merupakan bagian yang umum untuk semua asam -amino sedangkan R mewakili rantai samping
yang memiliki stuktur berbeda untuk setiap asam amino. Gugus karboksil dan amino dapat
dimanfaatkan untuk menganalisa suatu asam amino secara umum dalam suatu campuran,
sedangkan R dimanfaatkan dalam menganalisa asam amino secara spesifik.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 1
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN I

UJI KUALITATIF ASAM AMINO

III. PROSEDUR KERJA

III.1.Uji Nitroprusida

Reaksi antara gugus sulfidril dari sisteina, peptida (glutation) atau protein dengan
nitroprusida dalam suasana amoniak berlebih dapat diterangkan sebagai berikut :
[Fe3 + (CN )5 NO ]2− + NH 3 + RSH → NH 4 + [Fe2 + (CN )5 NOSR ]2 −

Warna salmon Warna merah

Reagen dan Bahan:

Reagen Nitroprusida 1%: Cari penyusun reagen ini, lalu kumpulkan ke asisten.
Sisteina hidroksida Ammonium hidroksida encer
Berbagai larutan asam amino

Prosedur:

1. Larutkan beberapa kristal sisteina hidroksida dalam 5 mL air.


2. Tambahkan 0,5 mL larutan nitroprusida 1%.
3. Tambahkan 0,5 mL ammonium hidroksida.

Pertanyaan:

1. Warna apa yang terjadi dan apakah warna tersebut stabil?


2. Apakah sistin akan memberikan uji positif?
3. Peptida dari sisteina yang mana yang memberikan uji nitroprusida yang positif?

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 2
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN I

UJI KUALITATIF ASAM AMINO

III.2. Uji Sistin

Reagen dan Bahan:

Larutan sistin NaOH 1 N


Timbal asetat

Prosedur:

1. Larutkan sedikit sistina ke dalam 5 mL NaOH 1 N.


2. Tambahkan beberapa kristal Pb asetat. Panaskan hingga mendidih.

Pertanyaan:

1. Apa warna endapan yang terbentuk?


2. Senyawa apa yang mengendap?

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 3
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN I

UJI KUALITATIF ASAM AMINO

III.3.Kromatografi Kertas Asam Amino

Kromatografi kertas salah satu jenis kromatografi yang memiliki fasa stasioner dan
gerak berupa cairan yang tidak saling campur. Pada sistem ini biasanya digunakan larutan
jenuh dari suatu pelarut nonpolar (misalnya n-butanol) dan pelarut polar (misalnya air).
Campuran pelarut ini bermigrasi keseluruh kertas, komponen polar teradsorpsi pada media
pendukung (selulosa) menghasilkan ribuan tetes kecil adsorpsi dari fasa stasioner. Tetesan
fasa stasioner yang teradsopsi ini dicuci berturut-turut dengan melewatkan fasa gerak yang
berupa pelarut nonpolar sehingga partisi atau pemisahan sampel campuran terjadi.

Pada kromatografi kertas, sampel (campuran zat) diteteskan dengan pipa kapiler diatas
kertas, kemudian campuran pelarut (eluen) dilewatkan untuk bermigrasi melewati noda
(spot) dengan arah ke atas (ascending) atau ke bawah (descending). Lamanya proses
migrasi bergantung pada ketebalan kertas, pelarut yang dipilih dan suhu. Jarak yang
ditempuh oleh setiap senyawa dari garis dasar relatif terhadap jarak tempuh pelarut/eluen
didefinisikan sebagai Rf.

Jarak yang ditempuh sampel dari garis dasar


Rf =
Jarak yang ditempuh pelarut dari garis dasar

Nilai Rf dari suatu senyawa dalam sistem kromatografi kertas bergantung pada banyak
variabel diantaranya sistem pelarut, suhu, lamanya elusi, dan jenis kertas. Karena
dipengaruhi oleh banyak variable, maka Rf suatu zat dalam suatu sistem yang diketahui
merupakan suatu nilai kasar. Oleh karena itu, untuk analisis kualitatif suatu sampel yang
diketahui digunakan bersama-sama sampel yang tidak diketahui. Dua senyawa yang
berbeda dalam satu sistem pelarut tertentu dapat memiliki nilai Rf yang sama, oleh karena
itu hasil analisis yang diperoleh dengan teknik kromatografi kertas harus uji dengan
metode yang lain.

Senyawa yang dianalisis dengan tekhik kromatografi kertas dapat ditentukan lokasinya
pada kertas dengan berbagai cara. Pada percobaan ini, noda ditentukan lokasinya pada
kertas dengan menggunakan senyawa pewarna, yaitu ninhidrin.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 4
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN I

UJI KUALITATIF ASAM AMINO

Reagen dan Bahan:

Larutan elusi (fasa gerak) = n-butanol : asam asetat : air = 60 : 15 : 25 atau 3 : 1: 1


Larutan asam amino standar Larutan sampel
Kertas kromatografi Larutan ninhidrin

Prosedur:

1. Siapkan kertas kromatografi. Beri penandaan dengan pensil. Larutan diteteskan 10 cm


dari pinggir kertas. Teteskan larutan asam amino standar berdampingan dengan jarak
1,5 cm satu sama lain menggunakan suatu kapiler (kira-kira 4 kali tetesan).
2. Tiap-tiap tetesan harus dibiarkan kering dulu dengan cara mendiamkan selama
beberapa menit. Kemudian lakukan penetesan tepat di atas tempat tetesan sebelumnya
Haruslah diusahakan agar cukup asam amino (sekitar 5µg) ditaruh di kertas tersebut,
sedangkan besar noda hendaknya jangan melebihi diameter 0,4 cm.
3. Kertas dijaga bersih dan jangan tersentuh oleh jari. Gunakan pinset untuk memegang
kertas.
4. Kemudian gantungkan kertas tersebut dalam lemari kromatografi selama beberapa jam
untuk menjenuhkan dengan uap eluen. Setelah penjenuhan tercapai maka tambahkan
larutan pengelusi.
5. Setelah larutan elusi berjalan cukup jauh, keluarkan kertas kromatografi. Lalu tandai
batas larutan dengan pensil dan keringkan kertas kromatografi pada 105 – 110 ºC.
Kemudian semprot kertas kromatografi dengan larutan ninhidrin dan keringkan lagi
pada 105 – 110 ºC selama 5 menit. Noda-noda asam amino akan terlihat.

Tugas:

Hitung harga Rf tiap-tiap noda dan catat warnanya. Kemudian tetapkan komponen-
komponen asam amino dalam larutan yang diselidiki dengan membandingkan Rf–nya
dengan Rf asam-asam amino standar.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 5
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN I

UJI KUALITATIF ASAM AMINO

IV. TUGAS PENDAHULUAN

1. Diantara metode analisa kualitatif di atas metode manakah yang bisa dimanfaatkan
untuk analisa kuantitatif? Jelaskan!
2. a. Apa yang dimaksud dengan zwitterion?
b. Akibat terbentuknya zwitterion ini, dari gugus manakah dari asam amino yang
menghasilkan nilai pKa dan pKb?
3. Salah satu cara biosintesis asam amino dalam tubuh adalah dengan mengubah suatu
asam amino yang jumlahnya berlebih menjadi asam amino yang diinginkan melalui
reaksi transaminasi. Tuliskan mekanisme reaksi transaminasi tersebut lengkap dengan
enzimnya dan asam amino apa yang disintesis dengan cara interkonversi?
4. Berikan contoh berikut penjelasannya tentang suatu penyakit yang diakibatkan oleh
kekurangan asam amino tertentu?
5. Apa keuntungan dan kerugian metode pimisahan dengan kertas kromatografi?
6. Apa metode kromatografi kertas dapat digunakan untuk analisa kuantitatif? Jelaskan!
7. Faktor apa saja yang mempengaruhi nilai Rf?

V. PUSTAKA

Harrow, B., 1960, Laboratory Manual of Biochemistry, Ed. V.

Clark, J. M. and Switzer, R. L., 1976. Experimental Biochemistry, 2nd ed.,W. H. Freeman
and Company, San Fransisco, USA.

Petunjuk Praktikum Biokimia Dasar Institut Teknologi Bandung 2005.

Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Indonesia 2005.

Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Negeri Jakarta 2005.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 6
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN II

UJI KUALITATIF PROTEIN

UJI KUALITATIF PROTEIN

I. TUJUAN

1. Mengetahui cara mengidentifikasi protein dengan memanfaatkan ikatan peptida


dengan uji kualitatif.
2. Mengamati pengaruh perubahan fisik seperti suhu, pH serta zat-zat kimia
terhadap struktur protein.

II. TEORI SINGKAT

Protein terdiri dari berbagai macam asam amino yang berikatan satu sama lain
melalui ikatan peptida. Karena setiap protein berbeda baik dalam jumLah dan jenis
asam amino penyusunnya, maka setiap protein mempunyai sifat fisika dan kimia
yang semuanya hampir berbeda kecuali dalam hal tertentu.

Karena dalam berbagai aspek kehidupan protein memegang peranan yang


sangat penting, maka perlu dilakukan berbagai macam percobaan yang menyangkut
protein antara lain: isolasi protein dan penentuan beberapa sifat protein di dalam
sampel tertentu dengan menggunakan berbagai macam prosedur yang satu sama
lainnya berbeda prinsip.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 7
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN II

UJI KUALITATIF PROTEIN

III. PROSEDUR KERJA

III.1.Pengendapan dengan Logam

Penambahan garam, asam, basa, logam dan pelarut lain dapat mempengaruhi
larutan protein dalam air. Adanya perbedaan kelarutan dapat disebabkan oleh
terbentuknya suatu senyawa kompleks yang tidak larut di dalam air, berubahnya
struktur protein sehingga mempengaruhi kelarutannya, atau adanya perbedaan sifat
dan pelarut lain yang ditambahkan.

Prosedur:

1. Siapkan 5 tabung reaksi dan lakukan percobaan dengan mengikuti petunjuk pada
tabel 1.
2. Amati yang terjadi, bila ada endapan, dipisahkan dan dilarutkan kembali dalam
air. Amati yang terjadi.
3. Bila ada protein yang larut kembali, lakukan tes dengan pereaksi Biuret.

Tabel 1. Pengendapan Protein

Nomor Tabung reaksi 1 2 3 4 5


Larutan protein di encerkan 1:4 (mL) 3 3 3 3 3
HgCl2 0,2 M (tetes) – 5 – – –
Pb(Ac)2 0,2 M (tetes) – – 5 – –
Asam pikrat jenuh (tetes) – – – 5 –
(NH4)2SO4 jenuh (mL) – – – – 2
H2O (mL) 1 – – – –

Pertanyaan:

1. Jelaskan hasil-hasil dari pengamatan diatas!


2. Terangkan mengapa putih telur digunakan sebagai penawar pada keracunan Pb
dan Hg!

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 8
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN II

UJI KUALITATIF PROTEIN

III.2.Pengendapan dengan Garam

Apabila terdapat garam-garam anorganik dalam konsentrasi tinggi dalam larutan


protein, maka kelarutan protein akan berkurang sehingga mengakibatkan
pengendapan protein tersebut. Teori menyebutkan bahwa sifat ini terjadi karena
kemampuan ion garam untuk terhidrasi sehingga bersaing dengan molekul protein
untuk mengikat air.

Reagen dan Bahan:

Reagen Millon: Larutan Merkuri dan ion mercuro dalam asam nitrat dan asam
nitrit.
Reagen Biuret: Tambahkan 1 mL NaOH 2,5 N ke dalam 3 mL larutan protein dan
aduk.
Tambahkan pula setetes CuSO4 0.01 M. Aduk, jika tidak timbul
warna,
tambahkan lagi setetes atau 2 tetes larutan CuSO4.
Larutan protein Larutan (NH4)2SO4

Prosedur:

1. Cara menjenuhkan 10 mL larutan protein dengan ammonium sulfat: tambahkan


sedikit garam kedalam larutan protein, aduk hingga melarut. Tambahkan lagi
sedikit ammonium sulfat dan aduk lagi, lakukan terus sehingga sedikit garam
tertinggal tidak terlarut.
2. Setelah larutan jenuh, kemudian disaring. Uji kelarutan endapan di dalam air.
Selanjutnya uji endapan dengan reagen Millon dan filtrat dengan uji Biuret.

Pertanyaan:

Terangkan hasil-hasil yang diperoleh!

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 9
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN II

UJI KUALITATIF PROTEIN

III.3. Pengendapan dengan Alkohol


Prosedur:
1. Siapkan 3 tabung reaksi dan lakukan percobaan dengan mengikuti petunjuk pada
tabel 2.
2. Amati perubahan yang terjadi dalam setiap tabung.

Tabel 2. Pengendapan Protein oleh Alkohol


Nomor Tabung Reaksi 1 2 3
Larutan putih telur diencerkan 1:4
5 5 5
(mL)
HCl 0.1 M (mL) 1 – –
NaOH 0.1 M (mL) – 1 –
Buffer Asetat pH 4.7 (mL) – – 1
Etanol 95% (mL) 6 6 6

III.4.Uji Koagulasi
Reagen dan Bahan:
Reagen Millon: Larutan Merkuri dan ion mercuro dalam asam nitrat dan asam
nitrit.
Larutan protein NaOH 2,5 N
Asam asetat 1 M

Prosedur:
1. Tambahkan 2 tetes HOAc 1M ke dalam 5 mL larutan protein. Letakkan tabung
dalam air mendidih selama 5 menit.
2. Ambil endapan dengan batang pengaduk. Uji kelarutan endapan di dalam air. Uji
endapan dengan reagen Millon.

Pertanyaan:
1. Apa fungsi penambahan asam kedalam larutan protein?
2. Protein apa yang menggumpal pada saat pendidihan?

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 10
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN II

UJI KUALITATIF PROTEIN

III.5.Denaturasi Protein
Prosedur:
1. Siapkan 3 tabung reaksi dan lakukan percobaan dengan mengikuti petunjuk pada
tabel 3.
2. Tempatkan ketiga tabung reaksi tersebut dalam air mendidih selama 15 menit.
3. Dinginkan pada suhu kamar dan amati apa yang terjadi. Ke dalam tabung no. 2
dan 3 ditambahkan 5 mL larutan buffer asetat pH 4,7 dan amati apa yang terjadi.
Tabel 3. Denaturasi Protein
Nomor Tabung Reaksi 1 2 3
Putih telur (mL) 5 5 5
Buffer asetat pH 4,7 (mL) 1 – –
HCl 0,1 M (mL) – 1 –
NaOH 0,1 M (mL) – – 1

Pertanyaan:
1. Sifat fisik protein apa yang mempengaruhi kelarutan dari protein dalam percobaan
ini?
2. Perubahan kimia apa yang berhubungan dengan denaturasi telur?

III.6.Uji Sulfur dalam Protein


Reagen dan Bahan:
Fusion mixture: 3 bagian natrium karbonat anhidrat dengan satu bagian kalium
nitrat.
Serbuk albumin telur Larutan BaCl2
HCl

Prosedur:
1. Campur 0,5 gram serbuk albumin dengan dua kali berat dari fusion mixture.
Panaskan dalam cawan porselin sampai tak berwarna.
2. Dinginkan dan larutkan dalam air panas. Saring jika perlu. Asamkan filtrat dengan
HCl. Panaskan hingga mendidih dan tambahkan beberapa tetes larutan BaCl2.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 11
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN II

UJI KUALITATIF PROTEIN

Pertanyaan:
Mengapa protein memberikan uji positif pada sulfur?

IV. TUGAS PENDAHULUAN

1. Gambarkan struktur senyawa kompleks antara Cu2+ dengan rantai peptida?


2. Mengapa logam dapat mengendapkan protein?
3. Apa yang dimaksud dengan salting in dan salting out ?
4. Apa istilah pengertian berikut:
a. Koagulasi
b. Denaturasi
5. Unsur-unsur apa yang biasa ada dalam protein tetapi tidak ada dalam lipid dan
karbohidrat?

V. PUSTAKA

Mathews, C. K. and Holde, K. E., 1990. Biochemistry. The Benjamin/Cumming


Publising Co., Redwood City, USA.

Petunjuk Praktikum Biokimia Dasar Institut Teknologi Bandung 2005.

Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Indonesia 2005.

Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Negeri Jakarta 2005.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 12
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN III

UJI KUALITATIF KARBOHIDRAT

UJI KUALITATIF KARBOHIDRAT

I. TUJUAN

Mengetahui cara isolasi karbohidrat dan karakteristik karbohidrat seperti tes


kualitatif.

II. TEORI SINGKAT

Karbohidrat mempunyai peranan yang penting dalam kehidupan, baik sebagai


sumber energi maupun sebagai penyusun struktur jaringan. Glukosa dan glikogen
misalnya, berperan sebagai sumber energi bagi tubuh kita, sedangkan selulosa
berperan sebagai penyusun struktur jaringan pada tanaman. Glukosa selain
sebagai sumber energi, juga berperan sebagai bahan baku bagi biosintesis
senyawa-senyawa yang diperlukan tubuh seperti purin, pirimidin, asam-asam
amino tertentu, porfirin, kolesterol, lemak, vitamin C, dan sebagainya.

Melihat pentingnya peranan karbohidrat bagi kehidupan, maka perlu


mengetahui cara isolasi karbohidrat dan karakteristik karbohidrat seperti tes
kualitatif.

III. PROSEDUR KERJA

III.1.Uji Anthrone

Reaksi anthrone merupakan metode yang baik dan cepat untuk menentukan
heksosa, aldopentosa, dan asam heksuronat, juga untuk mengetahui adanya
polisakarida. Larutan yang berwarna kehijauan ini memiliki absorpsi maksimum
620 nm, namun beberapa kabrohidrat dapat memberikan warna lain. Reaksi tidak
sesuai jika terdapat protein yang mengandung banyak gugus triptofan, karena
akan memberikan warna merah.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 13
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN III

UJI KUALITATIF KARBOHIDRAT

Reagen dan Bahan:

Reagen Anthrone 0,2%: Larutkan 0,2 gram anthrone dalam 100 mL H2SO4
pekat
Larutan glukosa 1% Larutan laktosa 1%
Larutan fruktosa 1% Larutan sukrosa 1%
Larutan galaktosa 1% Larutan amilum 1%
Larutan maltosa 1% H2SO4 50%
Kertas saring Asam asetat glasial

Prosedur:

1. Dengan hati-hati tambahkan 2 mL reagen anthrone kedalam tabung-tabung


yang telah berisi 0,2 mL larutan-larutan gula, juga kedalam tabung yang berisi
beberapa helai hancuran kertas saring.
2. Kocok setiap tabung dengan hati-hati dan biarkan beberapa saat. Perhatikan
perubahan warna.
3. Bila dihasilkan produk yang berupa susu, encerkan dengan asam asetat glasial
atau dengan asam sufat 50% (lakukan dengan hati-hati).

Pertanyaan:

1. Apakah ada perubahan warna selama dibiarkan beberapa saat?


2. Bila larutan yang hendak diselidiki juga mengandung senyawa-senyawa lain,
selain karbrohidrat, akan terbentuk warna kehijauan, mengapa?

III.2.Uji Pikrat

Gula-gula pereduksi mengubah asam pikrat menjadi asam pikramat.

Reagen dan Bahan:

Larutan Asam Pikrat Jenuh: Larutkan 1,2 gram asam pikrat dalam 100 mL
aquades
Larutan glukosa 1% Larutan laktosa 1%

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 14
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN III

UJI KUALITATIF KARBOHIDRAT

Larutan fruktosa 1% Larutan sukrosa 1%


Larutan galaktosa 1% Larutan amilum 1%
Larutan maltosa 1% Na2CO3 1 M

Prosedur:

1. Campur 2 mL larutan-larutan: glukosa; fruktosa; galaktosa; maltosa; laktosa;


sukrosa dan amilum dengan 1 mL larutan asam pikrat jenuh dan 0,5 mL
Na2CO3 1 M.
2. Kemudian semua tabung bersama-sama dipanaskan dalam penangas air
sampai terlihat perubahan warna.

Pertanyaan:

1. Larutan gula mana yang memberikan uji positif?


2. Tuliskan reaksi perubahan asam pikrat menjadi asam pikramat?
3. Mengapa uji ini dapat dipakai sebagai dasar untuk penentuaan kadar gula
darah secara kolorimetris?

III.3.Uji Fearon

Uji Fearon juga dipakai untuk membedakan monosakarida yang bergugus


reduksi dari disakarida yang juga bergugus reduksi.

Reagen dan Bahan:

Larutan glukosa 0,5% Larutan maltosa 0,5%


Larutan fruktosa 0,5% Larutan sukrosa 0,5%
Larutan manosa 0,5% Larutan laktosa 0,5%
Larutan xylosa 0,5% Larutan dextrin 0,5%
Larutan metilamina hidroklorida 5% (b/v) Larutan amilum 0,5%
Larutan NaOH 20%

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 15
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN III

UJI KUALITATIF KARBOHIDRAT

Prosedur:

1. Tambahkan 3-4 tetes larutan metilamina hidroklorida ke dalam tabung-tabung


yang telah berisi 4 mL larutan-larutan glukosa. fruktosa. manosa. xylosa.
maltosa. sukrosa. laktosa. dextrin. dan amilum.
2. Didihkan di dalam penangas air selama 30 detik. dinginkan. lalu tambahkan 4-
5 tetes NaOH 20%. Warna merah menunjukkan uji positif untuk disakarida
yang bergugus reduksi.

Pertanyaan:

Tabung mana yang memberikan uji positif?

III.4.Uji Foulger

Uji Foulger berfungsi untuk uji gula yang bergugus keto. seperti halnya uji
Seliwanoff.

Reagen dan Bahan:

Reagen Foulger: Tambahkan 2 gram stano klorida ke dalam 40 gram urea yang
telah
dilarutkan didalam 80 mL H2SO4 40% (v/v). Didihkan
campuran ini
hingga terlihat bening. Encerkan hingga 100 mL dengan
H2SO4 40%.
Larutan glukosa 0,5% Larutan maltosa 0,5%
Larutan fruktosa 0,5% Larutan sukrosa 0,5%
Larutan manosa 0,5% Larutan laktosa 0.5%
Larutan xylosa 0,5% Larutan dextrin 0,5%
HCl pekat Larutan amilum 0,5%

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 16
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN III

UJI KUALITATIF KARBOHIDRAT

Prosedur:

1. Ke dalam tabung-tabung yang berisi 2 mL larutan gula tambahkan 1 mL HCl


pekat dan 1 mL reagen Foulger.
2. Panaskan tabung-tabung tersebut di dalam penangas air selama dua menit.
terbentuknya warna biru menunjukkan reaksi yang positif untuk gula-gula keto.

Pertanyaan:
Larutan gula mana yang menunjukkan uji positif?

III.5.Uji Iodine

Uji Iodin dapat dipakai untuk membedakan amilum dari glikogen.

Reagen dan Bahan:

Larutan Iodine 0.01 M: Larutkan 10 gram kalium iodida dalam 1 liter air.
Tambahkan 2,5 gram iodin dan aduk.
Larutan amilum 1% HCl 6 N
NaOH 6 N

Prosedur:

1. Pipet ke dalam tiga tabung reaksi masing-masing 3 mL larutan amilum.


2. Tambahkan 2 tetes air pada tabung pertama, 2 tetes HCl pada tabung kedua
dan 2 tetes NaOH pada tabung ketiga.
3. Kocok semua tabung. lalu tambahkan 1 tetes larutan iodine ke dalam masing-
masing tabung. Perhatikan warna yang terbentuk. Panaskan tabung yang
berwarna, dinginkan, Perhatikan perubahan-perubahannya.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 17
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN III

UJI KUALITATIF KARBOHIDRAT

Pertanyaan:

1. Selain amilum. senyawa apa yang menghasilkan warna ketika diteteskan


iodine?
2.

3 I2 + 6 NaOH 5 NaI + NaIO3 + 3 H2O

5 NaI + NaIO3 + 6 HCl 3 I2 + 6NaCl + 3H2O

Dengan melihat kedua persamaan diatas, kondisi yang bagaimanakah yang


dapat memberikan hasil uji terbaik?
3. Bagaimana ketelitian uji iodine ini jika dibandingkan dengan uji anthron?

III.6.Uji Asam Musat

Galaktosa dapat dibedakan dari monosakarida lainnya dengan tes ini.


Monosakarida bila direaksikan dengan HNO3 pekat akan menghasilkan asam
dikarboksilat yang umumnya larut dalam air sedangkan galaktosa akan
menghasilkan asam musat yang tidak larut.

Reagen dan Bahan:

Glukosa 50 mg Galaktosa 50 mg
HNO3 pekat Aquades

Prosedur:

1. Siapkan dua tabung reaksi. isi tabung pertama dengan 50 mg glukosa dan
yang lainnya dengan 50 mg galaktosa.
2. Ke dalam masing-masing tabung. tambahkan 1 mL air suling dan HNO3
pekat. Panaskan kedua tabung tersebut dalam penangas air dalam lemari
asam
selama 30 - 60 menit.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 18
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN III

UJI KUALITATIF KARBOHIDRAT

3. Tambahkan H2O pada tiap tabung dan diamkan satu malam. Amati dan
tuliskan perubahan yang terjadi!

IV. PUSTAKA

Frais, F., 1971. Practical Biochemistry in Introductory Course, 1st ed., Butterworth
& Co.. Ltd., London, halaman 23-25.

Harrow, B. et al., 1960. Laboratory Manual of Biochemistry, 5th ed., W. B. Sanders


Comp., New Tork, halaman 1-4.

Petunjuk Praktikum Biokimia Dasar Institut Teknologi Bandung 2005.

Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Indonesia 2005.

Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Negeri Jakarta 2005.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 19
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN IV

UJI KUALITATIF LIPID

UJI KUALITATIF LIPID

I. TUJUAN

Mengetahui cara mengisolasi lipid dari suatu sampel beserta uji kualitatifnya.

II. TEORI SINGKAT

Lipid merupakan biomolekul organik yang tidak larut di dalam air tetapi larut di
dalam pelarut organik seperti eter, kloroform, dan benzen. Dalam tubuh, lipid
berfungsi sebagai surnber energi, komponen struktur membran, sumber bahan
baku bagi biosintesis basa-basa purin serta pirimidin yang menyusun asam
nukleat, biosintesis asam amino tertentu, dan sebagainya.

Selain lipid yang berada dalam keadaan bebas terdapat pula lipid yang
berikatan dengan senyawa lain. Bila lipid berikatan dengan protein disebut
lipoprotein, bila berikatan dengan karbohidrat disebut glikolipid, dan bila berikatan
dengan fosfat anorganik disebut fosfolipid.

III. PROSEDUR KERJA

III.1.Isolasi Lipid
Prinsip isolasi lipid adalah berdasarkan perbedaan kelarutan lipid dengan
senyawa lain yang ada di dalam sampel. Campuran lipid dari suatu jaringan dapat
dipisahkan berdasarkan kelarutan dalam berbagai pelarut lipid atau pelarut
organik. Sebagai contoh fosfolipid dapat dipisahkan dari sterol dan lipid netral
dengan menggunakan aseton, sebab fosfolipid tidak larut dalam aseton. Untuk
fraksinasi lipid dapat dilakukan penyabunan.

Prosedur pemisahan berbagai lipid dari kuning telur.


1. Pecahkan telur dan pisahkan putih telur dari kuningnya. Simpan putih telur
(diberikan kepada asisten) untuk penentuan protein.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 20
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN IV

UJI KUALITATIF LIPID

2. Letakkan kuning telur di dalam gelas piala 400 mL dan tambahkan 50 mL


etanol dan 25 mL eter (Perhatian: jangan bekerja dekat api!). Aduk dan
diamkan 10 menit.
3. Saring dengan kertas saring yang telah dibasahkan dengan alkohol ke dalam
gelas piala kering. Bilas endapan pada kertas saring dengan 20 rnL campuran
alkohol-eter (2:1) dan tampung filtrat yang dihasilkan.
4. Uapkan filtrat di atas penangas air menggunakan cawan penguap. Setelah
dingin larutkan residu dalam 10 mL eter.
5. Tarnbahkan perlahan-lahan 30 mL aseton lalu aduk. Pisahkan endapan dan
filtrat dengan proses penyaringan.
6. Endapan yang didapat adalah lesitin. Lesitin disimpan untuk percobaan
fosfolipid.
7. Filtrat diuapkan di atas penangas air. Dinginkan dan tambahkan 15 mL larutan
KOH 15% dalam alkohol lalu panaskan di atas penangas air selama 30 menit.
8. Tambahkan 50 mL eter. Endapan yang terbentuk adalah sabun sedangkan
filtratnya mengandung kolesterol. Sabun dan kolesterol dipisahkan dengan
penyaringan.
9. Uapkan filtrat yang rnengandung kolesterol di atas penangas air. Ekstraksi
endapan yang terbentuk dengan 5 mL alkohol sambil dipanaskan di atas
penangas air.
10. Pipet larutan alkohol dan masukkan ke dalam tabung sentrifuga. Ulangi
ekstraksi dengan 3 mL alkohol.
11. Sentrifugasi larutan alkohol selama 3 menit dan pindahkan supernatannya ke
tabung sentrifuga lain. Tambahkan air ke dalam supernatan sampai tidak
terbentuk endapan lagi. Diamkan selama 30 menit lalu sentrifugasi.
12. Dekantasi larutan di atasnya dan rekristalisasi endapan yang diperoleh dalam
alkohol panas. Dinginkan dan tambahkan beberapa tetes air guna
penyempurnaan kristalisasi. Sentrifugasi dan pisahkan kolesterol yang didapat.

III.2.Emulsi
Kebanyakan lipid larut dalam etanol 95%, tetapi membentuk suatu emulsi
apabila ke dalamnya ditambahkan beberapa tetes air. Emulsi yang terbentuk
mempunyai penampilan seperti susu dan tidak stabil. Akan kembali kepada

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 21
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN IV

UJI KUALITATIF LIPID

keadaan semula (campuran) setelah didiamkan sejenak. Penambahan suatu zat


ketiga yang mempunyai daya aktif permukaan, misalnya sabun, akan membuat
keadaannya lebih stabil.

Prosedur:
a. Sabun sebagai emulgator (pencegah emulsi)
Siapkan 4 tabung reaksi dan lakukan percobaan mengikuti petunjuk pada tabel
1. Tabel 1. Emulsi.
Nomor Tabung reaksi 1 2 3 4
H2O (mL) 5 5 5 5
Minyak parafin (tetes) 1 – 1 –
Minyak kelapa (tetes) – 1 – 1
HCl encer (tetes) 1 1 – –
Soda (tetes) – – 1 1

Keempat tabung reaksi dikocok dan ditutup ibu jari. Amati dan jelaskan
perubahan yang terjadi pada keempat tabung tersebut.

b. Gallus (empedu) sebagai emulgator


Campur dan kocok 3 mL air dan 1 mL gallus (blanko).
Campur dan kocok 3 mL air dan 1 tetes minyak kelapa (blanko).
Campurkan 3 mL air, 1 tetes minyak kelapa dan 1 mL gallus. Amati dan
jelaskan perubahan yang terjadi.

c. Protein sebagai emulgator


Kocok 3 mL protein 1% (blanko).
Kocok 3 mL protein 1% dan 3 tetes minyak. Amati dan jelaskan perubahannya.
III.3.Uji Kelarutan

Setiap senyawa lipid mempunyai karakteristik kelarutan yang berbeda dan sifat
ini digunakan pada ekstraksi dan isolasi lipid dari sampel biologis.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 22
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN IV

UJI KUALITATIF LIPID

Prosedur:

1. Siapkan 15 tabung reaksi dan lakukan percobaan mengikuti petunjuk pada


tabel 2.
2. Amati dan jelaskan perubahan yang terjadi.

Tabel 2. Tes Daya Kelarutan Lemak.

Nomor Tabung reaksi 1 2 3 4 5


H2O (mL) 3 – – – –
Alkohol (mL) – 3 – – –
Aseton (mL) – – 3 – –
Eter (mL) – – – 3 –
Kloroform (mL) – – – – 3
Minyak kelapa (tetes) 1–2 1–2 1–2 1–2 1–2

Nomor Tabung reaksi 1 2 3 4 5


H2O (mL) 3 – – – –
Alkohol (mL) – 3 – – –
Aseton (mL) – – 3 – –
Eter (mL) – – – 3 –
Kloroform (mL) – – – – 3
Lesitin (mg) 5 5 5 5 5

Nomor Tabung reaksi 1 2 3 4 5


H2O (mL) 3 – – – –
Alkohol (mL) – 3 – – –
Aseton (mL) – – 3 – –
Eter (mL) – – – 3 –
Kloroform (mL) – – – – 3
Kolesterol (mg) 5 5 5 5 5

III.4.Uji Penyabunan

Apabila lemak atau minyak dipanaskan dengan penambahan alkali, maka akan
terbentuk garam asam lemak atau sabun dan gliserol. Proses ini dikenal dengan
saponifikasi. Sabun larut dalam air, tetapi akan mengendap apabila ditambahkan
NaCl berlebih.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 23
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN IV

UJI KUALITATIF LIPID

Prosedur:
1. Tambahkan 3 mL larutan KOH alkoholis 10% ke dalam tabung reaksi yang
berisi 2 tetes minyak.
2. Panaskan campuran di dalam penangas air mendidih selama 1 menit.
3. Setelah dingin, tambahkan HCl sedikit berlebih.
4. Pisahkan asam lemak bebas dengan cara mengekstraksinya dengan
kloroform atau eter.
5. Lakukan uji busa

III.5.Uji Peroksida

Adanya peroksida ditunjukkan dengan pembebasan Iodin.

Prosedur:
1. Larutkan kira-kira 1 mL minyak olive di dalam 1 mL klorofrom, tambahkan 2 mL
asam asetat glasial dan satu tetes larutan KI 10%, aduk dengan rata dan
biarkan selama 5 menit.
2. Ulangi percobaan dengan menggunakan minyak/lemak tengik.

Pertanyaan:
Lipid mana yang menunjukan uji positif?
III.6.Uji Busa (untuk Sabun)

Prosedur:

1. Tambahkan beberapa mL air ke dalam tabung reaksi yang mengandung sabun


(hasil percobaan isolasi lipid III.1) kocok kuat-kuat.
2. Amati dan jelaskan perubahan yang terjadi.

Pertanyaan:

1. Apakah busa itu?


2. Bagaimana busa itu terbentuk?

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 24
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN IV

UJI KUALITATIF LIPID

3. Senyawa-senyawa apa lagi selain sabun yang membentuk busa?

III.7.Uji Pengendapan (untuk Sabun)

Prosedur:

1. Ke dalam larutan sabun dingin (hasil percobaan isolasi lipid) tambahkan


beberapa tetes asam klorida pekat sampai larutan memberikan uji positif
terhadap kertas indikator kongomerah.
2. Kocok selama penambahan asam dengan merata.

Pertanyaan:

1. Apa hasilnya?
2. Senyawa organik lain apa yang juga menghasilkan reaksi positif?

III.8.Uji Aklorein
Apabila lesitin atau gliserol dipanaskan disertai dengan penambahan kalium
bisulfit, maka akan terjadi dehidratasi membentuk akrolein yang berbau khas.
Reaksi :
CHOH CH2
KHSO4
CHOH CH + H2O

CH2OH CHOH

Gliserol akrolein

Prosedur:
1. Tambahkan kalium bisulfat anhidrida sebanyak 100 mg kedalam tabung reksi
kering yang berisi 1 - 2 tetes gliserol.
2. Panaskan campuran dan cium bau yang terbentuk.
3. Ulangi percobaan dengan menggunakan lemak dan lesitin (hasil percobaan
isolasi lipid III.1.)

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 25
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN IV

UJI KUALITATIF LIPID

III.9.Tes Fosfat
Fosfolipid jika direaksikan dengan ammonium molibdat akan menghasilkan
kompleks amonium fosfomolibdat yang berwarna biru, seperti reaksi dibawah ini.

PO43 –+12 (NH4)3MoO4 + 2 H2 Æ (NH4)3PO4 .12MoO3 + 21 NH3 + 12 H2O


(NH4)3PO4.12 MoO3 + asam askorbat Æ biru molibdenum + dehidro asam
askorbat

Prosedur:
1. Tambahkan 1 mL air ke dalam tabung reaksi yang berisi 10 tetes larutan lesitin
(hasil percobaan isolasi lipid III.1.), kemudian kocok sampai homogen.
2. Tambahkan 1 mL larutan amonium molibdat 2,5% dalam asam sulfat 5 N lalu
kocok campuran.
3. Tambahkan 5 tetes larutan asam askorbat 5 % dan amati perubahan warna
yang terjadi.

Petanyaan:
1. Bagaimana hasil dari percobaan tersebut?
2. Lipid apa yang mengandung nitrogen, juga fosfor?

III.10.Uji Ketidak Jenuhan

Prosedur:
1. Siapkan 15 tabung reaksi dan lakukan percobaan mengikuti petunjuk pada
tabel 3.
2. Buat larutan brom dengan cara melarutkan 1 mL Br2 dilarutkan di dalam 20 mL
klorofrom.
Tabel 3. Uji Ketidak Jenuhan Lemak.

Nomor Tabung reaksi 1 2 3 4


Minyak olive (tetes) 1 – – –
Gajih/gemuk (mL) – 1 – –
Lesitin (mL) – – 1 –
Kloroform (mL) 1 1 1 1

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 26
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN IV

UJI KUALITATIF LIPID

3. Teteskan larutan brom (dalam kloroform) ke dalam semua tabung dengan


menggunakan pipet Pasteur sampai terlihat warna kuning yang permanen.
Catat jumlah tetes yang diperlukan.

Petanyaan:
Amati dan jelaskan perubahan-perubahan yang terjadi.

III.11.Uji Salkowski untuk Kolesterol


Bila kolesterol dengan konfigurasi tidak jenuh di dalam molekulnya direaksikan
dengan asam kuat dalam kondisi bebas air, maka akan memberikan warna yang
karakteristik. Warna yang dihasilkan bervariasi dangan kondisi percobaan.
Mekanisme reaksinya menurut salah satu teori adalah mula-mula dibentuk
kompleks asam teraktivasi, diikuti dengan agregasi beberapa molekul
menghasilkan sistem terkonjugasi. Senyawa-senyawa kromofor yang dihasilkan
berlaku seperti indikator asam basa.
Baik uji Salkowski maupun uji Liebermann-Burchard akan memberikan hasil
yang baik, bila alat-alat gelas, reagen-reagen dan senyawa-senyawa yang akan
diuji berada dalam keadaan kering.

Prosedur:
1. Dalam tabung reaksi kering, larutkan 10 mg kolesterol (hasil percobaan isolasi
lipid III.1.) di dalam 2 mL klorofom anhidrat. Tambahkan volume dua tetes
H2SO4 pekat (B.D. 1,84).
2. Kocok tabung perlahan-lahan. Biarkan lapisan cair terpisah, amati warnanya.

Pertanyaan:
1. Lapisan mana yang merupakan lapisan klorofom? Bagaimana warnanya?
2. Jelaskan warna lapisan asam sulfat dalam cahaya yang dipantulkan dan
cahaya yang distransmisi!

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 27
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN IV

UJI KUALITATIF LIPID

III.12.Uji Liebermann - Burchard untuk Kolesterol


Apabila sterol yang mempunyai ikatan rangkap di dalam molekulnya
direaksikan pada kondisi kering dengan asam asetat anhidrid dan asam suifat
pekat, maka akan dihasilkan suatu warna yang karakteristik.

Prosedur:
1. Dalam tabung reaksi kering, larutkan 10 mg kolesterol (hasil percobaan isolasi
lipid III.1.) di dalam 2 mL klorofom anhidrat. Tambahkan enam tetes asam
asetat anhidrida dan dua tetes H2SO4 pekat (B.D. 1,84).
2. Kocok tabung perlahan-lahan sampai homogen. Biarkan untuk beberapa
menit, amati warna yang terbentuk.

Pertanyaan:
1. Jelaskan warna dari pada isi tabung?
2. Bagaimana kepekaan dari kedua uji diatas tersebut: Salkowski dan
Liebermann – Burchard terhadap kolesterol?
3. Apa yang menyebabkan reaksi warna ini berguna untuk penentuaan
kuantitatif?

IV. PUSTAKA
Frais, F., 1971. Pratical Biochemistry in Introductory Course, 1st ed., Butterworth &
Co. Ltd., London, halaman 23-25.

Harrow, B. et al., 1960. Laboratory Manual of Biochemistry, 5th ed., W. B. Sanders


Comp., New Tork, halaman 13-74.

Petunjuk Praktikum Biokimia Dasar Institut Teknologi Bandung 2005.

Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Indonesia 2005.

Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Negeri Jakarta 2005.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 28
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN V

ENZIM

ENZIM

I. TUJUAN

1. Mengetahui cara mengisolasi enzim


2. Mengamati beberapa faktor antara lain pH, konsentrasi substrat, suhu,
waktu inkubasi, koenzim dan inhibitor terhadap aktivitas enzim.

II. TEORI SINGKAT

Enzim adalah protein yang berfungsi sebagai biokatalis. Enzim sebagai protein
mempunyai sifat protein dan sebagai biokatalis enzim mempunyai aktivitas.
Aktivitas enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain suhu, pH, waktu
inkubasi, konsentrasi substrat, koenzim, inhibitor dan lainnya.

Untuk mengisolasi suatu enzim perlu diperhatikan sifat sebagai protein


terutama kelarutan dalam suatu pelarut, agar tidak terjadi denaturasi, yang akan
menghilangkan aktivitas.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 29
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN V

ENZIM

III. PROSEDUR KERJA


III.1.Isolasi Enzim Polifenol Oksidase

Hasil pertanian pada umumnya tidak dapat disimpan dalam waktu yang lama.
Salah satu penyebab cepat rusaknya komoditi ini adalah terjadinya pencoklatan
yang diikuti oleh perubahan penampilan, rasa dan bau.
Reaksi pencoklatan terutama disebabkan oleh enzim polifenol oksidase (PFO)
yang terkandung dalam buah, sayur dan umbi-umbian tersebut. Pada percobaan
ini polifenol oksidase diisolasi dari kentang.
Enzim polifenol oksidase adalah suatu enzim yang dapat mengkatalisis reaksi
hidroksilasi dan oksidasi substrat dari golongan senyawa-senyawa fenolik. Enzim
ini juga dikenal dengan nama fenol oksidase, fenolase, tirosinase, katekholase,
dopa oksidase dan katekol oksidase. Pada umumnya polifenol oksidase dapat
mengkatalisis dua macam reaksi yaitu:
1. Hidroksilasi pada senyawa monofenol menghasilkan difenol pada posisi orto,
dengan enzim yang berperan adalah kresolase.
2. Oksidasi orto difenol menghasilkan quinon, dengan enzim yang mengkatalisis
disebut katekolase.

Prosedur:

1. Blender 250 g potongan kentang dalam 250 mL aseton (sebaiknya dalam


keadaan dingin) dalam blender gelas selama kurang lebih 3 menit, saring.
2. Larutkan endapan yang diperoleh dalam 150 mL aseton dan blender kembali
dan saring. Endapan yang diperoleh adalah tepung aseton yang mengandung
enzim polifenol oksidase.
3. Keringkan endapan tersebut dengan cara diangin-anginkan. Larutkan 1,0 g
tepung aseton dalam 37,5 mL larutan buffer natrium fosfat 0,1 M dan pH 6,8.
Aduk campuran tersebut selama 1 jam pada suhu antara 5 - 10 °C.
4. Sentrifugasi campuran pada 3000 rpm selama 30 menit. Dekantasi dan saring
cairan dengan kertas saring Whatman no. 1. Filtrat yang diperoleh merupakan
enzim kasar.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 30
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN V

ENZIM

III.2.Penentuan Aktivitas Polifenol Oksidase


Aktivitas polifenol oksidase ditentukan berdasarkan metode Varda Khan yang
dimodifikasi.

Prosedur:
1. Siapkan 3 tabung reaksi dan lakukan percobaan sesuai petunjuk pada tabel 6.
2. Inkubasi tabung-tabung yang telah terisi pada suhu 30 °C selama 30 menit.
3. Aktivitas enzim dihentikan dengan merendam tabung dalam air mendidih
selama 3 menit.
4. Tentukan perubahan absorbansi pada λ = 470 nm. Aktivitas polifenol oksidase
adalah selisih antara absorbansi sampel dengan absorbansi kontrol. Aktivitas
polifenol oksidase dinyatakan dalam unit aktivitas. Satu unit aktivitas polifenol
oksidase dapat dinyatakan ekuivalen dengan kenaikan 0,001 Absorbansi per
menit. Aktivitas spesifik dinyatakan dalam unit per mg protein.

Tabel 1. Penentuan Aktivitas Polifenol Oksidase.

Bahan Kontrol 1 Kontrol 2 Sampel


Larutan buffer fosfat 0,1 M, pH 6,8
2,0 – 2,0
(mL)
Larutan katekol 2,0 x 10° M (mL) 2,0 – 2,5
H2O (bebas mineral, mL) 1,0 4,5 0,5
Larutan enzim kasar (mL) – 0,5 0,5

III.3.Penentuan Kadar Protein Enzim Kasar (Metode Lowry)


Reagen dan Bahan:
Reagen Folin Ciocalteu 1 M: Cari penyusun reagen ini, lalu kumpulkan ke asisten

Prosedur:
1. Tambahkan 5,0 mL pereaksi CuS04 ke dalam 0,5 mL larutan enzim kasar.
Kocok dan inkubasi selama 10 menit. Ke dalam campuran tersebut tambahkan
0,5 mL reagen Folin Ciocalteu 1 M dan ukur absorbansinya pada λ = 700 nm.
2. Larutan standar yang dapat digunakan adalah larutan Bovin Serum Albumin
dengan konsentrasi 20 - 200 µg.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 31
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN V

ENZIM

III.4.Pengaruh pH terhadap Aktivitas Polifenol Oksidase

Prosedur:
1. Siapkan 11 tabung reaksi dan lakukan percobaan sesuai petunjuk pada tabel
2.
2. Inkubasi tabung-tabung yang telah diisi pada 30°C selama 30 menit.
3. Aktivitas enzim dihentikan dengan merendam tabung dalam air mendidih
selama 3 menit.
4. Tentukan perubahan absorbansi pada λ = 470 nm.
Keterangan:
K1 = kontrol 1
K2 = kontrol 2
S = sampel

Tabel 2. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Enzim.


Tabung
Bahan (mL)
K1 S K2 K1 S K2 K1 S K2 K1 S K2 K1 S K2
Lar. Buffer
fosfat 2,0 2,0 2,0 – – – – – – – – – – – –
0,1 M pH 6,0
Lar. Buffer
fosfat – – – 2,0 2,0 2,0 – – – – – – – – –
0,1 M pH 6,4
Lar. Buffer
fosfat – – – – – – 2,0 2,0 2,0 – – – – – –
0,1 M pH 6,8
Lar. Buffer
fosfat – – – – – – – – – 2,0 2,0 2,0 – – –
0,1 M pH 7,2
Lar. Buffer
fosfat – – – – – – – – – – – – 2,0 2,0 2,0
0,1 M pH 7,6
Lar. Katekol 2,0 2,0 – 2,0 2,0 – 2,0 2,0 – 2,0 2,0 – 2,0 2,0 –
2,0 x 10–3 M
H2O 1,0 0,5 2,5 1,0 0,5 2,5 1,0 0,5 2,5 1,0 0,5 2,5 1,0 0,5 2,5
Lar. Enzim – 0,5 0,5 – 0,5 0,5 – 0,5 0,5 – 0,5 0,5 – 0,5 0,5
Kasar

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 32
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN V

ENZIM

III.5.Pengaruh Konsentrasi Substrat terhadap Aktivitas Polifenol Oksidase


Prosedur:
Tabel 3. Pengaruh Konsentrasi Substrat terhadap Aktivitas Enzim Polifenol
Oksidase.
Bahan (mL) K2 K1 S K1 S K1 S K1 S K1 S
Larutan buffer fosfat
– 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0
0,1 M pH 6,8
Larutan Katekol
– 2,0 2,0 – – – – – – – –
0,5 x 10–3 M
Larutan Katekol
– – – 2,0 2,0 – – – – – –
1 x 10–3 M
Larutan Katekol
– – – – – 2,0 2,0 – – – –
1,5 x 10–3 M
Larutan Katekol
– – – – – – – 2,0 2,0 – –
2 x 10–3 M
Larutan Katekol
– – – – – – – – – 2,0 2,0
2,5 x 10–3 M
H2O 4,5 1,0 0,5 1,0 0,5 1,0 0,5 1,0 0,5 1,0 0,5
Larutan enzim kasar 0,5 – 0,5 – 0,5 – 0,5 – 0,5 – 0,5

1. Siapkan 11 tabung reaksi dan lakukan percobaan sesuai dengan petunjuk


pada tabel 3.
2. Inkubasi tabung-tabung pada 300 C selama 30 menit.
3. Aktivitas enzim dihentikan dengan merendam dalam air mendidih selama 3
menit.
4. Tentukan perubahan absorbansi pada λ = 470 nm.

III.6.Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Polifenol Oksidase


Prosedur:
1. Sediakan 15 tabung reaksi dan ikuti prosedur pada tabel 4.
2. Aktivitas enzim dihentikan dengan merendam dalam air mendidih selama 3
menit.
3. Perubahan absorbansi ditentukan pada λ = 470 nm.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 33
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN V

ENZIM

Tabel 4. Pengaruh Suhu Inkubasi terhadap Aktivitas Enzim Polifenol Oksidase.

Bahan (mL) K1 K2 S K1 K2 S K1 K2 S K1 K2 S K1 K2 S
Larutan buffer
2,0 – 2,0 2,0 – 2,0 2,0 – 2,0 2,0 – 2,0 2,0 – 2,0
fosfat 0,1 M pH 6,8
Larutan Katekol
2,0 – 2,0 2,0 – 2,0 2,0 – 2,0 2,0 – 2,0 2,0 – 2,0
2,0 x 10–3 M
H20 1,0 4,5 0,5 1,0 4,5 0,5 1,0 4,5 0,5 1,0 4,5 0,5 1,0 4,5 0,5
Larutan enzim
– 0,5 0,5 – 0,5 0,5 – 0,5 0,5 – 0,5 0,5 – 0,5 0,5
kasar
Suhu inkubasi
pada waktu 30 26 °C 28 °C 30 °C 32 °C 34 °C
menit

III.7.Pengaruh Waktu Inkubasi terhadap Aktivitas Polifenol Oksidase

Prosedur:
1. Sediakan 15 tabung reaksi dan ikuti prosedur pada tabel 5.
2. Aktivitas enzim dihentikan dengan merendam dalam air mendidih selama 3
menit.
3. Perubahan absorbansi ditentukan pada λ = 470 nm.

Tabel 5. Pengaruh Waktu Inkubasi terhadap Aktivitas Enzim Polifenol Oksidase.


Bahan (mL) K1 K2 S K1 K2 S K1 K2 S K1 K2 S K1 K2 S
Larutan buffer
2,0 – 2,0 2,0 – 2,0 2,0 – 2,0 2,0 – 2,0 2,0 – 2,0
fosfat 0,1 M pH 6,8
Larutan Katekol
2,0 – 2,0 2,0 – 2,0 2,0 – 2,0 2,0 – 2,0 2,0 – 2,0
2,0 x 10–3 M
H20 1,0 4,5 0,5 1,0 4,5 0,5 1,0 4,5 0,5 1,0 4,5 0,5 1,0 4,5 0,5
Larutan enzim – 0,5 0,5 – 0,5 0,5 – 0,5 0,5 – 0,5 0,5 – 0,5 0,5
kasar
Waktu inkubasi
20 menit 25 menit 30 menit 35 menit 40 menit
pada suhu 30 °C

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 34
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN V

ENZIM

III.8. Pengumpulan Air Liur

Prosedur:
1. Cuci mulut dengan cara berkumur-kumur menggunakan air sehingga bebas
dari sisa makanan.
2. Tampung air liur sampai volumenya kurang lebih 25 mL.

III.9. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Enzim Saliva

Prosedur:
1. Sediakan 5 tabung reaksi dan ikuti prosedur pada tabel 6.
2. Inkubasi pada suhu 38° C. Tentukan pada pH berapa yang paling cepat
mencapai titik akromatik.
3. Lakukan tes iodium pada setiap tabung. Untuk tabung No. 1 dan 2, sebelum
penambahan larutan terlebih dahulu harus diasamkan dengan asam asetat.

Tabel 6. Pegaruh pH terhadap Aktivitas Enzim Saliva.

Nomor Tabung 1 2 3 4 5
Larutan buffer 5 mL (pH) 8,0 7,4 6,8 6,0 5,2
Larutan tepung 1% (mL) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
Larutan NaCl 0,1 M (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Larutan saliva 1 : 9 (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

III.10. Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Enzim Saliva

Prosedur:
1. Sediakan 4 tabung reaksi dan ikuti prosedur pada tabel 7.
2. Setelah penambahan saliva larutan harus langsung diinkubasi dan jangan
dibiarkan pada rak tabung, kecuali tabung no. 2. Setiap menit ambil 1 mL
sampel dan lakukan tes dengan iodium, yaitu dengan menambahkan 2 tetes
larutan Iodium 0,01 M.
3. Amati aktivitas enzimnya.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 35
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN V

ENZIM

Tabel 7. Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Enzim Saliva.

Nomor Tabung 1 2 3 4
Larutan tepung 1% 5 5 5 5
(Saliva
L) encer 1 : 9 2 2 2 2
(Suhu )inkubasi Air es Suhu kamar 38 °C Air
didih

III.11. Pengaruh Inhibitor terhadap Aktivitas Enzim Saliva

Prosedur:
1. Sediakan 6 tabung reaksi dan ikuti prosedur pada tabel 8.
2. Diamkan selama 10 menit sambil beberapa kali dikocok, kemudian tambahkan
5 mL larutan tepung 1% pada setiap tabung. Inkubasi pada suhu 38°C selama
15 menit.
3. Lakukan uji Iodium dan uji Benedict pada setiap setengah jumlah volum larutan
dalam tabung.
4. Amati serta tentukan apakah senyawa-senyawa tersebut berfungsi sebagai
inhibitor terhadap ptialin.

Tabel 8. Pengaruh Inhibitor terhadap Aktivitas Enzim Saliva.


Nomor Tabung 1 2 3 4 5 6
Larutan saliva 1 : 9 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
(Toluen
L) (tetes) 5 – – – – –
Kloroform (tetes) – 5 – – – –
HgCl2 1% (tetes) – – 5 – – –
Fenol (tetes) – – – 5 – –
NaF (tetes) – – – – 5 –
Air (tetes) – – – – – 5

IV. PUSTAKA

Mathews, C. K. and Holde, K. E. 1990. Biochemistry. The Benjamin/Cumming


Publising Co.,Redwood City. USA.

Petunjuk Praktikum Biokimia Dasar Institut Teknologi Bandung 2005.

Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Indonesia 2005.

Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Negeri Jakarta 2005.


LABORATORIUM JURUSAN KIMIA
FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 36
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN VI

DNA

DNA

I. TUJUAN

Mengetahui isolasi dan karakteristik DNA.

II. TEORI SINGKAT

DNA (deoxyribosanucleotide acid) adalah suatu polinukleotida yang disusun


oleh monomer dATP, dTTP, dGTP, dCTP yang terikat melalui ikatan fosfodiester.
DNA merupakan untai ganda berbentuk heliks yang kedua untainya mempunyai
urutan nukleotida yang komplemen dan terikat oleh ikatan hydrogen. DNA
merupakan materi genetik yang menentukan sifat dari suatu organisme. DNA
terdapat pada kromosom, mitokondria, plasmid dan virus.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 37
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN VI

DNA

III. PROSEDUR KERJA

III.1.ISOLASI DNA DARI BUAH DAN SAYUR


Reagen dan Alat:
Buah atau sayur yang lunak 20 gram Mortar and alu 1 pasang
Natrium Klorida 3 gram Batang Pengaduk 1 buah
Detergen Cair 10 mL Corong 1 buah
Etanol Pekat dingin (95-100%) 9 mL Pipet Tetes 1 buah
Gelas Kimia 30 mL 1 buah Gelas Ukur 10 mL 2 buah
Gelas Kimia 100 mL 2 buah Kertas Saring

Prosedur:
1. Kupas kulit buah, potong-potong daging buah menjadi bagian yang lebih kecil,
timbang sebanyak 20 g, kemudian haluskan sampai berbentuk seperti bubur
dengan menggunakan mortar. Lalu masukkan kedalam gelas kimia 100 mL.
2. Tambahkan 3 g NaCl dan 10 mL detergen cair pada campuran diatas,
kemudian tambahkan air sampai volume total campuran menjadi 100 mL.
3. Aduk campuran dengan batang pengaduk, kemudian saring campuran dengan
kertas saring. Biarkan hasil saringan beberapa menit sampai terlihat homogen.
4. Ambil 6 ml hasil saringan dan masukkan kedalam gelas kimia 30 mL yang
bersih. Kemudian teteskan sedikit demi sedikit etanol pekat sebanyak 9 mL
dengan pipet tetes secara perlahan dan tanpa digoyang-goyang. Tunggu
beberapa menit untuk melihat proses pengendapan DNA. Hasil preparasi
dapat diamati dengan terlihatnya benang-benang halus berwarna putih yang
mengambang dalam larutan tersebut.
5. Benang-benang halus DNA dapat diambil dengan menggunakan batang
pengaduk atau alat lainnya dengan cara melilitkan secara perlahan.
Catatan: Etanol dingin bersuhu -20°C atau dalam freezer

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 38
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN VI

DNA

III.2.ANALISIS SAMPEL DNA

1. Buat spektrum serapan dari 1 mL larutan DNA pada range 230-300 nm.
2. Catat puncak serapan dan tentukan λ maksimum (λ maksimum DNA 258 nm
dan A maksimum protein 280 nm).
3. Tentukan kemurnian DNA dalam sampel dengan memggunakan perbandingan
260 nm/280 nm).

III.3.ELEKTROFORESIS

1. Kemurnian DNA berasal dari asam nukleat yang diekstrak, dimana dapat
dilihat dari jumlah dan tipe/jenis pola pita-pita yang terbentuk.
2. Gunakan 0,1 mL sampel DNA untuk dianalisis dengan elektroforesis.
3. Ke dalam tabung Eppendorf tambahkan 10 µL sampel dan 10 µL buffer,
campur dengan menggunakan Vortex.
4. Isi salah satu sumur pada gel dengan DNA, lalu aliri arus 75 Volt dan buffer
TAE selama 1-15 menit atau sampai zat warna hampir mencapai ujung gel.
5. Gel difotografi dengan alat dokumentasi gel.

III.4.ANALISIS RESTRIKSI PLASMID DNA


Bakteri menghasilkan enzim yang dapat mendegradasi DNA. Salah satunya
adalah enzim retriksi endonuklease tipe II. Enzim ini mengkatalisa hidrolisa ikatan
fosfodiester pada DNA untai ganda. Enzim retriksi mengenal urutan nukleotida
yang spesifik pada DNA untai ganda. Enzim ini berfungsi untuk mendegradasi
molekul DNA asing artinya enzim ini berguna untuk pertahanan sel bakteri. DNA
sel bakteri sendiri mengalami modofikasi agar tidak dikenali oleh enzim retriksi
sehingga tidak akan dipotong oleh enzimnya sendiri. Salah satu contoh enzim
retriksi adalah EcoRI (nama enzim merupakan singkatan dari bakteri sumbernya
yaitu Escherichia coli strain R, sedangkan I merupakan enzim retriksi yang
pertama kali ditemukan di E. coli). Tempat pemotongan EcoRI merupakan
heksanukleotida dengan urutan yang spesifik (5’GAATTC3’). Dua ikatan
fosfodiester dihidrolissi oleh enzim sehingga menghasilkan dua fragmen.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 39
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN VI

DNA

5’ G G A T C C 3’ EcoRI 5’ G G A T C C 3’
+
H2O
3’ C C T A G G 5’ 3’ C C T A G G 5’

Sebanyak kurang lebih 200 enzim retriksi telah diisolasi dan dikarakterisasi.
Enzim ini digunakan dalam rekjayasa genetic untuk memotong DNA. Enzim ini
sering digunakan untuk memotong plasmid sehingga dapat digabungkan dengan
fragmen DNA asing untuk menghasilkan DNA rekombinan. Enzim retriksi juga
digunakan untuk analisa DNA dan kontruksi peta retriksi dari suatu plasmid.
Tujuan percobaan ini adalah membuat analisa retriksi plasmid DNA setelah
dipotong dengan beberapa enzim retriksi. DNA adalah suatu molekul bermuatan
negatif. Pemotongan plasmid DNA dengan enzim retriksi akan menghasilkan
fragmen DNA linier. Fragmen DNA akan bermigrasi dalam medium pendukung
agarosa dalam suatu medan listrik dengan kecepatan berbanding terbalik dengan
ukurannya. Fragmen DNA atau DNA hasil elektroforesis divisualisasikan dengan
merendam gel hasil elektroforesis dalam larutan etidium bromida. Fragmen DNA
yang mengikat etidium bromida akan mengalami fluoresensi jika diberi sinar UV.
Untuk menentukan ukuran fragmen DNA hasil pemisahan, digunakan DNA
standar yang telah dipotong dengan enzim retriksi tertentu dan PDI1 dengan
berbagai enzim retriksi, menganalisa fragmen DNA yang dihasilkan dengan
elektroforesis gel agarosa dan membuat peta retriksi plasmid pRS.314-PDI.
Reagen dan Alat:
Enzim retriksi dan buffernya Alat elektroforesis
TAE buffer (Tris-asetat 0,04 M, EDTA 0,002 M, pH Power supply
7,8)
Gel-loading buffer (Tris-asetat 0,04 M mengandung Lampu UV
50% gliserol dan 0,25 % bromphenol blue, pH 8,0)
Gel agarosa 1% dalam TAE Inkubator 37ºC

PERHATIAN:
Ethidium bromide adalah senyawa mutagenik dan karsinogenik. Gunakan sarung
tangan dan jas lab selama bekerja. Gunakan kacamata pelindung atau letakkan

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 40
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN VI

DNA

gel agarosa di bawah shield khusus ketika melihat DNA, jangan menyantuh alat
elektroforesis yang sedang ada voltase.

Prosedur:
1. Pemotongsn DNA dengan Enzim Retriksi
a. Masukkan ke dalam tabung Eppendorf komponen-komponen berikut: 15µl
H2O, 2 µl larutan DNA, 2 µl buffer dan 1 µl enzim retriksi.
b. Inkubasi campuran reaksi pada 37 ºC selama 1 jam.

2. Elektroforesis Gel Agarosa


a. Tambahkan ke dalam campuran reaksi di atas (campuran A1) gel loading
buffer.
b. Tambahkan buffer elektroforesis ke dalam tank.
c. Masukkan 10 µl campuran di atas (campuran B1) ke dalam sumur gel
agarosa dan pasang penutup.
d. Hubungkan kabel ke power supply dan lakukan elektroforesis pada 50 – 70
Volt.
e. Matikan power supply ketika tracking dye sampai pada ujung bawah gel.
f. Angkat gel dan masukkan ke dalam larutan ethidium bromida.
g. Periksa DNA di bawah lampu UV.

Tugas Praktikum:
1. Buat kurva kalibrasi untuk fragmen DNA standar.
2. Tentukan ukuran fragmen DNA plasmid Prs.314-PDI1 yang telah dipotong
dengan enzim retriksi dan buat peta plasmidnya.

IV. TUGAS PENDAHULUAN

1. Jelaskan apa yang anda ketahui dengan plasmid ?


2. Tuliskan urutan nukleotida dari enzim retriksi EcoRV dan BamIII ?
3. Jelaskan prinsip gel elektroforesis agarosa ?
4. Jelaskan mengapa ethidium bromide dapat digunakan untuk
memvisualisasikan fragmen DNA?
LABORATORIUM JURUSAN KIMIA
FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 41
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007
PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I PERCOBAAN VI

DNA

V. PUSTAKA

Mathews, C. K. and Holde, K. E. 1990. Biochemistry. The Benjamin/Cumming


Publising Co., Redwood City, USA.

Sumber: Training Life Science Education ITB, Agustus 2003.

Petunjuk Praktikum Biokimia Dasar Institut Teknologi Bandung 2005.

Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Indonesia 2005.

Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Negeri Jakarta 2005.

LABORATORIUM JURUSAN KIMIA


FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA Halaman 42
REVISI/IRMA/SEPTEMBER/2007