La PCR (abreviatura de Polymerase Chain Reaction) es una herramienta relativamente

sencilla y barata que puede utilizar para centrarse en un segmento de ADN y copiarlo
miles de millones de veces. La PCR se utiliza todos los días para diagnosticar
enfermedades, identificar bacterias y virus, hacer coincidir criminales con escenas de
delitos y de muchas otras maneras. ¡Suba al laboratorio virtual y vea cómo funciona!

¿Qué están haciendo estas cosas en mi reacción de PCR?

Los cebadores son piezas cortas de ADN que se hacen en un laboratorio. Dado que se
construyen a medida, los cebadores pueden tener cualquier secuencia de nucleótidos que
desee.

En un experimento de PCR, dos cebadores están diseñados para coincidir con el segmento
de ADN que desea copiar. A través de un emparejamiento de bases complementario, un
cebador se une a la hebra superior en un extremo de su segmento de interés y el otro
cebador se une a la hebra inferior en el otro extremo. En la mayoría de los casos, dos
cebadores de 20 o más nucleótidos tendrán como objetivo sólo un lugar en todo el
genoma.

Los cebadores también son necesarios porque la polimerasa de ADN no se puede fijar en
cualquier lugar viejo y comenzar a copiar. Sólo se puede añadir a una pieza de ADN
existente.

DNA Polimerasa es un complejo de proteínas que ocurre naturalmente cuya función es

copiar el ADN de una célula antes de que se divida en dos. Cuando una molécula de
polimerasa de ADN choca con un cebador que está emparejado en la base con una pieza
más larga de ADN, se adhiere cerca del final del cebador y comienza a añadir nucleótidos.
(En la naturaleza, estos cebadores están hechos por una enzima llamada primase).

La ADN polimerasa en nuestros cuerpos se descompone a temperaturas muy por debajo

de 95 ° C (203 ° F), la temperatura necesaria para separar dos cadenas complementarias
de ADN en un tubo de ensayo. La polimerasa de ADN que se usa más a menudo en la PCR
proviene de una cepa de bacterias llamadas Thermus aquaticus que viven en las aguas
termales del Parque Nacional de Yellowstone. Puede sobrevivir cerca de temperaturas de
ebullición y funciona bastante bien a 72 ° C (162 ° F).

Los nucleótidos son los componentes básicos de las moléculas de ADN. Se agrega una
mezcla de cuatro tipos de nucleótidos a su reacción de PCR A, C, G y T. ADN polimerasa
toma los nucleótidos que están flotando en el líquido alrededor de él y los une al final de
un cebador.
El objetivo de crear la base de datos de microbiomas orales humanos (HOMD) es
proporcionar a la comunidad científica información completa sobre las aproximadamente
700 especies de procariontes que están presentes en la cavidad oral humana.
Aproximadamente el 54% se nombran oficialmente, el 14% sin nombre (pero cultivado) y
el 32% se conocen solamente como phylotypes incultos. La HOMD presenta un esquema
de nomenclatura provisional para la especie actualmente sin nombre, de modo que los
datos de las cepas, clones y sondeos de cualquier laboratorio pueden estar directamente
vinculados a un esquema de referencia establecido de forma estable. El HOMD enlaza
datos de secuencia con información fenotípica, filogenética, clínica y bibliográfica. Las
secuencias del genoma para las bacterias orales determinadas como parte de este
proyecto, el proyecto del microbioma humano, y otros proyectos de la secuencia se están
agregando al HOMD como están disponibles. Genomas para 400 taxones orales (58% de
taxones en HOMD) están disponibles actualmente en HOMD. El sitio de HOMD ofrece
herramientas fáciles de usar para ver todos los genomas bacterianos orales públicamente
disponibles. ¡Bienvenido!

Introducción bacteriana virtual Introducción

Bienvenidos al Laboratorio Virtual de Identificación de Bacterias. El propósito del
laboratorio es familiarizarse con la ciencia y las técnicas utilizadas para identificar
diferentes tipos de bacterias basadas en su secuencia de ADN. No hace mucho tiempo, la
secuenciación del ADN fue un proceso largo y tedioso. Con equipos y kits comerciales
fácilmente disponibles, ahora es rutinario. Las técnicas utilizadas en este laboratorio son
aplicables en una amplia variedad de entornos, incluyendo la investigación científica y
laboratorios forenses.

Pasos básicos
Preparar una muestra de un paciente y aislar el ADN bacteriano completo.
Hacer muchas copias de la pieza deseada de ADN.
Secuencia del ADN.
Analizar la secuencia e identificar las bacterias.
El fragmento de ADN utilizado para identificar bacterias es la región que codifica una
pequeña subunidad del ARN ribosómico (16S rRNA). Nos referiremos a esta pieza como
16S rDNA. Diferentes especies bacterianas tienen secuencias únicas de 16S rDNA. La
identificación se basa en hacer coincidir la secuencia de su muestra con una base de datos
de todas las secuencias de 16S rDNA conocidas. (Más información sobre el ARN
ribosomal.)

Objetivos de aprendizaje
¿Qué tipo de muestras de pacientes se utilizan con el propósito de identificar posibles
patógenos?
¿Qué hace la PCR, cómo funciona y por qué es útil?
¿Cómo se separa el ADN deseado de todos los demás?
¿Cómo funciona un secuenciador automático de ADN?
¿Por qué es posible utilizar una secuencia de ADN para identificar bacterias?
A lo largo de cada ejercicio, esta ventana mostrará información que explica lo que está
haciendo. Todas las interacciones, sin embargo, se harán dentro de la ventana gráfica a la
izquierda. El pequeño cuadro blanco debajo del gráfico le dará instrucciones específicas
sobre qué objetos hacer clic en.

Parte 1 - Preparación de la muestra

La clave para una identificación exitosa es comenzar con una "buena" muestra. Muchas
bacterias patógenas no crecen bien en medio de cultivo sólido, lo que dificulta la
identificación por medios tradicionales. (¿Por qué?) Incluso los cultivos bacterianos de
escaso crecimiento, sin embargo, pueden identificarse con los métodos utilizados en este
laboratorio.

En este laboratorio, usted actuará como un patólogo o tal vez un técnico de laboratorio de
patología en un hospital de investigación bien equipado. Su tarea es identificar una
muestra bacteriana recibida de un médico.
Suponiendo que usted ha logrado desarrollar colonias bacterianas en un plato de cultivo
de medio sólido, el primer paso es recoger una sola colonia y dejarla caer en un tubo de
microcentrífuga.

El proceso de extracción de ADN bacteriano consiste en disolver la pared celular con un

tampón digestivo (en la botella con tapa blanca) disponible como un kit comercial. El
tampón contiene enzimas proteolíticas que "comen" la pared celular. Este paso puede
durar varias horas.

Ya que vamos a utilizar otras enzimas en el siguiente paso, tenemos que deshacerse de las
enzimas proteolíticas antes de que podamos proceder. Las enzimas se desnaturalizan
calentando la muestra en un baño de agua a 100 ° C. A continuación, los desechos
celulares se centrifugan en la centrífuga y aparecen como un depósito sólido (gránulo) en
la parte inferior del tubo. El ADN está contenido en el sobrenadante (el líquido), que se
transfiere entonces al tubo PCR.

Parte 2 - Amplificación de la PCR

Haga clic aquí para aprender ¿Qué es la PCR?

Paso 1: Agregar mezcla principal

Para preparar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), agregaremos la solución PCR

Master Mix a nuestro ADN de muestra. La solución PCR Master Mix (en la botella de tapa
roja) contiene lo siguiente: agua; un tampón para mantener la mezcla al pH correcto para
la reacción de PCR; grandes cantidades de los cuatro nucleótidos adenina, citosina,
guanina y timina; grandes cantidades de cebadores de ADN de oligonucleótidos que se
unen a la región 16S rDNA para iniciar el proceso de replicación (¿Qué son cebadores?); y
una ADN polimerasa termoestable que extiende la cadena de ADN de copia.

Al mismo tiempo que la reacción del ensayo, prepararemos reacciones de control

negativo y positivo. En lugar de la muestra de ADN, la reacción de control positivo
contiene ADN de control positivo (la solución de 16S rDNA en la botella con tapa verde),
mientras que la reacción de control negativo contiene agua estéril desionizada. Ambas
reacciones contienen la solución PCR Master Mix.

Paso 2: Ejecutar PCR

Una vez que los tubos de reacción se cargan en el termociclador (la "máquina de PCR"),
comienza el proceso automático de replicación del ADN (refiérase a la animación). La
máquina utilizada en este laboratorio tiene lecturas que describen lo que está sucediendo:

(de izquierda a derecha: temperatura, tiempo restante, número de ciclo, fundido,

recocido y extensión)
El control de temperatura se configura de la siguiente manera:
Etapa de incubación inicial: 95 ° C durante 10 minutos
30 ciclos de la siguiente secuencia de pasos:
Derretimiento: 95 ° C 30 segundos
Recoximación: 60 ° C 30 segundos
Extender: 72 ° C 45 segundos
Paso de extensión final: 72 ° C 10 minutos
Paso final: 4 ° C almacenar a esta temperatura
Durante cada ciclo, el primer paso (fundido) es separar las dos cadenas de ADN en la doble
hélice calentando el vial que contiene la mezcla de reacción de PCR a 95ºC durante 30
segundos. Los cebadores no pueden unirse a las hebras de ADN a una temperatura tan
alta, de modo que el vial se enfría a 60ºC. A esta temperatura, los cebadores se unen
(recoplan) al ADN monocatenario. (La razón por la cual las dos hebras separadas de ADN
no se reanudan es que hay un gran exceso de cebadores en la solución, por lo tanto, es
más probable que las hebras de ADN se unan a los cebadores en lugar de entre sí).
Extender) es permitir que la ADN polimerasa extienda la cadena de ADN de copia
elevando la temperatura a 70ºC durante 45 segundos.

Los tres pasos -la separación de las hebras, el recocido de la imprimación a la plantilla y la
síntesis de nuevas hebras- toman menos de dos minutos. Cada uno se lleva a cabo en el
mismo frasco. Al final de un ciclo, cada pedazo de ADN en el vial se ha duplicado. El ciclo
puede repetirse 30 o más veces, y cada pieza de ADN recién sintetizada actúa como una
nueva plantilla. Después de 30 ciclos, pueden producirse 1 millón de copias de la pieza de
ADN inicial.

Parte 3 - Purificar el producto de PCR

El tubo ahora debe contener muchas copias de 16s rDNA, cada uno cerca de 1.500 pares
de bases (pb) de largo. En este momento, es prudente ejecutar un gel para confirmar que
la reacción de PCR funcionó. El gel debe contener tres carriles: uno para el control
negativo (es decir, agua), que no debe tener un producto a menos que el agua esté
contaminada; otro para el control positivo (producto de PCR de una secuencia de ADN
conocida) para asegurarse de que la PCR misma funcionó; y el último carril para su
muestra.

Si está seguro de que la PCR funcionó, puede proceder a la purificación del producto de
PCR. Ejecutar un gel es en realidad un método de purificación. Una vez que el producto de
PCR está en el gel, puede cortar la banda correspondiente al producto de PCR y aislar el
ADN del gel. Hoy en día, usted puede comprar microfiltros compactos para filtrar el ADN
del tubo de PCR sin ejecutar un gel. Utilizaremos tales columnas de microconcentrador en
nuestro procedimiento:
Inserte la columna del microconcentrador de tamaño apropiado en un tubo de recogida.
Añadir 400 μl de tampón a la columna.
Añadir el contenido completo de PCR (~ 100 μL) a la columna.
Hacer girar la columna a 3.000 rpm en una centrífuga de ángulo fijo durante 15 minutos.
El producto de PCR debe quedar atrapado en la columna mientras que el tubo de recogida
debe contener todos los cebadores, nucleótidos y otros compuestos pequeños que ya no
necesitamos. Retire el tubo de recogida y deséchelo.
Invertir la columna y adjuntarla a un nuevo tubo de recogida.
Añadir 50 μl de tampón a la columna invertida. Este paso debe aflojar el ADN de la
columna en el tubo de recogida.
Girar la columna invertida a 3.000 rpm durante 2 minutos para recoger la muestra en el
tubo de recogida. Deseche la columna.
El tubo de recolección final debería tener ahora muchas piezas de ADNr 16S de 1.500 pb
de largo, con una cantidad muy pequeña de cadenas de ADN más largas (que son
contaminantes).

Parte 4 - Preparación para la secuenciación

La muestra de ADN ha sido purificada; su tubo de PCR ahora debe contener casi nada,
pero las copias del 16S rDNA. Ahora, podemos preparar la muestra para la secuenciación
automática. La tecnología de secuenciación de ADN es otra área de la biología molecular
que ha visto una impresionante cantidad de refinamiento. El método predominante,
ilustrado aquí, se llama secuenciación de ciclo de PCR. (Obtenga más información sobre la
secuencia del ciclo antes de continuar.)

En este laboratorio, utilizamos un conjunto de 12 cebadores; seis por cada hebra del ADN
bicatenario. Es teóricamente posible utilizar un solo cebador en la secuencia del ciclo de
PCR, pero no es factible para secuencias largas. Con múltiples cebadores, secuencias
cortas y superpuestas de ADN se secuencian para obtener la secuencia completa. Además,
no es absolutamente necesario secuenciar ambas cadenas, aunque la secuenciación de
ambas cadenas genera datos redundantes, reduciendo así el error. El número exacto y la
ubicación de los cebadores utilizados en una reacción dependen de la disponibilidad de
cebadores adecuados. Los cebadores utilizados aquí están disponibles a partir de una
fuente comercial y se unen a regiones conservadas del gen 16S rDNA. Deberían ser
capaces de unirse a la secuencia independientemente de la fuente bacteriana.

Cada tubo verde y azul contiene una "preparación en secuencia" consistente en

tampones, cebadores (uno diferente en cada tubo), ADN polimerasas, nucleótidos y
terminadores marcados con fluorescencia en proporciones adecuadas. El producto de PCR
del paso anterior se añade a cada tubo y se lleva a cabo otra PCR. Esta vez el objetivo no
es producir copias idénticas de ADN sino muchas copias de longitud variable. La animación
ilustra lo que está sucediendo en un tubo que contiene el cebador 651R. Cada cadena de
ADN se une al cebador en un extremo y tendrá un terminador marcado con fluorescencia
en el otro extremo.

Parte 5 - Secuenciación de ADN

Desde el último paso, usted tiene 12 tubos que contienen el producto de PCR final, una
mezcla de piezas de ADN de longitud variable. Todas las piezas de ADN de cada tubo
comienzan con el mismo cebador pero terminan con un nucleótido diferente marcado con
un marcador fluorescente (color diferente para cada uno de los nucleótidos A, T, G, C). Lo
que queda por hacer es separar las piezas individuales de ADN e identificar el nucleótido
final.

Esto se hace usando un secuenciador automático que realiza electroforesis en gel en el

ADN de cada tubo. La electroforesis en gel es un método para separar moléculas basadas
en diferencias de tamaño. El secuenciador utilizado en este laboratorio tiene un tubo
capilar delgado conectado en un extremo a un mecanismo de jeringa que contiene una
solución tampón. El tubo se llena con la solución tampón y el otro extremo se inserta en
uno de los tubos que contienen las piezas de ADN. A continuación, se aplica una corriente
eléctrica de manera que el extremo del tubo en contacto con el ADN tiene una carga
negativa y la jeringa termina una carga positiva. Dado que las moléculas de ADN están
cargadas negativamente, comienzan a moverse a través del tubo hacia el extremo de la
jeringa con carga positiva, con las piezas más pequeñas moviéndose más rápido que las
más grandes. Cerca del extremo de la jeringuilla, el tubo capilar pasa a través de un rayo
láser que excita los marcadores fluorescentes, y los detectores ópticos detectan el color
de la fluorescencia.

Podemos asumir que un conjunto completo de piezas de ADN, todas diferentes en tamaño
por exactamente un nucleótido, se generaron en el paso anterior. La pieza más pequeña
de ADN que tiene una etiqueta fluorescente unida a ella es la imprimación. Este
fragmento de ADN viajará más rápido que los otros. Mediante la lectura del color (en
nuestro ejemplo, rojo), determinamos que el primer nucleótido más allá de la secuencia
del cebador es timidina (T). La siguiente pieza más pequeña de ADN fluorescera con el
color (verde) que representa el siguiente nucleótido en la secuencia (A) y así
sucesivamente (véase la animación). Mediante la lectura de la secuencia de nucleótidos
basada en su fluorescencia a medida que las piezas de ADN pasan a través del haz de
láser, se puede reconstruir la secuencia del ADN.

El secuenciador borra automáticamente el buffer del tubo, mueve la bandeja, y ejecuta la

electroforesis de nuevo, repitiendo el programa hasta que todos los 12 tubos han sido
examinados. Los conjuntos de secuencias resultantes se recopilan mediante un programa
informático para construir la secuencia completa del gen 16S rRNA.

Parte 6 - Análisis de Secuencia de ADN

Muestra A - Líquido del ganglio linfático

(Vea la sección Muestras para más información)
Después de que se haya recogido la información de secuencia de todos los tubos de
reacción, el ordenador construye la secuencia real haciendo coincidir diferentes piezas.
Ahora tiene la secuencia 16S rDNA para esta especie bacteriana, que se puede comparar
con todas las otras secuencias conocidas 16S rDNA para su identificación.

Aprender acerca de la ciencia detrás de la secuencia de coincidencia.

Hay muchas bases de datos de secuencias en existencia. Algunas bases de datos se venden
comercialmente como parte de un kit de identificación. En este ejemplo, usaremos la base
de datos pública de GenBank disponible a través de la Biblioteca Nacional de Medicina. El
algoritmo de coincidencia es conocido como BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).
Una coincidencia directa de la secuencia de ADN determina la especie bacteriana exacta
que ha encontrado. Cuando la secuencia de ADN no es una coincidencia exacta, sino una
coincidencia cercana a otra encontrada en la base de datos de secuencias, es necesario
evaluar si se trata de una nueva especie o una variación de una existente.

Obtenga más información sobre los resultados de búsqueda de BLAST.

Ahora siga estos pasos para identificar su muestra:

Paso 1: Haga clic aquí para ver la salida de datos del secuenciador. Seleccione todos los
datos de la ventana y copie (ctrl-c en el PC o cmd-c en el Mac).

Paso 2: Haga clic aquí para ir al sitio de NCBI para realizar su búsqueda. (Esto abrirá una
nueva ventana)

Paso 3: En la página BLAST del sitio NCBI, pegue los datos (ctrl-v en el PC o cmd-v en el
Mac) en la casilla "Ingrese número de registro, gi o secuencia FASTA" en la sección
"Ingresar secuencia de consulta "cerca de la parte superior de la página. En la sección
"Elegir conjunto de búsqueda", base de datos: "Otros (nr, etc.)" y "Recolección de
nucleótidos (nr / nt)" ya deben estar seleccionados. Cuando esté listo, haga clic en el
botón azul "BLAST". (actualizado el 21 de octubre de 2007)

Paso 4: Siga las instrucciones proporcionadas por el sitio NCBI para obtener sus
resultados.

Paso 5: Vuelva a esta página (que debe permanecer abierta) e identifique las bacterias en
la ventana del laboratorio a la izquierda.
DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD BASADO EN LA RESPUESTA INMUNITARIA: UN
EJERCICIO LABORATORIO VIRTUAL

Los componentes del sistema inmune llamados anticuerpos se encuentran en la porción

líquida de la sangre y ayudan a proteger el cuerpo de los daños. Los anticuerpos se
pueden utilizar también fuera del cuerpo en un ensayo basado en laboratorio para ayudar
a diagnosticar la enfermedad causada por malfuncionamientos del sistema inmune o por
infecciones.

Este laboratorio virtual demostrará cómo se lleva a cabo tal prueba, denominada ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), y algunos de los principales problemas
experimentales que se pueden encontrar. Los estudiantes aprenderán sobre el
procedimiento de ensayo y los equipos y materiales que se necesitan. Al completar este
ejercicio, los estudiantes obtendrán una mejor comprensión del diseño experimental, los
conceptos clave en las reacciones inmunológicas, y la interpretación de los datos.
Conceptos cubiertos

La base de la inmunidad humoral

La base para ELISA
Posibles errores en la realización de un ELISA
Sensibilidad y especificidad de una prueba diagnóstica
Problemas experimentales potenciales

ELISA se utiliza en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está

presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y
directo, implica una serie de variables, como la selección de reactivos, la temperatura, la
medición del volumen y el tiempo, que si no se ajusta correctamente puede afectar a los
pasos posteriores y al resultado de la prueba. Este laboratorio virtual se ha desarrollado
para que cuando se cometa un error, no obtenga la respuesta correcta. El programa
realiza un seguimiento de los errores cometidos durante el experimento y genera un
informe al final.
Limitaciones de la Prueba

Esta prueba general tiene algunas limitaciones importantes.

En primer lugar, un resultado positivo que confirma correctamente la presencia de

anticuerpo no significa necesariamente que el paciente está enfermo. El cuerpo puede
continuar produciendo anticuerpos, aunque la persona puede haber tenido la enfermedad
antes y recuperado.

En segundo lugar, las personas pueden ser productores pobres de anticuerpos o pueden
tener alguna sustancia interferente en su sangre. La cantidad de anticuerpo, en
consecuencia, puede ser demasiado baja para medir con precisión o puede pasar
desapercibida. Este resultado se llama un falso negativo.
En tercer lugar, puede producirse un resultado positivo si un anticuerpo no relacionado
reacciona con el antígeno de forma no específica. A diferencia de un resultado
verdaderamente positivo donde se detecta el anticuerpo específico, sin embargo, esta
reacción positiva es falsa. La prueba de muchos pacientes y la ejecución de pruebas más
de una vez ayuda a los trabajadores de laboratorio a distinguir un resultado real de un
falso. Para evitar errores experimentales simples que conducen a resultados incorrectos,
los científicos realizan pruebas utilizando muestras duplicadas (o, a veces, más de dos).

Etapa 2 (Paciente A)

Usando el suero del paciente A, prepare tres diluciones como sigue:

Tomar 1 ml de suero del paciente A y añadir 1 ml de solución salina tamponada con

fosfato (PBS). Esta es una dilución 1: 2.

Tomar 1 ml de suero del paciente A y agregar 9 ml de PBS. Esta es una dilución 1:10.

Tomar 0,1 ml de suero del paciente A y añadir 9,9 ml de PBS. Esta es una dilución 1: 100.
Paso 3

Preparar una placa ELISA con 0,1 ml de las diferentes diluciones del suero del paciente
utilizando una pipeta Eppendorf®.

* Nota: La placa ELISA ha sido pretratada para unir el antígeno SLE a cada pocillo
.
Etapa 4

Añadir a la placa ELISA diluciones de 0,1 ml para cada título de anticuerpo primario anti-
ADN (control positivo) y un tampón (control negativo).

Step 5

Incubate the ELISA plate at 37° C for 15 minutes.

Paso 6

Retire el líquido de cada pocillo con la pipeta y lave con 0,1 ml de PBS.

A menudo, en un laboratorio real, estos lavados se repiten 3-6 veces antes de agregar la
siguiente sustancia. Con el fin de acelerar este ejemplo a lo largo, hemos dado sólo un
ejemplo de enjuague / lavado por paso.

Paso 7
Añadir 0,1 ml de solución tamponada que contiene un anticuerpo secundario que
reconoce anticuerpos hechos en seres humanos. Tenga en cuenta que este anticuerpo
secundario se hace en un conejo y tiene una enzima unida (HRP) que interactuará con el
sustrato en el siguiente paso.

Paso 8

Incubar la placa ELISA a 37 ° C durante 15 minutos.

Paso 9

Retire el líquido de cada pocillo con la pipeta y lave con 0,1 ml de PBS.

Paso 10

Añadir 0,1 ml de solución tamponada que contiene el sustrato químico (sustrato HRP). Si
hay anticuerpos humanos presentes, el sustrato transparente se volverá amarillo.

Paso 11

Ajuste el temporizador durante 15 minutos.