UJI BATAS MIKROBA

I. Tujuan
Mahasiswa dapat melakukan uji batas mikroba suatu produk
II. Dasar Teori
Uji Batas Mikroba dilakukan untuk memperkirakan jumlah mikroba aerob viabel di
dalam semua jenis perbekalan farmasi, mulai dari bahan baku hingga sediaan jadi, untuk
mengyatakan perbekalan farmasi tersebut bebas dari spesies mikroba tertentu. Otomatisasi
dapat digunakan sebagai pengganti uji yang akan disajikan, dengan ketentuan bahwa cara
tersebut sudah divalidasi sedemikian rupa hingga menunjukkan hasil yang sama atau lebih
baik. Selama menyiapkan dan melaksanakan pengujian, specimen harus ditangani secara
aseptik. Jika tidak dinyatakan lain, jika disebut ”inkubasi”, maka yang dimaksud adalah
menempatkan wadah di dalam ruangan terkendali secara termostatik pada suhu 30° dan 35°
selama 24 jam sampai 48 jam. Istilah “tumbuh” ditunjukan untuk pengertian adanya dan
kemungkinan adanya perkembangan mikrona viabel.
Uji Pendahuluan
Validasi hasil yang akan disajikan disini dalam banyak hal berdasarkan pada ketentuan
yang menunjukkan bahwa spesimen uji tidak menghambat pertumbuhan mikroba yang
terdapat dalam spesimen itu sendiri. Jadi sebagai uji pendahuluan dilakukan inokulasi secara
terpisah enceran spesimen uji dengan biakan viabel yang terdiri dari Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, dan Salmonella.Pengujian dilakukan dengan
menambahkan 1 ml dari tidak kurang enceran biakan mikroba berumur 24 jam kepada
enceran pertama spesimen uji (dalam dapar fosfat pH 7,2, Media Fluid Soybean-Casein
Digest atau Media Fluid Lactose Medium dan uji sesuai prosedur. Jika tidak terdapat
pertumbuhan mikroba di media bersangkutan, maka pengujian tersebut dinyatakan tidak
berlaku dan diperlukan modifikasi prosedur dengan (1) meningkatkan volume pengencer
dengan tetap mempertahankan bahan uji, atau (2) menambahkan zat inaktivator dengan
jumlah secukupnya ke dalam pengencer, atau (3) suatu kombinasi modifikasi (1) dan (2)
sedemikian rupa hingga terdapat pertumbuhan inokulum.
Bahan berikut ini adalah contoh dan konsentrasi zat yang ditambahkan ke dalam media
untuk menetralkan zat penghambat yang terdapat di dalam contoh, yaitu lesitin kedele 0,5%
dan polisorbat 204,0%. Sebagai alternatif, ulangi pengujian menggunakan Media Fluid
Soybean-Casein Digest-Soy Lecithin-Polysorbate 20 untuk menunjukan netralisasi pengawet
atau bahan antimikroba lainnya di dalam contoh. Jika zat penghambat terdapat di dalam
sediaan dan dapat larut, dapat digunakan prosedur yang divalidasi dan sesuai seperti Prosedur
uji menggunakan penyaringan membrane yang tertera pada Uji Sterilitas.
Jika penambahan inaktivator dan peningkatan volume seperti disebut di atas masih
tidak dapat menunbuhkan mikroba viabel dan jika contoh tidak cocok tidak cocok diuji dengan
cara penyaringan membrane, maka dapat disimpulkan bahwa kegagalan isolasi mikroba
disebabkan oleh daya bakterisida dari sediaan. Informasi ini berguna untuk menunjukkan
bahwa contoh tidak dapat dikontaminasi oleh jenis mikroba yang digunakan. Pemantauan
perlu dilanjutkan untuk menetapkan besarnya daya hambat dan daya bakterisida dari bahan
tersebut.
 Larutan Dapar dan Media
Media biakan dapat dibuat seperti dibuat di bawah ini, atau media biakan dehidrat dapat
digunakan jika sudah direkonstitusi sesuai petunjuk produsen atau distributor memiliki bahan
yang sebanding dan/atau menghasilkan media yang sama dengan media yang menggunakan
formula seperti disebut di bawah ini.
Peda pembuatan media menggunakan formula yang disebut di bawah ini, larutkan
bahan padat yang dapat larut dalam air, jika perlu panaskan hingga larup sempurna, dan
tambahkan larutan asam klorida atau natrium hidroksida secukupnya hingga diperoleh media
dengan pH yang diinginkan, jika sudah siap digunakan. Tetapkan pH pada suhu 25° ± 2°.
Jika pada formula disebut agar, gunakan agar dengan kadar air tidak lebih dari 15% dan
jika disebut air, gunakan Air Murni.
Larutan Dapar Posfat pH 7,2
Larutan 34g kalium posfat monobasa P dalam lebih kurang 500 ml air dalam labu
terukur-1000 ml; tambahkan lebih kurang 175 ml natrium hidroksida 1 N hingga pH 7,2 ± 0,1.
Tambahkan air sampai tanda, dan campur. Masukkan dalam beberapa wadah dan sterilkan.
Simpan dalam lemari pendingin.
Sebelum digunakan, encerkan 1 bagian larutan dengan 800 bagian air, dan sterilkan.
Media
Jika tidak dinyatakan lain, media harus disterilkan dengan pemanasan dalam otoklaf
(seperti yang tertera pada Sterilitas uap air dalamSterilitas dan Jaminan Strerilitas Bahan
Konfendia. Waktu paparan tergantung pada volume yang disterilkan.
Media FCDSLP (Fluid Casein Digest-Soy Lecithin-Polysorbate 20 Medium)
Digesti pankreatik kasein P 20 g
Lesitin kedele 5 g
Polisorbat 20 P 40 ml
Air 960 ml
Larutkan Digesti pankreatik kasein P dan Lesitin kedele di dalam tangas air pada suhu 48°
sampai 50° selama lebih kurang 30 menit hingga larut. Tambahkan 40 ml Polisorbat 20
P, campur dan masukkan dalam wadah sesuai yang dikehendaki.
Media PCA (Plate Count Agar)

Yeast 2,5 g
Pancreatic digest of Casein 5 g
Glucose 1 g
Agar 15-20 g
Air Suling 1 L
Sebelum digunakan, sesaat sebelum dituang ke dalam cawan, terhadap media yang telah
meleleh dan didinginkan hingga 45° pH diatur hingga 3,5 ± 0,1 menggunakan larutan asam
ladrat P steril (1 dalam 10). Media dengan pH tidak boleh dipanaskan lagi
Prosedur
Spesimen yang akan diuji disiapkan sedemikian rupa sesuai dengan sifat fisiknya dan
tidak mengubah jumlah dan jenis mikroba yang semula ada hingga diperoleh larutan atau
suspensi dari semua atau sebagian spesimen dalam bentuk yang sesuai dengan prosedur uji
yang akan dilaksankan.

Untuk bahan padat yang tidak seluruhnya melarut, perkecil ukuran bahan hingga
merupakan serbuk cukup halus, suspensikan ke dalam pembawa tertentu, dan lakukan
pengujian seperti tertera pada Angka Mikroba Aerob Total, Uji Staphylococcuc
aureus dan Pseudomonas aeruginosa, Uji Salmonella sp dan Escherichia coli.
Untuk spesimen cair yang terdiri atas larutan, suspense dalam air atau suatu larutan
pembawa hidroalkoholik yang mengandung etanol kurang dari 30%, dan untuk bahan padat
yang mudah larut dan praktis larus sempurna di dalam 90 ml dapar posfat pH 7,2 atau media
tertentu, lakukan pengujian seperti tertera pada Angka Mikroba Aerob Total, Uji Staphylococcuc
aureus dan Pseudomonas aeruginosa, Uji Salmonella sp danEscherichia coli.
Untuk cairan tidak campur air/salep, krim dan malam dibuat suatu suspensi dengan
menggunakan emulgator steril yang sesuai dalam jumlah yang minimal (misalnya salah satu
polisorbat), gunakan blender mekanik dan jika perlu hangatkan hingga suhu tidak lebih dari
45° san lanjutkan pengujian seperti tertera pada Angka Mikroba Aerob Total, Uji
Staphylococcuc aureus dan Pseudomonas aeruginosa, Uji Salmonella sp danEscherichia coli.
Untuk spesimen cair dalam bentuk aerosol, dinginkan wadah dalam campuran alcohol
dan es kering selama lebih kurang 1 jam, buka tutup wadah dan biarkan hingga mencapai suhu
kamar, dan biarkan propelan terbebas, atau jika memungkinkan hangatkan wadah untuk
mendorong propelan keluar. Pindahkan sejumlah tertentu bahan uji yang diperlukan untuk
pengujian seperti yang tertera pada salah satu dari dua paragraph yang telah diutarakan
sebelumnya. Jika hasil pengujian menggunakan residu. Jika ahasil pengujian menggunakan
tidak dapat disimpulkan atau meragukan, ulangi pengujian dengan menggunakan 20 wadah
atau lebih.

Angka Mikroba Aerob Total

Untuk spesimen yang cukup melarut atau transulen hingga dapat diuji dengan metode
lempeng, gunakan cara tersebut; jika tidak gunakan Metode Tabung Ganda. Dengan
menggunakan salah satu dari kedua cara tersebut, mula-mula larutkan atau suspensikan 10.0 g
spesimen berbentuk padat, atau 10 ml spesimen berbentuk cair yang diukur saksama, di
dalam dapar posfatpH 7,2, Media FSCD atau Media FCDSLP hingga diperoleh 100 ml. Untuk
spesimen kentalyang pada pengenceran awal (1:10) tidak dapat dipipet, encerkan spesimen
hingga diperoleh suspensi (1:50) atau (1:100), dan seterusnya hingga dapat dipipet. Lakukan
pengujian untuk menetapkan tidak terdapatnya zat penghambat (zat antimikroba) seperti yang
 tertera pada Uji Pendahuluan, sebelum melakukan penetapan Angka Mikroba Aerob
Total.Masukkan spesimen ke dalam media tidak lebih dari 1 jam setelah membuat enceran
yang sesuai untuk inokulasi.

Terdapat dua metode yang dapat dilakukan untuk Uji Batas Mikroba, yaitu:

1. Metode Lempeng

Metode ini dilakukan dengan cara inokulasi sediaan uji (specimen) dengan berbagai
pengenceran pada media agar tertentu. Setelah inkubasi 48 samapai dengan 72 jam,
pertumbuhan mikroba pada berbagai pengenceran diamati dan dihitung jumlah koloni yang
tumbuh.

Jika perlu encerkan cairan lebih lanjut sedemikian rupa hingga 1 ml diharapkan dapat
menghasilkan 30 koloni sampai 300 koloni. Pipet 1 ml enceran akhir masing-masing ke dalam 2
cawan petri steril. Segera tambahkan ke dalam cawan 15 ml sampai 20 ml Media SCDA yang
sebelumnya telah dicairkan dan didinginkan hingga lebih kurang 45°. Tutup cawan petri,
campur contoh dan agar dengan cara memiringkan atau memutarnya, dan biarkan isi cawan
memadat pada suhu kamar. Balikkan cawan dan inkubasi selama 48 jam hingga 72 jam. Setelah
inkubasi, amati pertumbuhan di dalam lempeng, hitung jumlah koloni, dan dari kedua lempeng
nyatakan rata-rata jumlah mikroba tiap g atau ml spesimen. Jika tidak ditemukan koloni
mikroba di dalam cawan dengan enceran awal (1:10), nyatakan hasil pengujian sebagai:
“kurang dari 10 mikroba per g atau ml spesimen”.

2. Metode Tabung Ganda

Metode ini dilakukan dengan menggunakan beberapa tabung yang berisi media dan
diinokulasikan dengan sediaan uji (spesimen) konsentrasi tertentu. Setelah diinkubasikan,
amati adanya pertumbuhan mikroba pada setiap tabung. Jumlah mikroba yang tumbuh tiap g
atau ml spesimen dihitung dari nilai duga terdekat/MPN (Most Probable Number) berdasarkan
table MPN.

Ke dalam setiap tabung dari 14 tabung berukuran sama tambahkan mesing-masing 9,0
ml Media FSCD steril. Pisahkan 12 tabung dan bagi dalam 4 kelompok masing-masing terdiri
dari 3 tabung. Satu kelompok sebagai control dan 3 kelompok lain sebagai: kelompok 1 (“100”),
kelompok 2 (“10”), kelompok 3 (“1”), dan 2 tabung lainnya masing-masing dinyatakan sebagai
tabung A dan tabung B. Ke dalam masing-masing tabung kelompok 1 (“100”) dan tabung A
dimasukkan 1ml larutan atau suspensi spesimen dan campur. Dari tabung A dipipet 1 ml ke
tabung B, dan campur. Tabung A dan tabung B masing-masing akan berisi 100 mg (100 l) dan
10 mg (10 l) spesimen. Ke dalam masing-masing tabung kelompok 2 (“10”) tambahkan 1 ml dari
tabung A, ke dalam masing-masing tabung kelompok (“1”) tambahkan 1 ml dari tabung B. Buang
sisa isi dari tabung dan inkubasikan. Setelah diinkubasi, amati adanya pertumbuhan di dalam
tabung, ketuga tabung control akan tetap jernih, dan berdasarkan ada tidaknya pertumbuhan di
kelompok 1, kelompok 2 dan kelompok 3, dan menggunakan acuan pada table, nyatakan Nilai
Duga Terdekat (MPN) mikroba tiap g atau ml spesimen.
 Sediaan Uji yang Digunakan

Merk : Frestea Lemon

Netto : 500 ml

mposisi : Air, Gula, Sari Buah Lemon, Konsentrat Teh, Pengatur Keasaman Asam Sitrat, Perisa Lemon &
Cooling, Antioksidan Asam Askorbat.

Expired date : 21 Januari 2011

Kode Produksi : BD3C 03:42

Diproduksi Oleh : PT. Coca-Cola Bottling Indonesia

Bekasi 17520 – Indonesia

Interpretasi hasil

Bila dari seluruh [etri tidak satu pun ynag menunjukkan jumlah antara 30 sampai
dengan 300 koloni, maka dicatat angka sebenarnya dari tingkat pengenceran terendah dan
dihitung sebagai angka lempeng total perkiraan.

III. Alat dan Bahan

1. Alat
- Cawan Petri
- Tabung Reaksi
- Labu Elenmeyer 250 ml
- Pipet volum 10 ml
- Pipet volum 1 ml
- Labu ukur 100 ml
- Coloni Counter

2. Bahan
- Media PCA
- Garam Fisiologi
- Aquadest steril
- Sediaan Uji
IV. Cara Kerja
a. Siapkan 6 tabung reaksi steril, susun pada rak tabung. Masing-masing tabung secara berurutan
diberi tanda sebagai kode pengenceran dan tanggal
pemeriksaan
b. Siapkan pula 7 petri dish steril. Pada 6 petri dish diberi tanda di bagian belakangnya sesuai
dengan kode pengenceran da tanggal pemeriksaan seperti pada butir a. Satu petri dish lainnya
diberi tanda “kontrol”
c. Pada Tabung kedua sampai dengan ke enam, diisi dengan 9 ml air garam phisiologis atau
aquadest atau larutan garam buffer phosphate, untuk pemeriksaan Bacillus aureus harus
menggunakan larutan garam buffer phosphate
d. Kocok bahan spesimen 10 ml dengan 90 ml air garam fisiologis, atau aquadest steril, atau
garam buffer phosphate pH 7,2 dalam labu elenmeyer. Ambil 10 ml masukkan pada tabung
kesatu
e. Pindahkan 1 ml bahan dari tabung kesatu ke dalam tabung kedua dengan pipet, cairan dibuat
sampai homogen
f. Pindahkan 1 ml bahan dari tabung kedua ke dalam tabung ketiga dengan pipet, cairan dibuat
sampai homogen
g. Demikian seterusnya hingga tabung keenam
h. Dari masing-masing tabung, dimulai dari tabung keenam dengan menggunakan pipet steril,
diambil 1 ml ke dalam masing-masing petri dish steril, sesuai dengan kode pengenceran yang
sama
i. Kemudian ke dalam masing-masing petri dish dituang media yang telah dipanaskan dalam
tangas air ± 45° C sebanyak 15 – 20 ml. Masing-masing petri digoyang perlahan-lahanhingga
tercampur merata dan biarkan hingga dingin membeku
j. Masukkan ke dalam inkubator 37° C selama 2 x 24 jam dalam keadaan terbalik
k. Kontrol dibuat dari cairan air garam phiologis atau aquadest atau larutan garam buffer
phosphate, dimasukkan ke dalam petri dish “kontrol” dan dituangi media cair tersebut di atas
sebanyak 15 – 20 ml
l. Pembacaan dilakukan setelah 2 x 24 jam dengan cara menghitung jumlah koloni yang tumbuh
pada setiap petri dish.
V. Hasil Pengamatan

Tabel Hasil Pengamatan Uji Batas Mikroba

Cawan Gambar Jumlah Koloni Keterangan
Petri
7 -

9 -

Gagal Daerah
penyebaran
terlalu besar

8 -

4 -
 7 -

Perhitungan :
Sesuai Interpretasi hasil, sampel yang digunakan adalah cawan petri dengan jumlah
mikroba 9 koloni, sehingga
=9x = 900 mikroba
VI. Kesimpulan
Uji batas mikroba dapat menentukan apakah suatu produk memenuhi standar
kandungan mikroba atau tidak.
Berdasarkan hasil pengamatan didapat kesimpulan bahwa the dengan merk frestea
mengandung mikroba rata-rata sebanyak 900 atau 9 x . Dan masih memenuhi standar
batas mikroba yang ditetapkan oleh BPOM, keterangan terlampir.

VII. Daftar Pustaka

Departemen Kesehatan RI, 1995. Farmakope Indonesia, Edisi IV. Jakarta
Obat, Bio Farmasi, NAPZA, Kosalkes dan Obat Tradisional, BPOM Metode Analisis PPOMN 2001,
Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional Badan POM, Interpretasi Hasil Halaman 50
Ketentuan Standar Praktikum Mikrobiologi AKFAR Muhammadiyah Cirebon

http://icarusphasmacist-wannabe.blogspot.co.id/2010/10/v-behaviorurldefaultvmlo.html