Cuantificación en CG y HPLC

• Los detectores dan una respuesta que es proporcional a la cantidad de sustancia (m):
Respuesta = a  m

• El coeficiente de proporcionalidad a es característico de cada sustancia pero no es

posible predecirlo en forma sencilla

Como el componente atraviesa

el detector en un período de
tiempo, la respuesta debe ser Área de la señal
evaluada en todo ese período

Si el coeficiente a es igual para varios

compuestos podemos determinar su A1/A2 = m1/m
/ 2
proporción relativa en una mezcla

1 2 3

Esto dependerá del tipo de detector y

la similitud entre los compuestos

En cromatografía gaseosa con detector de ionización de llama, las

diferencias de respuesta pueden ser muy grandes

mezcla de solventes conteniendo 1,5 mg/ml de cada uno

Chromatography Today, 2012, 52-56

Diferencias mucho mayores pueden darse en cromatografía líquida con

detector UV-visible donde algunos componentes pueden tener
respuesta nula y otros respuesta alta a una dada longitud de onda.

1
 El factor de respuesta ( f ) es la inversa del coeficiente a y
corresponde a la cantidad de sustancia por unidad de área

En el caso más general cada

componente tendrá un factor de
respuesta característico m1/m2 = f1A1/f2A2

1 2 3

Para conocer la relación entre los componentes debo

conocer los factores de respuesta individuales fi
Solvente f (CG-FID)

Los factores de respuesta los determino metanol 0,151

experimentalmente midiendo el área de la
señal producida por una cantidad conocida isopropanol 0,234
((Mi) de cada componente
p
acetato de 0,196
etilo
f1 = M1/A1 , etc.
cloroformo 0,039
1 2 3

tolueno 0,490
Esto requiere tener patrones de referencia
de pureza conocida de cada componente MTBE 0,303

acetonitrilo 0,212

Métodos de cuantificación

Método del estándar externo:

M1 = C1 x (Vol de inyección)
1) inyecto una masa conocida M1 del
componente a cuantificar (solución
de calibrado de concentración C1)

2) mido el área de la señal (A1) y

calculo el factor: f1 = M1/A1

3) inyecto la muestra problema y mido A’1

p
el área de la señal del componente a
cuantificar

4) usando el factor calculo la masa

del componente en la muestra m1 = f1A’1 C’1 = m1/(Vol de inyección)
inyectada y/o la concentración

Si el volumen de inyección es igual: C’1 = C1A’1/A1

2
 Ventajas
• Sencillo de implementar

Desventajas
• Requiere volúmenes de inyección precisos y reproducibles

• Requiere una gran estabilidad en el tiempo del sistema

cromatográfico (flujos, ancho de picos, etc.)

• Si se pasan varias muestras, debe inyectarse la solución de

calibración periodicamente (por ejemplo cada 3 o 5 muestras) para
verificar que el sistema está estable

• El método es susceptible a errores introducidos al hacer diluciones,

etc.

Si las muestras a analizar contienen cantidades muy dispares del

componente, debe verificarse el rango de linealidad de respuesta (curva de
calibración) y/o inyectar cantidad de estándar externo acorde a cada muestra

Método del estándar interno

1) Se agrega una cantidad igual del estándar (SI) a la
solución de calibrado y a las muestras de modo
de tener la misma concentración del estándar ASI A1

2) inyecto la solución de calibrado (concentración

conocida C1 del componente a cuantificar)

SI 1

3) mido el área de las señales del componente a

cuantificar (A1) y del SI y calculo el factor de F1 = C1ASI/CSIA1 (F1CSI) = C1ASI/A1
respuesta relativo:

A’SI A’1
4) inyecto la muestra problema (que contiene una
cantidad conocida de SI) y mido el área de la
señal del componente a cuantificar y del SI

SI 1

5) usando el factor F calculo la concentración

del componente en la muestra inyectada C’1 C’1 = F1CSIA’1/A’SI

3
 Ventajas
• Es independiente del volumen de inyección

• No requiere precisión en la preparación de la solución de SI ni conocer su

pureza, solo agregar la misma cantidad a muestras y solución de calibrado

• Es independiente de los errores por diluciones una vez agregado el SI

• E independiente
Es i d di t ded variaciones
i i en ell flujo
fl j o en las
l condiciones
di i de
d corrida
id

Desventajas
• Requiere disponer de una sustancia (el SI) que no se superponga con
ninguno de los componentes de la muestra y que sea eluida en las
mismas condiciones

• La preparación de muestras y soluciones de calibrado es más

laboriosa

Si las muestras a analizar contienen cantidades muy dispares del componente,

debe verificarse el rango de linealidad de respuesta (curva de calibración) y/o
utilizar soluciones calibradoras diferentes (de concentraciones similares a las
muestras)

Los métodos de estándar externo y estándar interno son de aplicación

general

Sin embargo debe tenerse cuidado con ciertos tipos de detectores que pueden tener
mucha variabilidad de respuesta incluso dentro de una misma corrida, y respuesta no
lineal, como por ejemplo los detectores selectivos de masa

En el caso de CG o HPLC acoplados a espectrómetros de masa, los cromatogramas

de corriente iónica total no son adecuados para cuantificar

La solución más conveniente es usar la misma sustancia como estándar interno

4
 En la práctica se usa como estándar interno la misma sustancia deuterada

Se agrega a la muestra una cantidad conocida de la TIC

sustancia a determinar (X) deuterada

El cromatograma de corriente iónica total muestra

todos los componentes y un único pico para XH y XD

AX M
El cromatograma de los iones de m/z = M solo
mostrará algunos componentes

X-H
X Hn

M+n
El cromatograma de los iones de m/z = M+n mostrará al ASI
componente X con n 1H reemplazados por 2H al mismo
tiempo de retención que puede usarse como SI
X-Dn

Como el componente a determinar y el SI son iguales y son detectados en el mismo momento

(al mismo tiempo de retención) la determinación no se afecta por la variabilidad del detector.

En RMN cada grupo de núcleos idénticos dará una señal de

complejidad variable pero inequivocamente asignable

• el área de cada señal es directamente proporcional a la magnetización de

l núcleos
los ú l que la
l producen
d

• en un espectro RMN las áreas relativas de las distintas señales dependen

solo del número de núcleos que les dan origen

• existe una relación sencilla y exacta entre las áreas relativas de distintas
señales en un mismo espectro

• las áreas relativas son independientes de la concentración y se

corresponden con la fracción molar de cada grupo de núcleos

5
Experimentos posibles
Cuantificación relativa de componentes
similar a un CG pero el factor de respuesta es conocido en forma exacta

nx: moles del componente x

Nx: Nº de núcleos de x que contribuyen a la señal Ix

La fracción molar de un componente en una mezcla puede determinarse en forma

directa, si se requiere %P/P se deben conocer las masas molares.
RMN es el método más usado para la determinación relativa de isómeros,
diasterómeros y enanteómeros (usando solventes o complejantes quirales), en ese
caso no hace falta conocer la masa molar

Cuantificación absoluta de componentes

La forma más simple es agregar un estándar (gravimetría) a una masa conocida de
cualquier mezcla: se obtienen resultados absolutos

RMN es un método primario de medición relativo

Un método primario de medición es un método con la más alta calidad metrológica
cuya operación puede ser descripta y entendida en forma completa, para el cual
puede escribirse un análisis completo de incertidumbre en términos de unidades SI
y cuyos resultados son aceptados sin referencia a un estándar de la cantidad que
se está midiendo

Determinación de grado de etoxilación de

lauril alcohol etoxilado

0,88 1,26 1,57 3,44

3,55-3,80

CH3((CH2)9CH2CH2O ((CH2CH2O))n -11-CH2CH2OH

AHC 23H AOX (4n+2)H

4n  2 A OX

23 AHC

A OX
n  5,75   0,5
A HC

6
 A OX
n  5,75   0,5
un patrón de referencia A HC

AOX (4n+2)H

n = 8,1

AHC 23H

0,88 1,26 1,57 3,44

3,55-3,80

CH 3(CH 2)9CH2CH2O (CH2CH2O)n -1-CH2CH2OH

A OX
n  5,75   0,5
una muestra desconocida A HC

AOX (4n+2)H

n = 8,9

AHC 23H

0,88 1,26 1,57 3,44

3,55-3,80

CH 3(CH 2)9CH2CH2O (CH2CH2O)n -1-CH2CH2OH

7
 6,624
H CN
C C
H CO2 CH2CH3

7,061

4,351 (c) 1,374 (t)

7.061

6.624

4.373
4.358
4.344
4.330

3.600

1.814

1.624

1.388
1.374
1.360

1.022

0.847
VP12185

Current Data Parameters

NAME U06-110801
EXPNO 1
PROCNO 1

F2 - Acquisition Parameters
Date_ 2006-08-17
Time 12.53
INSTRUM Avance 500
PROBHD 5 mm PABBI 1H/
PULPROG zg30
TD 65536
SOLVENT CDCl3
NS 32
DS 2
SWH 7500.000 Hz
FIDRES 0.114441 Hz
AQ 4.3691168 sec
RG 4
DW 66.667 usec
DE 6.00 usec
TE 296.5 K
D1 1.00000000 sec
TD0 1

======== CHANNEL f1 ========

NUC1 1H
P1 7.00 usec
PL1 0.00 dB
SFO1 500.1327507 MHz

F2 - Processing parameters
SI 32768
SF 500.1300063 MHz
WDW EM
SSB 0
LB 0.30 Hz
GB 0
PC 1.00
1.00

0.01
0.00
0.01
1.00

1.98

0.30

0.13

0.16

3.03

0.25
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm

espectro RMN 1H 500 MHz de adhesivo de base cianoacrilato (“la gotita”)

6,624 6,72
OH
H CN 5600 x AreaHQxMHQ
H ppm Hidroquinona =
C C 2x(AreaH1 + AreaH2)xMCN
H CO2 CH2CH3

7,061
OH
satélites de 13C
7.062

6.721

6.624

4,351 (c) 1,374 (t)

(0,56%)
determinación de
contenido de
hidroquinona en
adhesivo de base
cianoacrilato ((“la
la
gotita”)
1.000

0.005

0.006

0.004

0.992

7.45 7.40 7.35 7.30 7.25 7.20 7.15 7.10 7.05 7.00 6.95 6.90 6.85 6.80 6.75 6.70 6.65 6.60 6.55 ppm
4.374
4.359
4.345
4.331

3.601

1.815

1.620

1.389
1.375
1.361

1.022

0.848

4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm

8
 Muestra + SI diluida con D2O

En RMN también podemos usar el método

de estándar interno (similar al usado en CG
o HPLC)

En este ejemplo usamos RMN 13C

No es necesario separar los

componentes, ya que la información
en un espectro RMN permite
diferenciarlos e identificarlos
Solución de calibración
No debemos preocuparnos por
condiciones especiales de medición
porque, como en GC y HPLC, el factor
de respuesta se refiere al estándar
interno

Pero en RMN la cuantificación se hace respecto a los núcleos sin

importar en que molécula están, ya que su respuesta relativa (área)
es independiente de ésta

• La sustancia usada como referencia y nuestra muestra no

tienen porqué ser la misma
• No necesitamos p patrones de referencia de cada analito a
cuantificar
• No se requiere la separación previa de los componentes

¿Que condiciones debe cumplir la sustancia de referencia?

• contener al menos un núcleo igual al de la muestra (1H, 13C, 31P,
19F, 29Si, etc.)

• ser soluble en el mismo solvente q que la muestra

• no dar señales próximas a las de la muestra
• preferentemente dar una única señal (no imprescindible)
• obtenerse comercialmente con alto grado de pureza y título
confiable
• ser estable, no volátil y preferentemente sólida

9
Algunos patrones de referencia comunmente usados en QNMR:

núcleos solventes
dimetilsulfona 1H, 13C agua, orgánicos

1,3,5-trioxano 1H, 13C orgánicos

acetato de sodio 1H, 13C agua

anhidro
fosfato de sodio 31P agua
dodecahidrato
trifenilfosfato 31P orgánicos
trifluoroacetato de etilo 19F orgánicos

ortosilicato de etilo 29Si orgánicos

Espectro RMN 1H (500 MHz) de glifosato

solvente: D2O - piridina-d5 (7:1)
3.4534

2.8933
2.8687

HOD
D
DO2C CH2 N CH2 PO3D2

piridina-d4

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
(ppm)

10
 el 1,12% de las moléculas tienen13C

3.4534

2.8933

2.8687
Impureza

D J 1H-31P
DO2C 13
CH2 N CH2 PO3D2

J 1H-13C D
satélite 13C 13CH
satélite 13C DO2C CH2 N 2 PO3D2

(0,56%) J 1H-13C

3.75 3.70 3.65 3.60 3.55 3.50 3.45 3.40 3.35 3.30 3.25 3.20 3.15 3.10 3.05 3.00 2.95 2.90 2.85 2.80 2.75 2.70 2.65
(ppm)

agregando acetato de sodio:

3.4939

2.9247
2.9006

1.6315

Muestra: Pur-2
C¾digo interno: U04-190803

CH3COO-
Group Peak Start (ppm/Hz) End (ppm/Hz) Area Area %

1 3.89 1944.4 3.24 1621.0 2.4174E+005 100.00

N-CH2PO3H2 1 3.89 1944.4 3.24 1621.0 2.4156E+005 99.93
N CH2COO-
N-CH 2 3.41 1706.4 3.37 1687.8 1.8026E+002 0.07
2 3.16 1579.1 2.65 1326.6 2.4170E+005 100.00
1 3.16 1579.1 2.65 1326.6 2.4170E+005 100.00
3 1.86 930.1 1.35 673.4 1.1128E+005 100.00
1 1.86 930.1 1.35 673.4 1.1128E+005 100.00

Area(glifosato) Hestándar
moles(glifosato) = moles(estándar) x x
Area(estándar) Hglifosato

moles(glifosato) x M(glifosato)
%glifosato =
W(muestra)

3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4
(ppm)

La concentración no interviene! Los errores volumétricos no influyen en el resultado

11
 Glifosato técnico del
mercado local

3.5003

3.3955

3.0740
3.0499

2.9438
2.9197

2.8350
2.8104

2.5659
HO2C CH2
NH
HO2C CH2
HO2C CH2
IDA N CH2 PO3H2
CH3
H2O3P CH2 NMG
NH CH3
H2O3P CH2 N CH2 PO3H2
NMG IMPA + CH3
satélite 13C MAMPA
satélite 13C CH3
no ident. N CH2 PO3H2
H
MAMPA
H2NCH2 PO3H2
g
glicina
AMPA
NMG satélite 13C
no ident.

3.70 3.60 3.50 3.40 3.30 3.20 3.10 3.00 2.90 2.80 2.70 2.60 2.50 2.40
(ppm)

HO2C CH2
Otro glifosato local N CH2 PO3H2
CH3
NMG
4.4015

3.9015
3.8788

3.7235

3.4990

3.3847

3.3064

3.1156
3.0924
3.0669
3.0432

2.9293
2.9052

2.8483
2.8273
2.8232
2.8028

2.5559

HO2C CH 2
NH
HO2C CH 2 CH3
HO2C CH2 N CH2 PO3H2
N CH2 PO3H2
H
HO2C CH2 MAMPA
glicina
PMIDA
Satélite 13C + H2NCH2 PO3H2
Satélite 13C
no ident. IMPA
AMPA

PMIDA N-óxido
PMIDA

4.5 4.4 4.3 4.2 4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 3.0 2.9 2.8 2.7 2.6 2.5 2
(ppm)

12
En una muestra grado técnico podemos además cuantificar las impurezas (respecto
al acetato o al glifosato)

*** Current Data Parameters ***

Group Peak Start (ppm/Hz) End (ppm/Hz) Area Area % NAME : GLIFOSATO
LOTE 10-04
1 3.83 1917.6 3.26 1630.4 2.1654E+005 100.00 PROCNO : U04-120703 A
1 3.76 1879.4 3.69 1845.0 2.0670E+003 0.95 *** Acquisition Parameters ***
2 3.83 1917.6 3.31 1655.3 2.1347E+005 98.58 AQ_mod : qseq
3 3.39 1697.4 3.37 1684.0 5.3871E+002 0.25 INSTRUM : AM-500
4 3.31 1655.3 3.26 1630.4 4.7055E+002 0.22 NS : 8
2 1.80 900.3 1.45 724.7 1.1127E+005 100.00 O1 : 8177.00 Hz
1 1.80 900.3 1.45 724.7 1.1127E+005 100.00 O2 : 7700.00 Hz
SW : 14.9213 ppm
TD : 65536

3.7208

3.4968

3.3820

2.9235
2.8993

1.6234
TE : 303 K
CPULSE: 10.500 usec
acetato
SFREQ
(3H)
: 500.1354210 MHz
glifosato (2H) *** Processing Parameters ***
LB : 0.20 Hz
SI : 32768
SR : 6700.07 Hz
AQ_time : 4.3908880 sec

NUCLEUS : H
SOLVENT : D2O (+piridina-d)

DDATE : 2004/J l/26

2004/Jul/26

PMIDA (4H)

5.4 5.2 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0
(ppm)

Si queremos integrales con error menor al 1,1% debemos adoptar un

criterio uniforme respecto a las señales satélite

Podemos incluir los satélites siempre o excluirlos siempre en la integración de

las señales de un espectro
La superposición con otras señales dificulta incluirlos
Líneas muy anchas en la base dificulta excluirlos

Una alternativa es eliminar el acoplamiento 1H-13C. Esto tiene varias ventajas

adicionales:

Desaparece el ensanchamiento de la base de las líneas al eliminar los

acoplamientos 1H-13C a 2 y 3 enlaces
Se elimina el error de integración provocado por superposición de señales
con satélites de señales vecinas
Se pueden identificar con mayor facilidad impurezas en concentraciones
menores al 1%

13
Sin desacople de 13C Con desacople GARP-1
temperatura regulada a 303 K

3.4939

2.9247
2.9006

1.6315

3.5052

2.9407
2.9164

1.6411
3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4
(ppm) (ppm)

También es posible usar RMN 31P

12.4288

10.5103

8.9619

7.9684

2.9941

HO2C CH2 N CH2 PO3H2

H2
glifosato

HO2C CH2
N CH2 PO3H2
HO2C CH2
HO2C CH2 + CH2 PO3H2
N
HO2C CH2 O-
H 2NCH 2 PO3H 2
fosfato

29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1
(ppm)

14
 Espectro RMN 31P (202 MHz) de metamidofos técnico
solvente metanol, sin efecto Overhauser Nuclear, escala vertical x20,

P
H3CO NH2
SCH3

Podemos hacer una cuantificación absoluta agregando un estándar interno:

- 10 . 78
- 10 . 90

- 18 . 00
3 7.3 4

3 2.3 5

30 .9 3
3 0.4 5

25 .7 3
2 5 .54

2 2.2 7
21 .9 3
2 0.2 7

1 9 .46
1 9.4 2
1 9.3 5
1 9.2 5

1 2 .74

1 0.8 5
10 .7 7

10 .6 7
39 .16

30 .38

20 .15

19 .18

10 .96

10 .72

9 .7 7
29 .1

9 .36
9.3 3

1. 64
1.5 8
1 .44

O P O
P 3
H3CO NH2
SCH3

AreaMTD
MolesMTD = MolesTPPO ×
AreaTPPO
1.2 05

1.0 00

40 35 30 25 20 15 10 5 0 -5 -10 -15 -20 ppm

15
cuantificación de deltametrina
estándar de referencia: dimetilsulfona (CH3)2SO2

7 .41 1
7 .39 4
7.3 7 8

7 .36 1
7 .1 67
7 .14 2
7.0 4 0
7 .02 4

6 .70 7
6 .69 0

6.3 7 5

2 .98 5

2.0 7 7

1 .91 3

1 .25 1
1 .20 1
7.3 77

1.9 30
título 98,1%
(por CG 98,1%)

DMSO2

Br
CN
O
Br O
O H
1.0 2

1 .0 0

18 .53

1 .0 2
3. 07
1.0 3
2 .06
3.0 9

1 .02

6.1 1
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm

cuantificación de cipermetrina (mezcla de 4 diasterómeros)

estándar de referencia: dimetilsulfona (CH3)2SO2
título 93,1% DMSO2
Estándar de cipermetrina Lote 080125P1
U08-130301
6.1930
6.1787
6.1756
6.1613

5.6476
5.6313
5.6257
5.6094

2.9817

Group Peak Start (ppm/Hz) End (ppm/Hz) Area Area %

1 6.46 3230.5 6.09 3045.8 1.4219E+009 100.00

1 6.46 3230.5 6.20 3100.2 9.2275E+008 64.90
2 6.20 3100.2 6.09 3045.8 4.9830E
4.9830E+008
008 35.05
3 6.14 3070.7 6.09 3047.6 8.3154E+005 0.06
2 5.69 2844.5 5.57 2783.8 3.9989E+008 100.00
1 5.68 2842.2 5.66 2828.4 6.5241E+005 0.16
2 5.69 2844.5 5.57 2783.8 3.9819E+008 99.58
3 5.59 2793.4 5.57 2784.4 1.0422E+006 0.26
3 3.22 1611.0 2.79 1393.0 1.3766E+010 100.00
1 3.22 1611.0 2.79 1393.0 1.3759E+010 99.95
2 2.92 1460.9 2.79 1396.6 6.8632E+006 0.05

Cl
O
Cl O
H O CN

desacople GARP centrado a 100 ppm

regulación de temperatura a 303 K

6.4 6.2 6.0 5.8 5.6 5.4 5.2 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8
(ppm)

16
 análisis de excipientes en un producto farmacéutico
Polietilenglicol (PEG 400) 1%
H(O CH2CH2 )nOH
propilenglicol 0,4% CH2OH
Alcohol polivinílico 2%  3,52-3,65 CH2OH
agua
CH3
( CHCH2 )n
 1,030
1 030
OH  1,30-2,10
Verificación
soluciones acuosas de cada excipiente conteniendo 1mg/ml de dimetilsulfona
Medición
producto farmacéutico conteniendo 1 mg/ml de dimetilsulfona

Tabla de datos: 32K Llenado de ceros a 128K

Ancho espectral: 0 - 4,1 ppm ventana exponencial; LB: 0,30 Hz
Tiempo de adquisición: 7,99 seg Corrección de fase y de línea de
Tiempo de repetición: 8,99 seg base automática con ajuste fino
Angulo de pulso: 30º manual
Temperatura 297 K Referencia: 10% D2O
Número de espectros acumulados (NS): 16 Integración de señales manual,
Equilibración (DS): 2

%P/V

Propilenglicol 0,90 CH2OH

PEG 400 (n = 8 o 9) 0,36
CH2OH
Alcohol polivinílico
PHE 03904 1,87
3.9342
3.8784

3.6379
3.6293
3.6195
3.6009
3.5973
3.5453
3.5354
3.5268
3.4516
3.4435
3.4284
3.4203
3.3524
3.3388
3.3293
3.3157

3.0382

2.0018
1.9846

1.6024
1.5900
1.5452

1.0375
1.0246

U09-010403
CH3

Group Peak Start (ppm/Hz) End (ppm/Hz) Area Area %

DMSO2
1 3.67 1833.3 3.50 1751.1 5.2618E+010 100.00
1 3.67 1833.3 3.50 1751.1 5.2618E+010 100.00
2 3.09 1544.1 2.96 1482.3 2.0914E+010 100.00

H(O CH2CH2 )nOH 3

1 3.09 1544.1
2.20 1099.6
2.96 1482.3 2.0914E+010 100.00
1.19 596.7 1.4652E+011 100.00
1 2.20 1099.6 1.19 596.7 1.4652E+011 100.00
4 1.10 551.5 0.87 435.0 5.9783E+010 100.00
1 1.10 550.9 1.05 527.4 1.7317E+008 0.29
2 1.10 551.5 0.87 435.0 5.9319E+010 99.22
3 1.00 498.0 0.87 435.6 2.9107E+008 0.49

( CHCH2 )n
OH

4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0
(ppm)

17
Algunas fuentes de error intrínsecas a métodos cromatográficos y RMN
cuantitativo

fuente de error RMN HPLC / GC

diferente factor de Para núcleos distintos de 1H, usar como estándar de ref. un patrón
respuesta entre sustancia medir espectros sin NOE de título conocido de la sustancia a
a cuantificar y estándar Medir T1 previamente y usar cuantificar (no siempre disponible)
d referencia
de f i tiempos de repetición > 9T1
título incorrecto o dudoso Cambiar por otro estándar (otro Buscar otro proveedor del mismo
del estándar de referencia proveedor u otra sustancia de estándar (no siempre posible)
referencia), determinar título
contra otro estándar diferente
superposición de pico de Hacer el cálculo con más de una Cambio de condiciones (columna,
sustancia a cuantificar señal de la muestra o con más de solvente, temperaturas)
con una impureza un núcleo presente en la muestra Acoplar a espectrometría de masa y
desconocida Utilizar RMN 2D homo o determinar el espectro en distintas
heteronuclear para confirmar partes del mismo pico (no siempre
pureza de pico posible en HPLC)
Acoplar a RMN (solo para HPLC)
Detector contaminado, --------No se aplica---------- Cambiar/acondicionar columna
sangrado de columnas, limpiar detector, inyector, etc.
picos fantasmas

RMN cuantitativo (QNMR)

Ventajas
• No requiere estándares del compuesto principal ni de las impurezas
• No requiere separar el compuesto principal ni las impurezas
• Puede identificar y cuantificar impurezas nuevas o inesperadas
• En general no hay impurezas “invisibles”
• Es simple, preciso y económico
• No es destructivo (la muestra una vez preparada puede reanalizarse)
• No hay desgaste o deterioro de columnas, etc.

Desventajas
• Se requieren espectrómetros de RMN de alto campo que son costosos (20 a 30 veces
el precio de un GC o HPLC)

• La operación de los espectrómetros requiere personal especialmente entrenado y

con buenos conocimientos de la teoría del método

• El mantenimiento de los espectrómetros requiere insumos cuyo consumo es

permanente e independiente del uso (helio y nitrógeno líquidos)

18
Selección de bibliografía de RMN cuantitativo

U. Holzgrabe et al, J. Pharm. Biomed. Anal., 1998, 17, 557-616 (review)

G. F. Pauli, Phytochem. Anal., 2001, 12, 28-42 (review)
R. J. Wells et al, J. Agric. Food. Chem., 2002, 50, 3366-3374
T. S. Al-Deen et al, Anal. Chim. Acta, 2002, 474, 125-135
T. S. Al-Deen, et al, Accred. Qual. Assur., 2004, 9, 55–63
R J
R. J. Wells et al
al, Accred.
Accred Q Qual.
al Ass
Assur.,
r 2004,
2004 9,
9 450–456
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G. F. Pauli et al, J. Nat. Prod., 2005, 68, 133-149 (review)
G. F. Pauli et al, J. Nat. Prod., 2007, 70, 589-595
NMR Spectroscopy in Pharmaceutical Analysis 2008, Elsevier

19