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ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 1

Una breve historia de detección y cuantificación de ácidos nucleicos ............... 2

2. DIAGNÓSTICO GENÉTICO........................................................................... 5

3. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA: PCR.................................. 6

3.1. Fundamentos y componentes de la PCR ................................................. 7

3.2. Aplicaciones de la PCR convencional .................................................... 10

3.3. Modificaciones de la PCR: TP-PCR (triplet repeat primed PCR) ........... 12

4. PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL .................................................... 12

4.1. Fundamentos de la PCR en tiempo real ................................................ 13

4.2. Instrumentación de PCR en tiempo real ................................................ 14

4.3. Sistemas de detección de fluorescencia ................................................ 14

4.4. Ventajas de la PCR a tiempo real .......................................................... 18

4.5. Aplicaciones de la pcr a tiempo real....................................................... 19

4.6. Modificación de la PCR a tiempo real: PCR DIGITAL ............................ 22

4.7. Preparación de una PCR ....................................................................... 23

5. DETERMINACIÓN DE LA CARGA VIRAL DEL VIH .................................... 26

5.1. Dinámica de replicación viral del VIH-1.................................................. 26

5.2. Indicaciones de la determinación de la carga viral del vih-1 .................. 28

5.3. Recogida y manejo de muestras ............................................................ 29

5.4. Interpretación y rango lineal ................................................................... 29

6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 31


1. INTRODUCCIÓN

La reacción en cadena de la polimerasa, cuyas iniciales en inglés son PCR


("polymerase chain reaction"), es una técnica que fue desarrollada por Kary
Mullis a mediados de los años 80. Con esta metodología se pueden producir en
el laboratorio múltiples copias de un fragmento de ADN específico, incluso en
presencia de millones de otras moléculas de ADN. Como su nombre indica, se
basa en la actividad de la enzima ADN polimerasa que es capaz de fabricar una
cadena de ADN complementaria a otra ya existente. Sus únicos requerimientos
son que existan nucleótidos en el medio que son la materia base para fabricar el
ADN (los nucleótidos de adenina, timina, citosina y guanina), y una pequeña
cadena de ADN que pueda unirse a la molécula que queremos copiar para que
sirva como cebadora (el cebador, en inglés "primer").

La sensibilidad de la técnica de PCR es muy alta pero presenta algunos


inconvenientes, como son que no es una técnica cuantitativa y una relativamente
alta probabilidad de obtener falsos positivos por contaminación. Para solventar
este último problema se ha de optimizar la secuencia de los cebadores, así como
la temperatura precisa para que estos se unan al ADN en la localización correcta
y realizar una adecuada manipulación de los reactivos. Por otra parte para
solventar el problema de la cuantificación se han generado unas variaciones
sobre el esquema inicial de la PCR, dando lugar a lo que se conoce como PCR
cuantitativa o PCR en tiempo real.

La clave en la PCR cuantitativa es la posibilidad de detectar en tiempo


real la amplificación de nuestro genoma de interés. Para llevar a cabo esta
detección existen varios métodos pero casi todos basados en la utilización de
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otro fragmento de ADN (sonda) complementario a una parte intermedia del ADN
que queremos amplificar. Esta sonda lleva adherida una molécula fluorescente
y otra molécula que inhibe esta fluorescencia ("quencher"), de tal forma que sólo
cuando la sonda es desplazada de su sitio por acción de la ADN polimerasa la
molécula fluorescente se libera de la acción del "quencher" y emite fluorescencia
al ser iluminada con un láser. La cuantificación de la fluorescencia emitida
durante cada ciclo de la PCR será proporcional a la cantidad de ADN que se está
amplificando. En general para que sea válida esta técnica requiere realizar en
paralelo una curva patrón en las mismas condiciones para conocer la cantidad
total de ADN que se está amplificando.

Una breve historia de detección y cuantificación


de ácidos nucleicos

Inicialmente, la cuantificación de ácidos nucleicos significó la adición de


UTP o trifosfato de desoxitimidina (dTTP) a cultivos celulares o uno de muchas
posibles preparaciones experimentales in vitro y medir su incorporación
en ácidos nucleicos por precipitación de TCA (ácido tricloroacético). A pesar que
la incorporación radiactiva es una técnica cuantitativa y dio al investigador
una idea de los cambios globales en la población de ácidos nucleicos de su
sistema experimental, no fue satisfactoria para identificar o cuantificar
genes específicos o transcripciones. El primer avance en la identificación de
genes específicos vino con el desarrollo del método de transferencia del sur (1).
Esto fue seguido por la transferencia de Northern para el ARN (2). En ambos
casos, ahora era posible identificar específicamente un gen o transcrito por
hibridación de un gen marcado radioactivamente sonda a una membrana que
porta fragmentos de restricción de ADN o ARN. Ninguno de estos métodos eran
técnicas cuantitativas a pesar de los mejores esfuerzos por extraer información
cuantitativa de su uso.

La siguiente mejora en la cuantificación del transcrito de ARN vino con el


experimento de protección contra RNasa. En este método, un corto (<500 bases)
altamente radioactivo antisentido ARN se hizo a partir de un plásmido
construcción utilizando T7 RNA polimerasa. Se sintetizó ARN transcrito in vitro

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para la transcripción (es) de interés junto con una sonda usada para
normalización de carga. Las sondas antisentido radiactivas se combinaron
entonces con cada ARN total muestra y se hibridó hasta completarse en líquido.
El (los) producto (s) de ARN doble (s) resultante (s) se protegieron de la
subsiguiente adición de un cóctel de nucleasas especıficas de una sola hebra.
Los productos protegidos se separaron luego sobre un gel mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante (PAGE) y se expusieron
a película. Este método tenía la ventaja de hibridación en una superficie líquida
en lugar de una sólida y no requería la transferencia de los ARN a una
membrana. Sin embargo, el rango dinámico corto inherente al usar la película
era el mismo. Una vez más, el fosfoimager mejoró mucho en la cuantificación de
estos experimentos debido al rango dinámico expandido y software mejorado
para el análisis. El lado negativo de los experimentos de protección con RNasa
fue que las sondas tenían que tener alta actividad específica radioactiva y
requerían gran cuidado por razones de seguridad.

El procedimiento para realizar la reacción en cadena de la polimerasa


(PCR) fue introducido por primera vez por Kerry Mullis en 1983 (3) por el que
ganó el Premio Nobel en 1993. Es difícil pensar en otra técnica de laboratorio
que haya tenido un mayor impacto en tantas facetas diferentes de la
investigación biológica que la PCR. Al combinar la reacción de transcriptasa
inversa (RT) con la PCR, ahora era posible la identificación de un transcrito de
ARN específico a partir de números de copias muy bajos de material de partida.
La cuantificación de transcripciones de muestras desconocidas se hizo posible
con el advenimiento de la RT-PCR competitiva (4). En este método, una versión
truncada de la región diana de interés se encuentra entre los mismos sitios de
unión de cebador que la secuencia de transcripción diana dentro de un clon de
plásmido. El método más fácil para preparar un objetivo competitivo de
peque~no segmento fue digerir la región clonada entre los sitios de unión de
cebadores con una enzima de restricción y luego ligar los extremos pegajosos
resultantes, eliminando una sección corta de la secuencia. Los requisitos para la
construcción de la cuantificación fueron que era un tamaño similar, pero
diferente, que el producto de PCR diana y cuantificado. El plásmido contiene una
secuencia promotora de ARN de T7, SP6 o T3 en la corriente ascendente de la

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secuencia diana clonada. Utilizando el promotor de ARN, truncado ARN
transcrito in vitro se podría hacer y cuantificar. Las cantidades conocidas del
producto de ARN se introdujeron en la reacción de RT y se convirtieron en cDNA
junto con la secuencia diana dentro de la muestra desconocida. Posteriormente,
tanto el patrón truncado y las secuencias diana desconocidas se amplificaron
utilizando la PCR. Los ADN amplificados se separaron usando electroforesis en
gel de poliacrilamida desnaturalizante. En algunos métodos se añadió una base
de desoxinucleótido radioactivo para marcar el ADN amplificado y cuantificar
usando una película o un fosfoimador. En otros métodos, se visualizaron los
productos en el gel después de tinción con bromuro de etidio o SYBR® Green I.
La cuantificación de la banda diana desconocida se determinó por comparación
con la señal del patrón de ADN punteado y cuantificado. Aunque este método
fue el más exacto hasta la fecha todavía sufría de los problemas de detección
mencionados anteriormente. Sin embargo, la mayor parte de la crítica se centró
en el estándar de ADN clave. La preocupación era que el estándar de ADN
estaba compitiendo por los recursos de PCR en tiempo real del reactivo 2 y los
cebadores con el objetivo desconocido durante la PCR y, por lo tanto, podría
alterar el resultado final.

En 1996, Applied Biosystems (ABI) hizo que la PCR en tiempo real


estuviera disponible comercialmente (5) con la introducción del instrumento
7700. La PCR cuantitativa en tiempo real se ha convertido en el método más
preciso y sensible para la detección y cuantificación de los ácidos nucleicos aún
ideados. Este método ha superado la mayoría de las principales deficiencias de
las anteriores. Utilizando la especificidad y sensibilidad de la PCR combinada
con la detección directa del blanco elegido utilizando cebadores marcados
fluorescentemente, sondas o colorantes, se han eliminado los problemas
inherentes de los geles, la transferencia a una membrana, la hibridación de la
sonda radiactiva y las limitaciones de la película como detector. Existen dos
problemas para la PCR en tiempo real que aún persisten. Son 1) métodos de
cuantificación, es decir, tipo de estándar, calidad de ensayo y metodología de
cálculo utilizada y 2) cómo normalizar adecuadamente diferentes muestras para
corregir las diferencias en la entrada de ácido nucleico de muestra a muestra.

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2. DIAGNÓSTICO GENÉTICO

El diagnóstico genético es un proceso en el que hay que pasar por diferentes


fases: la historia genética (determinación de si se trata de un caso familiar, por
medio de la observación de los antecedentes), un estudio genético en el que se
obtiene información de tipa molecular del paciente y su familia y para el que hay
que determinar la metodología más adecuada a cada caso, y por último, el
consejo genético en el que se interpretan los datos obtenidos y se informa al
paciente (6)

Para el estudio genético, es importante identificar qué técnica es Ia más


adecuada para el análisis que se quiere llevar a cabo, porque depende del gen
que se analiza o de Ia información que se quiere obtener.

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Criterios para optimizar el método de preparación de la muestra

• Elección de la muestra más apropiada

• Sensibilidad deseada del ensayo

• Volumen requerido de muestra para procesar

• Número de tests diferentes a realizar sobre la misma muestra procesada

• Estabilidad de la diana durante la recogida y procesamiento de la muestra (inactivación


de nucleasas) Página 5 de 6 PCR en Tiempo Real

• Evitar el uso de soluciones tóxicas

• Evitar la centrifugación excesiva

• Eliminación de los inhibidores de la amplificación mediante diluciones

• Cantidad mínima de muestra a manejar

• Robustez del protocolo

• Ausencia de equipamiento muy específico

3. REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA: PCR
Prácticamente todas las muestras que entran en un laboratorio de
estudios genéticos tienen que pasar en algún momento por la técnica de PCR
(reacción en cadena de Ia polimerasa).

Se descubrió en 1986 por Kary Mullis, quien recibió el premio Nobel en


1993 por esta aportación. Desde entonces la técnica se utiliza en todos los
campos de la biología y ha sido considerada como la más revolucionaria en los
últimos años.

EI análisis de ADN es una herramienta esencial en la investigación y


diagnóstico, pero con Ia mayoría de métodos la cantidad de ADN obtenida para
un determinado parámetro es muy baja. El propósito de la PCR es producir un
gran número de copias de un determinado fragmento del genoma, es decir,
obtener una gran cantidad de ADN a partir de unas pocas copias. La PCR
posibilita la amplificación de cadenas de ADN de un amplio rango de tamaño
(hasta 20 kilobases) hasta 1 millón de veces y es extremadamente sensible (6).
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3.1. Fundamentos y componentes de la PCR

“El PCR nos permite encontrar la aguja en el pajar, no por el


procedimiento de ir separando la paja, sino por la vía de hacerla crecer hasta
que sea visible”, dijo Hans Burkardt, profesor de microbiología de las
universidades de Stuggart y Nuremberg (Alemania), en la presentación del PCR
en el 3er Congreso Nacional de Virología que se celebra en Vall d’Hebrón
(Barcelona).

La PCR es una técnica de amplificación enzimática in vitro permite amplificar


un fragmento específico de ADN situado entre dos regiones de secuencia
conocida, y consta de tres pasos:

 Desnaturalización del ADN (a 95°C): las dos hebras se abren a esta


temperatura.
 Hibridación de dos cebadores (a 50°C – 65°C): en este rango de
temperaturas los cebadores se unen a la hebra de ADN complementaria.
 Extensión o elongación de la PCR (72°C): La Taq polimerasa se une al
cebador y empieza a replicar la cadena que se desea amplificar.

Estos tres pasos o fases conforman un ciclo que se repite unas 30 o 40 veces.
Puesto que cada cadena que se sintetiza en el ciclo anterior sirve de molde para
en cada el siguiente, ciclo se duplican las copias de ADN. Así la cantidad de ADN
obtenido crece de forma que es exponencial y pueden conseguirse al final del
proceso millones de copias de un

único fragmento de ADN.

Componentes de Ia PCR
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 ADN molde:

EI primer paso antes de iniciar una PCR es extraer el ADN que se quiere
amplificar, normalmente a partir de muestras de sangre o de parafina. EI
protocolo de extracción y de PCR cambia en función del origen de la muestra ya
que el ADN puede haberse visto afectado de forma diferente por los diferentes
mecanismos de preparación de muestras.

Mediante técnicas de PCR se puede llegar a detectar una única molécula en


una mezcla compleja de ADN. La sensibilidad de la PCR varía dependiendo de
la cantidad de ADN molde (tamaño medio de los fragmentos y pureza). Además,
determinadas sustancias que pueden estar presentes en el ADN extraído
pueden disminuir Ia eficacia de la PCR. La cantidad óptima de ADN molde de
partida para Ia reacción de PCR es de 10-200ng.

 Cebadores:

Los cebadores son críticos para la PCR ya que proporcionan la especificidad


de Ia reacción. Así en función del diseño de estos cebadores se amplificará una
región u otra dentro der ADN utilizado como molde (normalmente, en la materia
que nos ocupa, se amplificará una región exónica de un gen relacionado con Ia
enfermedad).

La longitud y secuencia de los cebadores son características esenciales para


la reacción de PCR ya que determinan la eficiencia de Ia misma. Cuando se
diseñan los cebadores (existen programas informáticos específicos para ello),
hay que considerar bien Ia temperatura a la que debe realizarse Ia hibridación y
evitar los motivos repetidos que puedan hibridar de forma incorrecta con el ADN.
También debe evitarse la presencia de secuencias invertidas que puedan dar
lugar a la formación de estructuras secundarias en el cebador, o las secuencias
complementarias entre los cebadores que darían lugar a dímeros entre ellos.

 Enzima Taq polimerasa:

Es una enzima termoestable capaz de incorporar progresivamente


nucleótidos desde el extremo 3' de un cebador. La Taq polimerasa fue
inicialmente aislada de la bacteria Thermus aqaoticus y es capaz amplificar el
DNA a altas temperaturas (y por tanto no se desnaturaliza cuando en el ciclo se
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superan Ios 75°C y 95°C). Actualmente, se usan polimerasas comerciales y con
actividad "hot-start”, cuya activación se inicia a elevadas temperaturas, lo que
impide la síntesis a partir de dímeros de cebadores, que se pueden formar a
bajas temperaturas.

 Otros componentes:

Tampones: cada ADN polimerasa requiere de su tampón específico para


realizar su actividad enzimática en condiciones óptimas.

MgCl2: la concentración de MgCl influye en la productividad y especificidad de


la PCR. Una concentración baja de estos iones produce un bajo rendimiento. Sin
embargo, una concentración elevada produce la formación de productos
inespecíficos. La concentración final en la mezcla de reacción debe estar entre
1.5 y 5 nM.

Nucleótidos: componentes básicos del ADN, constituyen las unidades que la


Taq polimerasa va a utilizar para formar la nueva cadena de ADN. La
concentración estándar de los nucleótidos en la reacción es de 200 microM. Los
cuatro deben estar a la misma concentración para evitar errores en la
polimerización.

Termociclador: es un equipo que marca las temperaturas en los tiempos


indicados, de forma que permite realizar de forma automática las distintas fases
que conforman la reacción de PCR.

En una PCR se pasan de unas pocas copias de ADN a millones de copias,


que se pueden visualizar mediante diferentes métodos. Normalmente la
visualización del ADN amplificado durante la PCR se realiza mediante
electroforesis en gel de agarosa o electroforesis capilares en acrilamida. En
ambos casos, se utiliza la aplicación de una carga eléctrica para hacer migrar al
ADN, cargado negativamente, hacia el polo positivo. En el gel de agarosa, el
ADN, transparente se hace visible mediante un componente que se une al ADN,
el Bromuro de Etidio y en electroforesis capilar se utilizan fluoróforos.

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3.2. Aplicaciones de la PCR convencional

Amplificación de microsatélites (STRs)

Los microsatélites son regiones del genoma con repeticiones en tándem


de secuencias cortas (motivos) de nucleótidos (cac, gt,). Su presencia no es
indicativo de enfermedad, sino que su carácter polimórfico se puede utilizar para
considerarlos marcadores moleculares asociados a un gen. Es decir, no es que
las repeticiones en sí mismas impliquen una patología, pero sí que pueden ir
ligadas o asociadas a un alelo que produce una enfermedad y por tanto su
herencia es similar. Mediante marcadores polimórficos se pueden etiquetar
genes y ver cómo se están heredando dentro de una familia. Se pueden hacer
haplotipos, árboles familiares, etc

Ejemplo 1: Distrofia muscular de cinturas (enfermedad autosómica dominante)


se sabe que el gen responsable está ligado a una región concreta del
cromosoma 7q32. Se hizo un estudio de haplotipos con 7 microsatélites, tanto
en el probando, el padre, como en los hermanos de éste para ver qué
cromosoma había heredado el feto del padre, si el sano o el asociado a la
enfermedad.

Eiemplo 2: Síndrome de Prader-willi (15q11-13) está asociado a una deleción en


el cromosoma de origen paterno, a una disomía uniparental materna o a defectos
en el imprinting del cromosoma 15 paterno. En el caso especificado se determinó
mediante microsatélites que el paciente había heredado los dos cromosomas

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maternos y por tanto estaba afectado de la enfermedad por un efecto de disomía
uniparental del cromosoma materno.

Mutaciones Dinámicas

Son secuencias cortas repetidas, similares a las anteriores pero para las
que, en este caso, su repetición y/o expansién sí afecta a la expresión o función
de algún gen. Son por tanto repeticiones de nucleótidos en tándem que pueden
adquirir un tamaño patológico. Se denominan dinámicas porque este carácter
patológico depende del número de repeticiones. Hay muchas mutaciones
dinámicas descritas tanto en zonas exónicas como intrónicas. Algunos ejemplos
pueden verse en la enfermedad de Hunüngton, ataxias cerebroespinales,
distrofia miotónica, etc, todas ellas debidas a expansiones de tripletes.

Características de la inestabilidad de repeticiones de tripletes en tándem:

 Número de repeticiones polimórfico en la población.


 Adquieren un tamaño patológico.
 Inestabilida d intergeneracional.
 Fenómeno de anticipación.
 Enfermedades neurológicas.

Ejemplo 1: Enfermedad de Huntingon  alelos normales de 6-26 repeticiones/


alelos intermedios de27-Slrepeticiones/ alelos asociado a la enfermedad de
Huntington más de 36 repeticiones/ forma juvenil 60 repeticiones. En este tipo
de casos se suelen realizar electroforesis capilar, que permite detectar
variaciones de repeticiones de tripletes, al ser más sensible que la eleetroforesis
en agarosa. Las repeticiones patológicas se localizan en el exón 1 del gen que
codifica para la huntingtina y lo que se hace es una PCR con unos cebadores
que flanqueen esa región repetida y después analizarlo por electroforesis.

Ejemplo 2: Distrofia miotónica  alelos normales de5-24 repeticiones/ alelos


premutados de 35-49 repeticiones/ alelos asociados a DM1 mínima de 5&150
repeticiones/ alelos asociados a DM1 Clásica de 100-1000 repeticiones/ alelos
asociados a DM1 Congénita de más de 2000 repeticiones. En el caso planteado,
en algunos de los pacientes no se puede establecer de forma absoluta uno de
los alelos por lo que únicamente con Ia PCR no se puede caracterizar

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genéticamente al probando. En estos casos se puede hacer una PCR
flanqueante a la repetición que se está analizando y ver por electroforesis capilar
los alelos que están presentes: una segunda PCR, que está específicamente
diseñada para amplificar zonas repetidas. Es la TP-PCR, corno se indica a
continuación.

3.3. Modificaciones de la PCR: TP-PCR (triplet


repeat primed PCR)

La TP - PCR es una modificación de la PCR, específica para el estudio de


zonas repetidas' En ella se utiliza un cebador adyacente a la zona repetida y otr0
cebador diseñado sobre la repetición [es decir, que su secuencia es homóloga a
los tripletes de la expansión], que tiene añadida una cola que no hibrida con el
ADN molde. Esta cola es complementaria a un tercer cebador' Dado que el
cebador homólogo a la repetición tiene muchos posibles sitios donde hibridar se
va a ir uniendo en todas las posibles posiciones dentro de la expansión, y para
cada una de estas posiciones, con el tercer cebador vamos a obtener
amplificados de longitud variable.

Así pues, en la TP-PCR no se obtiene un solo pico, sino que se obtiene un


pico por cada una de las repeticiones de Ia expansión y en los pacientes que
tengan alelos expandidos se observará un efecto sierra, de muchos picos, en la
electroforesis capilar.

4. PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL

¿Qué es la PCR cuantitativa en tiempo real? Algunos creen que usted


tiene que ser capaz de observar el crecimiento de las curvas de amplificación
durante la PCR monitor de computadora con el fin de ser verdaderamente 'en
tiempo real. Esto por supuesto no es el caso. El software ABI 7700 SDS, el
programa original en tiempo real, no permite la visualización de las curvas de
amplificación a medida que avanzan a lo largo de la ejecución. Esto se debió
principalmente a la forma en que el software SDS realiza análisis de datos
utilizando el conjunto de datos finales de la placa entera en lugar de analizar

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cada reacción individualmente. Por lo tanto, para algunos instrumentos, los datos
finales deben estar presentes para el análisis de los datos. Para otros
instrumentos, no lo hace. Este último caso permite al software seguir el progreso
de la curva de amplificación en cada pozo en tiempo real, que se puede visualizar
en el monitor de la computadora. Esta capacidad no hace que estos instrumentos
sean exclusivamente instrumentos en tiempo real.

Por lo tanto, la PCR en tiempo real es la recolección continua de señal


fluorescente a partir de una o más reacciones en cadena de la polimerasa en un
intervalo de ciclos. PCR cuantitativa en tiempo real es la conversión de las
señales fluorescentes de cada reacción en un valor numérico para cada muestra.

La PCR a tiempo real es también una modificación de la PCR


convencional, que permite tanto la detección como Ia cuantificación de mRNA
RNA y DNA, la identificación de mutaciones puntuales (SNPs), el estudio de Ia
expresión génica y Ia diferenciación alélica.

4.1. Fundamentos de la PCR en tiempo real

La PCR a tiempo real simplifica la técnica de PCR puesto que no es


necesario realizar una electroforesis posterior ya que es en el propio
termociclador donde se detecta a tiempo real la cantidad de amplificado
existente. Por tanto se minimizan los riesgos de la técnica, como por ejemplo las
contaminaciones.

Fases de la PCR a tiempo real:

Exponencial: en cada ciclo se duplica Ia cantidad inicial del ADN diana


(asumiendo un 100% de eficiencia)
Lineal: los componentes de la reacción empiezan a consumirse, la
reacción es más lenta y algunos de los reactivos o enzimas empiezan a
degradarse. La eficiencia ya no es del 100% por lo que en cada ciclo ya
no se duplica Ia cantidad de ADN.

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Plateau: la amplificación está parada, no se producen nuevos productos.
Algunos productos de Ia PCR se pueden degradar. Esta fase es la que se
detecta en la PCR tradicional.

A diferencia de Ia PCR que se visualiza en un gel de agarosa y en Ia que


solo se analizaría el resultado de "sí" o "no" respecto a Ia amplificación, en la
PCR en tiempo real se pueden analizar todas las fases. No obstante, la fase que
normalmente se analiza es la exponencial y el valor con el que se suele trabajar
es el Ct, o ciclo en el cual se detecta Ia fluorescencia.

Los productos de amplificación en tiempo real se detectan a medida que


transcurren los ciclos de la PCR. En este caso, el termociclador no sólo aumenta
y disminuye la temperatura sino que está diseñado para detectarla en cada ciclo.
Este mecanismo está basado en la detección y cuantificación de un reporter
fluorescente, cuya señal aumenta en proporción directa a la cantidad de producto
de PCR generado en la reacción. El termociclador tiene acoplado un sistema de
detección, capaz de cuantificar la señal emitida por el reporter, al final de cada
ciclo.

En una misma reacción de PCR se pueden detectar diferentes mutaciones


o amplificados, en función del fluoroforo que se utiliza.

4.2. Instrumentación de PCR en tiempo real

Hay tres componentes principales en cualquier instrumento en tiempo


real: 1) la fuente de luz, que determina la gama de tintes de reportero que el
instrumento es capaz de usar; 2) el sistema de detección, donde se determinará
el rango espectral y la sensibilidad de cualquier ensayo; y 3) el mecanismo de
termociclado, el determinante de la velocidad a la que puede realizarse un
ensayo, la uniformidad de los cambios de temperatura de una muestra a otra y
el número de muestras que pueden acomodarse en cualquier momento (7).

4.3. Sistemas de detección de fluorescencia

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Los sistemas principales de detección de la fluorescencia son:

1) SYBRGreen (similar al bromuro de etidio. BrEt):

Se une preferentemente a DNA de doble cadena incrementando fuertemente su


fluorescencia. La fluorescencia emitida es proporcional a la concentración de
DNA, de esta forma, el producto que se está formando en cada ronda de
amplificación puede ser visualizado de forma continua. La señal aparece a partir
de un número determinado de ciclos, dependiendo de la concentración de
partida. La concentración de DNA se determina usando estándares de
concentración conocida y comparando las curvas de fluorescencia de dichos
estándares con la fluorescencia de la muestra.

Existen tres metodologías básicas comúnmente utilizadas en la detección


de ARN o ADN por PCR en tiempo real y todos ellos utilizan fluorescentes
tintes. En cada caso, se incrementa proporcionalmente una baja señal
fluorescente inicial durante cada ciclo sucesivo de PCR en tándem con el
incremento exponencial en el (los) producto (s) de ADN formado (s). El sistema
de ensayo más simple implica la incorporación de un tinte libre en el producto de
ADN de doble cadena recién formado. El colorante más utilizado para este
propósito en la PCR en tiempo real es SYBR® Green I (Molecular Probes /
Invitrogen).

La fluorescencia de fondo de SYBR® Green I cuando está en solución


como colorante libre y estimulada por la luz de la longitud de onda apropiada es
muy baja. Lo mismo es cierto para los ácidos nucleicos monocatenarios a las
concentraciones utilizadas para la PCR en tiempo real. Por el contrario, a medida
que se forma el producto de ADN de doble hebra, SYBR® Green I se une a la
ranura menor del ADN de doble hebra. El complejo de tinte de ADN da como
resultado un aumento dramático en la salida de fluorescencia, cuando está
correctamente iluminado, de aproximadamente 2.000 veces la salida inicial,
fluorescente (Figura 1).

Este sistema de ensayo tiene una relación señal / ruido muy buena. La
popularidad de los ensayos SYBR® Green I con los usuarios de PCR en tiempo
real se debe a tres factores: 1) bajo costo para el tinte; 2) facilidad de desarrollo
del ensayo, solo se requiere un par de cebadores; y 3) se puede usar el mismo
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mecanismo de detección para cada ensayo. El lado negativo es que cada
molécula bicatenaria producida en la reacción generará una señal, tal como
dímeros de cebador o productos de PCR inapropiados. Este hecho pone una
prima alta en el buen diseño del cebador y el control cuidadoso de la calidad
durante el desarrollo del ensayo. También significa que una ADN polimerasa de
arranque en caliente es un requisito para disminuir o eliminar las señales extra
ensayos (7).

Figura 1
Representación gráfica de la
incorporación del colorante SYBR®
Green I, resultando en un aumento
de la señal fluorescente durante la
PCR. El colorante libre tiene una
fluorescencia muy baja y no se unirá
a ADN monocatenario o
desnaturalizado. Durante el
recocido de cebador, se forma una
estructura bicatenaria y se une el
colorante SYBR® Green I, dando
como resultado un aumento
espectacular de la señal
fluorescente. Durante la extensión
del cebador por la ADN polimerasa Taq, la señal fluorescente aumenta proporcionalmente al
número de moléculas de colorante SYBR® Green I unidas por molécula bicatenaria. El proceso
se repite en cada ciclo con aumento de la fluorescencia total.

2) Sondas FRET (Fluoresence Resonance Transfer):

Las sondas FRET están compuestas por dos sondas; un fluoróforo donador,
que excitado por una fuente de luz externa, emite luz, absorbida por un segundo
fluoróforo próximo a él, denominado aceptor. Este aceptor emite luz a una
longitud de onda distinta del donador. Esta luz puede medirse. Para que este
fenómeno ocurra, ambas sondas deben estar muy próximas entre sí. Por lo que
deben diseñarse de manera específica para que hibriden con el DNA objetivo en
regiones muy cercanas, que permitan, que tras la excitación del fluoróforo
donador, éste sea capaz de excitar al fluoróforo aceptor, en la zona interna del

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amplificado por PCR con cebadores normales. A medida que se incrementa la
cantidad de DNA debida al número de ciclos, se incrementa igualmente la
cantidad de sondas que hibridarán y darán una señal. Así, la señal FRET será
directamente proporcional a la cantidad de producto de PCR específico. Si el
DNA no es específico, no se producirá hibridación de las sondas y por tanto no
habrá reacción (6).

3) SondasTaqman:

Es una única sonda formada por un reporter, fluoróforo que emite a una
determinada longitud de onda; y un quencher, que absorbe la luz emitida por el
reporter haciendo que dicha emisión no sea detectada. El quencher puede ser
un fluoróforo o una molécula que no emite fluorescencia. Tras la fase de
elongación de la PCR, se libera el reporter por un fenómeno de hidrolización y
se produce la detección. Es decir, durante la elongación la sonda se une al DNA
y cuando la polimerasa se encuentra con la sonda, gracias a su actividad
exonucleasa (actividad que degrada el DNA que encuentra por delante) degrada
la sonda liberando el reporter.

A medida que se incrementa la cantidad de DNA debida al número de ciclos,


se incrementa igualmente la cantidad de las sondas hidrolizadas. Así la señal
será directamente proporcional a la cantidad de producto de PCR específico. Si
el DNA no es específico no se producirá la hibridación de la sonda y por tanto no
habrá reacción.

TaqMan® o sondas de hidrólisis son oligonucleótidos lineales que han sido


históricamente marcados con un reportero en el extremo 5 'y un extintor en el extremo
3', aunque la orientación opuesta puede y ha sido usada. Cuando los colorantes
indicador y extintor están en estrecha proximidad en solución, la señal informadora se
apaga. La eficiencia de la extinción se determina por la secuencia de la sonda que a su
vez determina la eficacia con la que los extremos de la sonda se asocian en solución.
Cuando la sonda se hibrida con su secuencia diana complementaria, los dos tintes se
separan al máximo y la señal del informador es detectada por el instrumento. No hay
buenos predictores en ningún programa de software para qué tan bien una sonda se
apaga en la práctica. Sin embargo, existe una correlación directa e inversa entre la

[NOMBRE DEL AUTOR] 17


longitud de la sonda y la eficiencia de enfriamiento. Por esta razón, las sondas TaqMan®
se mantienen a menos de 30 bases de longitud.
Es esencial que la sonda se hibrida a la secuencia de hebra objetivo antes de los
cebadores para asegurar que la señal potencialmente puede generarse a partir de cada
amplicón recién sintetizado. La ADN polimerasa Taq se une y comienza a extender la
nueva cadena muy rápidamente después de la unión del cebador. Por esta razón, las
sondas de hidrólisis están diseñadas para tener un Tm 9-10 ° C más alto que sus
cebadores emparejados. Las sondas de hidrólisis dependen de la actividad 5 'nucleasa
de la ADN polimerasa Taq para su escisión durante la síntesis de nueva cadena para
generar una señal fluorescente a partir del colorante indicador recién liberado (Figura
2)
El nombre TaqMan® proviene de este paso de hidrólisis en una analogía con el
acción del viejo personaje del juego de computadora, Pacman. Nuevo establo térmico
Las ADN polimerasas se han introducido a partir de otros géneros de bacterias que no
contienen actividad 5 'nucleotidasa. Funcionan bien para la PCR pero no pueden
separar las sondas de hidrólisis (7)

Figura 2
Ilustración gráfica que muestra la generación de
señales fluorescentes a partir de una sonda
TaqMan®. Cuando está libre en solución, el
colorante fluorescente reportero se apaga
mediante una segunda molécula usando FRET. A
medida que la reacción se enfría hacia la
temperatura de recocido, la sonda se une a una
secuencia plantilla complementaria a una
temperatura más alta que la imprimación en la
misma cadena. Durante la extensión del cebador
por ADN polimerasa Taq, la sonda se desplaza y
se degrada por una nucleasa 5 'presente en Taq
ADN polimerasa. La liberación del colorante
indicador de la molécula de sonda y su
proximidad al colorante de extinción permite que
se realice la señal completa del colorante indicador.

4.4. Ventajas de la PCR a tiempo real


Las ventajas de la PCR en Tiempo Real son:

[NOMBRE DEL AUTOR] 18


 En la PCR convencional se observa el resultado final de Ia amplificación
(Fase plateau). En la PCR a tiempo real se analizan ros datos de Ia fase
de crecimiento exponencial.
 El incremento de Ia fluorescencia es directamente proporcional al número
de amplicones generados.
 La precisión, la resolución y la sensibilidad son mayores con la PCR a
tiempo real.
 La PCR convencional solo discrimina por el tamaño del amplificado.
 No se requiere ningún proceso post-PCR por lo que se ahorra tiempo.
Además se minimizan los problemas de contaminación por amplicones y
se reduce la variabilidad en el resultado.
 El rango dinámico, es decir la sensibilidad de Ia técnica para diferenciar
entre diferentes cantidades, es mucho mayor empleando PCR a tiempo
real.
 Si se emplean sondas en la detección de Ia fluorescencia, se evita la
detección de los artefactos de la reacción como ros dímeros de
cebadores.

4.5. Aplicaciones de la pcr a tiempo real

1) Genotipado:
 Curvas Melting o Curvas de Fusión:
o Cada ADN se caracteriza por su Tm o temperatura de Fusión, que se
define como la temperatura en la que el 50% del ADN está en cadena
simple (mitad del DNA está desnaturalizado).
o La Temperatura de fusión de un producto de PCR puede monitorizarse
midiendo la disminución de fluorescencia por incremento de Ia
Temperatura se obtienen así las curvas de fusión.
o Variaciones de la Tm del producto de PCR: la Tm depende de la
secuencia del fragmento que estemos amplificando. Un fragmento bajo
en GC tendrá una Tm más baja, mientras que un fragmento rico en GC,
tendrá una Tm más alta. El tamaño o longitud del fragmento también
modifican la Tm, así como las concentraciones de sal y otros
componentes de la reacción.

[NOMBRE DEL AUTOR] 19


 HRM (High Resolution Melting):
o Es una técnica reciente, de tan sólo unos pocos años, que permite
analizar la Tm del producto amplificado con alta resolución. Está basada
en un agente intercalante similar al SYBRGrem, pero con mayor
capacidad de intercalarse en el ADN de doble cadena. El análisis es
mucho más sensible y proporciona información incluso de un único
cambio en la cadena nucleotídica.
o Tras obtener un amplificado, si empezamos a subir la temperatura, el nivel
de fluorescencia caerá según vayamos aumentando la temperatura de la
reacción. Podemos normalizarlo y diferenciar distintas secuencias que
tengamos en la muestra. El HRM necesita muchas muestras a la vez,
porque lo que hace es comparar muchas curvas de Melting de unas
muestras con respecto a las otras.
o Se está utilizando para genotipado de mutaciones conocidas, mutaciones
recurrentes, y para el screening de BRCA 1 y 2. El problema es que el
saber si va a detectar un cambio puntual o no, por lo que se debe validar.
Esto lleva a que las mutaciones ya descritas sí pueden validarse, pero las
mutaciones de novo no se puede estar seguro de detectar todos los
cambios.
 AnáIisis de mutaciones mediante sondas FRET:
o Las curvas de Melting se hacen después de la PCR. Si tenemos una
pareja de sondas FRET y tenemos una mutación conocida, podemos
diseñar una sonda que se una en la región donde está esa mutación
conocida. Según aumentemos la temperatura, si el alelo posee esa región
que hemos detectado con la sonda, la unión va a ser más fuerte que si el
DNA tiene una secuencia diferente (su unión será más débil, por lo que
se despegará a una temperatura interior).
 Ejemplos:
1. Genotipado de factores de coagulación: el factor 5 Leiden tiene una
mutación recurrente que se analiza con sondas FRET. Se parte de
una fluorescencia inicial provocada por la unión de las sondas y según
se incrementa la temperatura se van desnaturalizando
(deshibridando) las sondas FRET del DNA de la muestra. Entonces,
un resultado de 2 picos nos indica que es DNA heterocigoto, mientras
[NOMBRE DEL AUTOR] 20
que si sólo aparece un pico se pueden dar dos opciones: si es el pico
que tiene la temperatura más alta, es el alelo frente al cual se ha
diseñado la sonda (puede ser el alelo mutante o el normal); y si es el
pico de la temperatura más baja, es el alelo frente al cual no se ha
diseñado sonda.
2. Síndromes mieloproiferativos crónicos: detección semicuantitativa de
la mutación p.Val617Phe del gen JAK2 mediante el empleo de sondas
FRET.
o El genotipado también puede realizarse usando Sondas TaqMan: en este
caso, en lugar de utilizar curvas melting, se diseñan dos sondas, cada una
de las cuales se une de forma específica al alelo mutado o al alelo normal.
 Ejemplo: Síndrome de Gilbert, genotipado del alelo A(TA)7TAA en el
promotor del gen UGT1A1 mediante sondas TaqMan.

2) Cuantificación

La cuantificación puede ser absoluta o relativa. La absoluta presenta errores más


grandes por lo que se suele usar la cuantificación relativa.

La cuantificación mediante la PCR a tiempo real permite determinar el porcentaie


del analito (del amplicón de interés) presente en una muestra. La PCR
cuantitativa se diseña de manera que el incremento de la cantidad de producto
produce un incremento en la fluorescencia emitida por sondas específicas. Para
cuantificar la muestra se obtiene el número de ciclo a partir del cual se empieza
a detectar la fluorescencia, denominado "Ct” y se compara con los diferentes Ct
obtenidos con un estándar en cantidades conocidas, Con una serie de patrones
se puede realizar una recta de regresión, entre el número de copias y el número
de ciclos necesarios para llegar al umbral de fluorescencia establecido
(realización de curvas patrón). Dependiendo de la concentración inicial del
analito se detectará antes o después la fluorescencia.

Ejemplos:

1. Cuantificación de reordenamientos (translocaciones) en


oncohematología.
[NOMBRE DEL AUTOR] 21
2. Cuantificación de polimorfisrnos en quimeras hematopoyéticas mediante
sondas TaqMan. Mediante este análisis se puede conocer si la sangre de
un paciente sometido a un trasplante de médula ósea, se está volviendo
a producir o si por el contrario ha sido totalmente sustituida por la sangre
del donante. Así se evalúa la evolución del trasplante.

En este caso no se utilizan estándares sino que se utiliza el ADN del receptor,
antes del trasplante, como calibrador. Lo que se analizan son polimorfismos
informativos de inserciones o deleciones, así como alelos nulos.

4.6. Modificación de la PCR a tiempo real: PCR


DIGITAL

La PCR digital lleva ya desarrollada desde hace unos años, pero ha sido
durante el último año cuando se ha iniciado su incorporación en diferentes
laboratorios para su utilización de forma rutinaria. La base de la PCR digital es
dividir una única reacción de PCR en miles de reacciones. Esta modificación de
la PCR a tiempo real permite hacer cuantificaciones absolutas. Funciona con
sondas TaqMan por lo que se puede diseñar una sonda para un alelo mutante y
una sonda para el alelo normal y ver la proporción de cada uno. Normalmente la
reacción es fragmentada en alrededor de 12000-15000 PCRs. La técnica permite
la cuantificación de cantidades iniciales muy pequeñas ya que al subdividir la
muestra la proporción de un alelo de baja frecuencia en la muestra general se
ve incrementada en algunas de las micromuestras. Dependiendo del número de
reacciones vacías, se sabe cuántas reacciones se tiene con 1, 2…5 copias, ya
que se sigue un modelo de distribución de Poisson, Se puede obtener ratios
entre alelos raros y alelos común. Se puede cuantificar hasta un ratio del 0.01%.

La PCR digital presenta como ventajas principales, la posibilidad de hacer


cuantificaciones absolutas y el hecho de que muchos factores que influyen en la
PCR de tiempo real normal, no influyen en la PCR digital. Por ejemplo, si hay
presencia de inhibidores en una muestra, todas las submuestras experimentarán
el mismo problema, sin influir en el ratio entre los productos que se detectan Sus

[NOMBRE DEL AUTOR] 22


principales utilidades es el genotipado en sangre materna de DNA fetal y el
genotipado de mutaciones en tumores (6).

4.7. Preparación de una PCR

Se han detallado previamente los componentes básicos que es necesario


incorporar a la reacción para completar una PCR (apartado 4.1.). El equipo en el
que se lleva a cabo la reacción es el termociclador (figura 3). ¿Qué otros
materiales necesitamos a nivel práctico para preparar la reacción? Pues
necesitaremos utilizar microtubos, placas de PCR, un juego de micropipetas y
puntas para las micropipetas (figura 3), además de hielo para mantener los
reactivos a baja temperatura.

Figura 3

Equipo y materiales para llevar a cabo una PCR: Termociclador, puntas, placa de PCR, microtubos
y juego de micropipetas.

Es frecuente que una PCR se prepare para obtener producto de


amplificación a partir de más de una muestra, es decir, que se prepare más de

[NOMBRE DEL AUTOR] 23


una reacción. ¿Cómo se suele trabajar en este caso? La forma habitual de
trabajar consiste en preparar la mezcla de reacción (en cantidad suficiente para
todas las muestras) que contenga todos los componentes de la PCR, a
excepción del DNA molde. Esta mezcla se distribuye en los microtubos o en la
placa de PCR y a continuación se añade a cada reacción el DNA molde. A B Se
detalla un ejemplo de preparación de PCR; los volúmenes y concentraciones son
orientativos, siendo valores frecuentemente empleados en la práctica.
Supongamos que los reactivos de la PCR se conservan a las concentraciones
que se indican en la tabla 1. Supongamos también que la mezcla de reacción
debe contener cada uno de los componentes a las concentraciones que se
recogen en la misma tabla. ¿Cómo determinamos el volumen a añadir a la
reacción de cada uno de los componentes? Se trata simplemente de saber que
se debe cumplir la siguiente igualdad (ecuación 1):

Como ejemplo, si los cebadores se conservan a una concentración


(concentración inicial) de 10 µM y los queremos a una concentración 0,4µM
(concentración final), sabiendo que el volumen total de la reacción de 25 µl
(volumen final), podremos aplicar la ecuación 1 para determinar el volumen que
es necesario tomar del tubo original (volumen inicial). Trabajando de esta forma
se calculan los volúmenes a añadir de cada uno de los componentes (tabla 1).
Tabla 1

Concentraciones de almacenamiento, concentraciones empleadas en la reacción y volumen a


añadir de los principales componentes de una PCR considerando un volumen total de 25 µl.

[NOMBRE DEL AUTOR] 24


Hasta completar el volumen final de 25 µl falta considerar la cantidad de
DNA a añadir. Entre 40 y 100 ng de DNA (cuando se trata de DNA total de planta)
son valores habituales. Es frecuente preparar el DNA de forma que se incorpore
todo el DNA necesario añadiendo 1 µl a la reacción. El resto hasta el volumen
total se completaría con agua destilada. En cualquier caso, como se ha dicho
previamente, se prepara en primer lugar la mezcla, sin el DNA, en cantidad
suficiente para todas las muestras a incluir en el análisis. Por tanto, se
multiplicarían los valores obtenidos en la tabla 1 para cada componente (además
del agua destilada) por el número total de muestras a analizar (incluyendo el
control negativo, ver cuadro 2). Un vez preparada esta mezcla, se distribuye en
microtubos o en placa de PCR: si de DNA se va a añadir 1 µl por reacción, se
distribuirán 24 µl de mezcla por reacción. A continuación se añade el DNA a cada
muestra, y el mismo volumen de agua en el control negativo. Los componentes
y la mezcla de reacción se mantendrán en hielo durante el proceso, con el fin de
evitar su degradación.

[NOMBRE DEL AUTOR] 25


Una vez preparados los tubos de reacción se introducen en el
termociclador. Como ya sabemos, la PCR se completa gracias a la repetición de
25-35 ciclos en los que se suceden las tres fases en que se modifica la
temperatura. Previamente a los ciclos de la PCR se lleva a cabo una
desnaturalización inicial de alrededor de cinco minutos; además, la reacción se
completa con una elongación final de aproximadamente 10 minutos (figura 4).

Figura 4

Perfil térmico típico de una PCR. Los tiempos de cada fase son orientativos. La temperatura de
hibridación puede variar en función de la especificidad de la reacción.

5. DETERMINACIÓN DE LA CARGA VIRAL

DEL VIH
5.1. Dinámica de replicación viral del VIH-1

[NOMBRE DEL AUTOR] 26


El genoma del VIH está formado por una cadena única de ADN de
polaridad positiva que mide aproximadamente 9,8 Kb y consta de 3 genes
esenciales: gag, pol y env. Cuando infecta una célula humana (CD4+), el ARN
es inmediatamente transcrito por la acción de una ADN-polimerasa-ARN
dependiente, comúnmente conocida como retrotranscriptasa, generándose un
ADN de doble hebra que atraviesa la membrana nuclear y que por la acción de
otra enzima viral, la integrasa, se integra de manera crónica en el genoma
humano. Sin embargo, este proceso sólo ocurre en el 1% de las células. En
alrededor del 99%, la producción viral se mantiene por ciclos de infección de los
linfocitos, producción viral y muerte con una cinética de recambio muy rápida. Se
calcula que la semivida de una partícula viral en plasma es de aproximadamente
6 h, el de una célula infectada de 1 día y el de un ciclo de generación completo
de 2,6 días. Este ciclo biológico fue descrito por Perelson et al en 1996 (8). Este
1% de las células que “escapan” a ese ciclo se acantona en los llamados
santuarios del virus, de los que parece imposible erradicarlo (9). Esta cinética
viral y el hecho de que la transcriptasa inversa introduce errores de trascripción
que producen mutaciones, origina que el virus se encuentre en el organismo
como un conjunto de poblaciones genéticamente distintas relacionadas entre sí
y con una población predominante. Esto se denomina cuasiespecies y es un
mecanismo que favorece la variabilidad del virus permitiéndole evolucionar
rápidamente como respuesta a presiones selectivas, bien del sistema inmunitario
o por el tratamiento antirretroviral.

En la infección por el VIH-1 se pueden diferenciar 3 períodos:

1. Primoinfección o fase aguda. Etapa inicial en la que los valores de


viremia son muy altos. Estos valores de virus en sangre aparecen
aproximadamente después de 2 semanas desde la práctica de riesgo
(sexual o parenteral), dura aproximadamente 3 o 4 semanas y en esta
etapa se produce la diseminación del virus a órganos linfoides
(santuarios).

2. Infección crónica o asintomática. Período en el que la fuerte respuesta


inmunológica contra el virus (fase de seroconversión) reduce los valores
de virus en sangre por debajo de los límites de detección de las

[NOMBRE DEL AUTOR] 27


plataformas actualmente aprobadas para su diagnóstico. Durante este
período se establece una competición entre el virus y el sistema inmune
del huésped: el virus genera continuamente nuevas variantes virales para
escapar de la acción del sistema inmune (fenómeno de escape) y puede
durar hasta 10 años. Por este motivo, la cuantificación viral no debe ser
considerada como una prueba diagnóstica (salvo situaciones
excepcionales). La detección de anticuerpos contra el VIH-1 es la primera
prueba que se debe utilizar para hacer el diagnóstico de infección por el
VIH.

3. Aparición de sida. Con cifras de CD4+ < 200/ul, síntomas generalizados


e infecciones oportunistas graves.

5.2. Indicaciones de la determinación de la carga


viral del vih-1

La cuantificación del ARN del VIH-1 es un reflejo de la replicación viral


activa y es esencial en algunas situaciones clínicas de la infección por este virus.
Las indicaciones principales son las siguientes:

– La carga viral es un marcador predictivo del tiempo de progresión a sida


independientemente del número de linfocitos CD4+ (10, 11). En los primeros
años de conocerse el sida se consideró el recuento de las células CD4+ como el
mejor marcador pronóstico de progresión, pero en el momento actual, el
procedimiento mejor para el seguimiento de los pacientes es el estudio de ambos
marcadores, carga viral y recuento de células CD4+(12).

– La cuantificación de la carga viral de VIH-1 debe ser realizada antes de iniciar


un tratamiento con antirretrovirales para medir la eficacia o respuesta al
tratamiento y en el caso de que se sustituya o añada algún fármaco, bien por
efectos secundarios o por sospecha de fracaso (13).

– Hay situaciones excepcionales en las que la carga viral es muy útil para el
diagnóstico o confirmación de infección por VIH-1. Por ejemplo, en el diagnóstico

[NOMBRE DEL AUTOR] 28


de infección neonatal (la determinación de anticuerpos no es útil) e incluso
cuando se sospecha infección aguda (reduce el período ventana).

5.3. Recogida y manejo de muestras

La muestra adecuada para todas las técnicas comerciales citadas


anteriormente es el plasma. El NASBA, debido a su método de extracción,
permite utilizar, además de plasma, otras muestras biológicas variadas como
líquido cefalorraquídeo, sangre, semen o secreciones cervicales (14).

El anticoagulante ideal es el EDTA debido a que el virus es más estable


en éste que cuando se utiliza como anticoagulante citrato de dextrosa. También
es importante considerar que en la muestra de sangre con citrato de dextrosa el
resultado puede ser más bajo por la dilución del volumen del anticoagulante
añadido. La sangre con heparina no se debe utilizar nunca, excepto para el
NASBA, porque está descrito que interfiere con algunos de los reactivos
utilizados en las técnicas.

Un aspecto crítico en el manejo de las muestras es que se debe separar


el plasma antes de las 6 h de la extracción de la sangre para así minimizar el
riesgo de la degradación del ARN y, por lo tanto, para evitar la obtención de
resultados inferiores a los reales. La muestra se debe conservar a –20 ºC hasta
su estudio, aunque el ARN viral es estable varios días en el plasma refrigerado
a 4º C.

El volumen de plasma requerido para cada técnica varía entre 200 y 1.000
μl.

5.4. Interpretación y rango lineal


Para la interpretación de los resultados de cuantificación de ARN de VIH-
1 se debe considerar la variabilidad intraensayo de la técnica que se está
utilizando y la variabilidad debida a aspectos biológicos. En diversos estudios
comparativos se ha confirmado que la variabilidad intraensayo es muy baja con
la mayoría de las técnicas mencionadas, aproximadamente entre 0,1 y 0,2 log10
(15-17). En general se considera que hay un cambio significativo cuando los

[NOMBRE DEL AUTOR] 29


valores medidos se diferencian en más de 0,5 log10. Hay mayor variabilidad
intraensayo cuanto más se acerca el resultado al límite inferior del rango lineal.

En cuanto a los aspectos biológicos a considerar en la cuantificación de


la carga viral, hay que tener en cuenta que, en general, en los pacientes estables
clínicamente que no han iniciado el tratamiento con antirretrovirales o en los que
no hay cambios en la administración de éstos, los valores de ARN del VIH-1 son
estables.

Algunas infecciones, especialmente la causada por el virus del herpes


simple o la administración de vacunas (gripe, tétanos o neumococo), pueden
ocasionar un ascenso transitorio del ARN del VHI-1, pero regresa a valores
basales antes de 1 mes. Por todo esto, pequeños cambios en la cuantificación
no deben ser interpretados como cambios relevantes o significativos para
adoptar decisiones clí- nicas. Por otra parte, también hay que tener en cuenta
que un resultado de carga viral indetectable no significa que el virus haya
desaparecido del paciente, sino que no se detecta en sangre. No se valora el
ADN proviral de VIH-1 integrado en los linfocitos o en otros tejidos del organismo
que actúan como reservorios.

[NOMBRE DEL AUTOR] 30


6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Southern EM (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments
separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 98: 503–517

2. Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (1977) Method for detection of specific RNAs
in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with
DNA probes. Proc Natl Acad Sci USA 74: 5350–4.

3. Mullis KB (1990) Target amplification for DNA analysis by the polymerase


chain reaction. Ann Biol Clin (Paris) 48: 579–582.

4. Vu HL, Troubetzkoy S, Nguyen HH, Russell MW, Mestecky J (2000) A method


for quantification of absolute amounts of nucleic acids by (RT)-PCR and a new
mathematical model for data analysis. Nucleic Acids Res 28: E18

5. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM (1996) Real time quantitative PCR.
Genome Res 6: 986–994.

5. Siciliano JD, Siciliano RF. The latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells:
a barrier to cure. Curr Opin HIV AIDS. 2006;1:121-8.

6. Carlos Luis Lafora (2014) Técnicas de Diagnóstico Molecular. Valencia,


España. 4ta Edición del Certificado en Genética Médica

7. Taylor & Francis. (2006). Real Time PCR. United States: Taylor & Francis

8. Siciliano JD, Siciliano RF. The latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells:
a barrier to cure. Curr Opin HIV AIDS. 2006;1:121-8.

9.Günthard HF, Wong JK, Ignacio CC, Guatelli JV, Riggs NL, Havlir DV, et al.
Human immunodeficiency virus replication and genotypic resistance in blood and
lymph nodes after a year of potent antiretroviral therapy. J Virol. 1998;72:2422-8

10. Mellors JW, Rinaldo CR, Gupta P, White RM, Todd JA, Kingsley LA.
Prognosis in HIV-1 infection predicted by the quantity of virus in plasma. Science.
1996; 272:1167-70.

[NOMBRE DEL AUTOR] 31


11. Mellors JW, Kingsley LA, Rinaldo CR, Todd JA, Hoo BS, Kokka RP, et al.
Quantitation of HIV-1 RNA in plasma predicts outcome after seroconversion. Ann
Intern Med. 199;122:573-9.

12. Langford SE, Ananworanich J, Cooper DA. Predictors of disease progression


in HIV infection: a review. AIDS ResTher. 2007;4:11.

13. Panel de expertos de GESIDA y Plan Nacional sobre el SIDA.


Recomendaciones de GESIDA/Plan Nacional sobre el SIDA respecto al
tratamiento antiretroviral en adultos infectados por el virus de la
inmunodeficiencia humana [consultado, 2-2009]. Disponible en:
http://www.msps.es/ciudadanos/enfLesiones/enfTransmisibles/
sida/docs/recomendacionesGesidaPNSTARfebrero2009.pdf

14. Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, Van
der Noordaa J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin
Microbial. 1990;28:495-503.

15. Cao Y, Ho DD, Todd J, Kokka R, Urdea M, LIfson JD, et al. Clinical evaluation
of branched chain DNA signal amplification for quantifying HIV Type 1 in human
plasma. AIDS Res Hum Retroviruses. 1995;11:353-61.

16. Lin HJ, Myers LE, Yen-Lieberman B, Hollinger FB, Henrard D, Hooper CJ, et
al. Multicenter evaluation of quantification methods for plasma Human
Immunodeficiency Virus Type 1 RNA. J Infect Dis. 1994;170:553-62.

17. Mole L, Ripich S, Margolis D, Holodniy M. The impact of active herpes simplex
infection on human immunodeficiency virus load. J Infect Dis. 1997;176:766-70.

[NOMBRE DEL AUTOR] 32