MEJORAMIENTO MICROBIANO POR MUTACIONES

Permite obtener una elevación en la producción de muchas

sustancias. Para la penicilina de producciones de menos
de 100 unidades/ml se a elevado a 85000 unidades/ml
(aprox. 50 g por L).

TIPOS DE MUTACIONES:
MUTACIONES ESPONTÁNEAS: por espontaneidad, con una
frecuencia de 10-10 y 10-5 por generación y por gen por la
cual no es recomendable para la selección, con relativa
frecuencia de reversión, causadas por integración y
escisión de elementos IS (Secuencias de Inserción) junto
con errores en el funcionamiento de enzimas (ADN
polimerasa, enzimas de recombinación y de reparación del
ADN.

MUTACIONES INDUCIDAS: por agentes mutágenos, con

frecuencias que pueden llegar a 10-5 a 10-3 (para obtención
de metabolitos secundarios) o hasta 10-2 a 10-1 (para
obtención de mutantes auxótrofos).

MUTAGÉNISIS DIRIGIDA:
Comprende:
1.Delecciones: las producidas por enzimas de restricción
actuando sobre ADN monocatenario circular que lo llega
a linearizar , cuyos extremos llegan a convertirse en
extremos romos perdiéndose secuencias de nucleótidos.
2.Inserciones:
 Por adaptador-conector: cuando se utilizan
moléculas adaptadoras de ADN (ADN bicatenario
 sintetizado químicamente que puede ser utilizado
para conectar los extremos de dos moléculas de ADN)
o conectoras (que es similar al adaptador pero posee
un sitio de reconocimiento para una enzima de
restricción) para ser insertado en el sitio de
reconocimiento en el que ha actuado la enzima de
restricción.
 Por transposones: ofrece una gran variedad de
ventajas. Puede obtenerse un fenotipo mutante con
una velocidad muy baja de reversión, hacen que sean
fáciles de aislar por los marcadores de resistencia
a antibióticos. Estos producen una interrupción en
la transcripción.
3.Mutaciones puntuales en lugares específicos del ADN:
 Por bisulfito: puede convertir un residuo citosina
del ADN monocatenario en un residuo uracilo ya que el
bisulfito sódico en el ADN origina la deaminación de
la citosina que después va a llevar a la transición
de GC a AT.
 Análogos de nucleótidos: pueden ser incorporados in
vitro en el ARN o en el ADN utilizando una enzima
que replicará el ácido nucleico de una forma
sincrónica. Incluyen a: N4-hidroxicitidina trifosfato
(N4-hidroxi-CTP) o N4-hidroxidesoxicitidina
trifosfato (N4-hidroxi-dCTP). La N4-hidroxicitosina
conduce a la formación de transiciones: de GC a AT
después de ser incorporada en una ronda de la
síntesis de ADN tanto con G como con A.
4.Mutagénesis con oligonucleótidos: para esto primero se
clona el gen deseado en un vector de ADN monocatenario
como el bacteriófago M13 y se después se le añade al
 sistema un oligonucleótido sintético de 15 a 100 bases
que contenga una secuencia complementaria a la región
de interés pero con una base que no aparece.

RESULTADOS DE LAS MUTACIONES ESPONTÁNEAS E INDUCIDAS

 Mutación en el genoma: causa cambios en el número de

cromosomas.
 Mutaciones en el cromosoma: pueden cambiar el orden de
los genes dentro del cromosoma, ejemplo: por delección,
deficiencia, inversión, duplicación o traslocación.
 Mutaciones puntuales o en los genes : pueden resultar
de cambios en la secuencia de bases dentro de un gen.
Sobre esto es lo que más existe. Estas generalmente
pueden revertir. Son las que más se utilizan para la
mejora de las cepas microbianas. Comprende:
Transiciones : cambio de una purina por otra o de una
pirimidina por otra pirimidina.
Transversiones : Substitución de una pirimidina por
una purina o viceversa.

 Mutaciones por desplazamiento de lectura: cuando un

nucleótido o más se insertan o se deleccionan alterando
el marco de lectura en la transcripción o traducción.
MUTACIÓN POR INSERCIÓN (MARCO DE LECTURA ALTERADO)
A T G C C T G G T T A T
T A C G C A C C A A T A

ADN NORMAL
A T G C C T G T T A T G
T A C G G A C A A T A C

MUTACIÓN POR DELECCIÓN (MARCO DE LECTURA ALTERADO)

A T G C C G T T A T G A
T A C G G C A A T A C T

MECANISMOS DE REACCIÓN DE LOS MUTÁGENOS:

1.MUTAGÉNESIS MEDIANTE RADIACIÓN:
 Luz ultravioleta de longitud de onda corta: tiene
efectividad entre 200 y 300 nm con un óptimo a 254 nm
que es la adsorción máxima del ADN. Los dímeros
importantes que forma son: timina-timina, timina-
citosina y citosina-citosina; esto entre pirimidinas
adyacentes o entre las de cadenas complementarias
(esto último origina entrecruzamientos). También
causa transiciones GC a AT (principalmente)
transversiones, mutaciones por cambio de marco de
lectura y delecciones. Intervienen todos los sistemas
de reparación que se conocen para las mutaciones que
causa a excepción de la reparación adaptativa. Su
frecuencia de mutaciones es aumentado impidiendo los
 mecanismos de fotorreactivación y reparación por
escisión que se puede hacer llevando a cabo todas las
manipulaciones bajo luz visible de longitud de onda
larga (600nm) y/o mediante el uso de cafeína o
inhibidores similares de la reparación.
 Luz ultravioleta de longitud de onda larga: para
longitudes de onda de 300-400 nm produce menos efecto
pero sóla; si es con presencia de colorantes que
interaccionan con el ADN se produce mayor frecuencia
de mutación y mayores velocidades de muerte.
Derivados del Psoralen como el 8-metoxipsoralen al
intercalarse en los pares de bases de ADN bicatenario
forma un aducto entre el 8-metoxipsoralen y una
pirimidina, luego por absorción de un segundo fotón
origina el acoplamiento del pirimidin psoralen
monoaducto con una pirimidina adicional, esto origina
viaductos entre cadenas complementarias de ácido
nucleico que origina entrecruzamiento. Estas lesiones
no son fotorreactivadas si son reparadas por escisión
reparación de nucleótidos conjuntamente con el de
reparación SOS que origina mutaciones.
 Radiaciones ionizantes: incluyen a los rayos X, ,
y  que actúan causando ionización del medio a
través del que pasan. Se utilizan generalmente cuando
no pueden ser utilizados otros mutágenos (ejemplo:
material celular impenetrable a los rayos
ultravioleta). Producen rupturas simples y dobles con
alta probabilidad. En alto porcentaje 90% se reparan
por escisión de nucleótidos. Las rupturas de la
doble cadena que origina dan lugar a cambios
 estructurales como translocaciones, inversiones o
mutaciones cromosomales similares por lo cual no es
preferido en el desarrollo industrial de cepas.

2. MUTAGÉNESIS CON AGENTES QUÍMICOS:

 Productos químicos que afectan el ADN en ausencia de
replicación:

Acido nitroso (HNO2): Deamina la adenina a

hipoxantina y la citosina a uracilo, luego la
hipoxantina aparea con citosina, uracilo con
adenina, lo cual provoca transiciones AT a GC y/o
GC a AT.
Provoca además de mutaciones puntuales (que son
frecuentes) delecciones.
Los productos de deaminación pueden ser eliminados
por mecanismos de escisión y reparación.
El nitrito induce además entrecruzamiento entre
cadenas complementarias.

Hidroxilamina (NH2OH): reacciona con las pirimidinas

pero sólo es mutágena con la citosina, en la que el
grupo amino es reemplazado con un grupo
hidroxilamino. El derivado que produce muestra
tautomerización y aparea entonces con adenina, y
entonces esto lleva a transiciones de GC a AT .

Agentes alquilantes: son los mutágenos más potentes

a excepción de la LUV. Para efecto prácticos.
Involucra compuestos como: etilmetanosulfonato (EMS),
metil metano sulfonato (MMS), dietilsulfato (DES),
 diepoxibutano (DEB), N-metil-N-Nitro-N-
nitrosoguanidina (NTG), N-metil-N-nitroso-urea y gas
mostaza. Producen transiciones, transversiones,
delecciones y mutaciones por cambio de lectura.
Presentan a la O6-alquilguanina y la O4-alquiltimina
como las lesiones premutacionales más importantes
produciendo errores de apareamiento principalmente
transiciones: de AT a GC o viceversa.

N-metil-N-nitro-nitrosoguanidina (NTG): Es un
mutágeno químico efectivo pero difícil de usar por
efectos carcinogénicos. La mayoría de sus mutaciones,
90%, son transiciones: GC a AT, en pequeño grado
delecciones y corrimientos de lectura como resultado
de la delección de pares de GC. El mecanismo exacto
de reacción no es conocido.

 Análogos de bases: presentan similitud estructural

con los nucleótidos. Los análogos 5-bromouracilo
(BU) o la 2-aminopurina (AP) se incorporan en el ADN
que se replica en lugar de las bases
correspondientes adenina y timina. Los análogos
tautomerizan más frecuentemente que las bases
naturales: BU en forma ceto aparea con adenina,
mientras que BU en forma enol aparea con guanina. Si
la forma ceto de BU se incorpora, existe una
transición de AT a GC causada por la
tautomerización; si tiene lugar la incorporación en
la forma enol se produce una transición de GC a AT.
Estos mutágenos son considerados de poco valor
 práctico por una serie de características que se
necesitaría en el proceso, lo que hace costoso.
 Mutágenos que originan corrimientos de lectura:
incluyen a las acridinas como la naranja de
acridina, la proflavina, y la acriflavina. Su
acción es intercalándose en la molécula de DNA para
dar inserciónes y delecciónes, que producirán
errores que originan la formación de proteínas
defectivas o la ausencia de proteína. Las acridinas
es útil en investigación pero no para desarrollo de
cepas. Son fuertes mutágenos en bacteriofagos T2, T4
pero con poco o ningún efecto en bacterias.

3.MÉTODOS ADICIONALES DE MUTAGÉNESIS:

 Genes mutadores: Involucra el uso de un gen mutador
que puede aumentar la frecuencia de mutación en un
factor de 100 . La causa de este efecto es que se
crea un ADN polimerasa con tendencia a error que
produce frecuentes errores al copiar el molde, lo
que resulta o en transiciones, o en transversiones
dependiendo del gen mutador. Por su alta velocidad de
mutación puede presentar dificultades en el manejo de
cepas para producción industrial.
 Elementos-IS, transposones, y bacteriófago Mu:
actuan destruyendo la función del gen en el que se
integran. Los genes se transcriben escasamente o
nada en absoluto probablemente debido al bloqueo de
la síntesis del ARNm
MECANISMOS DE REPARACIÓN DE LAS CÉLULAS FRENTE A LAS
MUTACIONES:

1.Se presentan cuando se producen por mutación en el

ADN los siguientes cambios estructurales:
 Dímeros de pirimidina: dos pirimidinas adyacentes
sobre una cadena de ADN se acoplan mediante
enlaces covalente adicionales, perdiendo su
capacidad de aparear.
 Cambios químicos de bases únicas: por
alquilaciones, deaminaciones que causan cambios en
propiedades de apareamiento del ADN.
 Entrecruzamientos entre las cadenas
complementarias del ADN: impiden su separación
durante la replicación.
 Intercalamiento de agentes mutagénicos en el ADN:
causan mutaciones por desplazamiento de lectura.
 Ruptura de cadena sencilla.
 Rupturas de la doble cadena.

2. Los mecanismos de reparación considerados son:

A. Fotorreactivación: es aplicado para ADN
monocatenario. Se da para eliminar los dímeros
de timina que se producen cuando se irradia las
células con L.U.V. (de longitud de onda corta de
254 nm). Esta eliminación se produce cuando las
poblaciones celulares irradiadas con luz U.V.
son expuestas subsecuentemente a la luz visible
de una longitud de onda de 300 a 450 nm, que
hace que se active una enzima de
 fotorreactivación que corta los dímeros de
timina. Este mecanismo también se presenta para
eliminar entrecruzamientos del ADN inducidos por
L.U.V.
B. Escisión reparación: Es aplicado para ADN
bicatenario. Son reparaciones que se dan en la
oscuridad por endonucleasas específicas para
determinado tipo de daño. Es impedida esta
reparación parcialmente mediante inhibidores
como la cafeína, la acriflavina, y el 8-
metoxipsoralen. Comprende :

 Escisión reparación de las lesiones inducidas

por la L.U.V.: Se da por mecanismo de
reparación por escisión de nucleótidos: los
nucleótidos defectivos son cortados y
reemplazados.
 Escisión reparación del ADN alquilado y
deaminado: funciona reconociendo y cortando las
bases modificadas.

C. Reparación post-replicativa de la recombinación:

se produce llenando el espacio u orificio que
queda en la cadena hija, posterior a la
replicación, con material de la cadenas
parentales mediante el proceso de recombinación;
y reparando a las cadenas parentales con ADN
polimerasa I utilizando las cadenas hijas como
molde.
D. Reparación SOS: es un método de reparación pero
que favorece el error; a diferencia de la
 fotorreactivación, reparación de la escisión, y
de la recombinación post-replicativa que
generalmente están libres de error. Es un
sistema inducible que está reprimida en células
de tipo silvestre no tratadas. Por este
mecanismo se rellenan orificios que solapan en
el ADN pese a la ausencia de molde pero la
información hereditaria queda defectiva por lo
que se dice que este mecanismo da lugar a
mutaciones. Son inductores del mecanismo de
reparación SOS la luz U.V. y el antibiótico
mitomicina C (que causa inhibición de la
replicación).
E. Reparación adaptativa: se produce después de
largos tratamientos con concentraciones
subletales de aquellos agentes mutágenos que en
altas dosis producen efectos mutagénicos o
letales. Conlleva a resistencia al agente
mutágeno. Esto no se da para la luz U.V.

EXPRESIÓN FENOTÍPICA DE LAS MUTACIONES:

 Muchas obedecen a un patrón recesivo (para la formación
de metabolitos).
 La expresión en mutaciones recesivas se da después de
una etapa adicional de crecimiento (después de más de
una etapa de reproducción).
 La expresión puede darse de una manera retrasada no
debida directamente al resultado de efectos genéticos,
ejemplo: las mutaciones que producen cambios en los
 ribosomas o mutaciones que dan lugar a la pérdida de
receptores de superficie (como en el desarrollo de
resistencia a bacteriófagos).

OPTIMIZACIÓN DE LA MUTAGÉNESIS:
Se basa en que el efecto de un mutágeno sobre un gen
específico o el efecto de una mutación sobre un proceso
complejo, como la biosíntesis de un metabolito
secundario, nunca puede ser predicho.

En la optimización se tiene en cuenta:

 La secuencia de bases del gen que va a ser mutado:
esto debido a que existen áreas con alta frecuencia de
mutagénesis denominadas zonas calientes.
 El sistema de reparación de la célula: en aquellos
con mecanismos de reparación parcialmente defectivos
los organismos pueden morir sin que se hayan inducido
mutaciones.
 Las mutaciones supresoras: que es una segunda mutación
que ayuda a restaurar al menos parcialmente la
actividad de un gen que se ha perdido por mutación.
Existen supresores intragénicos (actúan en el mismo
gen) y supresores extragénicos ( actúan en otro gen).
 Las condiciones de tratamiento: factores tales como
pH, composición del tampón, concentración del mutágeno,
tiempo de exposición, temperatura y fase de crecimiento
del organismo pueden afectar fuertemente la eficiencia
del proceso.