Anda di halaman 1dari 8

PEWARNAAN GRAM

A. Tujuan Percobaan
- Memahami dan dapat melakukan percobaan dan interpresikan hasil untuk membedakan mikroba
menjadi dua golongan yaitu Gram positif dan Gram negatif.

B. Teori Dasar
Pengamatan bentuk dan ukuran sel bakteri akan tampak jelas jika dilakukan pewarnaan
terhadap sel. Metode pewarnaan sel bakteri ini pertama kali dikembangkan oleh Christian Gram
pada tahun 1884 yaitu seorang ahli bakteriologi Denmark. Dia mengembangkan prosedur
pewarnaan ini selagi mencari suatu metode untuk memperlihatkan bakteri pneumokokus pada
jaringan paru-paru pasien yang mati karena pneumonia. Selain itu dia melihat bahwa beberapa
spesies bakteri dapat dibedakan dengan prosedur pewarnaan ini.
Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan diferensial yang membedakan bakteri dalam dua
kelompok yaitu bakteri Gram positif yang mengikat zat warna pertama dan bakteri Gram negatif
yang melepas zat warna pertama dan mengikat zat warna kedua. Ada dua teknik untuk
membakukan prosedur warna Gram yang hasilnya setara ialah teknik Hucker dan teknik Burke.
Teknik Burke dikenakan pada sel bakteri yang telah difiksasi, hasil pewarnaan pada bakteri
Gram positif berwarna ungu, sedangkan pada bakteri Gram negatif berwarna merah.
Hubungan bakteri dengan zat pewarna basa yang menonjol disebabkan terutama oleh adanya
asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi, jika bakteri itu diwarnai, muatan
negatif dalam asam nukleat bakteri bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa. Kristal violet,
fuchsin, dan birumetilen adalah beberapa zat pewarna basa yang lazim dipakai. Sebaliknya zat
pewarna asam ditolak oleh muatan negatif bakteri menyeluruh. Jadi, mewarnai olesan bakteri
dengan zat pewarna asam menghasilkan hanya pewarnaan pada daerah latar belakang saja.
Karena sel bakteri tak berwarna di atas latar belakang yang berwarna, teknik ini sangat berguna
untuk mengamati bentuk keseluruhan sel yang sangat kecil. Proses pewarnaan ini disebut
pewarnaan negatif.

Perbedaan tebal tipisnya struktur peptidoglikan menentukan mekanisme yang spesifik


terhadap penyerapan zat warna. Sifat ini dipergunakan untuk membantu identifikasi suatu
bakteri, sehingga dikenal adanya bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif.

Bakteri Gram positif yaitu bakteri yang bila diwarnai dengan kristal ungu atau yodium lalu
dicuci dengan alkohol akan tetap mempertahankan warna ungu setelah pewarnaan. Hal ini terjadi
karena bakteri Gram positif mempunyai lapisan peptidoglikan yang lebih tebal. Bakteri Gram
negatif yaitu kebalikan Gram positif, di mana bakteri tersebut akan kehilangan warna ungunya
setelah dicuci dikarenakan peptidoglikan Gram negatif lebih tipis dan jika dicuci dengan alkohol
akan berubah warna menjadi merah.
Bentuk dasar bakteri terdiri atas; bentuk bulat (kokus), batang (basil), dan spiral (spirilia)
serta terdapat bentuk antara kokus dan basil yang disebut kokobasil. Staphylococcus aureus
adalah bakteri Gram positif, kokus anaerobic fakultatif, katalase positif dan oksidase negatif. Di
bawah mikroskop bakteri ini terlihat seperti gerombolan anggur. Escherichia coli adalah bakteri
berbentuk batang (basil), anaerob fakultatif (dapat melakukan fermentasi ketika tidak ada
oksigen, dan bisa melakukan respirasi selular secara aerob bila ada oksigen.), Gram negatif, dan
non-spora. Bakteri ini memfermentasi laktosa, katalase positif, oksidase-negatif, dan indol
positif.

C. Alat dan Bahan


I. Alat
- Mikroskop
- Kaca Objek
- Ose bundar
- Kertas lensa
- Pinset
- Bunsen

II. Bahan
- Biakan agar miring bakteri :
o Staphylococcuc aureus
o Escherichia coli
- Perekasi pewarna gram
- Oli imersi
- Aquadest

D. Prosedur Percobaan
Kaca objek dibersihkan dengan alkohol hingga bebas lemak, kemudian diflambir dan diberi
tanda nama bakteri pada bagian bawah kaca objek. Kemudian dibuat preparat dari biakan bakteri
yang akan diwarnai dengan cara:
- 1 tetes suspensi diletakkan pada kaca objek lalu disebarkan setipis mungkin dengan membentuk
lingkaran dengan diameter 1cm
- Lalu dikeringkan dengan cara dihangatkan di atas api bunsen (fiksasi),
- Kemudian preparat siap diwarnai.
Preparat ditetesi dengan Kristal violet lalu didiamkan selama 1 menit. Sisa zat warna
dibuang, kemudian dibilas dengan lugol lalu tutup preparat dengan lugol dan didiamkan selama
30 detik. Larutan lugol dibuang lalu preparat ditetesi alkohol 96% tetes demi tetes sampai bilasan
alkohol terakhir tetap jernih. Preparat dicuci dengan aquadest dan diwarnai dengan zat warna
Fuchsin selama kurang lebih 30 detik lalu bilas dengan aquadest kemudian dibiarkan kering.
Amati di bawah mikroskop dengan pembesaran lensa objektif 100x memakai oli imersi
kemudian catat warna, susunan dan bentuk bakteri yang di dapat.

E. Data Pengamatan
Staphylococcuc aureus + Kristal violet → Bakteri jadi warna ungu, dibilas dengan lugol →
Bakteri tetap warna ungu, ditetesi alkohol dan dibilas dengan aquadest → Bakteri tetap warna
ungu, diwarnai dengan zat warna Fuchsin → Bakteri tetap warna ungu, dibilas dengan aquadest
→ Hasil akhir warna bakteri tetap ungu

Escherichia coli + Kristal violet → Bakteri jadi warna ungu, dibilas dengan lugol → Bakteri
tetap warna ungu, ditetesi alkohol dan dibilas dengan aquadest → Warna bakteri jadi luntur,
diwarnai zat warna Fuchsin → Bakteri berubah jadi warna merah, dibilas dengan aquadest →
Hasil akhir warna bakteri berwarna merah.

Pengamatan Staphylococcus aureus Escherichia coli

Warna Akhir Warna Ungu (Gram positif) Warna Merah (Gram negatif)
Bentuk Bakteri Coccus (bulat) Basil (batang)
Susunan Bakteri Menggunung dan berkelompok Berantai dan menyebar

← Gambar Bakteri Staphylococcus


aureus, di bawah mikroskop
← Gambar Bakteri Escherichia coli, di
bawah mikroskop

F. Pembahasan
Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop,
memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri
seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada
bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya.
Pada praktikum ini proses pewarnaan Gram, mula-mula kaca objek dibersihkan
menggunakan alkohol. Pembersihan ini dilakukan supaya kaca objek bebas lemak dan debu.
Setelah dibersihkan, kemudian kaca objek diflambir. Kultur bakteri murni (Staphylococcus
aureus dan Escherichia coli) diambil dan diratakan setipis mungkin di atas kaca objek yang
bersih sampai kira-kira membentuk lingkaran dengan diameter 1 cm. Dalam pengambilan kultur
bakteri ini tidak diambil terlalu banyak karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan
apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan
mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas. Apabila sudah merata,
kemudian dikeringkan dengan cara dilakukan fiksasi yaitu dengan melewatkan kaca objek di atas
nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca objek sehingga
olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam
proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api.
Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan kristal violet dan dibiarkan selama satu
menit. Kemudian dicuci dengan aquadest dan dibiarkan sampai kering (dengan cara dianginkan).
Pencucian ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari violet kristal. Setelah
kelebihan zat warna dicuci dengan aquadest kemudian dibilas dengan larutan lugol dan dibiarkan
selama 30 detik sehingga terbentuk suatu kompleks antara violet kristal dan lugol. Olesan bakteri
kemudian dicuci kembali dengan aquadest mengalir. Kemudian preparat ditetesi dengan alkohol
96%, tetes demi tetes sampai bilasan alkohol terakhir jernih dan dicuci kembali dengan aquadest
mengalir. Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan zat warna fuchsin selama 30 detik.
Kemudian dicuci dengan aquadest mengalir, dibiarkan hingga kering dan kaca objek ditutup.
Setelah olesan kering kemudian diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran kaca lensa
objektif 100x. Pada kaca objek yang berisi biakan murni Staphylococcus aureus ternyata warna
tetap tidak luntur dan tetap berwarna ungu dan setelah ditambah zat warna Fuchsin warna tetap
ungu, sedangkan pada biakan murni Escherichia coli warna menjadi luntur dan hilang sama
sekali tetapi setelah ditambah zat pewarna Fuchsin menjadi warna merah.
Berdasarkan hasil pengamatan tersebut Staphylococcuc aureus merupakan bakteri Gram
positif sedangkan Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif. Pemberian kristal violet
pada bakteri Gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap
mekanisme pewarnaan gram pada bakteri menurut Pelczar & Chan (1986) adalah didasarkan
pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri Gram positif mengandung protein dan
Gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis.
Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid
sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Zat warna Fuchsin masuk ke dalam sel dan
menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri Gram negatif sedangkan pada bakteri
Gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya
rembes dinding sel dan membran menurun sehingga zat warna Fuchsin tidak dapat masuk
sehingga sel berwarna ungu.
Perbedaan dasar antara bakteri Gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding
selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme
Gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme Gram negatif dengan
pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri Gram positif memiliki membran
tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri Gram negatif
lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
Staphylococcus aureus pada pewarnaan gram menghasilkan warna ungu sehingga termasuk
bakteri Gram positif. Bakteri ini berbentuk coccus. Koloninya tersusun berkelompok dan
menggunung seperti buah anggur. Perananya adalah dapat menghasilkan racun sebagai penyebab
sindrom trauma yang diderita oleh pria, wanita dan anak-anak. Sindrom racun trauma tersebut
berupa kejang, pingsan, turunnnya tekanan darah. Dinding sel bakteri Gram positif terdiri dari
lapisan peptidoglikan yang tebal dan ketika ditambahkan pewarnaan kristal violet maka dinding
sel bakteri Gram positif akan menyerap apa bila diberi alkohol dan pada Gram positif akan tetap
berwarna ungu walaupun diberi zat warna kedua, karena dinding selnya tersusun oleh lapisan
peptidoglikan yang tebal sehingga tidak dapat dicuci oleh alkohol.
Escherichia coli pada pewarnaan gram menghasilkan warna merah sehingga termasuk
bakteri Gram negatif. Bakteri Escherichia coli berbentuk basil (batang) yang pendek. Koloninya
tersusun seperti rantai memanjang. Pada bakteri ini tidak ditemukan endospora. Menurut
Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam family Entero bacteraceae yang
termasuk Gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. Escherichia coli hidup dalam
jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan
melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari Escherichia coli
merupakan pathogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan
serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan
limbah di air, indicator pada level pencemaran air serta mendeteksi pathogen pada feses manusia
yang disebabkan oleh Salmonella typhi. Dinding sel bakteri Gram negatif mempunyai kandungan
lipid yang tebal dan ketika ditambahkan pewarnaan kristal violet maka dinding sel bakteri Gram
negatif akan menyerap zat warna tersebut namun ketika diberi alkohol, kristal violet pada Gram
negatif jadi luntur disebabkan struktur dinding selnya yang sebagian besar tersususun oleh lipid,
sehingga ketika diberi zat warna kedua dinding sel bakteri Gram negatif akan menyerapnya
kembali sehingga hasil pewarnaan bakteri Gram negatif berwarna merah.

G. Kesimpulan
- Bakteri Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif, berubah warna menjadi warna merah
- Bakteri Staphylococcus aureus adalah bakteri Gram positif, menghasilkan warna ungu
- Bentuk bakteri Escherichia coli adalah basil (batang) yang tersusun berantai
- Bentuk bakteri Staphylococcus aureus adalah coccus (bulat) yang menggunung seperti buah
anggur

DAFTAR PUSTAKA
- Dwijoseputro. 1981. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Surabaya: Djambatan

- Pelczar Jr, M. J dan E. C. S. Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI-Press

- Fardiaz, Srikandi. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Jakarta: Gramedia Pustaka

- Sutedjo, M. 1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta: Rineka Cipta

- Tjitrosomo. 1982. Dunia Mikroba. Jakarta: Bharata Karya

- http://www.scribd.com/doc/27159878/Pewarnaan-Gram

- http://www.scribd.com/doc/22654811/Pewarnaan-Gram-Adel

- http://www.docstoc.com/docs/37899305/mikroba