UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE NICARAGUA

UNAN-MANAGUA

FACULTAD: CIENCIAS MEDICAS

CARRERA: MEDICINA

DEPARTAMENTO: MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA

ASIGNATURA: INMUNOGENETICA

UNIDAD 6:
DIAGNÓSTICO GENÉTICO
AÑO ACADEMICO 2017

PROFESOR: DRA. ANAGABRIELA DUARTE DÁVILA.

 OBJETIVOS
• Mencionar los métodos diagnóstico más utilizados en
genética médica
• Explicar el fundamento y la técnica de los métodos
diagnósticos .
• Exponer los conocimientos de genética básica para la
interpretación de resultados de laboratorio.
• Debatir las indicaciones de las pruebas de laboratorio.
• Interpretar los resultados obtenidos en las pruebas de
laboratorio .
• Valoración de la importancia de los conocimientos en genética
médica para la interpretación de los resultados de laboratorio.
 SUMARIO
• Historia clínica
• Técnicas de diagnóstico prenatal
• Análisis pedigree
• Estudios citogenéticos: Cariotipo, bandeo.
Fluorescencia en hibridación in situ
• Análisis de ADN
• Análisis bioquímico
• Tendencias diagnósticas
 APLICACIONES DIAGNÓSTICO
GENÉTICO
• Diagnóstico de portadores de enfermedades
recesivas.
• Diagnóstico pre-sintomático de enfermedades
de inicio tardío.
• Diagnóstico asintomático de enfermedad con
penetrancia reducida.
• Diagnóstico prenatal
• Test preimplantación.
HISTORIA CLÍNICA
ANÁLISIS PEDIGREE
CITOGENÉTICA
 CITOGÉNETICA
• Rama de la genética que se ocupa del estudio
de los cromosomas, su estructura y herencia,
aplicado a la práctica de la genética médica.
• Estudio de los cromosomas visualizados con el
Microscopio óptico.
 Citogenética

Molecular:
Bandeo FISH
Cariotipo
Cromosomas Cariotipo
Espectral
 CARIOTIPO
Representación gráfica de los Cromosomas.

Cromosomas son
visualizados durante la
METAFASE

Patrón cromosómico de una especie

Ordenamiento por :
expresado a través de un código, establecido
Tamaño de menor a mayor.
por convenio, que describe las características
Forma (centrómero y brazos).
de sus cromosomas.
Patrón de Banda (G: giemsa)
Total 7 Grupos.
1-22 Autosomas
X, Y Cromosomas sexuales
Siempre separados y al final
del cariotipo.
 CÓMO SE REALIZA CARIOTIPO?
1. Muestra: Sangre (leucocitos), líquido amniótico,
vellosidades, placenta o médula ósea.
2. Cultivo Celular: Suero de ternera + Fitohemaglutinina.
72 hrs a 37°C.
3. Añadir colchicina (Metafase: evita polimerización del
huso mitótico).
4. Añadir colruro de potasio para dispersarlos y evitar
que estén encimados.
5. Fijación
6. Tinción clásica: Giemsa
7. Observación bajo microscopio.
Fotografiados bajo el
microscopio para
obtener cariotipo.
 NOMENCLATURA
Cromosoma-Brazo-Región-Banda-Sub-banda

14q31.42
Cromosoma 14
Brazo q (brazo largo), Región 3,
la banda 1 y, separado por un
punto, la subbanda 4 y la
subsubbanda 2.
p: brazo corto del cromosoma.
q: brazo largo del cromosoma.
+: ganancia de un cromosoma completo.
-: pérdida de un cromosoma completo.
tel: telómero.
r( ): cromosoma en anillo. Entre paréntesis ponemos
el cromosoma involucrado.
del( )( ): deleción de. En el primer paréntesis ponemos
los cromosomas en los que se produce la deleción, y
en el segundo de dónde a dónde se produce la
deleción.
ins: inserción de.
dup: duplicación de.
inv( )( ): inversión de. En el primer paréntesis
ponemos los cromosomas en los que se produce la
inversión, y en el segundo los extremos del segmento
invertido.
t: translocación de.
i: isocromosoma, es decir, cromosoma que tiene los
dos brazos iguales ya sean dos brazos p o dos brazos
1.
.ish: cariotipo estudiado por FISH.
tri: trisomía.
trp: triplicación de una porción de un cromosoma.
 INDICACIONES CARIOTIPO
• RN con dismorfogénesis.
• Niños con retraso en el desarrollo y crecimiento.
• Individuos con ambigüedad en los genitales.
• Adolescentes sin desarrollo de caracteres
sexuales secundarios.
• Parejas con abortos a repetición.
• Parejas infértiles.
• Para diagnóstico prenatal
• Para apoyo diagnóstico padecimientos. Ej:
Leucemia.
 BANDEO CROMOSÓMICO
• Para visualizar los cromosomas en un cariotipo
deben aplicarse diferentes tinciones para que las
bandas transversales sean evidentes.
• Consiste en someter a los cromosomas a
desnaturalizaciones, a digestión enzimática o a
ambos, seguido de una tinción con colorante
específico para ADN. Esto hace que los
cromosomas se tiñan con una serie de bandas
claras y oscuras.
 Bandeo G Tripsina + Calor+ SSN+ Giemsa
BANDEO CROMOSÓMICO

Colorante fluorescente:
Bandeo Q
Quinacrina. Coincide con G

Calor+ Giemsa
Bandeo R bandas invertidas o “reverso”
respecto al bandeo G

Subgrupo bandas R en los

Bandeo T
telómeros.

Giemsa o fluorocromos
Bandeo C Heterocromatina de los
centrómeros.
Solo revelan deleciones grandes de una resolución por arriba de 4 Mb
Bandeo G: Patrón de regiones claras (G-, Bandas R) y
oscuras (G+).
Bandeo R
 Bandeo R y T.

Tiñe los genes de RNA ribosómico

situados cerca de las regiones tallo
y satélite de los cromosomas
acrocéntricos.
 HBRIDACIÓN IN SITU CON
FLUORESCENCIA (FISH)
• Un segmento específico de DNA de un
cromosoma es marcado con una etiqueta
fluorescente para crear una sonda.
• Esta es luego hidridizada con el cromosoma del
paciente y son visualizados bajo el microscopio.
• Debido a que la sonda será hidridizada solamente
con una secuencia complementaria de DNA, la
sonda marcará la presencia del segmento de
cromosoma evaluado.
• Puede usarse en interfase y metafase de la
mitosis.
Ej: Sonda específica para Cr sera hidridizada en 3
lugares en las células de una Trisomía 21.
 UTILIDAD FISH
• Esta técnica permite la rápida determinación de aneuploidías,
microdeleciones, duplicaciones, translocaciones, inversiones, así como la
adjudicación de un marcador genético a un cromosoma (cartografía
genética).
• Ej: sonda hibridiza a la región 15q correspondiente al Sd Prader Willi: una
sola señal en el paciente.
 CARIOTIPAJE ESPECTRAL
• Consiste en el uso de 5 diferentes sondas
fluorescentes que generan híbridos diferenciales
para diversos sets de cromosomas.
• Con el uso de cámaras especiales y software de
procesamiento de imágenes, esta técnica
produce un cariotipo en el cual cada cromosoma
es pintado con un diferente color.
• Permite visualizar reordenamientos como
traslocaciones.
• Ej: Cromosoma Filadelfia en LMC
 Diagnóstico
Molecular
Genético

DIRECTO INDIRECTO
Examina la Marcadores
mutación vinculados

-Detección de productos PCR

Por Electroforesis en gel -RFLPs
agarosa
-PCR-ASO
-DNA Chips
-RFLP-PCR
-Secuenciación DNA
-Southern blot
DIAGNÓSTICO GENÉTICO DIRECTO
 Detección de productos PCR
Por Electroforesis en gel agarosa
• Si la mutación cambia el tamaño del gen, esta
diferencia puede ser detectada por PCR,
amplificando el segmento de ADN en el que se
sospecha la mutación, por medio de
electroforesis en gel de agarosa.
• Ejemplo: Enfermedad de Hungtinton (gen HD:
Cr4p16.3 repetición > 36 CAG)
 Análisis del ADN: PCR
Graphic showing the excessive repetitions of the cytosine-adenine-guanine
(CAG) nucleotide sequence in a gene from a Huntington's disease patient
(bottom) compared to a gene from a person without the neurodegenerative
disorder (top).
Credit: National Institute of General Medical Sciences, National Institutes of
Health
La mutación es dominante, por lo cual los heterocigotos estaran
afectados.
Lane 1: Tío – homocigoto normal (no afectado)
Lane 2: Tía – Heterocigoto (afectado)
Lane 3: control HD mutación – solo la banda más pesada
Lane 4: control normal – solo la banda más pequeña
Lane 5: Padre - Heterocigoto (afectado)
Lane 6: John (hermano) - Heterocigoto (afectado)
Lane 7: Susan – homocigoto normal (no afectado)
Credit: Case It!: Huntington’s disease case with online role playing
 PCR y Sondas Alelo-Oligonucleótido específico
(ASO): Amplificación por PCR-Alelo específica
• Las sondas ASO son secuencias de nucleótidos
cortas que se unen específicamente a un
único alelo del gen.
• Ejemplo:
• Hemocromatosis (Mutación C282Y sustitución
codón 282 G:A)
• Anemia Drepanocítica (Mutación GAG:GTG;
Glutamato:Valina)
Unión de la sonda ASO "S" al ADN "S" (arriba) o al ADN
"A" (abajo).

Esquema de dot-blots utilizando las sondas

ASO "A" o "S".
 Análisis del ADN: PCR y ASO

Cystic Fibrosis gene (CFTR)

Souce: http://www.cram.com/flashcards/mbm-2f-recombinant-dna-1883792
 DNA-Chips
• Este enfoque implica incrustar miles de
oligonucleótidos diferentes, que representan diversas
mutaciones y secuencias normales, en un chip de
silicona.
• Regiones específicas del ADN del paciente son
amplificadas por PCR, marcado con una etiqueta
fluorescente y luego es expuesto a los oligonucleótidos
del Chip.
• Los sitios de hidridización en el chip son grabados por
una computadora.
• Ventajas: Registro computarizado y el tamaño
compacto del chip.
Análisis Polimorfismo Longitud de Fragmento de
Restricción de productos de PCR (RFLP-PCR)
• RFLP: Secuencias específicas de nucleótidos
en el ADN que son reconocidas y cortadas por
las enzimas de restricción (endonucleasas de
restricción) y que varían entre individuos.
• Se usan como marcadores para identificar
grupos particulares de personas con riesgo a
contraer ciertas enfermedades genéticas.
• Ejemplo: Enfermedad de Gaucher, Fibrosis
quística, Distrofia miotónica.
• En primer lugar se realiza una amplificación por
PCR del gen que queremos estudiar, y
posteriormente se realiza la digestión (o corte en
fragmentos) del producto amplificado con
enzimas de restricción, para ver los fragmentos
resultantes o fragmentos de restricción de ese
gen.
• Permite determinar inserciones o deleciones en
fragmentos de restricción de un gen y para
mutaciones puntuales que alteran la secuencia de
los mismos, pueden crear o hacer desaparecer
sitios de restricción en un gen que alteran el
patrón de fragmentos de restricción observados
en electroforesis.
Mujer de 16 años
Dx: Enfermedad de Gaucher
Mutación T1448C
Afecta sitio de restricción Hphl
Normal: No corta producto 150 bp
Mutado: 114 y 36 bp
 Secuenciación Directa ADN
• Secuenciación completa del gen en estudio.
• Es costoso y conlleva a un mayor tiempo.
• A veces es necesario si ningún conjunto
específico de mutaciones es responsable de la
mayoría de los casos de enfermedad.
• Ejemplo:
Cáncer de seno familiar.
 Southern Blot
• Detecta la presencia de una secuencia de ADN
• Utiliza electroforesis en gel de agarosa.
• Se usa para diagnóstico de inserciones o
deleciones.
• Ej: Prader willi, Angelman, X frágil.
DIAGNÓSTICO GENÉTICO INDIRECTO
• Si la mutación causante de la enfermedad en una
familia es desconocida, el análisis genético
indirecto puede usarse para determinar si uno de
los progenitores a transmitido la alteración a su
descendencia.
• Debe conocerse la localización del gen afectado
pero el gen por sí mismo y su función se
desconocen, o cuando el gen es conocido pero las
mutaciones son tan variadas y heterogéneas que
hacen difícil una análisis directo.
• Utiliza maracadores genéticos que están
estrechamente ligados al locus de la enfermedad.
• Los mismos utilizados en los estudios de mapeo
genético: RFLP, STRP y SNP.
• Un marcador genético es un polimorfismo del
gen o de un segmento próximo al locus génico
siendo los más utilizados los polimorfismos
debidos a dianas de restricción.

El Diagnóstico indirecto requiere el análisis familiar para

obtener el grupo de alelos correspondientes al
polimorfismo de restricción y que sirve de marcador
genético.
 STRPs Short Tandem repeat polymorphisms.
(Microsatélites o Secuencias repetidas cortas)
• Los microsatélites son segmentos cortos de
ADN de 1 a 6 pares de bases (pb), que se
repiten en tándem y de forma aleatoria en el
genoma de los seres vivos.
• Poco presente en exones. Su presencia se
asocia a enfermedades.
DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENE
H: Recesiva ligada al Cromosoma X.
Gen distrofina
Mutaciones muy variables
SNPs (single nucleotide polymorphism
o polimorfismo de nucleótido simple)
• Son la forma más sencilla y más común de polimorfismo
genético ya que consisten en el cambio de un solo nucleótido
en el contexto de una secuencia genética.
• Los SNPs por si mismos no proporcionan información sobre
genes específicos; simplemente indican una localización
cromosómica que es probable que esté estrechamente
asociada con un fenotipo dado
DIAGNÓSTICO PRENATAL
 • TRIPLE/CUADRUPLE PRUEBA
• AMNIOCENTESIS: 16 SG
• BIOPSIA VELLOSIDADES CORIÓNICAS: 10-12 SG