RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) berasal dari susunan DNA yang

terjadi karena proses evolusi, mutasi titik pada situs enzim restriksi, insersi atau delesi dalam
fragmen DNA. Dalam analisis RFLP, genomik DNA yang dipotong dengan enzim restriksi
dipisahkan melalui gel elektroforesis, dan diblot ke membrane netroselulase. Dasar dari
transfer DNA dari gel ke pensupport yang lebih solid adalah untuk mengawetkan posisi
fragmen DNA dan menyebabkan hibridisasi dapat dilakukan. Pola banding yang spesifik
divisualisasi dengan hibridisasi dengan probe yang dilabel. Probe biasanya probe lokus tunggal
yang spesies-specific berukuran 0.5 – 3kb yang diperoleh dari cDNA library atau genomik
library.

RFLP merupakan marker co-dominant. RFLP merupakan marker yang sangat dapat
dpercaya dalam analisis linkage dan breeding dan dapat ditentukan dengan mudah jika karakter
terdapat dalam bentuk homozigot atau heterozigot. Kekuatan dari marker RFLP adalah
konsistensi yang tinggi, sifat pewarisan co-dominant, dapat diulang antar laboratorium,
memberikan marker yang locus-specific, tidak memerlukan informasi sekuen, dan relative
mudah discor karena perbedaan yang besar antar fragmen. Tetapi penggunaan RFLP
memerlukan DNA dalam jumlah yang besar untuk pemotongan dengan enzim restriksi. Di
samping itu penggunaan isotop radioaktif relatif mahal dan berbahaya. Waktu yang diperlukan
juga cukup lama.

RLFP didasarkan pada polimorfisme yang muncul karena adanya basa yang mengalami
substitusi, penambahan, pengurangan dan perpindahan (translokasi) pada genom
DNA. Perubahan tersebut menyebabkan perbedaan ukuran dari fragmen restriksi yang dicerna
oleh enzim restriksi tertentu. RFLP hanya mendeteksi perbedaan-perbedaan dari fragmen
tersebut, dimana satu dengan lainnya berhubungan dengan homolognya dari probe molekuler
yang digunakan dalam hibridisasi. Probe molekuler yang digunakan untuk RFLP antara lain
probe genom DNA (yang diturunkan dari genom DNA) dan probe cDNA (yang diturunkan
dari mRNA). Kelebihan dari RFLP adalah dapat mendeteksi sifat co-dominan, artinya dapat
membedakan antara yang homosigot dan heterosigot. Selain itu kelebihan yang lain adalah
diharapkan didapatkan homologi polimorfik. Genom-genom inti dari eukariot mengandung
pengulangan urutan basa sekitar 2-15 pasang basa yang merupakan suatu motif yang tersebar
sepanjang genom yang disebut dengan dispersed repetitive DNA (drDNA) atau variable
number of tandem repeats (VNTRs). Oleh karena itu, urutan yang berulang ini dapat
digunakan sebagai probe multilokus yang mempunyai polimorfisme berbagai lokus secara
simultan.

A. Analisis Retiction Fragment Length Polymorphism (RFLP) adalah salah satu teknik
pertama yang secara luas digunakan untuk mendeteksi variasi pada tingkat sekuen DNA.
Deteksi RFLP dilakukan berdasarkan pada adanya kemungkinan untuk membandingkan
profil pita-pita yang dihasilkan setelah dilakukan pemotongan dengan enzim retriksi
terhadap DNA target.
B. Marka molekuler RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) merupakan marka
molekuler yang menggunakan enzim restriksi dalam mengidentifikasi sekuensi-sekuensi
DNA. Analisis RFLP yang merupakan marker kodominan telah banyak digunakan untuk
mencapai berbagai tujuan. Mengingat situs restriksi mempunyai sekuensi DNA tertentu,
berarti variasi keberadaan situs restriksi mencerminkan adanya variasi sekuensi DNA.
 Dengan kata lain, RFLP dapat berfungsi sebagai penduga variasi DNA. Variasi dideteksi
dalam bentuk pemotongan rangkaian panjang polimorfik (ganda) yang mana waktu
penilaian dari rangkaian variasi memungkinkan dari data fragmen itu sendiri, rangkaian
variasi yang panjang dalam suatu bagian dapat dinilai dari subtitusi nukleotida.
C. Berbagai keunggulan penerapan marker RFLP antara lain :
1. Menduga hubungan kekerabatan dari beberapa individu yang dianalisis,
2. Menduga ada tidaknya variasi genetik dari koleksi plama nutfah
3. Memonitor proses seleksi (melalui linkage) berbagai karakter
4. Memilah-milah komponen genetik dari karakter kuantitatif
5. Menganalisis gen yang berasal dari proses transformasi genetik
6. Bersifat kodominan sehinggan dapat mendeteksi adanya heterozigositas
7. Memiliki kemampuan memisahkan yang tinggi pada tingkat spesies, populasi.

D. Langkah-langkah kerja untuk mendeteksi RFLP di laboratorium meliputi :

1. Isolasi DNA
Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA.
DNA dapat ditemukan baik pada kromosom inti maupun pada organel yaitu pada
mitokondria dan kloroplas. Untuk mengekstrak DNA diperlukan langkah-langkah
laboratorium untuk memecah dinding sel dan membran inti, dan dilanjutkan dengan
pemisahan DNA dari berbagai komponen sel yang lain.
Proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya
dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi untuk mencegah DNA
rusak. Pemisahan DNA dari komponen sel yang lain, termasuk dibris sel, dilakukan
dengan sentrifugasi
2. Pemotongan dengan enzim restriksi dan elektroforesis gel
DNA hasil isolasi kemudian dipotong dengan menggunakan enzim restriksi tertentu
yang dipilh dengan hati-hati. Setiap enzim restriksi pada kondisi yang sesuai akan
mengenali dan memotong DNA sehingga dihasilkan fragmen-fragmen DNA. Fragmen-
fragmen tersebut selanjutnya di elektroforesis pada gel agarosa. Karena fragmen-
fragmen tersebut tidak akan terlihat sebagai smear berkesinambungan bila diwarnai
eteridium bromide, maka pewarnaan saja umumnya tidak dapat mendeteksi adanya
polimorfisme. Dengan demikian perlu dilakukan hibridasi dan visualisasi dilakukan
dengan Southern blotting.
 Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu
medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada
muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk
separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang
terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun
dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul
memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya
panas dari arus listrik yang digunakan.
3. Transfer DNA dengan Sothern blotting
4. Hibridisasi DNA