Anda di halaman 1dari 22

BIOTEKNOLOGI

AGEN TROMBOLITIK (ALTEPLASE)

OLEH :

IKA ANDRI PIPINURI (162200041)


KADEK ERLIN PUSPITA YANTI (162200042)
NI NYOMAN MARAYANTI UTAMI (162200043)

JURUSAN FARMASI
PROGRAM STUDI FARMASI KLINIS
INSTITUT ILMU KESEHATAN MEDIKA PERSADA
2017
BAB I
PENDAHULUAN

Bioteknologi berasal dari dua kata, yaitu 'bio' yang berarti makhuk hidup
dan 'teknologi' yang berarti cara untuk memproduksi barang atau jasa. Dari
paduan dua kata tersebut European Federation of Biotechnology mendefinisikan
bioteknologi sebagai perpaduan dari ilmu pengetahuan alam dan ilmu rekayasa
yang bertujuan meningkatkan aplikasi organisme hidup, sel, bagian dari
organisme hidup, dan/atau analog molekuler untuk menghasilkan produk dan jasa.
Pada umumnya bioteknologi dibedakan menjadi bioteknologi tradisional dan
modern. Bioteknologi tradisional adalah bioteknologi yang memanfaatkan
mikrobia (organisme) untuk memodifikasi bahan dan dan lingkungan untuk
memperoleh produk optimal. Misalnya pembuatan tempe, tape, roti, pengomposan
sampah. Sedangkan bioteknologi modern dilakukan melalui pemanfaatan
ketrampilan manusia dalam melakukan manipulasi makhluk hidup agar dapat
digunakan untuk menghasilkan produk sesuai yang diinginkan manusia. Misalnya
melalui teknik rekayasa genetik. Rekayasa genetik merupakan teknik untuk
menghasilkan molekul DNA yang berisi gen baru yang diinginkan atau kombinasi
gen-gen baru atau dapat dikatakan sebagai manipulasi organisme (Nurcahyo,
2011).
Bioteknologi modern tidak terlepas dengan aplikasi metode-metode
mutakhir bioteknologi (current methods of biotecnology) seperti (Nurcahyo,
2011):
1. Kultur jaringan merupakan suatu metode untuk memperbanyak jaringan/sel
yang berasal atau yang didapat dari jaringan orisinal tumbuhan atau hewan
setelah terlebih dahulu mengalami pemisahan (disagregasi) secara mekanis,
atau kimiawi (enzimatis) secara in vitro (dalam tabung kaca).
2. Teknologi DNA rekombinan (recombinant DNA technology) adalah suatu
metode untuk merekayasa genetik dengan cara menyisipkan (insert) gen yang
dikehendaki ke dalam suatu organisme. Transgenik adalah suatu metode
untuk. Rekayasa protein (protein engineering).
3. Hibridoma adalah suatu metode untuk menggabungkan dua macam sel
eukariot dengan tujuan mendapatkan sel hibrid yang memiliki kemampuan
kedua sel induknya.
4. Kloning adalah suatu metode untuk menghasilkan keturunan yang
dikehendaki sama persis dengan induknya.
5. Polymerase chains reaction (PCR) merupakan metode yang sangat sensitif
untuk mendeteksi dan menganalisis sekuen asam nukleat. RT-PCR untuk
memperbanyak (amplifikasi) rantai RNA menjadi DNA; tissue/cells →
extracted → RNA/mRNA → rT-PCR → copy DNA (cDNA).
6. Hibridisasi DNA adalah metode untuk menyeleksi sekuen DNA dengan
menggunakan probes DNA untuk hibridisasi (pencangkokan) rantai DNA
Pita ganda.
Munculnya teknologi DNA rekombinan (rDNA) dan penggunaannya di
industri farmasi telah membawa pertumbuhan pesat bagi perusahaan bioteknologi
dan sejumlah produk rDNA terapeutik tersedia untuk manusia. Teknologi
rekombinan DNA (rDNA) telah membuat dampak revolusioner di bidang
perawatan kesehatan manusia dengan memungkinkan produksi massal produk
ekspresi rDNA yang aman, murni dan efektif. Saat ini, beberapa kategori produk
rDNA, yaitu hormon, faktor pertumbuhan haemopoietik, produk koagulasi darah,
agen trombolitik, antikoagulan, interferon, interleukin dan enzim terapeutik
diproduksi dengan menggunakan teknologi rDNA (Bhopale and Nanda, 2005).
Terapi trombolitik juga dikenal sebagai obat penghilang bekuan darah.
Telah digunakan di daerah klinis untuk mengobati keluhan tromboemboli vena
dan arterial yang merupakan penyebab utama kematian. Pada tahun 1761,
Morgagni memimpin jalan terapi trombolitik. Agen trombolitik biasanya
digunakan untuk trombosis vena, emboli paru, infark miokard, tromboemboli
arteri dan stroke iskemik akut. Karena alasan tersebut berbagai jenis obat
trombolitik saat ini tersedia di pasaran: alteplase, anistreplase, urokinase,
streptokinase, tenecteplase, dan sebagainya (Ali et al., 2014).
Tabel 1. Klasifikasi Agen Trombolitik (Ali et al., 2014)
BAB II
PEMBAHASAN

2.1 Alteplase
Alteplase atau Tissue plasminogen activator (tPA) merupakan salah
satu agen trombolitik. T-PA adalah protease serin yang berperan dalam
fibrinolisis yang mengubah plasminogen menjadi plasmin. Mekanismenya
dengan cara memecah satu rantai plasminogen menjadi dua rantai yang
dihubungkan oleh ikatan disulfida dan menghasilkan senyawa yang
disebut plasmin.
Tissue plasminogen activator merupakan protein manusia terdiri dari
527 residu asam amino, termasuk 35 residu sistein yang masuk pembentukan
17 ikatan disulfida. Human tissue plasminogen activator berisi lima domain
struktural yang berbeda (Hua, 1997).

Gambar 1. Gen Tissue Plasminogen Activator

Tissue plasminogen activator (tPA) yang juga dikenal sebagai


fibrinokinase ini disintesis terutama pada sel endotel vaskular (sel-sel yang
melapisi bagian dalam pembuluh darah). Berikut merupakan diagram
skematik dari alteplase:

Gambar 2. Diagram Skematik Alteplase

Dalam alteplase terdapat lima domain utama, diantaranya finger (F),


growth factor (GF), kringle 1(K1), kringle 2 (K2) and protease (P) (Longstaff
and Thelwell, 2005). T-PA menampilkan empat potensi situs glikosilasi, tiga
di antaranya adalah glikosilasi (residu 117, 184 dan 448). Gugus karbohidrat
memainkan peran penting dalam menengahi hepatik penyerapan tPA. Hal ini
biasanya ditemukan dalam darah dalam dua bentuk: satu rantai polipeptida
(tipe I tPA) dan struktur dua rantai (tipe II), proteolitik berasal dari struktur
rantai tunggal (Walsh, 2003).
Meskipun tPA pertama dipelajari di akhir 1940-an, namun karakterisasi
luas masih terhambat oleh rendahnya tingkat di mana tPA tersebut disintesis.
Studi rinci difasilitasi pada tahun 1980 setelah penemuan bahwa garis sel
melanoma Bowes menghasilkan dan mengeluarkan sejumlah besar protein
ini. Ini juga memfasilitasi penilaian klinis awal. Gen tPA kloning dari sel
melanoma pada tahun 1983, dan difasilitasi produksi dalam skala besar
berikutnya dalam baris sel CHO oleh teknologi DNA rekombinan. TPA
cDNA berisi 2530 nukleotida dan mengkode protein matang 527 asam amino.
Pola glikosilasi serupa, meskipun tidak sama dengan molekul manusia asli.
Lisensi pemasaran untuk produk pertama dikeluarkan di Amerika Serikat
untuk Ge-nentech pada tahun 1987 (di bawah nama dagang Alteplase).
Indikasi terapi adalah untuk pengobatan infark miokard akut. Memerlukan
proses produksi awal (10 000 l) langkah fermentasi, dimana kultur sel CHO
menghasilkan dan mengeluarkan tPA ke media fermentasi. Setelah
pengangkatan sel oleh filtrasi sub mikrometer dan konsentrasi awal, produk
dimurnikan oleh kombinasi dari beberapa langkah kromatografi. Produk akhir
telah ditunjukkan untuk menjadi lebih besar dari 99 % murni oleh beberapa
penelitian analitis teknik, termasuk HPLC, SDS-PAGE, tryptic mapping dan
sekuensing N-terminal (Walsh, 2003).
Alteplase telah terbukti efektif dalam pengobatan awal pasien dengan
infark miokard akut (yaitu mereka diperlakukan dalam jarak 12 jam setelah
gejala pertama terjadi). Secara signifikan meningkatkan tingkat kelangsungan
hidup pasien (diukur 1 hari dan 30 hari setelah perlakuan awal). tPA
menempatkan dirinya sebagai pilihan lini pertama dalam pengelolaan infark
miokard akut. Dosis terapi 90-100 mg (sering diberikan melalui infus lebih
dari 90 menit), alteplase 3-4 mg selama periode tersebut. Namun, produk ini
dibersihkan dengan cepat oleh hati, menampilkan waktu paruh serum sekitar
3 menit. Seperti halnya untuk agen trombolitik, risiko yang paling signifikan
terkait dengan administrasi tPA adalah kemungkinan terjadinya perdarahan
berat (Walsh, 2003).

2.2 Up Stream Process


a. Host
Sistem ekspresi mamalia menghasilkan protein yang dilipat dan
dirakit dengan benar, dan mampu melakukan modifikasi pasca translasi
seperti glikosilasi, fosforilasi dan jembatan disulfida. Protein rekombinan
dari sistem ekspresi mamalia biasanya lebih mirip dengan protein manusia
asli daripada sistem host lain seperti bakteri, tumbuhan, dan ragi. Namun
ada kekurangan potensial pada sistem ekspresi sel mamalia; Ini termasuk
hasil protein, yang seringkali jauh lebih rendah daripada sistem ekspresi
prokariotik, dan persyaratan nutrisi yang lebih kompleks dan kultur sel
lebih sulit tumbuh dalam skala besar (Schmidt, 2004).
Protein rekombinan kompleks yang diproduksi dalam sistem
ekspresi sel prokariotik, seperti E. coli, seringkali tidak dapat larut dan
dapat terakumulasi di sitoplasma sebagai badan inklusi. Protein dalam
badan inklusi dilipat-lipat dan oleh karena itu perlu dilarutkan kembali,
namun tetap tidak pasti apakah semua molekul proteinnya benar.
Selanjutnya protein yang diekspresikan E.coli tidak mengalami glikosilasi,
dan kekurangan banyak post-translasi untuk modifikasi (Williams, 2012).
Keuntungan mengekspresikan protein rekombinan pada E.coli
adalah hasil panen yang tinggi, kemudahan perawatan dan genetika yang
ditandai dengan baik. Sifat dari sistem ekspresi yang berbeda telah
dieksploitasi untuk menghasilkan varian tPA baru untuk memodifikasi dan
memperbaiki fungsi tPA (Williams, 2012).

b. Sumber Gen
Tissue plasminogen activator (t-PA) dimurnikan dari cairan kultur
sel melanoma manusia (Bowes, RPMI-7272). Kultur sel ini diperoleh dari
sel melanoma paru dan metastasis dari seorang pasien bernama Bowes
oleh G. Moore pada tahun 1974. Sel melanoma manusia secara aktif
mensintesis dan mensekresikan t-PA yang digunakan untuk pembuatan
poli (A) mRNA (Collen and Lijnen, 2004).

c. Mekanisme Kloning
Sel CHO 1-15 (ATCC-CRL9606) yang mengandung cDNA dari gen
tPA dibiakkan di media Ham’s F12 yang mengandung FCS 10% (Gibco,
Germany). Selanjutnya DNA genom diekstraksi menggunakan kit Nucleon
(Amersham, USA). Struktur untaian DNA primer ujung awal dan akhir
dari cDNA tPA adalah sebagai berikut: F-tPA: 5΄AAC CAT GGA TGC
AAT GAA GAG AGG GCT C-3. R-tPA: 5΄GCG GCC GCT CAC GGT
CGC ATG TTG-3’. Untaian ini dirancang berdasarkan database tPA dari
(NCBI) (aksesi no 10047). cDNA tPA diamplifikasi menggunakan Expand
Long Template PCR System (Roche, Jerman). Amplifikasi terdiri dari 25
siklus sebagai berikut: denaturasi, 94°C / 30 detik; anil, 66°C / 60 detik;
ekstensi, 68°C / 90 detik; dan akhirnya campuran reaksi ditempatkan pada
suhu 68°C selama 10 menit (Soleimani et al., 2006).
Reaksi ligasi antara produk PCR dan vektor-T pTZ57R dilakukan
dan sel E. coli Top 10F ditransformasikan. Klon rekombinan dipilih
dengan menggunakan blue-white screening dan sekuensing dilakukan
dengan menggunakan untaian M13 awal dan M13 akhir untuk memastikan
integritas urutan gen. Gen tersebut kemudian dicerna dengan
menggunakan NotI dan NcoI (Fermentas, vilnius, Lithuania) dan
disubklon pada vektor ekspresi spesifik Leishmania pFX1.4sat dan
pFX1.4hyg (Bioscience, Jena, Germany). Vektor rekombinan digunakan
untuk transformasi sel E.Fi Top 10F dan setelah pemilihan klon
rekombinan dalam media yang mengandung ampisilin, plasmidnya
diambil. Klon terpilih yang mengandung sisipan tPA dikonfirmasi dengan
menggunakan analisis PCR dan enzimatik digestion (Soleimani et al.,
2006).

d. Ekspresi Gen
Kemampuan untuk mengekspresikan protein rekombinan dalam
jumlah besar adalah salah satu manfaat yang dapat diperoleh dari kloning
cDNA. Ekspresi protein rekombinan pada dasarnya dapat diarahkan ke
tiga lokasi yaitu sitoplasma, periplasma atau media kultivasi. DNA
rekombinan yang diperoleh diekspresikan dengan vektor ekspresi spesifik
Leishmania pFX1.4sat dan pFX1.4h. Vektor ekspresi ini memiliki 5' dan 3'
urutan ribosom kecil subunit. Mereka menghasilkan transkrip tingkat
tinggi. Dengan cara ini, Transkripsi gen terjadi dengan menggunakan
RNA polimerase I (Soleimani et al., 2006).

2.3 Proses Fermentasi


Hasil yang telah diperoleh dari proses up stream dikultur dalam media
Brain Heart Infusion Broth (DIFCO, USA) ditambah dengan 15 μg / ml
hemin (Sigma, UK) streptomisin (50 μg / ml dan penisilin (50 IU / ml).
Media padat digunakan untuk memilih klon rekombinan dan koloni tunggal
pada permukaan media. Dipilih media kultur padat yang mengandung 50 μg /
ml nourseothricin dan 25 μg / ml hygromycin B (Sigma, St. Luis, USA).
Sekitar 5 μg dari setiap vektor ekspresi dicerna dan dilinierisasikan dengan
Swal (Fermentas, Vilnius, Lithuania) untuk elektroporasi. Integrasi kaset
ekspresi ke lokus ssu rRNA dikonfirmasi dengan melakukan PCR pada DNA
genomik. Untuk tujuan ini, untaian DNA primer awal gen sat dan hyg dipilih
dari vektornya dan dipilih untaian akhir dari lokus ssu rRNA dari DNA
genomik. Untuk mengevaluasi ekspresi tPA spesifik, sel rekombinan dikultur
dalam media cair BHI yang mengandung 15 μg / ml hemin pada suhu 26 ºC
(Soleimani et al., 2006).

2.4 Down Stream Process


a. Pemisahan dan Pemurnian Protein
Langkah awal dari prosedur downstream ini meliputi pemisahan
protein dari sumbernya. Sebagian besar hal ini tergantung pada jenis
produk yang kita gunakan apakah intraselular ataukah extraselular. Secara
umum, penggunaan mammalia (CHO) sebagai host merupakan produksi
protein ekstraseluler. Sedangkan produk intraseluler di banyak jenis sel
rekombinan yaitu produk prokariotik. Setelah dilakukan proses
sentrifugasi selanjutnya dilakukan pemisahan antara media dengan sel.
Pada pemisahan protein ekstraseluler, yang diambil untuk diperlakukan
pada proses selanjutnya adalah media yang mengandung protein target,
sedangan selnya dibuang. Kemudian media yang mengandung protein
target dipekatkan dengan ultrafiltrasi atau fraksinasi sehingga diperoleh
suatu crude protein yang selanjutnya dapat masuk ke proses pemurnian
(Walsh, 2003).
Proses pemurnian tPA menggunakan multiple step purification
dengan langkah-langkah sebagai berikut:
Gambar 3. Prosedur Pemurnian tPA (Datar et al.,1993)

Ultrafiltrasi
Teknik ultrailtrasi efektif digunakan untuk menghilangkan seluruh
sel atau serpihan sel dari larutan. Serat membran yang digunakan dalam
proses levasi mikrofi umumnya memiliki diameter pori mulai dari 0,1
sampai 10 μm. Pori-pori seperti itu, mempertahankan seluruh sel dan
partikel besar, gagal mempertahankan sebagian besar komponen
makromolekul, seperti protein. Dalam kasus membran ultrafriltasi,
diameter pori biasanya berkisar antara 1 sampai 20 nm. Pori-pori ini cukup
kecil untuk mempertahankan protein dengan massa molekul rendah.
Selaput ltrasi ultrasonik dengan titik potong massa molekuler berkisar
antara 1 sampai 300 kDa tersedia secara komersial. Membran dengan titik
potong massa molekul 3, 10, 30, 50, dan 100 kDa paling banyak
digunakan (Walsh, 2007).
Ultrafiltrasi umumnya dilakukan pada skala laboratorium dengan
menggunakan sistem sel teraduk. Selaput pada membran ditempatkan pada
mesh di bagian bawah sel dan material yang akan dipekatkan kemudian
dipindahkan ke dalam sel. Penerapan tekanan, biasanya menggunakan gas
nitrogen. Molekul molekul lebih rendah dari pada ukuran pori-pori
pemotong (misalnya air, garam dan senyawa dengan berat molekul rendah)
semuanya melewati lapisan ultafiltrasi, sehingga memusatkan spesies
molekuler yang memiliki massa molekul jauh lebih besar daripada titik
potong molekul. Polarisasi konsentrasi (pembentukan lapisan
terkonsentrasi molekul secara langsung di atas permukaan membran yang
tidak dapat melewati membran) diminimalkan dengan mekanisme
pengadukan yang beroperasi di dekat permukaan membran. Jika tidak
terkontrol, polarisasi konsentrasi akan menghasilkan penurunan laju aliran
(Walsh, 2007).
Ultafiltrasi menjadi metode pemurnian protein untuk berbagai alasan
(Walsh, 2007):
1. Metode ini sangat lembut, memiliki sedikit efek buruk pada
bioaktivitas molekul protein
2. Diperoleh tingkat pemulihan yang tinggi, dengan beberapa produsen
mengklaim pemulihan di atas 99 %
3. Waktu pemrosesan cepat bila dibandingkan dengan metode konsentrasi
alternatif

Ion-exchange chromatography
Kromatografi pertukaran ion didasarkan pada prinsip daya tarik
elektrostatik reversibel dari molekul bermuatan ke matriks padat yang
mengandung gugus sisi kovalen yang berlawanan dengan muatan
berlawanan. Protein kemudian dapat dielusi dengan mengubah pH atau
dengan meningkatkan konsentrasi garam dari penyiraman irigasi. Matriks
pertukaran ion yang mengandung kelompok positif kovalen terlampir
disebut anion exchange. Ini akan menyerap protein anionik, misalnya
protein dengan muatan negatif. Matriks yang bermuatan negatif yang
dilekatkan secara kovalen disebut pengubah kation, yang mengadsorpsi
protein kationik, misalnya protein bermuatan positif. Kelompok fungsional
bermuatan positif (penukar anion) mencakup spesies seperti kelompok
aminoetil dan dietilaminoetil. Kelompok bermuatan negatif yang melekat
pada matriks penukar kation yang cocok meliputi kelompok sulfo dan
karboksi-metil (Walsh, 2007).
Selama proses pertukaran kation, protein bermuatan positif mengikat
matriks penukar ion bermuatan negatif dengan menggeser ion kontra (H+),
yang pada awalnya terikat pada resin dengan daya tarik elektrostatik. Elusi
dapat dicapai dengan menggunakan penyangga irigasi yang mengandung
garam. Kation garam, seperti Na+ dari NaCl, pada gilirannya
menggantikan protein dari matriks pertukaran ion. Dalam kasus protein
bermuatan negatif, penukar anion jelas digunakan, dengan protein
menyerap ke kolom dengan mengganti ion penghitung yang bermuatan
negatif (Walsh, 2007).

Size-exclusion chromatography
Size-exclusion chromatography, juga disebut kromatografi gel
filtrasi, memisahkan protein berdasarkan ukuran dan bentuknya. Karena
sebagian besar protein yang difraksinasi oleh teknik ini dianggap memiliki
bentuk molekul yang hampir serupa, pemisahan sering digambarkan
sebagai berdasarkan massa molekul, walaupun deskripsi semacam itu agak
sederhana (Walsh, 2007).
Fraksinasi protein dengan kromatografi eksklusi ukuran dicapai
dengan mengkuantifikasi larutan protein containing melalui kolom yang
dikemas dengan matriks gel berpori dalam bentuk manik. Saat sampel
bergerak ke bawah kolom, protein besar tidak dapat masuk ke dalam
manik-manik gel dan karenanya dengan cepat dielusi. Kemajuan protein
yang lebih kecil melalui kolom terbelakang, karena molekul tersebut
mampu memasuki manik-manik gel. Struktur internal manik-manik
matriks dapat divisualisasikan sebagai labirin, yang melaluinya protein
cukup kecil untuk memasuki gel harus lewat. Semua protein yang mampu
memasuki gel tidak ditahan dalam matriks gel untuk periode waktu yang
sama. Semakin kecil protein, semakin banyak jalur internal yang potensial
terbuka dan, pada umumnya, semakin lama dipertahankan dalam struktur
manik. Molekul protein, oleh karena itu, biasanya dielusi dari kolom
filtrasi agar menurunkan ukuran molekul (Walsh, 2007).

b. Modifikasi Protein/ Formulasi Produk Akhir


Kromatografi resolusi tinggi biasanya menghasilkan protein yang
98-99% murni. Tahap selanjutnya dari pemrosesan hilir memerlukan
formulasi ke dalam format produk akhir. Hal ini umumnya melibatkan:
1. Penambahan berbagai eksipien (zat selain bahan aktif yang, misalnya,
menstabilkan produk akhir atau meningkatkan karakteristik produk
akhir dengan cara lain).
2. Penyaringan produk akhir melalui filter absolut 0,22 mm untuk
menghasilkan produk steril, diikuti pengisian aseptiknya ke dalam
wadah produk akhir.
3. Freeze-drying (lyophilization) jika produk dipasarkan dalam bentuk
serbuk.

2.5 Analisis Produk Akhir


Semua produk jadi farmasi menjalani pengujian QC yang ketat, untuk
memastikan kesesuaiannya dengan spesifikasi yang telah ditentukan
sebelumnya. Uji potensi sangat penting, memastikan obat tersebut akan
manjur bila diberikan pada pasien. Aspek penting dari pengujian keselamatan
memerlukan analisis produk untuk mengetahui berbagai potensi kontaminan.
Berbagai uji analisa yang dapat dilakukan pada pengujian produk akhir
meliputi (Walsh, 2003):
1. Kontaminan berbasis protein
Sebagian besar langkah kromatografi yang dilakukan selama proses
down stream secara khusus disertakan untuk memisahkan protein yang
diminati dari protein kontaminan tambahan. Terutama jika protein
rekombinan diekspresikan secara intraselular. Selain kotoran protein yang
berasal langsung dari bahan sumber, protein lain mungkin terdapat selama
proses down stream. Misalnya, kultur media sel hewan biasanya
dilengkapi dengan serum betina / janin betina sapi (2-25%), atau dengan
koktail yang ditentukan dari berbagai protein regulasi yang dibutuhkan
untuk mempertahankan dan merangsang pertumbuhan sel-sel ini.
Pelaksanaan GMP harus dapat meminimalkan kontaminasi dari
sumber tersebut. Signifikansi klinis pengotor berbasis protein berkaitan
dengan: (a) potensi aktivitas biologis mereka; (b) antigenisitas. Sementara
beberapa kontaminan mungkin tidak menampilkan aktivitas biologis yang
tidak diinginkan, yang lain mungkin menunjukkan aktivitas yang
mengganggu produk itu sendiri (misalnya protease yang dapat
memodifikasi / menurunkan produk) atau pasien penerima (misalnya
adanya racun yang terkontaminasi).
2. Penghapusan bentuk protein target dari produk
Modifikasi protein apapun pada umumnya akan mengubah beberapa
aspek karakteristik fisikokimia. Ini memfasilitasi penghapusan bentuk
yang dimodifikasi dengan teknik kromatografi standar selama proses
down stream. Sebagian besar prosedur down stream untuk biofarmasi
berbasis protein meliputi gel-filtrasi dan pertukaran ion. Bentuk agregat
dari produk akan secara efektif dihilangkan dengan penyaringan gel
(karena menunjukkan massa molekul lebih besar dengan beberapa urutan
besarnya daripada produk asli). Teknik ini sama-sama efisien
menghilangkan bentuk produk proteolysed secara ekstensif. Varietas
glikoprotein yang kandungan karbohidratnya telah terdegradasi secara
ekstensif juga kemungkinan akan dihilangkan dengan kromatografi gel
filtrasi (atau pertukaran ion). Deamidasi dan oksidasi akan menghasilkan
varian produk dengan karakteristik muatan permukaan yang berubah,
sering kali membuat pengangkatannya oleh ion exchange relatif mudah.
Pembentukan ikatan disulfida yang salah, denaturasi parsial dan
proteolisis terbatas juga dapat mengubah bentuk dan muatan permukaan
protein, yang memudahkan pengangkatannya dari produk melalui
pertukaran ion atau teknik lainnya, seperti kromatografi interaksi
hidrofobik. Kisaran teknik kromatografi sekarang tersedia, bersamaan
dengan perbaikan pada resolusi yang dapat dicapai dengan menggunakan
teknik semacam itu, memungkinkan produksi rutin biofarmasi protein
yang melebihi 97-99% murni.
3. Potensi Produk
Setiap biofarmasi harus sesuai dengan spesifikasi potensi produk
akhir. Spesifikasi tersebut biasanya dinyatakan dalam istilah 'unit
aktivitas' per botol produk (atau per dosis terapeutik, atau per mg produk).
4. Penentuan Konsentrasi Protein
Deteksi dan kuantifikasi protein dengan mengukur absorbansi pada
280nm mungkin metode yang paling sederhana. Pendekatan ini
didasarkan pada fakta bahwa rantai samping tirosin dan triptofan
menyerap pada panjang gelombang ini. Metode ini populer, karena cepat,
mudah dilakukan dan tidak merusak sampel. Namun, ini adalah teknik
yang relatif tidak sensitif, dan konsentrasi protein berbeda yang berbeda
akan menghasilkan nilai absorbansi yang berbeda jika kandungan tirosin
dan triptofannya berbeda secara signifikan. Untuk alasan ini, metode ini
jarang digunakan untuk menentukan konsentrasi protein produk akhir,
namun secara rutin digunakan selama pemrosesan hilir untuk mendeteksi
protein elusi dari kolom kromatografi, dan karenanya melacak proses
pemurnian.
5. Deteksi pengotor produk berbasis protein
Elektroforesis gel poliakrilamida Sodium dodesil sulfat (SDS-
PAGE) merupakan teknik analisis yang paling umum digunakan dalam
penilaian kemurnian produk akhir. Teknik ini mudah dilakukan,
memberikan resolusi tinggi pemisahan polipeptida berdasarkan massa
molekul mereka. Band yang mengandung protein 100 ng dapat
divisualisasikan dengan pewarnaan gel dengan pewarna seperti
Coomassie blue. Analisis gel selanjutnya dengan memindai densitometri
laser memungkinkan penentuan kadar protein secara kuantitatif dari setiap
pita (sehingga memungkinkan kuantifikasi pengotor protein dalam
produk).
Satu kekhawatiran terkait analisis kemurnian berbasis SDS-PAGE
adalah kontaminan dari massa molekul yang sama dengan produk yang
tidak terdeteksi, karena mereka akan bermigrasi bersama dengannya.
Analisis elektroforesis 2 dimensi (2-D) akan mengatasi kemungkinan ini
dalam banyak kasus.
6. Elektroforesis Kapiler
Seperti bentuk elektroforesis lainnya, pemisahan didasarkan pada
tingkat migrasi protein yang berbeda pada penerapan medan listrik.
Seperti namanya, dalam kasus elektroforesis kapiler, pemisahan ini terjadi
di dalam tabung kapiler. Biasanya, kapiler akan memiliki diameter 20-50
mm dan panjangnya sampai 1m (biasanya dilipat untuk memudahkan
kemudahan penggunaan dan penyimpanan). Dimensi dari sistem ini
menghasilkan area permukaan yang sangat meningkat: rasio volume (bila
dibandingkan dengan gel slab), maka sangat meningkatkan efisiensi
pembuangan panas dari sistem. Hal ini memungkinkan operasi di
kepadatan arus lebih tinggi, sehingga mempercepat laju migrasi melalui
kapiler. Analisis sampel dapat dilakukan dalam 15-30 menit, dan deteksi
on-line di akhir kolom memungkinkan deteksi otomatis dan kuantifikasi
pita eluting. Kecepatan, kepekaan, otomasi tingkat tinggi dan kemampuan
untuk secara langsung mengukur band protein membuat sistem ini ideal
untuk analisis biofarmasi.
7. High-pressure liquid chromatography (HPLC)
HPLC ditandai oleh sejumlah fitur yang membuatnya menjadi alat
analisis yang menarik. Diantaranya:
 kecepatan fraksinasi yang baik (seringkali hanya beberapa menit
per sampel)
 resolusi puncak yang superior
 otomatisasi tingkat tinggi (termasuk analisis data)
 siap tersedia komersial berbagai sistem canggih.
8. Spektrometri massa
Kemajuan terbaru di bidang spektrometri massa sekarang
memperluas penerapan metode ini untuk analisis makromolekul, seperti
protein. Dengan menggunakan spektrometri massa electrospray, sekarang
mungkin untuk menentukan massa molekul banyak protein dengan
akurasi + 0,01%. Sebuah varian protein yang kehilangan satu residu asam
amino dapat dengan mudah dibedakan dari protein asli dalam banyak
kasus. Meski teknik ini sangat ampuh, analisisnya hasil yang diperoleh
terkadang kuran baik. Glikoprotein, misalnya, menghasilkan spektrum
yang sangat kompleks (karena heterogenitas alami mereka), sehingga
pentingnya temuan sulit untuk ditafsirkan.
9. Pendekatan imunologi untuk mendeteksi kontaminan
Kebanyakan biofarmasi rekombinan diproduksi di lini sel mikroba
atau mamalia. Jadi, meskipun produk berasal dari gen manusia, semua
kontaminan yang tidak terkait produk akan berasal dari organisme
produsen. Protein non-self ini cenderung sangat imunogenik pada
manusia, sehingga menghilangkannya dari aliran produk sangat penting.
Immunoassay dapat dengan mudah digunakan untuk mendeteksi dan
mengukur ketidakmurnian yang tidak terkait produk dalam persiapan
akhir (immunoassays umumnya tidak dapat digunakan untuk menentukan
kadar pengotor produk, karena antibodi yang diajukan terhadap pengotor
semacam itu hampir pasti bereaksi silang dengan produk itu sendiri).
10. Analisis Asam Amino
Analisis asam amino tetap merupakan teknik karakterisasi yang
dilakukan di banyak laboratorium, terutama jika produknya adalah
peptida atau polipeptida kecil (massa molekul 410.000 Da). Strateginya
sederhana-tentukan kisaran dan jumlah asam amino yang ada pada produk
dan bandingkan hasilnya dengan nilai yang diharapkan (teoritis). Hasilnya
seharusnya
sebanding.
11. Peptide mapping
Perhatian utama yang berkaitan dengan biofarmasi yang diproduksi
dalam sistem rekombinan ekspresi tinggi adalah potensi terjadinya mutasi
titik pada gen produk, yang mengarah ke struktur primer yang berubah
(yaitu urutan asam amino). Kesalahan dalam transkripsi gen atau
terjemahan bisa juga memiliki konsekuensi serupa. Satu-satunya prosedur
yang dijamin untuk mendeteksi perubahan tersebut adalah pengurutan
penuh sampel setiap batch protein. Meskipun urutan protein parsial
biasanya dilakukan pendekatan yang paling umum digunakan untuk
mendeteksi perubahan urutan asam amino adalah pemetaan peptida.
12. Sekuensisng N-terminal
N-terminal sequencing dari residu asam amino 20-30 pertama dari
produk protein telah menjadi tes kontrol kualitas populer untuk produk
biofarmasi. Teknik ini berguna karena:
 secara positif mengidentifikasi protein
 mengkonfirmasikan keakuratan urutan asam amino minimal N-
terminal dari protein
 dengan mudah mengidentifikasi adanya bentuk modifikasi dari
produk di mana satu atau lebih asam amino hilang dari N-
terminal.
13. Endotoksin dan kontaminan pirogenik lainnya
Pyrogens adalah zat yang, ketika mereka memasuki aliran darah,
mempengaruhi regulasi hipotalamus suhu tubuh, biasanya mengakibatkan
demam. Kontrol medis demam akibat pirogen terbukti sangat sulit, dan
pada kasus yang parah mengakibatkan kematian pasien.
Penerapan GMP yang efektif meminimalkan kemungkinan
kontaminasi produk oleh pirogen, misalnya GMP menyatakan bahwa
reagen kimia yang digunakan dalam pembuatan buffer proses sangat
murni. Bahan baku semacam itu oleh karena itu tidak mungkin
mengandung kontaminan kimia yang menunjukkan aktivitas pirogenik.
Selanjutnya, GMP mendorong penyaringan hampir semua produk
parenteral melalui filter 0,45 mm atau 0,22 mm pada titik selama
pemrosesan dan sebelum mengisi wadah produk akhir (walaupun produk
kemudian dapat disterilkan dengan autoklaf). Penyaringan memastikan
pemindahan semua komponen dari produk. Selain itu, sebagian besar
kontainer produk akhir diberikan bebas partikel segera sebelum diisi
dengan penggunaan pra-bilas otomatis WFI. Sebagai pengaman
tambahan, produk akhir biasanya dikenai uji partikulat oleh QC sebelum
peluncuran produk akhir. Format paling sederhana untuk tes semacam itu
bisa melibatkan inspeksi visual isi botol, walaupun peralatan pendeteksi
dan penghitungan partikel tertentu lebih sering digunakan.
BAB III
KESIMPULAN

1. Alteplase (tPA) merupakan salah satu agen trombolitik yang berperan dalam
fibrinolisis yang mengubah plasminogen menjadi plasmin.
2. Produksi alteplase rekombinan menggunakan CHO sebagai host karena CHO
mampu melakukan post translation modification.
3. Alteplase (tPA) diperoleh dari sel melanoma paru seseorang yang bernama
Bowes.
4. Up Stream Process meliputi proses kloning dimana tPA manusia diinsertkan
ke dalam plasmid E.coli lalu ditransformasikan ke dalam host CHO kemudian
diekspresikan untuk mendapatkan transkrip tingkat tinggi.
5. Dilakukan proses fermentasi pada media cair BHI untuk
mengembangbiakkan produk.
6. Down Stream Process meliputi proses pemisahan protein yang dilakukan
secara ekstraseluler, dilanjutkan dengan proses pemurnian dengan metode
multiple step purification, kemudian formulasi produk akhir dengan
penambahan eksipien maupun surfaktan.
7. Analisa kemurnian protein dapat dilakukan dengan berbagai metode, salah
satunya adalah SDS-PAGE dan HPLC.
DAFTAR PUSTAKA

Ali, R.M et al. 2014. ‘Aspect of Thrombolytic Therapy: A Review’. The


ScientificWorld Journal.

Collen, D and Lijnen, H.R. 2004. ‘Tissue-type plasminogen activator: a historical


perspective and personal account’. Journal of Thrombosis and Haemostasis.
Vol 2: 541-546.

Datar, R. et al. (1993). Process economics of animal cell and bacterial


fermentations: a case study analysis of tissue plasminogen activator.
Bio/Technology 11, 340–357.

Hua, Z.C. 1997. ‘Renaturation and Purification of Recombinant Tissue-Type


Plasminogen Activator Expressed In E.coli’. Biochemistry and Molecular
Biology International. Vol 41(4).

Soleimani, Mohammad et al. 2006. ‘Cloning of Tissue Plasminogen Activator


cDNA in Nonpathogenic Leishmania’. Yakhteh Medical Journal. Vol 8(3).

Walsh, Gary. 2007. Pharmaceutical Biotechnology : Concepts and Applications.


England, John Wiley & Sons, Ltd.

Walls, Gary. 2003. Biopharmaceuticals : Biochemistry and Biotechnology, 2nd


edition, A John Willey and Sons, Ireland.

Williams, S.C. 2012. ‘Studies on the Regulation of Tissue Plasminogen Activator


Activity by Physiological Templates’. Thesis. Imperial College London