Degeneración de la producción de

penicilina en cultivos de quimiostato

de Penicillium chrysogenum con etanol
limitado: un enfoque de biología de
sistemas
 Rutger D Douma , 1

 Joana M Batista , 1

 Kai M Touw , 1

 Jan AKW Kiel , 2

 Arjen M Krikken , 2

 Zheng Zhao ,1

 Tânia Veiga ,
1

 Paul Klaassen , 3

 Roel AL Bovenberg , 3

 Jean-Marc Daran , 1

 Joseph J Heijnen y 1

 Walter M van Gulik Autor de correo electrónico

1

BMC Systems Biology 2011 5 : 132

https://doi.org/10.1186/1752-0509-5-132
© Douma y otros;licenciatario BioMed Central Ltd. 2011
Recibido: 22 de febrero de 2011
Aceptado: 19 de agosto de 2011
Publicado: 19 de agosto de 2011

Abstracto
Fondo
La tasa y el rendimiento de la producción de penicilina por el hongo Penicillium
chrysogenum se han multiplicado mucho después de su descubrimiento por
Alexander Fleming en 1928 [ 1 ]. Inicialmente, esto se realizó por rondas
sucesivas de mutagénesis y selección al azar [ 2 - 4 ]. Recientemente, la
secuencia del genoma fue elucidada [ 5 ], lo que facilita transcriptome [ 6 ] y
estudios de proteoma [ 7 , 8 ]. En combinación con cálculos de flujo y estudios
de metaboloma [ 9 - 11 ], esto permite un análisis de biología de sistemas para
identificar objetivos de ingeniería metabólica para mejorar la producción de
penicilina.

Aunque en las actuales cepas de producción industrial la tasa de producción de

penicilina específica de biomasa (q p ) ha aumentado mucho, P. chrysogenum no
mantiene su alta capacidad de producción en fermentaciones prolongadas. Ya en
1932, la pérdida de la capacidad de producción se informó tras el subcultivo
continuo de cultivos de P. chrysogenum productores de penicilina [ 12 ] y
también se informó que las cepas más alejadas en el linaje perdían productividad
de penicilina en fermentaciones prolongadas de quimiostato de carbono limitado
[ 9 , 13]. - 17 ]. La degeneración de la formación del producto no solo se ha
observado para la producción de penicilina-G (PenG), sino también para otros
antibióticos, por ejemplo, la producción de ácido adipoil-7-
aminodeacetoxicefalosporánico (ad-7-ADCA) en P. chrysogenum [ 18 ], la
producción de oxitetraciclina en Streptomyces rimosus [ 19 ] y la producción de
tilosina en Streptomyces fradiae [ 20 ]. Esta pérdida de capacidad de producción
generalmente observada (parcial) durante el cultivo prolongado generalmente se
conoce como degeneración. Este fenómeno es de gran importancia porque
impide la aplicación de un proceso de producción continuo, que, para la
producción masiva de antibióticos como la penicilina, sería económicamente más
favorable en comparación con las fermentaciones discontinuas o discontinuas
alimentadas, debido a un menor tiempo de inactividad y por lo tanto más uso
eficiente del equipo.

Se entiende fácilmente que si un microorganismo (parcialmente) pierde su

capacidad de producción, se puede usar más sustrato y energía para crecer. La
producción de penicilina requiere una cantidad significativa de carbono y energía
metabólica [ 16 ] que da a las células no productoras una ventaja
competitiva. Una cepa que puede mantener su alta productividad durante más
tiempo (ausencia de degeneración) daría como resultado un proceso de
fermentación más productivo, y permitiría que las fermentaciones de penicilina
se ejecuten en modo continuo en lugar del modo de lote alimentado ahora
aplicado.

En este estudio, se aplicaron simultáneamente diferentes técnicas de la economía

en un intento de obtener una comprensión de los sistemas de la degeneración de
la producción de PenG en P. chrysogenum durante los cultivos prolongados de
quimiostato de carbono limitado. Este estudio del sistema se centra
principalmente en la vía de la penicilina (figura 1 ), en una cepa productora de
penicilina industrial alta, P. chrysogenum DS17690.Se realizaron cultivos
prolongados de quimiostato hasta 600 horas (30 generaciones) con etanol como
única fuente de carbono limitante, porque se observó que la degeneración era
más pronunciada con el etanol como sustrato limitante del crecimiento, en
comparación con la glucosa [ 9 ]. El análisis incluyó determinar el número de
clústeres de genes de penicilina, análisis de transcriptoma de genoma completo,
mediciones de los niveles de proteína de enzimas de vía de penicilina,
cuantificación del número de peroxisomas (microcuerpos donde se encuentra el
último paso de la ruta de penicilina), análisis de metaboloma ( del metabolismo
central, nucleótidos, intermediarios de la vía de la penicilina, incluidos el ácido
fenilacético intracelular (PAA) y PenG) y los cálculos del flujo metabólico.
 Figura 1
Vía de la penicilina en P. chrysogenum . La L-cisteína (Cys), la L-valina (Val)
y el ácido α-amino adípico (AAA) se producen a partir del etanol en el
metabolismo central. Estos tres aminoácidos precursores se convierten en L-α-
(δ-aminoadipil) -L-α-cystenyl-D-α-valina (ACV) por la enzima L-α- (δ-
aminoadipil) -L-α-cystenyl -D-α-valina sintetasa (ACVS, que está codificada por
el gen pcbAB ). El ACV se convierte posteriormente en isopenicilina-N (IPN) por
la enzima isopenicilina-N sintasa (IPNS, que está codificada por el
gen pcbC ). El IPN se transporta al peroxisoma donde se convierte en PenG con
el precursor PAA, que se agrega al medio y se importa en la célula y luego se
activa mediante fenilacetil CoA ligasa a PAA-CoA que es utilizada por la enzima
acil coenzima A: Isopenicilina N aciltransferasa (AT, codificada por el
gen penDE ). El producto PenG es luego transportado fuera del peroxisoma y
fuera de la célula al medio de cultivo.

Resultados
Observaciones generales
Para estudiar la degeneración de la producción de penicilina, se realizaron cuatro
cultivos repetidos de quimiostato de P. chrysogenum DS17690 con etanol como
única fuente de carbono limitante. Todos los cultivos de quimiostato estuvieron
precedidos por una fase discontinua durante la cual el cultivo creció
exponencialmente hasta que se agotó todo el etanol. Durante la fase discontinua,
no se produjo penicilina. Esto también se ha observado durante el crecimiento del
lote en la glucosa como fuente de carbono [21 , 22 ] y se atribuye generalmente a
la represión del catabolito de carbono.Aparentemente, también concentraciones
no limitadas de etanol dan como resultado la represión de la producción de
penicilina. Usando medidas TOC para cuantificar la formación de subproductos
no identificados (p. Ej. Proteínas / péptidos y polisacáridos, en parte como
resultado de la lisis celular), se encontró que los equilibrios de carbono y redox
se cerraron satisfactorios (100 ± 5%) para todos los análisis de quimiostato,
mostrando una formación de subproductos insignificante (<10%). Tomando en
cuenta la conversión de PAA en ácido orto -hidroxifenilacético (o-OH-PAA),
que en nuestras culturas representó aproximadamente el 10% del consumo total
de PAA, el balance de PAA cerró entre 90 - 110%, lo que indica la ausencia de
Catabolismo PAA, que está de acuerdo con observaciones anteriores [ 23 ].

Los patrones de tiempo medidos de las concentraciones de biomasa, PenG, PAA

y la tasa de producción de PenG específica de biomasa q p se muestran en la
figura 2 . Se puede observar a partir de estos patrones de tiempo que los cultivos
de quimiostato fueron bien reproducibles. La Figura 2D muestra que la tasa de
producción de penicilina específica de biomasa (q p ) alcanzó un valor máximo a
aproximadamente 40-80 horas después del inicio de la fase de quimiostato, que
es el tiempo necesario para las enzimas de la ruta de la penicilina, que se
reprimen durante el cultivo discontinuo. para alcanzar sus niveles máximos
[ 17 ]. Sin embargo, directamente después de alcanzar un valor máximo, se
observó la degeneración de la producción de penicilina, como puede deducirse de
la disminución de la concentración de PenG y un aumento correspondiente de la
concentración de PAA residual. La disminución de la producción de penicilina
coincidió con un aumento gradual de la concentración de biomasa. Esto se ha
observado antes [ 9 , 13 , 15 ] y no es inesperado porque una disminución de la
producción de penicilina da como resultado una mayor disponibilidad de sustrato
para el crecimiento. Teniendo en cuenta la estequiometría estimada de ATP de
esta cepa de P. chrysogenum [ 16 ], la disminución en la producción de penicilina
parece estar en correspondencia estequiométrica con el aumento en la
concentración de biomasa. Aunque el patrón del perfil de degeneración fue
altamente reproducible, como se puede ver en la figura 2 , los perfiles se
desplazaron ligeramente a tiempo para los cultivos individuales. Durante la
degeneración, la tasa de producción de penicilina específica de la biomasa, q p ,
disminuyó en promedio unas 10 veces.
Figura 2
Los patrones de tiempo de las concentraciones de biomasa, PenG, PAA y la
tasa de producción específica de PenG de biomasa q durante el cultivo de
p

quimiostato limitado en etanol . (A) PenG, (B) biomasa y (C) concentraciones

de PAA en el quimiostato 1 (círculos rellenos), 2 (cuadrados abiertos), 3
(triángulos rellenos) y 4 (diamantes) y (D) producción de PenG específica de
biomasa en el quimiostato 1 (línea continua), 2 (rayas pequeñas), 3 (puntos) y 4
(rayas grandes).
Análisis de flujo
Análisis de flujo metabólico, utilizando el modelo estequiométrico para el
crecimiento y la producción de PenG de van Gulik et al. [ 9 ], se aplicó para
estimar las distribuciones de flujo durante la producción máxima de penicilina (t
= 75 h) y después de la degeneración (t = 500 h). Los flujos a través del
metabolismo central de carbono y hacia la biosíntesis de los precursores de
penicilina ácido alfa-aminoadípico (AAA), cisteína (Cys) y valina (Val) para
estas dos condiciones se muestran como un diagrama de flujo en la figura 3 . Con
mucho, el mayor cambio en el flujo se observó para la biosíntesis de
cisteína. Debido a que en condiciones de alta producción, casi toda la cisteína
producida se utiliza para la biosíntesis de PenG y subproductos asociados (por
ejemplo, ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) y ácido 8-hidroxigenicílico (8-
HPA)), el cultivo degenerado tenía aproximadamente 20- doble flujo reducido en
el camino hacia la cisteína. Aunque menos drástico, el flujo biosintético hacia
valina (Val) disminuyó aproximadamente 3 veces, mientras que el flujo hacia
AAA disminuyó con 50%. Aunque la biosíntesis de PenG no da como resultado
un consumo neto de AAA, se convierte parcialmente en el subproducto ácido 6-
oxopiperidina-2-carboxílico (OPC) que se excreta. Durante la degeneración, la
formación de OPC disminuyó abruptamente (archivo adicional 1 , figura S15), lo
que resultó en un flujo reducido hacia AAA. Debido a que se supone que la
producción de penicilina requiere equivalentes reductores en forma de NADPH
(principalmente para la reducción de sulfato para sintetizar cisteína), el flujo
calculado a través de la ruta de la pentosa fosfato se reduce significativamente en
el cultivo degenerado. Aunque en este caso el resultado de estos cálculos MFA
depende de las especificidades del cofactor en el modelo estequiométrico, se ha
demostrado, es decir, a partir de estudios con trazador de gluconato 13C, que la
producción de penicilina supone una carga importante para el suministro de
NADPH citosólico [ 24]. , 25 ].
figura 3
Distribución de flujo calculada en el metabolismo central de P.
chrysogenum , suponiendo pseudo estado estacionario . Los números al lado
de las flechas representan el flujo promedio de quimiostato 3 y 4 en mmol / Cmol
/ h en el pico de producción de penicilina (t = 75 h, número superior) y el cultivo
degenerado (t = 500 h, número más bajo). La dirección de la flecha indica la
dirección del flujo. No se muestran todos los flujos en la red. Los errores
estándar de los flujos mostrados son menores al 5% a menos que se indique lo
contrario.
Copie el número del grupo de genes de penicilina
Los genes de la vía de producción de penicilina (figura 1 ) se incorporan como un
grupo en el genoma [ 26 ]. El aumento de la producción de penicilina de P.
chrysogenumDS17690 se debe en parte al hecho de que esta cepa contiene de
seis a siete copias [ 5 ] del grupo de genes de penicilina en comparación con la
cepa original P. chrysogenumNRRL1951, que contiene solo una copia [ 4 ] . Una
hipótesis plausible para la pérdida de producción de penicilina sería que la
pérdida de capacidad de producción es causada por la pérdida gradual de los
grupos de genes de penicilina, como ha sido observado por Christensen et
al. [ 15 ] para la síntesis de penicilina-V (PenV) en una variedad industrial
diferente de P. chrysogenum . Por lo tanto, el número de copias del grupo de
genes de penicilina se cuantificó durante la degeneración, utilizando PCR en
tiempo real. Este método de cuantificación arroja resultados precisos hasta un
número de 6 grupos de genes de penicilina. La Figura 4A muestra el resultado
para dos puntos de tiempo, concretamente t = 75 h (máximo q p ) yt = 500 h
(degenerado, bajo q p ) para 2 cultivos de quimiostato independientes
(quimioestatos 3 y 4). De esta figura se desprende que tanto durante la
producción máxima de penicilina como después de la degeneración del cultivo de
quimiostato, están presentes más de 6 grupos de genes de penicilina. Por lo tanto,
este análisis no proporcionó ninguna indicación de que la degeneración sea
causada por una pérdida de agrupaciones de genes de penicilina.

Figura 4
Resultados del clúster de genes de penicilina y cuantificaciones de
microcuerpo . (A) Copie el número del grupo de genes de penicilina en la cepa
de referencia (Wisconsin 54-1255, 1 agrupación de genes de penicilina, barra
blanca) y en dos series prolongadas de quimiostato de P. chrysogenumDS17690
en el pico de producción de penicilina (t = 75 h, barras negras) y el estado
degenerado (t = 500 h, barras grises). (B) Número promedio de microcuerpos por
célula subapical durante el cultivo de quimiostato: (círculos rellenos) chemostat
5, (cuadrados abiertos) quimiostato 6.
Cuantificación de microcuerpo
P. chrysogenum es un microorganismo eucariota y compartimentalizado en el
que se sabe que el último paso de la vía de producción de penicilina, la acil
transferasa (AT), se localiza en los peroxisomas (véase la figura 1 ). Kiel et al.
[ 27 ] han informado que la sobreproducción de Pc-Pex11p en P.
chrysogenum Wis54-1255 da como resultado una mayor abundancia de
peroxisomas y una producción de penicilina dos veces mayor.Aunque en el
estudio de Kiel et al. se usó una cepa diferente con una productividad mucho
menor, una posible hipótesis para la degeneración de la producción de penicilina
en nuestra cepa de alta producción, P. chrysogenum DS17690, podría ser una
disminución del número de peroxisomas en el tiempo durante el cultivo
prolongado de quimiostato de carbono limitado. Para investigar si la
degeneración en nuestra cepa DS17690 coincidía con una disminución en el
número de peroxisomas, se llevaron a cabo cultivos similares de quimiostato de
etanol prolongado con un mutante productor de GFP · SKL dirigido a
peroxisomas de P. chrysogenum DS17690 [ 28 ].

Se encontró que esta cepa derivada se comportó igual que la cepa DS17690, con
respecto a la tasa máxima de producción de penicilina, la concentración de
biomasa en estado estacionario y el perfil de degeneración (datos no
mostrados). A partir de la determinación del número de peroxisomas por célula
subapical durante la degeneración, no se obtuvo evidencia de una disminución
(ver figura 4B ). Sin embargo, se observó que la tasa específica de producción de
penicilina de la cepa GFP · SKL disminuyó 10 veces, siguiendo un patrón similar
al observado para P. chrysogenum DS17690.

Análisis de transcriptoma
Para investigar si la degeneración observada está relacionada con cambios en la
expresión de genes de la ruta de biosíntesis de penicilina y / o rutas metabólicas
conectadas, se realizó un análisis de transcriptoma en dos conjuntos de cuatro
muestras que se tomaron a lo largo de una ejecución de quimiostato duplicado
(chemostatos 1 y 2).Los datos se trataron como experimentos de series de tiempo
por duplicado. El coeficiente de variación promedio de los datos del
transcriptoma derivados de experimentos de degeneración duplicados no excedió
el 25%. El nivel de los genes actA y gdh2 que se usan comúnmente para
estándares de carga para el análisis Northern varió en menos del 21%. En primer
lugar, los resultados fueron probados para la hipótesis de que en esta serie de
muestras de tiempo no ocurrirían cambios en el nivel de las transcripciones. Se
encontró que de las 14000 transcripciones en P. chrysogenumaproximadamente
1000 mostraron una expresión diferencial significativa a lo largo de los cultivos
de quimiostato prolongados.

Claramente, los cambios en la expresión de los tres genes de biosíntesis de

penicilina son de interés principal. De hecho, se observó que los niveles de
expresión de todos los genes presentes en el grupo de genes de penicilina
disminuyeron (figura 5A ). Sin embargo, solo la disminución de casi
dos veces en pcbAB (ACVS) pareció significativa, mientras que este no fue el
caso de la menor disminución en pcbC (IPNS) y penDE (acil coenzima A:
isopenicilina N aciltransferasa, AT). El nivel de expresión de fenilacetil CoA
ligasa (Pc22g14900) no disminuyó. Estos resultados concuerdan con la
observación de que no hay una pérdida significativa del número de copias de los
grupos de genes de la penicilina. Sin embargo, la regulación a la baja global del
metabolismo secundario podría haber dado lugar a niveles de transcripción
inferiores de los genes de biosíntesis de penicilina. Sin embargo, los niveles de
transcripción de PcVelA (Pc13g13200) y PcLaeA (Pc16g14010), dos principales
homólogos del complejo de terciopelo y los reguladores conocidos de la
biosíntesis de penicilina [ 29 , 30 ] no mostraron ningún cambio durante la
degeneración.

Figura 5
La expresión media normalizada de genes en todo el etanol limitó el cultivo
de quimiostato.Los números son promedios para los quimiostatos 1 y 2 . (A)
Los genes de la ruta de la penicilina pcbAB (ACVS, círculos
rellenos), pcbC (IPNS, cuadrados vacíos ) y penDE (AT, triángulos rellenos). (B)
El gen Pc22g14600 (círculos rellenos).
Además de la biosíntesis de un producto, una capacidad suficiente para la
importación de precursores y la exportación del producto es crucial. En un
estudio de expresión de genoma completo con P. chrysogenum llevado a cabo en
condiciones de producción y no producción de PenG, se identificó un gen
putativo para la exportación de PAA (Pc22g14600) [ 6 ]. El nivel de expresión de
este gen durante el experimento de degeneración se representa en la figura 5B ,
que no muestra cambios durante la ejecución prolongada del quimiostato.

Los cambios en los niveles de expresión de otros genes podrían dar indicaciones
adicionales sobre la causa de la degeneración de la producción de penicilina. Por
lo tanto, los 1000 genes expresados diferencialmente se agruparon en seis grupos
diferentes en función de la tendencia de su comportamiento, como se puede ver
en la figura 6 .Posteriormente, se realizó un análisis de categoría funcional dentro
de los seis conglomerados. Las observaciones más interesantes se realizaron en
las categorías funcionales en el grupo 5, en el que los genes se regulan
continuamente a lo largo del experimento. Principalmente, el metabolismo del
nitrógeno y el azufre y los genes de utilización se redujeron a lo largo de los
cultivos de quimiostato prolongado. Análisis posteriores revelaron que muchos
de los genes regulados por disminución se relacionan con la ruta de biosíntesis de
la cisteína, uno de los precursores de la vía de la penicilina (archivo adicional 1 ,
figura S4).
Figura 6
Los 6 grupos de transcriptomas diferentes en los que los genes expresados
diferencialmente se dividieron y se sometieron a un análisis de categoría
funcional .
Se realizó una observación interesante en la comparación entre los 145 genes
regulados por disminución en el grupo 5 y los 167 genes que estaban solo
regulados en condiciones de producción de PenG, tal como informaron Harris et
al. [ 6 ]. Como se muestra en la figura 7A y 7B , 53 genes se producen en ambos
grupos, lo que significa que estos genes se asocian positivamente con la
producción de PenG. Utilizando el software MEME [ 6 , 31 ], se encontró un
motivo de regulación cis sobrerrepresentado en los 900 pares de bases cadena
arriba de los 53 genes mencionados (figura 7C ). Esto implica que este grupo de
genes podría estar regulado conjuntamente.

Figura 7
Los genes cuya expresión se correlaciona positivamente con la producción
de PenG . (A) diagrama de Venn de los genes que comprenden el grupo 5 y de
los genes cuyo nivel de transcripción se informó que era específicamente mayor
en condiciones de producción de PenG (grupo 5 en Harris et al. [ 6 ]). (B) los 53
genes que se superponen a los dos conjuntos. Los genes subrayados contenían al
menos un motivo cis-regulador, como se indica en (C), en sus secuencias
promotoras (las secuencias promotoras incluyen la región -900, -1). (C)
sobrerrepresentado cis-regulador motivo en el conjunto de los 53 genes. El
motivo ha sido identificado utilizando el software MEME y el logotipo ha sido
editado utilizando el software Weblogo.
Un análisis de los niveles de expresión de gluconeogénesis y los genes del ciclo
TCA muestra que los niveles de transcripción del metabolismo central no
cambiaron significativamente, lo que no es sorprendente debido al pequeño
cambio de flujo como resultado de la degeneración.

Niveles de proteína
Para investigar si los cambios en los niveles de las enzimas de la ruta de
biosíntesis de la penicilina ACVS, IPNS y AT podrían ser responsables de la
producción de PenG fuertemente reducida, estos se analizaron por Western Blot
para los quimiostatos 1 y 4. De hecho, los niveles de ACVS, IPNS y en menor
medida, se descubrió que AT disminuía durante la degeneración. La
Figura 8 (panel izquierdo) muestra cómo estos cambios se correlacionan con la
disminución en q p . Tenga en cuenta que un q p bajo corresponde a la condición
degenerada. El nivel de ACVS solo se pudo medir para el quimiostato 1, y
muestra una disminución aproximada de 3 veces después de aproximadamente
400 h de cultivo para los dos quimiostatos analizados. El cambio del nivel de
IPNS fue más pronunciado y disminuyó de 5 a 20 veces, para el quimiostato 1 y
4, respectivamente. Se encontró que la cantidad de AT disminuyó mucho
menos. La Figura 8 (panel izquierdo) muestra que q p es proporcional a la
cantidad de IPNS y no a la cantidad de AT, lo que está de acuerdo con hallazgos
anteriores [ 17 ].
Figura 8
Niveles de proteínas y metabolitos asociados con la producción de PenG,
representados frente a la producción específica de penicilina q Panel
P.

izquierdo: cantidades relativas de proteínas de las enzimas de la vía de biosíntesis

de penicilina (ver Figura 1) en comparación con la condición de referencia en el
pico de producción de penicilina (primer punto de tiempo) en el quimiostato 1
(círculos rellenos) y el quimiostato 4 (diamantes abiertos). Panel medio: niveles
intracelulares de precursores de penicilina e intermedios en chemostat 2
(cuadrados abiertos), chemostat 3 (triángulos rellenos) y chemostat 4 (diamantes
abiertos). Panel derecho: carga de energía, relación calculada de NADH / NAD
de la reacción del sensor Mannitol6P / F6P, PAA intracelular y la relación de
concentración de PAA en el quimiostato 2 (cuadrados abiertos), el quimiostato 3
(triángulos rellenos) y el quimiostato 4 (diamantes abiertos).
Análisis de metabolitos
Los niveles intracelulares de 17 intermedios del metabolismo del carbono central,
16 aminoácidos libres, 9 metabolitos relacionados con la biosíntesis de penicilina
y los nucleótidos de adenina se controlaron a lo largo de los cultivos de
quimiostato (archivo adicional 1 , figuras S5-14). La mayoría de los metabolitos
centrales no mostraron grandes cambios durante la degeneración. Sin embargo,
los niveles de varios compuestos intermedios de la gluconeogénesis fueron más
bajos en el momento en que se tomó la primera muestra (aproximadamente 100 h
de cultivo de quimiostato) y alcanzaron un valor estable y algo mayor a partir de
entonces. Los niveles de aminoácidos libres intracelulares no cambiaron durante
la degeneración, con la excepción de los precursores de β-lactama Val y AAA,
que disminuyeron consistentemente y alcanzaron un nivel respectivamente de 2,5
y 2 veces más bajo al final del cultivo.Desafortunadamente, el nivel de cisteína
parecía demasiado bajo para medirse con precisión. Se observaron cambios
significativos en los metabolitos relacionados con la vía de la penicilina
(figura 8 ). En esta figura, los niveles de estos metabolitos se representan en
función de la tasa de producción de penicilina. Similar a la disminución de los
niveles de los precursores directos Val y AAA, el nivel de ACV disminuyó
consistentemente con la tasa decreciente de producción de penicilina. También
disminuyeron los niveles intracelulares de IPN y PenG, pero solo para las tasas
de producción de penicilina por debajo de 0,2 mmol / Cmol / h. La disminución
de la tasa de producción de penicilina y las disminuciones correspondientes en
los niveles intracelulares de los precursores e intermedios de la vía durante la
degeneración también se reflejaron claramente en niveles extracelulares
fuertemente disminuidos de subproductos relacionados, es decir, la forma
carboxilada de AAA, 6-oxo- piperidina-2-ácido carboxílico (OPC), ácido 6-
aminopenicilánico (6-APA), ácido 8-hidroxipéico (8-HPA) y ácido peniciloico
(PIO).

Subcultivo continuo
Para verificar en qué medida la degeneración es un proceso reversible, el cultivo
degenerado del quimiostato 4 se usó como inóculo para dos cultivos de
quimiostato, llamados sub-quimiostatos 4.1 y 4.2. Después de que los subcultivos
alcanzaron un estado estable, se realizaron los mismos análisis que para el cultivo
parental. No se observaron diferencias con respecto al número de copias del
grupo de genes de penicilina, los niveles de proteína de las enzimas de la ruta de
biosíntesis de penicilina y los niveles de metabolitos, en comparación con el
cultivo original en el momento de la inoculación del subcultivo continuado
(archivo adicional 1 , figuras S2, S3, S5-14). Lo mismo vale para los niveles de
transcripción (ver Figura 9 ). La mayoría de los genes que se regularon
negativamente durante la degeneración de la producción de penicilina,
permanecieron regulados por disminución durante el subcultivo. Curiosamente,
las tasas de producción de penicilina de los dos subcultivos fueron 2 veces
mayores en comparación con el cultivo parental degenerado. Aparentemente, la
pérdida de producción de penicilina es parcialmente reversible después de un
período de cultivo en condiciones de exceso de carbono, que duró en este caso
durante aproximadamente diez generaciones.Sorprendentemente, la tasa de
crecimiento específica medida durante la fase discontinua del subcultivo
continuo fue un 25% mayor que la de la fase discontinua de los cultivos iniciales
(ver Tabla 1 ). Esto coincidió con una regulación al alza del gen putativo que
codifica la alcohol deshidrogenasa (Pc21g22820) durante el cultivo de
quimiostato, precediendo al rebrote en cultivo discontinuo.
 Figura 9
Mapa de calor del nivel de transcripción de los genes que componen el grupo
5 . El mapa de calor muestra los datos medios normalizados en el pico de
producción de penicilina (t = 75 h), del cultivo degenerado (t = 500 h) y durante
el estado estacionario del subcultivo continuado (t = 75 h) obtenido por
inoculación de un nuevo quimiostato con biomasa de la cultura degenerada.
tabla 1
Tasa de crecimiento máxima y tasa de producción de penicilina específica de
biomasa en 4 quimiostatos y 2 sub-quimiostatos inoculados con cultivo
degenerado de quimiostato 4

Ejecutar el μ max en fase de q p, máximo en la fase de q p en el momento de subcul

quimiostato lote (h -1 ) quimiostato (mmol Cmol - continuo (mmol Cmol -1 h -1 )
1
h -1)

Chemostat 1 0.088 0.52 -

Chemostat 2 0.086 0.52 -

Chemostat 3 DAKOTA DEL 0.52 -

NORTE

Chemostat 4 0.089 0.54 -

Sub chemostat 0.109 0.11 0.04

4.1

Sub chemostat 0.112 0.10 0.04

4.2
Discusión
Se realizó un enfoque de biología de sistemas para analizar la degeneración de la
formación de productos en cultivos de P. chrysogenum con alta producción de
penicilina.Con este fin, se llevaron a cabo 4 cultivos independientes de quimiostato de
etanol limitado a una velocidad de dilución en la que se sabía que la tasa de producción
específica de penicilina era máxima. Descubrimos que la producción específica de
penicilina alcanzó un nivel máximo entre 40 y 80 horas de cultivo con quimiostato y
luego disminuyó más de diez veces durante las siguientes 270 horas (aproximadamente
12 generaciones). Esta disminución no se puede atribuir a la inestabilidad genética del
amplicón de penicilina, ni a la regulación a la baja de la vía de biosíntesis de
penicilina.Sin embargo, se descubrió que los niveles de proteína de ACVS e IPNS
disminuyen significativamente durante la degeneración. También disminuyeron los
niveles intracelulares de los precursores de aminoácidos Val y AAA, pero esto podría
haber sido causado por la disminución del flujo hacia la penicilina. Las posibles causas
de los niveles reducidos de proteína observados podrían ser una fuerte disminución de la
eficiencia de traducción de ACVS y IPNS durante la degeneración o la presencia de una
variante de cultivo alterada en la biosíntesis de proteínas funcionales de estas enzimas,
que superaron a la parte de alto rendimiento de la población .
Métodos
Tensión
Los experimentos de quimiostato se realizaron con la cepa industrial de producción de
penicilina Penicillium chrysogenum DS17690, amablemente donada por DSM
Biotechnology Center (Delft, Países Bajos). Los experimentos de quimiostato dirigidos
a la cuantificación de microcuerpos se realizaron con una cepa Penicillium
chrysogenumDS17690 que contenía proteína verde fluorescente (GFP) que contiene la
tripeptidina carboxiterminal serina lisina leucina que funciona como una señal de
orientación peroxisomal (GFP · SKL) (cepa DS58274). Esta cepa se describió como
DS54465 GFP · SKL antes [ 28 ] y fue amablemente donada por WH Meijer
(Universidad de Groningen, Países Bajos).

Cultivo de medios y chemostat

El medio de cultivo se preparó como se describió anteriormente [ 9 ] y contenía 0,25
Cmol / l de etanol y 4 mM de PAA y se usó para la fase de lote y quimiostato de las
fermentaciones. Este medio permitió una concentración de biomasa en estado
estacionario de aproximadamente 3 g DW / L.

Los cultivos de quimiostato con etanol limitado se realizaron de acuerdo con Nasution
et al. [ 10 ] en un reactor agitado con turbina de 7 l con un volumen de trabajo de 4 l en
condiciones aeróbicas (DO> 70%) y una velocidad de dilución de 0,03 h -1 a 25 ° C y
pH 6,5.Los cultivos de quimiostato fueron precedidos por una fase discontinua. La
alimentación del quimiostato se inició justo antes del agotamiento del etanol, para evitar
la inanición de las células. Los cultivos de quimiostato se llevaron a cabo durante un
período máximo de 750 h, que representa aproximadamente 30 generaciones.

El muestreo para las mediciones de transcriptoma, transferencia de Western y

mediciones de metaboloma se realizó después de aproximadamente 75, 200, 350 y 500
h.

Continuo subcultivo de cultura degenerada

Después de aproximadamente 500 horas de cultivo (14 generaciones), 4 ml de cultivo
degenerado se transfirieron asépticamente a un fermentador que contenía 4 l de medio
de cultivo fresco, para el subcultivo. Las condiciones de cultivo (fase discontinua
seguida por cultivo de quimiostato) fueron las mismas que las aplicadas al cultivo
parental.

Análisis general de fermentación

Las concentraciones de PAA y PenG en el sobrenadante del cultivo se midieron con
HPLC-UV [ 44 ]. Los análisis de concentración de biomasa y oxígeno de gases y
dióxido de carbono se realizaron como se describió anteriormente [ 9 ].

Cuantificación del número de copias del grupo de genes de penicilina

El muestreo de biomasa se realizó como se describió anteriormente [ 6 ]. El ADN se
aisló usando un procedimiento de perlas con 2 - 4 perlas de vidrio (2,5 mm) para llevar
a cabo la lisis celular y la posterior purificación de ADN usando el kit FastDNA® SPIN
(MP Biomedicals, Solon, OH). La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó por
triplicado en 25 μl del volumen de reacción de IQ SybrGreen Supermix (Bio-Rad,
Hercules, CA), 0,5 μM de cada cebador y 2 ng de ADN genómico usando PCR en
tiempo real iQ5-Multicolor (Bio-Rad , Hercules, CA, EE. UU.). Para cuantificar el
número de clústeres de genes de penicilina, se amplificó pcbAB (cebador directo:
GAGAGCAGGTCTGACGAAGG, cebador inverso:
AACGAACGGTGTGATATGAACG) junto con niaD como referencia interna (1 copia
genómica, cebador directo: TGGAGGAAC TGGCATCACAC, cebador inverso:
ACATAAGCATCAAGGTCAGAACG). Se usaron los siguientes ajustes de PCR: 1
ciclo de 95 ° C durante 3 min y ciclos de 95 ° C durante 10 s, 58 ° C durante 45 s, 72 °
C durante 45 sy 95 ° C durante 1 min. Como control utilizamos P.
chrysogenum Wisconsin 54-1255 ya que se sabe que tiene un solo grupo de genes de
penicilina [ 4 , 26 ].

Análisis de transcriptoma
Muestreo, extracción de ARN, análisis de microarrays, análisis de datos y agrupamiento
se realizaron como se describió anteriormente [ 6 , 45 ]. En resumen, las muestras se
tomaron a través de un puerto de muestreo en la pared del reactor, se filtraron e
inmediatamente se inactivaron en nitrógeno líquido. Tras el análisis, las células se
molieron con un mortero y mano de mortero bajo enfriamiento constante con N2
líquido.Después de la extracción con trizol y cloroformo, se aisló el ARN usando un
método de extracción de fenol-cloroformo. Se sintetizó ADNc bicatenario a partir del
ARN aislado usando un kit de síntesis de ADNc One Cycle (Affymetrix, Santa Clara,
EE. UU.) Y después de la purificación se hibridó ARNc biotinilado con micromatrices
GeneChip® de Penicillium chrysogenum personalizadas (código de matriz
DSM_PENa520255F). La adquisición y cuantificación de imágenes de matriz se
realizaron utilizando Affymetrix GeneChip Operating Software (GCOS versión 1.2) y
todos los datos de expresión se probaron con la hipótesis de que la expresión no era
significativamente diferente. Los genes expresados diferencialmente se enriquecieron en
categorías MIPS usando una prueba exacta de Fisher. El análisis del promotor se realizó
utilizando el software basado en la web Multiple Em for Motif Elucidation
(MEME). Los datos del transcriptoma producidos en este estudio se han depositado en
la base de datos Genome Expression Omnibus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ bajo el
número de acceso GSE24212 y también se proporcionan como un archivo de Excel
(archivo adicional 2 ).

Western Blot
Las muestras para transferencia de Western se obtuvieron en tampón de congelación
como se describió previamente [ 46 ], precipitaron con 12.5% de TCA y almacenaron a
-20 ° C. Después de la descongelación en hielo, de cada muestra se tomaron alícuotas
independientes y se prepararon extractos de proteína bruta tal como se describió
anteriormente [ 7 ]. Las concentraciones de proteína se determinaron usando el sistema
de ensayo de proteína RC / DC (Bio-Rad, Hercules, CA) usando albúmina de suero
bovino como estándar. Posteriormente, se prepararon transferencias de Western por
triplicado utilizando las tres alícuotas tomadas independientemente, con la misma
cantidad de proteína cargada por carril - para las determinaciones de ACVS, IPNS y
AT, 60 μg, 3/30 μg y 30 μg de proteína, respectivamente. SDS / PAGE y Western Blot
se realizaron de acuerdo con los procedimientos establecidos. Las transferencias
Western se decoraron con anticuerpos policlonales específicos contra ACVS, IAT e
IPNS. Como anticuerpo secundario anti-IgG-AP de conejo (Santa Cruz Biotechnology,
Santa Cruz, CA) se usó con NBT / BCIP (Roche, Penzberg, Alemania) como
sustrato. Después de la detección, se exploraron las transferencias de Western usando un
densitómetro Bio-Rad GS-710. Las bandas específicas de ACVS, IAT e IPNS se
cuantificaron tres veces usando ImageJ 1.40
( http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html ). Después de promediar, los valores se expresaron
como porcentajes del valor inicial, que se estableció en 100%.

Cuantificación de microcuerpo
Para la cuantificación de microcuerpo se realizaron experimentos de quimiostato con P.
chrysogenum DS58274 que contenía una proteína fluorescente verde dirigida a
microcuerpo. Estos quimiostatos se realizaron exactamente como todos los otros
quimiostatos con P. chrysogenum DS17690.

La biomasa de muestras de caldo de cultivo de 1,5 ml se fijó usando formaldehído al

3,7% en tampón de fosfato potásico 50 mM pH 7,2 en hielo durante 1 h (centrifugación
durante 5 minutos a 6000 rpm) y se almacenó a 4ºC hasta un análisis posterior. De cada
hifa los peroxisomas en dos células sub apical se contaron y se promediaron utilizando
un microscopio de escaneo láser confocal (CLSM) como se describió anteriormente
[ 28 , 47 ].El número de peroxisomas por célula se determinó contando hasta 200
peroxisomas y dividiendo por el número de células.

Análisis de metabolitos
El muestreo y el procesamiento de muestras para el análisis de metabolitos
intracelulares se realizó como se describió anteriormente [ 35 ]. La cuantificación se
realizó como se describió anteriormente para los metabolitos del metabolismo central
[ 48 ], para los nucleótidos de adenina [ 49 ] y para los aminoácidos libres [ 50 ]. El
muestreo y procesamiento de muestras para metabolitos intracelulares relacionados con
la biosíntesis de penicilina incluyendo PAA intracelular y niveles de PenG se realizó
usando una nueva técnica de lavado rápido basado en lavado y filtración como se
describió anteriormente [ 11 ] para eliminar eficazmente las cantidades extracelulares
muy grandes de PAA y PenG.

Métodos de cálculo
En los cultivos de quimiostato con etanol como única fuente de carbono limitante, la
concentración de penicilina no alcanzará un valor estable en estado estacionario, porque la
degeneración es muy pronunciada. Por lo tanto, la tasa de producción de penicilina específica
de la biomasa q p en función del tiempo se calculó a partir del balance de masa de penicilina
dinámica usando ajustes polinomiales para las concentraciones medidas de biomasa y
penicilina en función del tiempo:
( Desconocido tipo de nodo: lapso )Desconocido tipo de nodo: lapsodesconocido tipo de nodo:
Desconocido tipo de nodo: lapsodesconocido tipo de nodo: lapsoDesconocido tipo de nodo: lapso

lapsoDesconocido tipo de nodo: lapsodesconocido tipo de nodo: lapsoDesconocido tipo de nodo: lapso( Tipo
desconocido nodo: lapso ) Desconocido tipo de nodo: lapsoDesconocido tipo de nodo:
lapsoDesconocido tipo de nodo: lapso( Desconocido tipo de nodo: lapso ) Desconocido tipo de nodo:
lapsoDesconocido tipo de nodo: lapsoDesconocido tipo de nodo: lapsoDesconocido tipo
de nodo: lapsoDesconocido tipo de nodo: lapso( Desconocido tipo de nodo: lapso )

(1)

Las otras tasas específicas q s , q O2 , q CO2 y μ se calcularon utilizando balances de masa

y estas tasas se usaron para el cálculo del flujo metabólico utilizando el modelo
estequiométrico de van Gulik et al. [ 9 , 10 ] asumiendo pseudo estado estacionario.

Las reacciones reversibles de F6P a Mannitol6P y FBP a G3P pueden usarse como una reacción
del sensor para determinar el cambio en el estado redox en el citosol. La relación relativa de
NADH a NAD [ 36 ] en comparación con el primer punto de tiempo (t1, alta q p ) se puede
calcular de la siguiente manera:
Desconocido tipo de nodo: lapsodesconocido tipo de nodo: lapsodesconocido tipo de nodo: lapsodesconocido tipo de nodo: lapsodesconocido tipo de nodo: lapsoDesconocido tipo de nodo: lapsodesconocido

/
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(2)
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(3)

Para el cálculo de la relación de concentración extra a intracelular de PAA, el volumen

intracelular supuesto fue de 2,5 ml / g DW [ 51 , 52 ].
Chem Cent J. 2013; 7: 57.

Publicado en línea el 27 de marzo de 2013. doi: 10.1186 / 1752-153X-7-57

PMCID: PMC3637571

Transformación microbiana del exemestano esteroideo

anticancerígeno y citotoxicidad de sus metabolitos contra
líneas celulares cancerosas

Elias Baydoun , 1
Marium Bibi , 2 Muhammad Asif Iqbal , 2 Atia-tul Wahab , 3 Dina

Farran , 1 Colón Smith , 1Samina A Sattar , 2 Atta-ur Rahman , 2, 3 y M Iqbal Choudhary 2, 3, 4

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Abstracto
Go to:

Fondo
La transformación microbiana de esteroides se ha empleado ampliamente para la
síntesis de fármacos esteroideos, tanto a nivel de laboratorio como industrial
[ 1 - 7 ]. En el proceso moderno de descubrimiento de fármacos, la generación de
bibliotecas de compuestos bioactivos con diversas estructuras desempeña un papel
importante [ 8 ].
Exemstane (nombre comercial aromasin) es un inhibidor de la aromatasa irreversible
esteroideo, utilizado para el tratamiento del cáncer de mama. Los cánceres de mama
tienen receptores de estrógeno (ER-positivo) y su crecimiento depende de la actividad
de la aromatasa. Por lo tanto, la inhibición de la enzima aromatasa reduce los niveles de
estrógeno y por lo tanto frena el crecimiento del cáncer de mama [ 9 - 12 ].
Curiosamente, el exemestano no solo aumenta el nivel de testosterona y reduce el
estrógeno, sino que también aumenta los niveles de factor de crecimiento similar a la
insulina (IGF) [ 10 ]. La gran reducción en los niveles de estrógeno combinada con un
aumento en el IGF, hace que el exemestano sea un medicamento efectivo para el cáncer
de mama [ 13 - 15 ]. En base a la importancia del exemestano en el tratamiento del
cáncer de mama, se sintetizaron previamente varios derivados de exemestano que
implican la modificación del metileno C-6 y la reducción del grupo ceto C-17, y se
evaluaron por su potencial inhibidor de aromatasa [ 16 - 19 ].
Durante el estudio actual, sintetizamos nuevos análogos de 1 mediante técnicas de
biotransformación. Los experimentos de detección mostraron que Macrophomina
phaseolina y Fusarium lini fueron capaces de transformar eficientemente 1 en varios
metabolitos. Las fermentaciones subsecuentes a gran escala produjeron tres nuevos
metabolitos 2 - 4 junto con un metabolito conocido 5 . Las estructuras de los
metabolitos se establecieron inequívocamente a través del análisis espectral
detallado. Los metabolitos transformados microbianos 2 y 4 de exemestano mostraron
un efecto anticancerígeno moderado contra las líneas celulares de cáncer PC3 y / o
Hela. Este intento exitoso de sintetizar nuevos derivados de un esteroide
anticancerígeno puede conducir al descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos
contra el cáncer.
Go to:

Resultados y discusión
Cuatro metabolitos microbianos fueron generados por las cepas fúngicas seleccionadas,
es decir, Macrophomina phaseolina y Fusarium lini (Figuras 1 y 2). 2 ). M.
phaseolina se informó anteriormente para catalizar la introducción de doble enlace entre
C-1 y C-2, grupos hidroxilo en C-6, C-15, C-16 y C-17, y el grupo carbonilo en C-17 de
la esqueleto esteroideo [ 1 , 20 ]. También se informa que F. lini cataliza la oxidación en
C-1, C-2, C-6 y C-11 del esqueleto esteroideo [ 21 ]. Las estructuras químicas de los
metabolitos 2 - 4 se informan aquí por primera vez junto con sus datos de RMN
(tablas 1 y 2 ).

Figura 1

La biotransformación de exemestano (1) con Fusarium liniprodujo metabolito 2.

Figura 2

La biotransformación de exemestano (1) con Macrophomina phaseolina produjo metabolitos

3-5.

tabla 1

Datos de 1 H-RMN de compuestos 1-5 en ppm, J en Hz

Tabla 2

Datos de 13 C-NMR de compuestos 1-5 en ppm

El efecto anticancerígeno del exemestano ( 1 ) [ 2 ] y sus análogos sintéticos en HeLa y

PC3 se determinaron usando el ensayo MTT. Los resultados obtenidos de estos ensayos
se presentan en la Tabla 3 .

Tabla 3

Citotoxicidad in vitro de los compuestos 1-5

La fórmula molecular C 20 H 24 O 3 [ M + , m / z 312] del metabolito 2 se dedujo de la
HREI-MS ( M + m / z 312.1705), sugirió la adición de un oxígeno en el sustrato 1 . El
análisis espectral de 1H-NMR de 2 (Tabla 1 ) mostró una señal de metino en el campo
abajo, en comparación con el material de partida exemestano ( 1 ), que resonaba a δ
4,30 (m, W 1/2 = 15,6 Hz), mientras que su respectivo carbono la señal estaba a δ 71,5 en
el espectro 13 C-NMR (Tabla 2 ). El espectro de HMBC (Figura 3 ) mostró
acoplamientos de largo alcance del protón de metina portador de hidroxilo (δ 4.30) con
C-9 (δ 48.6), C-10 (δ 44.3) y C-13 (δ 48.1), que sugirió la posición del metino portador
de hidroxilo en C-11. H-11 también mostró los picos cruzados COSY con H-9 (δ 1.62)
y H 2 -12 (δ 1.28, 2.13).Las asignaciones estereoquímicas se basaron en las
interacciones NOESY (Figura 3 ) entre H-11 (δ 4.30), H-8 (δ 1.98) y Me-19 (δ 1.18). H-
11 se dedujo así como orientado β. Metabolite 2 finalmente se identificó como 11α-
hidroxi-6-metileno-androsta-1,4-dieno-3,17-diona.

figura 3

Correlaciones importantes HMBC (a) y NOESY (b) en el metabolito 2.

Se dedujo que la composición molecular del metabolito 3 era C20H26O3 del análisis
HREI-MS ( M+ = m / z 314.1933, calculado 314.1882). Los espectros 1H-RMN μm
(Tabla 1 ) del metabolito 3mostraron dos picos de protones de metino que contienen
hidroxilo a δ 3.30 (d, J 17,16 = 7.5 Hz, H-17) y 4.07 (m, W 1/2 = 20.0 Hz). El espectro 13 C-
NMR de 3 carece de señal para C-17 carbonilo, mientras que el nuevo carbono metino a
δ 81.7 sugiere la reducción de C-17 cetona en C-17 OH. El protón geminal para el
grupo -OH (δ 4.07) se correlacionó con C-13 (δ 43.7), C-14 (δ 48.2) y C-17 (δ 81.7) en
el espectro HMBC. El metino C-17 (δ 81.7) mostró correlaciones HMBC con H-14 (δ
0.93, m) y H-18 (δ 0.99, s). En base a las observaciones anteriores, el carbono de metino
portador de hidroxilo se identificó como C-16. El H-16 (δ 4.07) mostró picos cruzados
NOESY con H-14 (δ 0.93), pero no interacción con H-18 (δ 0.99) (Figura 4 ). Por lo
tanto, el protón C-16 se asignó para estar orientado a α. El metabolito 3 se identificó así
como 16β, 17β-dihidroxi-6-metileno-androsta-1, 4-dien-3-ona.

Figura 4

Importantes correlaciones HMBC (a) y NOESY (b) en el metabolito 3.

La fórmula molecular C20H24O3 ( M + m / z 312.1725, calculado 312.1720) se dedujo

de la HREI-MS del metabolito 4 . Una señal distinta de protón de metino en el campo
abajo apareció a \ delta 3.77 (s ancho, W _ { 1/2 } = 9.3 Hz) en el espectro 1 H - RMN
de 4 . El espectro de ^ { 13 } C - NMR mostró una señal de carbono de cetona saturada a
\ delta 217.7. El resto del espectro fue claramente similar al metabolito 2 . El protón de
metino desprotegido fue HMBC correlacionado con este carbono cetónico, mientras que
su correspondiente carbono metino a δ 86.8 mostró las correlaciones HMBC con H2 -15
(δ 1.95, 2.29) y C H 3 -18 (δ 0.81). Estas interacciones, junto con la aparición de un
protón downfield (δ 3.77), indicaron que la cetona en C-17 se ha reducido a -
OH.Geminal H-17 (δ 3.77) mostró correlaciones NOESY con H-14 (δ 1.63), lo que
indica que está orientada axialmente (α-). El carbono cetona saturado (δ 217.7) se
colocó en C-16, en base a las correlaciones HMBC mencionadas anteriormente
(Figura 5 ). La estructura del metabolito 4finalmente se identificó como 17β-hidroxi-6-
metileno-androsta-1, 4-dieno-3, 16-diona.

Figura 5

Importantes correlaciones HMBC (a) y NOESY (b) en el metabolito 4.

Metabolite 5 tiene una composición molecular C20H26O2 (HREI-MS, M + m /

z 298.1730, calculado 298.1733). En base a los datos espectrales de 1 H y 13 C-RMN
(Tablas 1 y 2),2 ), el compuesto 5 se identificó como 17β-hidroxi-6-metileno-androsta-
1, 4-dieno-3-ona. Anteriormente se había informado de un producto transformado de
exemestano mediado por citocromo P 450 in vitro [ 22 ].
Se evaluó el efecto citotóxico de los compuestos 1-5 contra dos líneas celulares
tumorales, PC-3 (célula de cáncer de próstata) y Hela (célula de cáncer de cuello
uterino) (Tabla 3 ) usando el ensayo de MTT. El Compuesto 2 mostró una citotoxicidad
moderada contra la línea celular de cáncer con CI50 = 16.83 ± 0.96 y 24.87 ± 0.72 μM,
respectivamente, en comparación con el fármaco estándar, la doxorrubicina. El
compuesto 4 exhibió una actividad moderada contra la línea celular HeLa.
Go to:

Conclusión
En conclusión, se investigó por primera vez la biotransformación de exemestano ( 1 )
con F. lini y M. phaseolina, lo que proporcionó una ruta eficiente hacia la síntesis de
varios metabolitos nuevos 2- 5 . Se encontró que Metabolite 2 era moderadamente
activo contra ambas líneas de células cancerosas (HeLa y PC3). El trabajo presentado
aquí puede ser útil para el estudio del metabolismo in vivo de exemestano ( 1 ), así
como para el descubrimiento de nuevos fármacos contra el cáncer

Experimental

Sustrato y productos químicos

El exemestano ( 1 ) se adquirió en el mercado local como fármaco (Pfizer Canada Inc.,
nombre de marca Aromasin), se extrajo y se purificó adicionalmente mediante
cromatografía ultrarrápida. La cromatografía en capa fina (TLC) se llevó a cabo en
placas prerrecubiertas de gel de sílice (PF 254 ; Merck). La cromatografía en columna
(CC) se realizó usando gel de sílice (E. Merck, Alemania).Las rotaciones ópticas se
midieron en metanol con un polarímetro JASCO P-2000. Los espectros de 1H y 13C-
NMR se registraron en (CD3) 2CO y CD3OD en espectrómetros de Bruker
Avance. Los desplazamientos químicos (valores δ) se presentan en ppm y las constantes
de acoplamiento ( J ) están en Hz. Para los experimentos de RMN 1D y 2D, se usaron
secuencias de pulsos estándar de Bruker. Los espectros UV (en nm) se registraron en
metanol con un espectrofotómetro Hitachi U-3200. Los espectros infrarrojos (IR) (en
cm -1 ) se registraron con un espectrofotómetro FT-IR-8900. El espectrómetro de masas
JMS-600H de JEOL (Japón) se utilizó para registrar EI-MS y espectros de masas de alta
resolución (HREI-MS) en m / z (rel.%).
La actividad anticancerígena de los compuestos 2 - 5 se evaluó en placas de
microtitulación de fondo plano de 96 pocillos [Iwaki, Japón] utilizando el colorante
estándar MTT (3- [4, 5-dimetiltiazol-2-il] -2, 5 -bromuro de difenil-tetrazolio) [Sigma-
Aldrich Chemicals, St. Louis, USA] mediante análisis colorimétrico. Para este
propósito, las células se cultivaron en Medio Esencial Mínimo (MEM), suplementado
con Suero de Becerro Fetal (FCS) al 10%, piruvato sódico 1 mmol / l, antibiótico /
antimicótico al 1% (v / v) y pasaron semanalmente, usando 0.25 % de tripsina / EDTA
[Sigma-Aldrich Chemicals, St. Louis, EE. UU.] en matraces de cultivo tisular T-75
[Iwaki, Japón]. La absorbancia se tomó a una longitud de onda de 540 nm utilizando un
lector de microplacas (Spectra Max plus, Molecular Devices, EE. UU.) Utilizando el
software SoftMax Pro 340 [Molecular Devices, CA, EE. UU.]. El dimetilsulfóxido
(DMSO) y la doxorrubicina (inhibidor estándar) se adquirieron en Sigma-Aldrich
Chemicals, [St. Louis, USA].

Microorganismos y medio de cultivo

Los hongos se compraron a Northern Regional Research Laboratories (NRRL) u
obtuvieron como regalo de la Colección de Cultura de la Universidad de Karachi
(KUCC).
Fusarium lini (NRRL 2204) y Macrophomina phaseolina (KUCC 730) se cultivaron en
un medio de cultivo preparado mezclando glucosa (40.0 g), glicerol (40.0 ml), peptona
(20.0 g), extracto de levadura (20.0 g), KH 2 PO 4 (20,0 g) y NaCl (20,0 g) en H 2 O
destilada (4,0 l).

Líneas celulares
Las líneas celulares PC3 (cáncer de próstata) y HeLa (cáncer de cuello uterino) se
adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC) para actividad
anticancerígena.

Condiciones generales de fermentación y extracción

Se prepararon 4 litros de medio fúngico y se distribuyeron en 40 matraces cónicos (100
ml en cada matraz). Todos los matraces se autoclavaron a 121 ° C. Los cultivos
fúngicos se inocularon luego en cada matraz que contenía medio y se incubaron a
temperatura ambiente en el agitador durante tres días. El compuesto 1 se disolvió en 40
ml de metanol y se distribuyó por igual a los 40 matraces.Todos los matraces
experimentales se guardaron para la fermentación. También se realizaron dos
experimentos de control, es decir, medio + compuesto 1 y medio + hongo. La
transformación se verificó luego en TLC. Después de la detección de la transformación
en TLC, se filtró el cultivo fúngico de los 40 matraces y se extrajo con CH _ { 2} Cl _
{ 2} (12 l) mediante cromatografía líquido - líquido. La capa de diclorometano se
evaporó a vacıo . La goma obtenida se analizó mediante cromatografía en capa fina.

Fermentación y purificación de exemestano (1) con Fusarium lini

Se disolvió exemestano ( 1 ; 1,0 g) en 40 ml de metanol, y se incubó con cultivo de F.
Lini. La goma obtenida (2,3 g) se fraccionó (ARC 1-3) usando cromatografía en
columna de gel de sílice. La fase móvil estaba compuesta de éter de petróleo y acetona
con un gradiente del 10%. La fracción ARC-2 produjo metabolito 2 (4 mg, éter de
petróleo: acetona = 8: 2) después de la elución a través de columna de gel de sílice.

11α-Hidroxi-6-metileno-androsta-1,4-dieno-3,17-diona ( 2 )
Material amorfo; [a] 25 D : +81,4 ( c = 0,096, MeOH); IR (KBr): v max 3408, 1657
cm- 1 ; UV (MeOH): λ max nm (log ε) 247 (3,78); 1 H y 13 C-NMR: ver tablas 1 y 2
2 (archivo adicional 1 ).

Fermentación y purificación de exemestano ( 1 ) con Macrophomina phaseolina

La incubación de 1 (1,0 g / 40 ml de metanol) con 3 días de cultivo de M. phaseolina en
40 matraces durante 12 días produjo los metabolitos 3 (10 mg), 4 (5 mg) y 5 (6 mg).

16β, 17β-Dihidroxi-6-metileno-androsta-1,4-dieno-3-ona ( 3 )
Material amorfo; [a] 25 D : +181.6 ( c = 0.032, MeOH); IR (KBr): v max 3388, 1658
cm- 1 ; UV (MeOH): λ max nm (log ε) 249 (4,03); 1 H y 13 C-NMR: ver tablas 1 y 2
2 (archivo adicional 2 ).

17β-Hidroxi-6-metileno-androsta-1,4-dieno-3,16-diona ( 4 )
Material amorfo; [\ alpha] _ { 25} D : -56,0 ( c = 0,043, MeOH); IR (KBr): v max 3411,
1749, 1658 cm- 1 ; UV (MeOH): λ max nm (log ε) 247 (4,04); 1 H y 13 C-RMN: ver
tablas 1 y 2 2 (archivo adicional 3 ).

17β-Hidroxi-6-metileno-androsta-1,4-dieno-3-ona ( 5 )
Material amorfo; [a] 25 D : +174.5 ( c = 0.046, MeOH); IR (KBr): v max 3421, 1657,
cm- 1 ; UV (MeOH): λ max nm (log ε) 248 (4.24); 1 H y 13 C-RMN: ver tablas 1 y 2
2 (archivo adicional 4 ).

Ensayo de viabilidad celular

La citotoxicidad de los metabolitos 1 - 5 se determinó mediante el ensayo colorimétrico
basado en MTT en placas de 96 pocillos [ 23 ]. Ambas líneas celulares (PC-3 y HeLa)
se cultivaron en medios DMEM y MEM, respectivamente, en matraces de cultivo de
tejidos de 25 cm3. Los medios se suplementaron con FBS (5%), penicilina (100 IU / ml)
y estreptomicina (100 mg / ml). Los matraces se incubaron luego a 37 ° C en una
incubadora que contenía 5% de CO2. El matraz (80% de confluencia) se procesó para el
ensayo de citotoxicidad basado en MTT. El porcentaje de viabilidad de las células se
controló mediante colorante azul tripán. Las células con citoplasma claro se
consideraron viables. Para el ensayo, las células (1 x 10 5 ) se cargaron en placas
tratadas con cultivos de tejidos de 96 pocillos. La placa se incubó durante 24 horas a 37
° C. Después de la incubación, las células se trataron con diferentes concentraciones
(1,56 - 50 \ mu M disueltos en DMSO) de los compuestos 1 - 5 y se guardaron en una
incubadora durante 48 horas a 37ºC. Al final de la incubación, se añadió el colorante
MTT (50 μL, 2 mg / mL) a cada pocillo y la placa se incubó durante 4 horas a 37 ° C en
una incubadora. Después de la incubación, los cristales de formazano insolubles se
disolvieron añadiendo DMSO (100 μL).
La siguiente fórmula se usó para analizar los efectos citotóxicos de los compuestos.
% De inhibición = 100 - [( Absorbancia del compuesto de ensayo - Absorbancia de blanco ) /
( Absorbancia de control - Absorbancia de blanco ) × 100]

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Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.
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Contribuciones de los autores

EB, MIC, AR, DF y CM participaron en el diseño de la estrategia experimental, la
supervisión y la redacción de manuscritos. MB y MAI llevaron a cabo los
experimentos. AW realizó experimentos de RMN, mientras que SAS llevó a cabo los
exámenes biológicos. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.
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Material suplementario
Archivo adicional 1:

Datos espectroscópicos del metabolito 2. Incluyen los espectros de EI-MS, UV,

IR, 1 H-RMN, 13 C-RMN (BB, DEPTO-135 °, DEPTO-90 °), HMQC, HMBC,
ACOGEDOR-45 °, NOESY experimentos.
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Archivo adicional 2:

Datos espectroscópicos del metabolito 3. Incluya los espectros de EI-MS, UV, IR, 1 H-
RMN, 13 C-RMN (BB, DEPTO-135 °, DEPTO-90 °), HSQC, HMBC, ACOGEDOR-45
°, NOESY experimentos.
Haga clic aquí para el archivo (847K, pdf)

Archivo adicional 3:

Datos espectroscópicos del metabolito 4. Incluir espectros de EI-MS, UV, IR, 1 H-

RMN, 13 C-RMN (BB, DEPTO-135 °, DEPTO-90 °), HMQC, HMBC, ACOGEDOR-45
°, NOESY Experimentos.
Haga clic aquí para el archivo (825K, pdf)

Archivo adicional 4:

Datos espectroscópicos del metabolito 5. Incluir espectros de EI-MS, UV, IR, 1 H-

RMN, 13 C-RMN (BB, DEPT-135 °, DEPTO-90 °), HSQC, HMBC, ACOGEDOR-45 °,
NOESY experimentos.
Haga clic aquí para el archivo (842K, pdf)

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Expresiones de gratitud
Queremos agradecer al CNRS libanés (Consejo libanés para la investigación científica)
por una beca de investigación.
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Referencias

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