FQB 144 – Bioquímica I Carrera Biología

Lab 4: Purificación de proteínas

Purificación de proteínas

1. INTRODUCCIÓN
En este laboratorio desarrollaremos un método asequible para aislar una proteína que se encuentra en una mezcla junto con
otras 20 proteínas. Lograremos esto utilizando el programa “Protein Purification.” Esta aplicación puede ser descargada para
sus versiones Windows, Mac-OS, Linux, Android y iPhone, o puede ser utilizada en linea mediante la versión Java del
programa (http://www.agbooth.com/pp_ajax/index.html?locale=es). A continuación se encuentra la descripción del
problema y algunas consideraciones que debe tomar en cuenta antes de comenzar el programa.

1.1. ESCENARIO
Usted ha sido incorporado a un laboratorio de investigación y se le ha asignado la tarea de purificar una o más enzimas de la
manera más económica posible. Se le ha facilitado todo el equipamiento y materiales que necesite. También cuenta con la
ayuda de un técnico muy hábil pero no comunicativo. A último minuto su supervisor viaja en una visita extendida para un
laboratorio en el extranjero. En otras palabras, usted está solo. Usted debe tomar las decisiones e instruir al técnico según su
criterio. Buena Suerte!
1.2 COMENZANDO
Cuando usted selecciona “Comienzo”, podrá seleccionar una nueva mezcla y una proteína a purificar. Antes de comenzar, se
debe registrar la proteína que se quiere purificar. Se le indicaran características sobre la actividad enzimática de la enzima
que han sido identificadas previamente. Su técnico ha seleccionado tres anticuerpos monoclonales y un anticuerpo policlonal
específico para su proteína. De todas maneras, el técnico no está contento con ser dirigido por alguien nuevo en el equipo y
es poco comunicativo. Aunque sus instrucciones serán efectuadas tal como usted lo disponga, el técnico no le dará ningún
consejo o advertencia si usted comete errores. Usted está a cargo y debe tomar las decisiones y asumir las consecuencias.
Tenga en cuenta que si usted pierde la actividad enzimática, toma más de 10 pasos para purificar la proteína o permite que
los costos aumenten demasiado, el encargado financiero del laboratorio tratará de despedirlo, trate que esto no suceda.
1.3 ESTRATEGIA
1.3.1 Consideraciones iniciales
Todas las células, ya sean procariontes o eucariontes, contienen decenas de miles de diferentes proteínas con un amplio rango
de actividades biológicas. La purificación de proteínas es entonces central para cualquier análisis biológico de su estructura y
función. No hay un procedimiento único para purificar y aislar todas las proteínas en forma pura, pero existe un set de
procedimientos utilizados para distinguir entre proteínas en base a características estructurales o funcionales específicas.
Seleccionando los procedimientos adecuados y aplicándolos cuidadosamente en una secuencia de pasos, es teóricamente
posible obtener un alto grado de purificación y alto rendimiento de la proteína de interés. No hay un orden estándar en el cual
estos procedimientos puedan ser efectuados para obtener una purificación óptima. Por las diferencias estructurales y
funcionales entre las proteínas, una secuencia ideal para una proteína, será posiblemente incorrecta para otra.
El conocimiento de las bases teóricas de cada procedimiento, permitirá al investigador escoger un orden inicial de técnicas
para intentar una purificación. Sin embargo el desarrollo de un protocolo optimizado involucra numerosa experimentación de
ensayo y error para probar el potencial de cada paso de la purificación.
Independientemente del esquema de purificación adoptado, se debe tomar en cuenta que las proteínas son moléculas lábiles.
Su exposición a temperaturas moderadas (Ej. 37°C) causa su lenta denaturación, por lo que todos los pasos de la purificación
se deben efectuar en condiciones refrigeradas, a menos que se especifique lo contrario. Las proteínas también son sensibles
al pH, por lo que se deben utilizar soluciones tamponadas y evadir pHs extremos. Finalmente las proteínas son más
inestables en soluciones diluidas, por lo que las soluciones de proteínas no se deben diluir más de lo necesario.
1.3.2. Aislamiento de proteína en forma soluble
Aunque este programa simula la purificación de proteínas desde una fase acuosa, el punto de partida para la purificación de

Elaborado por: Dr. Sergio Gutiérrez Cortez IBMB - UMSA

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una proteína es usualmente un cultivo bacteriano, células vegetales, de cultivo celular o un tejido u órgano de origen animal.
El requerimiento inicial es liberar la proteína desde las células sin causar la pérdida de su actividad biológica. Un
procedimiento extensamente utilizado para células animales es la homogenización. Bacterias, levaduras y células vegetales
tienen paredes celulares gruesas que requieren el uso de métodos de disrupción más drásticos, como sonicación y el uso de
alta presión. Una ventaja de la homogenización, es que los mayores organelos se pueden conservar intactos, por esto si la
proteína está restringida en un organelo, por ejemplo proteínas del núcleo, mitocondrias o lisosomas, o quizás unida a la
membraba celular, se puede realizar una sustancial purificación al efectuar un fraccionamiento celular. Posteriormente, si la
proteína deseada se encuentra en forma soluble en el interior del organelo, puede ser liberada rompiendo el organelo con un
detergente no iónico o por sonicación. Una vez que la proteína ha sido liberada, se puede purificar utilizando los métodos
estándar simulados en este programa.
1.3.3. Elección de métodos de purificación
Hay numerosos métodos de purificación disponibles, algunos de los cuales son más comúnmente utilizados. El diseño
experimental de la purificación para una proteína en particular depende principalmente de las propiedades funcionales y
estructurales de la proteína de interés y de los contaminantes desde los cuales tiene que ser purificada. A continuación hay
algunas líneas generales en la selección de técnicas pero se debe recordar que las condiciones precisas para la aplicación de
esos métodos, se definen por experimentación de ensayo y error.
(I) Los primeros pasos de un esquema de purificación son usualmente aquellos que tienen el menor poder
resolutivo, como la precipitación por sulfato de amonio, o para algunas proteínas la denaturación por calor.
Estos procedimientos tienen la ventaja de reducir en gran manera la cantidad total de proteína en la muestra
comparado con los procedimientos cromatográficos, que son teóricamente capaces de alcanzar alta resolución.
Procedimientos de alta resolución, pero de poca capacidad, como el isoelectroenfoque (IEF), pueden ser
aplicados en las etapas finales de la purificación cuando hay relativamente baja concentración de proteínas, para
remover proteínas contaminantes remanentes e impurezas presentes en la muestra.
(ii) Es típicamente más eficiente escoger una serie de métodos que aprovechan diferentes propiedades físicas o
funcionales de las proteínas, que una serie de pasos que exploten la misma cualidad. Por ejemplo esquemas de
purificación que utilizan columnas cromatográficas de purificación , usualmente incluyen un procedimiento de
exclusión por tamaño (filtración por gel) y un procedimiento de fraccionamiento por carga (cromatografía de
intercambio iónico)
(iii) Durante la cromatografía, es una práctica común sacrificar algo de rendimiento, para aumentar la pureza. En
otras palabras, no intente recuperar hasta el último microgramo de proteína de interés si es que esto significa
incluir fracciones que contengan otras proteínas contaminantes. Las fracciones colectadas deben ser elegidas en
base a la máxima pureza a un rendimiento razonable.
(iv) Algunas técnicas de fraccionamiento, en partícular geles SDS-PAGE, Isoelectroenfoque y electroforesis bi-
dimensional, no son utilizados usualmente como procedimientos preparativos para purificación de proteínas
pero si para revisar el progreso de la purificación. Estas son técnicas analíticas de alta resolución. De todas
maneras, aunque no se trata originalmente de técnicas preparativas, actualmente existen métodos de análisis
capaces de detectar microgramos de proteínas. En estas situaciones estas técnicas analíticas pueden ser
consideradas como preparativas.
(v) Otra consideración importante al escoger una técnica de fraccionamiento es el costo. Ambos, el material
consumido y el tiempo del personal consumido tienen que ser considerados: Algunas técnicas son relativamente
baratas y rápidas, como el tratamiento con calor y el fraccionamiento con sulfato de amonio, mientras otros
tienden a ser de alto costo y demandan la inversión de mucho tiempo. Las técnicas particularmente de alto costo
son las que consumen anfolitos, como el isoelectroenfoque preparativo. Por lo tanto, mientras algunas técnicas

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aparecen a primera vista muy atractivas en términos de la alta resolución que ofrecen, a mayor escala son poco
prácticas, por su alto costo. De hecho se pueden obtener resultados igualmente satisfactorios con la combinación
de métodos económicos.
1.3.4. Monitoreando la purificación
Cada procedimiento de purificación subdivide la mezcla de proteínas en un número de tubos (fracciones), donde una o más
de estas va a contener la proteína de interés y otras fracciones contendrán proteínas que no se necesitan y serán descartadas.
Para determinar que fracciones guardar, se necesita ser capaz de detectar y cuantificar la proteína de interés. Si esta proteína
es una enzima, se debe disponer de un ensayo enzimático. Si la proteína es una hormona, se debe tener un ensayo de enlace
de hormona, radioinmunoensayo o un bioensayo. Alternativamente, la proteína puede contener un metal traza, como cobre o
molibdeno, que puede ser detectado. Este software de simulación asume por simplicidad que la proteína a detectar es una
enzima.
Además de cuantificar la cantidad de proteína de interés, hay que cuantificar la cantidad de proteína total, esta información
se necesita no solo para tomar la decisión de cuales fracciones deben ser colectadas para los siguientes pasos de purificación,
sino además ayudan a verificar la efectividad de cada paso de la purificación.
1.3.5. Cuantificación de proteína total
Para estimar la cantidad de proteína, se puede leer directamente la absorbancia a 280 nm de fracciones individuales
colectadas en cromatografía. Un método alternativo a la estimación fotométrica directa de la cantidad de proteína es el uso
de ensayos colorimétricos de cada fracción utilizando el reactivo de Lowry o el ensayo de Bradford.
1.3.6. Ensayo de actividad enzimática
La cantidad de enzima en una solución puede ser determinada midiendo su actividad catalítica (la cantidad de sustrato
consumido o producto generado en una unidad de tiempo). Idealmente, una enzima se mide con solución de reacción, que
debe estar a pH óptimo y contener cofactores o coenzimas requeridas, como también sustrato a niveles donde la enzima
estará saturada. Es a menudo más preciso monitorear la aparición de producto que la desaparición de sustrato. El método en
particular dependerá de la enzima en ser cuantificada. La situación más simple es cuando se mide la aparición de un producto
coloreado, midiendo su absorbancia en un espectrofotómetro. Por ejemplo, la lactato deshidrogenasa utiliza lactato y NAD+
como sustrato para producir piruvato y NADH. Ya que el producto, NADH absorbe luz a 340nm, mientras el lactato y NAD+
no lo hacen, la progresión de la reacción puede ser seguida monitoreando la absorbancia a esta longitud de onda. Si una
enzima no forma un producto coloreado, este producto puede ser sometido a una segunda reacción que si pueda ser detectada
espectrofotométricamente. Esto se llama un ensayo acoplado.
Tradicionalmente, una unidad de enzima es definida como la cantidad de enzima que causa la conversión de un micromol de
sustrato por minuto bajo condiciones de medición optimas. En años recientes se ha recomendado una nueva unidad
internacional de medida de la actividad enzimática, la Katal (abreviada kat) y es definida como la cantidad de enzima que
causa el consumo de 1 mol de sustrato por segundo.
1.3.7. Actividad específica, enriquecimiento y rendimiento
Ya que la actividad enzimática solo mide la cantidad de enzima presente y no aporta datos sobre la presencia de otras
proteínas contaminantes, se requiere otra medida para graficar esto, la actividad específica.
La actividad específica se calcula como el número de unidades de enzima por miligramos de proteína total. La actividad
específica de la enzima de interés será baja en el extracto original e irá aumentando durante la purificación hasta un máximo
cuando la enzima esté pura. La actividad específica es una medida de la pureza de la enzima.
Para monitorear la efectividad de una purificación de enzima, no es importante el valor absoluto de la actividad específica,

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ya que esta dependerá de las capacidades intrínsecas de cada enzima. En cambio el aspecto importante es cómo la actividad
específica cambia durante la purificación. El grado de enriquecimiento de la enzima alcanzada en cada etapa puede ser
calculada como se muestra a continuación:
Nivel de purificación = actividad específica de la fracción
actividad específica original
Una purificación exitosa no sólo tiene que aumentar la actividad específica de la enzima, además la enzima debe ser
recuperada con un buen rendimiento. Esto puede ser calculado como sigue:
Rendimiento = unidades de enzima luego del paso de purificación x 100%
unidades de enzima en la preparación original.
Note que el rendimiento de una enzima luego de una purificación en particular puede ser baja no porque el procedimiento
sea incorrecto para purificar la proteína, pero porque produce inactivación de la enzima.
1.3.8. Medición de la pureza
En el paso final de la purificación de la proteína, cuando coincide el perfil de proteína y de actividad enzimática, se puede
creer que la enzima se encuentra purificada. La prueba de que la proteína se encuentra pura solo se puede obtener por
secuenciación química o por espectrometría de masas. De todas maneras se pueden utilizar procedimientos mucho más
simples para analizar la pureza de una proteína. El procedimiento más común es el SDS-PAGE, que es rápido y sensitivo y
separa las proteínas sólo en base a su tamaño. Alternativamente se puede tratar el isoelectroenfoque que separa las proteínas
por diferencias de carga. Idealmente la técnica de elección para verificar la pureza de una muestra de proteína es la
electroforesis bi-dimensional en la que se separan las proteínas por su carga en la primera dimensión (isoelectroenfoque) y
por su peso molecular en la segunda dimensión (SDS-PAGE). Las proteínas que componen la mezcla se visualizan como
manchas en un gel. Dado la alta resolución de esta técnica, una muestra que tiene una sola mancha esta probablemente pura.
2. INSTRUCCIONES
Trabaje en parejas y elabore un documento que entregará al final del laboratorio con las actividades que se describen a
continuación. El documento debe ser enviado como pdf a sergio5515@yahoo.es. Asegúrese de guardar el documento como
Lab 4_Apellido1-Apellido2.pdf. Entregue una copia impresa del documento el martes 24 a las 14:00 en clase.

Parte I.
Para familiarizarse con el uso del programa, haga click en Ayuda → Ejercicios Tutoriales. En este tutorial, usted encontrará
una serie de preguntas y ejercicios a realizar. Responda a todas las preguntas (incluya las gráficas/esquemas pertientes) en el
documento separado que tendrá que entregar al final del laboratorio.

Parte II
El penúltimo ejercicio del tutorial consiste en la purificación de la proteína 10 de una mezcla de 20 proteínas. Pruebe varios
esquemas de purificación, imprima pantalla para mostrar el progreso de la purificación (Figura 1) en cada caso. Seleccione el
esquema que tiene el mayor rendimiento posible y en el documento que entregará, discuta qué pasos en este esquema fueron
claves para lograr este rendimiento. Adjunte las figuras/esquemas que sustenten sus argumentos.

Figura 1. Tabla de progreso de la purificación

Parte III
Realice el último ejercicio de este tutorial. Realice las actividades propuestas en el programa, adjunte sus resultados y
discusión en el documento que entregará al final del laboratorio.

Elaborado por: Dr. Sergio Gutiérrez Cortez IBMB - UMSA

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Webliografía:
1. http://www.ucl.ac.uk/~ucbcdab/enzpur/enzympur.htm En esta página pueden revisar los fundamentos de
las técnicas de separación que aparecen el el programa. Bajen hasta el final de la página y encontrarán links para
cada una de las técnicas.

Elaborado por: Dr. Sergio Gutiérrez Cortez IBMB - UMSA