TINCIONES

COLORANTES

- Catiónicos: se combinan con los constituyentes celulares cargados negativamente tales como ácidos

nucleicos, polisacáridos ácidos y superficies celulares. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta,
Safranina.
- Anionicos: se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como
numerosas proteínas. Ejemplos: Eosina, Fucsina acida y Rojo Congo.
- Liposolubles: se combinan con las sustancias grasas. Ejemplos: Sudan negro

2 TIPOS DE TINCIONES

Positivas: se emplea el uso de colorantes que tiñen al microorganismo y no al medio

- Simples: uso de un solo colorante. Sirven para distinguir formas.

- Diferenciales: uso de un colorante inicial y luego un colorante de contraste. Sirven para diferenciar

distintos tipos de células (Ejemplo: tinción Gram)

Negativas: se emplea el uso de colorantes que no tienen afinidad por los constituyentes celulares (Ejemplo:
nigrosina). Tiñen al medio y no a las bacterias, sirven para ver células con capsulas de mucopolisacaridos.

TINCIÓN DE GRAM (ensayo empírico)

FUNDAMENTO. Se trata de un método fisicoquímico. Permite la diferenciación de dos grandes grupos de

bacterias (Gram+ y Gram-) esto se debe a las diferencias en la estructura de la pared celular. Las bacterias
Gram+ poseen su capa de peptidoglicanos en mayor proporción que las Gram-.

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio
óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea. El modo más
simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes.

IMPORTANCIA. La tinción de Gram es una característica fenotípica muy importante. Se utiliza para la

clasificación taxonómica. También es una herramienta de confirmación.

PROCEDIMIENTO

1- Se colorea la muestra en un portaobjeto con cristal violeta (colorante básico), se deja reposar un
minuto. Como la carga neta de la superficie celular es negativa (carga positivas), el cristal violeta se
pega sobre la superficie celular. Ya que las cargas diferentes se atraen y cargas iguales se repelen.
Por ende, la muestra queda coloreada.

Tinción de Gram Página 1

 2- Se realiza un lavado con agua.
3- Se agrega un mordiente (sustancia que fija a la otra), en este caso se adiciona una solución de I 2/I-
(iodo/ioduro), comúnmente conocida como lugol. I2/I- genera que el cristal violeta cristalice (se
forma cristales solubles y precipita donde este)
El cristal violeta que ya se encuentra retenido en los poros de la pared, el I 2/I-, queda precipitado
dentro de la pared

Lo mismo ocurre en Gram (-). El cristal violeta tiñe las paredes delgadas y el LPS, ya que ambas tienen cargas
netas negativas.

El LPS es más permeable que una membrana citoplasmática por lo tanto el colorante no tiene problemas en
llegar a la pared delgada indistintamente. Cuando se agrega el mordiente, cristaliza tanto en uno como en
el otro.

4- Lavado con agua (puede ser agua corriente)

5- Decoloración. Se utiliza una mezcla de alcohol acetona. Este se deja actuar de 5 a 10 minutos.
El alcohol cetona como es un solvente orgánico, va a disolver los cristales que se generaron con la
adicción del cristal violeta

Cuando se agrega alcohol acetona a la Gram (+), esta se decolora pero solo las capas superficiales. En
cambio, en la Gram (-) barre todo. Esta primero tiene una capa lipídica y grasas con solventes orgánicos se
llevan más que bien.

El alcohol cetona barre con todo el cristal violeta y pasa, barre con todo el cristal violeta de la pared delgada.
Entonces la carga negativa vuelve a quedar disponible.

En cambio la carga neta de la Gram (+) está en su mayoría ocupada por el cristal violeta.

Los solventes orgánicos solubles en agua, como la cetona, generan una deshidratación en las estructuras de
la pared haciendo que los poros se cierren por lo que esto genera que el cristal violeta se fije.

Entonces en la Gram (+) la decoloración es solo superficial, el resto de la pared continua coloreada. Como
dicho tiempo determinado, Gram se dio cuenta que alcanzaba para decolorar a unas y a otra no. Ahí se dio
cuenta de la diferencia de estructuras, y que esa diferencia de estructura le daba cierta resistencia a la
decoloración a un tipo de bacteria por esos segundo de tiempo.

Por eso hay que repetir fielmente el procedimiento, ejemplo, si se deja por un minuto vamos a encontrar
igual de decoloradas a ambas tipos de bacterias, Gram (+) daría un falso Gram (-)

6- Lavado con agua

Tinción de Gram Página 2

 7- Colorante de contraste, el más habitual es la colorante básico de carga neta positiva, es la safralina
por un minuto, cuando se agrega la safralina, los espacios de la carga negativa de la Gram (-) están
libres, por ende se van a teñir con la safralina.
Probablemente también se tiña las capas superficiales de la Gram (+) pero va a predominar el violeta.
8- Lavado con agua y secado. Todos los colorantes se colocan en exceso. De manera convencional
Gram (+) violeta
Gram (-) rojo-rosado

Quizá si se cambia el orden del colorante, probablemente el Gram (+) será rojo-rosado y viceversa. Hay que
ver el grado de cristalización que se pueda alcanzar con el mordiente, y luego usar cristal violeta como
contraste.

Si los colorantes están diluidos, hay que ver si se forma la suficiente cantidad de exceso. Probablemente si
está muy diluido el cristal violeta, la decoloración arrastres todos los cristales.

Con el colorante de contraste no hay mucho problema porque su condición es que tenga otro color y que
sea con cargas neta positiva. También puede usarse fucsina.

Situación especial: carga neta de la membrana celular es tirando a neutro (nunca va a ser positiva una
membrana externa, puede ser poco negativa monas), se tiene que usar otro colorante de contraste de carga
neutra o casi neutra.

Gram variable

Va de Gram (+) a Gram (-), nunca al revés

Cuando la célula envejece (sigue metabolizando pero no se duplica), puede suceder que las capas
externas se hidrolicen y se pierdan, quedando una pared delgada, le ocurre lo que le ocurre al Gram -

Con tinción de Gram, da un falso negativo

Hace que la célula sea más permeable y como queda con una pared delgada, es incapaz de retener
cristales violetas.

Tinción de Gram Página 3

 TINCIÓN DE ESPORAS

Endoespora bacteriana: estructura bacteriana altamente resistente al calor y a condiciones ambientales

desfavorables. El principal desencadenante de la formación de esporas es la falta de nutrientes. Se observan
en los generos Bacillus y Clostridium (Gram +). Son altamente resistentes a:
-Calor
-Desecación
-Ácidos
-Álcali
-Desinfectantes

Protocolo:

1- Preparación del extendido y fijación por calor.

2- Cubrir con verde de malaquita calentando durante 3 minutos.
3- Lavar con agua.
4- Agregar colorante de contraste (safranina).
5- Lavar con agua.

Tinción de Gram Página 4

 Tinción de Gram (ejercicio)

Que sucede en una tinción de Gram si

1- Poseo lugol 100 veces diluido. El lugol sirve para precipitar el cristal violeta, cristalizar el cristal

violeta y que quede dentro de la estructura de la pared (que quede, en los poros, pegado) y eso le da
la resistencia al lavado con agua y la decoloración. Si esta diluido el lugol, el cristal violeta no
cristaliza, aun esta soluble. Entonces el agua se ve a llevar parte del colorante cristal violeta. Van a
quedar estructuras vacías disponibles para la safralina (colorante contraste). Al microscopio lo que
tendría que ser un Gram (+) va a ser un falso Gram (-). En la tinción de Gram se usa todo
concentrado para lograr saturación.
2- Tiño un cultivo viejo. Si es un Gram (+), va a seguir siendo Gram (+). Al igual que el Gram (-). Pero

el cultivo es un Gram variable va a dar Gram (-)

El Gram (-) no es ya en condiciones de retener el colorante cristal violeta en sus capas exteriores. No
es que el Gram (-) del Gram variable va a producir LPS lo que sucede en un Gram variable es que
cuando es viejo su pared celular se afina y no se retiene el cristal violeta
3- Si el colorante actúa 2 minutos. En los 5-10 segundos que se deja el decolorante, la pared de Gram

(+) retiene la mayor parte del colorante. Dando el color violeta pero se me paso con el tiempo, por
ejemplo 2 minutos, se va a seguir decolorando y se van a solubilizar todos los cristales. Barre con
todo el colorante, dando un falso Gram (-). Además se va a deshidratar.
4- Si el primer colorante actúa por 2 minutos. En la tinción de Gram, se agrega el colorante a una

concentración adecuada en exceso a la muestra para que la estructura se sature. Un minuto alcanza
para que la estructura se sature. Si lo dejamos dos minutos, solo estamos perdiendo tiempo. No
hace la diferencia
El tiempo de actuación del colorante no influye porque lo que se quiere es saturar y más de la
saturación no va a pasar.
5- Si tiño un micoplasma y una levadura. El objetivo de la tinción de Gram es tener la pared de las

bacterias.
- Micoplasma. No tiene pared. Tiene membrana citoplasmática, tiene carga negativa por lo que no se

va a teñir. Va a dar un falso Gram (-) porque la membrana plasmática no retiene el colorante.
- Levadura. Al tener una pared mucho más compleja y ser eucariota, me da como resultado de la

tinción una Gram (+), pero no tiene sentido teñir.

6- Si la fijación por calor se extiende demasiado. En tinción de Gram cualquier tinción, primero hay

que fijar la muestra a un portaobjeto.

Se fija por calor. Se coloca la muestra en el vidrio, se agrega una gotita de agua, se desparrama (para
distribuir la colonia sino se vería un cumulo de cosas). Se seca en la llama del mechero a una altura
prudencial. Siempre la muestra muere.

Tinción de Gram Página 5

 Se le da calor hasta que se seque (hasta que se evapore todo el líquido). Cuando esto sucede las
proteínas de la muestra coagulas y se pegan en el vidrio. Fijación.
Si extiendo demasiado el tiempo de fijación por calor, se quema la muestra y después se ve oscuro,
no se puede ver. Entonces no se distingue la tinción de Gram, quizá solo se distingue morfología.
7- Si invierto el orden de los colorantes. Como ambos colorantes tienen carga positivas (colorantes

básico) suponiendo que la fucsina o safralina (colorante contraste) tengan la misma capacidad de
cristalización con el lugol que tiene el cristal violeta. Entonces probablemente se invierte los colores.
Gram (+) dará rosado y Gram (-) dará violeta

Tinción de Gram Página 6