Anda di halaman 1dari 44

VALIDASI & VERIFIKASI METODA

MIKROBIOLOGI

Minggu, 19 November 2017


Labkesda DKI Jakarta
Ivan Sarifudin, S.T.

1
Penentu Kehandalan Analisis Mikrobiologi

Metode Analisa Peralatan Analis/Pelaksana

• Metode Standar • Neraca


• Pengetahuan
• Modifikasi • LAF
• Ketrampilan/kompeten
• Penyederhanaan • Pipet
• Ketelitian
• Inkubator
• Autoklaf

VALIDASI & VERIFIKASI TRAINING & UJI


KALIBRASI
METODE KOMPETENSI
2
Jenis Metode Uji

• Metode Standar : SNI, ASTM, ISO, dll


• Metode Resmi : Farmakope, EPA, dll
• Metode yang dikembangkan oleh organisasi profesional
yang memiliki reputasi nasional dan internasional : AOAC
• Metode Pustaka
• In house methode
• Metode Modifikasi

3
Pemilihan Metode
Faktor yang menjadi pertimbangan :

 Asal metode
 Status metode
 Apakah lab. menguasai teknologinya ?
 Apakah SDM/Analis kompeten ?
 Biaya & waktu yang dibutuhkan
 Metode mudah diaplikasikan
 Kondisi akomodasi & peralatan lab. memadai ?

4
Validasi

• Validasi adalah konfirmasi


melalui pengujian dan
pengadaan bukti yang
objektif bahwa metode
tersebut telah memenuhi
persyaratan yang telah
ditentukan.

5
Mengapa dilakukan Validasi ???

 Persyaratan ISO/IEC 17025-2005.


 Banyak lab. menggunakan metode uji dari manual book/alat.
 Lab. di daerah kesulitan mendapatkan reagensia/media tertentu
sehingga lab memangkas metode standar.
 In house method sebagai alternatif yaitu dengan memodifikasi
metode standar.

6
Kapan Validasi dilakukan ???

Apabila Laboratorium menggunakan ;


 Metode tidak baku
 Metode baku yang dimodifikasi
 Metode baku yang digunakan diluar lingkup yang dimaksud
 Metode yang dikembangkan oleh Laboratorium

7
Verifikasi

• Verifikasi metode adalah


konfirmasi melalui pengujian
dan pengadaan bukti yang
obyektif bahwa persyaratan
yang ditentukan oleh metode
yang bersangkutan telah
dipenuhi

8
Kapan Verifikasi dilakukan???
Apabila laboratorium menggunakan metode baku yang sudah
divalidasi oleh organisasi yang berwenang.
ISO/IEC 17025:2005 Pasal 5.4. (Metode Pengujian) Butir 5.4.2. :
”Laboratorium harus memastikan bahwa dapat menggunakan
metode standar dengan baik sebelum melakukan pengujian”

”Jika ada perubahan metode standar harus dikonfirmasi ulang”

9
Mengapa metode standar harus
diverifikasi ???
 Lab harus meyakinkan bahwa metode tsb dapat diterapkan
terhadap jenis sampel yang diuji
 Lab dapat mengetahui masalah yang timbul dalam
menerapkan metode tersebut
 Lab dapat mengetahui unjuk kerja analis dalam melakukan
pengujian dengan metode tsb
 Lab dapat menunjukkan bahwa pengujian dilakukan
dengan benar (memenuhi persyaratan tertentu)

10
Metode pengujian

 Kualitatif : menentukan ada atau tidaknya


mikroorganisme target pada sampel uji. Hasil uji
umumnya dinyatakan sebagai positif atau negatif

 Kuantitatif : menentukan jumlah mikroorganisme pada


sampel uji baik secara langsung (jumlah koloni) atau
tidak langsung (MPN, absorbance, dll)

11
METODA PENGUJIAN
1. Kuantitatif
 Hitungan Cawan
Pour plate : TPC, Y&M, Coliform, Enterobacteriaceae,dll.
Spread Plate : Y&M, S.aureus, B.cereus, dll.
 Petrifilm : TPC, Y&M, Coliform, dll

2. Semi kuantitatif
 MPN : Coliform, E.coli, dll.

3. Kualitatif
 Isolasi : E.coli, Salmonella, V.cholera,
L.monocytogenes, dll.

12
Acuan validasi metode kuantitatif
 Sac-Singlas, 2002. Guidance Notes C&B and ENV 002.
Method Validation of Microbiological methods
 ISO16140:2003 (Amd2011), Microbiology of Food and
Animal Feeding Stuffs —Protocol for the Validation of
Alternative Methods
 AOAC, 2012, International Methods Committee
Guidelines for Validation of Microbiological Methods for
Food and Environmental surfaces
 NordVal International Protocol for the validation of
microbiological alternative (proprietary) methods,
against a reference method. 2 June 2016

13
Acuan validasi metode kualitatif
 ISO16140:2003 (Amd2011), Microbiology of Food and
Animal Feeding Stuffs —Protocol for the Validation of
Alternative Methods
 AOAC, 2012, International Methods Committee Guidelines
for Validation of Microbiological Methods for Food and
Environmental surfaces
 US-FDA 2015, Guidelines for the Validation of Analytical
Methods for the Detection of Microbial Pathogens in Foods
in Feeds. 2nd edition
 NordVal International Protocol for the validation of
microbiological alternative (proprietary) methods, against a
reference method. 2 June 2016.
14
Validasi Metode Kuantitatif

Method Validation of Microbiological Methods,


Guidance Note : C & B and ENV 002. Singapore
Acreditation Council,
July 2002

15
Umum
 Lingkup pedoman validasi metode mikrobiologi untuk makanan, air dan
produk farmasi, dengan penekanan khusus pada metode kuantitatif di
mana perkiraan kuantitatif didasarkan pada penghitungan partikel pada
dasar pertumbuhan (multiplikasi) menjadi koloni atau kekeruhan.
 Prinsip-prinsip dan prosedur dalam lingkup ini umumnya dikenal sebagai
jumlah total koloni, jumlah paling mungkin (MPN) dan jumlah koloni
organisme target khusus pada media selektif.
 Pedoman ini tidak berlaku untuk validasi metode cepat (rapid methods)
yang tergantung pada pengukuran produk atau perubahan karena aktivitas
mikroba tetapi tidak mengatasi deteksi partikel individu dan metode
pengujian mikrobiologi menggunakan mikroorganisme sebagai alat uji.

Singapore Acreditation
Council, July 2002. 16
 Laboratorium diharapkan menggunakan referensi/metode standar yang

dipublikasikan untuk pengujian mikrobiologi.

 Laboratorium yang menggunakan referensi/metode standar tidak

diharuskan untuk menunjukkan validasi dari metode ini, tetapi hanya perlu

menunjukkan validasi sekunder (juga disebut verifikasi).

 Verifikasi diperlukan pengguna laboratorium hanya untuk memverifikasi

bahwa metode dapat memenuhi tujuan dan persyaratan untuk aplikasi

analisis yang dimaksud.

Singapore Acreditation
Council, July 2002. 17
 Dalam situasi di mana laboratorium untuk mengembangkan in-house
metode, membuat modifikasi standar metode / referensi atau

menggunakannya di luar penggunaan yang dimaksudkan, laboratorium

harus melakukan validasi metode.

 Mikroorganisme acuan yang digunakan untuk validasi harus diperiksa

kemurniannya dengan cara plating permukaan non-selektif dan selektif

media yang tepat dan pemeriksaan mikroskopis. Uji kemurnian kultur

dapat menggunakan metode konvensional atau rapid methods yang

disetujui untuk digunakan dalam referensi/metode standar jika

diperlukan.
Singapore Acreditation
Council, July 2002. 18
Parameter Validasi Metode Analisis
Mikrobiologi
1. Akurasi
2. Presisi (repeatability, reproducibility, dan intermediate
precision)
3. Sensitifitas & Spesifisitas
4. Selektifitas
5. Relatif recovery rate
6. Rentang hitung yang diterima (acceptable), batas atas dan
batas bawah dari rentang perhitungan
7. Ketangguhan (Robustness)

Singapore Acreditation
Council, July 2002. 19
1. Akurasi (Kecermatan)
 Akurasi adalah kemampuan metode untuk mengukur nilai yang sebenernya dari
mikroorganisme target dalam sampel.
 Dilakukan setidaknya 5 kali pada konsentrasi mikroba uji, dan dilakukan triplo dari
masing-masing dilusi.
Parameter :
Recovery (Perolehan Kembali)
Teknik analisis yang dilakukan dengan menambahkan kultur acuan pada
konsentrasi tertentu dalam suatu matriks contoh.
 Sebaiknyan gunakan contoh yang tidak mengandung sample yang tidak tercemar
(jika diperlukan lakukan sterilisasi).
 Laporakan hasil rata-rata dari masing-masing metode dan hitung persentasi
antara metode uji dan metode standar. Singapore Acreditation
Council, July 2002. 20
Contoh perhitungan akurasi & Relatif Recovery Rate

Singapore Acreditation
Council, July 2002. 21
2. Presisi (Keseksamaan)

 Presisi adalah tingkat kesesuaian antara hasil pengujian


individual dengan hasil rata-rata pengujian yang dilakukan
berulang pada sampel yang homogen.
 Repeatability (within lab), Reproducibility (between lab),
Intermediate precision (within laboratory variation)
Parameter :
 Relatif Standar Deviasi
 Koefisien Variasi

Singapore Acreditation
Council, July 2002. 22
 Repeatability (keterulangan) : variasi dalam independent test
terhadap sampel yang sama oleh analis yang sama dengan interval
waktu yang singkat.
 Reproducibility (ketertiruan) : variasi dalam independent test
terhadap sampel yang sama namun dilakukan oleh analis dan
laboratorium yang berbeda.
 Intermediate precision (keseksamaan antara) : variasi hasil
laboratorium pada hari yang berbeda, atau analis yang berbeda,
atau alat yang berbeda di dalam laboratorium yang sama.
 Dilakukan 15 kali pada 3 level konsentrasi (rendah, sedang, tinggi).

Singapore Acreditation
Council, July 2002. 23
Presisi

 ((Log a – log b) / x1)2


RSD =
2n

CV (coefisien of variation) = RSD x 100%

Keberterimaan :
RSD maksimum 0,1 (Ideal < 0,02)
Coevisien variasi, CV % : 100 x RSD

24
3. SENSITIFITAS & SPESIFISITAS
1.Sensitifity : kemampuan metoda dalam memberikan hasil positif
terhadap sampel presumtif positif.
2.Spesificity : kemampuan metoda dalam memberikan hasil negatif
terhadap sampel presumtif negatif.
3. False positive rate : pengamatan hasil positif yang salah.
4. False negative rate : pengamatan hasil negatif yang salah.
 Karakteristik kinerja ini berlaku untuk metode selektif dan dilakukan
verifikasi dugaan koloni positif dan negatif pada cawan atau
pertumbuhan positif dan negatif pada tabung (MPN).

Singapore Acreditation
Council, July 2002. 25
 Validasi : setidaknya gunakan tiga strain mikroorganisme
dalam proses spiking.
 Verifikasi : gunakan satu atau lebih mikroorganisme
dalam proses spiking.
 Validasi : semua presumtif positif dan negatif harus
dikonfirmasi.
 Verifikasi : hanya presumtif positif yang dikonfirmasi.

26
Confirmed Presumtive
Positif Negatif
Positif A B
(positive) (false negative)
C D
Negatif (false positive) (negative)

Sensitifitas = A/(A+B)
Spesifitas = D/(C+D)
False positive rate = C/(A+C)
False negatif rate = B/(B+D)
Efficiency = (A+D)/n
Selektifitas absolute = log (A/n)
Selektifitas apparent = F = log [(A+C)/n
n = A+B+C+D
Singapore Acreditation
Council, July 2002. 27
4. Rentang Hasil Pengujian
 Rentang hasil pengujian menunjukkan nilai terendah dan nilai
tertinggi dari pengujian yang dapat ditentukan dengan cermat
dan seksama.
 Batas rendah (Lower limit)
Hasil pengujian terendah yang ditandai dengan galat analisis
yang diperbolehkan tidak lebih dari 20%.
 Batas tertinggi (Upper limit)
Hasil pengujian koloni tertinggi yang masih dapat dihitung
dengan cermat dan seksama, galat analisis 15%.

Singapore Acreditation
Council, July 2002. 28
 Rentang hasil pengujian (lempeng agar) :
Makanan & farmasi : 25-250 koloni
Sampel air : 30-300 koloni
Kapang (A.brasilliensis) : 8-80 koloni

Singapore Acreditation
Council, July 2002. 29
Ketangguhan (Robustness)
 Robustness adalah kemampuan metode untuk tetap tidak
berpengaruh oleh variasi/keragaman parameter metode (misal :
waktu inkubasi, suhu inkubasi) dan menunjukkan hasil yang
reliable selama metode tersebut digunakan.
 Efek waktu inkubasi pada koloni hitungan bisa ditentukan
dengan cara menghitung sama cawan sampel dua kali pada dua
waktu inkubasi ekstrem yang ditentukan oleh metode.
 Efek suhu inkubasi pada koloni hitungan bisa ditentukan dengan
menginkubasi piring duplikat dari sampel yang sama pada
kedua suhu inkubasi ekstrim ditentukan oleh metode.
 Analisis statistik seperti Student t-test dapat digunakan untuk
melihat perbandingan cawan paralel diperoleh dari dua inkubasi
ekstrem waktu atau suhu inkubasi.
Singapore Acreditation
Council, July 2002. 30
Tahapan Validasi/Verifikasi

Memilih Organisme Uji


Memilih matriks sample
Melakukan pengujian sesuai prosedur
 Interpretasi hasil

31
Syarat,,,,

 Menggunakan peralatan yang terkalibrasi


 Dilakukan oleh personil yang kompeten
 Media/Reagent yang digunakan sesuai
spesifikasinya.
 Kondisi lingkungan memadai

32
Memilih Organisme Uji

Sesuai KAN-TN-LP 02
 MO acuan berasal dari koleksi yang diakui
 Menjamin ketertelusuran
 Dipelihara oleh Penanggungjawab MO acuan
 Pemeliharaan sebagai berikut :

33
Strain (ATCC, NTCC)

Subkultur sekali

*
Persediaan acuan
(Liofilisasi)

Dicairkan

Kultur kerja

*
(Penggunaan rutin)
* : uji kemurnian 34
Memilih Organisme Uji

 Kultur acuan yang dinyatakan sebagai kontrol positif harus


merupakan salah satu dari strain tersebut.
 Strain yang lain dipilih dari hal berikut :
• Strain dari organisme target yang diisolasi oleh
laboratorium dari sampel terdahulu dalam matrik yang
diperiksa.
• Strain dari organisme target yang dikumpulkan oleh kultur
collection.

35
Memilih Matrik Sampel

Tujuan seleksi sampel adalah untuk memilih sampel yang


mewakili lingkup variasi yang akan ditemui dalam matriks yang
telah ditentukan.
Dapat menggunakan sample yang tercemari secara alami atau
dapat menggunakan sample yang dicemari (spike sample).
Perhatian harus diutamakan pada mendeteksi jumlah dan
homogenitas kontaminan.

36
Persiapan matriks contoh Validasi & Verifikasi

1. Disiapkan sampel
2. Dilakukan spiking kultur
3. Dilarutkan dengan 9 bagian pelarut
4. Dihomogenisasi

37
Metode Spike Sample
Menghitung Populasi pada Biakan Murni
Hari ke 1

1 loop
Inkubasi selama
18-24jam pada
Biakan murni BHI- suhu 35-37 0C
dalam agar miring Broth/media
lainnya 10 ml

38
Metode Spike Sample

Menghitung Populasi pada Biakan Murni


Hari ke 2
Dst. 10-7 10-8 10-9
10-1 10-2 10-3

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
1 ml
BHI-Broth BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml
10 ml 1 ml

Hit. Jumlah Inkubasi selama 48 jam


koloni/ml pada suhu 36±1 0C

39
Metode Spike Sample
Menghitung Populasi pada Biakan Murni
Hari ke 4
Menghitung jumlah bakteri dalam cawan petri

Ulangan 10-7 10-8 10-9 Hasil

1 241 24 3
2,4 x 109 kol/ml
2 238 22 2

40
Pembuatan Spike Populasi Rendah

Dst
10-1 10-2 . 10-8

90 ml
1 ml 1 ml 10 ml sample
1 ml

BHI-Broth BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml Didapatkan 1 : 10 spike


10 ml sample populasi rendah
(2 kol/ml atau/gr)

41
Pembuatan Spike Populasi Sedang

Dst.
10-1 10-2 10-7

90 ml
1 ml sample
1 ml 1 ml 10 ml

BHI-Broth BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml


10 ml Didapatkan 1 : 10
spike sample
populasi sedang
(2,0 x 101 kol/ml atau/gr)

42
Pembuatan Spike Populasi Tinggi

10-1 10-2 10-6

90 ml
1 ml 1 ml 10 ml sample
BHI-Broth BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml
1 ml Didapatkan 1 : 10
10 ml
spike sample
populasi tinggi
(2,0 x102 kol/ml atau /gr)

43
The N

44