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GUÍA  PRÁCTICA  DE  MANEJO  Y  USO  DEL  EQUIPO  Y  SOFTWARE  DE  HPLC  
 
 
Expositora:  Blga.  Michelle  Chirinos  Arias  
 
 
1. EQUIPOS  Y  REACTIVOS  REQUERIDOS  
 
EQUIPOS  
• HPLC  (Shimadzu)  
• Computadora  
• Software  
 
MATERIAL  Y  REACTIVOS  
• Metanol  grado  HPLC  
• Acetonitrilo  grado  HPLC  
• Agua  grado  HPLC  
• Estándar  de  inmunosupresor.  
• Columna  C18  
• Jeringas  
• Filtro  para  HPLC  
• Micropipetas  
• Tips  de  10,  100  y  1000  ul.  
 
2. Preparación  de  Estándares  
 
Usar  fórmula          C1.V1=C2.V2  
Siendo  1  inicial  y  2  final  
 

 
 
3. MANEJO  DEL  EQUIPO  DE  HPLC  Y  SOFTWARE  
• Prender  la  computadora  
• Conectar   el   equipo   y   prender   el   desgasificador,   la   bomba,   el   horno   de   la   columna,   el   detector  
y   por   último   el   controlador   del   sistema.   (ver   figura   1   con   las   partes   del   HPLC).   Siempre   en   ese  
orden.  
• Abrir  el  software  LC  Solution  y  seleccionar  1,  esto  debido  a  que  en  este  caso  la  computadora  
solo  controla  1  equipo  de  HPLC.  

 
Michelle C. Chirinos Arias
Jefa de Laboratorio
Centro de Diagnóstico Molecular
 
         
• Aparecerá   una   pantalla   emergente   pidiendo   la   contraseña,   dar   OK.   En   estas   máquinas   por  
default  se  les  coloca  sin  contraseña.  
• Se  escuchará  2    timbres,  el  primero  corresponde  a  la  conexión  y  revisión  del  todo  el  sistema  
con  la  PC  y  el  segundo  a  la  autenticación.  En  otros  equipos  se  puede  escuchar  hasta  3  timbres  
que  corresponden  a  lo  mismo.  
• Luego  aparecerá  la  pantalla  en  tiempo  real.  

• Esperar  20  minutos  a  que  el  equipo  se  estabilice  y  que  la  lámpara  caliente.  
• Prender  la  bomba  (Pump)  en  el  software  haciendo  click  en  el  icono,  como  se  muestra  en  la  
sgte.  Figura.  

• Prender  el  horno,  haciendo  click  en  el  sgte.  Botón.  

• Una  vez  alcanzada  la  temperatura  de  60°C,  se  puede  correr  la  línea  base.  Haciendo  click  en  el  
siguiente  icono.  

• Pasado  los  15  minutos  de  la  corrida  de  la  línea  base,  verificar  que  ésta  sea  recta,  si  no  volver  a  
correrla.    
• Abrir  el  inyector  de  muestra  y  voltear  la  perilla  hacia  la  izquierda.  
• Inyectar  la  muestra,  asegurándose  que  no  exista  ninguna  burbuja.  
 
• Click  en  el  botón  Single  start.  
 
• Aparecerá  la  pantalla  Single  Run  donde  se  colocará  el  nombre  de  la  muestra,  su  ID,  el  método  
a  usar    y  el  Data  File  (colocar  el  nombre  de  la  muestra)  y  dar  OK.  
 

Michelle C. Chirinos Arias


Jefa de Laboratorio
Centro de Diagnóstico Molecular
 
         

• Por   último   aparecerá   una   ventana   a   la   cual   se   le   debe   dar   OK,   al   mismo   tiempo   que   se   gira   la  
perilla   del   inyector   a   la   derecha   (ya   que   en   nuestro   caso   es   un   HPLC   con   muestreador  
manual).  Esta  ventana  indica  que  la  lectura  debe  empezar  por  ello  es  necesario  bajar  la  perilla  
ya  que  en  ese  momento  la  muestra  estaría  entrando  a  la  columna.  
• Luego  de  la  corrida,  hacer  click  en  post-­‐run  
 

 
 

•  Aparecerá   la   siguiente   pantalla   la   cual   muestra   el   resultado   de   la   concentración   del  


inmunosupresor,  en  el  tiempo  de  retención  establecido  por  los  estándares,  el  cual  se  delimita  
por  una  línea  vertical  (regresión  lineal).  

Desgasificador

PC

Bomba

Muestreador

Detector

Horno de columna
 

Fig.  1  Partes  del  Equipo  de  HPLC  


 
 
 
 

Michelle C. Chirinos Arias


Jefa de Laboratorio
Centro de Diagnóstico Molecular
 
         
 
 
4. INTERPRETACIÓN  DE  RESULTADOS  

El   área   del   pico   del   cromatograma   es   directamente   proporcional   a   la   concentración   de   la   muestra.   Para  
determinar  la  concentración  del  inmunosupresor,  se  debe  tener  una  curva  de  calibración,  donde  se  conozca  la  
absorbancia     y   el   tiempo   de   retención   de   los   estándares.   El   analito   (compuesto   de   interés)   aparecerá   en   el  
mismo  tiempo  de  retención  que  los  estándares,  pero  su  pico  y  por  consiguiente  el  área  variará.    

 
5. Purgado  de  equipo  
 
Una  parte  del  mantenimiento  preventivo  de  la  bomba  del  HPLC  es  el  purgado,  que  significa  eliminar  burbujas  y  
contaminantes  de  las  mangueras  que  llevan  la  fase    móvil.  Para  ello  es  necesario  abrir  el  método  de  limpieza  
del   equipo   y   aumentar   el   flujo,   considerando   primero   al   solvente   A   hasta   que   no   haya   burbujas   y   al   solvente   B  
de  la  misma  forma.  Para  ello  girar  la  manija  que  se  encuentra  en  la  bomba    hacia  la  dirección  open  (izquierda)  
se  verá  salir  las  burbujas  por  un  tubo  que  conecta  al  desecho.  
 
 
6. Mantenimiento  y  limpieza  del  equipo  
 
El   método   de   limpieza   del   equipo   de   HPLC   puede   cambiarse   dependiendo   del   operador,   usualmente   son   15  
minutos  del  solvente  “A”  o  hasta  que  la  línea  base  que  se  está  corriendo  sea  estable.  Por  ultimo  hacer  lo  mismo  
con  el  segundo  solvente  o  de  preferencia  agua  grado  HPLC.  
 
 
7.  PREGUNTAS  DE  ENTENDIMIENTO  
 
1. ¿Cuál  es  el  principal  indicio  que  mi  columna  está  sucia  o  que  su  tiempo  de  vida  ya  está  por  terminar?  
2. Si  el  líquido  es  viscoso  ¿qué  pasa  con  la  velocidad,  la  presión,  la  temperatura?  
3. ¿Cómo  establezco  el  tiempo  de  retención  de  la  muestra?,  ¿qué  pico  debo  considerar?  
 
8.  CÁLCULOS  QUÍMICOS  
 
La   curva   estándar   se   establece   de   acuerdo   al   rango   donde   se   espera   se   encuentren   los   resultados.   Por   ejemplo  
si  los  resultados  usualmente  se  encuentran  en  el  rango  de  30  a  50ppb.  Se  recomienda  que  la  curva  estándar  
conste   de   las   siguientes   concentraciones   20,   30,   40,   50   y   60   ppb.   Es   recomendable   que   se   usen   al   menos   3  
puntos,  obviamente  si  hay  más  puntos  el  sesgo  es  menor.  
 
1. A  partir  de  un  STD    de  1ppm  preparar  un  nuevo  STD    de  500ppb  
2. A  partir  de  un  STD  de  100ppb  preparar  un  STD  de  10ng/mL  
3. Preparar  500ml  NaOH  de  1M  
4. Tengo  un  STD  stock  de  0.75  mg  (sólido)  ¿cómo  preparo  a  partir  de    ello  mi  STD  de  75ppm?  
5. ¿qué  significa  preparar  una  solución  al  20%  (p/v)?  Y  al  30%  (v/v)?  
6. Si  mi  stock  está  a  500ng/mL  como  preparo  los  siguientes  STD  20,  30,  40,  50  y  60  ppb?  
2
7. Los  valores  de  mi  curva  STD  arrojan  un  R  de  0.65  ¿qué  puedo  decir  de  la  curva?  
8. Los  valores  del  área  de  la  curva  de  la  pregunta  6  son    25,  35,  45,  67  y  70  respectivamente  y  el  valor  del  
área  de  mi  muestra  es  de  48.  Según  esto  ¿cuál  es  la  concentración  de  mi  muestra  en  ng/mL?  
Michelle C. Chirinos Arias
Jefa de Laboratorio
Centro de Diagnóstico Molecular
 
         
 
SOLUCIÓN  
 
PREGUNTAS  DE  ENTENDIMIENTO  
 
1. La  presión  aumenta,  para  que  el  flujo  se  mantenga  constante.    
2. La   velocidad   debería   disminuir   pero   para   que   no   ocurra   esto   la   presión   aumenta   y   la   temperatura  
debería  aumentarse,  ya  que  al  aumentar  la  temperatura,  la  presión  disminuye.  Todo  está  relacionado.  
3. Lo   establezco   de   acuerdo   al   pico   del   STD.   A   veces   pueden   aparecer   varios   picos,   el   que   debo  
considerar  usualmente  es  el  más  grande  y  el  que  va  disminuyendo  a  medida  que  la  concentración  de  
los  STD  que  coloco  van  disminuyendo.    
 
CÁLCULOS  QUÍMICOS  
 
1. 1ppm=  1000ppb  
C1.V1=C2.V2   Yo elijo el V2
1000ppb.V1=  500ppb.  10ml  
V1=  5ml  
Tomar  5ml  del  stock  de  1ppm  y  enrazar  con  solvente  hasta  10ml  
 
2. 1ppb=1ng/uL  
C1.V1=C2.V2  
100ppb.V1=  10ppb.  10ml    
V1=  1ml  
Tomar  1ml  del  stock  de  1ppb  y  enrazar  con  solvente  hasta  10ml  
 
3. NaOH  peso  molecular  de  40g  
M=(n/V)=  (w/PM)/V               El  volumen  debe  estar  en  litros  
1=  (w/40)/0.5         despejo  y  hallo  w  en  gramos  
w=  20  g  
pesar  20g  de  NaOH  y  agregarlo  en  500ml  de  agua.  
 
4. 1ppm=1mg/L  
75ppm=  (0.75mg)/xL  
X=  0.01  L  o  10  ml  
Colocar  los  0.75g  del  STD  en  10ml  de  solvente.  
 
5. 20  g  del  soluto  A  en  100ml  del  solvente  B  y  30  ml  de  la  solución  A  en  100ml  de  la  solución  B.      
6. 500ng/uL=500ppb    
para  20;  C1.V1=C2.V2;  500ppb.  V1=  20ppb.2000uL;  V1=80uL  

Michelle C. Chirinos Arias


Jefa de Laboratorio
Centro de Diagnóstico Molecular
 
         
para  30;    C1.V1=C2.V2;  500.V1=30.2000uL;  V1=  120uL  
para  40;  C1.V1=C2.V2;  500.V1=  40.  2000uL;  V1=  160uL  
para  50;  C1.V1=C2.V2;  500.V1=50.2000uL;  V1=  200uL  
para  60;  C1.V1=C2.V2;  500.V1=60.2000uL;  V1=  240uL  
2
7.  Es  mejor  repetirla,  la  curva  debe  tener  un  R  cercano  a  1.    
8. La   curva   al   colocarla   en   Excel   (usando   el   área   del   pico   como   ordenada   y   la   concentración   como  
abscisa)  sale  como  en  la  figura.  Usando  eso  puedo  calcular  la  concentración  si  el  área  es  de  48.  Para  
ello  reemplazo  en  la  fórmula  48=  1.22x  -­‐0.4.  Siendo  x  la  concentración  de  mi  muestra  igual  a  39.67  ppb  
o  39,67  ng/mL.  
 

y  =  1.22x  -­‐  0.4  


80  
á R²  =  0.95952  
r 70  
e 60  
a  
d 50  
e 40  
l   Serie1  
30  
p
i 20   Lineal  (Serie1)  
c
o   10  
0  
0   20   40   60   80  
Concentración  
                                                           
 
 
y  sería  recomendable  eliminar  algún  STD  ¿Cuál  se  eliminaría?,  ¿cambiaría  en  algo  la  curva?,  ¿cuál  de  ellas  es  
mejor?  
 
2
Se  obtendría  un  mejor  R  si  se  elimina  el  cuarto  dato,  además  sería  más  lineal.  Sin  embargo  estadísticamente  se  
recomienda  5  puntos  en  una  curva,  por  lo  que  lo  mejor  sería  volver  a  procesar  el  cuarto  estándar  y  medirlo  
para  incluirlo  nuevamente.  

Michelle C. Chirinos Arias


Jefa de Laboratorio
Centro de Diagnóstico Molecular