Anda di halaman 1dari 41

i

PERCOBAAN VI
AKTIVITAS SPESIFIK ENZIM α-AMILASE

JURNAL PRAKTIKUM BIOKIMIA

Oleh:
Sesika Novari 24030115130116
Trie Nanda M.P 24030115130117
Galih Saputra 24030115130119
Mawas Kuntum K. 24030115130120
Damar Rifai S. 24030115130122

Departemen Kimia
Fakultas Sains dan Matematika
Universitas Diponegoro
2017

i
ii

HALAMAN PENGESAHAN
Jurnal Praktikum Biokimia

Judul Praktikum : Aktivitas Spesifik Enzim α-amilase


Nama : Sesika Novari (NIM. 24030115130116)
Trie Nanda M.P (NIM. 24030115130117)
Galih Saputra (NIM. 24030115130119)
Mawas Kuntum K. (NIM. 24030115130120)
Damar Rifai S. (NIM. 24030115130122)
Semarang, 12 September 2017
Mahasiswa Praktikum,

Sesika Novari Trie Nanda M.P


NIM. 24030115130116 NIM. 24030115130117

Galih Saputra Mawas Kuntum K. Damar Rifai S.


NIM. 24030115130119 NIM. 24030115130120 NIM. 24030115130122

Menyetujui
Asisten Praktikum,

NIM. Commented [I1]: Diisi yak 

ii
iii

DAFTAR ISI

HALAMAN SAMPUL DEPAN ............................Error! Bookmark not defined.


LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA ................ Error! Bookmark not defined.
HALAMAN PENGESAHAN................................Error! Bookmark not defined.
DAFTAR ISI .......................................................................................................... iii
PERCOBAAN 6 ..................................................................................................... 1
AKTIVITAS SPESIFIK ENZIM α-AMILASE...................................................... 1
1. Tujuan Percobaan ............................................................................................ 1
2. Dasar Teori ...................................................................................................... 1
2.1. Enzim........................................................................................................ 1
2.2. Enzim α-amilase ....................................................................................... 1
2.3. Klasifikasi dan struktur protein ................................................................ 2
2.4. Aktivitas Spesifik Enzim .......................................................................... 2
2.5. Penentuan Aktivitas Enzim α-amilase...................................................... 3
2.6. Spektrofotometer UV-VIS ....................................................................... 3
2.7. Teknik Sentrifugasi .................................................................................. 4
2.8. Metode Nelson-Soumogyi ........................................................................ 4
2.9. Metode Lowry .......................................................................................... 4
2.10. Analisa Bahan ....................................................................................... 5
3. Metode Percobaan ........................................................................................... 7
3.1. Bahan ........................................................................................................ 7
3.2. Alat .......................................................... Error! Bookmark not defined.
3.3. Prosedur Kerja .......................................................................................... 7
3.3.1. Penentuan aktivitas enzim α-amilase ................................................ 7
3.3.2. Penentuan kadar gula pereduksi dengan metode Nelson-Somougyi 8
3.3.3. Penentuan kadar protein dengan metode lowry ................................ 8
4. Data Pengamatan dan Pembahasan ................................................................. 9
5. Kesimpulan Dan Saran.................................................................................. 33
5.1. Kesimpulan ............................................................................................. 33
5.2. Saran ....................................................................................................... 33

iii
iv

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 34


Commented [I2]: Pembahasan dipisah ya di daftar isi

iv
1

PERCOBAAN 6
AKTIVITAS SPESIFIK ENZIM α-AMILASE

1. Tujuan Percobaan
Menentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil isolasi dan
pemurnian awal

2. Dasar Teori
2.1. Enzim
Enzim telah banyak digunakan dalam bidang industri pangan, farmasi
dan industri kimia lainnya. Dalam bidang pangan misalnya amilase, glukosa-
isomerase, papain, dan bromelin, sedangkan dalam bidang kesehatan
contohnya amilase, lipase, dan protease. Enzim dapat diisolasi dari hewan,
tumbuhan dan mikroorganisme. Kelebihan enzim dibandingkan katalis biasa
adalah : dapat meningkatkan produk beribu kali lebih tinggi; bekerja pada pH
yang relatif netral dan suhu yang relatif rendah; dan bersifat spesifik dan
selektif terhadap subtrat tertentu.
K1 K3
Enzim + substrat Kompleks Enzim + Produk
K2
[E][S]
Kesetimbangan untuk pembentuk adalah :Km =
[ES]

Dengan Es adalah kompleks enzim substrat, E adalah enzim, S adalah


substrat, dan Km adalah tetapan kesetimbangan (Azmi, 2006).

2.2. Enzim α-amilase


Enzim α-amilase merupakan salah satu jenis enzim yang berperan atau
berfungsi menghidrolisis atau memecah molekul-molekul pati menjadi
molekul-molekul lain yang lebih sederhana seperti dekstrin, maltosa, dan
glukosa. Mekanisme kerja dari enzim α-amilase adalah dengan cara memecah
ikatan α-1,4 glikosidik rantai glukan pati. Enzim α-amilase bekerja optimum
o
pada pH sekitar 6 dan pada suhu 60 C. Jika suhu ditingkatkan, pH optimum
juga meningkat sampai sekitar 7. Jika α-amilase berasal dari Bacillus
2

licheniformis maka akan menghidrolisis pati dengan hasil utama


maltoheksosa, malopentosa dengan jumlah glukosa yang lebih tinggi (8 –
10%). Enzim α-amilase mampu meningkatkan rasa manis pada ekstrak sari
buah karena aktivitas enzim alfa amilase yang mampu menghidrolisis pati
pada pisang menjadi gula lain yang lebih sederhana (Darmajana and Agustina,
2008).
Enzim α-amilase mempunyai peran penting dalam proses dan perannya
di pemecahan amilum dan sakarifikasi dimana rantai panjang karbohidrat
akan terhidrolisis dan diubah menjadi rantai yang lebih kecil (Chaplin dan
Bucke, 1990)

2.3. Klasifikasi dan struktur protein


Secara umum protein dapat dikategorikan menurut tipe tugas yang
dilaksanakan yaitu (Nelson dan Cox, 1999):
a. Protein struktural: Terdiri atas molekul panjang, liat dan tidak larut
b. Protein globular: Bentuknya bulat dan larut dalam air.
c. Protein konfigurasi: Merupakan protein yang bersenyawa dengan zat lain.

Protein mempunyai struktur sebagai berikut:


1. Struktur primer: Struktur kerangka kovalen dan deret residu asam amino.
2. Struktur sekunder: Struktur konformasi residu asam amino dekat
polipeptida.
3. Struktur tersier: Struktur protein yang rantai keeseluruhannya 3 dimensi
4. Struktur kuertener: Struktur antaraksi antara sub unit protein

2.4. Aktivitas Spesifik Enzim


Aktivitas spesifik hanya dapat digunakan untuk preparat enzim yang
murni, yaitu jumlah satuan enzim per miligram enzim protein, tetapi aktivitas
spesifik dapat pula ditentukan pada enzim tidak murni. Aktivitas spesifik
enzim murni menunjukkan derajat kemurnian enzim dalam suatu sampel.Bila
berat molekul enzim diketahui, maka aktivitasnya dapat dinyatakan dalam
3

bentuk aktivitas molekular adalah jumlah satuan substrat permikromol enzim.


Atau dapat pula diartikan sebagai jumlah molekul substrat di ubah setiap
menit oleh setiap molekul enzim. Aktivitas molekuler merupakan sifat enzim
individu, jadi dapat dgunakan untuk menentukan kemurnian enzim seperti
halnya aktivitas enzim (Poedjiadi, 1994).
Meningkatnya konsentrasi substrat mempunyai beberapa manfaat, seperti
meningkatnya produktifitas volumetri dan meningkatkan kestabilan α-amilase
(Klibanov, 1983)

2.5. Penentuan Aktivitas Enzim α-amilase


Metode yang digunakan dalam mengukur aktivitas enzim α-amilase yaitu
metode spektrometri. Prosedurnya berupa penentuan produk (glukosa)
dengan bantuan sinar, sesuai hukum lambert-Beer :
-Log T = A = ε .b .c Dimana: T = transmitansi
A = absorbansi
ε = koefisien ekstingsi molar
b = tebal kuvet
c = konsentrasi
Untuk menentukan banyaknya produk glukosa yang terbentuk dari reaksi
enzimatis maka digunakan kurva standar glukosa. Produk dinyatakan dalam
satuan unit aktivitas yang didefinisikan banyaknya mol glukosa dan reaksi
enzimatis pada kondisi optimum(Sastrohamidjojo, 2001).

2.6. Spektrofotometer UV-VIS


Secara umum semua molekul dapat menyerap radiasi dalam daerah UV-
VIS karena mereka mengandung elektron yang dapat tereksitasi ke tingkat
energinya yang lebih tinggi. Panjang gelombang yang terjadi tergantung pada
beberapa kuat elektron ini terikat pada molekul. Absorbansi larutan
bertambah dengan penguraian kekuatan sinar, bila konsentrasi materi yang
dilewati cahaya bertambah maka cahaya lebih banyak diserap. Jadi
4

absorbansi berbanding lurus dengan ketebalan b dan dengan konsentrasi c


(Sastrohamidjojo, 2001).

2.7.Teknik Sentrifugasi
Teknik sentrifugasi adalah suatu teknik pemisahan berdasarkan sifat
partikel dalam medan gaya sentrifugal. Partikel yang berbeda berat jenis,
ukuran dan bentuknya mengendap searah dengan gaya sentrifugal dengan
kecepatan berbeda. Partikel yang akan dipisahkan biasanya disuspensi dalam
medium cair yang dimasukan dalam tabung sentrifugal yang dapat
ditempatkan dalam rotasi yang berputar, rotor terletak pada pusat sumbu
simetri (Nelson dan Cox, 1999).

2.8. Metode Nelson-Soumogyi


Penentuan aktivitas enzim α-amilase dilakukan dengan metode
spektrofotometri dimana dilakukan penentuan terhadapproduk enzimnya
yaitu glukosa dengan metodeNelson-Soumagyi yang prinsipnya adalah
pemanasan gula dengan larutan alkali dari tembaga tartrat dan terbentuk cupri
oksida (Nelson dan Cox, 1999).

2.9. Metode Lowry


Protein dengan asam fosfotungstien-fosfomolibdat pada suasana alkali
akan memberi warna biruyang intensitasnya tergantung pada konsentrasi
protein. Larutan A terdiri atas fosfotungstein, fosfomolibdat. Larutan B (2%
Na2CO3 dalam NH4OH 0,1 N, CuSO4 dan Na-K tartrat 2%). Cara
penentuannya adalah sebagai berikut, 1 ml larutan protein ditambah 0,5 ml
lowry B, digojog dan biarkan 20 menit. Selanjutnya diamati OD nya pada λ
yang terpilih. Cara lowry 20 kali lebih sensitif pada cara UV atau
buret(Nelson dan Cox, 1999).
5

2.10. Singkong
Manihot esculenta pertama kali dikenal di Amerika Selatan kemudian
dikembangkan pada masa prasejarah di Brasil dan Paraguay, sejak kurang
lebih 10 ribu tahun yang lalu. Bentuk-bentuk modern dari spesies yang telah
dibudidayakan dapat ditemukan bertumbuh liar di Brasil selatan. Meskipun
spesies Manihot yang liar ada banyak, semua kultivar M. esculenta dapat
dibudidayakan. Walaupun demikian, bukti-bukti arkeologis budidaya
singkong justru banyak ditemukan di kebudayaan Indian Maya, tepatnya di
Meksiko dan El Salvador (Cereda dan Matos, 1996).
Kandungan utamanya adalahpati dengan sedikit glukosa sehingga
rasanya sedikit manis. Pada keadaan tertentu, terutama bila teroksidasi, akan
terbentuk glukosida racun yang selanjutnya membentuk asam sianida (HCN).
Sianida ini akan memberikan rasa pahit. Umbi yang rasanya manis
menghasilkan paling sedikit 20 mg HCN per kilogram umbi segar, dan 50
kali lebih banyak pada umbi yang rasanya pahit. Proses pemasakan dapat
secara efektif menurunkan kadar racun (Cereda dan Matos, 1996).
Kingdom: Plantae

Divisi: Magnoliophyta

Kelas: Magnoliopsida

Ordo: Malpighiales

Famili: Euphorbiaceae

Subfamili: Crotonoideae

Bangsa: Manihoteae

Genus: Manihot

Spesies: M. esculenta

2.11. Analisa Bahan


2.11.1. Amilum
6

Polisakarida yang banyak terdapat dari tumbuhan, dalam bahasa


sehari-hari disebut pati, terdapat pada umbi, daun, batang, dan biji-bijian.
Terdiri atas dua macam polisakarida yaitu amilosa dan amilopektin
(Poedjiadi, 1994)
2.11.2. Glukosa
BM: 60,16 gmol-1, larut dalam larutan fehling, tollens dan eter,
sulit larut dalam alkohol, memiliki dua jenis yaitu D-glukosa dan L-
glukosa (Daintith, 1994).
2.11.3. ZnSO4
Senyawa kristalis larut air, berwarna putih, dibuat lewat pemanasan
bijih zink sulfida diudara dan melarutkan dan mengkristalisasi
sulfatnya(Daintith, 1994).
2.11.4. Ba(OH)2
Padatan putih, secdikit larut dalam air, bentuk yang umum adalah
oktahidrat, monoklinik, titik leleh 780C (Daintith, 1994).
2.11.5. Akuades
Cairan tak berwarna, titik leleh 00C, titik didih 1000C, tidak berbau dan
tidak berasa, terdiri dari satu molekul H2O dengan ikatan H-OH
1050(Daintith, 1994).
2.11.6. Reagen Lowry
- Reagen lowry A:Larutan asam phospo-fungatic-phospo-molybdic.
- Reagen lowry B:100 mL 2% Na2CO3 dalam larutan NaOH 0,1 N
dengan 1 mL CuSO4.5H2O1% dan 1 mL natrium-kalium tartat 2%
(Sudarmadji, 1997).
2.11.7. Buffer Phosfat
- Larutan A: 0,2 M larutan Na-Phospat monobasis (27,8 g dalam 1000
mL)
- Larutan B: 0,2 M larutan Na-phosphat dibasis (52,65 g)(Sudarmadji,
1997).
2.11.8. Reagen Nelson-Somougyi
7

- Reagen A:12 g K.Na tartat, 1,6 g Na-bikarbonat, 14,4 g Na-sulfat


anhidrat, 2,4 g Na-karbonat anhidrat dilarutkan dengan akuades.
- Reagen B:2 g CuSO4.5H2O ditambah 18 g Na2SO4 anhidrat
dilarutkan sampai 100 mL (Reagen Nelson Soumogyi : 1 bagian
Nelson A + 1 bagian Nelson A)(Sudarmadji, 1997).

III. Metode Percobaan


3.1 Bahan
- Sampel enzim - Reagen Nelson-Soumogyi
- CuSO4 - Akuades
- Amilum - Reagen Lowry
- Buffer fosfat - Ba(OH)2
- Larutan glukosa

3.2 Alat
- Tabung reaksi - Inkubator
- Gelas ukur - Spektrofotometer UV-VIS
- Sentrifuge - Pipet tetes
- Gelas bekker
7

3.3 Prosedur Kerja

1 mL amilum1 %

Penambahan 0,1 mL larutan enzim ekstrak dan hasil


fraksinasi
Penambahan 3,9 mL buffer fosfat
Diinkubasi selama 30 menit suhu 37˚C

Larutan enzim

3.3.1 Penentuan kadar gula pereduksi dengan metode Nelson-Somougyi

1 mL larutan inkubasi enzim


ekstrak kasar dan fraksi
Tabung reaksi

- Penambahan akuades 1,5 mL


- Penambahan 0,2 mL larutan Ba(OH)2 0,01M
- Penambahan larutan ZnSO4 0,2 ml 0,01 M
- Penggojogan dan sentrifugasi

1 mLsupernatan
Tabung reaksi
- Penambahan 1 ml reagen Nelson-Somougyi
- Pemanasan selama 15 menit
- Pendinginan
- Penambahan 1 ml reagen arsenomolibdat
- Pengenceran dengan air hingga volume menjadi 10 ml
- Penentuan konsentrasi dengan spektrofotometer UV-
VIS pada λ = 520 nm
- Pengulangan terhadap larutan standar glukosa
Hasil
8

3.3.2 Penentuan kadar gula pereduksi dengan metode Nelson-Somougyi (2)


1 mL larutan inkubasi
enzim fraksinasi
Tabung reaksi

- Penambahan akuades 1,5 mL


- Penambahan 0,2 mL larutan Ba(OH)2 0,01M
- Penambahan larutan ZnSO4 0,2 ml 0,01 M
- Penggojogan dan sentrifugasi

1 mLsupernatan
Tabung reaksi

- Penambahan 1 ml reagen Nelson-Somougyi


- Pemanasan selama 15 menit
- Pendinginan
- Penambahan 1 ml reagen arsenomolibdat
- Pengenceran dengan air hingga volume menjadi 10 ml
- Penentuan konsentrasi dengan spektrofotometer UV-
VIS pada λ = 520 nm
- Pengulangan terhadap larutan standar glukosa
Hasil

3.3.3 Penentuan kadar protein dengan metode Lowry


0,2 ml larutan enzim
Tabung reaksi
- Penambahan 1 ml reagen C
- Penambahan 0,1 ml reagen D
- Pendiaman 30 menit
- Pengukuran absorbansi pada λ = 750 nm
- Pengulangan terhadap blanko
Hasil
9

4 Data Pengamatan

No Perlakuan Hasil
1 Penentuan aktivitas enzim α- Larutan berwarna putih
amilase keruh
2 Penentuan kadar gula pereduksi Larutan berwarna putih
keruh.
Kadar gula (i) ekstrak kasar:
-5,16 x 10-3 dan (ii)
-3
fraksinasi: -8,11 x 10
3 Penentuan Kadar Protein Nilai Absorbansi bernilai
negatif untuk ekstrak kasar
yaitu -0,03 dan dari
fraksinasi yaitu -0,083
10

5 Pembahasan

Sesika Novari
24030115130116

Pembahasan
Percobaan aktivitas spesifik enzim α-amilase bertujuan untuk
menentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil isolasi dan pemurnian
awal. Sampel yang digunakan adalah sampel singkong yang terdiri dari sampel
enzim ekstrak dan hasil fraksinasi yaitu enzim yang sudah dimurnikan. Enzim
α-amilase merupakan enzim yang dapat menguraikan amilum dengan
memutuskan ikatan α-1,4 glikosida dalam pati dari bagian dalam molekul, baik
pada amilase maupun amilopektin. Prinsip percobaan ini adalah penentuan
aktivitas spesifik enzim α-amilase. Metode pada percobaan ini yaitu
spektrofotometri untuk mengetahui absorbansi dari sampel sehingga dapat
diukur aktivitas enzim α-amilase, metode Nelson-Soumogyi untuk menentukan
produk enzimatisnya, dan metode Lowry untuk menentukan kadar protein pada
sampel enzim.

5.1. Penentuan Aktivitas enzim α-amilase

Percobaan ini bertujuan untuk menentukan aktivitas spesifik enzim


α-amilase hasil isolasi dan pemurnian awal menggunakan metode inkubasi.
Sampel yang digunakan yaitu sampel enzim ekstrak dan sampel enzim
fraksinasi. Pada percobaan digunakan amilum karena enzim α-amilase
dapat menghidrolisis amilum dengan memutuskan ikatan α-1,4 glikosida
(Lehninger, 1999). Fungsi penambahan buffer PO4 adalah sebagai larutan
penyangga agar pH-nya stabil, di mana pH 6-7 merupakan pH optimum
aktivitas α-amilase. Jika pH-nya di atas pH optimum menyebabkan enzim
terdenaturasi sedangkan di bawah pH optimum akan menyebabkan enzim
tidak aktiv (Azmi, 2006).Campuran diinkubasi pada suhu 370C karena
suhu tersebut merupakan suhu optimum aktivitas enzim α-amilase.
11

Inkubasi adalah proses kontak antara enzim dengan substrat agar


membentuk produk yang bertujuan untuk mereaksikan enzim dengan
substrat sehingga terbentuk ikatan enzim-substrat. Jika suhu inkubasi lebih
tinggi maka protein akan terdenaturasi yang mengakibatkan aktivitas
enzim menurun. Jika diinkubasi pada temperatur yang lebih rendah maka
aktivitas enzim α-amilase kurang optimal (Azmi, 2006).

5.2. Penentuan kadar gula pereduksi dengan metode Nelson-Soumogyi

Percobaan ini betujuan untuk penentuan kadar gula pereduksi


dengan menggunakan metode Nelson-Soumogyi. Uji aktivitas spesifik
enzim α-amilase diawali dengan reaksi enzimatis, yaitu dengan
menambahkan larutan amilum 1% dan buffer fosfat ke dalam enzim kasar
dan enzim halus.

E + S ES E + P

Pada reaksi enzimatis diperlukan proses inkubasi, dimana pada


proses inkubasi ini terjadi kontak antara enzim α-amilase dengan substrat
dalam membentuk produk yaitu glukosa. Reaksi :

CH 2OH CH2 OH
O

OH
alf a - amilase
O OH O O + Buf f er Fosf at
OH OH

CH2 OH CH2 OH CH 2OH


O O
OH OH
OH O OH OH
HO HO
OH OH OH

Maltosa Glukosa
(Poedjiadi, 1994)

Penambahan larutan Ba(OH)2 bertujuan untuk meminimalisasi


masuknya oksigen dari luar ke dalam larutan yang dapat mengoksidasi
12

kupri oksida (Cu2O) dan penambahan ZnSO4 bertujuan untuk


mengendapkan protein. Supernatan yang terbentuk ditambahkan dengan
reagen Nelson-Soumogyi kemudian dipanaskan, pemanasan bertujuan
untuk mempercepat reaksi. Penambahan reagen Nelson-Soumogyi
menyebabkan terbebtuknya kupri oksida. Glukosa akan mereduksi ion
Cu2+ disebabkanadanya gugus aldehid pada glukosa.

Reaksi reduksi Cu2+ :

Cu2+ + e Cu

Ion Cu+ akan mengendap sebagai Cu2O dalam suasana basa :

2 Cu + + 2 OH- Cu2O + H2O

Reaksi terbentuknya kupri oksida :

CHO CHO
H C OH H C OH
OH C H
Cu2+ OH C H
+ Cu2O
H C OH Alkali
H C OH
H C OH H C OH
CH 2OH CH 2OH

Glukosa asam D-glukonat

(Lehninger, 1999)

Metode Nelson-Soumogyi menganalisa secara kuantitatif. Produk


reaksi enzimatis berupa glukosa, akan tetapi metode ini memiliki
kekurangan karena gula non pereduksi (sukrosa) tidak dapat terdeteksi dan
hanya bisa mendeteksi gula pereduksi (glukosa-fruktosa).

Gula dapat direduksi dengan sinar UV karena memiliki elektron-


elektron yang dapat tereksitasi dari keadaan dasar ketingkat energi yang
lebih tinggi. Biasanya transisi elektron disebabkan oleh elektron π dimana
13

dalam molekul glukosa mengandung gugus karbonil yang dibentuk oleh


elektron π (Lehninger, 1999).

Penentuan kadar glukosa dilakukan dengan mengukur absorbansi


larutan tersebut dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada λ
520 nm. Panjang gelombang 520 nm ini merupakan panjang gelombang Commented [I3]: Kayaknya bukan 520nm deh…
Seingetku 520 mas
maksimum, dimana terjadi serapan maksimum oleh larutan glukosa.
Absorbansi yang diperoleh dari sampel singkong ekstrak kasar yaitu -0,03
dan dari fraksinasi yaitu -0,083. Hasil negatif kemungkinan karena terjadi
radiasi baur dan konsentrasi larutan terlalu pekat.

5.3. Penentuan kadar Protein dengan Metode Lowry

Percobaan ini bertujuan untuk menentukan kadar protein dari sampel


enzim dari singkong ekstrak kasar dan hasil fraksinasi. Metode yang
digunakan adalah metode lowry. Penentuan kadar protein dengan metode
lowry didasarkan pada warna kompleks yang dibentuk. Warna yang timbul
disebabkan oleh reaksi tembaga alkali dengan protein dimana terjadi
reduksi fosfomolibdat oleh tirosin dan triptofan yang terdapat dalam
protein.

Reagen yang digunakan yaitu reagen C dan reagen D. Reagen C


merupakan campuran reagen A (larutan Na2CO3 2% dalam larutan NaOH
0,1 N) dengan 1 mL reagen Folin Ciocalteu dan 1 mL akuades. Reagen D
merupakan campuran dari 1 mL reagen Folin Ciocalteu dan 1 mL akuades.
1 mL reagen Folin Ciocalteu yang merupakan campuran natrium tungstat
dan natrium molibdat dalam asam. Campuran asam ini akan mereduksi
protein yang digunakan melalui penguraian Cu2+ sehingga campuran asam
ini kehilangan satu atau lebih atom oksigen dan kompleks biru yang
dihailkan merupakan kompleks antara protein dengan Cu2+.

Struktur kompleks biru :


14

HN NH
R CH C O
Cu2+
O C HC R
HN NH

(Lehninger, 1999)

Penentuan kuantitatif kadar protein secara lowry didasarkan pada


absorbansi sinar oleh kompleks biru. Absorbansi diukur dengan
menggunakan spektrofotometri UV-VIS. Absorbansi sampel yang
diperoleh yaitu pada λ=700nm untuk ekstrak kasar yaitu 1,025 dan untuk Commented [I4]: Cek lagi
Seingetku 700nm mas
sampel hasil fraksinasi yaitu 1,999. Nilai absorbansi yang didapat sangat
besar karena larutan memiliki konsentrasi yang sangat tinggi.

Trie Nanda Mulyana Purba


24030115130117

Pembahasan
Percobaan yang berjudul aktivitas spesifik enzim α-amilase
bertujuan untuk menentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil
isolasi dan pemurnian awal. Sampel yang digunakan pada percobaan ini
adalah singkong yang merupakan sumber karbohidrat. Enzim α-amilase
merupakan enzim yang dapat menguraikan amilum dengan memutuskan
ikatan α-1,4 glikosida dalam pati secara acak dari bagian dalam molekul
(endo-enzim), baik pada amilosa maupun amilopektin, dimana produk
akhir yang terbentuk adalah glukosa. Prinsip percobaan ini adalah
penentuan aktivitas spesifik enzim α-amilase secara spektrofotometri.
Metode pada percobaan ini yaitu Inkubasi, Sentrifugasi (yaitu proses
pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan dengan cara
sentrifugal/perputaran), dan metode spektrofotometri (pengukuran
absorbansi).

5.1. Penentuan Aktivitas enzim α-amilase


15

Percobaan ini bertujuan untuk menentukan aktivitas spesifik enzim


α-amilase hasil isolasi dan pemurnian awal menggunakan metode inkubasi. Commented [I5]: Menentukan aktivitasnya menggunakan
metode inkubasi ?
Fungsi inkubasi adalah proses proses kontak antara enzim dengan substrat
agar membentuk produk. Digunakan amilum karena enzim α-amilase dapat
menghidrolisis amilum. Fungsi penambahan buffer PO4 adalah sebagai
larutan penyangga agar pH-nya tetap. Di mana aktivitas α-amilase berada
pada range pH 5,4-6,4 (Azmi, 2006), maka digunakan buffer PO4 dengan
pH 6,1 (buffer asam), di mana pH ini merupakan pH optimum aktivitas α-
amilase. Jika pH-nya di atas pH optimum maka enzim akan mengalami
deprotonasi atau perubahan pH baik di atas maupun di bawah pH optimum
akan menyebabkan enzim terdenaturasi, sehingga aktivitas enzim
menurun.
Campuran diinkubasi pada suhu 370C karena suhu tersebut
merupakan suhu optimum aktivitas enzim α-amilase. Hal ini sebanding
dengan energi aktivasi (Ea) untuk setiap enzim membentuk kompleks
enzim-substrat dan kemudian membentuk produk dan enzim kembali. Jika
suhu inkubasi lebih tinggi maka protein akan terdenaturasi yang
mengakibatkan aktivitas enzim menurun. Begitu pula jika diinkubasi pada
temperatur yang lebih rendah maka aktivitas enzim α-amilase kurang
optimal.

5.2. Penentuan kadar gula pereduksi dengan metode Nelson-Soumogyi


Percobaan ini bertujuan untuk penentuan kadar gula pereduksi
dengan menggunakan metode Nelson-Soumogyi. Penentuan kadar gula
pereduksi merupakan wujud dari uji aktifitas spesifik enzim α-amilase.
Aktivitas spesifik enzim merupakan unit aktivitas enzim permiligram
protein, sedangkan satu unit aktivitas enzim α-amilase merupakan aktivitas
enzim yang menyebabkan terbentuknya 1µmol produk glukosa dari
substrat amilum persatuan waktu inkubasi pada kondisi temperatur dan PH
tertentu. Harga aktivitas spesifik enzim menunjukkann tingkat kemurnian
terhadap protein total. Uji aktivitas spesifik enzim α-amilase diawali
16

dengan reaksi enzimatis, yaitu dengan menambahkan larutan hasil inkubasi


ke dalam enzim kasar dan enzim halus (fraksi). Commented [I6]: Ditambahkan sampelenzim dengan amilum
dan buffer baru di inkubasi atau diinkubasi dahulu baru ditambahkan

Enzim + αsubstrat ⇋ enzim-substrat ➝ enzim + produk


kedalam sample enzim ?

Pada reaksi enzimatis diperlukan proses inkubasi, dimana pada proses


inkubasi ini terjadi kontak antara enzim α-amilase dengan substrat dalam
membentuk produk yaitu glukosa. Reaksi :

Commented [I7]: referensi

(Poedjiadi, 1994)
Kadar gula pereduksi dapat ditentukan dengan metode Nelson-
Soumogyi. Penambahan larutan Ba(OH)2 bertujuan untuk meminimalisasi
masuknya oksigen dari luar ke dalam larutan yang dapat menyebabkan
reoksidasi dari kupri oksida (Cu2O) dan penambahan ZnSO4 bertujuan
untuk mengendapkan protein sehingga menghasilkan larutan netral bebas
protein. Sentrifugasi berguna untuk memisahkan endapan dengan larutan.
Supernatan yang terbentuk ditambahkan reagen Nelson-Soumogyi dan
dipanaskan (dengan tujuan untuk mempercepat reaksi). Penambahan
reagen Nelson-Soumogyi menyebabkan terbebtuknya kupri oksida.
Reagen Cu-tartrat akan direduksi oleh glukosa, hal ini karena glukosa
mempunyai gugus gula pereduksi, yaitu gugus aldehid.
Reaksi reduksi Cu2+ :
Cu2+ + e ⟶ Cu+
Ion Cu+ akan mengendap sebagai Cu2O dalam suasana basa :

2 Cu + + 2 OH- ⟶ Cu2O ➘↓ + H2O


17

Reaksi terbentuknya kupri oksida : Commented [I8]: referensi ?

Penambahan reagen arsenomolibdat untuk memberikan warna biru


molibdenum sehingga intensitas warna biru dapat diukur secara
spektrofotometri.
Metode Nelson-Soumogyi menganalisa secara kuantitatif. Produk
reaksi enzimatis berupa glukosa, akan tetapi metode ini memiliki
kekurangan karena gula non pereduksi (sukrosa) tidak dapat terdeteksi dan
hanya bisa mendeteksi gula pereduksi (glukosa-fruktosa) padahal produk
dari pemecahan amilum oleh enzim α-amilase bukan glukosa melainkan
maltosa, sukrosa dan gula non pereduksi yang lain. Commented [I9]: Di Pahami lagi ya kata2nya… apa benar kaya
gitu ?produk akhirnya bukan glukosa ?
Gula dapat direduksi dengan sinar UV karena memiliki elektron-elektron
yang dapat tereksitasi dari keadaan dasar ketingkat energi yang lebih
tinggi. Biasanya transisi elektron disebabkan oleh elektron π dimana dalam
molekul glukosa mengandung gugus karbonil yang dibentuk oleh elektron
π. Commented [I10]: Referensi ?

Penentuan kadar glukosa dilakukan dengan mengukur absorbansi


larutan tersebut dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada λ
520 nm. Panjang gelombang 520 nm ini merupakan panjang gelombang Commented [I11]: cek

maksimum, dimana terjadi serapan maksimum oleh larutan glukosa. Kadar


gula pereduksi ditentukan dengan membandingkan absorbansi larutan
sampel terhadap kurva larutan standar glukosa.
18

Absorbansi enzim murni adalah -0.083. Absorbansi pada ekstrak kasar


adalah -0,03.
Kadar enzim hasil fraksinasi lebih besar karena pada enzim ekstrak kasar
terdapat enzim-enzim lain yang mungkin menimbulkan interferensi dan
pengukuran absorbansi. Commented [I12]: enzim kasar dan enzim murni maksutnya
apa?
Commented [I13]: Enzim-enzim lain ? Apakah enzim juga ikut
terukur ?
5.3. Penentuan kadar Protein dengan Metode Lowry Kalau nilainya lebih kecil dari blanko menandakan larutan
tersebut ??
Percobaan ini bertujuan untuk menentukan kadar protein dari larutan
singkong. Metode yang digunakan adalah metode lowry. Penentuan kadar
protein dengan metode lowry didasarkan pada warna kompleks yang yang
dibentuk dari protein yang bereaksi dengan reagen Folin-Ciocalteu untuk
memberikan kompleks berwarna yang intensitas warnanya bervariasi
berdasarkan jenis protein atau jumlah asam amino aromatik pada protein.
Warna yang timbul disebabkan oleh reaksi tembaga alkali dengan protein.
Reagen yang digunakan reagen Folin Ciocalteu yang merupakan campuran
natrium tungstat dan natrium molibdat dalam asam. Campuran asam ini
akan mereduksi protein yang digunakan dalam percobaan melalui
penguraian Cu2+ sehingga campuran asam ini kehilangan satu atau lebih
atom oksigen dan kompleks biru yang dihasilkan merupakan kompleks
antara protein dengan Cu2+.
Struktur kompleks biru :
Commented [I14]: Referensi ?

Penentuan kuantitatif kadar protein secara lowry didasarkan pada


absorbansi sinar oleh kompleks biru. Commented [I15]: Segini aja pembahasannya ?
19

Galih Saputra
24030115130119

Pembahasan
Percobaan berjudul “Aktivitas Spesifik Enzim α-Amilase” bertujuan
untuk menentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil isolasi dan
pemurnian awal. Enzim α-amilasemerupakan salah satu jenis enzim yang
berperan atau berfungsi menghidrolisis atau memecah molekul-molekul
pati menjadi molekul-molekul lain yang lebih sederhana seperti dekstrin,
maltosa, dan glukosa (Darmajana and Agustina, 2008).Enzim ini diisolasi
dari tanaman singkong. Metodenya adalah fraksinasi, spektrometri, dan
sentrifugasi. Commented [I16]: Apa kita melakukan ini ?

a. Penentuan Aktivitas Enzim α-amilase


Tujuan dari percobaan ini adalah untuk menentukan aktivitas
spesifik enzim α-amilase hasil isolasi dan pemurnian awal. Dalam
percobaan ini metode yang digunakan adalah inkubasi. Enzim α-amilase
menghidrolisis amilum dengan cara memecah ikatan α-1,4 glikosidik
rantai glukan pati(Darmajana and Agustina, 2008).pH optimum untuk α-
amilase berada dalam kisaran 6-7, sehingga penambahan buffer fosfat
berfungsi untuk menjaga pH agar tetap berada dalam kondisi awalnya.
Seandainya enzim tidak berada dalam pH optimumnya, enzim akan
terprotonasi, terdenaturasi, sehingga aktivitas enzim akan menurun.Suhu
37o C merupakan suhu tubuh manusia, jadi enzim akan bekerja optimum
pada suhu tersebut. Fungsi dari inkubasi selama 20 menit adalah untuk
menjaga proses enzimatis berlangsung secara keseluruhan pada suhu
optimum tersebut. Jika proses inkubasi berada dalam suhu di atas atau di
bawah nilai optimumnya, maka enzim akan terdenaturasi dan atau
terkoagulasi. Commented [I17]: Referensi ?
20

b. Penentuan Kadar Gula Pereduksi dengan Metode Nelson-Somogyi


Tujuan dari percobaan ini adalah untuk menentukan kadar gula
pereduksi dengan metode Nelson-Somogyi. Uji aktifitas enzim alfa
amilase dapat ditentukan dari penentuan kadar gula pereduksinya.
Aktifitas enzim merupakan unit aktifitas enzim permiligram, sedangkan Commented [I18]: Aktivitas enzim atau aktivitas spesifik
enzim ?
satu unit altifitas enzim merupakan aktifitas enzim yang menyebabkan
terbentuknya 1 mikromol produk per satuan waktu inkubasi paha suhu dan
pH tertentu.
Pada proses inkubasi terjadi proses pemecahan ikatan glikosida oleh
enzim alfa amilase. Reaksi yang terjadi:
Commented [I19]: Diberi keterangan amilase menjadi apa itu ?
Beserta referensi….

Penambahan Ba(OH)2berfungsi untukmeminimalisir masuknya oksigen


dimana oksigen ini dapat mengoksidasi Cu2O yang terbentuk karena
Ba(OH)2 bersifat basa. Penambahan ZnSO4 bertujuan untuk
mengendapkan protein. Sentrifugasi berfungsi untuk pemisahan partikel Commented [I20]: Referensi ?

agar dapat terendapkan di dasar tabung akibat adanya gaya sentrifugal.


Proses pemanasan bertujuan agar reaksi dapat terjadi lebih cepat akibat
meningkatnya energi kinetik. Penambahan reagen Nelson-Somogyi Commented [I21]: Setelah pemanasan kan dilakukan
pendinginan, itu untuk apa pendinginan tersebut ?
21

bertujuan untuk menyebabkan terbentuknya Cu2O berwarna kecoklatan.


Reaksinya:
Commented [I22]: Referensi ?

Penentuan kadar glukosa dilakukan dengan menggunakan metode


spektroskopi, dimana instrumen yang digunakan adalah spektroskopi UV-
Vis dengan panjang gelombang maksimumnya 520 nm. Panjang
gelombang maksimum akan menghasilkan absorbansi maksimum dan
kadar glukosanya dapat ditentukan secara maksimum pula. Gula memiliki
elektron phi dari karbonil yang dapat tereksitasi menjadi keadaan yang
lebih tinggi dari keadaan dasar sehingga dapat dideteksi dengan
spektroskopi UV-Vis.
Absorbansi yang didapat bernilai negatif. Seharusnya absorbansi
berada dalam kisaran 0,2-0,8. Dari hasil absorbansi, didapatkan nilai
absorbansi ekstrak kasar -0,03 dan fraksinasi -0,083.Adanya radiasi baur Commented [I23]: Kira-kira kenapa kok negative ?

membuat absorbansi menjadi negatif. Dari persamaan garis y = 0,0261 x – Commented [G24]: Ini mas

-3 Commented [I25]: Apa yang dimaksud radiasi baur ?


0,0037, didapatkan kadar gula ekstrak kasar sebesar -5,16 x 10 dan
fraksinasi sebesar -8,11 x 10-3 . Karena hasil kadar menunjukkan nilai
negatif maka perhitungannya dianggap tidak valid. Commented [I26]: Kenapa tidak valid ?

c. Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry


Tujuan percobaan ini adalah unutk menentukan kadar protein dari
enzim. Warna kompleks intensitas warnanya bervariasi berdasarkan jenis
proteinnya. Warna tersebut dihasilkan oleh reaksi tembaga alkali dengan
protein. Penambahan reagen Folin Ciocalteu bertujuan untuk mereduksi
protein dengan menguraikan Cu2+ sehingga menghilangkan satu atau lebih
22

atom oksigen yang dihasilkan. Skemanya:


Commented [I27]: Dicantumin aja websitenya
Commented [I28]: Referensi ?google mas

Penentuan kadar glukosa dilakukan spektroskopi UV-Vis dengan


panjang gelombang maksimumnya 700 nm. Protein memiliki elektron phi
dari karbonil yang dapat tereksitasi menjadi keadaan yang lebih tinggi dari
keadaan dasar sehingga dapat dideteksi dengan spektroskopi UV-Vis.
Absorbansi yang didapat bernilai negatif. Seharusnya absorbansi
berada dalam kisaran 0,2-0,8. Hal ini terjadi karena sampel tidak diberi
perlakuan yang sama dengan blangko dan menyebabkan hasil
absorbansinya negatif. Dikarenakan hasil absorbansi terlalu negatif, Commented [I29]: Bukannya semuanya diperlakukan
sama ?akuades gak diberi perlakuan yang sama mas
perhitungan untuk penentuan kadar protein diabaikan. Commented [I30]: Semua sampel, ekstrak kasar, f1 dan f2
diperlakukan sama… ditambahin reagen yang sama,volume yang
sama… alasannya bukan itu..

Kalau larutan sampel nilainya negative dibanding larutan blanko


berarti larutan sampel warnanya lebih pekat atau bening ?kalau lebih
bening berarti apakah lebih encer ?
23

Mawas Kuntum K.
24030115130120

Percobaanaktivitasspesifikenzim α-
amilasebertujuanuntukmenentukanaktivitasspesifikenzim α-
amilasehasilisolasidanpemurnianawal. Sampel yang digunakanadalah
sampel enzime ekstrak dan hasil fraksinasi yaitu enzime yang sudah
dimurnikan .Enzim α-amilasemerupakanenzim yang
dapatmenguraikanamilumdenganmemutuskanikatan α-
1,4glikosidadalampatisecaraacakdaribagiandalammolekul,
baikpadaamylasemaupunamilopektin.
PrinsippercobaaniniadalahPenentuanaktivitasspesifikenzim α-
amilasesecaraspektrofotometri. Metodepada percobaan ini yaitu
spektrofotometri untuk menentukan aktivitas enzime α-amilase, metode
Nelson-Soumogyi untuk menentukan produk enzimatisnya. Commented [I31]: Apa produk enzimatisnya ?

5.1. PenentuanAktivitasenzim α-amilase


Percobaaninibertujuanuntukmenentukanaktivitasspesifikenzim α-
amilasehasilisolasidanpemurnianawalmenggunakanmetode inkubasi.
Sampel yang digunakan yaitu sampel enzime ekstrak dan sampel enzime
fraksinasi. Pada percobaan digunakan amilum karena enzime α-amilase
dapat menghidrolisis amilum dengan memutuskan ikatan α-1,4
glikosida.Fungsipenambahan buffer PO4adalahsebagailarutanpenyangga
agar pH-nyatetap atau stabil. Di mana PH 6-7 merupakan PH oktimum
aktivitas α-amilase. JikaPH-nya diatas optimum akan menyebabkan
enzime terdenaturasi sedangkan di bawah PH optimum akan menyebabkan Commented [I32]: Referensi ?

enzime inaktiv sehinggaaktivitasenzimmenurun.

Campurandiinkubasipadasuhu 370C
karenasuhutersebutmerupakansuhu optimum aktivitasenzim α-amilase.
Jikasuhuinkubasilebihtinggimaka protein akanterdenaturasi yang
mengakibatkanaktivitasenzimmenurun. Begitu pula
24

jikadiinkubasipadatemperatur yang lebihrendahmakaaktivitasenzim α-


amilasekurang optimal. Commented [I33]: Referensi ?

5.2. Penentuankadargulapereduksidenganmetode Nelson-Soumogyi

Percobaaninibetujuanuntukpenentuankadargulapereduksidenganmen
ggunakanmetode Nelson-Soumogyi.
Penentuankadargulapereduksimerupakanwujuddariujiaktifitasenzim α-
amilase. Aktivitasenzimmerupakan unit aktivitasenzimpermiligram protein, Commented [I34]: Aktivitas enzim atau aktivitas spesifik
enzim ?
sedangkansatu unit aktivitasenzim α-amilasemerupakanaktivitasenzim
yang menyebabkanterbentuknya 1µmol
produkglukosadarisubstratamilumpersatuanwaktuinkubasi
padakondisitemperaturedan PH tertentu. Ujiaktivitasspesifikenzim α-
amilasediawalidenganreaksienzimatis,
yaitudenganmenambahkanlarutanamilum 1% dan buffer
fosfatkedalamenzimkasardanenzimhalus.

E + S ES E + P

Enzim αsubstratenzim-substratenzimproduk Commented [I35]: Ini apa ?

Padareaksienzimatisdiperlukan proses inkubasi, dimanapada proses


inkubasiiniterjadikontakantaraenzim α-
amilasedengansubstratdalammembentukprodukyaituglukosa. Reaksi :

CH 2OH CH2 OH
O

OH
alf a - amilase
O OH O O + Buf f er Fosf at
OH OH
25

CH2 OH CH2 OH CH 2OH


O O
OH OH
OH O OH OH
HO HO
OH OH OH

(Poedjiadi, 1994)

MaltosaGlukosa Commented [I36]: Ini apa ?

Kadar gulapereduksidapatditentukandenganmetode Nelson-


Soumogyi.
PenambahanlarutanBa(OH)2bertujuanuntukmeminimalisasimasuknnyaoksi
gendariluarkedalam larutan yang dapatmengoksidasikuprioksida (Cu2O)
danpenambahan ZnSO4bertujuanuntukmengendapkan protein. Supernatan
yang terbentukditambahkanreagen Nelson-Soumogyidandipanaskan
(dengantujuanuntukmempercepatreaksi). Penambahanreagen Nelson-
Soumogyimenyebabkanterbebtuknyakuprioksida. Reagen Cu-
tartratakandireduksiolehglukosa,
halinikarenaglukosamempunyaigugusgulapereduksi, yaitugugusaldehid.

Reaksireduksi Cu2+:

Cu2++ e Cu2+

Ion Cu+akanmengendapsebagai Cu2O dalamsuasanabasa :

2 Cu + + 2 OH- Cu2O + H2O

Reaksiterbentuknyakuprioksida :

CHO CHO
H C OH H C OH
OH C H
Cu2+ OH C H
+ Cu2O
H C OH Alkali
H C OH
H C OH H C OH
CH 2OH CH 2OH (Lehninger, 1999)

Glukosaasam D-glukonat Commented [I37]: Ini apa


26

Metode Nelson-Soumogyimenganalisasecarakuantitatif.
Produkreaksienzimatisberupaglukosa,
akantetapimetodeinimemilikikekurangankarenagula non pereduksi
(sukrosa) tidakdapatterdeteksi danhanyabias mendeteksigulapereduksi
(glukosa-fruktosa) padahalprodukdaripemecahanamilumolehenzim α-
amilasebukanglukosamelainkanmaltosa, sukrosadangula non pereduksi
yang lain. Commented [I38]: Pahami lagi..apa benar kaya gitu ?

Guladapatdireduksi dengansinar UV karenamemilikielektron-


elektron yang dapattereksitasidarikeadaandasarketingkatenergi yang
lebihtinggi. Biasanyatransisielectrondisebabkanolehelektron π
dimanadalammolekulglukosamengandungguguskarbonil yang
dibentukolehelektron π. Commented [I39]: Referensi ?

Penentuankadarglukosadilakukandenganmengukurabsorbansi
larutantersebutdenganmenggunakanspektrofotometer UV-VIS pada λ 520 Commented [I40]: Panjang gemlombangnya bukan ini..

nm. Panjanggelombang 520 nm


inimerupakanpanjanggelombangmaksimum,
dimanaterjadiserapanmaksimumolehlarutanglukosa. Kadar
gulapereduksiditentukandenganmembandingkanabsorbansilarutansampelte
rhadapkurvalarutanstandarglukosa. Commented [I41]: Hasilnya mana ?

5.2. Penentuankadar Protein denganMetode Lowry


Percobaaninibertujuanuntukmenentukankadar protein
darilarutanubiungu. Metode yang digunakanadalahmetodelowry.
Penentuankadar protein
denganmetodelowrydidasarkanpadawarnakompleks yang yangdibentuk
yang intensitaswarnanyabervariasiberasrkan jenisproteinataujumlahasam
amino aromaticpada protein. Warna yang timbul
disebabkanolehreaksitembaga alkali dengan protein.

Reagen yang digunakanreagenyaitureagen C dan D. Reagen C


merupakancampurandarireagen A yaitularutan NA2CO3 2% dalam larutan
27

NaOH 0.1 N dengan reagen Folin Ciocalteu dan 1 ml akuades. Reagen D


merupakan campuan dari 1 ml reagen Folin Ciocalteu yang
merupakancampurannatriumtungstatedannatriummolibdatdalamasam.
Campuranasaminiakanmereduksi protein yang
digunakandalampercobaanmelaluipenguraian
Cu2+sehinggacampuranasaminikehilangansatuataulebih atom
oksigendankompleksbiru yang dihasilkanmerupakankompleksantara
2+
protein dengan Cu .

Strukturkompleksbiru :

HN NH
R CH C O
Cu2+
O C HC R
HN NH (Lehninger, 1999)

Penentuankuantitatifkadar protein
secaralowrydidasarkanpadaabsorbansisinarolehkompleksbiru.
Absorbansidiukurdenganmenggunakanspektrofotometri UV-VIS.
Absorbansisampel yang diperolehyaitupada λ = 700nm untuk ekstrak kasar Commented [I42]: Bukan 700nm

yaitu 1,025dan untuk sampel hasil fraksinasi yaitu 1,999. Hasil tersebut Commented [I43]: Alasnny kenapa ?

buruk sebab saat perlakuan sebelum mengabsorbansi tidak dilakukang


pengenceran terlebih dahulu atau karena konsentrasi yang didapat terlalu
besar.
28

Damar Rifai Sabirin


24030115130122

V. Pembahasan
Percobaan aktivitas spesifik enzim α-amilase bertujuan untuk
menentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil isolasi dan pemurnian
awal. Sampel yang digunakan adalah sampel enzim ekstrak dan hasil
fraksinasi yaitu enzim yang sudah dimurnikan. Enzim α-Amilase
menghidrolisis ikatan α-1,4 glukossidik amilosa, amilopektin dan glikogen.
Enzim ini bersifat sebagai endoamilase, yaitu enzim yang memecah pati
secara acak dari tengah atau bagian dalam molekul. Prinsip percobaan ini
adalah Penentuan aktivitas spesifik enzim α-amilase secara kromatografi.
Metode pada percobaan ini yaitu Fraksinasi (yaitu, pemurnian yang
didasarkan pada pengendapan secara bertahap), Sentrifugasi (yaitu proses
pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan dengan cara
sentrifugal/perputaran), dan metode kromatografi (pengukuran absorbansi).

5.1. Penentuan Aktivitas enzim α-amilase


29

Percobaan ini bertujuan untuk menentukan aktivitas spesifik enzim


α-amilase hasil isolasi dan pemurnian awal menggunakan metode inkubasi.
Pada percobaan digunakan amilum karena enzim α-amilase dapat
menghidrolisis amilum dengan memutuskan ikatan α-1,4 glikosida.
Penambahan buffer PO4 berfungsi sebagai larutan penyangga agar pH nya
tidak stabil. pH aktivitas α-amilase berada pada range 5-6,5, maka
digunakan lah buffer PO4 yg bersifat asam, yang merupakan pH optimum
untuk enzim bekerja.Campuran diinkubasi pada suhu 370C karena suhu
tersebut merupakan suhu optimum aktivitas enzim α-amilase. Hal ini
sebanding dengan energi aktivasi (Ea) untuk setiap enzim membentuk
kompleks enzim-substrat dan kemudian membentuk produk dan enzim
kembali. Jika suhu inkubasi lebih tinggi maka protein akan terdenaturasi
yang mengakibatkan aktivitas enzim menurun. Apabila suhu lebih rendah
maka enzim akan bekerja kurang optimum. Commented [I44]: Referensi ?

5.2. Penentuan kadar gula pereduksi dengan metode Nelson-Soumogyi

Percobaan ini betujuan untuk penentuan kadar gula pereduksi


dengan menggunakan metode Nelson-Soumogyi. Penentuan kadar gula
pereduksi merupakan wujud dari uji aktifitas enzim α-amilase. Aktivitas
enzim merupakan unit aktivitas enzim permiligram protein, sedangkan Commented [I45]: Aktivitas enzim apa aktivitas spesifik
enzim ?
satu unit aktivitas enzim α-amilase merupakan aktivitas enzim yang
menyebabkan terbentuknya 1µmol produk glukosa dari substrat amilum
persatuan waktu inkubasi pada kondisi temperatur dan PH tertentu. Untuk
menguji aktivitas spesifik enzim α-amilase, digunakan reaksi enzimatis
dengan cara menambahkan 1% larutan amilum dan buffer PO4 ke dalam
enzim halus dan enzim kasar. Seperti contoh dibawah ini reaksi antara
enzim dan substrat.
E + S ES E + P
Enzim αsubstrat enzim-substrat enzim produk
30

Pada reaksi enzimatis diperlukan proses inkubasi, dimana pada


proses inkubasi ini terjadi kontak antara enzim α-amilase dengan substrat
dalam membentuk produk yaitu glukosa. Reaksi :

CH 2OH CH2 OH
O

OH
alf a - amilase
O OH O O + Buf f er Fosf at
OH OH

CH2 OH CH2 OH CH 2OH


O O
OH OH
OH O OH OH
HO HO
OH OH OH

Maltosa Glukosa

(Poedjiadi, 1994)

Penambahan larutan Ba(OH)2bertujuan untuk meminimalisasi


masuknnya oksigen dari luar ke dalam larutan yang dapat mengoksidasi
kupri oksida (Cu2O) dan penambahan ZnSO4bertujuan untuk
mengendapkan protein. Kemudian terbentuk supernatan lalu ditambahkan
reagen Nelson-Soumogyi dan dipanaskan yang berfungsi untuk
mempercepat reaksi tersebut. Penambahan reagen Nelson-Soumogyi
menyebabkan terbebtuknya kupri oksida. Reagen Cu-tartrat akan direduksi
oleh glukosa, hal ini karena glukosa mempunyai gugus gula pereduksi,
yaitu gugus aldehid.
Reaksi reduksi Cu2+:
Cu2++ e Cu2+
Ion Cu+ akan mengendap sebagai Cu2O dalam suasana basa :
2 Cu + + 2 OH- Cu2O + H2O Commented [I46]: perbaiki

Reaksi terbentuknya kupri oksida :


31

CHO CHO
H C OH H C OH
OH C H
Cu2+ OH C H
+ Cu2O
H C OH Alkali
H C OH
H C OH H C OH
CH 2OH CH 2OH

Glukosa asam D-glukonat


(Lehninger, 1999)

Metode Nelson-Soumogyi menganalisa secara kuantitatif. Produk


reaksi enzimatis berupa glukosa, akan tetapi metode ini memiliki
kekurangan karena gula non pereduksi (sukrosa) tidak dapat terdeteksi dan
hanya bisa mendeteksi gula pereduksi (glukosa-fruktosa) padahal produk
dari pemecahan amilum oleh enzim α-amilase bukan glukosa melainkan
maltosa, sukrosa dan gula non pereduksi yang lain.Gula dapat direduksi Commented [I47]: Pahami lagi… apa bener kaya gitu ?hasil
akhirnya emang bukan glukosa ?trus reaksi diatas apa dong….
dengan sinar UV karena memiliki elektron-elektron yang dapat tereksitasi
dari keadaan dasar ketingkat energi yang lebih tinggi.
Penentuan kadar glukosa dilakukan dengan mengukur absorbansi larutan
tersebut dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada λ 520 nm.
Panjang gelombang 520 nm ini merupakan panjang gelombang maksimum, Commented [I48]: Cek lagi

dimana terjadi serapan maksimum oleh larutan glukosa. Kadar gula


pereduksiditentukan dengan membandingkan absorbansi larutan sampel
terhadap kurva larutan standar glukosa.
Kadar enzim murni lebih besar karena pada enzim kasar terdapat
enzim-enzim lain yang mungkin menimbulkan interferensi dan
pengukuran absorbansi.Enzim murni yakni enzim yang didapatkan dari
hasil isolasi sampel serta pengekstrakan yang memang benar-benar sudah
dimurnikan.

5.3. Penentuan kadar Protein dengan Metode Lowry


32

Percobaan ini bertujuan untuk menentukan kadar protein dari


sampel singkong. Metode yang digunakan adalah metode lowry.
Penentuan kadar protein dengan metode lowry didasarkan pada warna
kompleks. Warna yang timbul disebabkan oleh reaksi tembaga alkali
dengan protein dimana terjadi reduksi fosfomolibdat oleh tirosin dan
triptofan yang terdapat dalam protein.
Reagen yang digunakan yaitu reagen C dan reagen D. Reagen C
merupakan campuran reagen A (larutan Na2CO3 2% dalam larutan NaOH
0,1 N) dengan 1 mL reagen Folin Ciocalteu dan 1 mL akuades. Reagen D
merupakan campuran dari 1 mL reagen Folin Ciocalteu dan 1 mL akuades.
1 mL reagen Folin Ciocalteuyang merupakan campuran natrium tungstat
dan natrium molibdat dalam asam. Campuran asam ini akan mereduksi
protein yang digunakanmelalui penguraian Cu2+ sehingga campuran asam
ini kehilangan satu atau lebih atom oksigen dan kompleks biru yang
dihailkan merupakan kompleks antara protein dengan Cu2+. Commented [I49]: Referensi ?

Penentuan kuantitatif kadar protein secara lowry didasarkan pada


absorbansi sinar oleh kompleks biru. Absorbansi diukur dengan
menggunakan spektrofotometri UV-VIS. Absorbansi sampel yang
diperoleh yaitu pada λ=700nm untuk ekstrak kasar yaitu 1,025 dan untuk
sampel hasil fraksinasi yaitu 1,999. Commented [I50]: Kenapa hasilnya bisa begitu ?
33

6 Kesimpulan Dan Saran

6.1 Kesimpulan Commented [I51]: Kesimpulan hanya menjawab dari tujuan :


Isinya :
Kadar glukosa, kadar protein, aktivitas dan kesimpulannya apakah di
- Penentuan aktifitas enzim alfa amilase dapat menggunakan metode sampel ini ada aktivitas alfa amilase ?

spektrofotometri, Nelson Somogyi, dan Lowry


- Kadar gula pereduksi ekstrak kasar sebesar -5,16 x 10-3 dan fraksinasi
sebesar -8,11 x 10-3
- Karena hasil kadar menunjukkan nilai negatif maka perhitungannya
dianggap tidak valid. Commented [I52]: kadar apa?

- Penentuan kadar protein tidak bisa digunakan karena hasil absorbansi


bernilai negatif. Commented [I53]: kadar protein ga negative kayaknya…

6.2 Saran
- Ikuti metode dan langkah kerja sesuai apa yang diharapkan
- Selalu teliti ketika penambahan reagen ke sampel dan blangko
34

DAFTAR PUSTAKA

Azmi, J. 2006. Penentuan Kondisi Optimum Fermentasi Aspergillus oryzae Untuk


Isolasi Enzim Amilase Pada Medium Pati Biji Nangka (Arthocarphus
heterophilus Lmk). Jurnal Biogenesis 2(2) halaman 55-58.
Cereda, M.P. and Mattos, M.C.Y. (1996). Linamarin - The Toxic Compound of
Cassava. Journal of Venomous Animals and Toxins (online) 2 (1), 6-12;
ISSN 0104-7930
Chaplin MF, Bucke C. 1990. The Large-Scale Use of Enzymes in Solution.
Enzyme technology halaman 146–61. Cambridge: Cambridge University
Press.
Daintith, John. 1994. Kamus Lengkap Kimia. Edisi Baru. Jakarta: Erlangga.
Darmajana. Doddy A, Wawan Agustina, dan Wartika. 2008. Pengaruh
Konsentrasi Enzim Α-Amilase Terhadap Sifat Fisik dan Organoleptik Filtrat
Bubur Buah Pisang (Bahan Pembuatan Tepung Pisang Instan). Didalam:
Seminar Nasional Sains dan Teknologi-II 2008 Lampung. Universitas
Lampung, 17-18 November 2008. Subang: Balai Besar Teknologi Tepat
Guna – LIPI
Klibanov A. M. 1983. Stabilization of enzymes against thermal inactivation. Adv
Appl Microbiol bab 29 halaman 1–28.
Lehninger, A.L. 1990. Dasar-Dasar Biokimia. Terjemahan Maggy Thenawidjaya.
Jakarta : Penerbit Erlangga
Nelson DL, Cox MM. 1999. Lehninger Principles of Biochemistry. New York:
Worth Publishers.
Poedjiadi, Anna. 1994.Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press.
Sastrohamidjojo, Hardjono. 2001. Kimia Dasar. Yogyakarta: Gadjah Mada
University Press.
Sudarmadji S, dkk. 1997. Prosedur Analisa untuk Bahan Makanan dan Pertanian.
Yogyakarta: Liberty.
35
36

LAMPIRAN

Persamaan garis: y = 0,0261x – 0,0037

Ekstrak kasar
y = 0,0261x – 0,0037
= 0,0261 {[(A-b)/a] . (Vtot/Venzim) . (Vsampel/Vanalit) . (1/BMglukosa) . (1/tinkubasi)} –
0,0037
= 0,0261 [{-0,03-(-0,0037)}/0,0261] . (5/0,1) . (4/1) . (1/180) . 1/20] – 0,0037
= -5,16 x 10-3 Commented [I54]: gunakan fungsi equation pada word

Fraksinasi:
y = 0,0261x – 0,0037
= 0,0261 {[(A-b)/a] . (Vtot/Venzim) . (Vsampel/Vanalit) . (1/BMglukosa) . (1/tinkubasi)} –
0,0037
= 0,0261 [{-0,083-(-0,0037)}/0,0261] . (5/0,1) . (4/1) . (1/180) . 1/20] – 0,0037
= 8,11 x 10-3