PERCOBAAN VI
AKTIVITAS SPESIFIK ENZIM α-AMILASE
Oleh:
Sesika Novari 24030115130116
Trie Nanda M.P 24030115130117
Galih Saputra 24030115130119
Mawas Kuntum K. 24030115130120
Damar Rifai S. 24030115130122
Departemen Kimia
Fakultas Sains dan Matematika
Universitas Diponegoro
2017
i
ii
HALAMAN PENGESAHAN
Jurnal Praktikum Biokimia
Menyetujui
Asisten Praktikum,
ii
iii
DAFTAR ISI
iii
iv
iv
1
PERCOBAAN 6
AKTIVITAS SPESIFIK ENZIM α-AMILASE
1. Tujuan Percobaan
Menentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil isolasi dan
pemurnian awal
2. Dasar Teori
2.1. Enzim
Enzim telah banyak digunakan dalam bidang industri pangan, farmasi
dan industri kimia lainnya. Dalam bidang pangan misalnya amilase, glukosa-
isomerase, papain, dan bromelin, sedangkan dalam bidang kesehatan
contohnya amilase, lipase, dan protease. Enzim dapat diisolasi dari hewan,
tumbuhan dan mikroorganisme. Kelebihan enzim dibandingkan katalis biasa
adalah : dapat meningkatkan produk beribu kali lebih tinggi; bekerja pada pH
yang relatif netral dan suhu yang relatif rendah; dan bersifat spesifik dan
selektif terhadap subtrat tertentu.
K1 K3
Enzim + substrat Kompleks Enzim + Produk
K2
[E][S]
Kesetimbangan untuk pembentuk adalah :Km =
[ES]
2.7.Teknik Sentrifugasi
Teknik sentrifugasi adalah suatu teknik pemisahan berdasarkan sifat
partikel dalam medan gaya sentrifugal. Partikel yang berbeda berat jenis,
ukuran dan bentuknya mengendap searah dengan gaya sentrifugal dengan
kecepatan berbeda. Partikel yang akan dipisahkan biasanya disuspensi dalam
medium cair yang dimasukan dalam tabung sentrifugal yang dapat
ditempatkan dalam rotasi yang berputar, rotor terletak pada pusat sumbu
simetri (Nelson dan Cox, 1999).
2.10. Singkong
Manihot esculenta pertama kali dikenal di Amerika Selatan kemudian
dikembangkan pada masa prasejarah di Brasil dan Paraguay, sejak kurang
lebih 10 ribu tahun yang lalu. Bentuk-bentuk modern dari spesies yang telah
dibudidayakan dapat ditemukan bertumbuh liar di Brasil selatan. Meskipun
spesies Manihot yang liar ada banyak, semua kultivar M. esculenta dapat
dibudidayakan. Walaupun demikian, bukti-bukti arkeologis budidaya
singkong justru banyak ditemukan di kebudayaan Indian Maya, tepatnya di
Meksiko dan El Salvador (Cereda dan Matos, 1996).
Kandungan utamanya adalahpati dengan sedikit glukosa sehingga
rasanya sedikit manis. Pada keadaan tertentu, terutama bila teroksidasi, akan
terbentuk glukosida racun yang selanjutnya membentuk asam sianida (HCN).
Sianida ini akan memberikan rasa pahit. Umbi yang rasanya manis
menghasilkan paling sedikit 20 mg HCN per kilogram umbi segar, dan 50
kali lebih banyak pada umbi yang rasanya pahit. Proses pemasakan dapat
secara efektif menurunkan kadar racun (Cereda dan Matos, 1996).
Kingdom: Plantae
Divisi: Magnoliophyta
Kelas: Magnoliopsida
Ordo: Malpighiales
Famili: Euphorbiaceae
Subfamili: Crotonoideae
Bangsa: Manihoteae
Genus: Manihot
Spesies: M. esculenta
3.2 Alat
- Tabung reaksi - Inkubator
- Gelas ukur - Spektrofotometer UV-VIS
- Sentrifuge - Pipet tetes
- Gelas bekker
7
1 mL amilum1 %
Larutan enzim
1 mLsupernatan
Tabung reaksi
- Penambahan 1 ml reagen Nelson-Somougyi
- Pemanasan selama 15 menit
- Pendinginan
- Penambahan 1 ml reagen arsenomolibdat
- Pengenceran dengan air hingga volume menjadi 10 ml
- Penentuan konsentrasi dengan spektrofotometer UV-
VIS pada λ = 520 nm
- Pengulangan terhadap larutan standar glukosa
Hasil
8
1 mLsupernatan
Tabung reaksi
4 Data Pengamatan
No Perlakuan Hasil
1 Penentuan aktivitas enzim α- Larutan berwarna putih
amilase keruh
2 Penentuan kadar gula pereduksi Larutan berwarna putih
keruh.
Kadar gula (i) ekstrak kasar:
-5,16 x 10-3 dan (ii)
-3
fraksinasi: -8,11 x 10
3 Penentuan Kadar Protein Nilai Absorbansi bernilai
negatif untuk ekstrak kasar
yaitu -0,03 dan dari
fraksinasi yaitu -0,083
10
5 Pembahasan
Sesika Novari
24030115130116
Pembahasan
Percobaan aktivitas spesifik enzim α-amilase bertujuan untuk
menentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil isolasi dan pemurnian
awal. Sampel yang digunakan adalah sampel singkong yang terdiri dari sampel
enzim ekstrak dan hasil fraksinasi yaitu enzim yang sudah dimurnikan. Enzim
α-amilase merupakan enzim yang dapat menguraikan amilum dengan
memutuskan ikatan α-1,4 glikosida dalam pati dari bagian dalam molekul, baik
pada amilase maupun amilopektin. Prinsip percobaan ini adalah penentuan
aktivitas spesifik enzim α-amilase. Metode pada percobaan ini yaitu
spektrofotometri untuk mengetahui absorbansi dari sampel sehingga dapat
diukur aktivitas enzim α-amilase, metode Nelson-Soumogyi untuk menentukan
produk enzimatisnya, dan metode Lowry untuk menentukan kadar protein pada
sampel enzim.
E + S ES E + P
CH 2OH CH2 OH
O
OH
alf a - amilase
O OH O O + Buf f er Fosf at
OH OH
Maltosa Glukosa
(Poedjiadi, 1994)
Cu2+ + e Cu
CHO CHO
H C OH H C OH
OH C H
Cu2+ OH C H
+ Cu2O
H C OH Alkali
H C OH
H C OH H C OH
CH 2OH CH 2OH
(Lehninger, 1999)
HN NH
R CH C O
Cu2+
O C HC R
HN NH
(Lehninger, 1999)
Pembahasan
Percobaan yang berjudul aktivitas spesifik enzim α-amilase
bertujuan untuk menentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil
isolasi dan pemurnian awal. Sampel yang digunakan pada percobaan ini
adalah singkong yang merupakan sumber karbohidrat. Enzim α-amilase
merupakan enzim yang dapat menguraikan amilum dengan memutuskan
ikatan α-1,4 glikosida dalam pati secara acak dari bagian dalam molekul
(endo-enzim), baik pada amilosa maupun amilopektin, dimana produk
akhir yang terbentuk adalah glukosa. Prinsip percobaan ini adalah
penentuan aktivitas spesifik enzim α-amilase secara spektrofotometri.
Metode pada percobaan ini yaitu Inkubasi, Sentrifugasi (yaitu proses
pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan dengan cara
sentrifugal/perputaran), dan metode spektrofotometri (pengukuran
absorbansi).
(Poedjiadi, 1994)
Kadar gula pereduksi dapat ditentukan dengan metode Nelson-
Soumogyi. Penambahan larutan Ba(OH)2 bertujuan untuk meminimalisasi
masuknya oksigen dari luar ke dalam larutan yang dapat menyebabkan
reoksidasi dari kupri oksida (Cu2O) dan penambahan ZnSO4 bertujuan
untuk mengendapkan protein sehingga menghasilkan larutan netral bebas
protein. Sentrifugasi berguna untuk memisahkan endapan dengan larutan.
Supernatan yang terbentuk ditambahkan reagen Nelson-Soumogyi dan
dipanaskan (dengan tujuan untuk mempercepat reaksi). Penambahan
reagen Nelson-Soumogyi menyebabkan terbebtuknya kupri oksida.
Reagen Cu-tartrat akan direduksi oleh glukosa, hal ini karena glukosa
mempunyai gugus gula pereduksi, yaitu gugus aldehid.
Reaksi reduksi Cu2+ :
Cu2+ + e ⟶ Cu+
Ion Cu+ akan mengendap sebagai Cu2O dalam suasana basa :
Galih Saputra
24030115130119
Pembahasan
Percobaan berjudul “Aktivitas Spesifik Enzim α-Amilase” bertujuan
untuk menentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil isolasi dan
pemurnian awal. Enzim α-amilasemerupakan salah satu jenis enzim yang
berperan atau berfungsi menghidrolisis atau memecah molekul-molekul
pati menjadi molekul-molekul lain yang lebih sederhana seperti dekstrin,
maltosa, dan glukosa (Darmajana and Agustina, 2008).Enzim ini diisolasi
dari tanaman singkong. Metodenya adalah fraksinasi, spektrometri, dan
sentrifugasi. Commented [I16]: Apa kita melakukan ini ?
membuat absorbansi menjadi negatif. Dari persamaan garis y = 0,0261 x – Commented [G24]: Ini mas
Mawas Kuntum K.
24030115130120
Percobaanaktivitasspesifikenzim α-
amilasebertujuanuntukmenentukanaktivitasspesifikenzim α-
amilasehasilisolasidanpemurnianawal. Sampel yang digunakanadalah
sampel enzime ekstrak dan hasil fraksinasi yaitu enzime yang sudah
dimurnikan .Enzim α-amilasemerupakanenzim yang
dapatmenguraikanamilumdenganmemutuskanikatan α-
1,4glikosidadalampatisecaraacakdaribagiandalammolekul,
baikpadaamylasemaupunamilopektin.
PrinsippercobaaniniadalahPenentuanaktivitasspesifikenzim α-
amilasesecaraspektrofotometri. Metodepada percobaan ini yaitu
spektrofotometri untuk menentukan aktivitas enzime α-amilase, metode
Nelson-Soumogyi untuk menentukan produk enzimatisnya. Commented [I31]: Apa produk enzimatisnya ?
Campurandiinkubasipadasuhu 370C
karenasuhutersebutmerupakansuhu optimum aktivitasenzim α-amilase.
Jikasuhuinkubasilebihtinggimaka protein akanterdenaturasi yang
mengakibatkanaktivitasenzimmenurun. Begitu pula
24
Percobaaninibetujuanuntukpenentuankadargulapereduksidenganmen
ggunakanmetode Nelson-Soumogyi.
Penentuankadargulapereduksimerupakanwujuddariujiaktifitasenzim α-
amilase. Aktivitasenzimmerupakan unit aktivitasenzimpermiligram protein, Commented [I34]: Aktivitas enzim atau aktivitas spesifik
enzim ?
sedangkansatu unit aktivitasenzim α-amilasemerupakanaktivitasenzim
yang menyebabkanterbentuknya 1µmol
produkglukosadarisubstratamilumpersatuanwaktuinkubasi
padakondisitemperaturedan PH tertentu. Ujiaktivitasspesifikenzim α-
amilasediawalidenganreaksienzimatis,
yaitudenganmenambahkanlarutanamilum 1% dan buffer
fosfatkedalamenzimkasardanenzimhalus.
E + S ES E + P
CH 2OH CH2 OH
O
OH
alf a - amilase
O OH O O + Buf f er Fosf at
OH OH
25
(Poedjiadi, 1994)
Reaksireduksi Cu2+:
Cu2++ e Cu2+
Reaksiterbentuknyakuprioksida :
CHO CHO
H C OH H C OH
OH C H
Cu2+ OH C H
+ Cu2O
H C OH Alkali
H C OH
H C OH H C OH
CH 2OH CH 2OH (Lehninger, 1999)
Metode Nelson-Soumogyimenganalisasecarakuantitatif.
Produkreaksienzimatisberupaglukosa,
akantetapimetodeinimemilikikekurangankarenagula non pereduksi
(sukrosa) tidakdapatterdeteksi danhanyabias mendeteksigulapereduksi
(glukosa-fruktosa) padahalprodukdaripemecahanamilumolehenzim α-
amilasebukanglukosamelainkanmaltosa, sukrosadangula non pereduksi
yang lain. Commented [I38]: Pahami lagi..apa benar kaya gitu ?
Penentuankadarglukosadilakukandenganmengukurabsorbansi
larutantersebutdenganmenggunakanspektrofotometer UV-VIS pada λ 520 Commented [I40]: Panjang gemlombangnya bukan ini..
Strukturkompleksbiru :
HN NH
R CH C O
Cu2+
O C HC R
HN NH (Lehninger, 1999)
Penentuankuantitatifkadar protein
secaralowrydidasarkanpadaabsorbansisinarolehkompleksbiru.
Absorbansidiukurdenganmenggunakanspektrofotometri UV-VIS.
Absorbansisampel yang diperolehyaitupada λ = 700nm untuk ekstrak kasar Commented [I42]: Bukan 700nm
yaitu 1,025dan untuk sampel hasil fraksinasi yaitu 1,999. Hasil tersebut Commented [I43]: Alasnny kenapa ?
V. Pembahasan
Percobaan aktivitas spesifik enzim α-amilase bertujuan untuk
menentukan aktivitas spesifik enzim α-amilase hasil isolasi dan pemurnian
awal. Sampel yang digunakan adalah sampel enzim ekstrak dan hasil
fraksinasi yaitu enzim yang sudah dimurnikan. Enzim α-Amilase
menghidrolisis ikatan α-1,4 glukossidik amilosa, amilopektin dan glikogen.
Enzim ini bersifat sebagai endoamilase, yaitu enzim yang memecah pati
secara acak dari tengah atau bagian dalam molekul. Prinsip percobaan ini
adalah Penentuan aktivitas spesifik enzim α-amilase secara kromatografi.
Metode pada percobaan ini yaitu Fraksinasi (yaitu, pemurnian yang
didasarkan pada pengendapan secara bertahap), Sentrifugasi (yaitu proses
pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan dengan cara
sentrifugal/perputaran), dan metode kromatografi (pengukuran absorbansi).
CH 2OH CH2 OH
O
OH
alf a - amilase
O OH O O + Buf f er Fosf at
OH OH
Maltosa Glukosa
(Poedjiadi, 1994)
CHO CHO
H C OH H C OH
OH C H
Cu2+ OH C H
+ Cu2O
H C OH Alkali
H C OH
H C OH H C OH
CH 2OH CH 2OH
6.2 Saran
- Ikuti metode dan langkah kerja sesuai apa yang diharapkan
- Selalu teliti ketika penambahan reagen ke sampel dan blangko
34
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
Ekstrak kasar
y = 0,0261x – 0,0037
= 0,0261 {[(A-b)/a] . (Vtot/Venzim) . (Vsampel/Vanalit) . (1/BMglukosa) . (1/tinkubasi)} –
0,0037
= 0,0261 [{-0,03-(-0,0037)}/0,0261] . (5/0,1) . (4/1) . (1/180) . 1/20] – 0,0037
= -5,16 x 10-3 Commented [I54]: gunakan fungsi equation pada word
Fraksinasi:
y = 0,0261x – 0,0037
= 0,0261 {[(A-b)/a] . (Vtot/Venzim) . (Vsampel/Vanalit) . (1/BMglukosa) . (1/tinkubasi)} –
0,0037
= 0,0261 [{-0,083-(-0,0037)}/0,0261] . (5/0,1) . (4/1) . (1/180) . 1/20] – 0,0037
= 8,11 x 10-3