Anda di halaman 1dari 27

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang


Mikroorganisme halofilik merupakan mikroorganisme yang tahan terhadap
kadar garam tinggi (Kanlayakrit dan Bovornreungroj, 2002; Oren, 2003; Falb,
2005; Kushner, 1985) Bakteri halofilik dapat ditemukan dalam bittern yaitu
pekatan sisa dalam proses pembuatan garam Madura merupakan salah satu sentra
industri garam yang cukup besar di Indonesia Garam dapat dibuat dengan cara
menampung air laut pada saat pasang ke dalam tambak garam yang selanjutnya
dilakukan pemekatan dengan cara diuapkan sehingga akan diperoleh kristal garam
Para petani garam biasanya hanya mengambil kristal garam (NaCl) untuk
dipasarkan sedangkan air sisa hasil pemekatan (bittern) belum dimanfaatkan,
padahal didalamnya banyak terkandung berbagai macam mineral dan berbagai
jenis mikroorganisme seperti bakteri halofilik (Dodia et al, 2006)
Enzim bakteri halofil dapat bertahan pada lingkungan dengan kadar garam
tinggi Hal ini dikarenakan sebagian besar asam amino yang menyusun protein
dalam sel bakteri halofil merupakan asam amino yang bersifat asam, yaitu asam
amino yang memiliki rantai samping gugus asam karboksilat (COOH), misalnya
asam glutamat dan asam aspartat (Edwards, 1990) Penambahan NaCl akan
menstabilkan konformasi protease dengan menetralkan muatan-muatan negatif
(COO-) sehingga aktivitas protease halofil meningkat dengan penambahan NaCl
(Oren, 2003; Edwards, 1990)
Aktivitas protease dipengaruhi oleh beberapa faktor salah satunya adalah pH
Protease memiliki pH optimum yaitu pH dimana aktivitas protease paling tinggi
dalam mengkatalisis reaksi hidrolisis protein menjadi oligopeptida dan asam-asam
amino penyusunnya Perubahan pH dari nilai optimum akan menyebabkan
terjadinya protonasi dan deprotonasi sehingga akan berpengaruh pada sisi aktif
protease dalam membentuk komplek enzim substrat, hal ini akan mempengaruhi
aktivitas protease (Poedjiadi, 1994; Suhartono, 1989)

1.2 Tujuan Penelitian


Tujuan penelitian ini adalah :
1. Memperoleh enzim protease dari bakteri halofilik
2. Mendapatkan pH optimum protease halofil
3. Menentukan Pengaruh penambahan NaCl terhadap aktivitas protease halofil
pada berbagai pH
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Mikroorganisme
Mikroorganisme atau mikroba adalah organisme yang berukuran mikro
(10 m atau 10-3 mm) Berdasarkan bentuk selnya, mikroorganisme dibagi menjadi
-6

dua yaitu mikoorganisme eukariotik dan prokariotik Mikroorganisme eukariotik,


diantaranya adalah fungi, khamir, jamur dan protozoa, sedangkan yang tergolong
mikroorganisme prokariotik diantaranya adalah bakteri, sianobakteri, dan virus
Mikroorganisme di gambarkan dengan sel tunggal atau unisel Beberapa jenis
mikroorganisme prokariotik unisel dapat terlihat oleh mata, dan beberapa jenis
multisel tidak dapat terlihat oleh mata (Todar, 2004)

2.2 Tinjauan Umum Bakteri


Bakteri berasal dari bahasa Yunani yaitu”Bakterion”yang berarti batang
atau tongkat Bakteri berkembangbiak dengan membelah diri Studi mengenai
bakteri mulai berkembang setelah ditemukan mikroskop oleh Anthonie Van
Leeuwenhoek (1683), yang akhirnya berkembang sampai terbentuklah cabang
biologi yaitu bakteriologi
Bakteri gram negatif mempunyai struktur dinding sel multilayer,
mengandung 5-20 % peptidoglikan, dinding sel mengandung lipid, polisakarida
dan protein, biasanya ada pada membran di luar membran peptidoglikan Membran
luar mengandung lipopolisakarida (LPS) Bakteri gram positif mempunyai dinding
sel lapis tunggal dan lebih kuat Dinding sel mengandung 90 % peptidoglikan
tetapi tidak mengandung lipopolisakarida (Brock, 1979; Carman, 2001) Karena
adanya perbedaan ini maka bakteri gram positif akan menghasilkan warna ungu,
sedangkan bakteri gram negatif akan memberikan warna merah pada akhir
pewarnaan gram (Carman, 2001) Perbedaan dinding sel bakteri gram positif dan
gram negatif ditunjukkan oleh gambar 21

Gram +

peptidoglikan
Gram - LPS & Protein

Gambar 2.1 Ilustrasi Dinding sel bakteri gram positif dan gram negatif

2.3 Bakteri Halofilik


Bakteri halofilik merupakan jenis mikroorganisme yang habitatnya berada
pada kadar garam tinggi Bakteri halofil dapat diklasifikasikan berdasarkan kadar
garam yang dibutuhkan diantaranya; jenis halofil pada kadar rendah yang tumbuh
optimal pada 0,2-0,85 molL-1 (2-5%) NaCl, jenis halofil pada kadar sedang yang
tumbuh optimal pada 0,85-3,4 molL-1 (5-20%) NaCl dan untuk jenis halofil yang
ekstrim (kadar garam tinggi) tumbuh optimal pada kadar garam sekitar 3,4-5,1
molL-1 (20-30%) NaCl Protein-protein penyusun sitoplasma dan ribosom pada
bakteri halofil mempunyai tingkat keasaman yang lebih tinggi dibandingkan
dengan bakteri lainnya (Edwards, 1990) Ilustrasi permukaan protein bakteri
halofil disajikan dalam gambar II.2

a b
Gambar 2.2 Ilustrasi permukaan protein bakteri halofilik (a) dan non halofil(b)
merah : karakter asam, biru : karakter basa, putih : karakter netral
(Oren, 2003)

2.4 Enzim
Enzim berasal dari istilah Yunani, yang artinya “di dalam sel” Enzim
merupakan protein yang berfungsi sebagai katalisator untuk reaksi-reaksi kimia
dalam sistem biologi (Winarno, 1983) Enzim bersifat spesifik terhadap substrat
tertentu Pada umumnya prinsip dasar mekanisme kerja enzim melalui dua
mekanisme yaitu :
1. Orientasi molekular (Molecular orientation)
Setiap substrat akan terorientasi secara tepat pada sisi aktif enzim untuk
terjadi reaksi
2. Pembentukan produk antara enzim-substrat (Intermedieted product)
Ikatan enzim-sustrat (ES) terjadi karena adanya penyebaran elektron dari
molekul substrat sehingga terjadi peregangan pada ikatan kovalen spesifik
Hal ini menyebabkan ikatan mudah putus Pembentukan produk antara ES
akan mempercepat laju kesetimbangan reaksi tanpa mempengaruhi konstanta
kesetimbangan (Shahib,1992)

2.4.1 Faktor-faktor yang Mempengaruhi Kerja Enzim


Faktor-faktor yang mempengaruhi kerja enzim, yaitu (Poedjiadi, 1994;
Suhartono, 1989) :
1. Konsentrasi enzim
Kecepatan reaksi bertambah dengan bertambahnya konsentrasi enzim Pada batas
tertentu, tidak terjadi kenaikan kecepatan reaksi walaupun konsentrasi enzim
diperbesar (gambar 23)

Gambar 2.3 Grafik pengaruh konsentrasi enzim terhadap kecepatan reaksi


1. Konsentrasi substrat
Kecepatan reaksi meningkat dengan pertambahan konsentrasi substrat Namun
pada batas tertentu, tidak terjadi kenaikan kecepatan reaksi walaupun konsentrasi
substrat diperbesar (gambar 24)

Gambar 2.4 Grafik pengaruh konsentrasi substrat terhadap kecepatan reaksi Suhu

Perubahan suhu lingkungan akan berpengaruh terhadap efektivitas sisi aktif


enzim dalam membentuk kompleks enzim-substrat Suhu optimum, merupakan
suhu dimana aktivitas enzim paling tinggi dalam mengkatalisis suatu reksi kimia
(gambar 25)

Suhu
v Optimum

Suhu

Gambar 2.5 Grafik pengaruh suhu terhadap kecepatan reaksi

2. pH
Perubahan pH lingkungan akan berpengaruh terhadap efektivitas sisi aktif
enzim dalam membentuk kompleks enzim-substrat (gambar 26) Nilai pH
optimum merupakan pH dimana aktivitas enzim paling tinggi dalam
mengkatalisis suatu reaksi

pH Optimum

pH

Gambar 2.6 Grafik pengaruh pH terhadap kecepatan reaksi

3. Inhibitor
Inhibitor merupakan molekul atau ion yang dapat menghambat reaksi
pembentukan kompleks enzim-substrat (ES) dengan cara menghambat pada
bagian aktif enzim Inhibitor dapat berupa bahan yang secara struktural
menyerupai substrat enzimnya tetapi salah satunya tidak bereaksi atau bereaksi
dengan sangat lambat dibandingkan dengan substrat

2.5 Enzim Protease


Enzim protease merupakan enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis
protein menjadi polipeptida dan asam amino penyusunnya (Bugg, 2004; Frey dan
Hegeman, 2007) Penggunan enzim protease dalam berbagai produk komersial
semakin meluas sejalan dengan kemajuan dalam bidang bioteknologi Protease
dimanfaatkan dalam bidang industri antara lain dalam pengolahan pangan,
penyamakan kulit, deterjen, dan pengolahan limbah cair Di Indonesia kebutuhan
akan enzim protease semakin meningkat namun kebutuhan ini masih tergantung
pada produksi impor Salah satu cara mengantisipasi ketergantungan terhadap
impor tersebut perlu ada usaha untuk memproduksi enzim protease (Norberg,
1969)

Berdasarkan sifat kimia dari lokasi sisi aktif enzim protease, maka jenis-
jenis protease dapat dibedakan menjadi:
1. Protease serin
Yaitu jenis protease yang mempunyai residu serin pada lokasi sisi aktif
Contoh : enzim tripsin, kemotripsin dan substilisin
2. Protease Sulfihidril
Yaitu jenis protease yang mempunyai residu sulfihidril pada lokasi sisi
aktif Contoh : Enzim papain dan bromelin
3. Protease Metal
Yaitu jenis protease yang kereaktifannya tergantung dengan adanya logam
Contoh : Enzim karboksil peptidase
4. Protease Asam
Yaitu jenis protease yang memiliki rantai samping gugus karboksil Contoh
: Enzim pepsin dan renin (Winarno, 1983)

Protease dapat diidentifikasikan menggunakan substrat azokasein


Azokasein merupakan protein yang mengikat zat warna azo Senyawa azo
memiliki srtuktur umum R-N=N-R’ R dan R’ adalah rantai organik yang sama
atau berbeda Seyawa azo dapat berupa senyawa aromatik maupun alifatik
Senyawa azo aromatik bersifat stabil dan mempunyai warna menyala Senyawa
azo alifatik lebih labil Reaksi zat warna azo dengan tirosin disajikan dalam
gambar 27 :

CH2CH(NH2)COOH CH2CH(NH2)COOH

+ -Cl N2 SO3H
N N SO 3H + HCl

OH OH

Tyrosine Diazonium compound Azo dye

Gambar 2.7 Reaksi asam amino (tirosin) dan senyawa azo (Plummer, 1979)
2.6 Identifikasi Mikrobiologi
Salah satu cara identifikasi bakteri adalah teknik pewarnaan gram Dalam
proses ini bakteri yang terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut: kristal ungu,
larutan yodium, alkohol (bahan pemucat), dan safranin Bakteri yang diwarnai
dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok yaitu gram positif dan gram
negatif
Pada bakteri gram negatif, penambahan kristal ungu dan iodin dapat
menghasilkan kompleks ungu-iodin yang terbentuk di antara membran luar dan
plasma yang dapat larut dalam alkohol-aseton Membran luar bakteri gram negatif
yang tersusun atas LPS (lipopolisakarida), protein larut dan lapisan tipis
peptidoglikan Lapisan peptidoglikan yang tipis membuat kompleks ungu-iodin
yang terbentuk antara membran luar dan plasma menjadi tidak stabil karena
penambahan alkohol-aseton (Beveridge, 1999; McClelland, 2001), sehingga
dengan penambahan safranin akan menimbulkan warna merah pada dinding sel
Sedangkan pada bakteri gram positif, lapisan peptidoglikan yang dimiliki lebih
tebal sehingga dengan penambahan alkohol-aseton hanya menyebabkan lapisan
peptidoglikan terdehidrasi (Inglis, 2001) Hal ini menyebabkan pori-pori dinding
sel menutup dan mencegah lepasnya kompleks ungu-iodin yang terbentuk (Brock,
1979; Todar, 2004)

2.7 Kurva Pertumbuhan bakteri


Fase –fase pertumbuhan pada bakteri (gambar 211) meliputi:
a) Fase adaptasi
Bakteri melakukan penyesuaian dengan kondisi lingkungan baru
a) Fase pertumbuhan logaritma (eksponensial)
Bakteri membelah dengan cepat dan konstan mengikuti kurva logaritma
b) Fase pertumbuhan tetap (Stasioner)
Jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati
c) Fase kematian
Sebagian besar populasi bakteri mulai mengalami kematian karena nutrien
habis dan ada zat racun

Fase
adaptasi Fase stasioner

Fase
eksponensial Fasa kematian

Gambar 2.8 Kurva Pertumbuhan Bakteri (Suhartono,1989)


2.8 Isolasi dan Pemurnian Enzim
2.8.1 Isolasi Enzim
Isolasi enzim pada umumnya dilakukan dengan pemisahan sel melalui
sentrifugasi Isolasi enzim diperlukan karena enzim yang terpisah dari sumbernya
dan murni lebih besar manfaatnya dalam bidang industri maupun kesehatan
(Scopes, 1982)
Pemisahan enzim dilakukan dengan proses sentrifugasi yang dilakukan
berdasarkan adanya gaya sentrifugal pada partikel Metode sentrifugasi merupakan
cara pemisahan enzim dari partikel-partikel lain yang tidak dikehendaki
berdasarkan ukuran partikel yang dipisahkan, medium cair dimasukan ke dalam
tabung sentrifugasi yang ditempatkan pada rotor berputar Partikel yang berbeda
ukuran, berat jenis, dan bentuk akan mengendap dengan gaya pada kecepatan
yang berbeda Teknik sentrifugasi banyak dipakai dalam isolasi enzim karena
pelaksanaanya mudah, cepat, dan lebih baik dalam penyaringan Setelah
sentrifugasi akan diperoleh larutan bening (supernatan) dan residu atau endapan
(Scopes, 1982)

2.8.2 Pemurnian Enzim


Pemurnian enzim dapat dilakukan dengan cara fraksinasi Fraksinasi
dilakukan untuk memurnikan enzim secara bertingkat dengan menggunakan
garam amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan yang berbeda (Dennison, 2002;
Bugg, 2004) Hal ini bertujuan untuk memisahkan protein enzim protease dengan
protein lainnya Penambahan garam elektrolit mengakibatkan terjadinya
pengurangan kelarutan protein (salting out) Pada proses salting out terjadi
kompetisi antara molekul-molekul protein dan kation garam dalam menarik air
Kepolaran ion-ion garam lebih besar sehingga kemampuannya mengikat air lebih
besar yang menyebabkan protein kekurangan air dan akhirnya mengendap
(Collowick, 1999)

2.8.3 Dialisis
Amonium sulfat yang terlarut setelah proses fraksinasi dipisahkan dengan
cara dialisis Prinsip dialisis adalah pemisahan partikel protein yang bermolekul
besar dengan partikel amonium sulfat dengan berat molekul kecil melalui
membran semi permeabel atas dasar sifat difusi karena perbedaan konsentrasi di
dalam dan di luar membran (Pierce, 2005)
Umumnya membran yang digunakan untuk proses dialisis ini adalah
membran selofan Membran selofan ini memiliki sifat semipermeabel yaitu dapat
dilewati molekul kecil tetapi akan menahan molekul ukuran besar (Pierce, 2005)

2.9 Unit Aktivitas dan Aktivitas Spesifik Enzim


Satu unit aktivitas enzim adalah aktivitas enzim yang menyebabkan
transformasi sejumlah substrat pada kondisi optimum Sedangkan aktivitas spesifik
adalah unit aktivitas enzim per milligram protein (Wirahadikusumah, 1989)
Faktor-faktor yang mempengaruhi dalam penentuan aktivitas enzim, yaitu
(Wirahadikusumah, 1989):
1) Persamaan reaksi yang dikatalisis oleh enzim tersebut
2) Pengaruh konsentrasi substrat
3) pH optimum dan suhu optimum
4) Analisis penentuan berkurangnya substrat atau bertambahnya produk
2.10 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry
Kadar protein digunakan untuk menentukan aktivitas spesifik enzim
(Lehninger, 1994) Penentuan kadar protein dilakukan dengan metode Lowry
berdasarkan kurva standar larutan BSA
Prinsipnya dalam penentuan kadar protein adalah reaksi pembentukan
kompleks ikatan peptida dengan ion-ion Cu2+ pada suasana basa dan reduksi asam
fosfomolibdat fosfotungstat pada reagen Folin ciocaltaeu oleh rantai samping
asam amino menjadi heteropolimolibdenum berwarna biru (Collowick, 1999)
seperti disajikan dalam gambar 29 dan dianalisis dengan spektrofotometer UV-Vis

Gambar 2.9 Reaksi Pembentukan Kompleks dalam Metode Lowry (Pierce, 2005)

2.11 Spektrofotometer Ultraviolet Cahaya Tampak (UV-VIS)


Spektrofotometer merupakan alat yang terdiri dari spektrometer dan
fotometer, digunakan untuk mengukur energi secara relatif jika energi tersebut
ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang
gelombang (Khopkar, 2002) Spektrofotometer UV-Vis bekerja pada panjang
gelombang 200-800 nm Semua molekul dapat menyerap radiasi dalam daerah
UV-Vis karena mengandung elektron yang dapat dieksitasikan ke tingkat energi
yang lebih tinggi Jika suatu molekul mengandung sebuah atom yang mempunyai
pasangan elektron bebas, sebuah elektron tak terikat (non-bonding) dapat
dieksitasikan ke tingkat energi yang lebih tinggi
Bila konsentrasi materi yang dilewati cahaya bertambah, maka cahaya akan lebih
banyak diserap Jadi, absorbansi berbanding lurus dengan ketebalan b dan
konsentrasi c (Underwood, 1998) Hubungan antara absorbansi A dan konsentrasi
zat pengabsorbsi c adalah linier

A=a bC

Keterangan:
A : Absorbansi
a : absorptivitas
b : tebal medium penyerap
C : Konsentrasi
BAB III
METODE PENELITIAN

Untuk mencapai tujuan penelitian dilakukan isolasi dan pemurnian


protease bakteri halofilik isolat bittern tambak garam Madura yang meliputi
beberapa tahap yaitu sentrifugasi, fraksinasi, dialisis, penentuan aktivitas dan
aktivitas spesifik enzim Dilanjutkan dengan penentuan pengaruh penambahan
NaCl terhadap aktivitas protease pada berbagai pH Penelitian dilakukan di
Laboratorium Biokimia jurusan kimia F MIPA UNDIP Semarang
3.1 Variabel Penelitian
3.1.1. Variabel yang diukur :
1. Aktivitas protease
2. Aktivitas protease pada berbagai pH
3. Aktivitas protease dengan penambahan NaCl pada berbagai pH
3.1.2. Variabel bebas :
1. Derajat keasaman (pH) larutan buffer
2. Konsentrasi NaCl
3.1.3. Variabel yang dikonstankan :
1. Konsentrasi Substrat (Azokasein)
2. Volume Substrat (Azokasein)
3. Volume Enzim
4. Suhu
5. Waktu inkubasi

3.2 Alat dan Bahan


3.2.1 Alat-alat
Peralatan yang digunakan antara lain: tabung reaksi, erlenmeyer, gelas
ukur, labu ukur, lampu spirtus, penangas air, pengaduk gelas, aluminium foil,
botol semprot, inkas, inkubator (Memmert), shaker inkubator TIT (TS-330 A),
sentrifugator (Centrific- 228), shaker waterbath incubator (Memmert), pH meter
(Orion 420 A) autoklaf (Clinical Autoclave Prestige Medical series 2100),
autoklaf (Napco model 8000-DSE autoclave), timbangan analitik, mikroskop
beserta slide mikroskop, lemari pendingin (Sanyo SR-LV 239 N), botol semprot,
kertas label, kapas, micropipette secorex (Swiss made), magnetik stirer (Nuova),
spektrofotometer UV-Vis, (Shimadzu) dan peralatan gelas lainnya

3.2.2 Bahan-bahan
1. Sampel
Koloni tunggal isolat bakteri halofilik
2. Bahan
Bahan–bahan yang dibutuhkan pada penelitian ini antara lain : tripton (Conda),
ekstrak ragi (Conda), KH2PO4 pa, akuades, reagen Lowry, BSA (Bovine Serum
Albumin), alkohol 70 % (Merck), TCA/ Tri Cloroacetic Acid (Merck), Azokasein
(Sigma) , larutan kristal ungu (Merck), reagen gram’s Iodin (Merck), alkohol-
aseton (Merck), safranin (Merck), bufer fosfat (Merck), glisin (Merck), NaOH
(Merck), NaCl (Merck), artificial sea water (ASW), KH2PO4 (Merck), glukosa
(Merck), kasein (Merck)
3.3 Cara Kerja
3.3.1 Pengadaptasian bakteri pada Halophile Synthetic Broth Media (HSBM)
Isolat bakteri sebanyak 10 μL dari stok media Enrichment halophile
Broth (EHB) diinokulasikan ke dalam 100 mL media HSB dengan pengaturan
komposisi bittern dan ASW (Artificial Sea Water), kemudian diinkubasi dalam
shaker inkubator pada temperatur 37 0C selama 24 jam dengan kecepatan 250
rpm
Pengadaptasian bakteri dari media EHB ke dalam media HSB dilakukan
secara bertahap dengan mengatur komposisi bittern dan ASW sampai semua
bittern digantikan oleh ASW

Perbandingan Komposisi (%)


Sampel
Bittern ASW
B Halofil 100 0
B Halofil 80 20
B Halofil 60 40
B Halofil 40 60
B Halofil 20 80
B Halofil 0 100
Aquades steril 0 100

3.3.2 Uji Morfologi dan Pewarnaan Gram


Slide mikroskop disterilkan dengan alkohol, kemudian dilewatkan di atas
api dan didinginkan pada suhu kamar Setelah itu 2-3 tetes kultur bakteri dari
media EHB diletakan di atas slide steril dan dikeringkan dengan cara melewatkan
slide di atas api dan mengangin-anginkan slide sehingga diperoleh preparat,
kemudian di atas preparat ditambahkan 2-3 tetes larutan kristal ungu dan
didiamkan selama 1 menit Kemudian dicuci dengan aquades dan diangin-
anginkan sampai kering Kemudian ditambahkan setetes reagen gram iodin, dan
didiamkan selama 1 menit Setelah itu slide dicuci dengan aquades dan
dikeringkan Larutan alkohol aseton ditambahkan sebanyak 2 tetes dan diamkan
selama 30 detik Kemudian ditambahkan safranin 2-3 tetes dan didiamkan selama
2 menit Pengamatan morfologi dan pewarnaan gram dilakukan di bawah
mikroskop dengan perbesaran 1500X Hal ini dilakukan juga pada kultur bakteri
dari media HSB (Carman, 2001)

3.3.3 Kurva Pertumbuhan bakteri


Sebanyak 10 μL kultur hasil dari peremajaan (sebagai starter)
diinokulasikan pada 100 mL media HSB dan diinkubasi dalam shaker inkubator
pada suhu 370C selama 48 jam dengan kecepatan 250 rpm dan diukur
absorbansinya tiap 4 jam sekali

3.3.4 Peremajaan bakteri pada media Halophile Synthetic Broth (HSB)


Isolat bakteri dari stok media Halophile Synthetic Broth (HSB), dapat
diremajakan kembali dengan menginokulasikan 10 μL isolat bakteri kedalam 100
mL media Halophile Synthetic Broth (HSB), kemudian diinkubasi dalam orbital
0
shaker inkubator pada suhu 37 C selama waktu optimum sesuai kurva
pertumbuhan

3.3.5 Produksi Enzim Protease


Isolat bakteri hasil starter diambil 100 µL, diinokulasikan pada 1 liter
media HSB dan diinkubasi dalam orbital shaker inkubator pada suhu 37 0C
selama waktu optimum berdasarkan kurva pertumbuhan

3.3.6 Isolasi Enzim Protease


3.3.6.1 Ekstraksi (pemisahan enzim ekstraseluler dari bakteri)
Isolat bakteri yang dihasilkan dengan volume 1 liter kultur produksi
enzim, disentrifus dengan kecepatan 6000 rpm selama 30 menit Kemudian
dipisahkan antara supernatan dan endapan Supernatan (enzim ekstrak kasar) yang
diperoleh selanjutnya disimpan pada suhu dingin (Bugg, 2004)

3.3.6.2 Fraksinasi dengan garam amonium sulfat


Fraksinasi dilakukan untuk memurnikan enzim secara bertingkat dengan
menggunakan garam amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan yang berbeda
(Dennison, 2002; Bugg, 2004) Amonium sulfat ditimbang sesuai dengan jumlah
yang dibutuhkan pada setiap tingkat fraksinasi Amonium sulfat yang sudah
ditimbang untuk fraksi 0-20 % dimasukan ke dalam larutan enzim sedikit demi
sedikit sambil diaduk Pengadukan dilakukan dengan menggunakan pengaduk
magnetik stirer dalam penangas dingin Setelah itu, campuran yang terbentuk
dibiarkan selama 2 jam dalam keadaan dingin, kemudian disentrifus dengan
kecepatan 6000 rpm selama 15 menit sehingga akan diperoleh endapan dalam
fraksi 0-20 % dan filtratnya Untuk mendapatkan protein enzim yang lebih banyak,
setengah bagian supernatan pada bagian bawah disentrifugasi kembali dengan
menggunakan mikrosentrifus dengan kecepatan 14000 rpm selama 15 menit
sehingga akan diperoleh endapan dan supernatan Endapan dipisahkan kemudian
disuspensikan dengan Bufer fosfat 0,05 M pada pH 7,0 Filtrat yang dihasilkan
dijadikan untuk fraksi 2 dengan penambahan amonium sulfat kembali sesuai
dengan kadar pada fraksi 2 dan dilakukan penambahan reagen seperti perlakuan
sebelumnya Hal ini dilakukan sampai terdapat fraksi-fraksi berikutnya, yaitu
didapatkan fraksi dengan tingkat kejenuhan 20- 40%, 40-60%, 60-80% dan 80-
100% (Bugg, 2004)

3.3.6.3 Dialisis
Dialisis dilakukan dengan menggunakan selofan yang telah direbus dalam
aquades selama 30 menit Selofan dibuat bentuk kantong dan diisi dengan larutan
enzim hasil fraksinasi, kemudian diikat kedua ujungnya Selofan yang berisi enzim
yang tersuspensi dalam buffer pospat 0,05 M pH 7,0 tersebut direndam dalam
larutan Bufer fosfat 0,0005M pada pH 7,0 Dalam keadaan dingin Bufer diaduk
dengan magnetik stirer dan setiap 2 jam diuji kandungan amonium sulfatnya
dengan penambahan BaCl2 Dialisis dihentikan jika hasil pengujian tidak terbentuk
endapan putih Hasil dari dialisis diperoleh beberapa fraksi yaitu fraksi 0-20%
(F1), fraksi 20-40% (F2), fraksi 40-60% (F3), fraksi 60-80% (F4), fraksi 80-
100% (F5) (Dennison, 2002)
3.3.7 Uji Aktivitas Enzim
Aktivitas protease ditentukan berdasarkan kemampuan protease
menghidrolisis ikatan peptida pada substrat azokasein 2 % (b/v) selama 30 menit
Untuk larutan sampel, sebanyak 2,25 mL bufer fosfat 0,05 M pH 7,0 (lampiran B)
ditambah dengan aquades 0,625 mL dicampurkan dengan 0,125 mL larutan
azokasein 2 %, kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 5 menit dalam
shaker water bath incubator Selanjutnya ditambahkan 0,5 mL larutan enzim, dan
diinkubasi kembali pada kondisi optimum yaitu 37 0C selama 30 menit dalam
shaker water bath inkubator Setelah itu ditambahkan 1,5 mL larutan TCA 10 %
Campuran dikocok dan diinkubasi didalam air es sesaat Untuk larutan blanko (t0),
sebanyak 2,25 mL Bufer fosfat 0,05 M pH 7,0 (lampiran B) ditambah dengan
aquades 0,625 mL dicampurkan dengan 0,125 mL larutan azokasein 2%,
kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 30 menit dalam shaker water bath
inkubator, setelah itu ditambahkan 1,5 mL TCA 10 % dan 0,5 mL larutan enzim
yang telah dipanaskan Campuran dikocok dan diinkubasi didalam air es sesaat
Larutan blanko dan larutan sampel disentrifus pada 6000 rpm selama 30 menit
Masing-masing supernatan diukur absorbansinya pada 440 nm (Kanlayakrit etal,
2002 dan Kamelia dkk, 2005)

3.3.8 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum BSA


Larutan alkalin Natrium karbonat (2 g/ml Na2CO3 dalam 0,1 mol/L NaOH)
(larutan 1) Larutan CuSO4 – Natrium, Kalium tartat (0,5 g/ml CuSO45H2O dalam
1 g/ml Natrium,Kalium tartat) (larutan 2) Kedua larutan dicampurkan dengan
perbandingan larutan 1: larutan 2 = 50 : 1 Campuran ini disebut dengan larutan
alkalin Sebanyak 7,5 mL larutan alkalin ditambahkan dalam 1,5 ml larutan BSA
(0,2 mg/ml) Larutan dikocok dan di inkubasi pada suhu kamar selama 10 menit,
kemudian ditambah dengan 0,75 ml reagen folin Larutan diinkubasi selama 30
menit pada suhu kamar kemudian ditentukan absorbansinya pada berbagai
panjang gelombang dengan spektrofotometer UV-Vis (Plummer, 1979)

3.3.9 Penentuan Kurva Standar BSA


Larutan alkalin Natrium karbonat (2 g/ml Na2CO3 dalam 0,1 mol/L NaOH)
(larutan 1) Larutan CuSO4 – Natrium, Kalium tartat (0,5 g/ml CuSO45H2O dalam
1 g/ml Natrium, Kalium tartat) (larutan 2) Kedua larutan dicampurkan dengan
perbandingan larutan 1: larutan 2 = 50 : 1 Campuran ini disebut dengan larutan
alkalin 7,5 larutan alkalin ditambahkan dalam 1,5 ml larutan BSA berbagai
konsentrasi (0,02 hingga 2,0 mg/mL) Larutan dikocok dan di inkubasi pada suhu
kamar selama 10 menit, kemudian ditambah dengan 0,75 ml reagen folin Larutan
diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar kemudian ditentukan absorbansinya
pada panjang gelombang maksimum BSA dengan spektrofotometer UV-Vis
(Plummer, 1979)

3.3.10 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry


Larutan alkalin Natrium karbonat (2 g/ml Na2CO3 dalam 0,1 mol/L NaOH)
(larutan 1) Larutan CuSO4 – Natrium, Kalium tartat (0,5 g/ml CuSO 45H2O dalam
1 g/ml Natrium, Kalium tartat) (larutan 2) Kedua larutan dicampurkan dengan
perbandingan larutan 1: larutan 2 = 50 : 1 Campuran ini disebut dengan larutan
alkalin 7,5 larutan alkalin ditambahkan dalam 1,5 ml larutan enzim Larutan
dikocok dan di inkubasi pada suhu kamar selama 10 menit, kemudian ditambah
dengan 0,75 ml reagen folin Larutan diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar
kemudian ditentukan absorbansinya pada panjang gelombang maksimum BSA
dengan spektrofotometer UV-Vis (Plummer, 1979)

3.3.11 Penentuan pH Optimum


Aktivitas protease ditentukan berdasarkan kemampuan protease
menghidrolisis ikatan peptida pada substrat azokasein 2 % (b/v) selama 30 menit
Untuk larutan sampel, sebanyak 2,25 mL bufer 0,05 M (Variasi pH : 6,0; 7,0;
7,6; 8,0; 8,6; 9,0; 9,8; 10,6) (lampiran B) ditambah dengan aquades 0,625 mL,
dicampurkan dengan 0,125 mL larutan azokasein 2 %, kemudian diinkubasi pada
suhu 37 0C selama 5 menit dalam shaker water bath incubator Selanjutnya
ditambahkan 0,5 mL larutan enzim, dan diinkubasi kembali pada kondisi optimum
yaitu 37 0C selama 30 menit dalam shaker water bath inkubator Setelah itu
ditambahkan 1,5 mL larutan TCA 10 %, Campuran dikocok dan diinkubasi dalam
air es sesaat Untuk larutan blanko (t0), sebanyak 2,25 ml buffer 0,05 M (Variasi
pH : 6,0; 7,0; 7,6; 8,0; 8,6; 9,0; 9,8; 10,6) (lampiran B) ditambah dengan aquades
0,625 mL, dicampurkan dengan 0,125 mL larutan azokasein 2 % Larutan
diinkubasi pada suhu 37OC selama 30 menit Kemudian ditambahkan 1,5 ml
larutan TCA 10 % dan 0,5 ml enzim yang sudah dipanaskan Campuran dikocok
dan diinkubasi dalam air es sesaat Larutan sampel dan blanko disentrifus pada
6000 rpm selama 30 menit Masing-masing supernatan diukur absorbansinya pada
440 nm Hal yang sama dilakukan pada sampel protease non halofil yaitu akstrak
daun pepaya yang mengandung papain (Kanlayakrit etal, 2002 dan Kamelia dkk,
2005)

3.3.12 Penentuan Pengaruh penambahan NaCl pada berbagai pH


Larutan sampel, sebanyak 2,25 mL bufer 0,05 M (Variasi pH : 6,0; 7,0;
7,6; 8,0; 8,6; 9,0; 9,8; 10,6) (lampiran B) ditambah dengan aquades 0,125 mL dan
0,5 mL NaCl 0,25 M, dicampurkan dengan 0,125 mL larutan azokasein 2 %,
kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 5 menit dalam shaker water bath
incubator Selanjutnya ditambahkan 0,5 mL larutan enzim, dan diinkubasi
kembali pada kondisi optimum yaitu 37 0C selama 30 menit dalam shaker water
bath inkubator Kemudian ditambahkan 1,5 mL larutan TCA 10 % Untuk larutan
blanko (t0), sebanyak 2,25 ml buffer 0,05 M (Variasi pH : 6,0; 7,0; 7,6; 8,0; 8,6;
9,0; 9,8; 10,6) (lampiran B) ditambah dengan aquades 0,125 mL dan 0,5 mL NaCl
0,25 M, dicampurkan dengan 0,125 mL larutan azokasein 2 % Larutan diinkubasi
pada suhu 37OC selama 30 menit Kemudian ditambahkan 1,5 ml larutan TCA 10
% dan 0,5 ml enzim yang sudah dipanaskan Campuran dikocok dan diinkubasi
dalam air es sesaat larutan sampel dan blanko disentrifus pada 6000 rpm selama
30 menit Masing-masing supernatan diukur absorbansinya pada 440 nm Hal yang
sama dilakukan pada sampel protease non halofil yaitu akstrak daun pepaya yang
mengandung papain (Kanlayakrit etal, 2002 dan Kamelia dkk, 2005)
Keterangan:
 bufer fosfat untuk pH 6; 7; 7,6; 8
 bufer glisin NaOH untuk pH 8,6; 9; 9,8; 10,6

BAB IV
PEMBAHASAN

Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk memperoleh protease dari


bakteri halofil, menentukan pengaruh penambahan NaCl terhadap aktivitas
protease ekstraseluler bakteri halolofilik pada berbagai pH Untuk memperoleh
hasil tersebut maka pada penelitian ini dilakukan beberapa tahap yaitu isolasi dan
pemurnian enzim protease dari bakteri halofilik, penentuan unit aktivitas dan
aktivitas spesifik enzim protease, penentuan pengaruh penambahan NaCl terhadap
aktivitas protease pada berbagai pH

4.1 Pengadaptasian Bakteri pada Halophile Synthetic Broth Media


Koloni tunggal bakteri halofilik dari pekatan sisa dalam proses pembuatan
garam (bittern) Madura telah berhasil diisolasi dengan menggunakan media
Enrichment Halophile broth (EHB) Sebagai langkah awal dilakukan peremajaan
bakteri dengan menumbuhkan pada media EHB agar diperoleh kultur bakteri pada
kondisi yang aktif Komponen penyusun media EHB antar lain glukosa, tripton,
ekstrak ragi, KH2PO4, NaCl 10%, bittern dan akuades Glukosa digunakan sebagai
sumber karbon, ekstrak ragi sebagai sumber karbon dan nitrogen organik
(Suhartono, 1989) Tripton sebagai sumber protein kompleks, KH2PO4 sebagai
sumber phosphor yang dibutuhkan sebagai komponen penyusun ATP, asam
nukleat Akuades digunakan sebagai pelarut dan NaCl digunakan untuk mengatur
tekanan osmotik dalam sel Larutan bittern digunakan untuk pengkondisian
lingkungan yang sebenarnya sehingga bakteri dapat beradaptasi pada lingkungan
yang baru sehingga kelangsungan hidupnya tetap terjaga Kultur bakteri halofil
hasil peremajaan selanjutnya ditumbuhkan pada media Halophile synthetic broth
(HSB) secara bertahap agar bekteri mampu beradaptasi dengan kondisi
lingkungan yang baru Komponen penyusun media HSB hampir sama dengan
media EHB Pada media EHB menggunakan bittern untuk pengkondisian
lingkungan yang sebenarnya sedangkan pada media HSB menggunakan air laut
buatan (artificial sea water) Tujuan penggantian bittern dengan artificial sea
water adalah agar bakteri dapat ditumbuhkan kapan dan dimana saja tanpa
tergantung pada sumber alaminya (bittern)
Proses penggantian bittern dengan artificial sea water dilakukan secara
bertahap Sebanyak 10mL bittern dalam media diganti dengan artificial sea water
dengan perbandingan tertentu, seperti disajikan dalam Tabel 41 Larutan media
kemudian diinkubasi dalam shaker inkubator pada temperatur ± 370 C dengan
kecepatan 250 rpm karena bakteri halofil tumbuh optimum pada temperatur 370 C
(Kanlayakrit et al, 2002) Fungsi inkubasi dalam shaker inkubator adalah proses
aerasi untuk mencukupi kebutuhan oksigen yang dibutuhkan bakteri halofil Proses
inkubasi dalam shaker inkubator dilakukan selama 24 jam, Kekeruhan pada media
cair selama inkubasi menunjukkan keberadaan bakteri pada media Hal ini
didukung dengan kontrol negatif yang menunjukkan tidak adanya perubahan
kekeruhan sebelum dan sesudah inkubasi
Proses adaptasi dilakukan sampai semua bittern dalam media diganti
dengan artificial sea water Proses adaptasi menunjukan bakteri halofil dapat
tumbuh pada media HSB (Tabel 4.1)

Tabel 4.1 Hasil Pengadaptasian bakteri pada Halophile Synthetic Broth Media
Perbandingan Komposisi (%)
Sampel Hasil Keterangan
Bittern ASW
B Halofil 100 0 Kuning keruh Tumbuh
B Halofil 80 20 Kuning keruh Tumbuh
B Halofil 60 40 Kuning keruh Tumbuh
B Halofil 40 60 Kuning keruh Tumbuh
B Halofil 20 80 Kuning keruh Tumbuh
B Halofil 0 100 Kuning keruh Tumbuh
Aquades steril 0 100 Kuning jernih Tidak tumbuh

Tumbuhnya bakteri halofil ditandai dengan kekeruhan pada media yang


semua komponen bitternnya diganti dengan artificial sea water

4.2 Pengamatan Morfologi dan Pewarnaan Gram Bakteri


Bakteri koloni tunggal yang ditumbuhkan dalam media EHB dan HSB,
selanjutnya diamati morfologi dan sifat gramnya untuk membuktikan bahwa
bakteri yang ditumbuhkan dalam media EHB dan HSB sama morfologi dan sifat
gramnya Pengamatan dan uji yang telah dilakukan terhadap isolat bakteri
memperoleh hasil seperti pada gambar 41

(a) (b)
Gambar 4.1 Morfologi bakteri halofil dari stok Erichment Halophile
broth medi (a),dan stok Halophile synthetic broth media (b)

Pada gambar 4.1 di atas terlihat bahwa bakteri yang ditumbuhkan dalam
media EHB dan HSB merupakan bakteri yang sama Hal ini terlihat dari hasil
morfologi berbentuk bulat (coccus) dan sama-sama mempunyai sifat gram negatif
Hal ini dibuktikan dengan terbentuknya warna merah pada bakteri setelah
penambahan safranin Pada bakteri gram negatif, penambahan kristal ungu dan
iodin dapat menghasilkan kompleks ungu-iodin yang terbentuk di antara
membran luar dan plasma yang dapat terekstraksi oleh penambahan alkohol-
aseton Membran luar bakteri gram negatif yang tersusun atas LPS
(lipopolisakarida), protein larut dan lapisan tipis peptidoglikan Lapisan
peptidoglikan yang tipis membuat kompleks ungu-iodin yang terbentuk antara
membran luar dan plasma menjadi tidak stabil karena tidak mampu menahan
alkohol-aseton (Beveridge, 1999; McClelland, 2001), sehingga dengan
penambahan safranin akan menimbulkan warna merah pada dinding sel
Sedangkan pada bakteri gram positif, lapisan peptidoglikan yang dimiliki lebih
tebal sehingga dengan penambahan alkohol-aseton hanya menyebabkan lapisan
peptidoglikan terdehidrasi (Inglis, 2001) Hal ini menyebabkan pori-pori dinding
sel menutup dan mencegah lepasnya kompleks ungu-iodin yang terbentuk (Brock,
1979; Todar, 2004)
4.3 Kurva Pertumbuhan Bakteri
Kurva pertumbuhan bakteri adalah kurva yang memberikan informasi
mengenai fase-fase pertumbuhan yang terjadi pada bakteri Kekeruhan dari kultur
bakteri diukur berdasarkan nilai transmitansi setiap 4 jam selama 48 jam dengan
menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 520 nm
Kekeruhan yang dihasilkan sebanding dengan konsentrasi sel bakteri (Brock,
1979)
Dari penelitian diperoleh profil kurva pertumbuhan seperti disajikan pada
gambar 43 Kurva pertumbuhan menunjukan bakteri mengalami fase lag (adaptasi)
setelah inkubasi 0 sampai 24 jam Pada fase ini, bakteri menyesuaikan dengan
kondisi lingkungan baru di sekelilingnya sehingga kecepatan pertumbuhannya
masih minimum (Suhartono, 1989)
Inkubasi 24 jam sampai 36 jam merupakan fase logaritmik, yaitu jumlah
bakteri yang tumbuh mencapai maksimum Pada fase ini bakteri membelah dengan
sangat cepat Setelah Inkubasi 40 jam, kultur bakteri memasuki fase stasioner dan
fase kematian kecepatan pertumbuhan bakteri mulai menurun karena bakteri
mulai kekurangan nutrisi untuk membelah diri dan adanya metabolit sekunder
yang bersifat racun terhadap bakteri
c

waktu pemanenan
protease halofil

a
waktu penambahan induser

Gambar 4.2 Kurva pertumbuhan bakteri halofil


(a)fase lag (b)fase log (c)fase stasioner

4.4 Peremajaan Isolat Bakteri pada Halophile Synthetic Broth Media


Peremajaan bakteri pada media HSB bertujuan untuk memperoleh bakteri
yang aktif setelah cukup lama disimpan Pada penelitian ini waktu inkubasi yang
digunakan untuk peremajaan bakteri halofil pada media HSB adalah 32 jam
sesuai dengan waktu optimum pada kurva pertumbuhan pada proses ini dilakukan
penambahan inducer kasein untuk menginduksi sintesis protease Kasein
ditambahkan pada awal fase logaritma (inkubasi 24 jam)

4.5 Produksi Enzim Protease


Produksi protease dilakukan dengan menumbuhkan isolat bakteri hasil
peremajaan pada media Halophile synthetic broth media yang ditambah dengan
kasein Inducer kasein berfungsi untuk menginduksi sintesis protease Kasein
ditambahkan pada awal fase logaritma (inkubasi 24 jam) dan pemanenan protease
dilakukan 32 jam yang merupakan waktu optimum pertumbuhan bakteri halofil
sesuai dengan kurva pertumbuhan Pada tahap produksi enzim, didapatkan
protease ekstraseluler yang dihasilkan oleh bakteri

4.6 Isolasi Enzim Protease


4.6.1 Pemisahan enzim ekstraseluler dari sel bakteri
Pemisahan enzim ekstraseluler dari sel bakteri bertujuan untuk
memisahkan enzim dari komponen media dan organel sel bakteri Proses
pemisahan dilakukan dengan sentrifus 6000 rpm selama 30 menit Setrifugasi
bertujuan untuk memisahkan komponen-komponen sel yang masih ikut terlarut
Sentrifugasi dilakukan berdasarkan pada perbedaan ukuran dan berat partikel yang
tersuspensi (Scopes, 1982; Bugg, 2004) Partikel dengan ukuran, berat dan bentuk
yang berbeda akan mengendap pada kecepatan yang berbeda Pada tahap isolasi
didapatkan endapan dan supernatan Endapan merupakan sisa komponen-
komponen media dan organel sel bakteri, sedangkan supernatan merupakan enzim
ekstrak kasar (crude enzyme) Enzim ekstrak kasar yang diperoleh kemudian
dimurnikan melalui proses fraksinasi bertingkat
4.6.2 Fraksinasi Amonium Sulfat Bertingkat
Enzim Ekstrak kasar yang diperoleh merupakan campuran protein enzim
dan protein non enzim, sehingga perlu dilakukan pemurnian Fraksinasi dilakukan
untuk memurnikan enzim secara bertingkat dengan menggunakan garam
amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan yang berbeda (Dennison, 2002; Bugg,
2004) Hal ini bertujuan untuk memisahkan protein enzim protease dengan protein
lainnya Cara ini dilakukan berdasarkan pengaruh dari jumlah penambahan garam
amonium sulfat yang berbeda terhadap kelarutan protein Pengendapan dengan
garam amonium sulfat akan terjadi karena kompetisi antara amonium sulfat dan
protein dalam memperebutkan air Amonium sulfat akan mengikat air, sehingga
protein akan mengendap Pada proses fraksinasi, terjadi penurunan kelarutan
protein akibat naiknya konsentrasi garam amonium sulfat dalam larutan, peristiwa
ini disebut salting out (Dennison, 2002; Bugg, 2004)
Pemilihan garam amonium sulfat pada fraksinasi didasarkan pada
kelarutannya dalam air, ketahanan sebagian besar protein terhadap garam
amonium sulfat, daya pengendap yang cukup besar dan mempunyai efek
penstabilan terhadap protein (Dennison, 2002; Bugg, 2004) Pada tahap fraksinasi
amonium sulfat bertingkat diperoleh fraksi-fraksi enzim dengan tingkat kejenuhan
F1 (0-20%), F2 (20-40%), F3 (40-60%), F4 (60-80%), F5 (80-100%) Fraksi-fraksi
enzim yang diperoleh kemudian dimurnikan lebih lanjut melalui proses dialisis
4.6.3 Dialisis
Dialisis merupakan proses pemurnian lanjutan terhadap protein enzim
(Bugg, 2004) Garam amonium sulfat dari proses fraksinasi dipisahkan dengan
cara dialisis Protein-protein enzim dapat dipisahkan dari molekul-molekul kecil
(molekul-molekul garam ammonium sulfat) dengan cara dialisis melalui membran
semipermeabel (Dennison, 2002; Bugg, 2004)
Dialisis pada dasarnya merupakan proses difusi, yaitu karena adanya
perbedaan konsentrasi larutan bufer fosfat di dalam (0,05 M) dan di luar membran
(0,0005 M) Membran selofan adalah membran semipermeabel sehingga yang
dapat keluar dari membran hanyalah molekul-molekul yang mempunyai ukuran
lebih kecil dari protein enzim Ion-ion garam amonium sulfat yang memiliki
ukuran lebih kecil dari protein enzim dapat keluar dari membran, sedangkan
molekul protein enzim yang memiliki ukuran lebih besar akan tertahan di dalam
membran
Amonium sulfat yang telah terbebaskan dapat menyebabkan
kesetimbangan di dalam dan di luar membran Apabila telah dicapai
kesetimbangan, maka proses difusi dihentikan sehingga amonium sulfat tidak
dapat keluar dari dalam membran Oleh karena itu, buffer diganti secara kontinyu
agar proses difusi amonium sulfat lebih cepat Protein enzim yang didapatkan dari
proses dialisis merupakan protein enzim yang terbebas dari amonium sulfat
Adanya ion-ion sulfat pada larutan buffer di luar membran setelah proses
dialisis dapat diidentifikasi dengan menggunakan larutan BaCl2 Jika masih
terdapat ion-ion sulfat pada bufer maka akan terbentuk endapan putih BaSO 4 dan
jika tidak terbentuk endapan putih berarti protein enzim telah terbebas dari ion
sulfat (Norberg, 1969)

4.7 Penentuan Unit Aktivitas dan Aktivitas Spesifik Enzim Protease


Penentuan aktivitas protease dalam penelitian ini dilakukan melalui
penentuan jumlah produk azopeptida hasil hidrolisis azokasein dengan katalis
protease yang menyerap pada panjang gelombang 440 nm (lampiran E) Azokasein
berfungsi sebagai substrat dari protease, dan bufer fosfat 0,05 M berfungsi untuk
mempertahankan pH lingkungan Inkubasi larutan pada suhu 37 0C berfungsi untuk
mengoptimalisasi reaksi antara enzim dengan substrat Sedangkan penambahan
TCA (Triclorid acetic acid) ke dalam larutan uji adalah untuk menginaktifkan
reaksi enzimatis yang sedang berlangsung setelah 30 menit
Dalam penelitian ini 1 Unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai besarnya
aktivitas protease yang menyebabkan perubahan absorbansi 1% per mL pada
panjang gelombang 440 nm pada kondisi percobaan(modifikasi dari Kamelia dkk,
2005)
Aktivitas spesifik adalah unit enzim per miligram protein (Lehninger,
1995) Nilai aktivitas spesifik ini dapat digunakan sebagai ukuran besarnya
kemurnian enzim hasil isolasi (Lehninger, 1994) Kadar protein dapat ditentukan
dengan metode Lowry yaitu analisa kuantitatif berdasarkan pembentukan
kompleks warna biru hasil reaksi antara Cu2+ dengan nitrogen dari rantai peptida
dalam suasana basa dan reduksi fosfomolibdat fosfotungstat pada reagen Folin-
Ciocaltaeu oleh rantai samping asam amino tirosin dan triptopan menjadi
heteropolimolibdenum berwarna biru (Collowick, 1999) Warna biru yang
dihasilkan kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang optimum
BSA yaitu 790 nm (lampiran F) Absorbansi yang diperoleh kemudian diolah
dengan bantuan kurva standar BSA, sehingga didapatkan kadar protein
Penentuan aktivitas dan aktivitas spesifik terhadap enzim protease halofil
dilakukan pada EK, F1, F2, F3, F4, dan F5 yang diperoleh Besarnya aktivitas
enzim pada suatu fraksi bergantung pada jumlah enzim yang akan berinteraksi
dengan substrat yang spesifik Sedangkan besar kadar proteinnya merupakan
jumlah protein total pada fraksi tersebut Aktivitas spesifik pada enzim kasar dan
setiap fraksi dipengaruhi oleh dua faktor, yaitu besarnya aktivitas enzim dan kadar
protein total pada fraksi tersebut Hasil penentuan aktivitas dan aktivitas spesifik
disajikan pada Tabel 41

Tabel 4.2 Hasil Penentuan Aktivitas dan Aktivitas Spesifik protease halofil
Fraksi Aktivitas Enzim Kadar Protein Aktivitas Spesifik
Kemurnian
Enzim (Unit/1mL) (mg/1mL) (Unit/mg protein)
EK 4,5 0,080 56,25 1,00
F1 5,3 0,024 220,83 3,72
F2 6,3 0,071 88,73 1,61
F3 4,7 0,105 44,76 0,79
F4 4,1 0,099 41,41 0,73
F5 4,3 0,069 63,32 1,11

Tabel 4.1 menunjukkan bahwa protease halofil memiliki aktivitas spesifik


tertinggi pada fraksi F1 (0-20 %), yaitu 220,83 Unit/mg protein Hal ini
menunjukan pada F1 komposisi protease lebih tinggi dibandingkan fraksi yang
lain

4.8 Penentuan pH Optimum


Definisi pH optimum adalah pH dimana aktivitas enzim paling tinggi
dalam mengkatalisis suatu reaksi (Poedjiadi, 1994; Price, 1984) Hasil penentuan
pH optimum protease halofil ini menunjukkan bahwa pH optimum untuk
protease adalah pH 8 Pada kondisi pH tersebut aktivitas enzim protease halofil
sebesar 2,2 unit Penyimpangan dari keadaan optimum mengakibatkan
berkurangnya aktivitas enzim dengan nyata Pada pH 6 aktivitas enzim paling kecil
kemudian mengalami peningkatan hingga mencapai pH optimum dimana aktivitas
enzim paling besar Hasil pengukuran pH optimum protease halofil disajikan pada
gambar 43

Gambar 4.3 Grafik Penentuan pH optimum protease halofil


OH- H+

Pada suasana asam, terdapat kelebihan H+ dalam lingkungan, sehingga


gugus NH2 pada protease akan menangkap H+ membentuk NH3+, akibatnya
protease dalam keadaan kation (gambar 44 a) Protease dalam keadaan ini disebut
mengalami protonasi Dalam suasana basa, terdapat kelebihan OH - dalam
lingkungan sehingga protease akan melepaskan ion H+ yang terdapat pada gugus
COOH, akibatnya protease dalam keadaan anion (gambar 44 b) Protease dalam
keadaan ini disebut mengalamai deprotonasi (Frey dan Hegeman, 2007; Bugg,
2004; Stryer, 2002) Protonasi dan deprotonasi dapat menyebabkan denaturasi
karena dapat mengubah struktur enzim terutama pada sisi aktifnya sehingga
mengakibatkan menurunnya aktivitas protease

(a) (b) (c)

Gambar 4.4 Ilustrasi muatan permukaan protease pada suasana asam dan basa
(a)basa (b)optimum (c)asam (+) NH3+ (-) COO- (Bugg, 2004)

Berdasarkan studi literatur sebagian besar protease yang diisolasi dari


bakteri halofilik termasuk dalam golongan serin protease, antara lain protease
dari Halobacillus sp, Halobacterium salinarum dan Haloferax Mediterranei
(Oren, 2003) sehingga soal no 16 pembahasan mekanisme reaksi berdasarkan
struktur pada sisi aktif dari serin protease
Sisi aktif dari protease serin antara lain asam aspartat pada posisi 102 (Asp
102), histidin pada posisi 57 (His 57) dan serin pada posisi 195 (Ser 195)
Mekanisme reaksi hidrolisis protein disajikan dalam gambar 4.5:

Polipeptida
substrat

Polipeptida substrat berikatan Transfer H+ dari serin 195 ke nitrogen


non kovalen dengan bagian pada gugus imidazol His 57, terbentuk
hidrofobik komplek Enzim-substrat
(a) (b)
Terbentuk ikatan hydrogen antara H+ pada Molekul air terikat pada enzim
Nitrogen His 57 dengan Nitrogen pada C
terminal, dihasilkan peptide bebas
(c) (d)

Enzim
bebas

Transfer proton dari molekul air ke Terbentuknya Enzim bebas, H+


Nitrogen pada imidazol His 57, gugus ditransfer kembali dari His 57 ke Ser
OH molekul air terikat pada subtrat 195
(e) (f)
Gambar 4.5 Mekanisme Reaksi Hidrolisis protein oleh protease serin

Mekanisme reaksi menunjukkan gugus hidroksil (OH-) pada serin 195 berperan
sebagai nukleofilik yang menyerang gugus karbonil dalam rantai polipeptida
substrat (gambar 45 a dan b)
Berdasarkan penelitian, mekanisme reaksi tersebut dapat terjadi pada
kondisi pH optimum yaitu 8 Pada kondisi dibawah pH optimum, suasana
lingkungan enzim menjadi sedikit lebih asam dan H+ dari gugus hidroksil pada
sisi aktif serin 195 akan lebih sukar lepas Sehingga pada kondisi ini komplek
enzim substrat tidak terbentuk
Pada kondisi pH di atas pH optimum, suasana lingkungan enzim akan
semakin basa, sehingga jumlah ion OH- dalam lingkungan semakin banyak
Banyaknya ion OH- dapat mengganggu reaksi enzimatis, selain dapat
menyebabkan sisi aktif enzim menjadi bersifat nukleofil, ion OH - sendiri juga
merupakan nukleofil yang dapat berinteraksi dengan substrat Jika ion OH- dari
lingkungan yang bereaksi dengan substrat maka produk yang diharapkan tidak
terbentuk
Perubahan pH juga berpengaruh pada proses hidrolisis (gambar 45 d) Pada
kondisi pH dibawah pH optimum, suasana lingkungan enzim berubah lebih asam,
H2O akan cenderung berikatan dengan H+ dari lingkungan membentuk H3O+
sehingga sifat nukleofiliknya berkurang dan komplek enzim substrat tidak akan
terbentuk Pada kondisi pH diatas pH optimum, suasana lingkunan enzim akan
semakin basa Banyaknya ion OH- dapat mengganggu proses hidrolisis, selain
dapat menyebabkan molekul air menjadi bersifat nukleofil, ion OH- sendiri juga
merupakan nukleofil yang dapat berinteraksi dengan substrat Jika ion OH- dari
lingkungan yang bereaksi substrat maka produk yang diharapkan tidak terbentuk

4.9 Pengaruh penambahan NaCl 0,125 M terhadap aktivitas protease halofil


pada berbagai pH

Enzim bakteri halofil dapat bertahan pada lingkungan dengan kadar garam
tinggi Hal ini dikarenakan sebagian besar asam amino yang menyusun protein
dalam sel bakteri halofil merupakan asam amino yang bersifat asam, yaitu asam
amino yang memiliki rantai samping gugus asam karboksilat (COOH), misalnya
asam glutamat dan asam aspartat (Edwards, 1990) Sebagian besar aktivitas enzim
dari bakteri halofil meningkat dengan penambahan garam (Oren, 2003; Edwards,
1990, Norberg dan Hofsten, 1969)
Hasil penelitian menunjukan aktivitas protease halofil meningkat dengan
penambahan NaCl 0,125 M Kurva aktivitas protease halofil dengan penambahan
NaCl pada berbagai pH memiliki profil yang sama dengan kurva aktivitas
protease halofil tanpa NaCl, seperti disajikan pada gambar 46

Gambar 4.6 Grafik pengaruh penambahan NaCl 0,125 M pada berbagai pH


(a) unit aktivitas dengan NaCl (b)unit aktivitas tanpa NaCl
Dari gambar 46 terlihat bahwa penambahan NaCl meningkatkan unit
aktivitas protease halofil Penambahan NaCl akan menstabilkan konformasi
protease dengan menetralkan muatan-muatan yang terjadi karena perubahan pH
lingkungan Adanya perubahan pH lingkungan akan mempengaruhi gugus-gugus
terutama pada rantai samping asam – asam amino penyusun protease Pada kondisi
pH optimum (pH = 8) suasana sedikit basa, maka gugus asam karboksilat
(COOH) yang ada pada rantai samping asam amino penyusun protease akan
melepaskan H+ menjadi COO-, karena gugus OH dari lingkungan (gambar 47)
Demikian pula gugus NH2 dari rantai samping asam amino akan menarik H+ dari
lingkungan membentuk gugus NH3+ Gugus COO- lebih banyak daripada gugus
NH3+ karena jumlah OH- lebih banyak daripada H+ Pada penambahan NaCl, ion
Na+ akan menetralkan muatan negatif (COO-), gaya tolak menolak antar muatan
negatif (COO-) yang berdekatan berkurang sehingga konformasi protease menjadi
lebih stabil
Pada kondisi di atas pH optimum suasana lingkungan menjadi lebih basa,
gugus asam karboksilat (COOH) yang ada pada rantai samping asam amino
penyusun protease akan melepaskan H+ karena ditarik oleh gugus OH- dari
lingkungan, sehingga menjadi gugus COO- Penambahan NaCl akan menetralkan
muatan negatif (COO-) pada asam amino, gaya tolak menolak antar muatan
negatif dari asam amino yang berdekatan berkurang sehingga konformasi
protease menjadi lebih stabil pada saat terjadi perubahan pH lingkungan menjadi
lebih basa
Ilustrasi muatan permukaan protease halofil dengan penambahan NaCl
pada pH optimum, asam dan basa disajikan dalam gambar 47

Asam

Optimum

Basa

(A)

Asam

Optimum
Basa

(B)

Gambar 4.7 Ilustrasi muatan permukaan protease pada berbagai pH


(A)tanpa penambahan garam (B)dengan panambahan garam

Aktivitas relatif merupakan besarnya perubahan aktivitas protease dengan


penambahan NaCl 0,125 M relatif terhadap aktivitas protease tanpa penambahan
garam Gambar 48 menunjukan aktivitas relatif protease halofil pada pH dibawah
kondisi optimum lebih besar (± 180%) daripada aktivitas relatif protease halofil
pada pH diatas kondisi optimum (± 110%)

Gambar 4.8 Grafik aktivitas relatif protease halofil dengan penambahan NaCl

Aktivitas relatif pada penambahan NaCl 0,125 M diatas pH optimum


lebih kecil dibandingkan aktivitas relatif pada pH dibawah pH optimum Hal ini
disebabkan suasana yang lebih basa, Na+ dalam menetralkan COO- terganggu
Kelebihan OH- dari lingkungan membuat Na+ cenderung berikatan dengan OH-
membentuk NaOH
Penambahan NaCl selain berperan dalam menetralkan muatan-muatan
negatif protease juga berperan dalam memberikan efek shielding Efek shielding
merupakan kemampuan garam untuk melindungi enzim dari pengaruh luar,
misalnya perubahan pH, perubahan temperature Keberadaan NaCl yang meruah
akan melingkupi permukaan protease Illustrasi permukaan protease dengan
adanya efek shielding disajikan pada gambar 48
(a) (b)

Gambar 4.9 Ilustrasi permukaan protease dengan efek shielding


(a) Tanpa efek shielding (b)Dengan efek shielding

Ikatan protease dengan garam lebih kuat sehingga tidak mudah untuk
menangkap H+ dan OH- dari lingkungan karena perubahan pH H+ dan OH-
lingkungan tidak langsung berinteraksi dengan enzim karena enzim dilingkupi
oleh kation (Na+ ) sehingga proses protonasi tidak seekstrim pada protease tanpa
efek shielding
Pada penelitian ini dilakukan uji aktivitas papain dengan penambahan
NaCl 0,125M pada berbagai pH Hal ini bertujuan untuk menentukan pengaruh
penambahan NaCl terhadap aktivitas protease non halofil. Hasil penelitian
menunjukan aktivitas papain menurun karena penambahan NaCl 0,125M
Besarnya aktivitas relatif papain disajikan pada gambar 49

Aktivitas
relatif (%)

pH

Gambar 4.10 Aktivitas relatif protease halofil dan papain dengan penambahan
NaCl (a)Protease halofil (b) papain

Gambar 4.9 menunjukan aktivitas relatif papain di bawah 100%


sedangkan aktivitas relatif protease halofil berada diatas 100% Hal ini
menunjukan penambahan NaCl 0,125M pada papain menyebabkan aktivitasnya
menurun sedangkan pada protease halofil aktivitasnya mengalami peningkatan.
Hal ini membuktikan ketahanan protease halofil terhadap kadar garam lebih tinggi
daripada protease non halofil (papain)
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan
Dari hasil penelitian yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan sebagai
berikut:
1. Telah diperoleh protease dari bakteri halofilik isolat bittern tambak garam
Madura Aktivitas tertinggi pada kondisi optimum diperoleh pada F1 (0-20
%) yaitu 220,83 unit/ mg protein
2. pH optimum protease halofil yang diperoleh adalah pH 8
3. Penambahan NaCl pada uji aktivitas protease halofil yang telah diperoleh
dapat meningkatkan aktivitas protease halofil
5.2 Saran
Pada penelitian selanjutnya perlu dilakukan penentuan pengaruh penambahan
garam yang lain pada berbagai pH untuk mengetahui pengaruh penambahan
garam tersebut dalam uji aktivitas protease halofil
DAFTAR PUSTAKA

Atlas, R M, and Richard, B, 1993, “Microbial Ecology: Fundamental and


Application”, 3ed ed, The Benjamin Cummings Publishing Company Inc,
Californi, page 423
Beveridge, T J, 1999, “Structure of Gram-Negative Cell Wall and Their Derived
Membrane Vesicles”, J Bacteriol, page 181, 4725-4733
Brock, T D, 1979, “Biology of Microorganisms”, 3rd ed, Prenctice-Hal Inc, New
Jersey
Bugg, T D H, 2004, “Introduction to enzyme and coenzyme chemistry”,2th edition,
Blackwell Publishing Ltd, Oxford, UK
Carman, D R, 2001, “Bacterial Characteristics: Introduction to Bacteriology”,
Micro, page 6, 11-23
Collowick, S P, and Kaplan, N O, 1999, “Methods in Enzymology”, Academic
Press Inc, New York, page 51-58, 87
Dassarma, S dan Arora, P, 2001, “Halophiles”, Encyclopedia of life sciences
Dennison, C, 2002, “A guide to protein isolation”, Kluwer academic publisher,
page 50-104
Dodia M S, Joshi, RH, patel, RK and Singh, SP, 2006,”Characterization and
Stability of Extracelluler Alkaline Proteases from Halophlilic and
Alkaliphilic Bacteria Isolated from Saline Habitat of Coastral Gujarat
India”, Brazilian Journal of Microbiology Vol 37: 276-282