Anda di halaman 1dari 29

BLUE TONGUE

Teknik Diagnostik

Identifikasi BTV Agen


o Kultur in vitro dan in vivo
Prosedur diagnostik yang sama digunakan untuk ruminansia domestik dan
ruminansia liar. Sejumlah sistem isolasi virus untuk BTV sudah umum digunakan, namun
metode yang paling sensitif adalah inokulasi telur ayam embrio (ECE). Inokulasi primer
kultur sel seperti garis sel KC (garis sel yang berasal dari nyamuk/parasit C. variipennis),
telah terbukti sangat sensitif (McHolland & Mecham, 2003). Inokulasi domba juga bisa
menjadi pendekatan yang berguna jika titer virus dalam sampel sangat rendah, seperti
yang mungkin terjadi beberapa minggu setelah infeksi virus, atau bila fasilitas
laboratorium tidak tersedia. Upaya untuk mengisolasi virus dalam sel kultur in vitro
mungkin lebih mudah, namun tingkat keberhasilannya seringkali jauh lebih rendah
daripada yang dicapai dengan sistem in-vivo (Gard et al., 1988). Spesimen untuk isolasi
virus meliputi darah yang tidak mengalami penggumpalan/koagulasi dari hewan viremik
yang dicurigai, bekuan darah setelah pemisahan serum, limpa atau kelenjar getah bening
yang dikumpulkan pada necropsi kasus klinis, atau parasit.
o Isolasi Embrio Ayam
i) Darah dikumpulkan/diambil/dikoleksi dari hewan yang dicurigai mengalami
viraemik dan kemudian darah tersebut ditampung pada tabung antikoagulan seperti
EDTA (ethylamine diamine tetra-acetic acid), heparin atau sodium citrate, dan sel darah
dicuci tiga kali dengan larutan buffered saltine saline (PBS) steril. Sel dicuci diganti
kembali di PBS atau natrium klorida isotonik dan disimpan pada suhu 4 ° C atau
digunakan segera untuk isolasi virus percobaan. Tissue/jaringan dan suspensi
midge/parasit/nyamuk juga bisa disiapkan dan disimpan seperti yang dijelaskan di atas
atau segera digunakan.
ii) Untuk penyimpanan jangka panjang dimana pendinginan tidak memungkinkan
sampel darah dikumpulkan dalam oksalat-fenol-gliserin. Jika sampel dapat dibekukan,
harus dikumpulkan dalam pepton laktosa buffer atau 10% dimetil sulfoksida dan
disimpan pada suhu -70 ° C atau lebih dingin. Virus ini tidak stabil pada suhu -20 °
C.BTV tetap bertahan selama beberapa bulan di seluruh darah dalam antikoagulan yang
disimpan pada suhu 4 ° C.
iii) Dalam kasus fatal, limpa dan kelenjar getah bening adalah organ pilihan untuk
usaha isolasi virus. Organ dan jaringan harus disimpan dan diangkut pada suhu 4 ° C ke
laboratorium dimana mereka dihomogenisasi di PBS atau larutan garam isotonik (1/10),
disentrifugasi pada 1500 rpm selama 10 menit, dan disaring (0,2-0,4 μm). Penangguhan
jaringan dapat digunakan seperti yang dijelaskan di bawah ini untuk sel darah.
iv) Sel darah yang dicuci diganti kembali dengan air suling atau disonikasi dalam
jumlah PBS dan 0,1 ml yang diinokulasi intravaskular ke 5-12 ECE yang berumur 9-12
hari. Prosedur ini membutuhkan latihan. Rincian disediakan oleh Clavijo et al. (2000).
v) Telur diinkubasi di ruang lembab pada suhu 32-33,5 ° C dan dituang setiap
hari. Setiap embrio kematian dalam 24 jam pertama setelah inokulasi dianggap tidak
spesifik.
vi) Embrio yang mati antara hari ke 2 dan 7 dipertahankan pada suhu 4 ° C dan
embrio yang tersisa hidup pada 7 hari terbunuh. Embrio yang terinfeksi mungkin
memiliki penampilan hemoragik. Embrio mati dan yang hidup sampai 7 hari
dihomogenisasi sebagai dua kolam yang terpisah. Seluruh embrio, setelah pengangkatan
kepala mereka, atau organ gabungan seperti hati, jantung, limpa, paru-paru dan ginjal,
dihomogenisasi dan puing-puing dihilangkan dengan sentrifugasi.
vii) Virus dalam supernatan dapat diidentifikasi secara langsung seperti yang
dijelaskan pada Bagian 1.2 di bawah atau setelah amplifikasi lebih lanjut dalam kultur
sel, seperti yang dijelaskan pada Bagian 1.1.2.
o Isolasi pada kultur sel
Isolasi virus dapat dicoba pada kultur sel BTV yang rentan seperti tikus L,
ginjal hamster bayi (BHK-21), ginjal monyet hijau Afrika (Vero) atau klon Aedes
albopictus C6 / 36 (AA). Efisiensi isolasi seringkali jauh lebih rendah setelah inokulasi
sel kultur dengan sampel diagnostik dibandingkan dengan yang dicapai pada ECE.
Tingkat pemulihan tertinggi dicapai dengan isolasi virus primer di ECE diikuti oleh sel
AAcells atau mamalia untuk replikasi virus lebih lanjut. Isolasi virus yang berhasil juga
telah dilaporkan menggunakan isolasi primer pada sel yang berasal dari Culicoides
sonorensis yang bebas dari virus BTV dan Culicoides dan ditunjuk sebagai sel KC atau
CuVa (McHolland & Mecham, 2003; Wechsler et al., 1989). Jika terjadi sel AA, KC atau
CuVa, bagian tambahan pada garis sel mamalia seperti BHK-21 atau Vero biasanya
dilakukan. Efek sitopatik (CPE) tidak harus diamati pada sel AA KCor CuVa namun
muncul dalam sel mamalia. Monolayer sel dipantau untuk penampilan CPE selama 5 hari
pada suhu 37 ° C dalam 5% CO2 dengan kelembaban. Jika tidak ada CPE yang muncul,
bagian kedua dibuat dalam budaya sel mamalia. BTV terisolasi dapat dideteksi setelah
setiap jalur kultur ECE atau sel dengan teknik deteksi antigen atau polymerase chain
reaction (PCR).
o Isolasi dari kambing
Prosedur untuk isolasi BTV ini tidak digunakan secara rutin, namun
berguna bila fasilitas laboratorium tidak tersedia atau bila ada persyaratan untuk
menyebarkan virus tanpa menggunakan sistem isolasi in-vitro.
i) Domba diinokulasi dengan sel dicuci dari 10 ml sampai 500 ml darah, atau suspensi
jaringan 10-50 ml. Inokulum diberikan secara subkutan dalam 10-20 ml aliquot. Volume
besar dapat membantu usaha isolasi virus dan harus diberikan secara intravena.
ii) Domba ditahan selama 28 hari dan diperiksa setiap hari untuk pyrexia dan mingguan
untuk tanggapan antibodi dengan menggunakan tes serologis seperti C-ELISA seperti
yang dijelaskan di bawah ini. Darah domba yang dikumpulkan pada 7-14 hari setelah
inokulasi biasanya mengandung virus yang terisolasi, yang dapat disimpan dengan baik
pada suhu 4 ° C atau -70 ° C dan terdeteksi dan dicirikan dengan menggunakan metode
yang dijelaskan pada Bagian B.1.2 dan B.1.3 di bawa.
o Deteksi Virus dan karakteristiknya
Keberhasilan teknik isolasi virus dinilai dengan menguji keberadaan BTV dalam
supernatan kultur sel, jaringan embrio atau darah hewan yang diinokulasi dengan
menggunakan sejumlah sistem deteksi. Sebelum munculnya teknik PCR teknik
imunodeteksi digunakan. Saat ini pengujian media isolasi oleh PCR real-time adalah
metode penyaringan yang disukai. Oleh karena itu, virus dalam supernatan dapat
diidentifikasi secara langsung oleh C-ELISA, PCR reverse-transkripsi (RT-PCR) atau
RT-PCR real-time, seperti yang dijelaskan pada Bagian B.1.3 di bawah ini.
Deteksi dan karakterisasi biasanya merupakan proses langkah-bijak, dengan tes khusus
serogroup yang digunakan pada awalnya untuk mendeteksi adanya BTV. Identifikasi
genotipe dan serotipe isolat BTV selanjutnya memberikan informasi epidemiologi yang
berharga dan sangat penting untuk pelaksanaan vaksin atau pengembangan vaksin. Uji
RT-PCR yang menggunakan primer spesifik serotipe akan memberikan informasi yang
paling cepat dan spesifik mengenai serotipe isolat (Johnson et al., 2000; Maan et al.,
2012; Mertens et al., 2007).
Genotip untuk epidemiologi molekuler dapat didasarkan pada tes RT-PCR dan urutan
amplikon. Laboratorium yang berbeda telah distandarisasi pada beberapa urutan gen yang
berbeda untuk tujuan ini. Bila tersedia, sekuens genom lengkap juga dapat dilakukan
untuk memberikan serotipe, serta informasi keteraturan unik dari isolat lainnya.
Prosedur netralisasi menggunakan antisera serotipe perorangan juga dapat digunakan
untuk serotipe, walaupun beberapa serotipe saling bertentangan dan interpretasinya bisa
menjadi sulit. Untuk laboratorium tanpa kemampuan serotipe, isolat BTV dapat
diserahkan ke beberapa Laboratorium Referensi OIE BT untuk serotipe isolat.
o Serogrup imunologikal grup
Isolasi Orbivirus biasanya disortir berdasarkan reaktivitasnya dengan
antisera standar spesifik yang mendeteksi protein, seperti VP7, yang dilestarikan dalam
masing-masing serogroup. Interaktivitas silang antara anggota serogrup BT dan EHD
meningkatkan kemungkinan bahwa isolat EHDV dapat salah untuk BTV berdasarkan
reaksi imunofluoresensi lemah dengan antiserum anti-BTV poliklonal. Antibodi
poliklonal dan monoklonal yang digunakan untuk isolat BTV serogrouping harus
dicirikan sesuai untuk tujuannya. Ada variasi VP7 yang signifikan dalam BTV, serta
keterkaitan antigenik antara orbivirus lain yang terkait erat, seperti EHDV, yang akan
mempengaruhi antibodi yang mengikat berbagai format uji (IFA, ELISA, AGID). Untuk
alasan ini, MAl serogroup khusus dapat digunakan. Sejumlah laboratorium telah
menghasilkan reagen spesifik serogroup semacam itu. Metode yang umum digunakan
untuk identifikasi virus ke tingkat serogroup adalah sebagai berikut.

i) Imunofluoresensi
Monolayer BHK atau sel Vero pada slide ruang (penutup kaca) terinfeksi
dengan virus atau virus yang diadaptasi dengan kultur jaringan pada lisat ECE. Setelah
24-48 jam pada suhu 37 ° C, atau setelah munculnya CPE ringan, sel yang terinfeksi
diperbaiki dengan agen seperti paraformaldehida, aseton atau metanol, antigen kering dan
virus yang terdeteksi menggunakan antiserum anti BTL atau BTV spesifik MAbs dan
standar prosedur imunofluoresen.
ii) Antigen menangkap enzyme-linked immunosorbent assay
Antigen virus dalam panen medium ECE dan kultur, serangga yang
terinfeksi dan darah domba dapat dideteksi secara langsung. Dalam teknik ini, protein
yang diturunkan dari virus ditangkap oleh antibodi yang diserap ke piring ELISA dan
bahan terikat yang terdeteksi menggunakan antibodi kedua. Antibodi penangkapan bisa
bersifat poliklonal atau MAb spesifik serogroup. Pemberian MAg dan antibodi polikonal
Serogroup khusus yang diangkat ke partikel inti yang dinyatakan baculovirus telah
berhasil digunakan untuk mendeteksi virus yang tertangkap.
o Serotipe Virus netralisasi
Tes penetralisir adalah tipe spesifik untuk serotipe BTV yang saat ini
diketahui yang telah diisolasi dalam budaya dan dapat digunakan untuk serotipe isolat
virus atau dapat dimodifikasi untuk menentukan spesifisitas antibodi dalam serum.
Dalam kasus isolat untyped, karakteristik lokalisasi serotipe BTV umumnya dapat
meniadakan kebutuhan untuk mencoba netralisasi oleh antisera pada semua serotipe
terisolasi, terutama bila serotipe endemik terkenal.
Ada berbagai metode berbasis kultur jaringan yang tersedia untuk
mendeteksi adanya antibodi anti-BTV yang menetralisir. Sel yang biasa digunakan
adalah BHK, Vero dan L929. Tiga metode untuk serotipe BTV diuraikan secara singkat
di bawah ini. Ada juga tes penghambatan fluoresensi, tidak dijelaskan. Antisera spesifik
serotipe BTV yang dihasilkan pada kelinci percobaan atau kelinci dilaporkan memiliki
lebih sedikit reaktivitas silang serotipe daripada yang dibuat pada sapi atau domba.
Adalah penting bahwa kontrol antiserum disertakan.
i) Penurunan plak
Virus yang menjadi serotyped diencerkan untuk menampung sekitar 100
unit pembentuk plak (PFU), dan diinkubasi tanpa antiserum (kontrol virus) atau dengan
pengenceran serial antisera standar individu ke panel serotipe BTV. Campuran virus /
antiserum ditambahkan ke monolayer sel. Setelah adsorpsi dan pengangkatan inokulum,
monolayer dilapis dengan agarose. Titer antibodi penetralisir ditentukan sebagai timbal
balik pengenceran serum yang menyebabkan pengurangan tetap (misalnya 90%) dalam
jumlah PFU. Virus yang tidak dikenal dianggap serologis identik dengan serotipe standar
jika yang terakhir dijalankan secara paralel dengan virus yang tidak terinfeksi, dan juga
dinetralisir.
ii) Penghambat plak
Pengujian dilakukan pada piring petri berdiameter 90 mm yang
mengandung monolay sel sadar yang terinfeksi dengan standar 5x 104 PFU atau virus
tanpa tip. Setelah adsorpsi dan pengangkatan inokulum, monolayer dilapis dengan
agarose. Antisera anti-BTV standar ditambahkan ke cakram kertas saring masing-masing
dan ditempatkan pada permukaan agarose. Piring diinkubasi minimal selama 4 hari. Zona
netralisasi virus, dengan kelangsungan hidup sel monolayer, akan mengelilingi cakram
yang berisi antiserum homolog.
iii) netralisasi mikrotit
Sekitar 100 TCID50 (50% dosis infark kultur jaringan) dari virus standar
atau untyped ditambahkan dalam volume 50 μl untuk menguji sumur lempeng microtitre
rata-rata dan dicampur dengan volume antiserum standar yang sama yang diencerkan
secara merata dalam media kultur jaringan. Sekitar 104 sel ditambahkan per sumur dalam
volume 100 μl, dan setelah inkubasi selama 4-6 hari, tes ini dibaca menggunakan
mikroskop terbalik. Wells dinilai untuk tingkat CPE yang diamati. Sumur yang hanya
mengandung sel atau sel dan antiserum, seharusnya tidak menunjukkan CPE. Sebaliknya,
sumur yang mengandung sel dan virus harus menunjukkan CPE 75-100%. Virus yang
tidak teridentifikasi dianggap serologis identik dengan serotipe BTV standar jika
keduanya dinetralkan dalam pengujian sampai tingkat yang sama.

o Metode molecular- deteksi asam nukleat


Teknik RT-PCR memberikan identifikasi cepat asam nukleat virus BT pada darah dan
jaringan hewan yang terinfeksi lainnya. Yang penting, diagnostik berbasis RT-PCR harus
diinterpretasikan dengan hati-hati karena prosedur RT-PCR akan mendeteksi asam
nukleat spesifik virus setelah virus tidak lagi layak dan mampu membangun infeksi baru
baik pada serangga maupun host mamalia. Oleh karena itu hasil RT PCR yang positif,
tidak selalu mengindikasikan adanya virus menular (MacLachlan et al., 1994).
Beberapa format RT-PCR tersedia yang dapat digunakan untuk mendeteksi BTV secara
khusus untuk "serogrup" Orbivirus dan ke "serotype" BTV. Pendekatan molekuler ini
jauh lebih cepat daripada pendekatan virologi dan imunologi tradisional, yang mungkin
memerlukan waktu hingga 4 minggu untuk menghasilkan informasi mengenai serogroup
dan serotipe.
Urutan asam nukleat gen BTV serumpun mungkin berbeda dengan daerah geografis
isolasi virus (Gould, 1987). Ini memberikan kesempatan unik untuk melengkapi studi
epidemiologi BTV dengan memberikan informasi tentang potensi asal geografis isolat
virus, sebuah proses yang disebut genotip atau topotip. Meskipun tampaknya
kemungkinan sekuensing isolat BTV dari berbagai belahan dunia dapat mengizinkan
diskriminasi asal geografis yang lebih ketat, hubungan antara urutan dan asal geografis
mungkin tidak langsung. Informasi sekuensing ini penting dan semua data tentang urutan
segmen BTV harus tersedia secara luas dengan mengirimkan data ke situs web yang
diakui secara resmi (misalnya http://oiebtnet.izs.it).
Situs web memberikan analisis pohon filogenetik isolat BTV berdasarkan urutan segmen
RNA. Data yang dikompilasi ini akan menyediakan sumber untuk studi epidemiologi,
identifikasi isolat baru dan desain primer baru untuk RT-PCR lebih lanjut dan
kemungkinan tes spesifik serotipe untuk BTV.
Kapasitas tes RT-PCR untuk mendeteksi sejumlah kecil molekul asam nukleat berarti
bahwa tes semacam itu sangat sensitif terhadap kontaminasi oleh asam nukleat asing.
Yang terakhir ini mungkin termasuk primer yang digunakan di laboratorium atau
polinukleotida yang diperkuat sebelumnya. Oleh karena itu penting untuk memiliki area
"bersih" yang berisi semua peralatan yang diperlukan untuk reagen dan persiapan uji dan
area terpisah dengan peralatannya sendiri untuk amplifikasi. Sarung tangan tahan harus
dipakai dan sering diganti pada semua tahap prosedur, terutama setelah bekerja dengan
sampel RNA atau DNA yang diperkuat. Ini akan membantu melindungi reagen dan
sampel dari kontaminasi oleh RNase di mana-mana dan agen lainnya dan dari
kontaminasi silang oleh DNA. Kemungkinan positif palsu, karena kontaminasi sampel,
menyoroti pentingnya urutan produk RT-PCR untuk menentukan, misalnya, jika urutan
yang diperkuat identik atau berbeda dari kontrol positif. Negatif palsu, misalnya karena
kualitas sampel yang buruk atau primer yang tidak tepat, dapat diidentifikasi setelah
kegagalan untuk memperkuat BTV dan gen inang, seperti globin, dari ekstrak sel yang
terinfeksi. Hal ini dibahas secara lebih rinci dalam Bab 1.1.6 Prinsip dan metode validasi
uji diagnostik untuk penyakit menular.
Ada banyak tes RT-PCR yang saat ini digunakan yang menggunakan metode ekstraksi
yang berbeda, reverse transcriptase, enzim amplifikasi, primer dan kondisi. Teknologi
berubah dengan cepat. Juga keragaman genetik gen BTV membuat pilihan dan validasi
uji RT-PCR bergantung pada penerapannya dalam lingkungan regional. Ini juga berlaku
untuk PCR real-time, yang akan dikembangkan untuk digunakan dalam diagnosis
molekuler rutin BTV di masa depan. Oleh karena itu prosedur yang tercantum di bawah
ini adalah contoh saja. Semakin penting untuk mempertahankan pengujian diagnostik
dengan akreditasi dengan standar internasional seperti ISO / ISEC 17025 dan
berpartisipasi dalam pengujian profisiensi. Sistem untuk menawarkan uji profisiensi
untuk tes RT-PCR sedang dikembangkan di sejumlah negara.
Dua tes BTV RT-PCR disajikan di sini: uji real-time (Hofmann et al., 2008), yang
menargetkan genom NS3; dan uji nested konvensional yang menargetkan genom NS1,
menggunakan primer yang dirancang oleh Katz et al. (1993). Uji coba nested telah
berhasil digunakan selama lebih dari 20 tahun dan mampu mendeteksi serotipe 1-24 dan
26 (serotipe 25 tidak diuji) dari beberapa spesies. Pengujian bersarang mungkin
bermanfaat bagi laboratorium tanpa kapasitas untuk melakukan PCR real-time. Uji RT-
PCR real-time yang disajikan di bawah ini telah diuji di beberapa laboratorium di seluruh
dunia dan telah ditemukan mampu mendeteksi semua serotipe BTV, dan sama atau
melampaui sensitivitas uji nested sambil memberikan deteksi BTV yang cepat dan
kuantitatif tanpa risiko kontaminasi yang terkait dengan tes PCR bersarang.
o Metode RT-PCR Real time
Metode RT-PCR real-time memberikan deteksi BTV yang sensitif dan
cepat dalam prosedur satu langkah. Keuntungan metode real-time melalui
metode PCR tradisional meliputi kecepatan pengujian, kuantisasi virus
yang ada, dan berkurangnya kesempatan untuk kontaminasi terjadi karena
tidak ada penanganan pasca amplifikasi seperti elektroforesis gel yang
dibutuhkan. Tes RT-PCR real-time adalah tes pilihan untuk diagnosis.
Metode yang disajikan di sini adalah adaptasi dari Hofmann et al. (2008)
dan mampu mendeteksi semua serotipe BTV dan strain yang diketahui
saat ini beredar. Uji coba tersebut menargetkan segmen BTV 10 (NS3).
Prosedur yang diberikan mungkin memerlukan modifikasi untuk
mengakomodasi laboratorium individual atau persyaratan kit RT-PCR
yang berbeda.
i) ekstraksi RNA dari darah, sampel jaringan, dan pengusir hama
Kit komersial tersedia secara luas; Langkah ekstraksi RNA dapat
dilakukan sesuai dengan prosedur yang ditentukan di setiap kit.
ii) Real-time reverse-transcription polymerase chain reaction
Kit PCR real-time satu langkah tersedia secara komersial. Berikut adalah
beberapa langkah dasar seperti yang dijelaskan oleh Hofmann et al.
(2008), yang dapat dimodifikasi tergantung pada persyaratan lokal / kasus
khusus, kit yang digunakan dan peralatan yang tersedia.
Urutan primer dan probe untuk deteksi virus spesies BTV:
BTV_IVI_F 5 "-TGG-AYA-AAG-CRA-TGT-CAA-A-3"
BTV_IVI_R 5 "-ACR-TCA-TCA-CGA-AAC-GCT-TC-3"
BTV_IVI_P 5 "FAM-ARG-CTG-CAT-TCG-CAT-CGT-ACG-C-3"
BHQ1
a) Larutan stok primer diencerkan dengan konsentrasi kerja 20 pmol / μl,
sedangkan probe diencerkan dengan konsentrasi kerja 5 pmol / μl.
b) Tata letak pelat uji harus dirancang dan dimasukkan ke perangkat lunak
PCR real-time. Dengan menggunakan tata letak sebagai panduan, 0,5 μl
masing-masing stok kerja primer (20 pmol / μl) ditambahkan ke masing-
masing sumur yang akan terus mengandung sampel RNA, kontrol positif
atau negatif. Pelat itu dipegang di atas es.
Catatan: Plat PCR bisa diganti dengan tabung atau strip yang sesuai.
c) 2 μl sampel RNA, termasuk pengujian dan kontrol positif dan negatif,
ditambahkan ke sumur yang sesuai dari piring yang mengikuti tata letak
(catatan: sumur ini sudah mengandung primer dari langkah b).
d) Denaturasi panas: 95 ° C selama 5 menit, tahan es selama 3 menit lagi.
e) Volume master-master master real-time yang sesuai untuk jumlah
sampel yang akan diuji disiapkan, mengikuti petunjuk dari pabriknya.
Probe harus dimasukkan dalam campuran master untuk memberikan
konsentrasi akhir 0,2 pmol / μl per sampel.
f) 22 μl campuran induk didistribusikan di masing-masing sumur pada
lempeng PCR yang berisi primer dan RNA terdenaturasi.
h) Pelat ditempatkan dalam siklus siklon real-time yang diprogram untuk
deteksi reverse transkripsi dan cDNA amplifikasi / pendeteksian
fluoresensi seperti yang disarankan oleh produsen. Profil termal berikut
adalah sebuah contoh:

48°C ×30 minutes


95°C ×2 minutes
50 cycles : 95°C ×15 seconds
56°C ×30 seconds
72°C ×30 seconds

o RT-PCR – Nested PCR


Pilih RT-PCR (reverse-transcription dan first stage amplification) dan PCR (nested
amplification) kit pilihan untuk melakukan uji nested. Pengujian yang disajikan di bawah
untuk ilustrasi menggunakan parameter yang terkait dengan kit tertentu. Sesuaikan
parameter PCR sesuai rekomendasi pabrik pembuat kit khusus yang akan digunakan.
Uji coba bersarang menggunakan penggunaan primer berikut ini:
Amplifikasi tahap pertama (luar) (encer sampai 25 pmol / μl; konsentrasi akhir pada PCR
masing-masing adalah 0,6 μM):
FW: GTT-CTC-TAG-TTG-GCA-ACC-ACC
RV: AGG-CCA-GAC-TGT TTC-CCG-AT
Amplifikasi bersarang (encer sampai 25 pmol / μl; konsentrasi akhir pada PCR masing-
masing 0,5 μM):
nFW: GCA-GCA-TTT-TGA-GAG-AGC-GA
nRV: CCC-GAT-CAT-ACA-TTG-CTT-CCT

i) Siapkan campuran amplifikasi tahap pertama (kit RT-PCR satu langkah) dari reagen
berikut (per sampel):
Air bebas nuklease 11,8 μl
5x satu langkah RT-PCR buffer 5.0 μl
Campuran dNTP 1,0 μl
Enzim 1,0 μl
Primer FW (25 pmol / μl) 0,6 μl
Primer RV (25 pmol / μl) 0,6 μl
ii) Keluarkan 20 μl campuran ke dalam setiap tabung PCR yang termasuk dalam uji.
Tambahkan 5 μl sampel atau kontrol RNA didenaturasi (dijelaskan di atas) ke tabung
yang sesuai. Tempatkan tabung di pengendara termal dan jalankan program berikut:
Transkripsi terbalik 50 ° C 30 menit
Aktivasi Taq 95 ° C 15 menit
Diikuti oleh 35 siklus dari:
Denatur: 94 ° C 45 detik
Anneal: 58 ° C 45 detik
Perpanjangan 72 ° C 60 detik (perpanjangan akhir 10 menit)
iii) Siapkan campuran PCR nested (Kit Polymerase DNA HotStarTaq) dari reagen
berikut (per sampel) :
Air bebas nukleat 40,75 μl
10 × buffer HotStar 5.0 μl
Campuran dNTP 1,0 μl
HotStarTaq 0,25 μl
primer nFW (25 pmol / μl) 1,0 μl
primer nRV (25 pmol / μl) 1,0 μl
iv) Keluarkan 49 μl campuran ke dalam setiap tabung PCR. Transfer 1,0 μl DNA yang
diperkuat dari reaksi tahap pertama (langkah 2) ke tabung nested yang sesuai. Ganti
sarung tangan di antara sampel, dan gunakan kehati-hatian saat mentransfer DNA untuk
menghindari kontaminasi silang sampel. Tempatkan tabung di pengendara termal dan
jalankan program berikut:
Aktivasi Taq 95 ° C 15 menit
Dilanjutkan dengan 28 siklus dari:
Denatur: 94 ° C 45 detik
Anneal: 62 ° C 45 detik
Ekstensi: 72 ° C 1 menit (ekstensi akhir 10 menit)
Lakukan elektroforesis gel diikuti dengan visualisasi ultraviolet pada produk PCR nested.
Kontrol positif dan sampel positif akan memiliki 101 base pair band. Kontrol negatif dan
sampel negatif seharusnya tidak memiliki band yang terlihat. Sampel positif mungkin
diurutkan untuk verifikasi.
o Tes Serologis
Antibodi anti-BTV yang dihasilkan pada hewan yang terinfeksi dapat
dideteksi dengan berbagai cara yang bervariasi dalam sensitivitas dan
spesifisitas. Antibodi spesifik serogroup dan spesifik serotipe didapat dan
jika hewan tersebut sebelumnya tidak terpapar BTV, antibodi penetral
yang dihasilkan spesifik untuk serotipe virus yang menginfeksi. Beberapa
infeksi dengan serotipe BTV yang berbeda menyebabkan produksi
antibodi yang mampu menetralisir serotipe yang belum terpapar binatang.
1) Komplemen Fiksasi
Uji fiksasi pelengkap (CFT) untuk mendeteksi antibodi BTV banyak
digunakan sampai tahun 1982, saat digantikan oleh uji AGID
walaupun CFT masih digunakan di beberapa negara.
2) Agar gel imunodifusion
Harus diakui bahwa kelemahan utama AGID yang digunakan untuk
BT adalah kurangnya spesifisitas karena tidak secara eksklusif
membedakan antara antibodi dengan serogrup BT dan EHD sehingga
tidak dapat digunakan secara definitif untuk mendeteksi antibodi
terhadap BTV sebagai reaksi positif. telah menjadi hasil infeksi spesies
Orbivirus lainnya. Namun tes AGID mudah dilakukan dan antigen
yang digunakan dalam pengujian relatif mudah untuk diproduksi.
Sejak 1982, pengujian tersebut merupakan salah satu prosedur
pengujian standar pergerakan internasional ruminansia, namun tidak
lagi dianggap cukup akurat untuk digunakan dalam mendukung
perdagangan internasional. Seruan positif AGID harus diuji ulang
dengan menggunakan uji serogroup khusus BT jika diperlukan
spesifisitas BTV. Uji yang lebih disukai, C-ELISA dijelaskan pada
Bagian B.2.3.
3) Kompetitif ELISA
ELISA kompetitif BT atau pemblokiran dikembangkan untuk
mengukur antibodi spesifik BTV tanpa mendeteksi antibodi yang
bereaksi silang terhadap Orbivirus lainnya (Afshar et al., 1989; Lunt et
al., 1988). Spesifisitasnya adalah hasil penggunaan salah satu dari
sejumlah MA serogroup-reaktif BT. Antibodi ini diturunkan di
sejumlah laboratorium, dan walaupun berbeda, semuanya tampak
berikatan dengan daerah terminal amino protein utama VP7. Pada C-
ELISA, antibodi dalam tes sera bersaing dengan MAbs untuk
mengikat antigen. Prosedur berikut untuk C-ELISA telah
distandarisasi setelah studi banding di sejumlah laboratorium
internasional.

Prosedur :
i) Pelat mikrotiter 96-sumur pertama dilapisi pada suhu 4 ° C
semalam atau pada suhu 37 ° C selama 1 jam dengan 50-100 μl
antigen kultur sel yang berasal dari budaya kultur jaringan atau inti
utamaantigen VP7 diekspresikan baik dalam Baculovirus (Oldfield et
al., 1990) atau ragi (Martyn et al., 1990) dan diencerkan pada buffer
karbonat 0,05 M, pH 9.6.
ii) Pelat dicuci lima kali dengan PBST (0,01 M PBS mengandung
0,05% atau 0,1% Tween 20, pH 7,2).
iii) Selanjutnya, 50 μl serum uji ditambahkan dalam rangkap dua pada
pengenceran tunggal, 1/5 (Afshar et al., 1989) atau 1/10 (Lunt et al.,
1988) pada PBST yang mengandung 3% albumin serum sapi (BSA).
iv) Segera, 50 μl pengenceran MAb yang telah ditentukan sebelumnya
yang diencerkan dalam PBST yang mengandung BSA 3%
ditambahkan ke masing-masing sumur. Sumur kontrol MAb
mengandung buffer pengencer di tempat uji serum.
v) Pelat diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 ° C atau 3 jam pada
suhu 25 ° C, dengan terus menerus mengocok.
vi) Setelah dicuci seperti yang dijelaskan di atas, sumur diisi dengan
100 μl cairan pengikatan IgG anti-tikus berlantai peroksidase
peroksidase peroksidase (H + L) yang sesuai dengan PBST yang
mengandung serum normal bovine 2%.
vii) Setelah inkubasi selama 1 jam pada 37 ° C, larutan konjugasi
dibuang dan piring dicuci lima kali dengan menggunakan PBS atau
PBST. Sumur diisi dengan larutan substrat 100 μl yang mengandung
1.0 mM ABTS (2,2 "-azino-bis- [3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic
acid]), 4 mM H2O2 dalam 50 mM natrium sitrat, pH 4.0, dan
lempengnya adalah terguncang pada suhu 25 ° C selama 30 menit.
(Substrat lainnya dapat digunakan dan reaksi berlanjut dengan gemetar
untuk jangka waktu yang tepat untuk memungkinkan pengembangan
warna.)
viii) Reaksi dihentikan dengan penambahan pereaksi berhenti, seperti
natrium azida.
ix) Setelah mengosongkan pembaca ELISA pada sumur yang
mengandung substrat dan pereaksi berhenti, nilai absorbansi diukur
pada 414 nm. Hasil dinyatakan sebagai persen inhibisi dan diturunkan
dari nilai absorbansi rata-rata untuk setiap sampel dengan rumus
sebagai berikut:
% inhibisi = 100 - [(sampel uji absorban rata - rata) / (kontrol absorber
rata - rata MAb) × 100].
NB: Beberapa laboratorium lebih suka menggunakan serum kontrol
negatif yang sebelumnya telah terbukti memiliki persentase
penghambatan nol sebagai alternatif kontrol MAb.
x) Persentase nilai inhibisi> 50% dianggap positif. Penghambatan
antara 40% dan 50% dianggap mencurigakan. Hasil uji sera duplikat
bisa bervariasi asalkan hasilnya tidak berbohong pada sisi positif
cutoff.
xi) Sera positif kuat dan lemah dan serum negatif harus disertakan
pada masing-masing piring. Yang lemah positif harus memberikan
penghambatan 60-80% dan negatifnya harus memberi penghambatan
kurang dari 40%.
Sejumlah C-ELISA yang diproduksi secara komersial berdasarkan VP-
7 rekombinan dan anti-VP-7 MAb sekarang tersedia. Tes komersial ini
secara rutin digunakan di banyak laboratorium di seluruh dunia dan
telah terbukti sesuai untuk tujuan uji coba cincin (Batten et al., 2008).
Penerimaan formal untuk tujuan perdagangan harus bergantung pada
adopsi perlengkapan individual ke Register OIE.
Perbedaan genetik strain BTV tertentu (misalnya kelompok regional
atau topotipe yang berbeda) dapat mempengaruhi sifat antibodi
serogroup-reaktif. Oleh karena itu, mungkin karakteristik diagnostik
untuk deteksi antibodi tidak seragam untuk semua virus yang tercakup
oleh serogroup. Hal ini harus diperhatikan dalam pertimbangan
kebugaran untuk tujuan.

o Indirect ELISA
ELISA tidak langsung untuk sampel susu dalam jumlah besar telah
terbukti dapat diandalkan dan berguna untuk keperluan surveilans
(Kramps et al., 2008). Ini harus divalidasi untuk serotipe yang relevan
sebelum digunakan.
o Virus Netralisasi serologi
Serologi VN mampu mengidentifikasi antibodi penetralisir spesifik
serotipe dan juga menentukan titernya. Ini adalah tes tambahan yang
penting di daerah endemik dimana banyak serotipe cenderung hadir.
Kemampuannya untuk mengidentifikasi serotipe yang terlibat dalam
wabah sangat penting untuk menerapkan tindakan pengendalian yang tepat
seperti vaksinasi. Hal ini juga berguna untuk surveilans epidemiologi,
studi transmisi dan untuk menentukan tanggapan antibodi yang berguna
terhadap vaksinasi. Antibodi penawar silang dapat berkembang pada
hewan yang pernah mengalami infeksi BTV. Secara khusus, infeksi
dengan serotipe kedua dapat memperluas respons antibodi penetral untuk
memasukkan antibodi ke serotipe yang belum terpapar hewan tersebut.
Penerapan serologi VN seringkali sangat berguna dalam hubungannya
dengan
Penyelidikan virologi lain yang, secara kombinasi, dapat memberikan
dasar yang lebih pasti untuk menyelesaikan distribusi serotipe.
Prosedur Uji
Beberapa metode untuk menentukan titer dan serotipe BTV telah
dijelaskan; Di sini prosedur yang telah distandarisasi setelah studi banding
di sejumlah laboratorium internasional diuraikan secara singkat. Sel yang
biasa digunakan adalah BHK dan Vero. Antisera spesifik serotipe BTV
yang dihasilkan pada kelinci percobaan atau kelinci dilaporkan memiliki
lebih sedikit reaktivitas silang serotipe daripada yang dibuat pada sapi atau
domba. Adalah penting bahwa kontrol antiserum disertakan.
i) 50μl pengenceran sera serial, dari 1/10 sampai 1/1280, ditambahkan ke
masing-masing sumur uji lempeng microtitre rata-rata dan masing-masing
sumur dicampur dengan volume serotipe referensi BT3 standar yang sama
(100-300 TCID50) . Pelat diinkubasi pada suhu 37 ° C dalam 5% CO2.
ii) Setelah 1 jam inkubasi, kira-kira 104 sel Vero atau BHK-21
ditambahkan per sumur dalam volume 100 μl, MEM (medium penting
minimal) yang mengandung antibiotik dan setelah diinkubasi selama 3-5
hari, tesnya sudah dibaca. menggunakan mikroskop terbalik
iii) Sumur dinilai untuk tingkat CPE yang diamati. Sampel dianggap
positif bila menunjukkan lebih dari 75% netralisasi CPE pada pengenceran
terendah (1/10). Titer serum merupakan pengenceran serum tertinggi yang
mampu menetralkan lebih dari 75% CPE dalam kultur jaringan.
NIPAH DAN HENDRA VIRUS

TEKNIK DIAGNOSTIK
Laboratory Biosafety
HeV dan NiV adalah patogen manusia yang berbahaya dengan tingkat kematian yang
tinggi dan tidak ada vaksinasi manusia atau pengobatan antiviral yang efektif (WHO,
2004). Semua manipulasi laboratorium dengan kultur virus hidup (termasuk tes serologis
seperti penetralisir virus (VN) dengan menggunakan virus hidup) atau materi yang
berpotensi terinfeksi / terkontaminasi seperti sampel jaringan dan darah harus dilakukan
pada tingkat biosafety dan penahanan yang sesuai yang ditentukan oleh analisis biorisk
(lihat Bab 1.1.4 Keamanan hayati dan biosekuriti: Standar untuk mengelola risiko
biologis di laboratorium hewan dan fasilitas hewan). Keselamatan pekerja laboratorium
harus diyakinkan oleh strategi pengelolaan risiko biologis yang diadopsi. Laboratorium
dapat menerapkan strategi pengelolaan risiko biologis yang berbeda tergantung pada
apakah mereka menguji sampel dengan PCR atau mencoba untuk menyebarkan agen.
Perbanyakan virus khususnya harus dilakukan dengan kondisi yang ketat dan sesuai yang
akan mencegah infeksi personil yang tidak disengaja di laboratorium. Selama isolasi
virus primer dari spesimen dari kasus yang dicurigai, harus diapresiasi dan tercermin
dalam prosedur bahwa jika efek sitopatik 'paramyxovirus like' (CPE) berkembang pada
kultur yang terinfeksi, tingkat risiko meningkat. Pedoman biosafety yang tepat akan
menekankan praktik laboratorium yang baik, penggunaan kabinet keselamatan kelas II
dengan peralatan pelindung diri yang sesuai atau kabinet kelas III. RT-PCR atau deteksi
imunofluoresen antigen henipavirus pada sel yang dipelihara dengan aseton dapat
digunakan untuk mengidentifikasi isolat sebagai henipavirus. Pengalihan kultur ke
laboratorium spesialis harus mengikuti standar transportasi sebagaimana ditentukan
dalam Bab 1.13 Pengangkutan spesimen asal hewan.
Identifikasi Agen
o Virus Isolasi dan Karakteristik
Isolasi virus sangat memudahkan prosedur identifikasi dan diagnosis definitif
harus dilakukan bila keselamatan operator dapat dijamin. Isolasi sangat relevan
dalam kasus baru atau wabah, terutama di negara-negara atau wilayah geografis
dimana infeksi oleh HeV atau NiV belum pernah didokumentasikan sebelumnya.
Teknik deteksi molekuler yang tidak memerlukan penanganan virus hidup, dapat
digunakan untuk mengidentifikasi adanya genom virus pada sampel. Implikasi
spesies satwa liar sebagai penghambat alami virus memerlukan serologi positif,
PCR atau isolasi virus dari hewan yang ditangkap liar (Daniels et al., 2007).
o pengambilan sampel dan pengajuan spesimen
Kisaran jaringan yang menghasilkan virus dalam kasus alami dan eksperimental
telah dirangkum (Daniels et al., 2000). Pada hewan hidup, penyeka (nasal atau
oro-naso-pharyngeal) dan serum harus selalu diajukan. Urine, otak, paru-paru,
ginjal dan limpa juga berguna, dan dapat dikumpulkan jika diperlukan tindakan
pencegahan keamanan hayati selama pengambilan sampel. Spesimen harus
diangkut pada suhu 4 ° C jika mereka dapat tiba di laboratorium dalam waktu 48
jam; Jika waktu transportasi akan lebih dari 48 jam, sampel harus dikirim beku
pada es kering atau uap nitrogen (≈ -78,5 ° C). Spesimen tidak boleh ditahan pada
suhu -20 ° C.
Spesimen diagnostik harus diserahkan ke laboratorium yang ditunjuk dalam
wadah yang dirancang khusus, sesuai dengan Bab 1.1.3.
o Isolasi dan Kultur Sel
Pertimbangan keamanan hayati sangat penting selama isolasi henipavirus, seperti
yang disebutkan pada Bagian 1 di atas.
Isolasi virus dibantu oleh fakta bahwa HeV dan NiV tumbuh dengan cepat
menjadi titer tinggi di banyak sel berbudaya. Ginjal monyet ginjal hijau Afrika
(Vero) dan sel ginjal kelinci (RK-13) telah ditemukan sangat rentan. HeV juga
bereplikasi dalam menyusui otak tikus dan telur ayam embrio, dan laboratorium
yang menggunakan sistem isolasi ini dalam penyelidikan infeksi yang tidak
terdiagnosis harus menyadari kemungkinan ini.
Di laboratorium yang melakukan isolasi virus, jaringan ditangani dalam kondisi
steril, dan suspensi 10% (b / v) dihasilkan dengan menggiling jaringan dalam
sistem homogenisasi tertutup. Semua proses harus dilakukan dalam kabinet Kelas
III atau kabinet Kelas II dengan perlengkapan pelindung pribadi yang sesuai
untuk operator. Tabung yang digunakan harus memiliki cincin O, dan benang
eksternal. Setelah klarifikasi homogenate dengan sentrifugasi pada rotor dengan
tutup pengaman pada 300 g dan 4 ° C, sebelum supernatan ditambahkan ke
monolayer sel yang konfluen.
CPE biasanya berkembang dalam waktu 3 hari, namun dua bagian 5 hari
direkomendasikan sebelum menilai percobaan tersebut tidak berhasil. Setelah
multiplisitas infeksi yang rendah, CPE ditandai dengan pembentukan sinsiti yang
mungkin, setelah 24-48 jam, mengandung lebih dari 60 atau lebih inti. Syncytia
yang terbentuk oleh NiV dalam monolayer sel Vero secara signifikan lebih besar
daripada yang diciptakan oleh HeV dalam periode waktu yang sama. Meskipun
distribusi nukleus pada sinsitiologi yang diinduksi NiV pada awal infeksi
menyerupai yang disebabkan oleh HeV, dengan inti yang digabungkan di tengah
syncytia, nukleus pada sinsitiologi NiV yang diinduksi dewasa didistribusikan di
sekitar bagian luar sel raksasa.
Metode Identifikasi
i) Imunostaining sel tetap
Kecepatan yang ditiru HeV dan NiV dan tingginya tingkat antigen virus yang dihasilkan
pada sel yang terinfeksi membuat metode pemberian imunofluoresensi untuk
mengidentifikasi dengan cepat keberadaan henipavirus menggunakan antiserum anti-NiV
atau anti-HeV. Reaktivitas silang serologis antara HeV dan NiV berarti antiserum
poliklonal terhadap antisita virus atau mono-spesifik terhadap protein individu dari virus,
akan gagal untuk membedakan antara HeV dan NiV.
Di bawah kondisi laboratorium yang tepat untuk mengelola risiko biologis, monolayer sel
Vero atau RK-13 yang tumbuh pada penutup gelas atau slide dalam ruang terinfeksi virus
yang terisolasi, dan monolayer diperiksa untuk mengetahui adanya syncytia setelah
inkubasi selama 24-48 jam di 37 ° C. Dianjurkan agar pengenceran virus (undiluted,
1/10, 1/100) diuji karena syncytia lebih mudah diamati setelah infeksi pada multiplisitas
rendah. Setelah terdeteksi syncytia terdeteksi, sel yang terinfeksi diperbaiki dengan
perendaman sepenuhnya di dalam bejana yang berisi aseton. Kapal tersebut disegel dan
disterilkan permukaannya sebelum dibuang ke lingkungan laboratorium dimana
seluncuran dimana virus yang sekarang tidak aktif dapat dikeringkan dengan udara.
Antigen virus terdeteksi menggunakan anti-HeV atau anti-NiV antiserum dan prosedur
imunofluoresen standar. Ciri khas dari sinsitia yang disebabkan oleh henipavirus adalah
adanya struktur poligon besar yang mengandung antigen virus yang berpendar.

ii) mikroskop immuno-elektron


Titer tinggi HeV dan NiV dalam sel secara in vitro mengizinkan visualisasi mereka
dalam media kultur dengan mikroskop elektron kontras negatif tanpa tahap konsentrasi
sentrifugal. Deteksi interaksi antibodi-virus dengan mikroskop immunoelectron
memberikan informasi berharga mengenai struktur virus dan reaktivitas antigenik,
bahkan selama isolasi virus primer. Teknik ultrastruktural lainnya, seperti kultur sel grid
(Hanna et al., 2006), di mana sel tumbuh, terinfeksi dan divisualisasikan pada grid
mikroskop elektron, dan identifikasi replikasi virus dan badan inklusi pada bagian tipis
kultur sel tertanam dan tetap Jaringan yang terinfeksi melengkapi upaya diagnostik.
Rincian teknik dan penerapannya pada deteksi dan analisis HeV dan NiV telah dijelaskan
(Hyatt et al., 2001).

Identifikasi Virus : Perbedaan antara Nipah Virus dan Hendra Virus


o Immunostaining Komparatif
Identifikasi lebih lanjut dari isolat henipavirus karena HeV atau NiV didasarkan
pada immunostaining komparatif seperti yang dijelaskan pada bagian ini. Perlu
untuk membandingkan isolat dengan kultur standar dari kedua HeV dan NiV, dan
semua pekerjaan harus dilakukan dengan menggunakan prosedur untuk mengelola
risiko biologis. Virus kontrol dan uji dititrasi pada monolayer sel Vero di piring
96 sumur dan setelah 18-24 jam, fokus infeksi terdeteksi secara imunologis pada
sel tetap aseton menggunakan antiserum anti virus. Titer virus dinyatakan sebagai
unit pembentuk fokus (FFU) / ml.
o Immunofluorescence assay
Isolasi virus yang bereaksi dengan antisera anti-HeV dan / atau anti-NiV dalam
uji imunofluoresensi dianggap serologis identik dengan baik HeV atau NiV jika
menunjukkan kepekaan yang sama terhadap netralisasi oleh antisera anti-HeV dan
anti-NiV seperti yang dilakukan. kontrol positif HeV atau NiV. Antiserum Anti-
HeV netralkan HeV pada pelebaran sekitar empat kali lipat lebih besar daripada
yang menetralkan NiV pada tingkat yang sama. Sebaliknya, anti-NiV antiserum
menetralkan NiV kira-kira empat kali lebih efisien daripada HeV (Chua et al.,
2000).
Versi baru dari uji netralisasi diferensial baru-baru ini telah dijelaskan, yang
menghindari penggunaan virus menular dengan menggunakan biospher ephrin-
B2-terikat (Bossart et al., 2007). Meskipun tes tersebut belum divalidasi secara
formal, tampaknya berpotensi menjadi alat skrining untuk digunakan di
laboratorium tanpa fasilitas yang memadai untuk sepenuhnya mengelola risiko
biologis untuk mengkultivasi HeV dan NiV.
o Mikrotiter Neutralisasi
Prosedur ini tergantung pada ketersediaan anti serum, spesifik untuk HeV dan
NiV, serta virus saham. Stok HeV dan NiV dan henipavirus yang tidak
teridentifikasi diencerkan dan ulangan masing-masing virus yang mengandung
kira-kira 100 TCID50 dalam 50 μl ditambahkan ke sumur uji lempeng microtitre
96 sumur datar. Virus dicampur dengan volume yang sama dari media esensial
minimal Eagle (EMEM) atau rangkaian pengenceran anti-heV atau anti-NiV
antiserum di EMEM. Campuran diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 45 menit dan
sekitar 2,4 × 104 sel ditambahkan ke masing-masing sumur sampai volume akhir
kira-kira 200 μl. Setelah 3 hari pada 37 ° C, tes ini dibaca menggunakan
mikroskop terbalik dan sumur diberi nilai untuk tingkat CPE yang diamati.
Mereka yang hanya mengandung sel atau sel dan antiserum tidak menunjukkan
CPE. Sebaliknya, sumur yang mengandung sel dan virus harus menunjukkan
syncytia dan kerusakan sel. Sumur positif adalah satu di mana semua atau
sebagian sel dalam bentuk monolayer syncytia besar khas infeksi henipavirus.
Metode Molekular-Deteksi asam nukleat
Genom lengkap dari kedua HeV dan NiV telah diurutkan, dan karena lebih banyak isolat
yang datang ke tangan, urutannya telah disimpan di Genbank. Metode berbasis PCR biasa
digunakan untuk mendeteksi virus. Mereka memiliki keunggulan biosafety untuk tidak
menyebarkan virus menular hidup dan mereka telah divalidasi di sejumlah laboratorium.
Mereka juga sangat sensitif dan spesifik.
o Real time RT-PCR
Pendekatan yang sangat sensitif dan berguna untuk mendeteksi genom
henipavirus pada spesimen adalah RT-PCR real-time (lihat Tabel 2). Metode
pengujian dan primer yang digunakan bergantung pada platform teknologi dan
kimia yang terkait yang digunakan di laboratorium individu (Mungall et al., 2006;
Wacharapluesadee & Hemachudha, 2007). Gen HeV M (Smith et al., 2001) dan
gen N (Feldman et al., 2009) Tes TaqMan adalah tes utama untuk diagnosis
penyakit HeV dan juga gen N untuk NiV.

o Konvensional RT-PCR dan Pengurutan Sanger


Dua tes PCR semi-nested konvensional, yang menargetkan gen M dan gen P, juga
dapat digunakan untuk mendeteksi HeV. Kedua tes ini digunakan sebagai tes
pelengkap untuk mengkonfirmasi hasil dari tes TaqMan ketika hasil yang tidak
biasa / atipikal muncul dari tes TaqMan. Mereka juga digunakan untuk
karakterisasi hev yang terdeteksi saat diikuti oleh sekuens Sanger (di-deoxy)
menggunakan primer yang sama (lihat Tabel 3).

o HeV RT-PCR Conditions


i) RT-PCR primer
1 × 48 ° C selama 30 menit, 94 ° C selama 2 menit
40 × 95 ° C selama 30 detik, 53 ° C selama 30 detik, 68 ° C selama 45 detik
1 × 68 ° C selama 7 menit
b) Semi-nested PCR
1 × 95 ° C selama 5 menit
30 × 95 ° C selama 30 detik, 55 ° C selama 30 detik, 72 ° C selama 45 detik
1 × 72 ° C selama 7 menit

o NiV RT-PCR Conditions


i) RT-PCR primer
1 × 48 ° C selama 30 menit
1 × 94 ° C selama 2 menit
40 × 94 ° C selama 30 detik, 52 ° C selama 30 detik, 68 ° C selama 45 detik
1 × 68 ° C selama 7 menit
ii) PCR bersarang
1 × 95 ° C selama 5 menit
30 × 94 ° C selama 30 detik, 52 ° C selama 30 detik, 72 ° C selama 45 detik
1 × 72 ° C selama 7 menit
Berbagai PCR konvensional untuk NiV telah dijelaskan, yang sebagian besar
menargetkan gen N. Untuk lebih jelasnya lihat publikasi berikut -
Wacharapluesadee & Hemachudha (2007). PCR bersarang yang menargetkan gen
L telah dijelaskan oleh Feldman et al., 2009.
Laboratorium yang ingin membuat metode deteksi molekuler harus mengacu pada
protokol yang diterbitkan atau berkonsultasi dengan OIE Reference Laboratory.
Deteksi Henipahvirus antigen pada jaringan-Immunohistochemistry
Imunohistokimia adalah alat ampuh yang memungkinkan visualisasi antigen virus di
dalam struktur sel dan jaringan. Antigen virus nukleoprotein biasanya terletak di dalam
struktur partikulat dengan ukuran dan bentuk variabel di dalam sitoplasma. Karena aspek
morfologis terhadap interpretasi, sinyal warna dapat dievaluasi secara efektif untuk
spesifisitasnya. Pengujian dilakukan pada jaringan fixedin formalin, yang memungkinkan
prosedur dilakukan dengan aman pada kondisi yang tidak mengandung mikrobiologis.
Antigen Henipavirus bereplikasi dalam berbagai jenis sel, termasuk endotelium, otot
polos vaskular, parenkim paru, glomerulus ginjal, sel tubuh neuron, jaringan limfoid dan
jaringan ikat (Hooper et al., 2001; Marsh et al., 2011; Middleton et al. , 2002; Mungall et
al., 2006). Antigen sangat padat pada sinsiti dan makrofag dalam lesi. Oleh karena itu,
jaringan yang sesuai untuk diagnosis infeksi henipavirus meliputi paru-paru, otak,
kelenjar getah bening, limpa dan ginjal. Dengan tidak adanya jaringan ini, ada baiknya
memeriksa jenis jaringan apapun, karena antigen dapat ditemukan pada pembuluh darah
sesekali di seluruh tempat tidur vaskular. Kecuali jika pakaian pelindung penuh dapat
dipakai dan protokol desinfeksi yang sesuai diimplementasikan, lebih aman membuang
hanya potongan-potongan kecil jaringan melalui sampling 'lubang kunci'. Jaringan paru-
paru dan kelenjar getah bening sub-mandibular adalah jaringan yang baik untuk dilepas
dengan cara ini.
Antisera poliklonal kelinci yang diangkat terhadap nukleoprotein henipavirus rekombinan
sangat dapat diandalkan untuk digunakan sebagai antibodi primer untuk imunohistokimia
diagnostik. Deteksi antigen fosfoprotein juga sesuai untuk tujuan diagnostik, walaupun
fosfoprotein cenderung kurang diekspresikan daripada nukleoprotein. Ada berbagai
sistem deteksi sekunder di pasaran yang bisa digunakan. Berikut ini adalah contoh
prosedur imunohistokimia yang menggunakan sistem imunoperoksidase dan AEC
chromagen. Metode lain dapat digunakan, dengan sedikit variasi metode untuk berbagai
enzim dan kromagen.

Prosedur
i) Proseskan jaringan tetap sesuai prosedur histologis rutin ke dalam blok lilin parafin dan
potong bagian pada slide kaca. Potong bagian kontrol positif dan kontrol negatif, jika
sesuai.
ii) Dewaxilah slide dengan cara perendaman dalam tiga bak mandi xilena berturut-turut
selama 3 menit. Bagian hidrat melalui dua perubahan etanol 98-100%, satu perubahan
etanol 70% dan air keran yang mengalir untuk menghilangkan sisa alkohol.
iii) Pengambilan antigen dapat dilakukan melalui pemanasan dalam buffer sitrat (pH 9)
selama 20 menit pada suhu 97 ° C, atau dengan pengolahan proteinase K selama 5 menit.
iv) Pada titik ini dan di antara setiap langkah berturut-turut sampai setelah langkah vii,
cuci slide di buffer TRIS (pH 7.6) beberapa kali.
v) Memblok senyawa endogen pada tahap ini. Ini akan tergantung pada sistem deteksi
yang digunakan, misalnya, jika sistem imunoperoksidase digunakan maka peroksidase
endogen perlu diblokir dengan H2O2 berair 3% selama 10 menit.
vi) Tambahkan antibodi primer pada pengenceran pra-karakteristik selama 45 menit.
vii) Tambahkan konjugat antibodi sekunder. Banyak sistem yang berbeda tersedia: yang
paling sederhana dan paling kuat terdiri dari satu langkah. Konsultasikan panduan produk
pabrikan untuk penggunaan yang benar.
viii) Tambahkan chromagen (misalnya, 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC), atau 3,3
'diamino-benzidine (DAB) selama 10 menit. Rujuklah panduan produk untuk
penggunaan yang benar.
ix) Cuci air suling untuk menghentikan perkembangan warna.
x) Counterstain dalam haematoxylin selama 30 detik sampai 3 menit (tergantung tipe).
xi) Bilas air keran. Tambahkan larutan Scott (0,04 M sodium bicarbonate, 0,3 M
magnesium sulfat), selama 1 menit dan cuci dengan baik dalam menjalankan air keran.
xii) Gunung dengan penutup-slip menggunakan media pemasangan berair.
xiii) Antigen virus dapat divisualisasikan dengan noda coklat / merah, warnanya
tergantung pada chromagen yang digunakan.
Semua metode pengujian di atas harus dianggap sebagai panduan saja; setiap parameter
uji perlu dioptimalkan untuk setiap laboratorium pengujian, karena akan bervariasi sesuai
dengan kondisi laboratorium yang spesifik.
Tes Serologi
Di laboratorium yang melakukan pengujian serologis, terutama dalam situasi wabah,
beberapa strategi telah diterapkan untuk mengurangi risiko paparan petugas laboratorium
terhadap HeV dan NiV. Sera dapat diiradiasi gamma (6 kiloGreys) atau diencerkan 1/5
dalam larutan garam buffer fosfat (PBS) yang mengandung 0,5% Tween 20 dan 0.5%
Triton-X100 dan tidak aktif pada suhu 56 ° C selama 30 menit. Proses yang digunakan
akan didasarkan pada penilaian risiko. Spesimen untuk pengujian dan pengujian
surveilans untuk sertifikasi gerakan hewan dapat dianggap sebagai biohazard yang lebih
rendah daripada investigasi penyakit selama wabah. Dalam beberapa keadaan, inaktivasi
panas dapat diadopsi sebagai tindakan pencegahan yang cukup. Namun ada nilai dalam
memiliki pendekatan standar untuk semua sampel dalam mengelola tes, daripada
mempertahankan beberapa metode pengujian.
Di Australia, pengenalan vaksinasi kuda terhadap virus Hendra telah mempengaruhi
kemungkinan jangkauan pengujian tes yang mendeteksi antibodi terhadap protein G. Tes
ini dapat digunakan untuk mendeteksi tanggapan kekebalan terhadap vaksinasi, dan
mendeteksi antibodi tidak lagi mengindikasikan infeksi sebelumnya pada situasi di mana
vaksin mungkin telah digunakan. Kemungkinan vaksinasi harus diperhitungkan saat
menafsirkan reaksi uji serologis.
o Uji Netralisasi Virus
Uji netralisasi virus (VNT) (Kaku et al., 2009; Tamin et al., 2009) diterima
sebagai standar acuan. Yang paling umum digunakan adalah uji microtitre yang
harus dilakukan pada kondisi pengelolaan risiko biologi yang sesuai. Test sera
diinkubasi dengan HeV atau NiV di sumur 96 mikrogit sebelum lempeng sebelum
penambahan sel Vero. Sera diskrining mulai dari pengenceran 1/2 meskipun hal
ini dapat menyebabkan masalah dengan sitotoksisitas yang diinduksi oleh serum.
Jika kualitas sampel buruk atau volume sampel kecil, seperti halnya flying fox
atau microbat sera, pengenceran awal 1/5 mungkin sesuai. Kultur dibaca pada hari
ke 3, dan sera yang menghambat pengembangan CPE secara keseluruhan
dianggap antibodi positif. Jika sitotoksisitas adalah masalah, pendekatan uji plak
kekebalan pasti akan berguna karena campuran virus / serum dikeluarkan dari
monolayer sel Vero setelah periode adsorpsi, sehingga membatasi efek toksiknya.
Hasil VNT dianggap positif jika neutralisasi virus diamati pada salah satu
pengenceran yang digunakan dalam pengujian. Jika antibodi penetral hadir untuk
kedua hev dan NiV, titer yang lebih tinggi> empat kali lipat dianggap positif dan
jika titer berbeda dengan <empat kali lipat serum dianggap positif untuk
henipavirus yang tidak ditentukan.
ELISA
Antigen Henipavirus yang berasal dari kultur jaringan untuk digunakan dalam enzyme-
linked immunosorbent assay (ELISA) diiradiasi dengan 6 kiloGreys sebelum digunakan,
pengobatan yang memiliki efek yang tidak dapat diabaikan pada titer antigen. Dalam
ELISA tidak langsung yang dikembangkan sebagai respons terhadap wabah awal di
Hendra pada tahun 1994, antigen berasal dari sel-sel yang terinfeksi-HEV yang
mengalami beberapa siklus pembekuan dan pencairan dan pengobatan dengan natrium
dodesil sulfat 0,1% (b / v). Baru-baru ini, penggunaan rekombinan yang dapat
diekspresikan dari protein Hendra G (Bossart et al., 2005) telah diterapkan untuk
perbaikan immunoassay Hendra (McNabb et al., 2014).
Dalam program surveilans babi nasional di Malaysia pada tahun 1999 (Daniels et al.,
2000) format ELISA tidak langsung digunakan dimana antigen diturunkan dengan
perlakuan detergen non-ionik pada sel yang terinfeksi NiV. Selanjutnya, untuk
mengendalikan aktivitas pengikat nonspesifik tingkat tinggi pada beberapa antisera babi,
ELISA yang dimodifikasi dikembangkan berdasarkan reaktivitas relatif sera dengan
antigen NiV dan antigen kontrol yang berasal dari sel Vero yang tidak terinfeksi. Di
Centers for Disease Control (CDC), Atlanta, AS, pendekatannya adalah untuk tidak
hanya memiliki ELISA tidak langsung untuk mendeteksi IgG tetapi juga menggunakan
ELISA untuk mendeteksi IgM. Untuk NiV, ELISA menggunakan antigen nukleokapsid
rekombinan juga telah dijelaskan (Yu et al., 2006), yang juga dikonfigurasikan untuk
mendeteksi IgG atau IgM.
Spesifisitas ELISA NiV tidak langsung (98,4%) (Ong et al., 2000) berarti bahwa dalam
program surveilans tes tersebut akan menghasilkan false positive. Ini mungkin bukan
masalah signifikan dalam menghadapi wabah NiV dimana sebagian besar babi terinfeksi
dan tujuan surveilansnya adalah untuk mendeteksi peternakan yang terinfeksi. Namun,
tingkat spesifisitas uji ini menimbulkan masalah pada spesimen non-wabah atau jika
jumlah sampel yang diuji terbatas. Jika hasil ELISA positif menunjukkan adanya infeksi
yang tidak benar, kegagalan untuk merespons dapat menyebabkan penyebaran virus dan
kematian manusia. Sebaliknya, memulai tindakan pengendalian untuk menanggapi hasil
ELISA positif palsu akan menghabiskan banyak sumber daya (Daniels et al., 2001).
Pendekatan saat ini adalah untuk menguji semua sera reaktif ELISA oleh VNT, dengan
sera bereaksi pada VNT dianggap positif. Konfirmasi VNT harus dilakukan dalam
kondisi dimana risiko bekerja dengan virus hidup dikelola secara memadai dan hal ini
mungkin memerlukan pengiriman sampel ke laboratorium yang diakui secara
internasional dengan prosedur yang telah ditetapkan untuk pekerjaan tersebut.
Prosedur berikut untuk ELISA NiV telah dikembangkan di Australian Animal Health
Laboratory (AAHL) untuk seras babi dan standar setelah studi kolaboratif di Institut
Penelitian Veteriner, Ipoh, Malaysia.
PROSEDUR
Metodologi terperinci untuk produksi dan / atau suplai NiV iradiasi dan antigen sel Vero
yang tidak terinfeksi tersedia di Laboratorium Kesehatan Hewan Australia.
i) Persiapan tes sera
a) Persiapan sampel darah sebelum sentrifugasi harus dilakukan di lemari pengaman
kelas biologi II dengan peralatan pelindung diri yang sesuai atau kabinet kelas III.
b) Uji serum uji 1/5 dalam PBS yang mengandung 0,5% (v / v) Triton X-100 dan 0.5% (v
/ v) Tween 20 di sumur piring mikrotiter 96 sumur. Tutup piring microtitre. Petugas
laboratorium harus mengenakan gaun dan sarung tangan dan menyemprotkan kedua
tangan mereka dan piring mikrotiter yang disegel dengan desinfektan yang sesuai
(misalnya 1% Virkon) sebelum melepaskan pelat mikrotiter dari lemari biosafety sampai
panas pada suhu 56 ° C selama 30 menit.
c) Campurkan 22,5 μl heat-inactivated serum dengan volume yang sama dari antigen sel
Vero yang tidak terinfeksi yang diencerkan 1/100 di PBS. Campur secara menyeluruh
dan inkubasi pada suhu 18-22 ° C selama 30 menit.
c) Tambahkan larutan pemblokiran 405 μl (PBS yang mengandung 5% serum ayam dan
susu skim 5%) untuk memberi pengenceran serum akhir 1/100 dan menetaskan pada suhu
18-22 ° C selama 30 menit. Aliquot 100 μl ditambahkan ke dua sumur yang mengandung
antigen NiV dan dua sumur yang mengandung antigen kontrol sel Vero yang tidak
terinfeksi seperti yang dijelaskan pada langkah vi.

ii) prosedur ELISA


a) Mengencerkan kontrol sel Vero dan antigen NiV di PBS untuk memastikan bahwa
sumur kontrol dan antigen virus dilapisi secara paralel dan pada konsentrasi protein yang
serupa. Antigen biasanya diencerkan 1/1000 sampai 1/4000, namun faktor pengenceran
spesifik harus ditentukan untuk setiap batch antigen. Tambahkan 50 μl virus dan antigen
kontrol sel ke sumur piring mikrotiter 96-sumur sebagai berikut: antigen virus pada
kolom 1, 3, 5, 7, 9 dan 11 dan antigen kontrol sel pada kolom 2, 4, 6, 8 10 dan 12.
Inkubasi pada suhu 37 ° C selama 1 jam dengan gemetar. Pelat juga bisa diinkubasi pada
suhu 4 ° C semalam.
b) Cuci piring ELISA tiga kali dengan PBS yang mengandung 0,05% Tween 20 (PBST)
(250 μl / sumur) dan blok dengan PBS yang mengandung 5% serum ayam dan 5% susu
skim (100 μl / well) selama 30 menit pada suhu 37 ° C di shaker.
c) Cuci piring tiga kali dengan PBST dan tambahkan 100 μl sera yang diserap dan diserap
dari langkah iii ke masing-masing sumur seperti ditunjukkan dalam format di bawah ini.
Tambahkan 100 μl PBS yang mengandung 5% serum ayam dan 5% susu bubuk skim
untuk konjugasi dan sumur kontrol substrat. Inkubasi piring tanpa gemetar selama 1 jam
pada suhu 37 ° C dan cuci tiga kali dengan PBST.
d) encerkan protein A / G-lobok peroksidase konjugat dalam PBST yang mengandung
1% (w / v) bubuk susu skim. Faktor pengencerannya sekitar 1 / 50.000. Campur dengan
baik dan tambahkan 100 μl protein A-konjugasi ke semua sumur kecuali sumur kontrol
substrat. Tambahkan 100 μl PBST yang mengandung 1% susu skim bubuk ke sumur
kontrol substrat. Inkubasi piring selama 1 jam pada suhu 37 ° C tanpa gemetar dan cuci
empat kali dengan PBST.
e) Siapkan substrat (3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidin; TMB) dengan melarutkan satu tablet (1
mg) dalam 10 ml buffer fosfat sitrat 0,05 M, pH 5,0, dan tambahkan 2 μl 30% segar v / v)
H2O2. Tambahkan 100 μl substrat TMB ke masing-masing sumur. Inkubasi selama 10
menit pada suhu 18-22 ° C dan hentikan pengujian dengan menambahkan asam sulfat
100 μl 1 M ke masing-masing sumur.
f) Membaca piring setelah blanking pada kontrol substrat dengan baik. Kepadatan optik
(OD) pada 450 nm pada antigen NiV dan kontrol Antigen sel Vero digunakan untuk
menghitung rasio OD untuk setiap serum (antigen OD pada antigen NiV / OD pada
antigen kontrol Vero).
ii) Interpretasi hasil
Sampel dengan nilai OD antigen NiV kurang dari 0,20 adalah negatif. Sampel dengan
nilai OD antigen NiV lebih besar dari 0,2 dinilai dengan rasio OD (antigen / kontrol)
sesuai nilai sebagai:
a) rasio OD> 2,0 dianggap positif
b) rasio OD antara 2,0 dan 2,2 harus dianggap diragukan
Diragukan dan sera positif harus diuji oleh VNT

Bead Based Assay


Uji berbasis manik dapat digunakan. Metode yang divalidasi di bawah ini adalah contoh
dari assay3.
Dua uji serologis berbasis multiplexed bead telah dikembangkan dengan menggunakan
teknologi berbasis bead magnetik (Luminex) dan menggabungkan identifikasi antibodi
terhadap HeV atau NiV dalam satu tes tunggal (Bossart et al., 2007; McNabb et al.,
2014). Kedua tes tersebut mengukur antibodi terhadap glikoprotein yang dapat larut
rekombinan yang diekspresikan larut (sG) dari HeV dan NiV. Satu tes mengukur antibodi
yang mengikat secara langsung ke sG (uji pengikatan) dan pengujian lainnya mengukur
kemampuan antibodi untuk memblokir reseptor henipavirus EphrinB2 yang mengikat sG
(uji pemblokiran). Protein sV HeV atau NiV rekombinan pertama digabungkan ke manik-
manik magnetik yang dapat diidentifikasi secara individual. Manik-manik yang
digabungkan kemudian dicampur dengan uji sera. Untuk uji pengikatan, sera terikat
kemudian dideteksi menggunakan konsentrat sekunder A / G biotinilasi dan Streptavidin-
phycoerythrin (S-PE). Untuk uji pemblokiran, sera harus bersaing dengan biotinylated
ephrinb2 karena mengikat sG dan S-PE lagi yang digunakan untuk mengukur reaksi.
Manik-manik tersebut kemudian diinterogasi oleh laser di mesin Luminex dan hasilnya
dicatat sebagai intensitas fluoresensi median (LKM) dari 100 manik. Pengujian
menggunakan reagen rekombinan sepenuhnya dan dapat dilakukan dengan keamanan
hayati relatif, sedangkan ELISA tradisional memerlukan perhatian yang lebih ketat
terhadap pengelolaan risiko biologi, terutama untuk produksi antigen. Serupa dengan
pendekatan yang dilakukan dengan ELISA, setiap tersangka positif sera kemudian diuji
oleh VNT.
o Bead Coupling Procedure
i) aktivasi manik
a) Bawa buffer aktivasi manik (0,1 M NaH2PO4, pH6.2) ke suhu kamar sebelum
digunakan.
CATATAN: Hati-hati untuk melindungi manik-manik dari cahaya seperti pada
fotobleach (tutup tabung dengan foil jika memungkinkan).
b) Pilih manik-manik karboksilat MagPlex (Luminex corp, yang disediakan
sebagai 1,25 × 107 manik / ml) untuk reaksi kopling protein (biasanya HeV: Bead
# 29 & NiV: Bead # 30). Vortex manik-manik selama 30 detik dengan kecepatan
sedang, lalu sonis manik-manik dengan sonication mandi selama ~ 30-60 detik.
Adalah penting bahwa manik-manik benar-benar disuspensikan kembali sebagai
partikel monodisperse tunggal.
c) Transfer 300 μl manik-manik karboksilat MagPlex # 28 & # 30 (3,75 × 106
manik) ke dalam 2 ml tabung sarstedt. Tempatkan tabung ke dalam pemisah
magnetik dan biarkan perpisahan terjadi selama 30-60 detik. Dengan tabung yang
masih diposisikan dalam pemisah magnetik, lepaskan supernatan dengan pipet;
Hati-hati jangan sampai mengganggu pelet manik.
d) Cuci manik-manik dengan menambahkan 300μl PBS-T ke tabung dan vorteks.
Tempatkan tabung ke dalam pemisah magnetik dan biarkan perpisahan terjadi
selama 30-60 detik. Dengan tabung yang masih diposisikan dalam pemisah
magnetik, lepaskan supernatan dengan pipet; Hati-hati jangan sampai
mengganggu pelet manik. Ulangi.
e) Tambahkan 600 μl buffer aktivasi manik ke tabung dan vortex. Tempatkan
tabung ke dalam pemisah magnetik dan biarkan perpisahan terjadi selama 30-60
detik. Dengan tabung yang masih diposisikan dalam pemisah magnetik, lepaskan
supernatan dengan pipet; Hati-hati jangan sampai mengganggu pelet manik.
Ulangi.
f) Tambahkan 240 μl buffer aktivasi manik ke tabung, tutup dengan foil dan
kocok selama 3 menit.
g) Siapkan EDC (Pierce) dan S-NHS (Pierce) pada buffer aktivasi bead segera
sebelum digunakan dengan konsentrasi 50 mg / ml (buffer 20 mg / mg bubuk).
Tambahkan 30 μl EDC 50 mg / ml yang baru dibuat ke dalam tabung, diikuti oleh
30 μl S-NHS 50 mg / ml yang baru dibuat ke dalam tabung. CATATAN: Buang
bagian yang tidak terpakai dan buat segar setiap kali.
h) Tutup tabung dengan aluminium foil dan kocok manik-manik pada suhu kamar
selama 20 menit.
i) Sementara manik-manik sedang mengerami, siapkan protein sG. Gunakan 90
μg masing-masing hev sG & NiV sG dan gunakan PBS (jangan gunakan PBS-T,
karena menghambat kelompok karboksi) untuk membawa protein sampai volume
akhir 300 μl.
j) Setelah inkubasi, manik-manik sekarang diaktifkan dan siap untuk kopling.
Tempatkan tabung ke dalam pemisah magnetik dan biarkan perpisahan terjadi
selama 30-60 detik. Dengan tabung yang masih diposisikan dalam pemisah
magnetik, lepaskan supernatan dengan pipet; Hati-hati jangan sampai
mengganggu pelet manik.

ii) kopling protein


a) Cuci manik-manik dengan menambahkan 300 μl PBS ke tabung dan vorteks
(jangan gunakan PBS-T karena menghalangi gugus karboksil). Tempatkan tabung
ke dalam pemisah magnetik dan biarkan perpisahan terjadi selama 30-60 detik.
Dengan tabung yang masih diposisikan dalam pemisah magnetik, lepaskan
supernatan dengan pipet; Hati-hati jangan sampai mengganggu pelet manik.
b) Tambahkan semua 300 μl protein olahan, di atas, ke manik-manik yang
diaktivasi.
c) Tutupi tabung dengan aluminium foil dan kocok manik-manik secukupnya
pada suhu kamar selama 2 jam.
d) Protein sekarang digabungkan ke manik-manik. Tempatkan tabung ke dalam
pemisah magnetik dan biarkan perpisahan terjadi selama 30-60 detik. Dengan
tabung yang masih diposisikan dalam pemisah magnetik, lepaskan supernatan
dengan pipet; Hati-hati jangan sampai mengganggu pelet manik.
e) Cuci manik-manik dua kali dengan 300 μl PBS-T seperti dijelaskan di atas.
Tempatkan tabung ke dalam pemisah magnetik dan biarkan perpisahan terjadi
selama 30-60 detik. Dengan tabung yang masih diposisikan dalam pemisah
magnetik, lepaskan supernatan dengan pipet; Hati-hati jangan sampai
mengganggu pelet manik.
f) Resuspend manik-manik yang digabungkan dalam buffer penyimpanan 1,8 ml
bead (10 ml PBS, 1% BSA, 0,05% sodium azide dan 1 tablet protease inhibitor
(Roche) dan simpan pada suhu 4 ° C.
CATATAN: Periksa reaktivitas sG dengan panel henipavirus sera sebelum
digunakan. Gunakan 1 μl butir yang digabungkan per sumur untuk mengikat
henipavirus dan menghambat uji serologis (prosedur ini cukup banyak pasangan
untuk menguji sekitar 1800 sera). Digabung manik-manik dapat disimpan pada
suhu 4 ° C selama minimal 1 tahun dan menjaga reaktivitas.
o Henipahvirus Luminex Binding Assay Procedure
i) Prosedur uji
a) Pilih butiran HeV dan NiV sG yang sebelumnya digabungkan. Vortex manik-
manik selama 30 detik dengan kecepatan maksimal, lalu sonis manik-manik
dengan sonication mandi selama ~ 30-60 detik.
b) Encerkan manik-manik di dalam blocker (2% susu skim di PBS-T) pada
konsentrasi yang sesuai untuk jumlah serum yang akan diuji (1 μl masing-masing
bead set / well).
c) Tambahkan 100 ml manik-manik yang diencerkan ke sumur yang sesuai dari
pelat datar rata-rata NUNC TC 96-well.
d) Tutup pelat di foil dan kocok di RT selama 30 menit pada shaker piring.
e) Letakkan plat pada dudukan magnet dan biarkan perpisahan terjadi selama 30-
60 detik. Dengan piring yang masih berada di dudukan magnet, masukkan isi ke
wastafel dan dengan lembut dikan pada handuk kertas, lepaskan piring dari
dudukan magnet.
f) Cuci dua kali dengan PBST atau alternatifnya, gunakan mesin cuci piring
magnet otomatis.
g) Tambahkan 100 μl kontrol dan uji sera yang diencerkan 1/100 di PBS-T ke
sumur (sera kelel encer 1/50).
CATATAN: Semua sera harus dilarutkan dengan panas selama 35 menit pada
suhu 56 ° C sebelum pengujian.
h) Tutup pelat di foil dan kocok di RT selama 30 menit pada shaker piring.
i) Letakkan plat pada dudukan magnet dan biarkan perpisahan terjadi selama 30-
60 detik. Dengan piring yang masih berada di dudukan magnet, masukkan isi ke
wastafel dan dengan lembut dikan pada handuk kertas, lepaskan piring dari
dudukan magnet.
j) Cuci dua kali dengan PBST atau alternatifnya, gunakan mesin cuci piring
magnetik otomatis.
k) Encerkan protein biotinilasi A (Pierce) 1/500 (2 ug / ml) dan protein biotinilasi
G (Pierce) 1/250 (2 μg / ml) pada tabung yang sama di PBS-T dan tambahkan 100
μl ke sumur.
l) Tutup piring di foil dan kocok di RT selama 30 menit di atas shaker piring.
m) Letakkan plat pada dudukan magnet dan biarkan perpisahan terjadi selama 30-
60 detik. Dengan piring yang masih berada di dudukan magnet, masukkan isi ke
wastafel dan dengan lembut dikan pada handuk kertas, lepaskan piring dari
dudukan magnet.
n) Cuci dua kali dengan PBST atau alternatifnya, gunakan mesin cuci piring
magnetik otomatis.
o Tambahkan 100 μl Streptavidin R-PE (QIAGEN) diencerkan 1/1000 (1 ug / ml)
di PBS-T ke sumur.
p) Tutup piring di foil dan kocok di RT selama 30 menit pada shaker piring.
q) Baca piring menggunakan mesin Luminex dan perangkat lunak yang sesuai.
ii) Interpretasi hasil
Hasilnya dapat ditafsirkan dari nilai LKM mentah atau dapat diubah menjadi
persentase relatif terhadap LKM untuk pengendalian positif (% P) dengan
menggunakan rumus berikut:
(Tes LKM serum / kontrol positif LKM) × 100
Sampel yang memberi LKM> 1000 atau% P> 5 harus diuji terlebih dahulu dalam
uji Binding dan Blocking. Jika sampel masih positif maka harus diuji lebih lanjut
oleh VNT untuk konfirmasi.
o Henipavirus Luminex Blocking Assay Procedure
i) Prosedur uji
a) Pilih butiran HeV dan NiV sG yang sebelumnya digabungkan. Vortex manik-
manik selama 30 detik dengan kecepatan maksimal, lalu sonis manik-manik
dengan sonication mandi selama ~ 30-60 detik.
b) Encerkan manik-manik di dalam blocker (2% susu skim di PBS-T) pada
konsentrasi yang sesuai untuk jumlah serum yang akan diuji (1 μl masing-masing
bead set / well).
c) Tambahkan 100 ml manik-manik yang diencerkan ke sumur yang sesuai dari
pelat datar rata-rata NUNC TC 96.
d) Tutup pelat di foil dan kocok di RT selama 30 menit pada shaker piring.
e) Letakkan plat pada dudukan magnet dan biarkan perpisahan terjadi selama 30-
60 detik. Dengan piring yang masih berada di dudukan magnet, masukkan isi ke
wastafel dan dengan lembut dikan pada handuk kertas, lepaskan piring dari
dudukan magnet.
f) Cuci dua kali dengan PBST. Atau, alternatifnya, gunakan pencuci piring
magnet otomatis.
g) Tambahkan 100 μl kontrol dan uji sera yang diencerkan 1/50 di PBS-T ke
sumur (sera kelel encer 1/25).
CATATAN: Semua sera harus dilarutkan dengan panas selama 35 menit pada
suhu 56 ° C sebelum pengujian.
h) Tutup pelat di foil dan kocok di RT selama 30 menit pada shaker piring.
i) Letakkan plat pada dudukan magnet dan biarkan perpisahan terjadi selama 30-
60 detik. Dengan piring yang masih berada di dudukan magnet, masukkan isi ke
wastafel dan dengan lembut dikan pada handuk kertas, lepaskan piring dari
dudukan magnet.
j) Cuci dua kali dengan PBST atau alternatifnya, gunakan mesin cuci piring
magnetik otomatis.
k) Encerkan ephrinB2 biotinilasi (RnD Systems) 1/1000 (50 ng / ml) di PBS-T
dan tambahkan 100 μl ke sumur.
l) Tutup piring di foil dan kocok di RT selama 30 menit pada shaker piring.
m) Letakkan plat pada dudukan magnet dan biarkan perpisahan terjadi selama 30-
60 detik. Dengan piring yang masih berada di dudukan magnet, masukkan isi ke
wastafel dan dengan lembut dikan pada handuk kertas, lepaskan piring dari
dudukan magnet.
n) Cuci dua kali dengan PBST atau alternatifnya, gunakan mesin cuci piring
magnetik otomatis.
o Tambahkan 100 μl streptavidin R-PE (QIAGEN) diencerkan 1/1000 (1 ug / ml)
di PBS-T ke sumur.
p) Tutup piring di foil dan kocok di RT selama 30 menit pada shaker piring.
q) Baca piring menggunakan mesin Luminex dan perangkat lunak yang sesuai.
ii) Interpretasi hasil
Untuk uji pemblokiran, pembacaan LKM mentah diubah menjadi persentase
penghambatan (% I) dengan menggunakan rumus berikut: (1 - [uji coba LKM /
LKM NSC]) × 100
Sampel yang memberi nilai% I> 15 harus diuji terlebih dahulu dalam pengujian
uji dan uji pembungkusan. Jika sampel masih positif maka harus diuji lebih lanjut
oleh VNT untuk konfirmasi.