Laporan praktikum 5 09 Juni 2017

PEMERIKSAAN VIBRIO SP

I. TUJUAN
1. Mengdentifikasi bakteri Vibrio cholera secara biokimia.
2. Mengetahui cara pembuatan media untuk penanaman bakteri
Vibrio cholera.

II. DASAR TEORI

Vibrio cholerae merupakan bakteri gram negatif, berbentuk basil
(batang) dan bersifat motil (dapat bergerak), memiliki struktur antogenik
dari antigen flagelar H dan antigen somatik O, gamma-proteobacteria,
mesofilik dan kemoorganotrof, berhabitat alami di lingkungan akuatik dan
umumnya berasosiasi dengan eukariot. Spesies Vibrio kerap dikaitkan
dengan sifat patogenisitasnya pada manusia, terutama V. cholerae
penyebab penyakit kolera di negara berkembang yang memiliki
keterbatasan akan air bersih dan memiliki sanitasi yang buruk (Rhiny,
2013). Klasifikasi dari Vibrio cholerae sebagai berikut:
Kingdom : Eubacteria
Divisi : Bacteri
Class : Schizomycetes
Ordo : Eubacteriales
family : Vibrionaceae
Genus : Vibrio
Spesies : Vibrio cholera
Vibrio cholera adalah salah satu bakteri yang masuk dalam family
Vibrionaceae selain dari Aeromonas dan Plesiomonas, dan merupakan
bagian dari genus Vibrio. Bakteri ini pertama kali ditemukan oleh Robert
Koch pada tahun 1884 dan sangat penting dalam dunia kedokteran karena
menyebabkan penyakit kolera. Vibrio cholera banyak ditemui di
permukaan air yang terkontaminasi dengan feces yang mengandung
kuman tersebut, oleh karena itu penularan penyakit ini dapat melalui air,
makanan dan sanitasi yang buruk (Candra, 2006).
Vibrio cholerae termasuk bakteri gram negative, berbentuk batang
bengkok seperti koma dengan ukuran panjang 2-4 µm. Pada isolasi, Koch
menamakannya “kommabacillus”. Tapi bila biakan diperpanjang, kuman
itu basa menjadi batang lurus yang mirip dengan bakteri enteric gram
negative. Kuman ini dapat bergerak sangat aktif karena mempunyai satu
buah flagella polar yang halus (monotrik). Kuman ini tidak membentuk
spora. Pada kultur dijumpai koloni yang cembung, halus dan bulat yang
keruh dan bergranul bila disinari (Rhiny, 2013).

Bakteri ini bersifat aerob atau anaerob fakultatif. Suhu optimum

untuk pertumbuhan pada suhu 18-37°C. Dapat tumbuh pada berbagai jenis
media, termasuk media tertentu yang mengandung garam mineral dan
asparagin sebagai sumber karbon dan nitrogen. V. cholerae ini tumbuh
baik pada agar Thiosulfate-citrate-bile-sucrose (TCBS) (Alam dkk, 2013).
Salah satu cirri dari Vibrio cholerae ini adalah dapat tumbuh pada
pH yang sangat tinggi (8,5-9,5) dan sangat cepat mati oleh asam.
Pertumbuhan sangat baik pada pH 7,0. Karenanya pembiakan pada media
yang mengandung karbohidrat yang dapat difermentasi, akan cepat mati.
V. cholerae meragi sukrosa dan manosa tanpa menghasilkan gas tetapi
tidak meragi albinosa. Kuman ini juga dapat meragi nitrit. Ciri khas lain
yang membedakan dari bakteri enteric gram negative lain yang tumbuh
pada agar darah adalah tes oksidasi hasilnya positif (Wati, 2013).
Semua Vibrio cholerae mempunyai antigen flagel H yang sama.
Antigen flagel H ini bersifat tahan panas. Antibodi terhadap antigen flagel
H tidak bersifat protektif. Pada uji aglutinasi berbentuk awan. Antigen
somatik O merupakan antigen yang penting dalam pembagian grup secara
serologi pada Vibrio cholera. Antigen somatik O ini terdiri dari
lipoposakarida. Pada reaksi aglutinasi berbentuk seperti pasir. Antibodi
terhadap antigen O bersifat protektif (Farradisa, 2012).
III. ALAT & BAHAN
 Alat
 Petridish  Ose Jarum
 Tabung Reaksi  Labu Spiritus
 Rak Tabung Reaksi  Objek glass
 Tabung Durham  Mikroskop
 Erlenmeyer  Autoclave
 Gelas Ukur  Incubator
 Beaker Glass  Kawat kasa
 Batang Pengaduk  Spatula
 Pipet tetes  Mikropipet
 Blue tip steril  Pelor
 Ose Bulat
 Bahan
 Sampel Vibrio (limbah kuah pindang)
 Media Thiosulfate-citrate-bile salts sucrose agar (TCBS)
 Media Alkaline Peptone Water (APW)
 Blood Agar Plate (BAP)
 Media Triple Sugar Iron Agar (TSIA)
 Media Simon Citrat
 Media Methyl Red (pepton water, glukosa, indikator methyl
red)
 Media gula – gula (glukosa, laktosa, sukrosa, peptone water,
indikator BTB)
 Semi solid agar
 Nutrient agar miring
 Pewarna Gram
 Reagen Kovac’s
 Kapas
 Aluminium foil
 Karet
  Plastik 2kg
 Kertas

IV. PROSEDUR KERJA

 Pembuatan Media
Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan saat pembuatan media.
1. Media TSIA
Ditimbang media TSIA sesuai takaran yaitu 1,3gr kemudian
dilarutkan dalam 20 ml aquades.Panaskan media hingga terlarut
sempurna dan homogen.Tuang media ke dalam 4 tabung reaksi masing-
masing sebanyak 5 ml. Tutup tabung dengan menggunakan kapas,
kemudian sterilisasi dengan menggunakan autoclave. Setelah proses
sterilisasi selesai, miringkan agar pada tabung dan tunggu hingga
memadat.
2. Media TCBS
Ditimbang media TCBS sesuai takaran yaitu 4,4gr kemudian
dilarutkan dalam 50ml aquadest steril yang telah diautoclave terlebih
dahulu.Memanaskan dengan nyala api kecil hingga media homogent
dengan sempurna.Jangan mengautoclave media.Dituang media pada
cawan petri, tunggu hingga media memadat.
3. Media BAP
Ditimbang media BAP 3,15gr kemudian media dilarutkan dalam
50ml aquades lalu media dipanaskan hingga media larut dan
homogen.Mensterilisasi media pada autoclave pada suhu 1210C selama
15 menit.Pada keadaan hangat tambahkan darah golongan darah O
(5%/v) yang sudah dikocok menggunakan Erlenmeyer kecil yang berisi
pelor ke dalam media tetapi jangan sampai pelor ikut masuk ke dalam
media dan homogenkan.Dituang media pada cawan petri, tunggu
hingga media memadat.
4. Media APW
Ditimbang komposisi media APW yaitu : peptone (0,4 gram/liter),
Nacl (0,4gram/liter). Semua bahan dilarutkan dengan 40ml aquadest
kemudian dipanaskan hingga semua bahan larut dan homogen.Tuang
media ke dalam 4 tabung reaksi secara rata kemudian sterilisasi pada
autoclave pada suhu 1210C selama 15 menit.
5. Media SCA
Ditimbang media SCA sesuai takaran yaitu 0,44gr kemudian
larutkan dalam 20ml aquades.Panaskan media hingga terlarut sempurna
dan homogen.Tuang media ke dalam 4 tabung reaksi masing-masing
sebanyak 5 ml. Tutup tabung dengan menggunakan kapas, kemudian
sterilisasi dengan menggunakan autoclave. Setelah proses sterilisasi
selesai, miringkan agar pada tabung dan tunggu hingga memadat.
6. Media gula-gula
- Glukosa : Ditimbang peptone 1,25gr dan glukosa 0,25gr dalam
50ml aquades
- Sukrosa : Ditimbang peptone 0,625gr dan sukrosa 0,25gr dalam
25ml aquades
- Laktosa : Ditimbang peptone 0,625gr dan laktosa 0,25gr dalam
25ml aquades
- Kemudian masing-masing glukosa, sukrosa dan laktosa dilarutkan
hingga tercampur semua.Tambahkan 1-3 indikator BTB,
homogenkan. Tempatkan tabung durham ke dalam tabung reaksi
sebelum dituangkan media dengan posisi tabung durham dalam
keadaan terbalik. Tutup tabung dengan kapas berwarna (glukosa :
merah; sukrosa : kuning; laktosa : biru) kemudian sterilisasi pada
autoclave.
7. Media Methyl Red
Ditimbang media peptone 1,25gr kemudian larutkan media peptone
dalam 25ml aquades.Tambahkan sumber glukosa 0,25gr lalu larutkan
hingga tercampur sempurna.Tuang media pada 4 tabung reaksi.Tutup
tabung dengan kapas, sterilisasi pada autoclave.
8. Media Semi Solid
Ditimbang media NA 0,25gr kemudian dilarutkan dalam 25ml
aquades.Panaskan media hingga terlarut sempurna kemudian tuang ke
 dalam 4 tabung reaksi ± 3- 5 ml, tutup dengan kapas kemudian
sterilisasi pada autoclave.
9. Media NA Miring
Ditimbang media NA 0,25gr kemudian dilarutkan dalam 25ml
aquadest.Panaskan media hingga terlarut sempurna kemudian tuang ke
dalam tabung reaksi ± 3- 5 ml. Sterilisasi pada autoclave pada suhu
1210C selama 15 menit. Setelah proses sterilisasi selesai, miringkan
media dan tunggu hingga memadat.

 Inokulasi Bakteri
1. Inokulasi pada media pengaya
Media : APW
Dipipet 1 – 2 ml sampel kemudian inokulasikan pada media
APW.Inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam.Pertumbuhan bakteri
pada media ditandai dengan perubahan media menjadi keruh.
2. Inokulasi pada media differential
Media : Media TCBS
Dipanaskan ose bulat pada bunsen kemudian dinginkan.
Inokulasikan bakteri yang tumbuh pada APW ke media TCBS dengan
metode streaking pada permukaan media.Inkubasi pada suhu 370C
selama 24 jam.Amati pertumbuhan koloni bakteri meliputi warna dan
karakteristik makroskopis. Koloni murni bakteri kemudian disimpan
pada media NA miring sebagai stock culture dengan cara distreaking.
3. Inokulasi pada media BAP
Media : Media BAP
Dipanaskan ose bulat pada bunsen kemudian dinginkan.
Inokulasikan bakteri yang tumbuh pada APW dan NA miring ke
media BAP dengan metode streaking pada permukaan media.Inkubasi
pada suhu 370C selama 24 jam.
4. Inokulasi pada media biokimiawi
- Inokulasi pada media padat dengan dasar (butt) dan miring
(slant)
  Media : SCA dan TSIA
Dianaskan ose jarum pada api bunsen, kemudian dinginkan
ose jarum , ambil kuman pada NA miring dengan ose lalu
goreskan pada lereng media, kemudian media ditusukkan dari
tengah media hingga ke dasar. Inkubasi media pada suhu 350C
selama 18-24 jam untuk media TSIA dan pada suhu 370C
selama 24 jam pada media SCA.
 Media : semi solid
Dipanaskan ose jarum pada api bunsen kemudian
dinginkan, ambil kuman pada NA miring dengan ose kemudian
tusukkan ose pada media dengan tegak lurus hingga dasar media
kemudian cabut. Inkubasi media pada suhu 370C selama 24 jam.
- Inokulasi pada media cair
 Media : Gula-gula dan Methyl Red
Panaskan ose bulat pada api bunsen, ambil kuman pada NA
miring dengan ose bulat dan inokulasikan dengan cara diaduk
menggunakan ose bulat tadi pada media cair gula-gula dan
methyl red. Inkubasi media pada suhu 370C selama 24 jam.
 Pengamatan
1. Pada media TCBSamati pertumbuhan bakteri dari segi bentuk,
ukuran, pigmen, tepi, elevasi dan warna.
2. Pada media Na amati adanya warna putih/ kabut pada media.
3. Pada media TSIA dilihat dari perubahan warna dan terbentuk
atau tidaknya gas dan SCA dilihat dari perubahan warna.
4. Pada media gula-gula dilihat dari perubahan warna dan
pembentukan gas/ gelembung udara pada tabung durham.
5. Pada media methyl red dilihat dari perubahan warna.
Dilanjutkan dengan uji indol menetesi media methyl red
dengan Reagen Kovac kemudian amati ada atau tidaknya
cincin merah yang mengubungkan antara reagen dengan media
dalam hitungan detik.
 6. Pada media BAP amati perubahan warnanya apakah hemolisa
menyeluruh, sebagian atau tidak sama sekali.
7. Kemudian dilakukan pengecatan Gram menggunakan media
semisolid.

V. INTERPRETASI HASIL
 Morfologi V. cholera
Berbentuk batang bengkok bila diisolasi dari feses penderita atau
dari biakan yang masih muda (usia kultur 24 - 48 jam). Biakan tua
umumnya berbentuk batang lurus. Sel berukuran 1-3 x 0,4-0,6 µm.
Bergerak dengan flagella peritrik, tidak berspora, tidak berselubung dan
bersifat Gram (-).
 Karakterisasi biokimia V. cholera
Glukosa +
Laktosa -
Sukrosa +
Citrat -
MR +
Indol +
Semisolid +
Hemolisa +
TSIA
Lereng : Alkalis
Dasar : Acid
H2S : -
Gas : -

 Sifat biakan
 Koloni bulat, smooth, cembung
 Bersifat aerob dan tumbuh pada media sederhana
 pH optimum pertumbuhan 7,8 – 8,0 dan tumbuh subur pada pH
9,2.
  Tidak tahan asam, bila dalam pembenihan terdapat karbohidrat
yang tidak dapat difermentasikan kuman akan mati
 Tumbuh baik pada median yang mengandung garam mineral
sebagai sumber karbon dan nitrogen
 Pada medium pepton (banyak mengandung triptofan dan nitrat)
akan membentuk indol yang dengan asam dulfat akan
membentuk warna merah (test indol +)
 Media yang dapat digunakan untuk kultur :
1. Media pemupuk/ pengaya : pepton alkali pH 8,4-9,2. Tumbuh
setelah lama inkubasi 6 -18 jam dan pada permukaan terlihat selaput.
2. TCBS :V. cholera tumbuh dengan koloni berwarna kuning,
sedangkan V. parahaemolyticus tumbuh dengan koloni berwarna
hijau.
3. Agar soda : tumbuh dengan koloni berwarna abu-abu.

VI. HASIL

NO MEDIA MAKROSKOPIS MIKROSKOPIS GAMBAR

1 TCBS Ukuran : 0,3 cm Bentuk :

(koloni Bentuk : circular batangmelengkung
Sp 1) Tepi : Gram : Negatif (-)
bergelombang Warna : Merah
Elevasi : cembung Susunan : menyebar
 REAKSI SIFAT BIOKIMIAWI

UJI REAKSI GAMBAR

Methyl Negatif (-)

red

Simon Positif (+)

Citrat

TSIA Lereng : (-)

Dasar : (-)

Gas : (+)

H2S : (-)

Semi Positif (+)

Solid
 UJI GULA GULA

UJI REAKSI GAMBAR

Glukosa Positif (+)

Sukrosa Positif (+)

Laktosa Positif (+)

 MEDIA BAP
HASIL GAMBAR
α Hemolisa
(lisissebagi
an)

VII. PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini inokulasi bakteri pertama kali dilakukan
pada media APW yang bertujuan untuk mengisolasi bakteri patogen dari
mixed culture, APW mengandung substansi penghambat yang dapat
menekan pertumbuhan bakteri lain selain vibrio. Jika pada media APW
bakteri tumbuh maka akan dilanjutkan penanaman bakteri pada media
selective TCBS.
 Pada media TCBS didapatkan 1 koloni yang tumbuh pada media
TCBS. Koloni pertama berukuran kecil 0,3cm, bentuk circular, elevasi
cembung, dan berwarna kuning.
Pada media BAP (Blood Agar Plate) didapatkan hasil α Hemolisa
yang berarti lisis sebagian. Bakteri ditanam pada media BAP bertujuan
untuk melihat kemampuan bakteri dalam menghidrolisis darah karena ada
beberapa bakteri tertentu yang dapat memproduksi enzime hemolysins
yang akan bereaksi terhadap sel darah merah.
Pada uji reaksi biokimia didapatkan hasil yaitu, pada media TSIA
terdapat gelembung udara yang berrarti bakteri tersebut menghasilkan gas.
Pada media Simon Citrat di dapatkan hasil positif, artinya bakteri memiliki
enzim citrat permiase yaitu enzim spesifik yang membawa citrat ke dalam
sel. Pada media Methyl Red didapatkan hasil negatif dimana media tidak
berubah warna menjadi warna merah setelah ditambahkan Methyl Red
artinya bekteri tidak menghasilkan asam campuran dari proses fermentasi
glukosa yang terkandung dalam medium Methyl Red. Pada media semi
solid didapatkan hasil positif hal ini menunjukan adanya pergerakan
bakteri yang ditandai dengan adanya penyebaran berwarna putih seperti
akar di sekitar inokulasi.
Pada uji gula-gula media sukrosa, glukosa dan laktosa didapatkan
hasil positif ditandai dengan perubahan warna menjadi kuning dan
terdapat gelembung pada tabung durham, artinya bakteri membentuk asam
dari fermentasi laktosa, glukosa dan laktosa
Pencegahan yang dapat dilakukan untuk menghindari agar tidak
terjangkit penyakit yang disebabkan oleh bakteri vibrio sebagai berikut :
1. Pemanasan air dengan benar (hingga mendidih) dan sanitasi yang
baik dapat mencegah infeksi Vibrioi cholerae.
2. Pencegahan juga dapat dilakukan dengan perbaikan sanitasi
khususnya makanan dan air melalui pendidikan. Pasien kolera
sebaiknya diisolasi, eksresinya didisinfeksi dan orang-orang kontak
diawasi. Khemoprofilaksis dengan obat antimikroba mungkin
diperlukan.
 3. Pemberian imunisasi dengan vaksin yang mengandung ekstrak
lipopolisakarida dari vibrio atau suspense pekat vibrio dapat
memberikan perlindungan yang terbatas pada orang-orang yang
rentan (missal kontak antar anggota keluarga) tetapi tidak efektif
sebagai alat kontrol epidemic. Vaksin ini memberikan proteksi 60
– 80% untuk masa 3 – 6 bulan.
4. Imunisasi toksoid kolera pada manusia tidak lebih baik daripada
vaksin standar. Hingga saat ini perbaikan hygiene / sanitasi yang
memberikan pencegahan yang mantap terhadap kolera (Rhiny,
2013).
VIII. SIMPULAN
Dari hasil praktikum Pemeriksaan Vibrio Cholerae yang dilakukan
dapat disimpulkan bahwa didapatkan Bakteri Batang Gram (-), Vibrio sp.
IX. DAFTAR PUSTAKA

Alam, M.S, Sarjono P.R, Aminin, A.L.N. 2013. Isolasi Bakteri Selulolitik
Termofilik Kompos Pertanian Desa Bayat, Klaten, Jawa Tengah. Chem Info.
No.1(1) :190-195.

Candra, Joddi Iryadi. 2006. Isolasi dan Karakteristik Bakteri Asam Laktat Dari
Produk Bekasam Ikan Bandeng (Chanos chanos).[Skripsi]. Institut
Pertanian Bogor : Bogor.

Faradisa. 2012. Laporan Mikrobiologi Teknik Isolasi Mikroba, (Online),

(http://disachem.blogspot.co.id/2012/04/laporan-mikrobiologi-teknik-isolasi.html)
diakses 27 Maret 2017

Rhiny. 2013. Laporan Praktikum Mikrobiologi, (Online),

(http://rhinychenceng.blogspot.co.id/2013/07/laporan-praktikum-
mikrobiologi_5764.html)
diakses 25 Maret 2017

Sofiatul. 2015. Isolasi Bakteri, (Online),

(http://aliranirinaunsriakuakultur14.blogspot.co.id/2015/03/isolasi-bakteri.html)
diakses 26 Maret 2017

Wati. 2013. Pembuatan Biogas dari Limbah Cair Industri Bioetanol Melalui
Proses Anaerob (Fermentasi). Universitas Diponegoro : Semarang
 Dosen Pengampu,

Ni Wayan Desi Bintari, M.Si