MÉTODO DE SECUENCIACIÓN SANGER

UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE INGENIERIA EN ALIMENTOS

CARRERA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

BIOINFORMÁTICA

Integrantes:
- Cisneros Ruth
-Flores Valeria
-Guanoquiza Kelly
--torres Daniela
-Sailema Magdalena

ING. CHRISTIAN GALARZA

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MÉTODO DE SECUENCIACIÓN SANGER

El método de secuenciación de Sanger fue diseñado por Fred Sanger en
1977), es también conocida como método didesoxi o de secuenciación
de ADN mediante terminación de cadena. Se basa en el uso de ADN
polimerasa para sintetizar cadenas de ADN con una terminación
específica, generándose fragmentos de ADN de todos los tamaños
posibles. Esto es viable, mediante el uso nucleótidos modificados que no
tienen grupos hidroxilos en su extremo 3´ OH, grupo esencial para la
polimerización por la ADN polimerasa, de la misma forma cuando se
incorpora un dideoxinucleótido (ddNTP), como residuo terminal, evita
que la cadena de ADN continúe extendiéndose, de tal forma que se
obtienen fragmentos de diferentes tamaños, (De Necochea, & Canul,
2004; Peña, 2013).

Proceso de secuenciación tradicional por el método de Sanger

La estrategia es hacer cuatro reacciones (Figura 1). Se incluye la hebra
de ADN a secuenciar, ADN polimerasa, cebadores desoxiribonucleótidos,
didesoxirribonucleótidos trifosfato correspondientes a las 4 bases (A, G, T
Y C).

Figura 1. Método de Sanger, Cuatro reacciones con

ddNTPs diferentes permiten la síntesis con distintos
fragmentos.
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1. La muestra de ADN se divide en cuatro tubos de reacciones de

secuenciación separadas que contienen los cuatro tipos de ddNTP
(ddATP, ddGTP, ddCTP, o ddTTP), además se incluyen el resto de
componentes moleculares ya nombrados.

2. Se inicia la reacción añadiendo los cebadores marcados y

complementarios al extremo 3′-OH de la secuencia molde. La
polimerización ocurre dirección 5′ a 3′.

3. La cadena recién sintetizada se finaliza en el punto de la adición del

ddNTP complementario y se generan fragmentos de ADN de diferentes
tamaños. El tubo de ddATP genera fragmentos acabados en A, el tubo
de ddTTP acabados en T, y así sucesivamente.

4. Para estudiar los diferentes fragmentos sintetizados en los cuatro tubos

de reacción se desnaturalizan y se realiza una electroforesis en gel de
poliacrilamida. Cada disolución se añade a diferentes carriles en el gel y
se deja correr la electroforesis, así las muestras se separan según el
tamaño y tipo de nucleótido en cada pocillo. La lectura del gel se
comienza desde arriba que sería el extremo 3′ (fragmentos más
pequeños) hasta abajo, que corresponde al extremo 5′ (fragmentos más
grandes). Esto nos proporciona la lectura correcta de la secuencia de
ADN. (Galera, 2014; Gobernado, 2013).

Se aísla y se clona el ADN que se desea secuenciar, este ADN se

desnaturaliza y se emplea una sola hélice en la secuenciación. En la
secuenciación se utiliza un cebador o “primer” marcado
radiactivamente que suministra el extremo 3’OH que necesita la ADN
polimerasa. Se preparan cuatro tubos de reacción, cada uno con el ADN
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molde de hélice sencilla que se desea secuenciar, con ADN polimerasa,

con el cebador marcado y con los cuatro nucleótidos trifosfato. A cada
tubo se le añade una pequeña proporción de un didesoxinucleótido
trifosfato , un tubo con ddATP, otro con ddTTP, el tercero con ddGTP y el
cuarto con ddCTP. En cada uno de estos tubos se producirán cadenas
de ADN de distintas longitudes, terminando todas en el lugar en el que se
incorporó el dideoxi correspondiente añadido al tubo. Posteriormente,
estas piezas de ADN se separan mediante electroforesis vertical en geles
de acrilamida. Las piezas más pequeñas migran más rápidamente que
las grandes y la secuencia se puede leer directamente sobre el gel de
acrilamida.

autorradiografía del gel de secuenciación:

En este tipo de geles pueden leerse hasta 300 bases. (Rodríguez, 2015)

Ventajas
o Las reacciones de secuencias se realizan en unas horas.
o Reacciones más ¨puras¨, con menos contaminantes que afecten
la resolución del gel.

BIBLIOGRAFÍA
De Necochea, R., & Canul, J. (2004). Secuenciación de Ácidos Nucleicos.
Instituto de Biotecnología UNAM.
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Galera, A. (2014). Método de Sanger: Secuenciación tradicional.

Recuperado de:
http://elguardiandeloscristales.com/wordpress/metodo-de-sanger-
secuenciacion-tradicional/. (Consultado: 01/07/2017)

Gobernado, I. (2013). Secuenciación de Exoma Completo en Trastorno

Bipolar autosómico dominante: Afectación del Gen Period3- Ritmo
Circadiano. Universidad Alcalá.

Peña, J., Gregorio, O., & Barrera, B. (2013). Los métodos experimentales
que permiten el estudio de las macromoléculas de la vida: historia,
fundamentos y perspectivas. Educación química, 24(2), 237-246.

Rodríguez, G. (2015). Secuenciación automática de ADN. Recuperado

de: http://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/biomed1.htm#sanger. .
(Consultado: 01/07/2017)