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ESCUELA POLITECNICA DEL EJÉRCITO

FACULTAD DE CIENCIAS APLICADAS


INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA

INFORME DE LABORATORIO

Nombre: Abad Myriam; Cruz Nathaly Materia: Biología Molecular I

Practica N°:03 Fecha: 19 – 01 – 2017 Curso/Paralelo: 1606

1. TEMA: Extracción de ADN

2. OBJETIVOS:

Objetivo General.
- Extraer ADN a partir de una muestra vegetal (hoja de espinaca – Spinacia
Olerasea).
Objetivos Específicos
- Identificar y familiarizarse con el correcto procedimiento para una extracción
de ADN, utilizando la técnica de DNA Zol Reagent.
- Obtener y preparar correctamente una muestra (vegetal) suficiente y de calidad
para utilizarla en el proceso de extracción de ADN.
- Conocer y diferenciar las funciones y características de los diferentes tipos de
reactivos y materiales que se utilizan durante la extracción de ADN.

3. INTRODUCCIÓN o MARCO TEORICO:

Ácido desoxirribonucleico (ADN), es el material genético de todos los organismos


celulares y casi todos los virus; este lleva la información necesaria para dirigir la
síntesis de proteínas y la replicación. (Ferreira, 2008)

En la extracción de ácidos nucleicos, existen diferentes tipos de métodos que permiten


su obtención partiendo de diferentes fuentes por ejemplo: plantas, plásmidos, gotas de
sangre, cabellos, células bacterianas o eucarióticas, entre otras. Estas contendrán
ADN de buena calidad, si se colecta y preserva apropiadamente. (TGS, 2000) La
mayor dificultad para colectar material biológico con propósitos genéticos es evitar la
degradación del ADN. Los principales agentes degradadores de ADN en muchas
muestras son las enzimas DNAasas. Estas pueden estar ya presentes en la misma
muestra, o ser producidas por los microorganismos que crecen en la misma. (Wasser,
1997)

Muchos estudios de Biología Molecular comienzan con la extracción de ácidos


nucleicos, los cuales requieren de una serie de etapas básicas. (Pimentel, 2015) . El
proceso de extracción de ADN empieza por: la lisis celular que libera las moléculas en
una fase acuosa que es separada de los restos celulares por centrifugación. Las
proteínas son removidas de la fase acuosa con solventes orgánicos (fenol,
cloroformo). El ADN, que permanece en la fase acuosa, precipita junto al etanol y
posteriormente es purificado (opcional) pero este permite separar el DNA de
materiales contaminantes, como RNA y proteínas. Por último el DNA queda
suspendido en un buffer adecuado (Malajovich,2006).
Una técnica de extracción de DNA utiliza DNA Zol Regiens (DNAzol®), que es un
completo reactivo listo para usarse para el aislamiento de ADN genómico o viral de
muestras sólidas y líquidas de animal, humano y origen vegetal. El procedimiento se
basa en el uso de una innovadora solución de lisis guanidina – detergente que
hidroliza el ARN y promueve la precipitación selectiva del ADN de la célula lisada (1,
2). Este método de aislamiento de ADN avanzado combina fiabilidad y eficacia con la
sencillez de un protocolo de aislamiento rápido (Chomczynski, 2013).

4. MATERIALES Y MÉTODOS:

Materiales

- Equipo de protección personal: mandil, guantes.


- Muestras biológicas: hojas de espinaca.
- Equipos: microcentrifuga
- Reactivos: Nitrógeno líquido, DNA Zol, cloroformo, etanol (100%), etanol
(95%), buffer TE.
- Otros materiales: tubos eppendorf (1,5mL), micropipetas, puntas de
micropipetas, pistilo, mortero, espátula, pipetas, papel toalla, marcador de
vidrio.

Metodología:

 Preparación de la muestra:
o Se colocó las hojas de espinaca en el mortero (sin tallos).
o Se agregó nitrógeno líquido en el mortero y se procedió a macerar las
hojas hasta pulverizarlas.
o Se tomó un poco de muestra y se colocó en el tubo eppendorf.
 Lisis y homogenización:
o Se añadió 1mL de DNA Zol por cada 25-50 mg de muestra.
o Se mezcló a fondo con la ayuda de un pistilo.
o Se incubo por 5 -10 minutos a temperatura ambiente mezclando por
inversión.
o Se añadió 300 uL de cloroformo.
 Centrifugación:
o Se centrifugo por 10 minutos a 10000 rpm a 4°C
o Se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf.
 Precipitación:
o Se precipito el sobrenadante 0,5 mL con etanol 100% por 1Ml de DNA
Zol.
o Se mezcló por inversión y se dejó reposar por 3 minutos.
o Se eliminó nuevamente el sobrenadante, dejando únicamente el DNA.
 Lavado:
o Se lavó el precipitado 2 veces con 1 mL de etanol 95%
o En cada lavado se invirtió el tubo de 3-6 veces.
o Se almacenó lo tubos eppendorf en forma vertical para precipitar el
DNA y se eliminó el etanol.
 Suspensión:
o Se dejó secar el DNA a temperatura ambiente por unos 3 minutos.

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Se disolvió el pellet en buffer TE, agitándolo con una punta para que se
o
homogenice.
5. RESULTADOS Y OBSERVACIONES:

A) Lisis y Homogenización:

Foto 1: Recipiente de nitrógeno líquido y Foto 2: Se coloca el nitrógeno líquido Foto 3: Triturando rápidamente las
hojas de espinaca en mortero. en el mortero con las hojas de hojas de espinaca.
Tomada por: Myriam Abad espinaca. Tomada por: Myriam Abad
Tomada por: Myriam Abad

Foto 4: Colocando el polvo de espinaca Foto 5: Homogenización de la Foto 6: Se añadió cloroformo a la


en el tubo eppendorf. muestra con DNA Zol utilizando muestra homogenizada.
Tomada por: Myriam Abad un pistón pellet eppendorf. Tomada por: Nathaly Cruz
Tomada por: Nathaly Cruz

 Se utilizaron muestras muy frescas de hojas de espinaca porque es necesario el


buen estado de la muestra para conseguir con éxito la extracción
 El proceso de trituración debe ser rápido debido a que se necesitarían grandes
cantidades de nitrógeno líquido para mantener la muestra, y la muestra tiene que
ser triturada hasta quedar en un fino polvo
 Al añadir el DNAzol a la muestra se utilizó un pistón pellet eppendorf para
homogeneizar la muestra, para después añadir el cloroformo

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B) Centrifugación:

Foto 7: Se centrifugó los Foto 8: Fases obtenidas después de la Foto 9: Se extrajo el sobrenadante
tubos eppendorf. centrifugación del tubo eppendorf. obtenido de la centrifugación.
Tomada por: Nathaly Cruz Tomada por: Myriam Abad Tomada por: Myriam Abad

 El proceso de centrifugado nos da como resultado un sobrenadante, el cual


transferimos a un nuevo tubo.

C) Precipitación:

Foto 10: Se colocó el sobrenadante en Foto 11: Se colocó etanol 100% al Foto 12: Se centrifugó una segunda vez
otro tubo eppendorf tubo con el sobrenadante. y se obtuvo el precipitado
Tomada por: Nathaly Cruz Tomada por: Nathaly Cruz Tomada por: Myriam Abad

 Una vez obtenido el sobrenadante se realizó la precipitación, en la cual añadimos


etanol a la muestra, mezclamos y centrifugamos, se pudo observar un precipitado
color blanco lechoso.

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D) Lavado:

Foto 13: Se eliminó la parte líquida Foto 14: Se colocó etanol al 95% en Foto 15: Se centrifugó los tubos
del tubo eppendorf, procurando el tubo eppendorf eppendorf.
dejar solamente el pellet. Tomada por: Nathaly Cruz Tomada por: Myriam Abad
Tomada por: Myriam Abad

 En el proceso de lavado fue necesario centrifugación de nuevo por dos minutos,


ya que el ADN no tenía la textura deseada.
 Se eliminó el sobrenadante.

E) Suspensión:

Foto 16: Se dio la vuelta el tubo Foto 17: Se añadió el buffer TE al tubo seco Foto 18: Se homogenizo con
eppendorf y dejo secar Tomada por: Myriam Abad la micropipeta.
Tomada por: Nathaly Cruz Tomada por: Nathaly Cruz

 Se procedió a secar los tubos


 Por ultimo a los tubos secos que contenían el pellet se les añadió TE y se
homogeneizo con la punta de la micropipeta.

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6. DISCUSIÓN
La obtención de DNA íntegro y puro es una parte fundamental para el buen desempeño
de las técnicas utilizadas en Biología Molecular (Tang et al. 2005, Wang et al. 2005). En la
práctica realizada se extrajo el DNA de espinaca con un protocolo específico para este
procedimiento, pero además de plantas se puede extraer DNA de animales, algunas
bacterias y virus, en los cuales se aplica una metodología o un método diferente, por ende
es muy importante conocer a que organismo se le extraerá DNA y que protocolo se debe
usar para este, si es un método tradicional o un método en el cual usamos kits de
extracción.

Independientemente del método de extracción que se utilice, lo importante es realizar


cada paso con cuidado para obtener ADN íntegro y puro que permita llevar a cabo las
técnicas posteriores. Las técnicas actuales de biología molecular no requieren de grandes
cantidades de material genético. (Velázquez, s.f.). Al realizar cada etapa de la extracción
de DNA de espinaca se lo hizo en los tiempos exactos especificados en el protocolo.

Una de las ventajas de utilizar métodos tradicionales es su bajo costo, así como un alto
rendimiento. Sin embargo, en ocasiones el material obtenido está fragmentado. Estos
métodos son susceptibles de contaminación, variación y errores por los múltiples pasos
de manipulación (Störmer et al. 2007). El rendimiento de los kit de extracción depende de
la calidad de la muestra extraída, la cantidad de muestra tomada, y la capacidad que
tienen las membranas para unirse a los reactivos.

El fenol y el agua (solución acuosa donde se encuentra el ADN) no se pueden mezclar,


por lo que el ADN que es muy polar debido a su carga negativa, permanecerá en la fase
acuosa de la solución, mientras que las proteínas (formadas por grandes cadenas cuyos
componentes elementales son aminoácidos algunos polares y otros no) quedarán tras la
centrifugación en la interfase y en la fase orgánica debido a su polaridad (Potosí, 2008).
Es necesario el uso de reactivos como fenol, cloroformo y alcohol isoamilico o etanol en
algunos casos para la eliminación de proteínas. Hay que extraer el sobrenadante con
cuidado para no arrastrar las proteínas.

7. CONCLUSIONES

 Se aplicó y aprendió correctamente el proceso de extracción de DNA ayudándonos


de la técnica de DNA Zol Regent en una muestra vegetal de hojas de espinaca.
 Se consiguió extraer una muestra vegetal de calidad media ya que las hojas se
encontraban un poco mojadas y eso genero la formación de cristales y esto
provoco que no se pueda triturar completamente las hojas.
 Se identificó las etapas del proceso de extracción de DNA respetando el tiempo de
cada una de ellas, ya que la muestra puede dañarse o en el caso del lavado,
desperdiciarse.
 El cloroformo ayuda a la remoción de lípidos, es por ellos que al colocarlo en los
tubos, se observa la separación de tres fases.

8. RECOMENDACIONES
 Cuando se procede a obtener el polvo del material genético, se debe tomar en
cuenta el cambio de coloración ya q esto indica que se produce oxidación
(coloración verde oscuro).
 Es recomendable utilizar muestras de hojas bien secas, frescas y sin tallos, para
lograr triturarlas completamente y evitar la formación de cristales.

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 En el proceso de lavado el ADN se muestra en forma lechosa, esta debe estar
adherida a las paredes del tubo y no deslizarse, en caso de no presentar esa
textura se debe realizar nuevamente la centrifugación.
 Medir y colocar correctamente los volúmenes necesarios de reactivos,
especialmente al momento de pipetear.
 Procurar optimizar y evitar desperdiciar la muestra durante los procesos de lavado
o cambio de envase.

9. ANEXOS

 Cuestionario

I. Cuál es la función que cumple el DNA Zol Reagent?


El DNA Zol es un completo reactivo listo para usarse para el aislamiento de ADN
genómico o viral de muestras sólidas y líquidas de animal, humano y origen vegetal. El
procedimiento se basa en el uso de una innovadora solución de lisis guanidina –
detergente que hidroliza el ARN y promueve la precipitación selectiva del ADN de la célula
lisada (1, 2). Este método de aislamiento de ADN avanzado combina fiabilidad y eficacia
con la sencillez de un protocolo de aislamiento rápido (Chomczynski, 2013).
Tipos de DNA Zol:
 DNA Zol: se lo utiliza para muestras como células, tejidos y muestras
líquidas
 DNA Zol ES: se lo utiliza específicamente para muestras de DNA de
plantas.
 DNA Zol BD: se lo usa específicamente para muestras de DNA genómico o
viral de sangre.
(Chomczynski, Mackey, Drews, & Wilfinger, 1997)

II. Con qué otros reactivos se puede realizar extracción de DNA y describa
brevemente un protocolo? Con qué otros reactivos se puede realizar
extracción de DNA y describa brevemente un protocolo?

 Descripción Protocolo de (Poresbski, et al; 1997): Extraction protocol for


plants containing high polysaccharide and polyphenol component.

- Tomar el material vegetal (50 mg de tejido seco) y triturarlo en un mortero con ayuda
de nitrógeno líquido.
- Macerar con 5 mg de PVP hasta tener un polvo final.
- Añadir 500 uL de buffer de extracción: 100 mM Tris.Cl pH 8,0; 1.4M NaCl, 20 mM
EDTA pH 8.0; CTAB 0.2%; 2b-mercaptoetanol 0,3% a 65 °C y volver a macerar la
muestra en el mismo mortero.
- Posteriormente se toma la mezcla y se la coloca en tubos eppendorf de 1.5 ml
estériles con la ayuda de espátulas de polipropileno también estériles.
- Incubar en baño maría a 65 °C por 1 hora, con agitación cada 20 minutos.
- Terminada la lisis dejar enfriar cada tubo por 5 minutos.
- Añadir un volumen de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), mezclarlo por 5 minutos.
- Centrifugar la mezcla a 5000 rpm por 10 minutos.
- Trasladar el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf.
- Repetir la purificación por CIA hasta no tener interfase después de la centrifugación.
- Añadir la mitad del volumen de NaCl 5M y 2 volúmenes de etanol frío al 90%.
- Centrifugar a 5000 rpm por 20 minutos.

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- Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol frío al 70%.
- Dejar secar durante 20 minutos.
- Re suspender en TE a 4 °C durante toda la noche.
- Añadir 3 ul de RNA (10 mg/ul).
- Incubar en baño maría durante 30 minutos a 37 °C, al término del mismo añadir 3 ul
de proteinasa K e incubar a 37 °C por treinta minutos más.
- Colocar fenol-cloroformo-isoamílico (25:24:1) y centrifugar a 5000 rpm por 20 minutos.
- Pasar el sobrenadante a un eppendorf estéril y añadir la décima parte del volumen
con Acetato de sodio 2M.
- Reposar toda la noche a -80 °C. Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos.
- Lavar el pellet con etanol frío al 70% .
- Re suspender con 200 – 300 ul de TE.
- Almacenar a -20 °C.

Tris EDTA (etilen


(hidroximetil diamino
amino): Buffer tetracético):
Biológico, agente quelante
mantiene el ph que captura
de la solución iones de
entre 7-8 Magnesio

Alcoholes:
B-
etanol,
Mercaptoetanol
isopropanol:
: destruye los
permiten que se
puentes disulfuro
precipite el DNA.

Otros reactivos
utilizados en la
extracción de DNA
(Zárate, 2008)
PVP (Polivinil
porrolidona):
detergente NaCl y KCl:
capaz de estabilizan las
eliminar cargas Iónicas
compuesto
fenólicos

CTAB
(Hexadecil
Cloroformo:
trimetil
solvente
bromuro de
orgánico capaz
amonio):
de eliminar
Solubiliza
Sarkosil (Laurel lípidos
polisacáridos y
sarcosina):
membranas
Detergente que
inhibe
hexoquinasas y
buen solvente.

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III. ¿Por qué es importante mantener a temperatura ambiente el DNA Zol
Reagent?

Para poder mantener estable el reactivo DNA Zol debe conservarse en una temperatura
entre 15 y 30 °C; esta temperatura es aproximadamente la promedio en temperatura
ambiente. Por ende si se conserva el reactivo a temperaturas mayores o menores a las ya
mencionadas, va a generar que la estructura y los componentes del DNA Zol se
deterioren, haciendo que pierda su eficiencia y estabilidad. (Traverso, 2005) Además este
reactivo es capaz de mantener muestras de DNA por largos periodos de tiempo de hasta
máximo un año.(Chomczynski, Mackey, Drews, & Wilfinger, 1997).

10. BIBLIOGRAFÍA
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