INFORME DE LABORATORIO
2. OBJETIVOS:
Objetivo General.
- Extraer ADN a partir de una muestra vegetal (hoja de espinaca – Spinacia
Olerasea).
Objetivos Específicos
- Identificar y familiarizarse con el correcto procedimiento para una extracción
de ADN, utilizando la técnica de DNA Zol Reagent.
- Obtener y preparar correctamente una muestra (vegetal) suficiente y de calidad
para utilizarla en el proceso de extracción de ADN.
- Conocer y diferenciar las funciones y características de los diferentes tipos de
reactivos y materiales que se utilizan durante la extracción de ADN.
4. MATERIALES Y MÉTODOS:
Materiales
Metodología:
Preparación de la muestra:
o Se colocó las hojas de espinaca en el mortero (sin tallos).
o Se agregó nitrógeno líquido en el mortero y se procedió a macerar las
hojas hasta pulverizarlas.
o Se tomó un poco de muestra y se colocó en el tubo eppendorf.
Lisis y homogenización:
o Se añadió 1mL de DNA Zol por cada 25-50 mg de muestra.
o Se mezcló a fondo con la ayuda de un pistilo.
o Se incubo por 5 -10 minutos a temperatura ambiente mezclando por
inversión.
o Se añadió 300 uL de cloroformo.
Centrifugación:
o Se centrifugo por 10 minutos a 10000 rpm a 4°C
o Se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf.
Precipitación:
o Se precipito el sobrenadante 0,5 mL con etanol 100% por 1Ml de DNA
Zol.
o Se mezcló por inversión y se dejó reposar por 3 minutos.
o Se eliminó nuevamente el sobrenadante, dejando únicamente el DNA.
Lavado:
o Se lavó el precipitado 2 veces con 1 mL de etanol 95%
o En cada lavado se invirtió el tubo de 3-6 veces.
o Se almacenó lo tubos eppendorf en forma vertical para precipitar el
DNA y se eliminó el etanol.
Suspensión:
o Se dejó secar el DNA a temperatura ambiente por unos 3 minutos.
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Se disolvió el pellet en buffer TE, agitándolo con una punta para que se
o
homogenice.
5. RESULTADOS Y OBSERVACIONES:
A) Lisis y Homogenización:
Foto 1: Recipiente de nitrógeno líquido y Foto 2: Se coloca el nitrógeno líquido Foto 3: Triturando rápidamente las
hojas de espinaca en mortero. en el mortero con las hojas de hojas de espinaca.
Tomada por: Myriam Abad espinaca. Tomada por: Myriam Abad
Tomada por: Myriam Abad
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B) Centrifugación:
Foto 7: Se centrifugó los Foto 8: Fases obtenidas después de la Foto 9: Se extrajo el sobrenadante
tubos eppendorf. centrifugación del tubo eppendorf. obtenido de la centrifugación.
Tomada por: Nathaly Cruz Tomada por: Myriam Abad Tomada por: Myriam Abad
C) Precipitación:
Foto 10: Se colocó el sobrenadante en Foto 11: Se colocó etanol 100% al Foto 12: Se centrifugó una segunda vez
otro tubo eppendorf tubo con el sobrenadante. y se obtuvo el precipitado
Tomada por: Nathaly Cruz Tomada por: Nathaly Cruz Tomada por: Myriam Abad
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D) Lavado:
Foto 13: Se eliminó la parte líquida Foto 14: Se colocó etanol al 95% en Foto 15: Se centrifugó los tubos
del tubo eppendorf, procurando el tubo eppendorf eppendorf.
dejar solamente el pellet. Tomada por: Nathaly Cruz Tomada por: Myriam Abad
Tomada por: Myriam Abad
E) Suspensión:
Foto 16: Se dio la vuelta el tubo Foto 17: Se añadió el buffer TE al tubo seco Foto 18: Se homogenizo con
eppendorf y dejo secar Tomada por: Myriam Abad la micropipeta.
Tomada por: Nathaly Cruz Tomada por: Nathaly Cruz
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6. DISCUSIÓN
La obtención de DNA íntegro y puro es una parte fundamental para el buen desempeño
de las técnicas utilizadas en Biología Molecular (Tang et al. 2005, Wang et al. 2005). En la
práctica realizada se extrajo el DNA de espinaca con un protocolo específico para este
procedimiento, pero además de plantas se puede extraer DNA de animales, algunas
bacterias y virus, en los cuales se aplica una metodología o un método diferente, por ende
es muy importante conocer a que organismo se le extraerá DNA y que protocolo se debe
usar para este, si es un método tradicional o un método en el cual usamos kits de
extracción.
Una de las ventajas de utilizar métodos tradicionales es su bajo costo, así como un alto
rendimiento. Sin embargo, en ocasiones el material obtenido está fragmentado. Estos
métodos son susceptibles de contaminación, variación y errores por los múltiples pasos
de manipulación (Störmer et al. 2007). El rendimiento de los kit de extracción depende de
la calidad de la muestra extraída, la cantidad de muestra tomada, y la capacidad que
tienen las membranas para unirse a los reactivos.
7. CONCLUSIONES
8. RECOMENDACIONES
Cuando se procede a obtener el polvo del material genético, se debe tomar en
cuenta el cambio de coloración ya q esto indica que se produce oxidación
(coloración verde oscuro).
Es recomendable utilizar muestras de hojas bien secas, frescas y sin tallos, para
lograr triturarlas completamente y evitar la formación de cristales.
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En el proceso de lavado el ADN se muestra en forma lechosa, esta debe estar
adherida a las paredes del tubo y no deslizarse, en caso de no presentar esa
textura se debe realizar nuevamente la centrifugación.
Medir y colocar correctamente los volúmenes necesarios de reactivos,
especialmente al momento de pipetear.
Procurar optimizar y evitar desperdiciar la muestra durante los procesos de lavado
o cambio de envase.
9. ANEXOS
Cuestionario
II. Con qué otros reactivos se puede realizar extracción de DNA y describa
brevemente un protocolo? Con qué otros reactivos se puede realizar
extracción de DNA y describa brevemente un protocolo?
- Tomar el material vegetal (50 mg de tejido seco) y triturarlo en un mortero con ayuda
de nitrógeno líquido.
- Macerar con 5 mg de PVP hasta tener un polvo final.
- Añadir 500 uL de buffer de extracción: 100 mM Tris.Cl pH 8,0; 1.4M NaCl, 20 mM
EDTA pH 8.0; CTAB 0.2%; 2b-mercaptoetanol 0,3% a 65 °C y volver a macerar la
muestra en el mismo mortero.
- Posteriormente se toma la mezcla y se la coloca en tubos eppendorf de 1.5 ml
estériles con la ayuda de espátulas de polipropileno también estériles.
- Incubar en baño maría a 65 °C por 1 hora, con agitación cada 20 minutos.
- Terminada la lisis dejar enfriar cada tubo por 5 minutos.
- Añadir un volumen de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), mezclarlo por 5 minutos.
- Centrifugar la mezcla a 5000 rpm por 10 minutos.
- Trasladar el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf.
- Repetir la purificación por CIA hasta no tener interfase después de la centrifugación.
- Añadir la mitad del volumen de NaCl 5M y 2 volúmenes de etanol frío al 90%.
- Centrifugar a 5000 rpm por 20 minutos.
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- Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol frío al 70%.
- Dejar secar durante 20 minutos.
- Re suspender en TE a 4 °C durante toda la noche.
- Añadir 3 ul de RNA (10 mg/ul).
- Incubar en baño maría durante 30 minutos a 37 °C, al término del mismo añadir 3 ul
de proteinasa K e incubar a 37 °C por treinta minutos más.
- Colocar fenol-cloroformo-isoamílico (25:24:1) y centrifugar a 5000 rpm por 20 minutos.
- Pasar el sobrenadante a un eppendorf estéril y añadir la décima parte del volumen
con Acetato de sodio 2M.
- Reposar toda la noche a -80 °C. Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos.
- Lavar el pellet con etanol frío al 70% .
- Re suspender con 200 – 300 ul de TE.
- Almacenar a -20 °C.
Alcoholes:
B-
etanol,
Mercaptoetanol
isopropanol:
: destruye los
permiten que se
puentes disulfuro
precipite el DNA.
Otros reactivos
utilizados en la
extracción de DNA
(Zárate, 2008)
PVP (Polivinil
porrolidona):
detergente NaCl y KCl:
capaz de estabilizan las
eliminar cargas Iónicas
compuesto
fenólicos
CTAB
(Hexadecil
Cloroformo:
trimetil
solvente
bromuro de
orgánico capaz
amonio):
de eliminar
Solubiliza
Sarkosil (Laurel lípidos
polisacáridos y
sarcosina):
membranas
Detergente que
inhibe
hexoquinasas y
buen solvente.
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III. ¿Por qué es importante mantener a temperatura ambiente el DNA Zol
Reagent?
Para poder mantener estable el reactivo DNA Zol debe conservarse en una temperatura
entre 15 y 30 °C; esta temperatura es aproximadamente la promedio en temperatura
ambiente. Por ende si se conserva el reactivo a temperaturas mayores o menores a las ya
mencionadas, va a generar que la estructura y los componentes del DNA Zol se
deterioren, haciendo que pierda su eficiencia y estabilidad. (Traverso, 2005) Además este
reactivo es capaz de mantener muestras de DNA por largos periodos de tiempo de hasta
máximo un año.(Chomczynski, Mackey, Drews, & Wilfinger, 1997).
10. BIBLIOGRAFÍA
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