Bibliografía:
Yu G, Fadrosh D, Goedert JJ, Ravel J, Goldstein AM. (2015). Nested PCR Biases in
Interpreting Microbial Community Structure in 16S rRNA Gene Sequence Datasets.
PLOS ONE 10(7): e0132253. doi:10.1371/journal.pone.0132253
PCR múltiplex-Touchdown para detectar simultáneamente Cryptosporidium
parvum, Giardia lamblia y Cyclospora cayetanensis, las causas principales de la
diarrea del viajero
Una de las enfermedades más comunes y de mayor tasa de ataque en un viaje es la diarrea
del viajero (TD). Los patógenos que la causan TD provocan síntomas como heces sueltas
urgentes, dolor abdominal y fiebre. Puede provocarse por bacterias, virus, así como
parásitos protozoarios transmitidos por el agua. Estos últimos han sido causantes de los
brotes endémicos en algunos países, en particular Cryptosporidium parvum, Giardia
lamblia y Cyclospora cayetanensis ya que no pueden ser curados con los tratamientos
antimicrobianos estándar. Por lo que, este estudio tuvo como objetivo desarrollar un
método de PCR multiplex simultáneo para detectar 3 especies de parásitos protozoarios
a base de agua (C. parvum, G. lamblia y C. cayetanensis) causantes de TD.
Para el análisis del ADN se adquirieron ooquistes de C. parvum, quistes de G. lamblia y
ARNr 18S para C. cayetanensis. Se adquirió también muestras de heces fecales. El ADN
se extrajo utilizando un kit de sangre y tejido DNeasy con un proceso repetido de
congelación y descongelación (6 ciclos de 95 ° C durante 1 minuto y nitrógeno líquido
durante 30 segundos). El ADN purificado se eluyó con 20 μl de tampón y se almacenó a
-20ºC. Los cebadores de PCR de diagnóstico se diseñaron para amplificar los segmentos
de genes de la proteína de la pared del ooquiste de Cryptosporidium (COWP), el gen de
la glutamato deshidrogenasa (gdh) para G. lamblia, y el gen del ARN ribosómico 18S
(18S rRNA) para C. cayetanensisfueron.
Para el proceso de PCR se utilizó ADN (1-3 μl), 15 μl de Taq Polimera, y 5 μl de la
mezcla de primers y agua destilada hasta un volumen total de 30 μl. El programa de
amplificación por PCR múltiplex-touchdown consistió en 5 minutos a 95°C para la
desnaturalización previa, 20 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 30
segundos, annealing a 65°C (con disminuciones de 0,2°C desde 65°C a 61,2°C en cada
ciclo) durante 40 segundos, y la extensión a 72°C durante 1 minuto. Esto fue seguido por
otros 25 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 30 segundos, annealing a 61,2 ° C
durante 40 segundos y extensión a 72 ° C durante 1 minuto. La reacción se terminó con
una extensión final durante 5 minutos a 72 ° C. Los productos de PCR fueron
fotografiados con transiluminación UV después de cargar con agarosa al 2%.
Se obtuvo como resultado que, el tamaño de amplicón para cada parásito fue de 555 pb
(C. parvum), 188 pb (G. lamblia) y 400 pb (C. cayetanensis). Cada amplicón exhibió un
100% de similitud con accesiones a la base de datos de GenBank (AB089292, KJ499992y
AB111183). Al analizar los cebadores en mezcla se observó que no hubo ninguna
reactividad cruzada. Los resultados expuestos dan a conocer que el protocolo de PCR
múltiple a más de no tener reacciones cruzadas fue capaz de proporcionar fragmentos
muy específicos para cada especie, por lo que, en un análisis rápido estas especies podrían
ser caracterizadas y dar a conocer el origen de la TD. Se puede concluir que el protocolo
presentado ha demostrado una elevada la capacidad de diagnóstico simultáneo de
múltiples protozoos en muestras de heces. Sin embargo, hay que tomar en cuenta que este
estudio se limita a tres especies, por lo que es importante realizar más investigaciones
para determinar un tratamiento de ser posible con todos los patógenos causantes de esta
enfermedad.
Bibliografía:
Shin, J.-H., Lee, S.-E., Kim, T. S., Ma, D.-W., Chai, J.-Y., & Shin, E.-H. (2016). Multiplex-
Touchdown PCR to Simultaneously Detect Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, and
Cyclospora cayetanensis, the Major Causes of Traveler’s Diarrhea. The Korean Journal of
Parasitology, 54(5), 631–636. http://doi.org/10.3347/kjp.2016.54.5.631
Retos para diseñar y desarrollar aptámeros de ADN para los objetivos de
proteínas. Optimización de la PCR asimétrica para la generación de una biblioteca
de ADN de una sola hebra
Debido a su alta especificidad, adaptabilidad y facilidad de modificación, los aptámeros
se han utilizado en una amplia gama de aplicaciones, incluida la purificación por afinidad,
el descubrimiento de fármacos, el cribado de alto rendimiento, la administración de
fármacos, los diagnósticos médicos y los biosensores. La obtención de aptámeros se da
por un proceso experimental en el que se usan secuencias aleatorias de ARN o ADN como
punto de partida y las secuencias particulares de ácidos nucleicos con mayor afinidad por
un objetivo son aisladas, este proceso se denomina SELEX (evolución sistemática de
ligandos por enriquecimiento exponencial). Este estudio tiene como objetivo diseñar una
biblioteca de ADN aleatoria para una mayor selección de aptámeros y amplificar la
biblioteca mediante PCR asimétrica, evaluando la influencia de factores como la
temperatura de annealing, el número de ciclos de amplificación y la concentración
de Mg2 +.
Para esto se utilizó un cocktail de PCR que incluye la Taq polimerasa de ADN (5 U/ml),
buffer 10x (KCl 500 mM y Tris-HCl 200 mM, pH 8,4) y MgCl2 (100 mM), una biblioteca
de ADN de cadena sencilla al azar, primers forward y reverse 1 μM en proporción 5:1,
buffer TAE 10x, EDTA 1 mM, y agua purificada, todo a un volumen de 30 μL.
Para la PCR asimétrica se utilizó un molde de ADN al azar de secuencia 5'-
GGTGTTACTCTTCATGTGGATCCG(N30)AGAATTCAGCACCCTAGCCTCGT-3'.
Los primers fueron F: 5'-GGTGTTACTCTTCATGTGGATCCG-3 'y R: 5'-
ACGAGGCTAGGGTGCTGAATTCT-3'. Se usaron 5 ng de ADN al azar como molde
de partida. El programa de termociclador fue: desnaturalización inicial a 95°C durante 3
min, desnaturalización a 95°C durante 30 segundos, annealing del primer a varias
temperaturas por 45s, extensión a 72°C por 30 s y extensión final a 72°C durante 5 min.
Los productos de amplificación se cargaron en gel de agarosa al 3% y se corrió a 70 V
durante 30 minutos a temperatura ambiente, usando una cámara horizontal.
Tras realizar el enriquecimiento y electroforesis se analizó el efecto de la temperatura de
recocido en productos de PCR. Se llevaron a cabo una serie de procesos de amplificación
a diferentes temperaturas de hibridación que varían de 60°C a 70°C en una manera de
PCR de gradiente, siendo la temperatura de annealing óptima 65°C para ambos cebadores.
La concentración de cloruro de magnesio se analizó a diferentes concentraciones: 0,25
mM a 2 mM, siendo 0,5-1,0 mM lo óptimo. Para examinar el efecto de este factor, se
realizaron reacciones de PCR asimétricas en diferentes ciclos de amplificación, de 15 a
45 ciclos por intervalos de 10 ciclos. Después de 25 ciclos de amplificación, se detectaron
productos no específicos en el gel. Gracias a lo descrito se pudo concluir que, la necesidad
de encontrar una metodología óptima para la producción de aptámeros es necesaria pues
éstos han atraído mucha atención debido a su capacidad para unirse a moléculas diana
con alta afinidad y especificidad. SELEX ejecuta el aislamiento de aptámeros con alta
afinidad para un objetivo específico, siendo el paso más importante y crítico en este
proceso de ingeniería la conversión de dsDNA a ssDNA, siempre tomando en cuenta los
factores que afectan el proceso de enriquecimiento. Entre las diversas técnicas
desarrolladas para este proceso, la PCR asimétrica presenta mayor factibilidad económica
y de rendimiento.
Bibliografía:
Tabarzad, M., Kazemi, B., Vahidi, H., Aboofazeli, R., Shahhosseini, S., & Nafissi-Varcheh, N.
(2014). Challenges to Design and Develop of DNA Aptamers for Protein Targets. I.
Optimization of Asymmetric PCR for Generation of a Single Stranded DNA Library. Iranian
Journal of Pharmaceutical Research : IJPR, 13(Suppl), 133–141.