Anda di halaman 1dari 13

BAB I

PENDAHULUAN
A. Latar Belakang

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah proses penggandaan DNA secara in


vitro dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA
target.PCR menggunakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara
enzimatik tanpa menggunakan organisme.Reaksi PCR dibantu oleh enzim polimerase dan
oligonukleotida yang berperan sebagai primer dan terjadi dalam thermocycler. Primer terbagi
dua yaitu primer forward (primer yang berada sebelum target) dan primer reverse (primer
yang berada setelah target). Antar primer terdapat puluhan hingga ribuan nukleotida yang
menandakan panjang target DNA. Selain enzim polimerase, dibutuhkan dNTPs yang terbagi
dATP (nukleotida berbasis Adenin), dCTP (nukleotida berbasis Sitosin), dGTP (nukleotida
berbasis Guanin) dan dTTP (nukleotida berbasis Timin) (Muladno 2002).

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan


atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara
lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA
dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp) (Dwidjoseputro 1998).

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi
melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin
rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan
membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar
(DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di
bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan
larutan etidium bromida. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di
dalam larutan etidium bromida sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet (Dwidjoseputro
1998).

B. Tujuan Praktikum:
1. Memahami metode isolasi DNA
2. Memahami bahwa DNA dapat diperoleh dari jaringan apapun yang memiliki inti sel
3. Mampu melakukan isolasi DNA sesuai prosedur dengan menggunakan sampel DNA
4. Memahami prinsip dasar PCR dan Elektroforesis Agarose

1
5. Memahami dan dapat melakukan teknik PCR menggunakan DNA manusia.
6. Menggunakan alat elektroforesis dengan benar untuk membaca nilai base pair
fragment DNA
7. Mengolah data yang diperoleh dari praktikum untuk memperoleh base pair
fragmentDNA
8. Mengumpulkan data dari hasil praktikum

C. Manfaat Praktikum :

PCR banyak digunakan untuk berbagai tujuan, misalnya mendiagnosis penyakit


keturunan (penyakit genetik), mendeteksi keberadaan penyebab penyakit infeksi seperti
bakteri dan virus, mempelajari evolusi manusia, forensik dan lain sebagainya. Polymerase
Chain Reaction atau sering disingkat sebagai PCR adalah suatu teknik perbanyakan materi
genetik baik DNA yang terdapat pada kebanyakan mikroorganisme penyebab penyakit
maupun RNA yang terdapat pada virus tertentu seperti virus imunodefisiensi manusia (HIV,
penyebab AIDS) dan virus hepatitis C (HCV, penyebab hepatitis C). Karena kemampuan
PCR untuk memperbanyak jumlah materi genetik sangat tinggi, maka PCR dapat digunakan
untuk mendeteksi keberadaan materi genetik dengan jumlah sangat rendah dalam suatu
spesimen atau sampel. PCR terdiri atas beberapa siklus dimana pada setiap siklus terjadi
penggandaan materi genetik dan jika siklus ini dilakukan berulang-ulang, maka materi
genetik yang diperoleh akan menjadi banyak sehingga mempermudah deteksi keberadaannya.
Secara umum, PCR dilakukan sebanyak 25 – 35 siklus.
Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari
produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat
disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat
diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog dari
spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger printing,
mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu,
mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas
gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan
sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui
variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat
molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA
yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar

2
individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid
DNA

3
BAB II

PEMBAHASAN DAN HASIL PENGAMATAN

Sebelum melakukan elektroforesis, terlebih dahulu diawali dengan isolasi DNA dan
PCR terhadap sampel. Perlakuan yang dilakukan pada sampel saat pada PCR adalah :

1. Pre-denaturasi pada suhu 95oC selama 3 menit.


2. Diikuti dengan 30 siklus :
a. Denaturasi selama 30 detik pada suhu 95oC
b. Annealing selama 30 detik pada suhu 50oC
c. Extension atau elongasi selama 2 menit pada suhu 72oC
3. Perpanjangan tambahan pada akhir siklus selama 10 menit pada 72oC

Setelah PCR berlangsung kemudian dilanjutkan mengambil sampel dari tabung dengan
untuk dilakukan elektroforesis pada agarose. Hal ini bertujuan untuk mengecek keberhasilan
dari PCR.

Pada penggunaan agar-agar untuk eletroforesis agarose, agar-agar yang digunakan tidak
boleh terlalu panas saat dituang ke dalam cetakan karena jika terlalu panas cetakan akan
retak-retak dan agar-agar juga tidak boleh terlalu dingin karena agar-agar akan mengental dan
tidak dapat menjadi sumur. Saat menuang agar-agar ke dalam cetakan yang harus
diperhatikan adalah gelembung udara karena tidakboleh ada gelembung udara pada saat
mencetak agar-agar. Jika ada gelembung udara maka akan menghambat aliran listrik pada
saat elektoforesis.

Pada saat melakukan elektroforesis tahap pertama yang dilakukan adalah mengisi
masing-masing sumur, dimana setiap agar-agar harus diisi dengan marker dan sampel DNA.
Untuk sampel digunakan pewarna berupa loading buffer dan DNA tersebut dijadikan satu di
atas parafilm kemudian dimasukkan ke dalam masing-masing sumur. Setelah marker negatif
dan sampel DNA diisi pada setiap sumur,arus dijalankan pada elektroforesis. Adanya arus
dapat diketahui dari gelembung gas yang keluar dan arus berlangsung dari negatif ke
positif.Reaksi elektroforesis ini berlangsung selama 30 menit. Setelah itu, stop mesin
elektroforesis dan angkat gel tersebut. Rendamlah gel atau agar-agar di dalam larutan EtBr
(Ethidium bromida) selama 20 menit. Angkat gel tersebut dan rendam dalam akuades
selama 10 menit untuk mencuci kelebihan EtBr. Karena EtBr bersifat karsinogenik,

4
gunakanlah sarung tangan atau sendok plastik saat mengambil gel kemudian letakkan di
bawah sinar UV (transliminator) untuk melihat pita DNA yang terbentuk.

5
TAHAPAN PRAKTIKUM
I. Isolasi DNA
II. PCR
III. Elektroforesis

Bahan PCR
1. 12,5 µl Master Mix
2. 2 µl Forward Primers (920 F) (10 pmol/µl)
3. 2 µl Reverse Primers (1400R) (10 pmol/µl)
4. 6,5 µl Aquades (air steril)
5. 2 µl Deoxyribonucleic Acid (DNA)
6. Secukupnya Es Batu

Alat PCR
1. Tabung PCR 200 mikro liter (atau PCR tertentu menggunakan 500 mikro liter)
2. Pepetman 0.5- 10 mikro liter dan 10-200 mikroliter dengan tip- nya
3. Pengaduk Homogen (Centrifugasy)
4. Alat PCR (Termocycle)

Cara Kerja PCR


1. Ke dalam tabung PCR (0.2 ml PCR tube) dimasukkan semua bahan sesuai jumlah
yang telah diperhitungkan.
2. Selama proses pemasukkan semua bahan dalam tabung, setiap bahan harus diletakkan
pada tempat yang dingin agar reaksi enzimatis tidak terjadi.
3. Setelah seluruh bahan mix master dan DNA template dimasukkan dalam tabung,
maka bahan-bahan tersebut diaduk di Centrifugasy yang membuat seluruh larutan
menjadi homogen.
4. Setelah semua bahan menjadi homogen maka campuran tersebut dimasukkan ke
dalam alat PCR atau biasa disebut termocycle. Pada tahap ini terjadi proses sebanyak
30 siklus dan waktu yang digunakan adalah 2 ½ jam. Tahap- tahap tersebut
melingkupi
a Pre- Denaturasi selama 3 menit pada suhu 95oC
b 30 siklus berikutnya:
 Denaturasi selama 30 detik dengan suhu 95oC
6
 Annealing selama 30 detik pada suhu 50oC
 Extension selama 2 menit pada suhu 72oC
c. Perpanjangan pada tahap akhir siklus selama 10 menit pada suhu 72oC
5. Kemudian setelah melewati tahap PCR ini, maka sampel dari tabung sebanyak 5µl
akan diuji melalui tahap elektroforesis pada agarose 1% sehingga dapat diketahui
hasil yang diharapkan.

Bahan Elektroforesis
1. Agarose 1%
2. DNA hasil isolasi/PCR
3. Loading Buffer (buffer yang digunakan pada saat memasukkan sampel ke dalam gel,
biasanya berisi zat warna dan mengandung gliserol agar DNA tidak menyebar diatas
gel)
4. Buffer Tris- Asam asetat EDTA (TAE:1 kali strength)
5. Ethidium Bromida (EtBr)
6. Aquades

Alat Elektroforesis
1. Elektroforesis set (Chamber, sisir untuk membuat gel, cetakan gel, power supply)
2. Pipetman 10 mikro liter dengan tipnya.
3. Parafilm
4. Arus listrik
5. Sarung tangan
6. Transluminator (lampu UV)
7. Kamera

Cara Kerja Elektroforesis


1. Timbang agarose 1 g dan tambahkan 100 ml buffer TAE IX
2. panaskan agarose sampai larut dengan sempurna dalam mikrowave
3. Cor agarose pada cetakkan yang standar digunakan. Sebelum agarose memadat
letakkan comb untuk mencetak sumuran.
4. angkat sisir (untuk membuat sumur sample) ke arah vertikal secara perlahan – lahan.

7
5. Masukkan ke dalam chamber elektroforesis yang elah diisi TAE Buffer IX, dengan
permukaan larutan buffer 2-3 mm diatas agar. Perhatikan jangan sampai ada
gelembung udara dibawah cetakan (tray) agarose karena kan menghambat aliran
listrik pada saat elektroforesis.
6. Pipet suspensi DNA (1-2 mikro liter), tergantung dari konsentrasi DNA. Biasanya
DNA akan di isolasi dari 1.5 ml kulture cair, dan DNA akhir di larutkan dalam 1
mikro liter buffer TE, di ambil sebanyak 3-5 mikro liter menghasilkan pita DNA yang
bagus. Terlalu banyak DNA akan memberikan pita yang terlalu tebal dan terkadang
smear (fuzzy).
7. Teteskan di atas parafilm yang bersih dan tambahkan dengan loading buffer (agar
DNA tidak menyebar di atas permukaan agar). Loading buffer di buat 6x strength,
sehingga 1 mikro liter loading buffer ditambah 5x volume DNA. Berikut urutan DNA
dan ukuran loading buffer yang digunakan :
a. DNA 6, diambil pada ukuran 5µl masuk ke dalam loading buffer dan diambil
kembali dengan ukuran 6µl.
b. DNA 8, diambil pada ukuran 5µl masuk ke dalam loading buffer dan diambil
kembali dengan ukuran 6µl.
c. Marker sebagai DNA leader, diambil pada ukuran 3µl masuk ke dalam
loading buffer dan diambil kembali dengan ukuran 4µl.
d. DNA 34, diambil pada ukuran 5µl masuk ke dalam loading buffer dan diambil
kembali dengan ukuran 6µl.
e. DNA 52, diambil pada ukuran 5µl masuk ke dalam loading buffer dan
diambil kembali dengan ukuran 6µl.
8. Masukkan sampel secara vertikal tepat di dalam sumur gel. Lakukkan hati- hati agar
sampel tidak menyebar di atas agarose.
9. Hubungkan tangki elektroforesis dengan sumber arus. Kutub negatif pada sisi yang
dekat dengan sumuran. Hidupkan sumber arus dengan voltase konstan. Elektroforesis
dilakukan selama 30 menit.
10. Stop mesin elektroforesis dan angkat gel.
11. Rendam dalam larutan ethidum bromida (konsentrasi 5 mikro gr/ml) dalam buffer IX
TAE selama 10 menit.
12. Angkat gel dengan menggunakan sarung tangan (EtBr bersifat karsinogenik) dan
rendam dalam aquades selama 10 menit (destaining agar kelebihan EtBr tercuci.

8
13. Pita yang terbentuk dapat terlihat di bawah sinar UV (trasliminator) dan selanjutnya,
hasil akan difoto dengan kamera.

9
BAB III
PENUTUP
Simpulan

1. Teknologi PCR digunakan untuk memperbanyak sampel DNA.


2. Marker yang hasil dari elektroforesis bertumpuk diakibatkan karena saat memasukkan
marker ke dalam sumur kurang hati-hati dan mungkin diakibatkan karena kurangnya
waktu saat elektroforesis.

PCR merupakan teknik perbanyakan DNA secara in vitro. Terdapat beberapa


komponen dalam PCR diantaranya enzim Taq polymerase, primer, dNTP dan larutan
penyangga (buffer). Sedangkan beberapa tahap dalam PCR yaitu pradenaturasi,
denaturasi, annealing dan extension. Kelompok kami berhasil melakukan teknik PCR
koloni karena terdapat pendaran.

Saran

a. Saat praktikan mengisolasi DNA lebih diperhatikan oleh survervisor atau petugas
laboratorium sehingga kesalahan dalam pengerjaan prosedur dapatdikurangi dan
DNA diperoleh dengan benar.
b. Peralatan yang digunakan untuk praktikum sebaiknya ditambah sehingga
memudahkan untuk pengerjaan praktikum dan praktikan juga lebih memahami proses
praktikum.

10
DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Penerbit Djambatan


Muladno. 2002. Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha Muda

11
LAMPIRAN
DAFTAR GAMBAR

12
13