20.

0 PENENTUAN KADAR ASAM OXALAT DALAM EKSTARAKSI

PELARUT TEPUNG WIJEN
20.1 : peralatan
- Waring Blender
20.2 : Reagen
1. Asam hidroklori encer (1+1)
2. Larutan ammonium hidroksida –sp gr 0.880
3. Pelarut tungstate fosfat (larutkan 24gm natrium tungstate dalam air, tambahkan 40 ml
asamfosfatmanis (sp. 1,75) dan ecerkan larutan menjadi 1 L).
4. larutan buffer kalsiumklorida (larutkan 25 gm kalsium klorida anhidrat dalam 500 ml
asam asetat glasial 50% kemudian tambahkan larutan ini kedalam 530 gm natrium asetat
dan ecerkan dalam 500 ml air.
5. Larutan cuci (larutan asam asetat 5% ditambahkan kalsium oksalat dan disimpan dalam
suhu kamar, kocok larutan secara berkala sebelum digunakan)
6. larutan asam sulfat 10%
7. larutan kalium permanganate 0,02 N
8. alkohol kapril
20.3 Prosedur kerja
6 gm sampel dihomogenkan dengan 100 ml air dalam blender kemudian pindah
kancampuran tersebut kegelas ukuran 600 ml dengan jumlah minimum pencucian.
Tambahkan 2 volume dil HCl kesetiap 10 volume cairan (untuk konsentrasi normal) dan
satu atau dua tetes alcohol kapril dan didihkan selama 15 menit. Biarkan dingin, kemudian
pindahkan kelabu volumetric ukuran 500 ml, encerkan dan kocok secara berkala untuk
menandai,dan dibiarkan semalaman. Campur dan saring dengan kertas saring. Pindahkan
filtrat dengan pipet 25 ml kedalam tabung yang dilengkapi dengan sumbat, tambahkan 5
ml peraksi tungstate fosfat, aduk dangan membalik satu atau dua kali dan simpan salama 5
jam. Centrifuge selama 10 menit pada 3000 rpm. Pindahkan tepat 20 ml larutan bening
kedalam tabung sentrifus 50 ml dan tambahkan setetes ammonium hidroksida bijih dari
buret sampai larutannya basa yang ditandai oleh endapan fostotat yang terbentuk.
Tambahkan 5 ml pelarut kalsium klorida,aduk dengan batang pengaduk dan biarkan tabung
semalam di lemari es pada suhu 5-70C. centrifuge selama 10 menit, dengan hati-hati
lepaskan pencucian, larutkan endapan dalam 5 ml asam sulft 10%, letakkan tabung dalam
rendaman air pada suhu 1000C selama 2 menit dan titrasi asam oksalat dengan 0,02 N
kalium permanganate.
20.4 Perhitungan
1 mL 0.02 N Potasium Permanganat = 0.00090gm asam oksalat (Pustaka: IS) No
IS 6108 - 1971 Keterangan untuk Tepung Wijen Goreng (pelarut yang diekstraksi)
20.5: Estimasi
asam oksalat dalam pelarut tepung wijen yang diekstraksi dengan metode HPLC-
UV
20.5.1 Peralatan
Sistem HPLC analitis dilengkapi dengan detektor array Waters 996 photodiode.
Pemisahan dilakukan dengan menggunakan kartrid baja Waters Atlantis dC18 (150  4,6
mm i.d.) dengan diameter partikel 300 Å, dengan menggunakan kolom pelindung Waters
Waters (20  4.6 mm) dC18 untuk melindungi kolom analisis.
20.5.2Pelarut
1. Metanol grade gradien HPLC
2. Natrium dihidrogen fosfat (NaH2PO4) dan asam fosfat
3. Etanol
4. Standar asam cis-aconitic, fumaric, quinic, l- (+) - tartaric dan
5. Natrium piruvat
6. Ultrapure air
20.5.3 Prosedur

Campurkan sampel (kira-kira 100 gm) sampai tepung homogen. Ambil 5 sub
sampel gandum homogenisasi segar untuk mengukur pH dan keasaman. Tentukan pH (2
gm tepung dengan 50 ml air murni) dengan mengukur potensiometri pada T= 200 C dengan
pH meter (AOCA, 1990). Tentukan keasaman dengan cara titrasi dengan 0,1 N natrium
hidroksida sampai pH 8,1. Dan hasilnya dinyatakan dalam gram asam sitrat anhidrat per
kilogram. (AOAC,1990).
Penentuan asam organic dengan HPLC digabungkan dengan detector sesuai dengan
metode diode array (Hernandez Suarez et al.,2008) yang sebelumnya telah dioptimalkan.
Untuk setiap penambahan, timbang sekitar 1 gram tepung yang di homogennisasi
langsung pada tabung polypropylene dan tambahkan dengan 2 ml etanol 80%. Setelah itu,
masukkan tabung kedalam bak ultrasound padasuhu 500C selam 5 menit dan kemudian
sentrifugasi selama 5 menit pada 1090x g. dengan hati-hati mengganti supernatant untuk
mencegah kontaminasi dengan pellet kering. Kemudian. Tambahkan lagi 2 ml etanol 80%
ke pellet dan tempatkan dalam tabung dan pemukul ultrasound seperti dijelaskan diatas.
Gantikan dua supernatant di tabung yang sama. Konsentrasi fasa cair dengan
nitrogen sampai menghilangkan semua etanol; atur residu sampai 5 ml dengan air ultra
murni dan simpan di T=800C di dalam freezer.Terputusnya ikatan ini melalui filter 0,45
μm dan melalui anion-excharger yang kuat, yang sebelumnya didahului dengan 3 ml air
ultrmurni. Elute senyawa ini dengan mencuci dua fraksi 1 ml natrium dihidrogen fosfat
(NaH2PO4 =20mm= sampai pH=1). Lakukan suntikan duplikat dan gunakan daerah puncak
rata-rata untuk kuantifikasi.
 Tahap gerak natrium dihidrogen fosfat (NaH2PO4=20mm sampai pH=2,7)
 Volume injeksi 10μL dari kedua larutan standar dan ekstrak sampel
 Kecepatanalir: 0,7 ml min-1.
  Panjang gelombang :210nm Identifikasi puncak HPLC dengan membandingkan waktu
retensi dan data spektral yang diperoleh dari standar.
(Ref: Jurnal Internasional Ilmu Pangan dan Teknologi 2012, 47, 627-632) Atau Nour, V.
et al./Not. Bot. Hort. Agrobot. Cluj. Analisis Asam Organik HPLC pada Jus Citrus yang
Berbeda dalam Kondisi Fase Terbalik.38 (1) 2010, 44-48.Atau Vanda Pereira dkk.
Metodologi HPLC-DAD untuk kuantifikasi asam organik, furan dan polifenol dengan
injeksi langsung sampel anggur. J. Sep. Sci. 2010, 33, 1204-1215.

21.0 PENENTUAN GOSSYPOL BEBAS DAN TOTAL DI KAPAS EKSTRACTED

COTTON SEED FLOUR
21.1 Gossypol Gratis
21.1 Definisi
Istilah gossypol bebas mendefinisikan turunan gossypol dan gossypol pada produk biji
kapas yang larut dalam aseton berair di bawah kondisi metode ini.

21.1.2 Peralatan
(1) Pengocok mekanis untuk menampung labu Erlenmeyer 250 mL dan memberikan
goncangan kuat.
(2) Spektrofotometer mengisolasi sebuah band pada 40 nm dan dilengkapi dengan sel jalur
cahaya 1 cm atau colorimeter yang dilengkapi dengan filter yang memiliki transmitansi
maksimum antara 440 - 460 nm.
(3) Grinding mill - dengan layar 1 mm
(4) Biji kaca sekitar 6 mm diameter.
(5) Labu Erlenmeyer 250 mL, pipet, kertas saring, retensi sedang, ukuran 11 cm (Whatman
No 2 atau eqvt)
(6) Labu Volumetrik 25, 200, 250 mL, Kelas A
(7) Water bath untuk operasi pada suhu 100 ° C dilengkapi dengan penjepit untuk
mendukung 25 mL labu volumetric Bahan
(1) Pelarut
a) Aseton berair - Campur 700 mL aseton dengan 300 mL air suling.
b) Isopropil alkohol berair (2 - propanol) - Campurkan 800 mL isopropil alkohol dengan
200 mL air.
c) Anilin - disuling dengan sejumlah kecil debu Seng. Redistill bila reagen kosong melebihi
0,022 absorbansi (95% transmitansi)
(2) Larutan tiourea - Larutkan 10 gm tiourea dalam air hingga 100 mL
(3) 1,2 N HCl -Tambahkan 106 mL HCl pekat (35-37%)dengan air sampai 1 L.
(4) Gossypol - Standar primer atau asam asetat gossypol (89,61% gosipol oleh wt)
digunakan untuk kalibrasi.
(5) Larutan Gossypol Standar - dibuat dengan menimbang secara akurat gosipol standar
25 mg atau 27,9 mg asam asetat gossypol dan memindahkan secara kuantitatif ke labu
volumetrik 250 mL dengan menggunakan 100 mL aseton. Tambahkan 1 mL asam asetat
glasial, 75 mL air, encerkan ke volume yang samadengan aseton dan aduk rata. Pipet 50
mL larutan ini ke dalam labu volumetrik 200 mL, tambahkan 100 mL aseton, 60 mL air
dan encerkan. Campur dengan baik. Larutan gosipol standar ini mengandung 0,025 mg
 gosipol per mL jika sebenarnya 25 mg gosipol atau 27,9 mg gosipol asetat ditimbang. Hal
ini stabil selama 24 jam saat terlindungi dari cahaya.
21.1.4 Prosedur
Menggiling sekitar 50 gm sampel di penggilingan Wiley untuk mencapai ukuran 1
mm. Bobot sampel dan aliquot ekstrak aseton yang akan diambil untuk pengujian harus
bergantung pada kandungan gosipol namun ukuran sampel tidak boleh melebihi 2-5 gm
jika gosipol bebas diperkirakan antara 0,2 - 0, 5% dan Aliquot ekstrak yang akan diambil
untuk tes harus 10 mL
pindahkan sampel yang ditimbang dengan akurat ke labu Erlenmeyer 250 mL,
tambahkan beberapa manik kaca dan aseton berair 50 mL, stopper dan kocok dengan kuat
pada shaker mekanis selama 1 jam. Filter melalui kertas saringan kering yang membuang
5 mL pertama dan mengumpulkan filtrat dalam labu kecil.
Pipet aliquot ke dalam labu volumetrik 25mL
Untuk satu larutan contoh yang ditetapkan sebagai larutan A, tambahkan 2 tetes 10%
berairtiourea, 1 tetes 1,2 N HCl dan encerkan volume dengan isopropil alkohol berair.
Untuk sampel kedua yang ditunjuk sebagai larutan B, tambahkan 2 tetes 10%, tiourea
berair, 1 tetes 1,2 N HCl dan 2 mL anion redistiling.Pipet secara cepat dapat digunakan
untuk pengeluaran anilin. Siapkan residu reagen yang mengandung volume larutan aseton
berair sama dengan sampel aliquot dan tambahkan 2 tetes 10 tiourea dan 2 mL anilin
(jangan tambahkan HCl 1,2 N). Panaskan sampel aliquot B dan reagen kosong dalam bak
air mendidih selama 30 menit. Keluarkan larutan dari bak mandi, tambahkan sekitar 10 mL
isopropil alkohol berair; untuk menghasilkan larutan homogen dan dingin sampai suhu
kamar.Encerkan dengan isopropil alkohol berair.Tentukan absorbansi sampel alikuot A
pada 440 nm menggunakan isopropil alkohol berair untuk mengatur instrumen pada
absorbansi nol (transmitansi 100%). Dengan instrumen pada absorbansi nol dengan
isopropil alkohol berair, tentukan absorbansi pereaksi kosong. Jika bahan reagen kosong
melebihi 0,022 unit absorbansi, analisis harus diulang dengan menggunakan aniline yang
baru disuling.Tentukan absorbansi sampel alikuot B pada 440 nm dengan menggunakan
pereaksi kosong untuk mengatur instrumen pada absorbansi 0. Hitung absorbansi yang
dikoreksi dari aliquot sebagai berikut Absorbansi yang dikoreksi = (absorbansi B -
absorbansi A)
Dari absorbansi sampel yang dikoreksi, tentukan mg gosipol dalam sampel aliquot
dengan mengacu pada grafik kalibrasi yang dibuat dengan mengambil 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10
mL aliquot larutan gosipol standar (0,025 mg / ml) ke labu volumetrik 25 mL. Untuk satu
set aliquot yang ditunjuk C tambahkan 2 tetes 10% tiourea berair, 1 tetes 1,2 N HCl dan
encerkan ke volume dengan isopropil alkohol berair dan tentukan absorbansinya. Ke set
lain dari aliquot yang ditunjuk D tambahkan 2 tetes tiourea berair, 2 tetes 1,2 N HCl dan 2
mL anion redistilled. Siapkan residu reagen yang mengandung 10 ml aseton berair, 2 tetes
tiourea berair dan 2 mL anilin (jangan tambahkan HCl).Panaskan standar dan reagen
kosong dalam rendaman air mendidih selama 30 menit, dinginkan dan encerkan volume
dengan isopropil alkohol berair dan tentukan absorbannya. Tentukan absorbansi yang
dikoreksi. Plot absorbansi yang dikoreksi untuk setiap standar gosipol terhadap mg gosipol
dalam volume 25 mL untuk mendapatkan grafik kalibrasi (Ref: - AOCS (1989) Metode
Resmi Ba 8 - 78).

21.2Total Gossypol
21.2.1 Definisi
Turunan gossypol dan gossypol keduanya bebas dan terikat pada produk biji kapas
yang mampu bereaksi dengan 3 - amino -1 propanol dalam larutan dimetilformamida untuk
membentuk kompleks diaminopropanel yang kemudian bereaksi dengan anilin untuk
membentuk dianilinogossypol dalam metode ini.

21.2.2 Peralatan
sama seperti pada 21.1.2 di atas dan pipet 1, 2, 4, 5, 10 mL.
(1) Pelarut - Isopropil alkohol (n - propanol), n - heksana (b.p 68-690C), dimetil
formamida, 3 - amino 1 propanol (propanolamina), bebas dari warna, asam asetat glasial
dan anilin. Anilin harus didistilasi ulang dengan seng menggunakan kondensor
berpendingin air.
(2) Campuran isopropil alkohol-heksana (60 + 40)
(3) Pereaksi kompleks yang dibuat dengan pipetting 2 mL dari 3 amino-1 propanol dan 10
mL asam asetat glasial menjadi labu volumetrik 100 mL, didinginkan sampai suhu kamar
dan diencerkan dengan volume dengan dimetil formamida. Siapkan pereaksi mingguan dan
simpan di kulkas jika tidak digunakan.
(4) Gossypol atau Gossypol acetic acid sebagai standar utama.
(5) Larutan Gossypol standar yang dibuat dengan menimbang 25 mg gosipol standar
primer atau 27,9 mg asam asetosil asetat ke dalam labu volumetrik 50 mL. Larutkan dan
buat volume dengan reagen kompleks. Solusi stabil selama 1 minggu jika disimpan di
kulkas. Larutannya mengandung 0,50 mg gosipol per ml. Asam gosipol asetat dengan
0.8962 untuk mendapatkan mg gosipol.

21.2.3 Prosedur Kerja

Giling 50 gm sampel di pabrik Wiley untuk lulus 1 mm saringan. Timbang 0,5 -
0,75 gm sampel secara akurat dan transfer ke labu volumetrik 50 mL. Tambahkan reagen
pengompleks 10 mL. Siapkan reagen kosong yang mengandung 10 mL reagen
pengompleks dalam labu volumetrik 50 mL. Panaskan sampel dan kosongkan dalam
rendaman air pada suhu 100 ° C selama 30 menit, dinginkan, encerkan volume dengan
campuran isopropil alkohol-heksana. Filter melalui kertas saring 11 cm ke dalam labu
Erlenmeyer 50 mL stoppered filtrate pertama dibuang 5 mL. Pipet 2 mL ekstrak sampel
duplikat ke dalam labu volumetrik 25 mL. Pipet duplikat aliquot kosong dengan volume
yang sama seperti contoh aliquot ke dalam labu volumetrik 25 mL. Encerkan satu set
sampel dan aliquot kosong dengan campuran isopropil - heksana dan cadangan sebagai
referensi untuk pengukuran penyerapan.Tambahkan 2 mL anilin dengan pipet ke set
sampel lainnya dan alikuot alien kosong, panaskan dalam rendaman air selama 30 menit,
dinginkan, encerkan volume dengan campuran isopropil - heksana dan aduk rata. Diamkan
selama 1 jam. Ukur absorbansi pada 440 nm reagen kosong yang diolah dengan anilin
menggunakan aliquot kosong tanpa anilin sebagai larutan referensi. Tentukan absorbansi
sampel aliquot yang direaksikan dengan anilin dengan menggunakan aliquot sampel yang
diencerkan tanpa anilin sebagai larutan referensi. Kurangi absorbans reagen kosong dari
sampel aliquot yang diolah dengan anilin untuk mendapatkan absorbansi yang dikoreksi.
Dari absorbansi sampel aliquot yang dikoreksi menentukan mg gossypol dalam sampel
aliquot dengan mengacu pada grafik kalibrasi yang disiapkan seperti pada 21.1. 4 (gosipol
gratis).
 (Ref: - AOCS (1989) Metode Resmi Ba 8 - 78).
21.3 Penentuan
Gossypol Bebas dan Total pada Tepung Benih Pelarut yang diekstraksi dengan
metode HPLC UV:

21.3.1 Untuk Gossypol gratis

 HPLC - detektor absorbansi gelombang ganda,
 Kolom Zorbax Eclipse XDB-C18 (4,6 mm × 250 mm, partikel 5 μm)
 C18 pre-column (4,6 mm x 20 mm, 5 μm) (Wang et al 1985).
 Fase gerak - 90: 10 (v / v) metanol-0,5% asam asetat aqueous
 Kecepatan aliran larutan 0,8 mL / menit.
 Panjang gelombang untuk deteksi UV adalah 254 nm.
 Volume injeksi: 5 μL.
 Pengujian dapat dilakukan pada suhu kamar.
(Ref: - Yingfan et al. J. Biosci. Vol. 29 No. 1, March, 67-71, 2004
REFERENSI
1. IS: 8184 – 1976 Method for determination of Ergot in Food grains
2. AOAC 17th edn, 2000, Official method 970. 66 Light and Heavy Filth
3. 15.2.4.6 (2-14) of Food Safety and Standards (Food Products Standards and Food
Additives) Regulations, 2011
4. IS 4333 (Part 1): 1996 Methods of analysis for Food grains Part I Refractions
5. AOAC 17th edn, 2000, Official method 941.16 Filth in grain products and brewers grits
6. AOAC 17th edn, 2000, Official method 993.26 Light filth in Whole Wheat Flour
7. AOAC Method No. 970.24
8. IS 4333 (Part 5) 1970 – Methods of Analysis for Food grains Part 5
9. IS 8184 :1976 Method of determination of Ergot in Food grains
10. AOAC 17th edn Official method 915. 03 Hydrocyanic acid in Beans/IS 11535:1986/ISO
2164- 1975 Method of test for determination of glycosidic hydrocyanic acid in pulses
11. AOAC 17th edn, 2000, Official method 925. 08 Sampling of flour
12. IS 1155 :1968 Method of Determination of Gluten
13. IS 12711 :1989 Method of Determination of Alcoholic Acidity
14. Pearson’s Composition and Analysis of Foods 9th edn, page 33
15. Pearson’s Composition and Analysis of Foods, 9th edn, page 17
16. Official Journal of the European Communities N° L 344/36 of 26.11.92, Determination of
crude fibre
17. AOAC, 2005, 962.09
18. IS: 460-1962
19. ISI Handbook of Food Analysis (Part IV) – 1984 Page 121
20. UgurBasaranet al. African Journal of Biotechnology Vol. 10(20), pp. 4072-4080, 16 May,
2011
21. Arenfot et al. J. Agric. Food Chem., Vol. 43, No. 4, 1995
22. FAO Manuals of Food Quality Control 14/8, page 200
23. IS:4706 (Part I) 1978 Methods of test for edible starches and starch products
24. FAO Manuals of Food Quality Control, 14/8, pages 204 – 215
25. IS 12741 – 1989 Bakery products – Methods of sampling
26. IS 1011 – 1992 Biscuits – Specification
27. IS 12711:1989 Bakery products – Methods of Analysis
28. Pearson Composition and Analysis of Foods 9th edn, page 316
29. FAO Manuals of Food Quality Control 14/8 page 31/British standard 1743 : Part 2 : 1980
30. IS 12983: 1990/I.S.O 8892: 1987, Oilseed Residues – Determination of Total Residual
Hexane
31. IS specification No IS 6108 - 1971 Specification for Edible Sesame Flour (solvent
extracted)
32. International Journal of Food Science and Technology 2012, 47, 627–632
33. Nour, V. et al./Not. Bot. Hort. Agrobot. Cluj. HPLC Organic Acid Analysis in Different
Citrus Juices under Reversed Phase Conditions.38 (1) 2010, 44 48
34. Vanda Pereira et al. HPLC-DAD methodology for the quantification of organic acids,
furans and polyphenols by direct injection of wine samples. J. Sep. Sci. 2010, 33, 1204–
1215
35. AOCS (1989) Official Method Ba 8 – 78
36. Yingfan et al. J. Biosci. Vol. 29 No. 1, March, 67-71, 2004