20

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Jenis penelitian

Jenis penelitian ini adalah eksperimental dengan analisa kualitatif

karena adanya variabel manipulasi, variabel respon, dan variabel kontrol.

3.2 Rancangan Penelitian

Sampel tanaman diambil dan dipotong kecil-kecil Ekstrak 10 gram

daun pepaya menggunakan pelarut air 100 mL dipanaskan di atas

penangas air hingga suhu mencapai 90°C lalu dihitung selama 15 menit

dan dipekatkan. Ekstrak kental dibuat larutan induk 500 ppm kemudian

dibuat larutan kerja 20μg/mL, 40 μg /mL, 60μg/mL, 80μg/mL, dan

100μg/mL dari larutan induk. Larutan kerja diujikan pada media NA yang

sudah ditanami bakteri Staphylococcus aureus menggunakan kertas

cakram. Hasil uji didapatkan dan dianalisa setelah 24 jam inkubasi.

Penelitian aktivitas antibakteri ekstrak daun pepaya (Carica

papaya L.) dengan pelarut air dilakukan 6 kali replikasi dengan 5

konsentrasi. Rancangan penelitian dapat dilihat pada tabel 3.1.

 21

Tabel 3.1 Rancangan Penelitian

Konsentrasi Kontrol 20μg/mL 40μg/mL 60μg/mL 80μg/mL 100μg/mL

μg/mL (-) A B C D E F
Replikasi
1 A1 B1 C1 D1 E1 F1
2 A2 B2 C2 D2 E2 F2
3 A3 B3 C3 D3 E3 F3
4 A4 B4 C4 D4 E4 F4
5 A5 B5 C5 D5 E5 F5
6 A6 B6 C6 D6 E6 F6

Keterangan :

A = Kontrol negatif
B = Ekstraksi dengan konsentrasi 20 μg/mL
C = Ekstraksi dengan konsentrasi 40 μg/mL
D = Ekstraksi dengan konsentrasi 60 μg/mL
E = Ekstraksi dengan konsentrasi 80 μg/mL
F = Ekstraksi dengan konsentrasi 100 μg/mL

B F

AAAA
A
E

C D

Gambar 3.1 Rancangan Cawan Petri

Keterangan :

: Dalam 1 cawan terdapat 5 konsentrasi dan 1 kontrol

negatif.

3.3 Lokasi dan Waktu Penelitian

 22

Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Akademi

Farmasi Surabaya, Jl. Ketintang Madya No. 81 Surabaya. Penyusunan

rancangan naskah proposal dari bulan September 2017 sampai dengan

bulan Desember 2017.

3.4 Populasi

Populasi dalam penelitian ini adalah daun pepaya (Carica papaya

L.) yang diperoleh dari UPT Materia Medika Batu, Jl.Lahor No.817 Batu

Jawa Timur. Bakteri Staphylococcus aureus yang diperoleh dari Badan

Balai Laboratorium Kesehatan Surabaya.

3.5 Sampel, Besar Sampel, dan Cara Pengambilan Sampel

3.5.1 Sampel

Sampel dalam penelitian ini adalah ekstrak air daun pepaya

(Carica papaya L.) tua yang berwarna hijau tua diperoleh dari UPT

Materia Medika Batu Jl. Lahor No. 817 Batu Jawa Timur.

3.5.2 Besar Sampel

Besar sampel yang digunakan pada penelitian ini yakni 50 mg

ekstrak air daun pepaya. Hasil ekstraksi yang dihasilkan diencerkan

dengan beberapa konsentrasi yaitu 20μg/mL, 40 μg /mL, 60μg/mL,

80μg/mL, dan 100μg/mL.

3.5.3 Cara Pengambilan Sampel

Sampel dibuat dengan menimbang 50 mg ekstrak air daun pepaya

yang telah di evaporator kemudian dilarutkan ad 100 mL aquadest steril.

 23

Membuat pengenceran ekstrak dengan konsentrasi 20μg/mL, 40 μg /mL,

60μg/mL, 80μg/mL, dan 100μg/mL.

3.6 Variabel Penelitian

Variabel Penelitian ini menggunakan 3 variabel :

1. Variabel Manipulasi (variabel bebas): Konsentrasi ekstrak daun pepaya

(Carica papaya L.).

2. Variabel Respon (variabel terikat): Zona hambat bakteri Staphylococcus

aureus.
3. Variabel Kontrol (variabel terkendali): Suhu inkubasi, lama inkubasi,

media pertumbuhan, jenis bakteri, jenis daun pepaya (Carica papaya

L.).
3.7 Definisi Operasional
1. Ekstrak adalah sediaan kering, kental atau cair dibuat dengan penyari

simplisia menurut cara yang cocok, di luar pengaruh cahaya matahari

langsung. Pada penelitian ini dibuat larutan dengan konsentrasi

20μg/mL, 40μg/mL, 60μg/mL, 80μg/mL, dan 100μg/mL.

2. Diameter zona hambat bakteri Staphylococcus aureus adalah area jernih

atau bening pada media agar yang mengelilingi kertas cakram tempat

zat dengan aktivitas antimikroba terdifusi. Diameter zona hambat dapat

diukur menggunakan penggaris dan jangka sorong.

3. Staphylococcus aureus adalah salah satu bakteri patogen yang dapat

menyebabkan bisul, pneumonia bahkan keracunan pada manusia.

4. Daun pepaya adalah jenis tumbuhan yang berdaun menjari dan memiliki

tulang daun yang menyirip yang dapat dimanfaatkan sebagai obat.

3.8 Teknik dan Instrumen Pengumpulan Data
Pada penelitian kali ini metode yang digunakan adalah difusi kertas

cakram untuk mengetahui pengaruh konsentrasi ekstrak daun pepaya

 24

(Carica papaya L.) terhadap bakteri Staphylococcus aureus pada media

agar Nutrient Agar (NA).

1. Tahap pertama
a. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan untuk membuat ekstrak daun pepaya

dengan metode infusa yaitu alat timbangan, panci, kompor,

evaporator, wadah bejana, beaker glass, gelas ukur, erlenmeyer,

batang pengaduk, corong, cawan, kertas saring, kain flanel. Bahan

yang digunakan daun pepaya dan pelarut air.

b. Pembuatan ekstrak daun pepaya (Carica papaya L)
Sampel kering daun pepaya sebanyak 10 gram di ekstraksi

dengan metode infusa menggunakan pelarut air 100 mL dengan cara

sampel dimasukkan dalam panci kemudian ditambahkan pelarut air

100 mL dipanaskan di atas penangas air hingga suhu mencapai 90°C

lalu dihitung selama 15 menit sambil sesekali diaduk. Hasil infusa

diserkai selagi panas menggunakan kain flanel kemudian diuapkan

menggunakan evaporator pada suhu 40°C untuk memisahkan pelarut

air sampai diperoleh pelarut ekstrak kental. Hasil ekstraksi

dimasukkan dalam botol kaca steril dan disimpan dalam ruang LAF.
2. Tahap kedua
a. Mensterilkan alat-alat yang digunakan dalam penelitian dengan

menggunakan oven yaitu cawan petri, beaker glass, vial, erlenmeyer,

cawan porselen pada suhu 180°C selama ±2jam, pinset dibakar

dengan pembakaran diatas api langsung dan labu ukur, gelas ukur,

media disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121°C dengan

tekanan 1 atm selama 15 menit.

b. Pembuatan suspensi biakan Staphylococcus aureus
 25

Alat yang digunakan yaitu tabung reaksi, rak tabung reaksi, kawat

ose, pipet volume 10 mL, dan spiritus bakar. Bahan yang digunakan

yaitu Nutrient Broth (NB) steril dimasukkan ke dalam tabung reaksi

sebanyak 10 mL, biakan Staphylococcus aureus diambil dengan

menggunakan kawat ose 1 goresan kemudian disuspensikan dengan

NB steril dan di inkubasi pada 37°C selama 24 jam.

3. Tahap Ketiga
a. Membuat Media Nutrient Agar (NA)
Alat yang digunakan yaitu : cawan petri, timbangan analitik,

pipet volume 10 mL, mikro pipet, gelas ukur, beaker glass, sendok

tanduk, batang pengaduk, kaca arloji, kertas cakram, autoclave,

inkubator, dan kompor. Bahan yang digunakan: media NA, aquadest,

biakan bakteri Staphylococcus aureus yang sudah di suspensikan

dengan NB.
b. Membuat media Nutrient agar (NA) dengan mencampurkan

sebanyak 2 gram serbuk NA ke dalam 100 mL aquadest, dipanaskan

di atas kompor hingga berwarna seperti minyak goreng. Autoclave

media NA dengan suhu 121°C selama 15 menit.

c. Pipet 10 mL media NA steril yang masih cair pada suhu 45°C

masukkan ke dalam cawan petri kemudian inkubasi 24 jam, setelah

24 jam tambahkan biakkan bakteri yang sudah dihomogenkan dalam

NB pipet 100 μL bakteri Staphylococcus aureus kemudian

homogenkan dalam cawan petri secara spread plate inkubasi suhu

35°C selama 24 jam.

4. Tahap Keempat
a. Membuat larutan induk ekstrak daun pepaya (Carica papaya L.)

dengan konsentrasi 500ppm. Larutan induk dibuat dengan

 26

menimbang 50 mg ekstrak daun pepaya yang telah di evaporator

kemudian dilarutkan dalam aquadest steril ad 100 mL.

b. Membuat pengenceran ekstrak dengan konsentrasi 20μg/mL, 40

μg /mL, 60μg/mL, 80μg/mL, dan 100μg/mL dengan cara sebagai

berikut :
1. Konsentrasi 20μg/mL: 2 mL dari hasil maserasi tambahkan

aquadest steril ad 50 mL, masukkan dalam labu ukur, tutup dan

kocok ad homogen.
2. Konsentrasi 40μg/mL: 4 mL dari hasil maserasi tambahkan

aquadest steril ad 50 mL, masukkan dalam labu ukur, tutup dan

kocok ad homogen.
3. Konsentrasi 60μg/mL: 6 mL dari hasil maserasi tambahkan

aquadest steril ad 50 mL, masukkan dalam labu ukur, tutup dan

kocok ad homogen.
4. Konsentrasi 80μg/mL: 8 mL dari hasil maserasi tambahkan

aquadest steril ad 50 mL, masukkan dalam labu ukur, tutup dan

kocok ad homogen.
5. Konsentrasi 100μg/mL: 10 mL dari hasil maserasi tambahkan

aquadest steril ad 50 mL, masukkan dalam labu ukur, tutup dan

kocok ad homogen.
c. Meletakkan 5 kertas cakram dengan diameter 6 mm yang telah

ditetesi larutan ekstrak daun pepaya (Carica papaya L.) kemudian

diletakkan pada media NA.

d. Inkubasi dalam inkubator selama 24 jam dengan suhu 37°C.

Pengamatan zona bening, diukur dengan menggunakan jangka

sorong.
5. Tahap kelima
 27

Alat yang digunakan yaitu jangka sorong. Amati zona hambat pada

masing-masing konsentrasi, catat dan dokumentasi, dan hasil data

penelitian dianalisa menggunakan statistik uji Anova One way.

3.9 Teknik Pengolahan Data dan Analisa Data

3.9.1 Teknik Pengolahan Data
Pengamatan dilakukan setelah inkubasi selama 24 jam pada suhu

37°C. Data yang diperoleh :

1. Konsentrasi ekstrak daun pepaya yang efektif untuk menghambat

pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus disajikan dalam

bentuk statistika.
2. Efektifitas ekstrak daun pepaya untuk menghambat pertumbuhan

bakteri Staphylococcus aureus ditampilkan secara diskriptif.

3.9.2 Teknik Analisa Data
Data yang di dapat di analisis dengan menggunakan statistika

SPSS18 dengan membandingkan diameter zona hambat dari konsentrasi

masing-masing ekstrak daun pepaya (Carica papaya L.) dengan

menggunakan uji Anova one way.

Tabel 3.2 Rancangan hasil pengukuran diameter zona hambat bakteri

Staphylococcus aureus pada konsentrasi tertentu

Kontrol Konsentrasi
Perlakuan negatif
20µg/mL 40µg/mL 60µg/mL 80µg/mL 100µg/mL
(-)
 28

Rata - rata