PT-LMC 002 Requisitos Gerais e Orientações para Exames Microbiológicos

PT – LMC 002
Procedimento Técnico Emissão: 25/10/17
REQUISITOS GERAIS E ORIENTAÇÕES PARA Revisão: 00

EXAME MICROBIOLÓGICOS Página 1 de 112
REQUISITOS GERAIS E ORIENTAÇÕES PARA EXAMES

MICROBIOLÓGICOS
CÓPIA CONTROLADA – PROIBIDO REPRODUÇÃO

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1.0 OBJETIVOS E ALCANCE
Abrange exame para bactérias, bolores e leveduras e pode ser usado se

suplementadas com orientação específica para príons, parasitas e vírus. Não
abrange o exame para toxinas ou outros metabólitos (aminas, por exemplo)
produzidos por microrganismos.
Esta Norma aplica-se a microbiologia de alimentos, alimentos para animais, indústria

de produção de alimentos, e ambiente de produção primária.
O objetivo desta Norma é contribuir para garantir a validade dos exames de

microbiologia de alimentos, e ajudar a garantir que as técnicas gerais usadas para a
realização desses exames são as mesmas em todos os laboratórios, ajudar a
alcançar resultados homogêneos em laboratórios diferentes, e contribuir para a
segurança do pessoal de laboratório, evitando riscos de infecção.
2.0 INTRODUÇÃO
Ao conduzir exames microbiológicos é especialmente importante que
- apenas os microrganismos que estão presentes nas amostras sejam isolados e

contabilizados;
- os microrganismos não contaminem o meio ambiente
Para conseguir realizar isso é necessário também ter atenção à higiene pessoal e
realizar as técnicas de trabalho com certeza de eliminação de contaminações
externas, sempre que possível.
Uma vez que, nesta Norma Internacional, é possível dar apenas alguns exemplos de
precauções que devem ser tomadas durante uma análise microbiológica, um
conhecimento profundo das técnicas microbiológicas e dos microrganismos
envolvidos é essencial. É importante que as análises sejam realizadas com a maior
precisão possível, incluindo monitoramento e registro de aspectos que podem afetar

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os resultados e os cálculos do número de microrganismos e o cálculo de incerteza

de resultados.
Em ultima instância, é de responsabilidade do coordenador do laboratório de julgar

se as manipulações são seguras e se podem ser consideradas boas práticas
laboratoriais.
Um grande número de manipulações podem, por exemplo, sem intenção levar a

uma contaminação cruzada e o analista deve sempre verificar a precisão dos
resultados dados por sua técnica.
A fim de realizar as análises corretamente é necessário tomar certas precauções ao

construir e equipar o laboratório.
Certas precauções devem ser tomadas, não apenas por motivos de higiene, mas
também para garantir boa reprodutibilidade dos resultados. Não é possível
especificar todas as precauções que devem ser tomadas em todas as
circunstâncias, mas essa Norma Internacional pelo menos fornece as medidas a
serem tomadas ao preparar, esterilizar, armazenar os meios e utilizar os
equipamentos.
Se a orientação dada nessa Norma Internacional for seguida, será uma contribuição
para manter a saúde e segurança de todos. Informações adicionais sobre esse
assunto pode ser encontrada na literatura listada na Bibliografia.
A fim de distinguir as orientações nessa Norma Internacional, elas estão impressas

em um tipo de letra diferente (Times New Roman).
3.0 PREMISSAS
3.1 Geral
Esta cláusula dá requisitos gerais, para os princípios da concepção e organização

de um layout de laboratório de microbiologia.

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Exame das amostras estágio primário de produção (especialmente para recepção de

amostras e preparação de amostras) devem ser separadas da análise de outras
amostras para reduzir os riscos de contaminação cruzada.
3.2 Considerações sobre segurança
O projeto de laboratório deverá cumprir os requisitos de segurança que vai depender

do tipo de micro-organismo. Para este efeito, os micro-organismos são classificados
em quatro categorias de risco:
Categoria de risco 1 (nenhum risco ou muito baixo para o indivíduo e para a

comunidade).
Um micro-organismo que é improvável que causam a doença humana ou animal.
Categoria de risco 2 (risco moderado para o risco individual e baixo para a

comunidade).
Um agente patogênico que pode causar doenças no homem ou animal, mas é

improvável que seja um perigo grave para os trabalhadores de laboratório, a
comunidade ou o ambiente. Exposições laboratoriais podem causar infecção
humana grave, mas o tratamento eficaz e medidas preventivas estão disponíveis e o
risco de propagação da infecção é limitada.
Categoria de risco 3 (alto risco para o risco individual e baixo para a comunidade).
Um patógeno que geralmente causa doença humana ou animal grave, mas

normalmente não se espalham de um indivíduo infectado para outro. Tratamento
eficaz e medidas preventivas estão disponíveis.
Categoria de risco 4 (alto risco para o indivíduo e para a comunidade).
Um patógeno que geralmente causa doença humana ou animal grave e que pode
ser facilmente transmitido de um indivíduo para outro, direta ou indiretamente.
Tratamento eficaz e medidas preventivas não são geralmente disponíveis.
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AVISO - Consulte a regulamentação nacional, que define a categoria de risco de

micro-organismos encontrados particularmente dentro das fronteiras do país em
questão.
3.3 Design de Laboratório
As diretrizes para a disposição de laboratório descrito abaixo cobrem exames para a

detecção de micro-organismos pertencentes à categoria de risco 1, 2 e 3 para
microbiologia alimentar.
Note-se que as medidas de segurança adicionais podem ser necessárias,

dependendo da legislação local.
3.4 Áreas do Laboratório
3.4.1 Geral
O laboratório compreende áreas associadas com amostras e testes (ver 3.4.2) e

áreas em geral (Ver 3.4.3). Estas devem ser separadas.
3.4.2 Áreas associadas com amostras e testes
É considerado boa prática ter locais separados ou áreas claramente designadas,

para o seguinte:
- recebimento e armazenamento das amostras;
- preparação de amostras, em particular no caso de matérias-primas (por exemplo,

produtos em pó contendo um número elevado de micro-organismos);
- exame das amostras (a partir da suspensão inicial), incluindo a incubação de

micro-organismos;
- manipulação de patógenos presuntivo;
- armazenamento de cepas de referência e outras cepas;

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- preparação e esterilização de meios de cultura e equipamentos;
- armazenamento de meios de cultura e reagentes;
- exame de alimentos para a esterilidade;
- descontaminação;
- limpeza de vidro e outros equipamentos;
- armazenamento de produtos químicos perigosos, de preferência mantidos em

armários especialmente designados, salas ou prédios.
3.4.3 Áreas gerais
As seguintes áreas são consideradas separadas:
- entradas, corredores;
- áreas administrativas (por exemplo, escritórios, salas de documentação, etc);
- vestiários e banheiros;
- salas de arquivo;
- sala de reunião
- salas de repouso.
3.5 Layout e acessórios das instalações
3.5.1 Objetivos
O objetivo é garantir que o ambiente dentro do qual os exames microbiológicos são

realizados não afetem a confiabilidade dos resultados do teste.

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Providenciar instalações de forma a evitar o risco de contaminação cruzada.

Maneiras de atingir este objetivo são, por exemplo:
a) para a construção do laboratório de acordo com o princípio do layout "não volta";
b) a realização de procedimentos de forma sequencial utilizando as devidas

precauções para garantir o teste e integridade da amostra (por exemplo, uso de
recipientes fechados);
c) separar as atividades por tempo ou espaço.
Evitar condições extremas, tais como temperatura excessiva, poeira, umidade,

vapor, ruído, vibração, etc.
Espaço deve ser suficiente para permitir que as áreas de trabalho sejam mantidas
limpas e arrumadas. O espaço necessário deve ser proporcional ao volume de
análises e a organização interna global do laboratório. O espaço deve ser regulado
pela legislação nacional, quando existir.
3.5.2 Instalações
As instalações devem ser construídas e equipadas a fim de reduzir o risco de

contaminação por poeira e, portanto, por microrganismos (para micro-organismos da
categoria de risco 3 verificar a legislação nacional).
a) As paredes, tetos e pavimentos devem ser lisos, fácil de limpar e resistente a

detergentes e desinfetantes usados em laboratórios.
b) O piso deve ser antiderrapante.
c) tubos suspensos de transporte de líquidos não devem cruzar as instalações a

menos que sejamhermeticamente fechados. Qualquer outra estrutura aérea deve
ser coberta ou facilmente acessível para limpeza regular.

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d) Janelas e portas devem ser capazes de ser fechado quando realização dos
ensaios, a fim de minimizar correntes de ar. Além disso, devem ser construídos de
modo a evitar a formação de poeira, e assim, facilitar a sua limpeza. A temperatura
ambiente (18 ° C a 27 ° C) e qualidade do ar (conteúdo micro-organismo, a taxa de
poeira se espalhando, etc) deve ser compatível com a realização dos testes. Um
sistema de ventilação de filtro de ar de entrada e saída de ar é recomendado para
esta finalidade.
e) Um sistema de extração adequada deve ser instalado para evitar a exposição às

poeiras provenientes do manuseio de meios de cultura desidratados, e as amostras
em pó.
f) Testes que devem ser realizados em uma atmosfera de baixa contaminação, a

sala deve ser especialmente equipada com uma cabine de fluxo laminar ou cabine
de segurança biológica.
g) Se necessário, o ambiente de laboratório devem ser protegidos contra os efeitos

nocivos da radiação solar através da utilização de venezianas ou painéis de vidro
tratados adequadamente. Persianas instaladas internamente não são adequadas,
pois são de difícil limpeza e podem se tornar uma fonte de poeira.
3.5.3 Outros pontos
Os seguintes pontos devem ser considerados:
- disponibilidade de abastecimento de água de qualidade apropriada para o uso

pretendido;
- disponibilidade de energia elétrica;
- disponibilidade de gás (encanado ou engarrafado);
- luz adequada em cada seção do laboratório;

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- superfície de bancada e móveis de laboratório fabricados em material liso,

impermeável, de fácil limpeza e desinfecção;
- mobiliário de laboratório concebido de modo a facilitar a limpeza dos pisos (por

exemplo, mobiliário móvel);
- nenhuma mobília, documentos ou outros itens que não sejam os estritamente

necessários para as atividades de teste, devem ser mantidos na área de testes;
- disponibilidade de instalações de armazenamento para armazenar documentos

usados ao manipular as amostras, meios de cultura, reagentes, e etc;
- fornecimento de lavatórios de mão em cada sala de testes e, se necessário, em

áreas gerais, de preferência perto da porta;
- disponibilidade de uma autoclave para destruição de resíduos contaminados e

meios de cultura, a menos que um adequado sistema para a remoção de resíduos
contaminados para incineração esteja em vigor;
- fornecimento de sistemas de segurança para cobrir incêndio, emergência elétrica e

chuveiro de emergência e instalações para lavagem dos olhos;
- fornecimento de instalações de primeiros socorros.
3.6 Limpeza e desinfecção
Os seguintes pontos devem ser verificados.
a) Os pisos, paredes, tetos, bancadas de laboratório, mobiliário e junções entre

estes devem ser submetidos a manutenção e reparação regular, a fim de evitar
rachaduras que podem atuar como uma fonte de contaminação.
b) A limpeza regular e desinfecção devem ser realizadas a fim de manter as

instalações em condições adequadas para a realização de testes. Superfícies

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contaminadas ou potencialmente contaminadas devem ser descontaminadas

utilizando desinfetante conhecido por ser bactericida e fungicida.
NOTA 1 Salas e equipamentos podem ser descontaminados por fumigação com

vapor de formaldeído, se permitido pela legislação nacional.
c) Os sistemas de ventilação e seus filtros devem receber manutenção regularmente

e os filtros mudados quando necessário.
d) A qualidade microbiológica de superfícies de trabalho laboratorial, superfícies de

contato pessoal, e ar devem ser monitorados regularmente (a frequência depende
dos resultados de testes anteriores).
e) a contaminação de superfície pode ser estimado através da aplicação direta à

superfície de uma placa de contato contendo neutralizantes contra agentes
sanitizantes (por exemplo, lecitina, tiossulfato de sódio). A qualidade do ar pode ser
examinada por exposição de 15 min uma placa de Petri abertas contendo meio de
ágar não seletivo (ágar contagempor exemplo placa - PCA) ou um Ágar seletivo
adequado para o microrganismo alvo procurado (por exemplo, ágar batata).
4.0 PESSOAL
4.1 Generalidades
Requisitos gerais sobre a competência do pessoal pode ser encontrada em ISO /

IEC 17025.
4.2 Competência
Para cada método ou técnica, os critérios objetivos devem ser definidos para a
avaliação das competências adequadas, ambos inicialmente e em uma base
contínua.
A competência pode ser estabelecida dentro do laboratório de controle de qualidade

interno (ver 15.1.2).
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4.3 Verificação de competênciaem curso do pessoal
Verificação de competência em curso do pessoal deve ser avaliada regularmente

com parâmetros objetivos. Isso inclui participação em programas internos de
garantia da qualidade, testes de proficiência (ver ISO / IEC Guia 43-1), o uso de
materiais de referência ou por avaliação através de testes para enumeração de
microrganismos como descrito na ISO 14461-2.
4.4 Higiene
As seguintes precauções de higiene pessoal devem ser tomadas a fim de evitar a

contaminação das amostras, meios de cultura e para evitar o risco de infecção do
pessoal.
a) Usar vestuário de laboratório devidamente preso, limpo e em bom estado,

fabricados a partir de um tecido que limita os riscos de inflamabilidade. Esta roupa
não deve ser usada fora das áreas de trabalho e, possivelmente, vestiários.
b) Usar proteção para os cabelos e barba, se necessário, para a integridade da

amostra.
c) Manter unhas limpas e de preferência curtas.
d) Lave bem as mãos em água morna, de preferência por uma torneira não-operada
manualmente, antes e depois de exames microbiológicos e imediatamente depois de
ir ao banheiro banho. Use sabão líquido ou em pó ou, possivelmente, um
desinfetante, entregue preferencialmente por um dispensador mantido em boas
condições de limpeza. Para a secagem das mãos, usar papel ou toalhas de pano
descartáveis. Estas precauções são aplicáveis tanto aos funcionários do laboratório
quanto aos visitantes.
e) Ao trabalhar com amostras expostas, meios de cultura, e ao inocular, evitar falar,

tossir, e etc.

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f) As pessoas que tenham infecções de pele ou doenças devem tomar precauções,

onde os microrganismos podem contaminar as amostras e invalidar os resultados.
g) Não comer ou beber no laboratório e não colocar alimentos para consumo

pessoal em refrigeradores ou freezers do laboratório.
h) pipetagem com a boca é proibida.
5.0 APARELHOS E INSTRUMENTOS
5.1 Geral
De acordo com boas práticas de laboratório, todos os aparelhos e equipamentos

devem ser mantidos limpos e em bom estado de funcionamento. Antes do uso, o
equipamento deve ser verificado como apto para o uso pretendido e seu
desempenho monitorado durante o uso, sempre que necessário.
Os aparelhos e dispositivos de monitorização devem ser calibrados por órgãos de

calibração rastreáveis e a recalibração e os controles intermediários necessários
realizados, e os procedimentos e os resultados documentados.
Equipamentos devem ser regularmente checados e passar por manutenção para

garantir a segurança e adequação ao uso. O equipamento deve ser controlado de
acordo com as condições de trabalho e a precisão exigida para os resultados.
A frequência de calibração e verificações de cada item do equipamento são, na

maioria dos casos, não especificadas nesta Norma, uma vez que será determinada
por cada laboratório, dependendo do tipo de equipamentos e ao nível de atividade
do laboratório, e de acordo com as instruções do fabricante. Em um número limitado
de casos, uma frequência foi especificada desde que foi considerada essencial.
Aparelhos e equipamentos devem ser construídos e instalados para facilitar a

operação e para permitir a facilidade de manutenção, limpeza, descontaminação e
de calibração.

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Quaisquer incertezas de medição indicados nesta cláusula referem-se a aparelhos e

equipamentos em causa e não para todo o método de análise.
Ao longo desta cláusula, os requisitos para a precisão de medição de equipamentos

de medição são dadas. Estes são baseados na tolerância práticas necessárias para
demonstrar o controle adequado dos equipamentos em uso rotineiro. A precisão
declarada está relacionada com a incerteza metrológica do aparelho.
Para equipamentos de controle de temperatura, verificar a estabilidade e

homogeneidade da temperatura antes do uso inicial e depois de qualquer reparação
ou modificação que possa ter um efeito sobre o controle de temperatura.
5.2 Cabines de segurança
5.2.1 Descrição
Uma cabine de segurança é uma estação de trabalho com o fluxo de ar laminar

horizontal ou vertical para remover poeira e outras partículas, como os micróbios, a
partir do ar.
O número máximo tolerável de partículas por metro cúbico com um tamanho maior
ou igual a 0,5 μm representa a classe de espalhamento de poeira de uma cabine de
segurança. Para cabines usadas em microbiologia alimentar, o número de partículas
não deve exceder 4 000 por metro cúbico.
Cabines para uso em laboratórios de microbiologia de alimentos são de quatro tipos.
a) Cabines de segurança de Classe I possuem abertura frontal e se destinam a

proteger o operador e o meio ambiente, mas não irá proteger o produto de
contaminação externa. Aerossóis potencialmente infectados serão contidos dentro
do gabinete e preso por impactação no filtro. O ar filtrado é normalmente
descarregada para a atmosfera, se isso não for feito, o ar deve passar por dois filtros
HEPA montados em série. Eles não são recomendados para trabalhar com

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patógenos de categoria de risco 3 por causa das dificuldades em manter e garantir a

proteção do operador apropriado.
b) Cabines de segurança de Classe II protegem o produto, o operador e o meio

ambiente. Eles recircular parte do ar filtrado, outra parte vai para a atmosfera e
retornam no ar de reposição através da abertura de trabalho, proporcionando assim
a proteção do operador. Eles são adequados para trabalhar com patógenos de
categoria de risco 3.
c) Fluxos laminares de saída horizontal protegem o trabalho de contaminação, mas

joga qualquer golpe de aerossol gerado para o rosto do operador. Portanto, eles não
são adequados para lidar com culturas inoculadas ou preparação de cultura de
tecidos.
d) fluxo de ar laminar vertical protege o produto através do uso de fluxo laminar

vertical de HEPA-ar filtrado. Eles também protegem o operador através do uso de ar
internamente recirculado. Eles são particularmente adequados para proporcionar um
ambiente asséptico para a manipulação de produtos estéreis e para proteger o
operador quando o manuseio de pós.
Usar cabines de proteção para todo o trabalho que envolva a manipulação de

agentes patogênicos e pós contaminados, se necessário por regulamentação
nacional.
O uso de um queimador de gás ou incinerador não é recomendado em cabines de

proteção. Se for necessário, o queimador de gás deve ter uma pequena chama de
modo que o fluxo de ar não seja perturbado. O uso de material descartável (alças,
pipetas, etc) é uma alternativa disponível.
5.2.2 Uso
Usar cabines de proteção que sejam apropriadas para a aplicação pretendida e as

condições ambientais no laboratório.

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Cabines devem ser mantidas livres de todos os equipamentos possíveis.
Colocar todo material necessário dentro da cabine antes de começar a trabalhar

para minimizar o número de movimentos do braço para dentro e fora da abertura de
trabalho. Posicionar equipamentos e materiais de forma a minimizar a perturbação
do fluxo de ar na abertura de trabalho.
Operadores devem ser adequadamente treinados para o uso correto de cabine para
garantir a sua segurança e a integridade do produto ou cultura.
5.2.3 Limpeza e desinfecção
Limpar e desinfetar a área de trabalho após o uso com desinfetante apropriado e

não corrosivo, de acordo com as instruções do fabricante. Examinar regularmente
grades, arame, pré-filtros de proteção e limpar com um pano encharcado de
desinfetante.
Para cabines de fluxo laminar, a superfície do filtro deve ser limpa regularmente a
vácuo, tomando cuidado para não danificar o meio do filtro.
Cabines de segurança devem ser fumigadas antes de trocar de filtro ou

manutenção.
Após a limpeza das cabines, lâmpadas UV podem ser utilizadas para a desinfecção.
As lâmpadas UV devem ser regularmente limpas e substituídas em conformidade
com as instruções do fabricante. Se forem usadas, devem ser limpas regularmente
para remover qualquer pó ou sujeira que possa bloquear a ação germicida da luz. A
intensidade da luz ultravioleta deve ser checada sempre que a cabine for
recertificada de modo a garantir que a emissão da luz está de acordo com as
recomendações do fabricante.
5.2.4 Manutenção e inspeção

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A eficiência de uma cabine de proteção deve ser verificada por uma pessoa
qualificada, no recebimento e, posteriormente, em intervalos regulares, conforme
recomendado pelo fabricante, bem como após qualquer reparo ou modificação. A
eficiência deve ser checada também após relocação.
Verificação periódica de qualquer contaminação microbiana deve ser realizada por

uma verificação da superfície e das paredes da cabine.
A verificação periódica do número de micro-organismos presentes no ar deve ser

realizada durante o funcionamento dos filtros usando o equipamento usual. Por
exemplo, expor diversas placas de Petri abertas contendo um meio de cultura de
ágar não-seletivo (por exemplo, PCA) em cada gabinete por 30 min. Outros métodos
podem ser usados.
5.3 Balanças e diluidores gravimétricos
5.3.1 Uso e incerteza de medição
Balanças são usadas principalmente para a pesagem da porção teste da amostra a

ser analisada, os componentes dos meios de cultura e reagentes. Além disso, eles
podem ser usados para a realização de medições de líquido de diluição por volumes
em massa.
Diluidores gravimétricos são instrumentos eletrônicos constituídos de uma balança e

distribuidor de líquido programável e são utilizados durante a preparação de
suspensões iniciais de amostras; eles funcionam através da adição de diluente a
uma sub-amostra em uma proporção definida. A sub-amostra é, então, pesada até a
tolerância especificada no set do aparelho, e o diluidor dispensa diluente suficiente
para a relação necessária (por exemplo, 9 pra 1 para diluições decimais).
Um laboratório de microbiologia de alimentos deve estar equipado com balanças

com o intervalo de incerteza necessário para pesar os diferentes produtos.

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Salvo disposição em contrário, a resolução da balança deve alcançar a tolerância de

1% mas deve ser suficiente para alcançar a máxima tolerância de 5% da massa.
Exemplo: Para pesar 10g, a balança deve poder ser lida a 0,1g;
Para pesar 1g, a balança deve poder ser lida a 0,01g.
Colocar o equipamento sobre uma superfície estável e horizontal, ajustado conforme

necessário e protegido contra vibrações e vento.
Os equipamentos devem ser limpos e desinfetados após o uso ou derrame durante

a pesagem com um desinfetante adequado e não corrosivo.
5.3.3 Verificação de desempenho e calibração
A calibração deve ser checada em toda a faixa de uso por uma pessoa qualificada
numa frequência dependente do uso.
O desempenho do sistema da balança deve ser regularmente verificado durante o

uso e após a limpeza com pesos de checagem na faixa de uso e por uma pessoa
treinada. Calibração deve ser verificada em toda a gama por uma pessoa
qualificada, dependente da frequência de uso.
Pesos de checagem também podem ser verificados imediatamente após a

calibração da balança.
5,4 Homogeneizadores, liquidificadores e misturadores
5.4.1 Descrição
Este equipamento é usado para preparar a suspensão inicial da amostra teste.
Os seguintes aparelhos podem ser utilizados:

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Stomacher com sacos estéreis, possivelmente com um dispositivo de regulação de

velocidade e tempo; ou um homogeneizador rotativo (liquidificador), a velocidade
nominal de que é entre 8 000 rpm e 45 000 rpm, com vidro esterilizável ou tigelas
de metais equipados com tampas, ou um misturador de vibraçãocom sacos estéreis,
ou outro sistema de homogeneização com eficiência equivalente.
Em certos casos, mistura manual pode ser feita usando pérolas de vidro estéreis
com diâmetro adequado (Cerca de 6 mm).
5.4.2 Uso
O tempo de funcionamento normal de um homogeneizador peristáltico é de 1 min a

3 min dependendo o tipo de alimento.
Não use este tipo de aparelhos para determinados gêneros alimentícios, tais
como:produtos que correm o risco de punção da bolsa (presença de partículas com
ponta, duras ou secas);produtos difíceis de homogeneizar por causa de sua textura
(por exemplo, salame).
O homogeneizador rotativo deverá funcionar por um período tal que o número total
de rotações é entre 15000 rpm e 20000 rpm. Mesmo com o mais lento
homogeneizador, este tempo não deve exceder 2,5 min.
O misturador de vibração pode ser usado para a maioria dos gêneros alimentícios,
incluindo produtos duros ou secos. O tempo de operação usual é 0,5 min a 1 min.
Se os micro-organismos são susceptíveis de serem encontradas no fundo de
estruturas coesas, a amostra deve ser cortada em pedaços pequenos antes do
processamento.
Contas de vidro podem ser usadas para a preparação, por agitação, de suspensões
iniciais de certos produtos viscosos ou espessos, em especial determinados
produtos lácteos (ver normas específicas).

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Limpar e desinfetar homogeneizadores peristáltico e misturadores vibracionais

regularmente e após qualquer derrame do saco.
Para homogeneizadores rotativo, limpar e esterilizar o vidro ou tigela de metal após

cada utilização.
5.4.4 Manutenção
Inspeção e manutenção do equipamento de acordo com as instruções do fabricante.
5.5 pHmetro
5.5.1 Descrição
Um medidor de pH é usado para medir a diferença de potencial, a uma temperatura

determinada, entre um eletrodo de medição e um de referência, os dois sendo
introduzidos no produto. Devem ser capazes de medir com uma precisão de 0,01
unidades de pH, permitindo medições com tolerância de ± 0,1 unidades de pH. O
medidor de pH deve ser equipado com compensação manual ou automática de
temperatura.
NOTA: O eletrodo de medição e o eletrodo de referência normalmente são

agrupados em um sistema de eletrodos combinados.
5.5.2 Uso
Um medidor de pH é usado para medir o valor de pH do meio de cultura e

reagentes, para verificar se o ajuste é necessário durante sua preparação e como
um controle de qualidade depois da esterilização.
Também pode ser usado para medir o valor de pH de amostras e suspensões de

amostras. O uso de um medidor de pH é discutido na norma específica para o
produto a ser analisado, e em que as condições para a determinação do valor de pH
e para ajuste do valor do pH são especificados.

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Ajustar o medidor de pH, conforme indicado no manual do fabricante para medir o

valor de pH em uma temperatura padronizada, por exemplo, 25 ° C. Ler o valor de
pH após a estabilização ser atingida. Registrar o valor para duas casas decimais.
NOTA: A leitura pode ser considerada estável quando o valor de pH medido durante
um período de 5 s variar não mais que 0,02 unidades de pH. Usando eletrodos em
boas condições, o equilíbrio é normalmente alcançado dentro de 30 s.
5.5.3 Calibração e Verificação
Calibrar o medidor de pH de acordo com as instruções do fabricante, usando pelo

menos dois, e de preferência três padrões de soluções tampão, pelo menos,
diariamente antes do uso. Definir erros máximos admissíveis para esta verificação,
dependendo da utilização.
As soluções padrão devem ser rastreáveis e ter valores de pH especificado para

duas casas decimais na temperatura de medição (em geral, pH 7,00 e pH 4,00 e / ou
pH 9,00 a 25 ° C, de acordo com as instruções do fabricante).
Os padrões utilizados devem englobar o valor de pH a ser medido.
Após a calibração do medidor de pH com as duas soluções tampão padrão

rastreáveis, o pH deve ser verificado pelo uso de um terceiro tampão controle, de,
por exemplo, pH 5 ou 8, para demostrar a funcionalidade do medidor.
Se as leituras estiverem fora dos limites permissíveis, ajustar o medidor de pH de

acordo com as instruções do fabricante. Esse ajuste deve ser seguido de uma
calibração e checagem.
5.5.4 Manutenção
Verificar e manter os eletrodos de acordo com as instruções do fabricante. É

necessário, em particular,

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- o acompanhamento regular da condição dos eletrodos com relação ao

envelhecimento e sujidade, e
-o tempo de resposta e estabilidade.
Enxaguar os eletrodos com água destilada ou deionizada após cada utilização.

Levando em consideração a sujidade e envelhecimento dos eletrodos, limpe-os
regularmente mais exaustivamente de acordo com as instruções do fabricante.
Armazenar os eletrodos de acordo com as instruções do fabricante.
5.6 Autoclave
5.6.1 Descrição
Uma autoclave permite que uma temperatura de vapor saturado seja atingida na
câmara.
A autoclave deve ser equipada com
- pelo menos uma válvula de segurança,
- uma torneira de drenagem,
- um dispositivo de regulagem permitindo que a temperatura na câmara seja mantida

a +3°C da meta de temperatura (para levar em conta a incerteza de medição
associada ao termopar de medição), e
- um termômetro ou um termopar de gravação.
5.6.2 Uso
Com a esterilização a vapor, todo o ar é expulso antes do acúmulo de pressão. Se a

autoclave não estiver equipada com um dispositivo de evacuação automática, é
necessário remover o ar até que um jato de vapor contínuo seja emitido.

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Para a esterilização de meios de cultura, o vapor saturado na câmara deve ser na

temperatura de pelo menos 121°C ± 3,0, ou temperatura especificada por instruções
de produção ou fabricante, ou ainda especificada no método de teste.
Para a destruição de micro-organismos e descontaminação de meios de cultura

usados, o vapor saturado na câmara deve estar a uma temperatura de pelo menos
121°C ± 3,0.
Durante o mesmo ciclo de esterilização, não use o autoclave para esterilizar o

equipamento limpo (e/ou meio cultura) e, descontaminar equipamentos usados (e/ou
meios de cultura utilizados).
É preferível usar autoclaves separadas para estes dois processos. Após

autoclavagem, todos os materiais e equipamentos devem ser resfriados dentro da
autoclave antes da remoção.
Por razões de segurança, não remova o conteúdo até que a temperatura caia abaixo
de aproximadamente 80°C.
5.6.3 Manutenção
Limpe a câmara, as vedações de drenagem do filtro e porta regularmente. Verificar a

vedação da porta. Realizar operações de drenagem e descalcificação, se
necessário, em intervalos regulares. Siga as recomendações do fabricante.
5.6.4 Verificação
A autoclave deve ser mantida em boas condições de funcionamento e deve ser

regularmente inspecionada pelas autoridades competentes, pessoal qualificado, e
em conformidade com as instruções do fabricante.
Manter os instrumentos de monitoramento em boas condições de funcionamento e

verificá-lose calibrá-los regularmente.

PT – LMC 002

Validação inicial deve incluir estudos de desempenho para cada ciclo de operação e
cada configuração de carga usada em prática. Este processo deve ser repetido após
o reparo ou modificação significativa. Suficientes sensores de temperatura devem
ser posicionados dentro da carga para demonstrar a penetração adequada de calor
em todos os locais. Validação e revalidação devem considerar a adequação dos
tempos de aquecimento e resfriamento, bem como a temperatura de esterilização.
Para cada carga, no mínimo, um indicador de processo deve ser incluído no centro
da carga para verificar o processo de aquecimento onde um registro rastreável da
eficiência do processo não estiver disponível.
5.7 Preparador de Meio
5.7.1 Descrição
Um preparador de meio é desenvolvido principalmente para a esterilização de

grandes volumes de meio (>1L). É constituído por uma caldeira, compartimento de
água e um dispositivo de agitação contínua. O equipamento deve também ser
equipado com um medidor de temperatura, medidor de pressão, timer, e válvula de
segurança.
Além disso, a unidade deve ter uma trava de segurança para impedir abertura até
que uma temperatura de <80 ° C seja alcançada.
5.7.2 Uso
Siga as instruções do fabricante em todos os momentos.
Todo o processo produtivo ocorre dentro do aparelho. Após a adição de todos os

ingredientes, eles são dissolvidos por agitação e aquecimento. Isto é seguido pela
esterilização.
5.7.3 Manutenção

PT – LMC 002

Lavar o preparador e enxaguar abundantemente com água purificada entre cada lote
de meio.
5.7.4 Verificação
O preparador deve ser mantido em boas condições de funcionamento e

inspecionado regularmente por profissionais competentes, de acordo com as
instruções do fabricante.
Manter os instrumentos de monitoramento em boas condições de funcionamento e

verificar regularmente o seu desempenho.
Validação inicial deve incluir estudos de desempenho para cada ciclo de operação e
cada tamanho de carga utilizada na prática. Este processo deve ser repetido após o
reparo ou modificação significativa. Duas sondas de temperatura, uma ao lado da
sonda controle e outra adjacente a ele, devem ser usadas para demonstrar
aquecimento uniforme.
A temperatura e a duração de cada ciclo devem ser verificadas.
5.8 Estufa
5.8.1 Descrição
Uma estufa consiste de uma câmara de isolamento que permite que a temperatura
seja mantida estável e distribuída de forma uniforme, dentro do erro máximo
admissível de temperatura especificado no método de ensaio.
5.8.2 Uso
Estufas devem estar equipadas com um sistema de regulação que permite que a
temperatura ou outros parâmetros sejam mantidos estáveis ao longo do volume
inteiro de trabalho. Definir o volume de trabalho para garantir que este é seja
alcançado.

PT – LMC 002

Se a temperatura ambiente é próxima ou maior do que o da incubadora, é

necessário colocar um sistema de resfriamento para a câmara.
As paredes de estufas devem ser protegidas da luz solar.
Se possível, as estufas não devem ser completamente preenchidas em uma única

operação, porque os meios de cultura terão um longo tempo para entrar em
equilíbrio da temperatura, independentemente do tipo de estufa utilizada (por
convecção forçada de ar ou de outra forma). Evitar deixar a porta aberta por longos
períodos.
Ao carregar as estufas, deve ser dada atenção à circulação de ar (ver 10.2.4).
5.8.3 Limpeza e sanitização
Limpar e higienizar regularmente as paredes internas e externas da estufa e, se for o

caso, remover o pó do sistema de ventilação.
5.8.4 Verificação
Verificar a estabilidade da temperatura e da homogeneidade da distribuição de

temperatura durante todo o volume de trabalho da estufa através do uso simultâneo
de termômetros ou termopares com conhecida precisão e faixa de temperatura
adequada.
Use as informações para definir a faixa de operação aceitável da incubadora e a

posição ideal do termômetro usado para monitorar a temperatura de trabalho.
Por exemplo, para atingir uma temperatura alvo de 37 ° C ± 1 ° C quando os dados

de um lado mostrarem um intervalo de 36,8 ° C para 37,3 ° C do outro lado da
estufa, em seguida, a faixa de operação deve ser reduzida para 36,2 ° C para 37,7 °
C, a fim de garantir que a todas as partes da estufa atinjam a temperatura alvo de 37
° C.
Este processo deve ser repetido após cada reparo ou modificação significativa.
PT – LMC 002

A temperatura de operação deve ser verificada com um ou mais termômetros de

máxima e mínima ou termopares gravação, por exemplo.
O termopar ou termômetro de gravação utilizado para o monitoramento de rotina da

estufa deve ser fixado em uma posição definida a partir dos dados de perfil como
atingir a temperatura alvo.
Verifique a temperatura da estufa, pelo menos, a cada dia de trabalho. Para este
efeito, cada estufa deve incorporar pelo menos um dispositivo de medição de
trabalho, cuja sonda pode ser imersa em glicerol (ou outro dissipador de calor
apropriado) contida em um frasco lacrado.
Outros sistemas de verificação de desempenho equivalentes podem ser utilizados.
5.9 Geladeira, câmaras frigoríficas
5.9.1 Descrição
Estes são câmaras que permitem o armazenamento refrigerado. Para a

conservação de amostras de alimentos para análise, a temperatura será de 3°C+2°C
(erro máximo admissível), exceto para aplicações específicas.
Para outros usos, a temperatura, salvo indicação em contrário, deve ser de

5°C+3°C.
5.9.2 Uso
A fim de evitar a contaminação cruzada, use câmaras diferentes, ou pelo menos

diferentes recipientes, para alcançar separação física, para o armazenamento de
- meios de cultura e reagentes não inoculadas,
- amostras de teste, e
- culturas de microrganismos e meios de culturaincubados.

PT – LMC 002

Carregar geladeiras, chillers e câmaras frigoríficas de tal forma que a circulação de

ar adequada seja mantida e o potencial de contaminação cruzada minimizado.
5.9.3 Verificação
Verifique a temperatura de cada câmara a cada dia de trabalho usando um

termômetro ou uma sonda instalada permanentemente. A precisão exigida do
dispositivo de monitoramento de temperatura é dependente do propósito para o qual
a unidade é utilizada.
5.9.4 Manutenção e limpeza
Realizar as seguintes operações de manutenção em intervalos regulares para

garantir a operação adequada:
- remoção da poeira das pás do motor ou do exterior de troca de calor placas;
- descongelação;
- limpeza e higienização do interior das câmaras.
5.10 Freezer e congelador
5.10.1 Descrição
Um freezer é uma câmara que permite o armazenamento de produtos congelados. A

temperatura, a menos que especificada de outra forma, deve ser inferior a -15 ° C,
de preferência abaixo de -18 ° C para as amostras de alimentos.
Um ultra-freezer é uma câmara que permite armazenamento de produtos

ultracongelados. A temperatura, a menos que necessite contrário, deve ser abaixo
de -70 ° C.
5.10.2 Uso
5.10.2.1 Freezer
PT – LMC 002

Câmaras diferentes, ou pelo menos diferentes recipientes, devem estar disponíveis

para conseguir a separação física para o armazenamento de
- reagentes não inoculados,
- amostras para análise, e
-culturas de micro-organismos.
Carregar o freezer de tal forma que a baixa temperatura seja mantida, em particular
quando produtos descongelados são introduzidos.
5.10.2.2Ultra-freezer
É usado no armazenamento de microrganismos de cultura referência, e / ou de

trabalho, e reagente.
Carregar o freezer de tal forma que a baixa temperatura seja mantida, e evite a
contaminação cruzada entre micro-organismos e reagentes.
5.10.3 Verificação
Verificar a temperatura de cada câmara regularmente, usando um dispositivo de

monitorização de temperatura adequado.
5.10.4 Manutenção
Realizar regularmente as seguintes operações de manutenção:
- remoção da poeira das pás do motor e do externo de troca de calor placas (se
acessível);
- descongelação;
- limpeza e higienização do interior das câmaras.

PT – LMC 002

5,11 Banho controlado termostáticamente (banho-maria)
5.11.1 Descrição
Um banho controlado termostáticamente, cheio de um líquido (água, etilenoglicol,

etc), com ou sem tampa ou equipado com outro dispositivo para limitar a
evaporação, é necessária para manter uma temperatura especificada. Controle de
temperatura é muitas vezes mais preciso do que em uma estufa incubadora,
permitindo erros máximos admissíveis de 0,5°C ou menores.
As temperaturas necessárias de trabalho e os erros máximos admissíveis são

estipulados em cada aplicação ou método. Um sistema de resfriamento é necessário
para manter uma temperatura próxima ou abaixo da temperatura ambiente.
5.11.2 Uso
Os principais usos são os seguintes:
- incubação a uma temperatura constante de meios de cultura inoculados;
- manutenção de ágar estéril fundido durante a preparação dos meios;
- manutenção de temperatura de ágar estéril fundido para uso em métodos

específicos;
- preparação de suspensões ou soluções de amostra inicial a uma temperatura

controlada;
- tratamento térmico de suspensões de amostra inicial a uma temperatura controlada

(pasteurização, por exemplo).
Onde o controle preciso da temperatura é necessário, o banho deve ser equipado

com uma bomba de circulação de água e um sistema de regulação de temperatura
automático. Qualquer agitação do líquido não deve causar dispersão de gotículas.

PT – LMC 002

Banhos com tampa são preferíveis para o uso preciso ou altas temperaturas.
Tampas inclinadas que permitem a drenagem de condensado devem ser usadas.
Para a incubação dos caldos inoculados, manter o nível do líquido de modo que a
parte superior do caldo fique pelo menos 2 centímetros abaixo do nível do líquido no
banho durante todo o período de incubação.
Outros recipientes devem ser colocados dentro do banho de forma que o nível do
seu conteúdo seja inferior ao do líquido.
A profundidade de imersão deve impedir a entrada de água através do fechamento.
Dispositivos para manter a estabilidade dos recipientes podem ser necessários, por
exemplo, estantes.
Todos os recipientes devem ser secados após a remoção do banho e antes de nova
utilização.
Verificar a estabilidade e homogeneidade da temperatura em todo o banho antes do

uso inicial e depois de qualquer reparo ou modificação que tenha um efeito sobre o
controle de temperatura.
Monitorar cada banho com um dispositivo termopar, termômetro, ou gravador de

temperatura com o mínimo adequado grau de incerteza de medição (ver 5.28.2), e
independente do sistema de regulação de temperatura automático.
Um display digital também pode ser usado, desde que a sua precisão e resolução
sejam verificadas.
Monitorar a temperatura do banho durante cada uso ou pelo menos diariamente, por
períodos prolongados de incubação.
5.11.4 Manutenção

PT – LMC 002

Banhos devem ser preenchidos com líquido, tal como recomendado pelo fabricante.
Para a incubação das culturas, água destilada ou deionizada deve ser
preferencialmente utilizada.
Verifique regularmente o nível do líquido para garantir o correto funcionamento do

banho e imersão satisfatória de itens na banheira. O nível do líquido deve cobrir
sempre os elementos de aquecimento.
Banhos devem ser esvaziados, limpos, higienizados e reabastecidos regularmente e

com uma frequência dependendo do uso, ou depois da ocorrência de um derrame.
5.12 Vaporizadores, incluindo banhos de água fervente
5.12.1 Descrição
Vapor de água fervente e banhos consistem de um elemento de aquecimento

cercado por água em um recipiente com uma tampa aderente. Um banho de água
fervente aquece a água a uma temperatura igual ou próxima ao ponto de ebulição,
com ou sem a produção de vapor.
5.12.2 Uso
Os principais usos são os seguintes:
-derretimento de ágar;
- preparação de meio termo lábil;
- redução da contaminação de pequenos itens de equipamentos entre o uso.
O nível seguro e adequado de água deve estar presente no recipiente para garantir
que os elementos de aquecimento estão cobertos em todos os momentos.
Autoclave com um compartimento para liberar vapor também pode ser usado.
5.12.3 Manutenção
PT – LMC 002

Mantenha vaporizadores e banhos de água fervente com água limpa.
Se necessário, descalcificação regular deve ser feita a uma frequência dependente

da dureza da água local.
5.13 Forno de esterilização
5.13.1 Descrição
Um forno de esterilização é uma câmara que é capaz de manter uma temperatura

de 160°C a 180°C para a destruição de micro-organismos pelo calor seco.
5.13.2 Uso
Apenas os equipamentos robustos, como vidro e metal para devem ser esterilizados
no forno de esterilização, não usá-lo para artigos de plástico e borracha.
Antes da esterilização, limpe todos os vidros e metais para serem esterilizados no

forno.
Se vidro volumétrico for esterilizado no forno de esterilização, deve-se verificar

regularmente a precisão dos volumes marcados.
A temperatura deve ser uniforme em toda a câmara. O forno deve estar equipado
com um termostato e um dispositivo de termômetro ou de gravação de temperatura
com precisão adequada.
Deve ser equipado com um indicador de tempo, ou temporizador.
Uma vez que a temperatura de funcionamento é atingida, o processo de

esterilização deve durar pelo menos 1 hora a 170°C ou uma equivalente combinação
de tempo/temperatura.
Após a esterilização, para evitar rachaduras, vidros devem ser mantidos no forno até
seu resfriamento antes da remoção.

PT – LMC 002

Verificar a estabilidade e homogeneidade da temperatura durante todo o forno antes

do uso inicial e depois de qualquer reparação ou modificação que possa ter um
efeito sobre o controle de temperatura.
O forno deve estar equipado com um dispositivo termopar termômetro, ou

temperatura de gravação-calibrada de precisão adequada, que é independente do
sistema de regulação de temperatura automático. O monitoramento do dispositivo
deve ter uma resolução de 1°C, ou melhor, na temperatura do forno utilizado.
A temperatura do forno deve ser monitorada e gravada durante cada uso.
5.13.4 Manutenção
Limpar as superfícies internas quando necessário.
5.14 Micro-ondas
5.14.1 Descrição
Um forno de micro-ondas é um dispositivo que permite o aquecimento de itens por

energia de micro-ondas em pressão atmosférica.
5.14.2 Uso
o uso disponível do equipamento atualmente é apenas para aquecer líquidos ou

derreter meios de cultura com ágar.
ATENÇÃO - Não aqueça meios contendo componentes sensíveis ao calor no

micro-ondas a menos que tenha sido verificado que esta forma de
aquecimento não tem nenhumefeito sobre o desempenho do meio. Nenhuma
avaliação ainda foi feita da eficiência do micro-ondas para esterilizar meios de
cultura e fornos de micro-ondas não devem ser usado para esta finalidade.

PT – LMC 002

O forno deve ser capaz de aquecer líquidos e meios de cultura de forma controlada
através de um ciclo de emissão de micro-ondas. A distribuição das micro-ondas
deve ser homogênea para evitar zonas de superaquecimento. Fornos equipados
com disco girador ou um agitador para o micro-ondas possuem uma melhor
distribuição de calor.
Não utilize o equipamento de metal, incluindo os fechos de metal. Solte tampas de

garrafas ou tampas antes do aquecimento.
Aquecimento por períodos mais longos em avaliações de baixa potência pode dar
uma melhor distribuição de calor.
ATENÇÃO - Manuseie itens aquecidos com cuidado. Conteúdo podem se

tornar superaquecidos e podem ferver para fora das garrafas ou as garrafas
podem explodir.
O ágar deve derreter em uma configuração de baixa potência (por exemplo, ciclo de
degelo), e um dissipador de calor da água (por exemplo, 50 ml a 100 ml de água
emum copo de micro-ondas) são recomendados para auxiliar o controle do processo
de aquecimento.
Um tempo de espera de pelo menos 5 min é recomendada após o processo de

aquecimento antes da remoção do frasco, do forno de micro-ondas.
Tempos de aquecimento adequado e ajustes de potência devem ser estabelecidos

primeiro para os diferentes volumes de líquidos e meios de cultura rotineiramente
manuseados, para garantir um ótimo desempenho e evitar superaquecimento de
produtos sensíveis.
5.14.4 Manutenção

PT – LMC 002

Limpar o forno imediatamente caso ocorra qualquer derrame, bem como em

intervalos regulares, dependendo do uso.
Selos de porta dos fornos devem ser inspecionados para verificação da integridade
e o forno checado para vazamento de radiação em intervalos regulares.
5,15 Lavador de vidro
5.15.1 Descrição
Lavadores de vidro de laboratório são máquinas controladas eletronicamente para

lavagem geral de vidraria de laboratório, que podem ser programadas para
diferentes ciclos de lavagem e enxágue (por exemplo, água destilada ou deionizada
ou ácido).
Dispositivos para lavagem de pipetas de vidro são lavadores de vidro projetados

especialmente para limpar os orifícios estreitos de pipetas.
5.15.2 Uso
Muitos tipos de máquina de lavar vidro estão disponíveis, e estes são, geralmente,
instalados e utilizados de acordo com instruções do fabricante.
Verificar a eficácia da limpeza por inspeção visual e, em aplicações críticas, realizar

testes para assegurar que o vidro esta isento de substâncias inibidoras.
Resíduos alcalinos ou ácidos podem ser verificados por meio de uma solução
deindicador de pH, um pH dentro da faixa de 6,5 a 7,3 deve ser alcançado.
5.15.4 Manutenção
Programar manutenção regular, conforme especificado pelo fabricante, com uma

frequência adequada.

PT – LMC 002

Manutenção mais frequente pode ser necessária para equipamentos muito usados
ou em áreas de águas duras.
5.16 Microscópio óptico
5.16.1 Descrição
Existem diferentes tipos de microscópio: binocular, monocular, com um sistema de

visualização por monitor, equipados com uma câmera de fluorescência, com uma
fonte de luz interna ou externa. Para exames bacteriológicos, objetivas de 10X (lente
seco) a 100X (imersão em óleo e com mola turret) são usados para obter uma
ampliação total de 100 a 1000X. Microscopia de contraste de fase também é de
valor inestimável para o exame de "Preparações liquidas".
5.16.2 Uso
Configure o sistema ótico do microscópio de acordo com as instruções do fabricante.

O eixo óptico da luz da lâmpada de alta intensidade deve passar pelo centro do
condensador de sub-estágio, o deslizador e a lente objetiva pela ocular para que
aberrações esféricas e cromáticas não ocorram.
5.16.3 Manutenção
Siga as instruções do fabricante para o armazenamento, a limpeza e manutenção.

Evitar a condensação que ocorre quando a umidade é alta, pois isso pode levar à
deterioração da qualidade da lente.
Cada dia ou após o uso, remover o óleo das lentes de imersão e peças relacionadas
com o tecido da lente. Use um solvente recomendado pelo fabricante. Regularmente
remover da lente ocular a gordura causada por cílios.
O sistema óptico pode ser facilmente danificado, é desejável que a manutenção seja
feita de preferência pelo fabricante.
5.17 Bico de Bunsen ou incinerador de fio

PT – LMC 002

5.17.1 Descrição
Bico de Bunsenproduz uma chama nua estreita a partir de rede de gás ou bujão.
Variando a quantidade de ar misturado com o gás para controlar o grau de calor
produzido.
Incineradores de fio usam gás ou eletricidade para alcançar calor vermelho sem uma
chama para esterilizar alças ou agulhas usados para a manipulação de culturas.
5.17.2 Uso
Um bico de bunsen é usado principalmente para a esterilização de alças de metal e

agulhas, trazendo-os ao calor vermelho e para outros pequenos itens de
equipamentos duráveis a chama - esterilizante.
O incinerador de fio é usado para esterilizar alças de metal e agulhas, e é preferido

ao manusear bactérias patogênicas, uma vez que evita respingos e evita riscos de
contaminação cruzada.
Queimadores a gás podem produzir muito calor e turbulência do ar no laboratório.
Técnica de assepsia pode ser alcançada sem um queimador de gás, utilizando

materiais descartáveis. Em cabines de segurança biológica, o uso de queimadores a
gás deve ser evitado, pois podem interferir inaceitavelmente com o fluxo laminar de
ar. Neste caso, o uso de material descartável estéril é recomendado.
5.17.3 Manutenção
Limpar e desinfetar regularmente bicos de bunsen e capas dos incineradores de fio,

especialmente se qualquer cultura microbiana tiver sido derramada sobre os
dispositivos.
5.18 Dispenser para meios de cultura e reagentes
5.18.1 Descrição

PT – LMC 002

Um dispensador é um instrumento ou dispositivo utilizado para distribuir meios de

cultura e reagentes em tubos, frascos ou Placas de Petri. Tais dispositivos variam de
cilindros de medição simples, pipetas ou seringas manuais, até seringas automáticas
e bombas peristálticas programáveis por dispositivos controlados eletronicamente,
com uma entrega variável automática.
5.18.2 Uso
Equipamento limpo usado para distribuição de meios de cultura e reagentes deve

estar livre de substâncias inibidoras. Usar tubulação separada para meios seletivos
para minimizar o carreamento de tais substâncias.
Se a distribuição asséptica de meios de cultura estéreis e reagentes é necessária,

todas as partes do equipamento de dispensação em contato com o produto devem
ser estéreis.
A incerteza de medição do instrumento ou aparelho deve ser adequada para o

máximo de erro admissível no volume a ser dispensado, que não deve exceder 5%
rotineiramente. O máximo de erro admissível em medição de volumes de líquido de
diluição usado para preparar diluições decimais é 2%.
Verifique volumes dispensados antes do uso inicial, depois, regularmente, de acordo

com um cronograma documentado, e sempre após os ajustes que afetam o volume
dispensado.
5.18.4 Limpeza e manutenção
Limpar a superfície externa do dispenser após cada utilização. Lavar e enxaguar

bem todas as partes do dispenser que entrarem em contato com o produto e
esterilizá-los se necessário para o uso em líquido estéril. Não utilizar desinfetantes
em superfícies que entrem em contato com o produto para ser dispensado, pois
podem transmitir propriedades inibidoras.

PT – LMC 002

Todos os dispensadores automáticos deverão ser mantidos em boas condições de

manutenção, de acordo com as instruções do fabricante.
5.19 Vórtex
5.19.1 Descrição
Este instrumento facilita a mistura homogênea de meios líquidos (por exemplo,

diluições decimais e amostras de líquido para teste) ou suspensões de células
bacterianas em um líquido.
A mistura é alcançada por um movimento de rotação excêntrica do conteúdo do tubo

ou recipiente (produzindo um vórtex).
5.19.2 Uso
Pressione a base do tubo ou recipiente contendo o líquido a ser misturado contra a

cabeça do mixer. A velocidade de mistura é controlada pela variação da velocidade
do motor ou o ângulo de contato com a cabeça do mixer.
O operador deve assegurar que o derramamento não ocorra durante a mistura,

ajustando a velocidade quando necessário e segurando o tubo aproximadamente
um terço de seu comprimento abaixo do topo, a fim de ser capaz de controlar melhor
o tubo e, evitar que o líquido suba muito alto no tubo.
Precauções apropriadas devem ser tomadas para minimizar a libertação de

aerossóis ao abrir recipientes em agitação.
Mistura adequada é evidenciada pelo aparecimento de um vórtice em toda a

profundidade do líquido durante a operação de mistura.
5.19.4 Manutenção

PT – LMC 002

Manter o equipamento limpo. Se ocorrer o derramamento, descontaminar o

equipamento usando um desinfetante de laboratório adequado.
5.20 Contador de Colônias
5.20.1 Descrição
Contador de colônias manual utiliza dispositivo de contagem acionadas por pressão

e, geralmente, dão uma indicação audível de cada contar e possuem um visor digital
da contagem geral. Elas podem ser simples dispositivos pen-like ou podem consistir
de um suporte iluminado com uma grade calibrada para a placa e uma lente de
aumento para ajudar na detecção de colônia. Contadores de colônia eletrônicos
automatizados, analisadores de incorporadores de imagem, operam por uma
combinação de sistemas de hardware e software, incorporando o uso de uma
câmera e um monitor.
5.20.2 Uso
Seguir as instruções do fabricante. Ajustar a sensibilidade de um contador

automático para garantir que todas as colônias serão contadas. Contadores
eletrônicos automatizados de colônia também exigem programação separada,
quando utilizado com diferentes tipos de agar e matrizes, e para a contagem em
spreadplate e pourplate, para assegurar adequada discriminação de colônias alvo.
Verificações devem ser feitas manualmente em uma base regular para assegurar
que as contagens precisas são obtidas utilizando um contador de colônia.
Além disso, contadores de colônias automatizados devem ser verificados a cada dia
de utilização com uma placa de calibração contendo um conhecido número de
partículas contável ou colônias.
5.20.4 Manutenção

PT – LMC 002

Manter o equipamento limpo e livre de poeira, evitar arranhar as superfícies que são
um elemento essencial do processo de contagem. Programar a manutenção
periódica de contadores eletrônicos que incorporam analisadores de imagem como
especificado pelo fabricante, em uma freqüência adequada.
5.21 Equipamento para cultura em atmosfera modificada
5.21.1 Descrição
Este pode ser um frasco que possa ser hermeticamente fechado ou qualquer outro
equipamento apropriado que permita condições de atmosfera modificada (por
exemplo, para anaerobiose) para ser mantido durante o tempo total de incubação do
meio de cultura. Outros sistemas de desempenho equivalente tais como cabines de
anaerobiose, podem ser usados.
Siga as instruções do fabricante para a instalação e manutenção.
5.21.2 Uso
A composição da atmosfera necessária pode ser obtida por meio da adição de uma
mistura de gases (por exemplo, de um cilindro de gás) após a saída do ar do frasco,
pelo deslocamento da atmosfera em uma cabine ou por qualquer outro meio
apropriado (como pacotes de gás disponível no mercado).
Em geral, incubação anaeróbica requer uma atmosfera de menos de 1% de

oxigênio, 9% a 13% de dióxido de carbono; incubação microaeróbica (capnaeróbica)
requer uma atmosfera de 5% a 7% de oxigênio e cerca de 10% de dióxido de
carbono.
Condições talvez precisem ser modificadas dependendo das exigências do micro-

organismo específico.

PT – LMC 002

Coloque um indicador biológico ou químico para monitorar a natureza da atmosfera

em cada câmara durante cada uso. Crescimento da estirpe controle ou uma
mudança de cor do indicador químico verifica se as condições de incubação
apropriada foram alcançadas.
5.21.4 Manutenção
Se um catalisador é montado, deve-se regenerá-lo regularmente, em conformidade

com as instruções do fabricante. Se as válvulas estão instaladas, limpar e lubrificar-
las para garantir o funcionamento correto e substituir se necessário.
Regularmente limpar e higienizar o equipamento.
5.22 Centrífuga
5.22.1 Descrição
Centrífugas são dispositivos operados mecânica ou eletronicamente que usam a

força centrífuga para separar partículas suspensas, incluindo micro-organismos, a
partir de fluidos.
5.22.2 Uso
Em algumas aplicações, a concentração de micro-organismos alvo é atingida por

centrifugação de amostras de líquido para promover a formação de um deposito que
pode ser ressuspenso em líquido e submetido a um exame mais aprofundado.
Tomar as precauções necessárias para impedir a geração de aerossóis e

contaminação cruzada, pelo uso correto do equipamento e o uso de tubos de
centrifugação fechados e estéreis ou potes.

PT – LMC 002

Onde a velocidade de centrifugação é crítica ou especificada no ensaio, utilizar

regularmente um indicador de velocidade e tacômetro calibrado independente, e
sempre após reparos ou modificações significativas.
5.22.4 Manutenção
Limpar e desinfetar centrífugas regularmente e após qualquer derrame envolvendo

culturas microbianas ou amostras potencialmente contaminadas.
Centrífugas devem ser sofrer manutenção regularmente.
5.23 Placa de aquecimento
5.23.1 Descrição
Placas de aquecimento são dispositivos de aquecimento controlados

termostáticamente. Alguns equipamentos incorporam sistemas de agitação
magnética.
5.23.2 Uso
Placas de aquecimento equipados com sistemas de agitação magnética são

utilizados para aquecimento de grande volumes líquidos, tais como meios.
Não use placas de aquecimento sem sistemas de agitação para a preparação dos
meios de cultura.
5.23.3 Manutenção
Limpar qualquer derrame logo que a unidade for resfriada.
5.24 Plaqueador espiral automático
5.24.1 Descrição

PT – LMC 002

O plaqueador espiralautomáticoé um equipamento que distribui um volume

predeterminado de líquido sobre a superfície de uma placa de ágar em rotação. O
braço de distribuição se move do centro do placa para a borda de fora, formando
uma Espiral de Arquimedes. O volume dispensado diminuí assim que o dispensador
de distribuição se move do centro para a borda da placa, de modo que se forme uma
relação inversa entre o volume depositado e o raio da espiral. O volume da amostra
dispensado em qualquer segmento específico é conhecido e é constante. Uma fonte
de vácuo é necessária para o carregamento e distribuição de líquidos.
5.24.2 Uso
O equipamento é utilizado para dispensar uma amostra de líquido, uma amostra

homogeneizada ou uma diluição em uma placa de ágar adequada, a fim de
determinar a contagem de colônias. Após a incubação, as colônias se desenvolvem
ao longo das linhas onde o líquido foi depositado. O número de colônias em uma
área conhecida é contada usando uma grade de contagem fornecido com o
equipamento e a contagem calculada.
A superfície da placa de ágar usada como base deve ser reta e livre de bolhas de ar.
As placas devem ser pré-secadas antes do uso para garantir que estão livres do
excesso de umidade.
O sistema de distribuição deve ser higienizado e lavado com água estéril antes de
cada amostra e após o uso.
Verificar o ângulo de ponta da caneta diariamente usando um vácuo para segurar

uma lamínula sobre a face da caneta. A tampa de deslizamento deve ser paralela e
a 1 mm da superfície do ágar.
O padrão de distribuição deve ser verificado por meio da supressão de tinta lavável.
O padrão espiral deve ser mais denso próximo ao centro do placa onde a deposição

PT – LMC 002

começa e tornar-se cada vez menos denso, no ponto de saída da caneta. A porção
clara da placa deve ser central e com cerca de 2,0 cm de diâmetro.
Uma verificação diária deve ser realizada para garantir que a ponta da caneta esteja
no ângulo correto para a superfície do ágar usando a tampa de deslizamento e
indicador de nível fornecido com o instrumento.
A esterilidade da placa espiral deve ser verificada por plaqueamento de água estéril
para cada série de amostras examinadas.
Uma verificação gravimétrica do volume de dispensados deve ser realizada

regularmente com água destilada. A massa obtida deve estar dentro de um erro
máximo admissível de +5% da massa esperada para o volume dispensado.
5.24.4 Manutenção
Desinfecção da tubulação de distribuição e da caneta pode ser conseguida através

de lavagem com uma solução contendo 0,5% a 1% de cloro livre. Isto deve ser
seguido por enxágue com água destilada ou deionizada estéril.
Bloqueios podem ser evitados utilizando suspensões ou uma parcela do líquido

sobrenadante, para que todas as partículas sejam removidas antes da colocação da
suspensão da amostra.
Eventuais derrames devem ser removidos imediatamente e os equipamentos limpos

em uma base regular.
O equipamento deve ser reparado e verificado de acordo com o uso.
5.25 Destiladores, deionizadores e aparelhos de osmose reversa
5.25.1 Descrição

PT – LMC 002

Estes dispositivos são usados para produzir água destilada ou deionizada/

desmineralizada com a qualidade exigida para a preparação de meios de cultura
microbiológicos ou reagentes de laboratório e para outras aplicações.
5.25.2 Uso
Instalar, autorizar e usar equipamentos em conformidade com as instruções do

fabricante, tendo em conta a localização da água de laboratório, resíduos e serviços
elétricos.
Água deve ser controlada regularmente, ou quando usada após o armazenamento

para condutividade satisfatória, e não será mais de 10μS/cm para o preparo de
meios e reagentes.
Se a água é armazenada antes do uso ou produzida através de um trocador de íons,

controles adequados de contaminação microbiana devem ser realizados em
conformidade com o PT-LMC-003 –PREPARO E AVALIAÇÃO DE MEIO DE
CULTURA.
5.25.4 Manutenção
Destiladores devem ser limpos e descalcificados com uma frequência dependente

da dureza da água de entrada. Deionizadores e aparelhos de osmose reversa
devem ser mantidos de acordo com as instruções do fabricante.
5.26 Temporizadores e dispositivos de temporização (timer)
5.26.1 Descrição
Dispositivos de temporização e temporizadores integrais são instrumentos que

permitem que o período de tempo correto seja usado para muitas aplicações no
laboratório, onde a duração é especificada e crítica.

PT – LMC 002

5.26.2 Uso
Timer analógico ou digital, portátil ou de bancada são usados para monitorar a

duração das operações de laboratório (Por exemplo, aplicação de manchas de
filmes microbianos, homogeneização das amostras) devem estar em boas condições
de funcionamento e capazes de alcançar a precisão exigida.
Operar timer integrado sobre equipamentos de laboratório (por exemplo, autoclaves,

centrífugas, homogeneizadores), em conformidade com as instruções do fabricante.
Estes temporizadores devem ser capazes de alcançar a precisão exigida.
Verifique todos os temporizadores utilizados nas operações de laboratório, onde a

duração é fundamental para o resultado, com outro marcador de tempo
regularmente, e após reparos significativos.
5.26.4 Manutenção
Limpar e verificar regularmente o timer para o funcionamento correto.
Dispositivos de tempo integral devem ser verificados como parte do procedimento de

manutenção para o instrumento.
5.27 Pipetas e pipetadores
5.27.1 Descrição
Pipetas são dispositivos de vidro ou de plástico descartáveis usados para fornecer

volumes de materiais líquidos ou viscosos; pipetas graduadas entregam volumes
medidos com uma precisão que depende da especificação.
Pipetadores automáticos (mecânicos) equipados com pontas de plástico são

dispositivos que dispensam volumes fixos ou ajustáveis de líquidos, manualmente
ou por ação de pistão operado eletronicamente.

PT – LMC 002

5.27.2 Uso
Descartar pipetas que estão danificadas ou quebradas.
Pipetas Pasteur estéreis ou pipetas graduadas e ponteiras devem ser equipadas

com uma ficha de lã de algodão não-absorvente para evitar contaminação quando
usado para manipular culturas microbianas.
Não executar pipetagem com a boca em instalações microbiológicas, exceto para

líquidos não-contaminados.
Bulbos usados em pipetas Pasteur ou pipetas graduadas e em ponteiras para

pipetadores automáticos devem ser do tamanho correto para evitar saída de liquido
e garantir um funcionamento eficiente.
Verificar se as pipetas graduadas entregam o volume correto, se o fabricante não

certificar a sua exatidão (veracidade e precisão).
Testar os pipetadores novos antes de entrar em uso, e em intervalos regulares,

dependendo da frequência e natureza de uso, para confirmar que estão em acordo
com os erros máximos admissíveis definidos em norma específica. Executar
checagem gravimétrica intermediária usando água destilada ou deionizada para
garantir que os volumes dispensados permanecem dentro dos erros máximos
admissíveis.
Confira novos lotes de pipetas graduadas.
5.27.4 Manutenção
Descontaminar e limpar/ esterilizar apropriadamente pipetas não-descartáveis e

pipetadores automáticos, após cada uso.

PT – LMC 002

Se os barris ou pistões de pipetadores automáticos se contaminarem em uso,

desmontá-los para descontaminação e limpeza. Após a montagem, recalibrá-los.
Quando não for possível que isso seja feito em laboratório, retornar o pipetadores ao
fabricante para a montagem e recalibração.
5.28 Termômetros e dispositivos de monitorização da temperatura, incluindo

aparelhos de registro automático
5.28.1 Descrição
Termômetros são dispositivos de mercúrio ou álcool em vidro que são usados para
monitorar temperaturas em toda a gama de atividades de laboratório.
Outros dispositivos de monitorização da temperatura incluem termômetros de

resistência de platina e os instrumentos que usam termopares para medir
temperatura e fornecer um registro visual, impresso ou eletrônico de temperatura
com variação do tempo.
Termômetros de referência e outros dispositivos de monitorização da temperatura

devem ser calibrados para padrões nacionais ou internacionais e certificada como
tal. Eles devem ser utilizados apenas como referência e não deve ser utilizado para
o monitoramento de rotina.
Termômetros de trabalho e outros dispositivos de gravação de temperatura devem

ser calibrados de forma que permita rastreabilidade a padrões nacionais ou
internacionais.
Dispositivos de precisão adequados, que estejam em conformidade com uma

especificação internacional ou nacional podem também ser usados como
termômetros de trabalho após verificação da sua performance.
5.28.2 Uso

PT – LMC 002

Termômetros e outros dispositivos de monitorização da temperatura devem ser

capazes de medir a temperatura requerida por um aplicativo dentro de determinados
erros máximos admissíveis.
A incerteza de medição do dispositivo de monitoramento de temperatura deve ser

quatro vezes menor do que o alcance do erro máximo admissível solicitado. Por
exemplo, para um erro máximo permissível de +1°C, a incerteza de medição deve
ser de +0,25°C, para um erro máximo permissível de +0,5°C, a incerteza de medição
deve ser de ± 0,125°C. A incerteza de medição da calibração do termômetro de
referência também deve levar em conta a determinação da temperatura de
funcionamento.
Termômetros ou termopares colocados em incubadoras de ar devem ser protegidos

em recipientes adequados cheio de glicerol, parafina líquida ou polipropilenoglicol
para proteger contra a perda de calor quando a porta é aberta e fornecer uma leitura
estável.
Usar termômetros de imersão total com apenas o bulbo imerso.
Termômetros colocados em banhos-maria devem ser imersos na água, em

conformidade com as especificações individuais, por exemplo, imersão parcial
termômetros devem ser imersos na profundidade especificada para esse
termômetro, por exemplo, 76 mm ou 100 mm.
Não usar termômetros se a coluna de mercúrio ou álcool estiver quebrada.
Termômetros de mercúrio em vidro são frágeis e, se houver um risco de quebra, eles

devem ser colocados dentro de dispositivos de proteção que não interferem com as
medições de temperatura.
AVISO - O mercúrio é perigoso para a saúde. Remover derrames, em

conformidade com regulamentos da legislação nacional.

PT – LMC 002

Termômetros de referência devem ser calibrados em todos os pontos com padrões

rastreáveis nacionalmente ou internacionalmente, antes do uso inicial e pelo menos
a cada 5 anos. Verificação intermediária de um único ponto de calibração (por
exemplo, ponto de gelo) deve ser realizada para verificar o desempenho.
Termopar de referência deve ser totalmente calibrado com padrões rastreáveis

nacionalmente ou internacionalmente, antes do uso inicial e de acordo com
instruções do fabricante. Verificações intermediárias são efetuadas com um
termômetro de referência para verificar o desempenho.
Outros dispositivos de monitorização da temperatura (como receptores de ondas de

rádio) devem ser calibrados com padrões rastreáveis de acordo com normas
nacionais ou internacionais, em conformidade com as instruções do fabricante.
Termômetros de trabalho e termopares devem ser verificados no ponto de gelo e /

ou com um termômetro de referência na faixa de temperatura de trabalho.
5.28.4 Manutenção
Manter termômetros e termopares em bom estado de limpeza.
Manter outros dispositivos de monitorização da temperatura de acordo com as

instruções do fabricante.
5.29 Separadorimunomagnético
5.29.1 Descrição
Este equipamento é usado para separar e concentrar microrganismos alvo em

culturas líquidas por meio de esferas paramagnéticas revestidas com um anticorpo
apropriado.
Separador manual consiste de um misturador rotativo capaz de ir de 12 RPM a 20

RPM, e um concentrador de partículas com uma barra magnética removível.

PT – LMC 002

Separadores automáticos usam matrizes de barras magnéticas e suportes de tubos.

As partículas magnéticas mudam de tubo para tubo e permitem que o processo
inteiro de separação, incluindo as etapas de lavagem, possa ser executado
automaticamente em um ambiente fechado.
5.29.2 Uso e verificação
Siga as instruções do fabricante para uso e aquelas dadas em normas específicas

(por exemplo, E. coli O157).
Para o sistema manual, verificar a velocidade de rotação do misturador.
Para sistemas manuais e automatizados, verifique se o sistema é capaz de isolar em

baixos níveis o micro-organismo alvo antes de colocá-lo em uso rotineiro.
É importante valorizar o potencial de contaminação cruzada durante os

procedimentos de separação manual e tomar as medidas adequadas para evitar que
isso aconteça.
5.29.3 Manutenção
Inspeção e manutenção do equipamento de acordo com as instruções do fabricante.
5.30 Sistema de filtragem
O sistema de filtração utilizado deve ser como descrito no PT-LMC-003 Preparo e

avaliação dos meios de cultura.
5.31 Outros equipamentos e software
Outro equipamento e seu software associado deverão ser capazes de alcançar a

precisão necessária e deve estar em conformidade com as especificações
relevantes para os testes em questão. Programas de calibração devem ser
estabelecidos para quantidades ou valores fundamentais em que essas
propriedades têm um efeito significativo sobre o resultado. Antes de uso rotineiro,

PT – LMC 002

calibrar ou verificar o equipamento para comprovar que ele atende aos requisitos do
laboratório e está em conformidade com as especificações padrão. Quaisquer
reconfigurações ou modificações feitas pelo laboratório para o software devem ser
verificadas para garantir que o software modificado de o resultado correto.
6.0 PREPARAÇÃO DE MATERIAIS DE VIDRARIA DE LABORATÓRIO E

OUTROS
6.1 Preparação
Vidro e materiais de laboratório utilizadas em microbiologia devem ser de projetos

adequados, utilizados de forma adequada e preparados de modo a garantir a sua
limpeza e/ ou esterilidade até o momento do uso.
Deve ser projetado para evitar ou limitar o contato entre o operador e o material
infectante.
Tubos e garrafas devem ser fechados pelos meios adequados. Se necessário vidros
a serem esterilizados (pipetas, por exemplo) devem ser colocados em recipientes
especiais ou envolto em um material apropriado (papel especial, papel alumínio,
etc.) Vidraria para ser autoclavada vazia deve permitir o acesso livre de vapor, caso
contrário, a esterilização não será alcançada.
6.2 Esterilização / descontaminação
6.2.1 Geral
A temperatura e a duração da esterilização / descontaminação devem ser

registradas. Indicadores de esterilização podem ser usados para distinguir entre
materiais esterilizados e não esterilizados.
6.2.2 Esterilização por calor seco
Aquecer vidros, etc, em um forno de esterilização por pelo menos 1 hora a 170°C ou
equivalente.
PT – LMC 002

6.2.3 Esterilização por calor úmido (vapor)
Vapor úmido sob pressão é o método mais eficaz de esterilização de vidraria de

laboratório e materiais.
A temperatura da câmara de autoclave deve ser mantida em 121°C por pelo menos
15 min (ver 5.6).
6.2.4 Descontaminação com compostos químicos
Use compostos químicos (por exemplo, produtos à base de cloro, álcoois,

compostos quaternários de amônio) em concentrações adequadas e por um tempo
de contato adequado.
Assegurar que os resíduos químicos não afetará a recuperação de micro-

organismos.
6.3 Equipamentos e materiais descartáveis
Equipamentos e materiais descartáveis podem ser usados em vez de equipamentos

e materiais reutilizáveis (vidro, placas de Petri, pipetas, frascos, tubos, alças,
espalhadores, etc), se as especificações forem semelhantes.
É aconselhável verificar se tal equipamento é adequado para uso em microbiologia

(em especial no que diz respeito à sua esterilidade) e que o material não contém
substâncias que inibem o crescimento de micro-organismos.
6.4 Armazenamento de objetos de vidro limpo e materiais
Proteger os vidros limpos e materiais contra a poeira durante o armazenamento, em

condições que irá manter a sua limpeza.
6.5 Gerenciamento de objetos de vidro esterilizado e materiais

PT – LMC 002

Armazenar vidro e materiais em condições que garantam que eles permaneçam

estéreis. Armazenar equipamento de uso único, de acordo com as instruções do
fabricante, sem qualquer deterioração da embalagem.
Armazenar equipamentos de preparo de laboratório em condições limpas.
Quando o equipamento esterilizado é destinado para microbiologia, coloque uma

data de validade (ou data de fabricação) em cada pacote.
6.6 Uso de descontaminação e desinfecção
6.6.1 Descontaminação de equipamentos descartáveis
Descontaminar material descartável antes da sua eliminação.
Além dos métodos descritos nesta cláusula, a incineração pode ser usada. Se
houver um incinerador no local, descontaminação e descarte podem ser realizados
em uma única operação.
6.6.2 Descontaminação de artigos de vidro e materiais antes da sua utilização
Em geral, a esterilização dos equipamentos deve ser feito por calor úmido (ver 6.2.3)
ou calor seco (ver 6.2.2).
Em certas situações (por exemplo, amostragem de campo), descontaminação

química pode ser apropriada. Após o tratamento, os equipamentos devem estar
livres de substâncias inibidoras.
6.6.3 Descontaminação de artigos de vidro e materiais após o uso
Materiais para descontaminação e eliminação devem ser colocados em recipientes,

por exemplo, sacos de plástico autoclavável. Aautoclavagem é o método preferido
para todos os processos de descontaminação (pelo menos 30 min a 121°C). A
autoclave deve ser carregada de uma maneira que favoreça a penetração do calor

PT – LMC 002

para a carga (por exemplo, sem excesso de embalagem) e tendo o cuidado de soltar
tampas / abrir sacos.
Método alternativo, que não a autoclave, pode ser usado se for permitido pelos
regulamentos nacionais.
Autoclave todos os equipamentos que tenham estado em contato com culturas

microbiológicas (meios de cultura sólidos ou líquidos), incluindo frascos reutilizáveis
antes de serem lavados.
Durante o exame, descontaminação por imersão em desinfetante preparada

recentemente use a diluição para equipamentos pequenos e equipamentos
resistentes à corrosão (pipetas, por exemplo).
Use pipetas Pasteur apenas uma vez.
A maioria dos desinfetantes possuem alguns efeitos tóxicos. Use luvas e óculos de
proteção quando manusear desinfetante concentrado.
6.7 Gestão de resíduos
O descarte correto de material contaminado não afeta diretamente a qualidade da

análise da amostra, mas é uma questão de gestão de laboratório.
Deve estar de acordo com normas nacionais ambientais, de saúde e de segurança.
Um sistema para a identificação e separação de materiais contaminados e suas

embalagens devem ser estabelecidos
- para lixo não contaminado (por exemplo, amostras de alimentos não inoculadas)
que pode ser descartado no lixo em geral,
- bisturis, agulhas, facas, vidro quebrado,
-material contaminado para autoclavagem e reciclagem, e

PT – LMC 002

- material contaminado para autoclave e eliminação, ou para eliminação somente se

o material for ser incinerado (ver, No entanto, os requisitos especiais para o risco de
categoria 3 microrganismos abaixo).
Incineração de materiais contaminados e seus recipientes devem ser realizados em

conformidade com a legislação nacional ambiental, de saúde e de segurança.
Materiais contaminados com microrganismos de categoria risco de 3 e seus

recipientes devem ser autoclavados antes de serem incinerados.
6.8 Lavagem
Lavar equipamentos reutilizáveis somente depois de ter sido descontaminados.

Após a lavagem, enxágue todo o equipamento com água deionizada/ destilada.
Equipamentos especializados podem ser usados para facilitar as operações de

limpeza (por exemplo, uma máquina de lavar pipeta, máquina de lavar louça, através
de ultrassom).
Após a lavagem, equipamentos reutilizáveis devem estar livres de resíduos que

possam afetar o crescimento subsequente de micro-organismos.
7.0 PREPARAÇÃO E ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA
Preparar e esterilizar meios de cultura, de acordo com as instruções do PT-LMC-003

Preparo e avaliação dos meios de cultura.
8.0 AMOSTRAS DE LABORATÓRIO
8.1 Amostragem
8.1.1 Geral
Embora extremamente importante para a interpretação dos resultados, amostragem

e planos de amostragem não são uma parte desta Norma. É importante que o

PT – LMC 002

laboratório receba uma amostra representativa do lote do produto que não tenha
sido danificada ou alterada durante o transporte e armazenamento.
A amostra deve ser protegida contra a contaminação pelo ar externo, o recipiente da

amostra, os dispositivos de amostragem usados e o manuseio inadequado. Um
recipiente da amostra não deve ter mais de três quartos do produto, a fim de evitar
vazamentos e para permitir uma boa mistura da amostra no laboratório.
Identificar amostras de forma clara e completa, e gravar a informação da amostra.
Frequentemente, a temperatura no momento da coleta e após o recebimento é útil

para o laboratório para a interpretação de resultados.
A amostra deverá ser apresentada na embalagem original, sem abrir.
Se o produto é volumoso ou em um recipiente grande demais para o envio para o

laboratório, transferir uma parcela da amostra assepticamente para um recipiente
estéril.
O recipiente da amostra estéril deve ser aberto apenas no tempo suficiente para
permitir que a amostra seja transferida e fechada imediatamente depois.
8.1.2 Plano de amostragem
O laboratório não realiza a amostragem dos produtos.
8.2 Transporte
O modo de transporte das amostras para o laboratório deve assegurar que eles são
mantidos em condições que irá minimizar qualquer alteração no número de
microrganismos presentes.
Entregar amostras para o laboratório imediatamente com as condições de

armazenamento original mantida tanto quanto possível.

PT – LMC 002

A amostra deve ser acondicionada de modo a que a ruptura ou derrame seja

evitado.
O rótulo do produto deve indicar se a refrigeração é necessária.
Amostras que não exigem refrigeração ou congelamento podem ser acondicionadas

em um recipiente que use material de embalagem adequado para evitar a quebra.
Não use gelo solto, pois isso pode causar contaminação do produto, se houver
quebra de recipiente ou vazamentos.
As seguintes temperaturas durante transporte são recomendadas:
- produtos estáveis: temperatura ambiente (abaixo de 40°C);
- produtos congelados ou ultracongelados: abaixo de -15°C, de preferência abaixo

de -18°C;
- outros produtos não estáveis à temperatura ambiente: 1°C a 8°C;
- amostras deswab: ver ISO 17604.
Quando não há condições especificadas, é recomendável que as partes envolvidas

concordem com a duração e a temperatura de transporte.
8.3 Recebimento
Verificar as condições das amostras no recebimento.
Se sua condição não é satisfatória ou se as amostras são insuficientes, o laboratório

deve recusar amostras.
Em circunstâncias especiais, podem ser testados, após discussão e acordo com o

cliente.

PT – LMC 002

No entanto, o relatório de ensaio deve incluir reservas sobre a validade dos

resultados.
Documentar as amostras admitidas no laboratório de tal maneira que o seu

progresso até o momento da elaboração do relatório de ensaio possa ser
monitorado. A identidade e codificação das amostras e os registros devem
assegurar rastreabilidade em todas as fases no laboratório.
Se necessário, as superfícies externas das embalagens podem ser desinfetadas

com um desinfetante apropriado.
Verifique os recipientes de amostra para defeitos físicos evidentes.
Observe as seguintes informações:
- data (e hora, se for o caso) de recepção;
- detalhes da amostragem (data de amostragem e do tempo, se a condição de

amostra relevante e conhecida);
- nome do cliente;
Após a recepção de amostras perecíveis, registrar a temperatura de transporte ou a

temperatura de uma amostra simulada incluída para este fim.
Examine as amostras o mais rapidamente possível após a recepção, de preferência

no prazo de 24 h, ou conforme acordado entre as partes.
Para produtos altamente perecíveis (como crustáceos), os testes devem começar no

prazo de 24 h de amostragem. Para produtos perecíveis (tais como peixes, leite cru),
o teste deve começar dentro de 36 h.
Se os prazos dos testes mencionados acima não puderem ser respeitados, as

amostras podem ser congeladas a abaixo de -15 ° C, de preferência -18 ° C, desde

PT – LMC 002

que tenha sido demonstrado que a recuperação do microrganismo alvo(s) não é

significativamente prejudicada.
8.4 Armazenamento
Armazene as amostras à espera do ensaio em condições que irá minimizar qualquer

alteração no número de microrganismos presentes.
As temperaturas de armazenamento seguintes são recomendadas:
- produtos estáveis: temperatura ambiente (18 °C a 27 °C);
- produtos congelados ou ultracongelados: abaixo de -15 °C, de preferência abaixo

de -18 °C;
- outros produtos não estáveis à temperatura ambiente, incluindo alimentos

estragados: 3 °C±2 °C;
- amostras deswab: ver ISO 17604.
8.5 Porção de teste
8.5.1 Regras específicas para a tomada de porções para ensaio
Refere-se ao PT-LMC-004 responsável pelas regras específicas da retirada da

porção de ensaio e preparação da suspensão e homogeneização inicial.
8.5.2 Conservação e destruição de amostras de laboratório
Exceto em casos especiais, manter as amostras de laboratório até que todos os

resultados tenham sido obtidos, ou por mais tempo, se necessário, embalá-las em
um recipiente estéril (por exemplo, um saco plástico) e armazená-los em sua
temperaturade armazenamento original.
Produtos perecíveis devem ser congelados.

PT – LMC 002

NOTA: Não é normalmente aceita a prática de reanalisar as amostras, devido a

possíveis mudanças no status microbiano.
9.0 EXAME
9.1 Precauções de higiene durante a análise
Para evitar a contaminação do meio ambiente e das porções de teste, manipular

produtos em pó (desidratados) em uma sala ou área separada, ou em uma cabine
de segurança biológica.
Antes de abrir amostras comuns, passe álcool 70% (em volume) (ou outro produto
equivalente) ao redor do ponto de abertura previsto e deixe evaporar. Antes de abrir
embalagens esterilizadas, mergulhe a área a ser aberta em uma solução contendo
de 100 ppm a 200 ppm de cloro livre (ou outro esterilizante adequado) por menos 10
min para destruir microrganismos que possam contaminar a amostra.
Qualquer instrumento utilizado para abrir a embalagem e retirar a totalidade ou parte

da amostra (abridor de latas, tesoura, colher, pinças, pipetas, etc) devem ser
esterilizados.
A área de trabalho adjacente deve ser limpa com um desinfetante apropriado antes
do início dos testes.
As mãos devem ser lavadas imediatamente antes de começar os testes e

novamente durante os testes se forem contaminadas.
Todos os instrumentos utilizados devem ser esterilizados e protegidos da exposição

à contaminação antes e durante o uso.
Todos os instrumentos e ferramentas utilizadas devem ser colocados em um

recipiente adequado para posterior eliminação ou esterilização.
Tomar precauções para que o trabalho seja realizado, na medida do possível, sob
condições assépticas. Por exemplo:
PT – LMC 002

a) certificar-se que a área de trabalho seja limpa, que todas as possíveis fontes de
contaminação sejam removidas ou reduzidas ao mínimo e que não haja correntes de
ar (ou seja, que as portas e janelas estejam fechadas), e evitar a movimentação
desnecessária de pessoal durante o exame;
b) antes e depois do trabalho, descontaminar a superfície de trabalho com um

desinfetante apropriado;
c) antes de começar, certifique-se que tudo que é necessário para a realização do

trabalho (e apenas isso) esteja disponível;
d) realizar o trabalho sem demora;
e) separar as atividades por tempo ou local em "limpa" e "suja" (isto é

particularmente importante com alto risco amostras, como carne crua e ovos crus);
f) usar equipamentos descartáveis;
g) se todo o conteúdo de um maço de pipetas descartáveis, placas de Petri, etc, não

for utilizado durante o curso de um exame, certificar-se que a embalagem está bem
fechada após remoção do número apropriado de unidades;
h) limpar imediatamente qualquer derramamento, por meio de almofadas de algodão

ou qualquer outro material apropriado impregnado com 70% (em volume) de álcool
ou qualquer outro desinfetante apropriado, em seguida, limpar e desinfetar a
superfície de trabalho antes de continuar;
i) usar cabine de segurança para o manuseio de produtos susceptíveis de conter

bactérias patogênicas, se recomendado por regulamentação nacional;
j) ao remover uma pipeta estéril de uma embalagem, não permita que a ponta toque
a superfície externa das pipetas restantes, pois tais superfícies estão sujeitas à
contaminação;
k) não permitir a pipeta tocar as bordas ou gargalos de garrafas de diluição.

PT – LMC 002

1) Quando outros desinfetantes além do álcool 70% (em volume) são usados, os
tempos de contato apropriado, de acordo com a instruções do fabricante, são
necessários para a desinfecção eficaz.
Os aerossóis são uma das principais causas de contaminação ambiental e de

infecção. Aerossóis podem ser formados por exemplo:
- ao abrir placas de Petri, tubos e frascos;
- quando se utilizar shakers, seringas, centrífugas, etc;
- ao esvaziar pipetas;
- ao esterilizar alças de inoculação ou agulhas;
- quando abrir ampolas contendo culturas liofilizadas.
Sua formação deve, portanto, minimizada.
9.2 Preparação da suspensão inicial e diluições
9.2.1 Geral
Prepare a suspensão inicial e diluições, de acordo com a parte relacionada no PT-

LMC-004.O tempo que decorre entre o final da preparação da suspensão inicial e o
momento em que o inóculo entra em contato com o meio de cultura não deve
exceder 45 minutos, a não ser especificamente mencionado em normas
internacionais pertinentes.
A suspensão inicial e as etapas de diluições podem ser seguidas por uma etapa de
enriquecimento, conforme descrito em normas específicas.
9.2.2 Concentração
9.2.2.1 Centrifugação ou filtração por membranas

PT – LMC 002

Se for necessária a contagem de números baixos de microrganismos, a enumeração

pode ser melhorada, tanto em termos de sensibilidade e precisão, através da
introdução de um teste de concentração de porção. Esta concentração pode ser
obtida por centrifugação ou filtração por membranas.
Se estiver usando a centrifugação, ressuspender o depósito centrifugado em um

volume conhecido de diluente e continuar a análise.
Para cada combinação (alimentos mais micro-organismo) considerar, realizar um

estudo prévio para demonstrar quando se deve fazer teste de concentração de
porção.
A filtrabilidade de suspensões de alimentos deve ser avaliada.
O desempenho do método global, em termos de sensibilidade, seletividade,

linearidade e repetibilidade, devem ser verificados.
Se o nível de contaminação é desconhecido, o método padrão (sem filtração) deve

ser conduzido em paralelo.
9.2.2.2 Imunosseparação
Se os números baixos de microrganismos alvo estão presentes na amostra,

separação e concentração de microrganismos podem ser alcançadas com esferas
imunomagnéticas revestidas com anticorpos específicos.
Espalhe as esferas, juntamente com os microrganismos alvo capturado, diretamente

no meio sólido específico em acordo com as normas específicas. No entanto,
verifique se as esferas imunomagnéticas revestidas com os anticorpos específicos
utilizados para esta etapa de concentração são adequadas, como mostrado por
estudos de avaliação publicada na literatura científica internacional, de preferência
relacionados com microbiologia alimentar.
10.0 ENUMERAÇÃO

PT – LMC 002

10.1 Geral
Ao avaliar a qualidade microbiológica e/ou segurança de alimentos e alimentos para

animais, muitas vezes saber se os microrganismos estão presentes não é suficiente
para. Na maioria dos casos, o aspecto quantitativo é igualmente importante, o que
traz a necessidade de enumerar microrganismos. Isto pode ser conseguido de várias
maneiras: através de exame direto (microscopia), através da inoculação em meio
sólido ou líquido, por citometria de fluxo, por reação em cadeia da polimerase em
tempo real, etc. No entanto, esta Norma só cobre enumeração em meios sólidos e
líquidos.
Enumeração em meios sólidos se baseia na capacidade de muitos microrganismos

para produzir colônias no interior ou na superfície de ágar, que pode ser reconhecido
como tal a olho nu ou com o auxílio de uma lupa simples. No entanto, se a matriz
contém muitas partículas que podem interferir com a detecção de colônias, ou se o
nível de bactérias é muito baixo, este princípio não pode ser utilizado sem antes se
separar os microrganismos alvos da matriz (por exemplo, por filtração ou
imunosseparação). Nesses casos, enumeração com meios líquidos é muitas vezes
uma alternativa mais adequada.
10.2 Enumeração usando um meio sólido
10.2.1 Geral
Placa de Petri deve ser rotulada com o número da amostra, diluição, data e qualquer
outra informação desejada.
Diluições devem ser selecionadas para garantir que as placas obtenham o número
apropriado de colônias (ver 10.3.1) e elimine qualquer possibilidade de propriedades
inibidoras.
Usar uma pipeta estéril para transferências de cada diluição, salvo se trabalhar a
partir da maior diluição para a menor diluição.

PT – LMC 002

10.2.2 Número de placas de Petri por diluição
Para as técnicas de enumeração em microbiologia alimentar, duas placas devem ser

utilizadas.
10.2.3 Técnica de pourplate
10.2.3.1 Geral
Retirar os volumes definidos da diluição a ser examinada, tocando a ponta da pipeta

contra o lado do tubo para remover o excesso de líquido que aderirem ao exterior.
Levante a tampa da placa de Petri estéril apenas alto o suficiente para inserir a
pipeta, em seguida, dispensar o conteúdo. Despeje ágar fundido a 44°C a 47°C em
cada placa de Petri. Evite derramar o meio fundido diretamente sobre o inóculo.
Imediatamente misture o meio derretido e o inóculo cuidadosamente de modo a
obter uma distribuição homogênea dos microrganismos dentro do meio. Permitia o
esfriamento e solidificação, colocando a placa de Petri sobre uma superfície fria
horizontal (o tempo de solidificação do Agar não pode exceder 10 minutos).
Depois de retirar ágar temperado do banho-maria, seque a garrafa com uma toalha
limpa para evitar a água de contaminar as placas. Evite derramar o meio do lado de
fora da embalagem ou no interior da tampa da placa quando vazar.
Isto pode exigir que se segure a garrafa em uma posição quase horizontal, ou
evitando o ajuste da garrafa entre os passos derramamento.
Se existir a possibilidade da presença de colônias invasoras que façam

espalhamento (por exemplo, Proteus spp.). Está previsto que a placa a ser
examinada, possa ser coberta com ágar não nutritivo estéril ou Ágar idêntico ao
meio de cultura utilizado no teste 3), para evitar ou minimizar o espalhamento.
2) Geralmente 18 a 20 ml de Ágar em 90 milímetros placas de Petri, para obter pelo

menos 3 mm de espessura.

PT – LMC 002

3) Geralmente 5 ml de Ágar em 90 milímetros placas de Petri.
10.2.4 Inoculação em superfície
10.2.4.1 Geral
Métodos de plaqueamento projetado para produzir apenas colônias de superfície em

placas de Agar têm certas vantagens sobre o método de placa derramar. A
morfologia de colônias de superfície é facilmente observada, melhorando a
habilidade do analista para distinguir entre diferentes tipos de colônia.
Microrganismos não são expostos ao calor do Ágar derretido, de modo que

contagens mais altas podem ser obtidas.
Usar placas com pelo menos 3 mm de espessura de Ágar, com superfície lisa, e
livres de bolhas de ar e umidade na superfície.
Para facilitar a disseminação uniforme, a superfície do Ágar solidificado deve ser

seca em conformidade com o PT-LMC-003 Preparo e avaliação dos meios de
cultura,de forma que o inóculo seja absorvido dentro de 15 min.
10.2.4.2 Método Spread-plate com alça de Drigalski
Usando uma pipeta estéril, transferir o inóculo (geralmente 0,1ml ou 0,5ml) da

amostra teste líquida ou da suspensão inicial, no caso de outras amostras para a
placa de ágar (90 mm ou 140 mm de diâmetro, respectivamente). Repetir este passo
para a diluição decimal seguinte (as colônias para serem contadas, deverão, estar
presente em uma etapa de diluição de 10 -1, no caso de material da amostra de
líquida e 10-2, no caso de amostra de outro material) e, se necessário, repetir o
procedimento para outras diluições decimais.
Se for necessário para detectar baixas contagens microbianas no caso de certos

produtos, o limite de detecção pode ser aumentado em um fator de 10, analisando
1,0 ml da amostra no caso de produtos líquidos e 1,0 ml da suspensão inicial no

PT – LMC 002

caso de outros produtos. Para esse fim, 1,0 ml do inóculoé espalhado ou sobre a
superfície de uma placa de Petri grande (140 mm de diâmetro) ou sobre as
superfícies de três pequenos placas de Petri (90 mm de diâmetro).
Usando uma alça de Drigalski feita de vidro, plástico ou aço (por exemplo feito de
um bastão de vidro e em forma um taco de hóquei sobre 3,5 mm de diâmetro e 20
cm de comprimento, dobrados em ângulo reto em cerca de 3 cm de um lado e
achatado nas extremidades por aquecimento), espalhar o inóculo o mais rápido
possível uniformemente sobre a superfície do ágar sem tocar as paredes laterais da
placa de Petri. Permitir que o inóculoseja absorvido na placa com as tampas no
lugar por cerca de 15 min à temperatura ambiente.
Em certos casos (como indicado em normas internacionais pertinentes), o inóculo

pode ser depositado em uma membrana, e espalhada em seguida, como descrito
anteriormente.
10.2.4.3 Método do plaqueamento em Spiral
10.2.4.3.1 Geral
O método do plaqueamento em espiral para determinar o nível de microrganismos

foi testado em ensaios Inter laboratoriais com leite, produtos lácteos e outros tipos
de alimentos.
O equipamento utilizado – o plaqueador espiral automático- é descrito em 5.24.
10.2.4.3.2 Preparação da placa de ágar
Um dispensador automático com um sistema de entrega estéril é recomendado para

a preparação de placas de ágar, para garantir que as placas estão niveladas.
Despeje a mesma quantidade de Ágar em todas as placas para que a mesma altura
do ágar seja dispensada a fim de manter o ângulo de contato correto.
Alternativamente, preparados de placas de ágar pronto para uso podem ser usadas.
PT – LMC 002

10.2.4.3.3 Processo de plaqueamento e contagem
Descontaminar a ponta da caneta e tubos puxando primeiro uma solução de

hipoclorito de sódio (ver 5.24.4) e depois água esterilizada através do sistema, antes
de tirar a amostra líquida para a caneta.
Colocar uma placa previamente derramada com ágar, na plataforma giratória inferior
a caneta. A amostra é diferencialmente dispersada conforme a ponta da caneta
passa na superfície da placa de Agar rotativo. Remover a placa inoculada e devolver
a caneta para sua posição inicial. Descontaminar a caneta e carregar para a
inoculação de uma outra placa.
Após a incubação, colocar a grade de contagem da placa espiral central no lugar.

Use a regra de 20contagens para determinar a contagem. Escolher qualquer fatia e
começar a contar as colônias a partir da borda externa do primeiro segmento em
direção ao centro, até que 20 colônias sejam contadas. Completar através da
contagem de colônias remanescentes na segmento a partir da vigésima colônia.
Contar uma área correspondente no lado oposto da placa e dividir o número de
colônias contadas em ambos os lados pelo volume de amostra depositada nestas
duas áreas. O volume de amostra associado a cada parte da grade de contagem é
dado no manual operacional que acompanha cada plater espiral.
10.2.5 Incubação
Salvo recomendação contrária em normas específicas, inverter imediatamente as

placas após a inoculação, e colocá-las rapidamente na estufa incubadora à
temperatura adequada. Se a desidratação excessiva ocorrer (por exemplo, em 55 °
C ou em caso de forte circulação de ar), enrole os placas vagamente em sacos
plásticos antes da incubação ou usar qualquer sistema similar de eficiência
equivalente.
Durante o período de incubação, pequenas variações na temperatura de incubação

podem ser inevitáveis e é aceitável, por exemplo, durante as operações usuais de
carga ou descarga da estufa incubadora, mas é importante que esses períodos
PT – LMC 002

sejam mantidos a um mínimo possível. A duração destas variações deve ser

monitorada para garantir que elas não tenham um efeito significativo sobre o
resultado.
NOTA: Em certos casos, pode ser útil para armazenar placas inoculadas em 3°C ±
2°C para usar em comparação com placas inoculadas e incubadas na contagem, a
fim de evitar confundir as partículas do produto a ser examinado com colônias. A
lupa binocular também pode ser usada para distinguir partículas do produto das
colônias.
Em determinadas circunstâncias, pode ser desejável para a organização do trabalho

no laboratório refrigerar as placas inoculadas por um período máximo de 24 horas
antes da incubação. Se isso for feito, o laboratório deve assegurar que essa prática
não afete a contagem resultante.
Geralmente, placas de Petri não devem ser empilhadas em mais de seis placas para
incubação aeróbica e devem ser separadas umas das outras e das paredes da
incubadora pelo menos 25 mm. No entanto, pilhas maiores com menos
espaçamento pode ser aceitável em incubadoras equipadas com sistemas de
circulação de ar, neste caso, a distribuição de temperatura deve ser verificada.
Após a incubação, as placas normalmente devem ser examinadas imediatamente.

Podem, no entanto, ser armazenadas, salvo descrito em normas específicas, por até
48 h na geladeira. Armazenamento refrigerado por períodos mais longos só é
aceitável se tiver sido demonstrado que não têm efeito sobre os números, à
aparência ou a confirmação posterior das colônias. Com certos meios contendo
corantes indicadores, placas podem ser refrigeradas para equilibrar a temperatura
ambiente antes de se examinar, para garantir que a cor correta tenha sido
recuperada.
10.3 Cálculo e expressão dos resultados obtidos com meios sólidos
10.3.1 Contagem de colônias

PT – LMC 002

Após o período de incubação indicado na norma específica, a contagem de colônias

(colônias total, colônias típicas ou colônias presuntivas) para cada placa contendo
menos de 300 colônias (ou qualquer outro número indicado na norma específica).
Ao contar colônias típicas ou presuntivas, a descrição das colônias é a indicada no

padrão específico.
Em certos casos, pode ser difícil contar as colônias (por exemplo, quando os micro-
organismos espalhados estão presentes). Considerar colônias espalhadas como
colônias individuais. Se menos de um quarto da placa estiver coberto por
espalhamento, contar as colônias na parte não afetada do placa e calcular o número
dele para toda a placa. Deduzir por extrapolação o número teórico que deve
corresponder à placa inteira. Se mais de um quarto estiver coberto, descarte a
contagem. Considerar colônias espalhadas como uma colônia.
Nas diferentes modalidades de cálculo dado em 10.3.2, contagens tiradas das

placas que não contenham colônias, deverão ser feitas onde essas placas foram
mantidas.
Quando um plaqueador espiral automáticotiver sendo usado, a contagem de

colônias é como descrito em 10.2.4.3.3.
10.3.2 Expressão dos resultados
10.3.2.1 Geral
10.3.2.1.1 Os casos de que trata este subitem são casos gerais:
- inoculação de uma placa de Petri 90 mm de diâmetro por diluição;
- número máximo de contagem para as colônias totais presentes: 300 por placa;
- número máximo total de colônias (típicas e atípicas) em uma placa, em uma

contagem de colônias típicas ou presuntivas: de preferencialmente 300 por placa;

PT – LMC 002

- número máximo de contagem de colônias típicas ou presuntivas: 150 por placa;
- número de colônias inoculadas presuntivas para identificação ou confirmação (ver

10.3.2.3): em geral 5 em cada placa.
Estes números são definidos nas normas específicas.
Quando as placas com um diâmetro diferente de 90 milímetros são usadas, o

número máximo de colônias deve ser aumentado ou diminuído em proporção à área
da superfície das placas (ou membranas).
10.3.2.1.2 Os métodos de cálculo apresentados a seguir são para os casos que

ocorrem mais frequentemente quando os testessão realizados de acordo com boas
práticas de laboratório. Casos especiais podem acontecer ocasionalmente (por
exemplo, a relação dos fatores de diluição usada para duas diluições sucessivas
pode ser muito diferente), e é, portanto, necessário que os resultados de contagem
obtidos sejam analisados e interpretados por um qualificado microbiologista e, se
necessário, rejeitado.
10.3.2.2 Método de cálculo: caso geral (contagem de colônias total ou colônias

típicas)
Para um resultado ser considerado válido, é geralmente necessário contar as

colônias em pelo menos uma placa contendo pelo menos 10 colônias [colônias total,
colônias típicas ou colônias em conformidade com critérios de identificação (Ver
10.3.2.3)].
Calcular o número N de micro-organismos presentes na amostra de teste como uma

média ponderada de duas diluições sucessivas através da Equação (1):
Onde,

PT – LMC 002

é a soma das colônias contadas com duas placas retidas a partir de duas
diluições sucessivas, sendo que pelo menos uma das quais contenham um mínimo
de 10 colônias;
V é o volume de inóculo colocado em cada placa, em mililitros;
d é a diluição correspondente à diluição primeiro retido [d= 1 é quando o produto

retido for um líquido não diluído (Amostra)].
Arredondar o resultado calculado para dois algarismos significativos. Ao fazer isso,

se a terceira figura for inferior a 5, não modificar a figura anterior, se a terceira figura
for maior ou igual a 5, aumente uma unidade do número anterior.
Expressar o resultado de preferência com um número entre 1,0 e 9,9 multiplicado

pela potência de 10 adequada, ou um número inteiro com dois algarismos
significativos.
Exprimir o resultado com o número N de micro-organismos por mililitro (produtos

líquidos) ou por grama (outros produtos).
EXEMPLO
Contagem produziu os seguintes resultados:
a primeira diluição reteve (10-2): 168 colônias;
a segunda diluição reteve (10-3): 14 colônias.
Arredondando o resultado especificado acima, o número de micro-organismos é

17000 ou 1,7 x 104 por mililitro ou por grama de produto.

PT – LMC 002

10.3.2.3 Método de cálculo: após a identificação
Quando o método utilizado requer a identificação, um determinado número A

(geralmente 5) de colônias presuntivas devem ser identificadas a partir de cada um
das placas retidas para a contagem de colônias. Após a identificação, calcular, para
cada uma das placas, o número α de colônias em conformidade com os critérios de
identificação, através da Equação (2):
onde
b é o número de colônias em conformidade com critérios de identificação entre as

colônias identificadas A;
C é o número total de colônias presuntivo contou com o placa.
Arredondar o resultado calculado para o número inteiro mais próximo. Ao fazer isso,
se a primeira figura após o ponto decimal for inferior a 5, não modificar a figura
anterior, se a primeira figura depois do ponto decimal for maior ou igual a 5,
aumentar a figura anterior em uma unidade.
Calcular o número N de micro-organismos identificados presentes na amostra de
teste, substituindo por na equação dada em 10.3.2.2.
Arredondar o resultado, conforme especificado em 10.3.2.2.
Expressar o resultado, conforme especificado no 10.3.2.2.
EXEMPLO

PT – LMC 002

Teste das colônias selecionadas foi realizado:
- das 66 colônias, 8 colônias foram testadas, 6 dos quais cumpriu com os critérios,
α= 50;
- das 4 colônias, todas as 4 cumpriram os critérios, α= 4.
Arredondar o resultado, conforme especificado em 10.3.2.2, o número de micro-

organismos é 49000 ou 4,9 x 104 por mililitro ou por grama do produto.
10.3.2.4 Método de cálculo: baixas contagens
10.3.2.4.1 caso quando uma placa (amostra ou suspensão inicial ou primeira

diluição) contém menos de 10 colônias
Contagens de 10, até o limite (prática) superior de cada método estão na faixa de
precisão ideal. Precisão diminui rapidamente à medida que o número de colônias
diminui abaixo de 10, no entanto. Dependendo da finalidade do teste, um limite
inferior de determinação pode ser definido como a seguir para contagem inferior a
10.
A definição de limite de determinação é: concentração média mais baixa de

partículas x por porção analítica onde o padrão da incerteza relativa esperada, é
igual a um valor especificado “(RSD)". RSD é o desvio-padrão relativo, que é
calculado dividindo-se a estimativa do desvio padrão s de uma população a partir de
uma amostra por dessa amostra. Em vez de RSD, símbolo o w será usado para o
desvio padrão relativo. Assim,
No caso de uma distribuição de Poisson, x é calculada pela equação:

PT – LMC 002

Se w é fixado em 50% para o limite de precisão relativa aceitável (o que parece ser
razoável em microbiologia), o limite inferior de determinação será o número de
colônias dadas por:
Assim, os resultados com base na contagem de menos de quatro deve ser tratada
como mera detecção da presença do micro-organismo.
Resumindo:
Se a placa tiver menos de 10 colônias, mas, pelo menos, 4, calcular o resultado

como dado, no caso geral (10.3.2.2), e relatá-lo como número x estimado de
microrganismos por mililitro (produtos líquidos) ou por grama (outros produtos).
Se o total for de 3 a1, a precisão do resultado é muito baixa e o resultado deverá ser
reportado como:
"Os microrganismos estão presentes, mas menos do que (4x d) por grama ou ml".
10.3.2.4.2 Caso onde a placa (amostra ou suspensão inicial ou primeira

diluição) não contém colônias
Se a placaque contém a amostra do teste (produtos líquidos) ou a suspensão inicial

(outros produtos) ou a primeira diluição inoculada ou retida não contém quaisquer
colônias, o relatório do resultado é dado da seguinte forma:
"Inferior a 1/d micro-organismos por mililitro" (produtos líquidos) ou "menos de 1/d

micro-organismos por grama"(Outros produtos)

PT – LMC 002

onded é o fator de diluição da suspensão inicial ou da primeira diluição inoculada ou

retida (d= 100=1 onde a amostra de teste inoculada diretamente do produto líquido é
retida).
10.3.2.4.3 Casos especiais
10.3.2.4.3.1 Geral
Estes casos dizem respeito à contagem de colônias típicas ou presuntivas.
10.3.2.4.3.2 Caso 1
Se o número de colônias típicas e atípicas para a placa tiver uma primeira diluição d1
maior do que 300 (ou qualquer outro número indicado na norma específica), com
colônias típicas visíveis ou colônias confirmadas, e se, o placa contendo o d2 diluição
subsequente possuir menos de 300 colônias (ou qualquer outro número indicado na
norma específica), e nenhuma colônia típica visível ou confirmada, relatar o
resultado da seguinte forma:
"Menor que 1/d2 e maior que 1/d1 micro-organismos por mililitro" (produtos líquidos)
ou "menor que 1/d2 e maior que 1/d1 micro-organismos por grama "(outros produtos),
onde d1 e d2 são os fatores de diluição correspondente à diluição d1 e d2.
EXEMPLO
- a primeira diluição reteve (10-2): mais de 300 colônias no placa, com colônias
típicas ou confirmadas presente;
- a segunda diluição reteve (10-3): 33 colônias, sem colônias típicas ou confirmadas

presente.
O resultado, expresso em micro-organismos, é menor que 1000 e maior que 100 por
mililitro ou por grama de produto.

PT – LMC 002

10.3.2.4.3.3 Caso 2
Se o número de colônias típicas e atípicas na placa, tiver uma primeira diluição d1

maior do que 300 (ou qualquer outro número acima do indicado na norma
específica), com colônias típicas visíveis ou colônias confirmadas, e se a placa d2
contendo a diluição subsequente tiver menos de 300 colônias (ou qualquer outro
número indicado na norma específica) ou nenhuma colônia típica visível ou
confirmada, o relatório do resultado é dado da seguinte forma:
"Menor que 1/d2 micro-organismos por mililitro" (produtos líquidos), ou menor que
1/d2 micro-organismos por grama" (Outros produtos)
onde d2é o fator de diluição correspondente à diluição d2.
EXEMPLO
- a primeira diluição reteve (10-2): mais de 300 colônias no placa, sem colônias
típicas ou confirmadas presente;
- a segunda diluição reteve (10-3): 33 colônias, sem colônias típicas ou confirmadas

presente;
O resultado, expresso em microrganismos, é inferior a 1000 por mililitro ou por

grama de produto.
10.3.2.5 Método de cálculo: casos especiais
10.3.2.5.1 Quando o número de colônias contadas (colônias total, colônias típicas ou

colônias presuntivas) é superior a 300 (ou qualquer outro número indicado em
norma específica) para a placa contendo uma primeira diluição d1, com um número
de colônias (colônias totais, colônias típicas ou colônias em conformidade com
critérios de identificação) menor que 10 para a placa contendo a diluição d2
subsequente:
PT – LMC 002

- se os números de colônias para a placa contem a diluição d1 dentro do intervalo de

334 a 300 (a parte superior do intervalo de confiança para uma média ponderada
igual a 300), use o método de cálculo para casos em geral (ver 10.3.2.2);
- se os números de colônias para a placa contem a diluição d1 maior do que 334 (o

limite superior do intervalo de confiança para uma média ponderada igual a 300),
apenas levar em conta o resultado da contagem de diluição d2 e calcular uma
contagem estimada (ver 10.3.2.4), exceto, quando um máximo de 300 for definido
para a contagem de colônias, se esta contagem estimada for inferior a 8(limite
inferior do intervalo de confiança para uma média ponderada igual a 10), uma vez
que a diferença entre as duas diluições é então inaceitável.
Os números correspondentes aos intervalos de confiança devem ser adaptados para

o número máximo indicado para a contagem de colônias.
EXEMPLO1
Contagemproduziu os seguintes resultados:
Usar o método de cálculo para os casos em geral, usando as duas placas retidas
com diferentes diluições.
EXEMPLO 2
Contagemproduziu os seguintes resultados:
a primeira diluição reteve (10-2): mais de 334 colônias no placa;

PT – LMC 002

Assinalar uma contagem estimada com base nas colônias contadas no placa para a
diluição 10-3.
EXEMPLO 2
Contagem(quando um número máximo de 300 foi fixado para a contagem de

colônias) produziu os seguintes resultados:
- a primeira diluição reteve (10-2): mais de 334 colônias no placa;
- a segunda diluição reteve (10-3): 7 colônias.
O resultado desta contagem é inaceitável.
EXEMPLO 4
Contagem (quando um número máximo de 150 foi fixado para a contagem de

colônias) produziu os seguintes resultados:
- a primeira diluição reteve (10-2): mais de 167 colônias na placa (limite superior do
intervalo de confiança com uma média ponderada média igual a 150);
- a segunda diluição reteve (10-3): 7 colônias.
Assinalar uma contagem estimada com base em colônias contadas na placa para a
diluição 10-3.
10.3.2.5.2 Quando a contagem de colônias (colônias totais, colônias típicas ou

colônias presuntivas) para cada uma das placas, para todas as diluições inoculadas
produz um número superior a 300 (ou qualquer outro número indicado na norma
específica), o relatório do resultado é dado seguinte forma:
"Maior que 300/d" (no caso das colônias total ou colônias típicas) ou "maior que
" (no caso de colônias confirmadas), expressa em micro-organismos por
mililitro (produtos líquidos) ou micro-organismos por grama (outros produtos)

PT – LMC 002

onde
d é a diluição da última diluição inoculada;
b é o número de colônias em conformidade com critérios de identificação entre as

colônias presuntivas A.
10.3.2.5.3 Quando o placa que contém a última diluição inoculada tiver mais de 10
colônias e menos de 300 (ou qualquer outro número indicado na norma específica)
colônias (colônias total, colônias típicas ou colônias presuntivas), calcular o N
número de micro-organismos presentes usando a Equação (4):
onde
c é o número de colônias contadas na placa;
V é o volume do inóculo utilizado em cada placa, em mililitros;
d é a diluição correspondente à diluição retida.
Arredondar o resultado, conforme especificado em 10.3.2.2.
Expressar o resultado com o número N de micro-organismos por mililitro (produtos

líquidos) ou por grama (outros produtos).
EXEMPLO
- na última diluição inoculada (10-4): 120 colônias.
Assim

PT – LMC 002

Arredondando o resultado, conforme especificado em 10.3.2.2, o número N 'de

micro-organismos é 1200000, ou 1,2x 106 por mililitro ou por grama do produto.
10.3.3 CONTAGEM DE COLÔNIAS COM DUAS PLACAS POR DILUIÇÃO
10.3.3.1 Geral
Especifica para cálculos de expressão de resultados por enumeração de duas

placas por diluição.
10.3.3.2 Contagem de colônias
Requerimentos e recomendações estão em 10.3.1 e 10.3.2.1.1 (refere-se à

contagem de colônias e a expressão de resultados conforme a baixo) são aplicáveis.
Após o período de incubação estabelecido no padrão especificado, a contagem de

colônias (total de colônias, colônias típicas ou presumido de colônias suspeitas) por
cada placa contendo ate 300 colônias ( ou qualquer outro numero estabelecido
especificado no padrão).
Nesta subclasse, o caso tratado corresponde com o seguinte caso geral:
- Inoculação em uma placa de petri de 90 mm de diâmetro por diluição; e pelo

menos duas diluições sucessivas são realizadas;
- Numero máximo de contagem para o total de colônias presente: 300 por placa;
-Numero máximo total de colônias (típico e atípico) presente na placa quando contar
típicasou colônias presuntivas: preferencialmente 300 por placas ;
- Numero máxima de contagem para colônias típicas ou colônias presuntivas: 150

por placa;
- Numero de colônias presuntivas inoculadas para identificação ou confirmação

(10.3.3.2.2),em cada placa retirada: em geral 5.

PT – LMC 002

Estes números serão definidos em métodos específicos.
O método de calculo sãodefinidos para os seguintes casos que ocorrem com mais
frequentemente quando o teste são realizados de acordo com as boas praticas do
laboratório. Casos especiais podem ocorres ocasionalmente ( o numero de colônias
em duas placas com a mesma diluição pode mostrar significativa discrepância ou
relacionado com o fator de diluição usado por duas sucessivas diluição talvez muito
diferentes) e isso é portanto necessário para a contagem do resultado obtido para
ser examinado e interpretado por um microbiologista qualificado e ,se necessário,
rejeitado.
10.3.3.2.1 Método de calculo:Caso geral (Contagem total de colônias ou

colônias típicas)
Para um resultado ser valido, e ser considerado geralmente é necessáriocontar as

colônias em pelo menos uma placa contendo no mínimo de 10 colônias [total de
colônias, colônias típicas ou colônias comprimento com identificação ou critério
confirmação(10.3.3.2.2 ).
Se duas placas de petri por diluição são usadas, a relação entre a contagem da
colônia da primeira placa e a contagem da colônia da segunda placa deve ser igual
a primeira.
Exemplo 1 Se a contagem de colônias da primeira placa, com a maior contagem, é

250, a contagem da segundaplaca, com baixa contagem, não deve ser inferior a
196.
Calcular o numero N de microrganismopresente na amostra teste com o meio

pesado a partir de duas diluições sucessivas usando a formula :
Ʃ𝐶
N=
𝑉 𝑋[𝑛1+(0,1 𝑥 𝑛2)𝑥]𝑑

PT – LMC 002

Onde
ƩC é a soma da contagem de colônias em todas as placas retiradas de duas

diluições sucessivas, e onde pelo menos uma conte um mínimo de 10 colônias;
V é o volume de inoculo aplicado para cada placa, em mililitros;
n1 é a numero de placas retirada na primeira diluição;
n2 é o numero de placas retiradas da segunda diluição;
d é o fator de diluição correspondente ao retirado da primeira diluição

‘selecionada’ [d=1 quando o produto liquida não é diluído (amostra teste) é usado].
Arredondar os resultados calculados para dois algarismos significantes. Em ordem

para fazer isso, se o terceiro numera for inferior a 5 não modificar o algarismo
precedente, se o terceiro numero é maior ou igual a 5,aumentar o algarismo
precedente para uma unidade.
Tomar como resultado um numero de preferência entre 1,0 e 9,9multiplicado pelo

poder apropriado de 10, ou um numero inteiro com dois algarismo significante.
Expressar o resultado da seguinte forma:
- Numero N de microrganismos por mililitro (produtos liquido) ou por grama (outros

produtos).
Exemplo 2 Contagem produziu o seguinte resultado:
- Na primeira diluição (10 ¯²) retirado: 168 e 215 colônias;
- Na segunda diluição (10¯³) retirado:14 e 25 colônias;

PT – LMC 002

Ʃ𝐶 168+215+14+25 422
N= = = =19182
𝑉𝑥[𝑛1+(0,1𝑥 𝑛2)𝑥]𝑑 1𝑥[2+(0,1𝑥2)𝑥]10¯² 0,022
Arredondando o resultado de acordo com o procedimento, o numero de

microrganismos é 19000 ou 1,9x10¯⁴ por mililitro ou por grama do produto.
10.3.3.2.2 Método de calculo: Caso após identificação ou confirmação
Quando o método usado requer identificação ou confirmação, dado um numero, A

(geralmente 5),ao presumir 5 colônias suspeitas é inoculado a partir de placas
suspeitas retirada para contagem de colônias. Depois identificação ou confirmação,
calcular, para cada uma das placas, o numero, ᵅ, do comprimento de colônias com
identificação ou critérios confirmação, usando formula (10.3.3.2):
𝑏
ᵅ= xC
𝐴
Onde
A Número de colônias repicadas
b é o numero comprimento de colônias com identificação ou critério confirmação

entre a inoculação das colônias, A ;
C é o total o numero presumido de colônias suspeitas contados na placa.
Arredondar o cálculo dos resultados para o numero anterior mais próximo. Fazer
isso na ordem, se o primeiro numero decimal for inferior a 5, não modificar o
algarismo anterior, se o algarismo depois do ponto decimal for maior ou igual a
5,aumentar o algarismo anterior em uma unidade.

PT – LMC 002

Calcular o numero N,NE ou N de microrganismos identificados ou confirmados

presente na amostra teste, substituindo ƩC por Ʃa usando a formula em
10.3.3.2.1,10.3.3.2.3 ,respectivamente.
Arredondar o resultado como recomendado em 10.3.3.2.1
Expressar o resultado como recomendado em 10.3.3.2.1,10.3.3.2.3

respectivamente.
Exemplo: Contagem produziu o seguinte resultado:
-Na primeira diluição (10 ‾ 3) retirada:66 e 80 colônias
-Na segunda diluição (10 ‾4) retirada: 4 e 7 colônias
Teste de colônias selecionadas foi realizado:
-Para66 colônias,8 colonias,6 dos quais cumpriu o critério, consequentemente 𝑎=

50
-Para 80 colônias, 9 colônias, 6 dos quais cumpriu o critério, consequentemente

a=53
-Para 7 colonias,5 colonias,4 das quais cumpriu o critério, consequentemente 𝑎 =6
-Para 4colônias, todas as 4 que tenham cumprido o critério, consequentemente 𝑎

=4
Ʃ𝑎 50+53+6+4 113
N= = = =51364
𝑉 𝑋[𝑛1+(0,1 𝑥 𝑛2)𝑥]𝑑 1𝑥[2+(0,1𝑥2)𝑥]10¯³ 0,0022
Dos arredondamentos de resultados como recomendado em 10.3.3.2.1 o numero

de51000 ou 5,1x104 por mililitro ou por grama do produto.

PT – LMC 002

10.3.3.2.3 Método de calculo: Contagem estimada caso de duas placas(Teste

de amostras ou suspensão inicial ou primeira diluição) Contendo menos de 10
colônias.
Requerimentos e recomendações de 10.3.2.4.1 relativo ao menor limitedeterminado

são aplicável.
Se cada um das duas placas da amostra de teste (produtos líquidos). Ouda

suspensão inicial (outros produtos), ou da primeira diluição inoculado ou retido,
contem menos de 10 colônias ( total de colônias, colônias típicas ou comprimento de
colônias com identificação ou critério de confirmação) e o conjunto de duas placas
contem pelo menos 4 colônias, calcular o numero estimado 𝑁𝐸 de microrganismos
presente no teste realizado com um media aritmética de contagem de colônias com
duas placas usando a formula (10.3.3.2.1):
Ʃ𝐶
𝑁𝐸 =
𝑉𝑛𝑑
Onde:
Ʃ𝐶é a soma de colônias que contem em duas placas;
Vé o volume de inoculo aplicado em cada placa, em mililitro;
né o numero retirado da placa (neste caso ,n=2);
dé o fator de diluição da suspensão inicial ou da primeira diluição inoculado ou

retirado [d=1 quando a amostra não diluída em produtos liquido (amostra teste) é
usado].
Arredondar os resultados como recomendado em10.3.3.2.1
Expressar os resultados seguintes:
- estimar numero 𝑁𝐸 de microrganismos por mililitros (produtos liquido) ou por grama

(outros produtos).
PT – LMC 002

Exemplocontagem produz o seguinte resultado:
- Na primeira diluição (10−2 ) retirado,8 e 9 colônias onde contados.
8+9 17
𝑁𝐸 = = =850
1𝑥2𝑥10 ¯² 0,02
Arredondamento por resultado é recomendado em 10.3.3.2.1, o numero estimado 𝑁𝐸

de microrganismoé 850 ou 8,5x 10−2 por mililitro ou por grama do produto.
10.3.3.2.4 Caso de duas placas (teste de suspensão inicial ou primeira diluição)

Não contendo colônias.
Se duas placas do teste (produtos liquido),ou da suspensão inicial(outros

produtos),ou da primeira diluição inoculada ou retirada, não contem qualquer
colônia, expressar o seguinte resultado:
Menor que 1/vdde microrganismo por mililitro(produtos liquido) ou por grama (outros
produtos);
Onde
V é o volume de inoculo usado por em cada placa, em mililitros;
dé o fator de diluição da suspensão inicial ou da primeira diluição inoculada ou

retirada [d=1 onde o não diluição de produto liquido(amostra teste) é usado=0,1
onde 10−1 é usado diluição,etc.].
10.4Enumeração de bolores e leveduras
10.4.1 Geral
Bolores e leveduras geralmente devem ser enumerados seja por uma técnica de
pour-plate, que facilita a enumeração ou por uma técnica spread-plate que fornece a
PT – LMC 002

máxima exposição das células ao oxigênio atmosférico e evita o estresse de calor do

Agar derretido. Placas de ágar vertidas devem ser secas antes de serem inoculadas
conforme PT-LMC-003 Preparo e avalição dos meios de cultura.
Alguns bolores e leveduras podem ser infecciosos ou podem provocar reações

alérgicas, às vezes até mesmo em indivíduos saudáveis. Assim, é importante estar
razoavelmente cauteloso ao trabalhar com eles. Idealmente, as placas devem ser
mantidas em incubadoras, não em uma sala aberta. Tampas das placas devem ser
removidas o mais raramente possível, normalmente apenas para fins essenciais, tais
como a preparação de uma lamina para exame microscópico. Agulhas esterilizadas
pelo calor devem ser resfriadas antes de fazer transferências, para evitar dispersão
de conídios e outras células. Bancadas de trabalho e as incubadoras devem ser
desinfetadas rotineiramente.
Placas de Petri devem ser incubadas em posição vertical e não devem ser
manipuladas até que as placas estejam prontas para ser contadas, o movimento
pode resultar na liberação de conídios ou esporos e subsequente desenvolvimento
de colônias de satélite, dando uma superestimava da população.
10.4.2 Contagem de colónias de bolores e leveduras
Placas com 10 a150 colônias são geralmente contadas. Se a micoflora consiste

principalmente de fungos, selecione placas contendo as contagens na faixa de
menor população; se a micoflora consiste principalmente de leveduras, placas que
contenham até o limite superior podem ser selecionadas para a contagem.
Se a identidade das colônias estiver duvidosa, examinar em microscópio pelo menos

cinco colônias por amostra para confirmar que bactérias não estão presentes.
10.5Enumeração usando um meio líquido revisar essa parte
10.5.1 Princípio

PT – LMC 002

Porções de teste são inoculadas em um meio líquido que é projetado para suportar o
crescimento de um determinado microrganismo ou um grupo de microrganismos, e
muitas vezes inibem a proliferação de microrganismos não-alvo.
Para determinar se o crescimento dos microrganismos-alvo tenha ocorrido, vários

critérios podem ser usados, por exemplo, detecção visual de turbidez, produção de
gás, mudanças de cor, posterior isolamento dos microrganismos em um ágar
seletivo. A composição do meio de crescimento e os critérios para distinguir entre
um resultado positivo e um negativo são definidos nas normas correspondentes.
Usando essa abordagem, apenas um valor qualitativo pode ser atribuído a cada
porção de teste, ou seja, o resultado é ou positivo ou negativo. Para obter uma
estimativa da quantidade de microrganismos que está presente, é necessário
examinar várias porções de ensaio e os procedimentos estatísticos para determinar
o número mais provável (NMP).
10.5.2 Inoculação
10.5.2.1 Geral
Se um meio de crescimento seletivo é usado, a adição da amostra de ensaio não

deve reduzir as suas propriedades seletivas (permitindo assim o crescimento de
micro-organismos não-alvo). Na maioria das normas padrões informações sobre a
compatibilidade de uma determinada matriz e do meio líquido é descrita no âmbito,
mas cuidados devem ser tomados com matrizes como especiarias, cacau, caldo de
carne, etc, pois podem conter substâncias inibidoras de crescimento, que exigem a
adição de compostos neutralizantes, o uso de uma quantidade maior de fatores de
diluição, filtração, centrifugação ou separação imunomagnética para separar o
microrganismo alvo a partir da matriz, mesmo que isso nem sempre seja
especificado nas normas correspondentes. Incompatibilidade também pode ser
devido à composição biológica da matriz: amostras ambientais altamente
contaminadas, produtos fermentados ou produtos com bactérias probióticas,
obviamente representam um desafio maior para a análise do microbiologista do que

PT – LMC 002

as amostras que contêm somente muito poucos microrganismos. Para essas

matrizes problemáticas, experimentos com microrganismos representativos devem
ser realizados para verificar se o método é realmente compatível com a matriz.
10.5.2.2 Procedimento
Salvo disposição em contrário das normas correspondentes, volumes inferior ou

igual a 1ml da porção teste são normalmente adicionados cinco a dez vezes ao
volume de um único meio com concentração simples. Volumes entre 1ml e 100ml
são normalmente adicionados a volumes iguais de meios com dupla concentração.
Para volumes maiores que 100 ml, meios mais concentrados podem ser usados.
Para fins especiais, meios estéreis desidratados podem ser dissolvidos a frio (ou
pré-aquecidos a 30°C) da amostra a ser analisada.
Salvo disposição em contrário, o tempo entre preparar a primeira diluição de uma

amostra e inoculação do último tubo, placa de vários poços, ou frasco devem ser
inferior a 15 minutos.
Uma nova pipeta estéril deve ser utilizada para cada diluição.
10.5.3 Escolha do sistema de inoculação
A essência do método NMP é que a diluição de uma amostra a um grau tal que
inóculos, às vezes, mas nem sempre contêm microrganismos viáveis. O "resultado",
isto é, o número de inóculos produzindo crescimento em cada diluição, dará uma
estimativa da concentração inicial de bactérias na amostra. A fim de obter
estimativas sobre uma ampla gama de concentrações possíveis, microbiologistas
usam diluições em série, incubando vários tubos (ou placas, etc) em cada diluição.
O número mais provável (NMP) de microrganismos presentes na amostra original, e
a precisão da estimativa, pode ser calculada por procedimentos estatísticos sobre a
base do número de tubos positivos e negativos observados após a incubação.
Fazer a escolha das várias configurações disponíveis de NMP de acordo com

PT – LMC 002

- o número esperado de microrganismos na amostra em estudo,
- requisitos regulamentares,
- a precisão necessária, e
- quaisquer outras considerações práticas.
A incerteza de medição depende do número de positivo nas porções teste

observadas, semelhante a incerteza de medição em contagem do número de
colônias, que depende do número de colônias em uma placa. A incerteza de
medição aumenta à medida que uma função da raiz quadrada do número de tubos
utilizados aumenta. O número de tubos tem que ser quadruplicado para reduzir pela
metade a incerteza de medição. Quando os sistemas usam apenas alguns tubos de
replicação, a incerteza de medição é baixa.
Dependendo do seu tamanho, porções de teste podem ser inoculadas em tubos ou

frascos contendo a quantidade necessária do meio líquido. Para porções de teste
pequenas, placas com vários poços também podem ser usadas.
10.5.3.1 Sistema único de diluição
Quando a concentração de micro-organismos esperado é pequena ou varia apenas

moderadamente, o mais adequado é o sistema de inoculação em uma série única de
porções de ensaio igual. Onde a relação esperada entre o número máximo e mínimo
de microrganismos é menor que 25, dez porções de teste em paralelo é a menor
número esperado de funcionar; com 50 tubos paralelos, uma relação de 200 é o
limite.
10.5.3.2 Sistema Múltiplo de diluição
Quando a concentração de microrganismos na amostra é desconhecida, ou se

suspeita de haver grande variação, pode ser necessário inocular tubos em série de
várias diluições. Inocular um número suficiente de diluições para garantir um sistema

PT – LMC 002

com resultados positivos e negativos. O número de diluições também depende do

método de cálculo utilizado para estimar o valor do NMP. Se tabelas forem usadas,
então os resultados de três diluições devem estar disponíveis, e as configurações
dos sistemas são restritas aos disponíveis em tabelas. Com programas de
computador, o número de diluições e tubos paralelos é irrestrito.
10.5.3.3 Sistema de diluição simétrica
O sistema NMP simétrico mais comumente aplicado utiliza três ou cinco tubos
paralelos por diluição. A precisão obtida com este sistema diminui rapidamente com
o menor número de tubos por diluição. Os resultados de três tubos de design são
pouco mais do que indicações da ordem de grandeza da concentração. Se maior
precisão for necessária, recomenda-se que cinco ou mais tubos paralelos sejam
escolhidos.
10.5.3.4 Sistema de diluição não simétrica
Em um sistema de diluição não simétrica, os diferentes níveis de diluição não têm o

mesmo número de tubos. Usar esses sistemas apenas para calcular o número de
micro-organismos dentro de uma faixa bem definida.
10.5.4 Incubação
Incubar os tubos, frascos ou garrafas inoculados em uma estufa incubadora ou em

banho-maria. Coloque placas de vários poços, em uma estufa incubadora.
Escolher a duração e a temperatura de incubação após a referência de um método

específico, pois dependem do microrganismo ou grupo de micro-organismos
procurado.
Para alguns microrganismos, um processo de incubação de dois estágios e/ou uma

etapa de confirmação pode ser necessária.
Pesquisar em normas específicas para obter detalhes.

PT – LMC 002

10.5.5 Interpretação dos resultados
Os critérios que distinguem resultados positivos de negativos variam de acordo com

cada microrganismo ou grupo de microrganismos e são definidos nas normas
correspondentes. Usando estes critérios, contar e registrar o número de resultados
positivos obtidos em todos os testes derivados de uma amostra.
10.5.6 Determinação dos valores NMP
Há três possibilidades diferentes para determinar o valor do NMP: cálculo com

fórmulas matemáticas, consulta das tabelas de NMP, ou utilização de programas de
computador específico. Desde que sejam baseados nas mesmas considerações
estatísticas, eles são igualmente válidos. Estes três métodos são detalhados a
seguir.
10.5.6.1 Fórmulas matemáticas
10.5.6.1.1 Fórmula aproximada para todos os casos
Os valores aproximados de NMP para qualquer número de diluições e tubos

paralelos são derivados da aplicação da seguinte equação (adaptado da referência
[36]):
onde
Zp é o número de tubos positivos;
mré a massa de referência da amostra, em gramas;
ms é a massa total, em gramas, da amostra em todos os tubos com as reações

negativas;

PT – LMC 002

mt é a massa total, em gramas, da amostra em todos os tubos.
NMP é expresso por massa de referência da amostra em gramas (geralmente 1 g,

por vezes 100 g).
10.5.6.1.2 Solução "exata" para uma série de tubos
O valor do NMP para uma única série de tubos é derivado da seguinte fórmula:
onde
mr é a massa de referência da amostra, em gramas;
mm é a massa, em gramas, da amostra em cada tubo da série;
ln é o logaritmo natural;
n é o número de tubos na série;
zp é o número de tubos com uma reação positiva.
10.5.6.1.3 Precisão estimada em ensaios de diluição simples
Os limites de confiança de 95% da estimativa NMP podem ser calculados

aproximadamente através da equação:
onde
x é o limite de confiança superior ou inferior a 95%;

PT – LMC 002

mré a massa de referência da amostra, em gramas;
mm é a massa, em gramas, da amostra em cada tubo da série;
ln é o logaritmo natural;
n é o número de tubos na série;
zn é o número de tubos com uma reação negativa.
O sinal positivo é conectado com o limite inferior e o sinal de menos com o limite
superior. A aproximação não é muito bom quando a maioria dos tubos são negativos
(estéril), mas melhora quando a proporção de tubos positivos aumenta.
10.5.6.1.4Precisão estimada em ensaios de diluiçãomúltipla simétrica
O padrão de incerteza log10 de um sistema de NMP de diluição múltipla simétrica

pode ser obtido pela equação aproximada de Cochran:
onde
SE é o erro padrão de log10NMP;
f é o fator de diluição entre diluições consecutivas (principalmente 10);
n é o número de tubos por diluição.
Os limites superior e inferior do grau confiança de 95% podem ser conseguidos,

respectivamente, multiplicando e dividindo a estimativa NMP pelo antilogaritmo de
2x SE. Esse procedimento tende a exagerar o limite de confiança superior.
10.5.6.2 Tabelas de NMP

PT – LMC 002

10.5.6.2.1 Tabelas para sistemas diluição simples
Para expressar o resultado por massa de amostra de referência (ou o volume de

amostras de líquido), multiplique o NMP e os 95%d os valores-limite pela razão
(massa de referência) / (massa toma de ensaio). Não multiplicar o padrão
logarítmico
Incerteza. A massa de referência em microbiologia alimentar é geralmente 1g. A

massa tomada no ensaio corresponde à quantidade de amostra (em gramas) que
está presente no volume usado para inocular os tubos, por exemplo, 0,1g se 1ml do
homogeneizado 10-1 foi utilizado.
EXEMPLO
Vinte tubos de caldo de dupla concentração foram inoculados com 5 ml alíquotas de

uma amostra de dez vezes diluída (0,1 g / ml). Após a incubação, 16 dos tubos
apresentaram crescimento visível. Qual foi a densidade mais provável de bactérias
(organismos por grama) na amostra? Tabela B.3 dá 1,61 como o número mais
provável de organismos por tubo, com um limite inferior de 95% de 0,93 e um limite
superior de 95% de 2,77.
Cada tubo recebeu uma porção teste de 5 ml, o que corresponde a 0,5 g de
amostra. Portanto, o número mais provável de micro-organismos em 1 grama de
amostra é dada por:
NMP= /g = 3,2/g
com o intervalo de confiança de 95%, variando de
limite inferior de 95% = /g= 1,9/ g;

PT – LMC 002

limite superior de 95% /g = 5,5/g
10.5.6.2.2 Tabelas para sistemas de diluição múltiplas: três diluições

sucessivas
Com sistemas simétricos, é comum a prática do uso de três diluições sucessivas

com três ou (Tabela B.5) ou cinco (Tabela B.7) repetições. Registrar o número de
resultados positivos para cada conjunto de tubos e, a partir da tabela de NMP para o
sistema de inoculação utilizada, leia o número mais provável de micro-organismos
presentes no volume de referência da amostra.
Algumas combinações de tubos positivos são mais prováveis do que outras. Por
exemplo, uma combinação de resultados positivos 0, 0, 3 é muito menos provável de
ocorrer do que a combinação 3, 2, 1. Para quantificar esta probabilidade, todas as
combinações de resultados positivos têm sido atribuídas a uma categoria, variando
de 0 a3. A categoria de resultado 1 é um resultado com maior probabilidade,
enquanto que uma categoria de resultado 3 é rara e não pode ser reproduzido
facilmente. Os piores casos são de categoria 0 resultados, que devem ser
considerados com grande suspeita. Supondo-se que os resultados da análise
estiverem corretos, seria de esperar que 95% das combinações observadas cairiam
na categoria 1, 4% na categoria 2, 0,9% na categoria 3 e apenas 0,1% na categoria
0. Categorias são mais bem explicadas na Tabela B.6.
No caso em que mais de três diluições são feitas, a seleção da combinação "direta"
de três diluições consecutivas nem sempre é muito clara. No entanto, isso pode ser
feito facilmente pela gravação de todas as possíveis combinações de tubos positivos
e lendo a categoria correspondente na Tabela B.5.
A partir daí, aplicar as seguintes regras:
1) Selecione a combinação de três diluições consecutivas com uma categoria 1 de

perfil para obter o índice de NMP. Se mais de uma combinação de perfil de categoria
1 tiver sido obtida, use a que apresentar o maior numero de tubos positivos.
PT – LMC 002

2) Se nenhuma combinação de perfil de categoria 1 estiver disponível, usar uma de

perfil de categoria 2. Se mais de uma combinação de perfil de categoria 2 for obtido,
use a que apresentar o maior numero de tubos positivos.
3) ) Se nenhuma combinação de perfil de categoria 2 estiver disponível, usar uma de

perfil de categoria 3. Se mais de uma combinação de perfil de categoria 3 for obtido,
use a que apresentar o maior numero de tubos positivos.
Alguns exemplos são mostrados na Tabela 1.
Tabela 1 - Exemplos de seleção de resultados positivos para o cálculo do MPN
10.5.6.3 Programas de computador
Os programas de computador mais versáteis não representam nenhuma restrição

sobre o número de diluições e tubos paralelos ou simetria do sistema de NMP. MPN
AssayAnalyzeré um programa disponível gratuitamente com base em um programa
anterior.
10.5.7 Expressão dos resultados

PT – LMC 002

Do índice NMP lido na tabela B.5 [de acordo com a combinação de três (ou cinco)
diluições consecutiva retida], determinar o numero de micro-organismos mais
prováveis no volume referido.
Resultados do relatório como o número mais provável de micro-organismos (ou

grupo específico de microrganismos) por grama ou mililitro. A massa ou o volume de
referência pode ser diferente de g ou ml (por exemplo, 100 g ou 100 ml).
11 Método de detecção (método qualitativo)
11.1 Geral
Um método de detecção é um método que determina a presença ou ausência de

micro-organismos em uma determinada quantidade de produto.
11.2 Princípio
Salvo disposição em contrário de norma internacional especifica, misturar (produtos

líquidos) ou homogeneizar (outros produtos) uma quantidade P do produto a ser
examinado com 9xP ml ou 9 xP g de um caldo eletivo e/ou seletivo.
Para facilitar a recuperação de micro-organismos estressados em alimentos, as

amostras são geralmente pré-enriquecidas em um caldo não-seletivo seguido de
enriquecimento seletivo e isolamento em meios Agar seletivos / diferenciais. O uso
de dois diferentes caldos de enriquecimento, bem como de dois ou mais meios de
ágar seletivo, aumentam a sensibilidade do método.
Após a incubação, espalhar com uma alçada obtida do caldo seletivo sobre a
superfície de um meio Agar seletivo de tal forma a obter colônias isoladas. Salvo
disposição em contrário, os caldos de enriquecimento incubados só podem ser
refrigerados após a avaliação do impacto de sistemas de refrigeração nos resultados
e somente se claramente estipulado no resultado do teste.

PT – LMC 002

Um número (geralmente cinco por placa de ágar) das colônias obtidas após a
incubação são, então, identificado com técnicas adequadas de confirmação.
A seleção de colônias para confirmação deverá abranger representativamente

colônias tipicamente suspeitas.
11.3 Incerteza de medição
A estimativa da incerteza de medição de determinações qualitativa está sendo

investigada pela ISO/TC 34/SC 9.
12 Métodos de confirmação
12.1 Geral
Utilizar apenas culturas puras para confirmação bioquímica e sorológica.
Os testes de confirmação de referência são descritos nas normas específicas. Como

uma alternativa aos testes bioquímicos descritos nessas normas específicas, os
métodos de confirmação descritos nesta cláusula (bioquímicos, sondas de DNA)
podem ser utilizados nas condições descritas na cláusula, salvo disposição em
contrário as normas específicas.
12.2 Preparação de uma cultura pura
Começar a preparação de uma cultura pura pela seleção de uma única colônia em
um meio Agar. Então inocular a colônia selecionada em meio de ágar não-seletivo.
Após a incubação, selecione uma colônia bem isolada para posteriores testes de
confirmação. Repita a operação se necessário.
Se possível, os testes de confirmação deverão ser feitos usando células de uma

única colônia. Se houver material insuficiente em uma colônia, ele deve primeiro ser
repicadas em um meio líquido ou em um meio inclinado ágar, após o qual a
subcultura pode ser utilizada para os testes a serem realizados.

PT – LMC 002

12,3 Teste de Gram (técnica de Hucker modificada)
12.3.1 Geral
Esta forma de coloração de células bacterianas permite a descrição da morfologia

da bactéria e sua classificação em dois grupos em função de serem ou não capazes
de reter a coloração de cristal violeta (Gram +) nas condições de ensaio. Esta
divisão resulta principalmente de diferenças na estrutura da parede da célula dos
dois grupos e se correlaciona com outras diferenças importantes entre os dois
grupos.
A alternativa satisfatória à coloração de Gram é o uso de solução de hidróxido de

potássio 3% (KOH). Uma alçada do crescimento bacteriano é agitada em 2 gotas de
solução de KOH. Bactérias gram-negativas farão com que a solução tornar-se muito
viscosa e mucóide em 30 segundos, com formação de um filete da seguinte mistura
na alça, quando levantada.
Há uma série de maneiras de conduzir um teste de Gram, mas todos seguem as

sequências abaixo.
12.3.2 Soluções
12.3.2.1 Geral
Soluções disponíveis no mercado podem ser utilizados.
Neste caso, siga as recomendações do fabricante.
12.3.2.2 Solução de cristal de violeta
12.3.2.2.1 Composição
Cristal violeta 2,0 g
Etanol (95%) 20 ml

PT – LMC 002

Oxalato de amônio (C2H8N2O4) 0,8 g
água 80 ml
12.3.2.2.2 Preparação
Dissolver o cristal violeta no etanol, e o oxalato de amônio na água destilada.

Misturar as duas soluções e manter a mistura em repouso por 24 h antes do uso.
12.3.2.3 Solução de iodo
1,0 g de iodo
Iodeto de potássio (KI) 2,0 g
água 100 ml
Dissolver o iodeto de potássio em 10 ml de água e adicionar o iodo em frações.

Após dissolução, completar o 100 ml em um balão volumétrico.
12.3.2.4 Solução de safranina
Safranina0,25 g
Etanol (95%) 10 ml
água 100 ml
Dissolver o safranina no etanol, em seguida, misturar com a água destilada.

PT – LMC 002

12.3.3 Técnica de Gram
Depois de fixar uma alçada de bactérias numa lâmina de microscópio com a chama,
preparada a partir de uma cultura 18 a 24 horas ou quando o caldo estiver turvo,
cobrir o filme com o cristal violeta. Deixar reagir por 1 min.
Delicadamente lavar com água a lamina inclinada por alguns segundos.
Cubrir a lâmina com a solução de iodo. Deixar reagir por 1 min.
Delicadamente lavar com água a lamina inclinada por alguns segundos.
Despeje delicadamente e de forma contínua um filme de etanol (95%) sobre a rampa

inclinada durante um período não superior a 30 s até que nenhuma cor violeta saia
da lamina.
Delicadamente lavar com água a lamina inclinada para eliminar o etanol. Cubra a
lâmina com uma solução de safranina por 10 segundos. Delicadamente lavar com
água a lamina inclinada.
Secar a lamina.
12.3.4 Interpretação
Colocar uma gota de óleo de petróleo na lamina, e examinar na objetiva de alta

potência de um microscópio. As células bacterianas que aparecem em azul ou
violeta são denominadas Gram-positivas (+ Gram), aquelas que são cor de rosa, ou
cor vermelha escura são denominadas Gram-negaivas (- Gram).
Para uma cultura pura de certos tipos de bactérias, tanto as células Gram-positivas e
Gram-negativas podem ser obtidas no mesmo campo do microscópio.
NOTA Quantidade muito densa de células pode dar uma resposta incomum.
12.4 Uso de galerias bioquímicas para identificação

PT – LMC 002

Galerias bioquímicas disponíveis podem ser usadas para identificação de colônias

isoladas.
Verificar se as galerias são adequadas, através de estudos de avaliação publicados

em revistas de literatura científicas internacionais, de preferência relacionados à
microbiologia de alimentos. Esta verificação é especialmente importante se o
fabricante não tem validação de dados sobre as galerias.
O laboratório deve obter um certificado de controle para cada lote, com indicação
das estirpes de ensaio.
O fabricante deve especificar também as cepas de controle que o laboratório pode

usar para verificar a preservação do desempenho das galerias.
As galerias devem incluir, no mínimo, os testes bioquímicos descritos nas normas

específicas ou ser complementadas por outros testes.
12.5 Uso de sondas nucléicas para a identificação
Sondas nucléicas podem ser utilizadas para identificação de colônias isoladas.
No entanto, deve-se verificar se as sondas nucléicas utilizadas para a confirmação

são adequadas, como mostradas por estudos de avaliação publicados em literatura
científica internacional, de preferência relativa à microbiologia de alimentos. Esta
verificação é especialmente importante se o fabricante não tem dados de validação
das sondas.
O laboratório deve obter um certificado de controle para cada lote, com indicação
das estirpes de ensaio.
O fabricante deve especificar também as cepas controle que o laboratório pode usar
para verificar a manutenção do desempenho da sonda.
4) Os pedidos de informação devem ser dirigidos para o centro de referência

nacional, regional ou internacional indicado para cada micro-organismo.
PT – LMC 002

12.6 Métodos sorológicos
12.6.1 Geral
Quando confirmação sorológica é necessária, realizá-la após a identificação

bioquímica das colônias isoladas.
12.6.2 Testes de aglutinação em laminas
Reações antígeno-anticorpo causam nas células bacterianas agregação e formação

massas floculantes ou densos grânulos. No caso das bactérias da família
Enterobacteriaceae, a reação entre o antígeno "H" (flagelar) e seu antissoro
homólogo resulta em um amontoado floculante, enquanto que a reação envolvendo
o antígeno "O" (somático) resulta em uma mais densa aglomeração granular.
Antes de aglutinação com anti-soros, um teste deve ser realizado para determinar se
as células bacterianas aglutinam em solução de 3% de cloreto de sódio. Se as
células bacterianas aglutinarem, a cepa é autoaglutinante e não deve ser aglutinada
com anti-soros.
Anti-soros disponíveis comercialmente são de dois tipos: anti-soros polivalentes que

reagem com micro-organismos de um determinado gênero ou com grupos de
sorovares e que são adequados para triagem preliminar, e anticorpos monoclonais
específicos, cuja utilização permite a identificação de um sorovar especifico.
O laboratório deve obter um certificado de controle para cada lote de anti-soros, com
indicação das cepas testes.
Verifique se os testes de aglutinação são adequados, como mostrado por estudos

de avaliação publicado em literatura científica internacional, de preferência
relacionados à microbiologia de alimentos.
Ao usar os reagentes, adequados controles positivos e negativos devem ser usados.
12.6.3 Teste de aglutinação de látex

PT – LMC 002

Um método mais rápido está disponível comercialmente, empregando partículas de

látex revestidas com grupos de anticorpos específicos. O antígeno no extrato é
testado contra uma série de látex reagentes.
Verifique se os testes de aglutinação em látex são adequados, como mostrado por

estudos de avaliação publicados em literatura científica internacional, de preferência
relacionados à microbiologia de alimentos.O laboratório deve obter um certificado de
controle para cada lote, com indicação das cepas testes.
Ao usar os reagentes, adequados controles positivos e negativos devem ser

usados.Os pedidos de informação devem ser dirigidos para o centro de referência
nacional, regional ou internacional indicado para cada microrganismo.
13.0 RELATÓRIO DE ENSAIO
O relatório deve especificar o método utilizado, se necessário a temperatura de

incubação, e os resultados obtidos. Deve também mencionar todos os detalhes
operacionais não especificadas nesta Norma, bem como aqueles considerados
como opcional, juntamente com os detalhes de quaisquer incidentes que possam ter
influenciado os resultados.
Constar também no relatório de ensaio se mais testes devem ser realizados por um
laboratório de referência, ou, e se esses testes foram realizados, quais foram os
resultados.
O relatório de ensaio deve incluir todas as informações necessárias para a

identificação completa da amostra. Também é apropriado incluir todas as
informações necessárias para a interpretação dos resultados do teste.
Se necessário, a medida de incerteza, deve ser incluída no relatório de ensaio.
14.0 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
14.1 Validação de métodos de referência

PT – LMC 002

A validação de métodos de referência está sendo investigada pela ISO/TC 34/SC 9.
14.2 Validação de métodos alternativos
A ISO 16140 orientapara o protocolo técnico de validação de métodos alternativos

comparados com métodos de referência.
14.3 Validação de métodos internos
A validação de métodos internos está sendo investigada pela ISO/TC 34/SC 9.
15.0GARANTIA DE QUALIDADE DOS RESULTADOS / CONTROLE DE

QUALIDADE DE DESEMPENHO
15.1 Controle de qualidade interno
15.1.1 Controle de qualidade interno é composto por todos os procedimentos

realizados por um laboratório para a contínua avaliação do seu trabalho. O objetivo
principal é garantir a consistência dos resultados no dia-a-dia e a sua conformidade
com critérios bem definidos.
15.1.2 Um programa de verificações periódicas é necessário para demonstrar que a

variabilidade (entre os analistas, entre equipamentos ou entre materiais) está sob
controle. Todos os testes incluídos no escopo de atividade do laboratório precisam
ser protegidos.
O programa deve envolver:
- o uso de amostras fortificadas, com níveis variáveis de contaminação, incluindo a

cepa alvo e flora contaminante;
- o uso de amostras naturalmente contaminadas a partir de uma gama de matrizes;
- o uso de materiais de referência (incluindo materiais para ensaios de proficiência);
- testes de replicação;
PT – LMC 002

- replicação de testes de avaliação.
O intervalo entre essas verificações é influenciado pela natureza dos ensaios

efetuados pelo laboratório e a frequência na qual os testes são realizados.
Recomenda-se que, sempre que possível, os testes devem incorporar controles para
monitorização do desempenho.
15.1.3 Em casos especiais, um laboratório pode realizar um teste específico raro. É

reconhecido que, em tais casos, um programa de controle de qualidade interno em
curso pode ser inadequado e que pode ser mais adequado realizar em paralelo com
o teste um esquema para demonstrar desempenho satisfatório.
15.2 Cepas de referência
Manutenção de cepas de referência de acordo com o PT-LMC-003 Preparo e

avaliação dos meios de cultura.
15.3 Avaliação externa da qualidade (ensaios de proficiência)
Laboratórios devem participar regularmente em programas de ensaios de

proficiência que são relevantes para o seu âmbito de atividade.
Deve ser dada preferência aos programas de ensaios de proficiência que utilizem
matrizes adequadas.
Laboratórios devem usar avaliação externa da qualidade não só para avaliar

tendência de laboratório, mas também para verificar a validade do seu sistema de
qualidade como um todo.
16.0 BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
ISO 7218:2007amd 1:2013. Microbiology of food and animal feeding stuffs – General
requirements and guidance for microbiological examinations.

PT – LMC 002

17.0 APROVAÇÃO E RESPONSABILIDADE
Tarefa Responsável
Elaboração Gerente Técnico
Análise Crítica deste documento Gerente da Qualidade
Aprovação Gerente Técnico
18.0 HISTÓRICO DAS REVISÕES
REVISÃO DESCRIÇÃO DATA

00 Emissão inicial 25/10/2017

PT – LMC 002

ANEXO

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PT – LMC 002

Procedimento Técnico Emissão: 25/10/17

REQUISITOS GERAIS E ORIENTAÇÕES PARA Revisão: 00

REQUISITOS GERAIS E ORIENTAÇÕES PARA EXAMES

CÓPIA CONTROLADA – PROIBIDO REPRODUÇÃO

REQUISITOS GERAIS E ORIENTAÇÕES PARA Revisão: 00

1.0 OBJETIVOS E ALCANCE

Abrange exame para bactérias, bolores e leveduras e pode ser usado se

Esta Norma aplica-se a microbiologia de alimentos, alimentos para animais, indústria

O objetivo desta Norma é contribuir para garantir a validade dos exames de

Ao conduzir exames microbiológicos é especialmente importante que

- apenas os microrganismos que estão presentes nas amostras sejam isolados e

- os microrganismos não contaminem o meio ambiente

CÓPIA CONTROLADA – PROIBIDO REPRODUÇÃO

REQUISITOS GERAIS E ORIENTAÇÕES PARA Revisão: 00

os resultados e os cálculos do número de microrganismos e o cálculo de incerteza

Em ultima instância, é de responsabilidade do coordenador do laboratório de julgar

Um grande número de manipulações podem, por exemplo, sem intenção levar a

A fim de realizar as análises corretamente é necessário tomar certas precauções ao

A fim de distinguir as orientações nessa Norma Internacional, elas estão impressas

Esta cláusula dá requisitos gerais, para os princípios da concepção e organização

CÓPIA CONTROLADA – PROIBIDO REPRODUÇÃO

REQUISITOS GERAIS E ORIENTAÇÕES PARA Revisão: 00

Exame das amostras estágio primário de produção (especialmente para recepção de

3.2 Considerações sobre segurança

O projeto de laboratório deverá cumprir os requisitos de segurança que vai depender

Categoria de risco 1 (nenhum risco ou muito baixo para o indivíduo e para a

Um micro-organismo que é improvável que causam a doença humana ou animal.

Categoria de risco 2 (risco moderado para o risco individual e baixo para a

Um agente patogênico que pode causar doenças no homem ou animal, mas é

Um patógeno que geralmente causa doença humana ou animal grave, mas

Categoria de risco 4 (alto risco para o indivíduo e para a comunidade).

REQUISITOS GERAIS E ORIENTAÇÕES PARA Revisão: 00

AVISO - Consulte a regulamentação nacional, que define a categoria de risco de

3.3 Design de Laboratório

As diretrizes para a disposição de laboratório descrito abaixo cobrem exames para a

Note-se que as medidas de segurança adicionais podem ser necessárias,

3.4 Áreas do Laboratório

O laboratório compreende áreas associadas com amostras e testes (ver 3.4.2) e

3.4.2 Áreas associadas com amostras e testes

É considerado boa prática ter locais separados ou áreas claramente designadas,

- recebimento e armazenamento das amostras;

- preparação de amostras, em particular no caso de matérias-primas (por exemplo,

- exame das amostras (a partir da suspensão inicial), incluindo a incubação de

- manipulação de patógenos presuntivo;

- armazenamento de cepas de referência e outras cepas;

REQUISITOS GERAIS E ORIENTAÇÕES PARA Revisão: 00

- preparação e esterilização de meios de cultura e equipamentos;

- armazenamento de meios de cultura e reagentes;

- exame de alimentos para a esterilidade;

- limpeza de vidro e outros equipamentos;

- armazenamento de produtos químicos perigosos, de preferência mantidos em

3.4.3 Áreas gerais

As seguintes áreas são consideradas separadas:

- áreas administrativas (por exemplo, escritórios, salas de documentação, etc);

3.5 Layout e acessórios das instalações

O objetivo é garantir que o ambiente dentro do qual os exames microbiológicos são

CÓPIA CONTROLADA – PROIBIDO REPRODUÇÃO

REQUISITOS GERAIS E ORIENTAÇÕES PARA Revisão: 00

Providenciar instalações de forma a evitar o risco de contaminação cruzada.

a) para a construção do laboratório de acordo com o princípio do layout "não volta";

b) a realização de procedimentos de forma sequencial utilizando as devidas