AULA PRÁTICA
29- Equipamentos que usam calor e pressão precisam de cuidados redobrados no uso. Não deixar
materiais sob aquecimento sem o seu acompanhamento. Pedir auxílio aos técnicos, se
necessário.
30- Colocar vidrarias quentes sobre panos ou flanelas, e não diretamente sobre a bancada ou outras
superfícies mais frias, pois podem trincar ou quebrar.
31- Cuidado ao trabalhar com vidrarias: elas são frágeis, fáceis de quebrar, e o estoque é limitado;
32- Manter um comportamento apropriado e com disciplina. Não correr e não fazer barulho
desnessário.
33- Certificar-se da correta utilização dos equipamentos. Pedir explicação de uso aos técnicos, se
necessário.
34- O professor (responsável pelo laboratório ou pela turma que estiver usando o laboratório) tem
total autonomia para remover do laboratório o usuário que não estiver seguindo estritamente as
normas de utilização (gerais e/ou específicas).
35- Em casos de acidentes (cortes, queimaduras, etc.) com equipamentos, vidrarias, reagentes,
microrganismos procure manter a calma, comunique os técnicos e solicite ajuda. Existe um
procedimento de atendimento para estes casos.
1. Alça de inoculação;
2. Autoclave;
3. Balanças;
4. Balão de fundo chato;
5. Bastão de vidro;
6. Becker;
7. Bico de gás;
8. Cálice;
9. Chapa elétrica;
10. Conta-gotas;
11. Erlenmeyer;
12. Escova para limpeza de vidrarias;
13. Espátulas;
14. Estante para tubos de ensaio;
15. Estufa;
16. Esterilizador;
17. Pisseta ou pissete
18. Funil;
19. Lâminas;
20. Lamínulas;
21. Microscópio;
22. Pera;
23. Pinças;
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24. Pipetas;
25. Placa de Petri;
26. Provetas;
27. Tela de amianto;
28. Tripé;
29. Tubos
1 ) ALÇA DE INOCULAÇÃO:
– Arame de liga metálica e cabo;
– Transfere por toques leves, a amostra infectada para culturas
2) BALANÇA:
– Determina a massa de um corpo (“peso’’)
– Balança analítica elétrica: cuidar com a conservação
– Balança analítica eletrônica: Estágio mais avançado – décimo do grama ao milésimo do miligrama
3) BALÃO DE FUNDO CHATO:
– Balão de Florence ou Florença;
– Vários usos;
– Condicionamento e preparo de meios de cultura;
4) BASTÃO DE VIDRO:
– Muito usado;
– Agitação de soluções;
– Cuidado: não ser danificado nem danificar o recipiente;
5) BECKER:
– Copo de Becker, copo de Griffin, copo de Berlim;
– Varios usos;
– Pesagem e diluição
6) BICO DE GÁS:
– Chamas de diferentes intensidades ;
– Vários tipos;
– Bico de Bunsen, Bico de Tirril, Bico de meker;
– Cuidados no acendimento:
1. Segurar o fósforo aceso acima e ao lado do tubo;
2. Abrir cautelosamente a torneira de gás;
3. Chama acesa ( ajustá-la) :
• Amarelada e fumacenta: Falta ar
• Desprendendo do bico: Excesso de gás;
• Bico queimado por dentro: Mistura de ar e gás não está bem regulada – apagar imediatamente o bico .
Esfriar;
Como acender corretamente o bico de gás:
1. Fechar a entrada de gás;
2. Abrir o gás e acender a chama;
3. Abrir o ar até obter uma chama totalmente azulada;
4. Se a chama não estiver azul e estiver totalmente aberto, diminuir o gás.
7) CÁLICE:
– Copo de precipitação ou sedimentação
– Usado em decantação ou substâncias quando em suspensão
8) CHAPA ELÉTRICA:
– Fonte de calor ( resistência elétrica);
– Protegida por material refratário ( ex. Amianto);
– Uso: Aquecimento de substâncias inflamáveis
9) CONTA – GOTAS:
– Colorações
10)ERLENMEYER:
– Aquecer substâncias;
– Boca estreita: substâncias voláteis ou inflamáveis ( Vantagens sobre o becker)
– Agitação / destilação
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27) TUBOS:
– Uso variado
– Diâmetro e comprimento variam
PROVETAGEM:
– Proveta: cilindro graduado / medir volumes
– Não é utilizado para volumes com alta precisão
– Calibração à 20C
– Substância – becker – proveta
– Becker – bastão de vidro – proveta ( paredes)
– Graduação
LEITURA:
1. Analisar a proveta (capacidade, subdivisões, ...)
2. Medida desejada – parte inferior do líquido – menisco – solução transparente;
3. Parte superior do menisco – substância opaca
4. Leitura: menisco à altura dos olhos do observador;
Obs. – A proveta deverá estar de repouso, se segurar com as mãos a leitura é incorreta.
PIPETAGEM:
1. Mergulhar a pipeta limpa e seca na solução ( a ponta não deve tocar o fundo, nem ficar muito na
superfície)
2. Sucção: até acima do volume desejado
3. Controlando com o dedo indicador ajustar o volume desejado ( menisco)
4. Retirando o dedo o volume escoa rapidamente
OBS.
– Nunca pipetar líquidos corrosivos ou venenosos com a boca e sempre com a pera;
– Ao encher a pipeta deixar sempre a ponta da mesma abaixo da solução;
– A ponta da pipeta deve ficar em contato com a parede interna para o volume escoar completamente;
– Uma pequena quantidade sempre permanece na ponta da pipeta – previsível
–
AUTOCLAVE:
– Vários modelos: horizontais, verticais, gas, vapor;
– Laboratórios de microbiologia:
– Caldeira cilíndrica de paredes resistentes;
– Tampa com borracha: perfeita vedação
– Interior: suporte para cesta metálica;
– Fundo: espaça – água (onde fica mergulhada a resistência)
– Tampa: orifício de escapamento, válvula de segurança e manômetro ( pressão e temperatura)
- O vapor tem ação esterilizante pois se condensa na superfície fria dos objetos cedendo-lhes seu calor latente.
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AULA PRÁTICA
A) ROTEIRO TEORIA:
Microscópio Luminoso:
• Partes Mecânicas: base ou pé, platina, presilhas, charriot, revólver, canhão, botões macrométrico e
micrométrico, botões de controle coaxiais x e y, condensador, diafragma, botões do condensador,
botão de abertura do diafragma.
• Lentes oculares
• Lentes objetivas
• Objetiva de imersão / Óleo de imersão
• Poder de resolução do microscópio (comprimento de onda da luz)
Microscópio Eletrônico
B) RESUMO TEORIA:
Baixo poder 5 10 50
C) ROTEIRO PRÁTICA:
PROCEDIMENTO:
Procedimento Geral:
NOTA: A lente frontal do condensador deverá estar na sua posição mais alta para que se possa aproveitar
toda a sua capacidade.
– Geralmente utilizada para organismos grandes como helmintos e seus ovos e para focalização de
lâminas.
É necessário utilizar óleo de imersão para que os raios luminosos não sejam desviados pela camada de ar
entre a lente e a lâmina.
• Nunca soprar as lentes para retirar a poeira, pois micropartículas de saliva podem se depositar nas
lentes.
• Nunca usar lenços faciais para limpeza de lentes pois estes podem conter filamentos de vidro que
riscam a lente. Poderão ser usados tecido de linho ou algodão hidrófilo.
• Seguir rigorosamente as instruções do fabricante do equipamento quanto ao uso de solventes para a
limpeza.
• Nunca usar álcool para limpeza de lentes, pois a cola usada na montagem das mesmas é
freqüentemente solúvel em álcool.
• Limpar o óleo residual das objetivas ao final de cada uso com algodão hidrófilo, ou uma flanela
macia, umedecido em xilol ou em éter-acetona 1:1.
• Nunca deixar os orifícios de conexão das objetivas e oculares abertos.
• Mantê-los fechados por plug de proteção adequados ou com as próprias oculares ou objetivas.
• Não tocar nas lentes com as mãos.
• Somente usar óleo de imersão que atenda a especificação estabelecida pelo fabricante.
• Nunca usar óleo de imersão para trabalhos com objetivas que não sejam de imersão. Estes óleos
danificam as substâncias de montagem destas objetivas.
• Os microscópios devem ser colocados em superfícies isentas de vibrações e não são recomendadas
mudanças de localização.
Limpeza:
Corpo:
– Usar álcool ou uma flanela levemente umedecida com água para limpeza do corpo do
microscópio.
– Quando usar a flanela úmida, secar imediatamente com uma flanela seca.
– Lubrificar as partes móveis com lubrificante derivado do petróleo, como a vaselina, ou
outro lubrificante recomendado pelo fabricante.
ANOTAÇÕES:
MATERIAIS:
EQUIPAMENTOS:
AMOSTRA:
RESULTADOS:
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ASSUNTO: Colorações
ROTEIRO TEORIA:
- Exame à fresco
- Colorações:
• Coloração simples
• Coloração composta
• Etapas da coloração: preparação do esfregaço, fixação do esfregaço, coloração
RESUMO TEORIA:
- Exame à fresco
- Coloração:
PREPARAÇÃO DO ESFREGAÇO
• Para sucesso na observação, é necessário que o esfregaço seja bem feito, apresentando-se em
monocamadas, suficientemente concentrado de forma a facilitar a visualização.
• A secagem dos esfregaços deve ocorrer ao ar. Depois de secos, os esfregaços podem ser fixados com
calor, passando rapidamente 2 a 3 vezes através da chama de bico de Bunsen.
FIXAÇÃO DO ESFREGAÇO
• Após secar, passar a lâmina com o esfregaço para cima, por três vezes pela chama do bico de
Bunsen.
COLORAÇÃO:
COLORAÇÃO DE GRAM
• A coloração de Gram é uma das mais importantes em microbiologia, pois separa asbactérias
em dois grandes grupos: Gram positivas e Gram negativas.
– A coloração de Gram utiliza características diferenciais das células bacterianas. Estas
características diferenciais se referem à estrutura da parede celular dos microrganismos.
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Reagentes
1. Cristal Violeta
– Este composto cora toda a célula em roxo-azulado intenso.
Preparo Solução A:
– Cristal violeta (90-95% de pureza) - 2 g
– Etanol 95% - 20 mL
– Filtrar em papel de filtro.
Preparo Solução B:
– Oxalato de amônio - 0,2 g
– Água destilada - 80 mL
Preparo Solução de Trabalho:
– Misturar as soluções colocando-se a solução B sobre a A. Deixar em repouso por 24 horas,
filtrando em seguida.
– Estocar em frasco âmbar.
2. Solução de lugol (iodo iodeto de potássio)
– O iodeto substitui o cloro do cristal violeta, formando um complexo insolúvel em água.
Preparo da solução de trabalho:
– Cristais de iodo (ou ressiblimado) - 1 g
– Iodeto de potássio - 2 g
– Água destilada. - 300 mL
– Misturar e deixar em repouso até dissolução.
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3. Descorante
– A solução de etanol 95% - acetona atua como descorante.
– A descoloração ocorre apenas nas células de microrganismos Gram negativos.
– Alguns autores sugerem que o álcool altera a permeabilidade da membrana externa dos
organismos Gram negativos, devido à sua ação sobre a membrana lipopolissacarídica,
permitindo a retirada do complexo cristal violeta-iodeto da célula.
Preparo da solução descorante de etanol - acetona:
– Acetona - 10 mL
– Etanol 95% - 100 mL
4. Safranina (contracorante)
• A safranina atua como contracorante tornando as células Gram negativas coradas e visíveis.
• As células de microrganismos Gram positivos provenientes de culturas velhas, lesadas por qualquer
motivo ou mortas, também podem ser coradas pela safranina.
Preparo do contracorante - Safranina O - Solução estoque:
– Safranina O - 2,5 mL
– Etanol 95% - 100 mL
Solução de trabalho:
– Solução estoque de safranina O - 10 mL
– Água destilada - 90 mL
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COLORAÇÃO DE GRAM
INTERPRETAÇÃO:
Existem algumas teorias que explicam a coloração de Gram:
1. O mecanismo da coloração de Gram se refere á composição da parede celular, sendo que as Gram
positivas possuem uma espessa camada de peptideoglicano e as Gram negativas, uma fina camada de
peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por lipoproteínas, fosfolipídeos,
proteínas e lipopolissacarídeos.
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• Durante o processo de coloração, o tratamento com álcool (ou álcool - acetona) extrai os lipídeos,
resultando então uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram
negativas. Assim o complexo cristal violeta - iodo ( CV-I ) pode ser retirado e as bactérias Gram
negativas são descoradas.
• A parede celular das bactérias Gram positivas, em virtude da sua composição diferente, torna- se
desidratada durante o tratamento com álcool, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o
complexo CV-I não pode ser extraído.
2. Outra explicação baseia- se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de bactérias.
Nas bactérias Gram positivas, o complexo CV-I é retido na parede após tratamento pelo álcool- acetona,
o que causa provavelmente uma diminuição da do diâmetro dos poros da camada de peptideoglicano da
parede celular. A parede das bactérias Gram negativas permanece suficientemente grande, mesmo depois
do tratamento com o álcool- acetona, possibilitando a extração do complexo CV-I.
3. Segundo Trabulsi, na etapa diferencial com o álcool -acetona, as bactérias Gram negativas devido a
pequena espessura da camada basal e às descontinuidades existentes nesta camada, em pontos de
aderência entre a membrana externa e a membrana celular, tem o complexo corado extraído pelo álcool,
que deixa as células descoradas.
ROTEIRO PRÁTICA:
EXAME À FRESCO;
1. Flambar rapidamente uma lâmina de microscopia limpa, nos dois lados, “cortando” lentamente a
chama do bico de Bunsen;
2. Flambar a alça de repicagem ao rubro e, a seguir, deixá-la esfriar, conservando-a todavia, perto da
chama;
3. Tomar o tubo com a suspensão de microrganismos, agitá-lo levemente com a mão esquerda e, com
os dedos mínimos e anular da mão direita, remover o tampão de algodão da boca do tubo;
4. Flambar a boca do tubo de cultura;
5. Introduzir a alça de repicagem, presa entre o polegar e o indicador da mão direita, no interior do
tubo, até tocar a suspensão;
6. Flambar novamente a boca do tubo de cultura; Fechar o tuba com o tampão de algodão e colocá-lo
na estante;
7. Tomar uma lâmina (anteriormente preparada) com a mão e depositar em seu centro uma gotícula de
supensão;
8. Pingar uma gota de azul de metileno a pequena distância da suspensão e, sobre a lâmina, colocar uma
lamínula;
9. Observar ao microscópio em objetiva de 40x.
COLORAÇÕES:
Coloração simples:
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Coloração de Gram:
Exercícios de fixação:
ANOTAÇÕES:
MATERIAIS:
EQUIPAMENTOS:
REAGENTES:
AMOSTRA:
RESULTADOS:
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AULA PRÁTICA
INTRODUÇÃO
OBJETIVOS
PROCEDIMENTO
B- Experimento de Price
1. Dividir o fundo da placa de Petri com ágar sangue em três partes, com lápis marcador, e
identificar a placa.
2. Retirar um swab (zaragatoa) do tubo com assepsia e umedecê-lo em salina estéril;
3. Esfregar sobre a pele da palma da mão;
4. Semear em um terço da placa de ágar sangue, identificando-o como “mão sem lavar”
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EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO
1. Em relação às placas com ágar nutriente (ar, pele, cabelo e respiração), enumere e caracterize as
colônias que cresceram na superfície das placas, quanto a tamanho, cor e forma.
Ar
Respiração Pele ou cabelo
2. Em relação às placas com ágar sangue, esquematize o resultado obtido com a experiência de Price.
4. O que ocorreu com os controles? Justifique os resultados e tire suas conclusões sobre essa aula.
ANOTAÇÕES:
MATERIAIS:
EQUIPAMENTOS:
REAGENTES:
AMOSTRA:
RESULTADOS:
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AULA PRÁTICA
TEORIA /PRÁTICA:
• Todos os materiais (frascos, vidrarias, instrumentos, utensílios, etc) utilizados em uma análise
microbiológica passam por diversas etapas até que se encontrem totalmente limpos, estéreis e
isentos de resíduos químicos e orgânicos.
• Para isto, são utilizados os agentes físicos e agentes químicos.
• Este trabalho envolve as atividades de
descontaminação, descarte dos resíduos contaminados, lavagem, acondicionamento e
esterilização.
Tampas de plástico ou borracha, tubos de roscas ou outros frascos, devem passar por um tratamento
para a remoção de resíduos tóxicos:
Mergulhar em água destilada, autoclavar a 121oC/15 minutos e enxaguar com água
destilada.
Repetir este procedimento mais de uma vez.
Obs.:
• Pode-se também proceder a descontaminação dos materiais em estufa à temperatura de 170 – 180 oC
por um tempo de 1 - 2 horas.
• Porém deve-se levar em consideração o seguinte critério:
Nem todos os tipos de materiais podem ser esterilizados em estufa.
Vidrarias volumétricas ao serem submetidas ao calor dilatam e podem sofrer
alterações significativas nas medidas de volume;
Materiais de borrachas, plásticos, etc, não podem ser submetidos à temperaturas
muito elevadas por longos períodos.
Materiais utilizados nas análises microbiológicas que não entram em contato com as culturas de
microrganismos passam diretamente para a etapa de lavagem, descartando esta etapa de
descontaminação.
2. LAVAGEM:
• Nesta etapa deve-se levar em consideração a escolha do detergente e os métodos de enxágüe, para a
remoção dos resíduos.
• O enxágüe dos utensílios deve ser feito de forma a garantir a completa remoção dos resíduos de
detergente, solução sulfocrômica ou outro agente de limpeza utilizado.
• Os resíduos destes compostos podem interferir nas análises microbiológicas, tanto por alteração das
características dos meios de cultura, como por inibição do crescimento dos microrganismos.
3. SECAGEM:
• Após a etapa de lavagem, as vidrarias e demais utensílios passam para a etapa de secagem;
• Esta etapa é geralmente realizada em estufa ou em forno próprio para a secagem de materiais à
temperatura de 100 oC por aproximadamente 1 a 2 horas.
4. ACONDICIONAMENTO:
• Os procedimentos seguintes referem-se aos frascos e utensílios vazios.
• Material com meios de cultura, diluentes e reagentes devem ser preparados, acondicionado e
esterilizado seguindo as orientações geralmente contidas nos rótulos de embalagens ou no manual
próprio de preparo de reagentes e meios de culturas.
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a) Placas de Petri: devem ser acondicionadas em estojos porta placas de alumínio ou aço inoxidável,
em grupos de mesma dimensão, ou embrulhadas em papel Kraft em grupos de até dez placas.
b) Pipetas: Preencher o bocal com algodão e acondicionar em estojos porta pipetas de alumínio ou aço
inoxidável, em grupos de mesmo volume com as pontas para baixo, na extremidade oposta à tampa
do estojo.
Proteger o fundo dos estojos com um chumaço de algodão ou gaze para evitar danos nas
pontas das pipetas.
Pode-se também embrulhar as pipetas individualmente em papel Kraft, lembrando-se de
identificar a extremidade do embrulho que deve ser aberta no momento da análise, e e anotar
externamente o volume da pipeta.
c) Tubos de ensaio vazios: tampar com tampão de algodão ou de gaze, ou ainda com as respectivas
tampas no caso dos tubos rosqueáveis.
Acondicionar em grupos de 4 a 6 tubos de mesmo tamanho e volume, embrulhar com
papel Kraft e vedar com fita crepe especial.
d) Frascos de homogeneização e outros frascos vazios tampados com tampão de algodão, gaze ou
tampa própria: Cobrir a tampa ou o tampão com papel Kraft.
e) Espátulas, pinças, tesouras e demais utensílios: embrulhar individualmente com papel Kraft,
lembrando-se de identificar a extremidade do embrulho que deve ser aberta no momento da análise.
5. ESTERILIZAÇÃO:
A destruição de todos os microrganismos presentes em um material, incluindo os esporos, é
denominada esterilização.
Todo o material de laboratório vazio (placas, pipetas, tubos de ensaio, frascos, pinças, tesouras, etc)
após a etapa de acondicionamento devem ser esterilizados em autoclave (calor úmido) ou estufa
(calor seco).
• A esterilização pode ocorrer por agentes físicos (calor, radiações, filtrações) ou químicos (óxido de
etileno, beta propiolactona, glutaraldeido, formaldeido)
5.1.1. Flambagem:
– Consiste em passar o material sobre a chama de um bico de Bunsen ou lamparina.
– Utilizado para bocas de tubos de ensaio, lâminas de vidro e, eventualmente para espátulas,
sondas, etc.
– Para tubos de ensaio, a flambagem tem finalidade de evitar possíveis contaminações na
transferência ou inoculação de culturas.
– No caso de lâminas, espátulas e sondas a flambagem é efetuada após imersão em álcool,
não implicando necessariamente em esterilização.
•Quando a alça de
inoculação é colocada na
chama, gotículas podem ser
Parte formadas, resultando em
mais Parte propagação de organismos
x
quente mais fria vivos.
• Por exemplo: os esporos de Bacillus anthracis são destruídos entre 2 e 15 minutos pelo calor úmido
a 100 oC, mas com o calor seco leva mais de 180 min a 140 oC para conseguir o mesmo resultado.
• Endósporos bacterianos são as formas mais resistentes de vida.
• Por outro lado as formas vegetativas das bactérias são muito mais sensíveis ao calor e usualmente
são mortas dentro de 5 a 10 minutos pelo calor úmido a 60 – 70 oC.
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• Células vegetativas de leveduras e outros fungos são geralmente destruídas entre 5 e 10 minutos pelo
calor úmido a 50 – 60 oC.
• Para matar os esporos dos fungos no mesmo período de tempo são necessárias temperaturas de 70 –
80 oC.
• A susceptibilidade dos protozoários e de muitos vírus ao calor é similar àquela da maioria das células
vegetativas.
• O calor úmido utilizado para matar os microrganismos pode ser na forma de vapor, água fervente ou
água aquecida a temperaturas abaixo do seu ponto de ebulição.
AUTOCLAVE:
• Desenvolvida no século XIX, a autoclave é um equipamento essencial em todo o laboratório de
microbiologia.
• Muitos meios de culturas, soluções e materiais contaminados são esterilizados rotineiramente com
este aparelho.
• A autoclave parece uma panela de pressão no sentido em que ambas utilizam vapor sob pressão,
porém a temperatura e a a pressão interna na autoclave podem ser bem mais controladas.
• Â câmara de parede dupla da autoclave é primeiramente lavada com vapor fluente, para remover
todo o ar.
• É então preenchida com vapor puro e mantida a uma determinada temperatura e pressão por um
período especifico de tempo.
• É essencial que todo o ar residual inicialmente presente na câmara seja completamente substituído
por vapor d’água.
• Se o ar estiver presente, reduzirá a temperatura interna da autoclave.
• É a temperatura e não a pressão no interior da câmara, que mata os microrganismos
• Uma autoclave é usualmente operada a uma pressão de 15 lb/pol2, na qual a temperatura do vapor é
121oC.
• O tempo necessário para esterilizar nesta temperatura depende do material que está sendo tratado.
• Leva mais tempo para o calor penetrar em um material viscoso ou sólido do que em material fluido.
• O tempo necessário também depende do volume do material que está sedo esterilizado.
• Por exemplo, 1.000 tubos contendo 10 ml cada de um meio líquido podem ser esterilizados em 10 a
15 minutos a 121 oC, enquanto o mesmo volume de meio (10 litros) em um único frasco necessitará
de uma hora ou mais, pois mais tempo será requerido para o calor penetrar no centro do material
volumoso.
• Obs.
– Ao usar a autoclave é importante que todo o ar seja removido antes que a pressão seja
aumentada, pois uma mistura de ar e vapor resulta numa temperatura menor a uma
dada pressão.
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• Estas membranas filtrantes são discos de ésteres de celulose finos (150 µm), com poros pequenos,
que retém os microrganismos.
• Um sistema de filtração por pressão positiva muito utilizado para pequenos volumes (até 100 ml) é o
Swinnex filter-holderr (Millipore Filter Corporations) que é facilmente adaptados a seringas
hipodérmicas.
• Para evitar a contaminação do analista por partículas aerossóis que são emitidas durante a
manipulação de materiais biológicos, foram desenvolvidas cabines de segurança biológica que
empregam sistema de filtração.
– O ar é aspirado para dentro do equipamento e filtrado através de filtros de acetato de
celulose aderido a uma folha de alumínio, com a finalidade de reter 99 % de partículas
presentes no ar.
6. SECAGEM DE MATERIAIS:
• Esta etapa pode ou não ser realizada.
• É utilizada quando a etapa de esterilização é por calor úmido (autoclave).
• Geralmente após este tipo de esterilização, os materiais ficam úmidos, podendo facilitar uma
contaminação.
• A secagem pode ser realizada em estufa de Pasteur a temperaturas de no máximo 100 oC.
• A armazenagem dos materiais deve ocorrer apenas após os mesmo estarem totalmente secos.
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ROTEIRO:
Exercícios de fixação:
ANOTAÇÕES:
MATERIAIS:
EQUIPAMENTOS:
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AULA PRÁTICA
MEIOS DE CULTURA:
• Quando uma população de microrganismos está em crescimento ativo em um meio nutritivo , ocorre
a formação de uma cultura;
• Quando uma única espécie de microrganismo se desenvolve em um meio de cultura esta cultura é
chamada de cultura pura.
Todos os trabalhos em laboratórios são baseados em culturas puras, pois são as únicas
que permitem estudos precisos de morfologia e fisiologia microbiana.
Algumas Definições:
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Extratos:
• São concentrados aquosos desidratados, obtidos a partir de carnes (sem tendões e graxas), de
leveduras ou de malte.
• Os extratos de carne e levedura geralmente são isentos de carboidratos fermentáveis, ao contrário do
extrato de malte, o qual possui um elevado teor, principalmente de maltose, indicado particularmente
para o cultivo de leveduras e bolores.
• O valor nutritivo dos extratos é devido à substâncias solúveis obtidas a partir da matéria prima tais
como: carboidratos, compostos orgânicos, vitaminas hidrossolúveis e sais.
Peptonas:
• São substâncias de origem protéica;
• Obtidas a partir de proteínas nativas que foram transformadas em fragmentos hidrossolúveis.
• O termo “peptonas” é usado quando são obtidos por via enzimática, e o termo “hidrolisado”
quando obtida por via inorgânica.
• As peptonas constituem uma mistura de peptídeos, e os hidrolisados uma mistura mais ou menos
irregular de diversos peptídeos e aminoácidos livres.
• As peptonas e os hidrolisados representam as substâncias basais mais importantes para a preparação
dos meios de cultura para os microrganismos.
• As peptonas e os hidrolisados disponibilizam nitrogênio para o meio de cultura.
A. Meios Líquidos
B. Meios Fluidos
C. Meios Semi-sólidos
D. Meios Solidificados
E. Meios Sólidos
A consistência do meio de cultura está relacionada com o estado físico, considerando-se o teor de ágar-ágar
adicionado ao meio de cultura.
Ágar-ágar:
• É um polissacarídeo ácido obtido a partir de algas marinhas (Rhodophyceae), que pro hidrólise
fornece D-galactose e pequena quantidade de D-galactose e ácido sulfúrico.
• É utilizado como agente solidificante de meios de cultura
• Não são considerados como fonte nutritiva para os microrganismos (pois não são hidrofilizados
pelos microrganismos)
Propriedades do ágar-ágar:
• Em soluções aquosa na concentração de 1,2% se dissolve e se liquefaz somente a temperatura de
95oC e permanece líquido até 45-48 oC.
• Nesta temperatura de o meio de cultura pode ser semeado sem risco de inativar os microrganismos,
ou ainda poderá ser enriquecido pela adição de proteínas coaguláveis (sangue, soro), vitaminas ou
atores termolábeis.
• Depois de solidificado, adquire consistência firme e pode ser incubado a 35-37 oC sem perder a
consistência.
• Resistem a autoclavação (121 oC, exceto em pH menor que 4,0 e maior que 9,0);
• É destituído de toxicidade para os microrganismos;
• Praticamente não é atacado (hidrolisado) pelos microrganismos;
• Na concentração de 1,5% - 2% confere um certo grau de umidade à superfície do meio de cultivo,
permitindo no entanto, a obtenção de colônias isoladas.
• A estrutura do gel quando na concentração de 1,2% impede a mobilidade bacteriana, porém favorece
a difusão dos nutrientes.
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D. Diferenciais: Possuem substancias que evidenciam uma característica que permite separar ou
diferenciar um grupo ou uma espécie de microrganismo. Ex ágar EMB., ágar baird parker, etc.
E. Seletivo-diferenciais: São aqueles que combinam seletividade e diferenciação. Ex. ágar Manitol
Salgado, seletivo para estafilococos devido ao alto teor de sal, diferenciando o S. aureus (colônia
amarela) do S. epidermidis (colônia branca) através da fermentação do manitol.
F. Dosagem: Meios de composição definida (sintéticos) empregados para a dosagem de vitaminas,
aminoácidos e antibióticos. Há também meios especiais para a avaliação de desinfetantes. Ex.
Antibiotic Agar.
G. Contagem: são aqueles meios específicos apara a contagem de colônias, cuja composição deve
obedecer a recomendações padronizadas. Ex. Plate Count Agar (ágar padrão para contagem).
H. Identificação: Existe uma grande variedade de meios rotineiramente utilizado em microbiologia
para a identificação bioquímica de microorganismos. Ex. prova da Urease, Citrato, Indol,
Fermentação da Glicose, etc.
I. Estoque: A manutenção adequada da viabilidade e das características fisiológicas de uma cultura
pode exigir um meio diferente daquele que é recomendado para o seu crescimento ótimo, pois o
crescimento rápido pode estar associado a uma rápida morte celular devido à eliminação de
substâncias tóxicas como produto do metabolismo dos microrganismos. Ex. caldo nutriente, agar
Nutriente semi-sólido, etc.
Observações:
• Ao se preparar meios de cultura deve-se ter em mente alguns fatores que podem interferir com um
resultado satisfatório do crescimento bacteriana. Como exemplo o pH que geralmente é do meio
final, pronto para a inoculação e determinado a temperatura ambiente.
– Se o meio contiver fosfatos ou outros tampões ativos, devemos ajustar as quantidades dos
sais do tampão para obter o pH apropriado.
• Outro fator de influencia é a temperatura, pois ao preparar um meio de cultura não podemos deixá-
lo por mais de uma hora á temperatura ambiente, pois pode ocorrer uma evaporação de água,
alterando sua composição final. Além disso o risco de contaminação do meio é maior
Recomendações:
• Manter registro escrito onde conste data de recepção, prazo de validade e outras anotações que
considere necessárias, como, por exemplo, controle de estoque.
• Meios de cultura desidratados devem permanecer bem fechados em recipientes âmbar e ao abrigo da
luz, e em alguns casos, sob refrigeração.
• Meios em forma de pós se conservam durante um ano;
• Meios granulados se conservam por três anos.
Teste de esterilidade:
• Após a autoclavação (esterilização do meio a 121oC por 15 minutos) os meios devem ser deixados na
estufa até o dia seguinte para controle de sua esterilidade.
Controle de Qualidade:
• Embora muitos meios tenham sido submetidos a controle de qualidade pelo fabricante, em muitos
casos deve-se repetir a avaliação no laboratório antes de sua utilização.
• Deve-se em cada novo lote de meios, inocular microrganismos reservas, isto é, microrganismo que
pertencem a coleção do laboratório (bacterioteca), pois as reações destes nos meios já são
conhecidas.
• Por exemplo: Estreptococos grupo A em agar sangue devem apresentar bom crescimento e beta
hemólise.
• Adicionar ao meio de cultura a metade da água necessária e homogeneizar bem, até obter uma
suspensão homogênea.
• Adicionar o restante da água e homogeneizar, lavando várias vezes o recipiente aonde se pesou o
meio.
• Meios contendo agar devem ser deixados em repouso por 10 a 15 minutos antes do aquecimento,
para que o agar seja “embebido” com água assegurando total dissolução;
• Determine o pH do meio em potenciômetro previamente ajustado com tampões.
• Um meio preparado adequadamente manterá o pH indicado no rótulo de sua embalagem.
Esterilização:
• Distribuir em recipiente adequado, quantidade correspondente a 2/3 da capacidade do frasco;
• Esterilizar a 121oC por 15 minutos (o aumento da temperatura ou do tempo poderá causar alterações
no meio).
• Obs. Alguns meios, principalmente os enriquecidos com proteínas, aminoácidos, vitaminas ou outros
nutrientes podem apresentar sensibilidades a altas temperaturas, podendo ocorrer perdas de alguns
destes componentes. A indicação sempre constará no rótulo do produto, devendo apenas ser
aquecidos em temperaturas de aproximadamente 60 oC (banho-maria), até 100 oC (vapor fluente).
• Desvio de cor: alteração de pH, superaquecimento, resíduos nas vidrarias;
• Crescimento pobre: presença de resíduos como detergentes nas vidrarias, resíduos tóxicos na água,
pH alterado, superaquecimento, uso do meio quente;
• Colônias alteradas: umidade excessiva na superfície do meio, distribuição de substancias inibidoras
no preparo;
• Crescimento atípico: meio vencido, armazenamento inadequado, resíduos de substancias nas
vidrarias ou na água, superpopulação.
ROTEIRO PRÁTICA:
ANOTAÇÕES:
MATERIAIS:
EQUIPAMENTOS:
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Exercícios de fixação:
ANOTAÇÕES:
MATERIAIS:
EQUIPAMENTOS:
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TEORIA:
Semeaduras:
• Os microrganismos necessitam de um meio de cultura adequado para o seu crescimento in vitro. Mas,
além dos componentes presentes no meio, outros fatores interferem no seu desenvolvimento: são fatres
ambientais como temperatura (psicrófilos, mesófilos, termófilos) e tensão de oxigênio (aeróbias,
anaeróbias facultativas, microaerófilas).
• Inoculando um microrganismo em um meio de cultura que possua todos esses requisitos nutritivos e
fatores ambientais favorecidos, o microrganismo inicia o seu desenvolvimento neste meio, passando
pelas fases da curva de crescimento, desde a fase de latência, logaritmica, estacionária até a fase de
morte.
• A fase logaritmica (exponencial) é caracterizada por divisões sucessivas (cissiparidade, originando a
formação de um grupamento de bactériasda mesma espécie, que é denominado de colônia (massa de
célula). Essa évisualizada sem o auxílio do microscópio, sendo então considerada como característica
macroscópica das bactérias.
• Como cada espécie possui um tipo morfológico colonial diferente, estas devem ser analizadas, quanto à
elevação, forma, tamanho, bordas e pigmentação. Em um meio de cultura, um único tipo de colônia
observado é denominado cultura pura; vários tipos de colônia, cultura mista. Em microbiologia, há
várias técnicas de inoculação de microrganismos; algumas são utilizadas para exames qualitativos e
outras para estudos quantitativos (contagem de bactérias).
• Dentre as técnicas empregadas, encontramos:
o Estrias em superfície (esgotamento):
Estrias contínuas: em tubos e placas
Estrias descontínuas: em placas
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o Diluição:
Pour plate: com ágar liquefeito (placas)
Superfície (placas)
Em meio líquido: profundidade (tubos)
Normas Utilizadas:
a) O fio da alça de platina devem sempre ser flambados antes e depois de qualquer inoculação, ou seja,
devem ser aquecidos ao rubro no cone interno da chama do bico de Bunsen. Para a coleta de
material, devem ser esfriados na parte interna do recipiente com o enio de cultura.
b) Os recipientes (tubos de ensaio, placas de Petri, etc) com meio de cultura, devem sempre ser abertos
próxmo à chama do bico de Bunsen.
c) A boca dos tubos de ensaio deve ser aquecida após a retirada da tampa e antes da colocação da
tampa. A tampa nunca deve ser colocada sobre a bancada, sendo retirada e mantida segura pelo dedo
mínimo da mão direita durante a ioculação.
Método:
1) Estrias Cotínuas:
a) Tubos: Podemos usar meios sólidos com bisel curto ou longo e sem bisel. O bisel curto é semeado
com agulha de níquel cromo, inserindo-a no meio até quase o fundo do mesmo e em seguida,
estriando-se a superfície do bisel. Esta forma é utilizada em meios de identificação de bactérias. O
bisel longo é utilizado principalmente para a conservação de cepasde bactérias e fungos, onde
semeia-se com a alça ou agulha, estriando a superfície do bisel. No sem bisel a inoculação deverá ter
a profundidade de 2/3 do meio e nãodeverá ter mais do que uma única picada. Semeia-se com
agulha; é mais utilizado para se verificar a motilidade das bactérias.
Interpretação dos Resultados: Para avaliar a leitura dos resultados desta técnica deve-se observar os
seguintes ítens:
- Quantidade: pode ser escassa, moderada ou abumdadnte.
- Margens ou bordos do crescimento: pode ser descrita como uniforme ou nítida, ou mostrando várias
irregularidades.
- Consistência da massa de crescimento: pode ser butírica ou de consistência semelhante à de manteiga,
facilmente removivel com a alça de platina, viscosa ou mucóide, seca ou quebradiça.
- Cromogênese ou pigmentação: pode ser opaca,translúcida ou com pigmentos.
Em tubos sem bisel a interpretação dos resultados se baseia em:
- Resultado positivo: crescimento por todo o meio, semelhante a um pinheiro invertido (microrganismo com
motilidade).
- resultado negativo: o crescimento ocorre somenteno local da inoculação.
b) Placas: O estriamento contínuo é feito com alça de níquel cromo, semeando em zigue-zague sobre
toda a superfície da placa.
2) Estrias Descontínuas:
a) Placas: A semeadura por esgotamento descontínuo é mais apropriada para o isolamento de colônias
de bactérias. Esta semeadura deve ser feita espalhando-se a amostra com uma alça de platina em um
terço da placa, logo em seguida flabar a alça e a partir desse inóculo fazer o espalhamento. Deve-se
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passar a alça sobre o inóculo e a semeadura em forma de zigue-zague não tocando mais o inóculo
inicial.
Obs. O sucesso da semeadura está em :
- Grande número de estrias
- Não perfurar o meio
- Não voltar a lça sobre a estria
- Pegar pequena quantiade do material para estriar.
3) Diluição:
a) Pour Plate: liquefazer o meio de cultura. Colocar em uma placa de Petri, com uma pipeta
previamente esterilizada, 1 ml do inóculo e verter 15 – 20 ml do meio de cultura liquefeito (e
resfriado à 45 – 42 oC). Homogeneizar com movimentos circulares em 8 (10 x) e esperar solidificar.
A te´cnica pour plate pode ser realizada com o onjetivo de se obter colônias isoladas (estudo
qualitativo) ou para realizar a contagem de colônias em placas (estudo quantitativo).
Interpretação dos resultados: Para o resultado quantitativo realizar a contagem das colônias escolhendo
a placa que contenha de 25 – 250 colônias. Em seguida realizar o cálculo.
b) Superfície (Spread Plate): Nesta técnica o meio já deve estar solidificado na placa. Com um pipeta
previamente esterilizada, colocar sobre o meio 0,1 ml do inóculo e espalhar com alça de Drigalski.
c) Meios líquidos: A introdução do inóculo e meio líquido pode ser feita com uma alça de níquel
cromo ou com uma pipeta. Com a alça, introduzi-la no meio e agitá-la levemente. Com a pipeta,
depositar o inóculo no fundo do tubo e aspirar algumas vezes com a pipeta para homogeneizar.
Interpretação dos resultados: O resultado de crescimento no meio líquido é observado por:
- Quantidade de crescimento, que pode ser escassa, moderada ou abundante;
- Distribuição de crescimento: pode ser crescimento uniformemente distribuído (nitidamente turvo),
crescimento confinado à superfície do meio como uma espuma ou filme (película); ou crescimento acumulado
como sedimento que pode ser granuloso ou viscoso; e ainda verificar o odor, que pode ser pútirdo, aromático
ou desprezível.
CONDIÇÕES DE INCUBAÇÃO:
Após a inoculação, as bactérias deverão ser icubadas em ambiente com tensão de oxigênio e temperatura
ideais para o seu desenvolvimento. O tempo de incubação depende de cada espécie de microrganismo
variando entre 24 – 48 horas ou mais para atingirem a fase logarítmica de crescimento, sendo vsíveis
macroscopicamente.
ROTEIRO DA PRÁTICA:
Semeadura
por estrias:
esgotamento
Semeadura
Pour plate:
Contagem
ANOTAÇÕES:
MATERIAIS:
EQUIPAMENTOS:
AMOSTRA:
RESULTADOS:
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ROTERIO DA PRÁTICA:
EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO:
ANOTAÇÕES:
MATERIAIS:
EQUIPAMENTOS:
AMOSTRA:
RESULTADOS:
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TEORIA:
1. DILUIÇÕES:
• Diluição é o procedimento de adição de uma substância a outra para reduzir a concentração de uma
das substâncias.
• O uso mais comum da palavra diluição ocorre no sentido de que "tantas partes de um material estão
sendo diluídas em um número total de partes do produto final (diluente + material)".
• "Uma diluição é uma expressão de concentração ou proporção, não de volume".
• "Diluição indica a quantidade relativa de substâncias em uma solução".
• Em "frases de diluição", o menor número sempre se refere ao número de partes da substância que
está sendo diluída, enquanto que o maior número sempre se refere ao número de partes que constitui
a solução final.
Exemplo:
Frase de Diluição:
"Fazer uma diluição 1 para 10 de leite
em solução salina peptonada".
Esta frase poderia ser escrita de outras formas, com o
mesmo significado:
• "Fazer uma diluição 1 em 10, de leite em solução salina peptonada".
• "Fazer uma diluição 1 para 10, de leite com solução salina peptonada".
• "Fazer uma diluição 1/10, de leite com solução salina peptonada".
• "Fazer uma diluição 1:10, de leite usando solução salina peptonada".
• "Fazer uma diluição de 1 parte de leite e 9 partes de solução salina peptonada".
1.1 Diluições decimais
– Diluições decimais são diluições em que a quantidade de substância a ser diluída
corresponde à unidade, ou múltiplos da unidade e o volume final da solução diluída é igual
a 10 ou múltiplo de 10 (diluições de base 10).
1.2 Diluições decimais seriadas
– São diluições decimais preparadas em série e que possuem um fator de diluição único e
igual a 10.
Exemplo:
Preparar diluições decimais de uma cultura bacteriana em fase estacionária até 10-3:
a) Preparar uma diluição 1:10 da cultura em fase estacionária em solução salina peptonada, isto é, misturar 1
mL da cultura em fase estacionária com 9 mL de solução salina peptonada (10-1).
b) A partir da diluição 1:10 preparada conforme item 1 deste exemplo, após homogeneização em agitador de
tubos, tomar 1 mL e misturar com 9 mL de solução salina peptonada, de forma a obter a diluição 1:100 da
cultura em fase estacionária (10-2).
c) A partir da diluição 1:100 preparada conforme item 2 deste exemplo, após homogeneização em agitador de
tubos, tomar 1 mL e misturar com 9 mL de solução salina peptonada, de forma a obter a diluição 1:1000 da
cultura em fase estacionária (10-3).
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Diluições Seriadas:
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
9 ml 9 ml 9 ml
diluente 9 ml
diluente diluente diluente
Amostra ou
Cultura
bacteriana Diluição Diluição Diluição Diluição
-1 -2 -3 -4
10 10 10 10
ou 1/10 ou 1/100 ou ou
ou 0,10 ou 0,010 1/1000 1/10000
ou ou
0,0010 0,00010
– Para a obtenção de uma diluição de base 10, homogeneizam-se porções da amostra com
volume de diluente necessário para completar o volume correspondente a 10 vezes o
volume (ou peso) da amostra.
Assim, a diluição 1:10 de uma amostra de leite pasteurizado pode ser obtida homogeneizando:
– 1 mL de leite + 9 mL de diluente, ou
– 10 mL de leite + 90 mL de diluente, ou
– 20 mL de leite + 180 mL de diluente, ou
– 25 mL de leite + 225 mL de diluente, e assim por diante.
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Diluições Seriadas:
+ Homo- 1 ml
1 ml 1 ml
geneizar
25 g
AMOSTRA DE 225 ML DE
ALIMENTO DILUENTE
(ÁGUA
9 ml 9 ml
PEPTONADA) Diluição diluente diluente
-1
10
ou 1/10 Diluição
-2 Diluição Diluição
ou 0,10 10 -3 -4
10 10
ou 1/100 ou ou
ou 0,010 1/1000 1/10000
ou ou
0,0010 0,00010
• As diluições seriadas devem ser realizadas para a partir delas se fazer
a inoculação nos meios de cultura;
• É feita pelo menos uma inoculação de cada diluição
• Com o alimento diluído, fica mais fácil encontrar uma placa ideal para
se fazer a contagem de microrganismos
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Preparo da 25 g ou ml do Alimento
ou 1/10
– Evitar a homogeneização manual das diluições, pois o processo manual resulta a cada vez
em diferentes graus de homogeneidade.
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• Dessa forma, para alimentos com expectativa de crescimento bacteriano baixo, devido ao seu
processo de fabricação e de conservação, as inoculações deverão ser efetuadas a partir da diluição
inicial 100 para líquidos ou 10-1 para sólidos ou pastosos, com no mínimo, duas diluições
sucessivas.
• Por outro lado, para alimentos que se desconhece o número aproximado de microrganismos
existentes, as diluições a serem preparadas deverão garantir condições de realização das contagens.
Usualmente, nesses casos, utilizam-se as diluições 10-1 a 10-6.
– O tempo gasto para a execução das diluições de uma amostra de alimentos até sua inoculação em
meios de cultura deverá ser de, no máximo, 20 minutos, de forma a não permitir a multiplicação dos
microrganismos contidos nas diferentes diluições, o que acarretaria a obtenção de resultados falsos
para a contagem de microrganismos.
– Ao retirar as pipetas dos cartuchos ou ao desenrolar o papel que envolve individualmente cada uma
delas, tomar o máximo de cuidado para não tocar com a pipeta a superfície externa do cartucho, as
mãos, as bordas externas dos tubos ou dos recipientes.
– Esses mesmos cuidados deverão ser tomados quando se estiver efetuando as inoculações nas placas
ou nos tubos de ensaio. Caso tal situação ocorra, despreze a pipeta e reinicie o procedimento
corretamente.
– Não inserir a ponta da pipeta mais do que 2,5 cm abaixo da superfície do líquido dentro dos tubos ou
dos recipientes contendo as diluições das amostras, diminuindo assim, a superfície de contato da
pipeta com a amostra diluída.
– Dispensar lentamente o inóculo, permitindo a drenagem total até a marca final da pipeta por um
período de 4 a 6 segundos, nos casos em que o mesmo corresponda ao volume total da pipeta.
Preferentemente, usar pipetas que não sejam de esgotamento total.
– Quando da dispensa de parte do conteúdo de uma pipeta, deixar que o líquido escorra lentamente. O
procedimento de expulsão rápida do líquido contido na pipeta acarreta a retenção de um maior
volume de líquido aderido às paredes.
– Sempre utilizar pipetas com marcação nítida de volume e, preferencialmente, que permitam a
pipetagem do volume desejado sem que seja necessária a expulsão da última porção da pipeta.
– Quando esse tipo de pipeta não estiver disponível no laboratório, para a pipetagem de 1 mL, é
recomendável a utilização de pipetas com capacidade de 2 mL, com graduação de 1/10 ou 1/100,
aspirando o inóculo até o volume total da mesma e dispensando a primeira porção (1 mL) no interior
da placa ou do tubo.
– As pipetas utilizadas não deverão ter capacidade superior a 10 vezes o volume a ser medido, para
assegurar que o inóculo dispensado seja o requerido.
– Por exemplo, se o inóculo for de 0,1 mL, utilizar uma pipeta de 1 mL com graduação de no mínimo
1/10, aspirando o inóculo até o volume total da mesma e dispensando a primeira divisão no interior
da placa ou do tubo.
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ROTEIRO DA PRÁTICA:
2) Preparo:
2.1) Desinfetar a área externa da embalagem com álcool à 70 %;
2.2) Pesar 25 g da amostra para um frasco estéril previamente tarado com 225 ml de diluente; ( cortar pedaços
pequenos de diversos pontos da amostra)
2.3) Homogeneizar a amostra ( 8000 – 15000 rpm por 1 à 2 min. )
2.4) Preparar as diluições seriadas: a partir da diluição 1/10 ( retirar 1 ml da diluição 1/10 e passar para um
tubo com 9 ml de diluente e assim sucessivamente até a última diluição )
3) Pré – relatório :
3.1) Anotar todos os cuidados na hora da recepção da amostra, retirada da unidade analítica, preparo das
diluições
3.2) Anotar todos os cuidados assépticos
3.3) Anotar as dificuldades e erros durante a prática
2) Preparo:
2.1) Homogeneizar a amostra no frasco ( revolver a amostra com uma espátula estéril );
2.2) Desinfetar a área externa da embalagem com álcool à 70 %;
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2.3) Pesar 25 g da amostra para um frasco estéril previamente tarado com 225 ml de diluente; ( cortar pedaços
pequenos de diversos pontos da amostra)
2.4) Homogeneizar a amostra ( 8000 – 15000 rpm por 1 à 2 min. )
2.5) Preparar as diluições seriadas: a partir da diluição 1/10 ( retirar 1 ml da diluição 1/10 e passar para um
tubo com 9 ml de diluente e assim sucessivamente até a última diluição )
3) Pré – relatório :
3.1) Anotar todos os cuidados na hora da recepção da amostra, retirada da unidade analítica, preparo das
diluições
3.2) Anotar todos os cuidados assépticos
3.3) Anotar as dificuldades e erros durante a prática
2) Preparo:
2.1) Homogeneizar a amostra no frasco ( revolver a amostra com uma espátula estéril ) – o intervalo entre a
mistura e a retirada analítica não deve exceder 15 min. ;
2.2) Desinfetar a área externa da embalagem com álcool à 70 %;
2.3) Pesar 25 g da amostra para um frasco estéril previamente tarado com 225 ml de diluente; ( cortar pedaços
pequenos de diversos pontos da amostra)
2.4) Homogeneizar a amostra ( 8000 – 15000 rpm por 1 à 2 min. )
2.5) Preparar as diluições seriadas: a partir da diluição 1/10 ( retirar 1 ml da diluição 1/10 e passar para um
tubo com 9 ml de diluente e assim sucessivamente até a última diluição )
3) Pré – relatório :
3.1) Anotar todos os cuidados na hora da recepção da amostra, retirada da unidade analítica, preparo das
diluições
3.2) Anotar todos os cuidados assépticos
3.3) Anotar as dificuldades e erros durante a prática
2) Preparo:
2.1) Retirar os ovos da geladeira e passar para uma estufa à 20 C, por um certo período de tempo;
2.2) Em seguida, passar para 25 C, por um certo período de tempo;
2.3) Transferir para temperatura ambiente, para equilibrar a temperatura;
2.4) Lavar os ovos com água e detergente ( a água deve estar 11C acima da temperatura dos ovos, portanto
não inferior à 32 C )
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3) Pré relatório:
3.1) Anotar todos os cuidadosna hora da recepção da amostra, retirada da unidade analítica, preparo das
diluições;
3.2) Anotar todos os cuidados assépticos;
3.3) Anotar as dificuldades e erros durante a prática.
2) Preparo:
2.1) Desinfetar a área externa da embalagem com álcool à 70 %;
2.2) Pesar 25 g da amostra em um frasco com 225 ml de diluente suplementado com tween 80 à 1% (
peso/volume)
2.3) Homogeneizar a amostra à 8000 rpm por 1 à 2 min.
2.4) Preparar as diluições seriadas: a partir da diluição 1/10 ( retirar 1 ml da diluição 1/10 e passar para um
tubo com 9 ml de diluente e assim sucessivamente até a última diluição )
3) Pré – relatório :
3.1) Anotar todos os cuidados na hora da recepção da amostra, retirada da unidade analítica, preparo das
diluições
3.2) Anotar todos os cuidados assépticos
3.3) Anotar as dificuldades e erros durante a prática
5) Preparo:
2.1) Desinfetar a área externa da embalagem com álcool à 70 %;
2.2) Pesar 25 g da amostra em um frasco com 225 ml de diluente suplementado com tween 80 à 1% (
peso/volume)
2.3) Homogeneizar a amostra à 8000 rpm por 1 à 2 min.
2.4) Preparar as diluições seriadas: a partir da diluição 1/10 ( retirar 1 ml da diluição 1/10 e passar para um
tubo com 9 ml de diluente e assim sucessivamente até a última diluição )
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6) Pré – relatório :
3.1) Anotar todos os cuidados na hora da recepção da amostra, retirada da unidade analítica, preparo das
diluições
3.2) Anotar todos os cuidados assépticos
3.3) Anotar as dificuldades e erros durante a prática
2) Preparo:
2.1) Desinfetar a área externa da embalagem com álcool à 70 %;
2.2) Transferir 50 g da amostra para um frasco estéril e previamente tarado;
2.3) Adicionar o diluente na proporção 1/1 ( 1 ml de diluente para 1 g da amostra)
2.4) Lavar a amostra agitando vigorosamente o frasco, manualmente por 50 vezes;
2.5) Preparar as diluições seriadas: pegar 1 ml do preparado e adicionar em 9 ml de diluente ( Diluição 1/10) e
assim sucessivamente até a última diluição.
3) Pré – relatório :
3.1) Anotar todos os cuidados na hora da recepção da amostra, retirada da unidade analítica, preparo das
diluições
3.2) Anotar todos os cuidados assépticos
3.3) Anotar as dificuldades e erros durante a prática
2) Preparo:
2.1) Desinfetar a área externa da embalagem com álcool à 70 %;
2.2) Medir 25 ml da amostra para um frasco estéril previamente tarado com 225 ml de diluente; ( cortar
pedaços pequenos de diversos pontos da amostra)
2.3) Homogeneizar a amostra ( 8000 – 15000 rpm por 1 à 2 min. )
2.4) Preparar as diluições seriadas: a partir da diluição 1/10 ( retirar 1 ml da diluição 1/10 e passar para um
tubo com 9 ml de diluente e assim sucessivamente até a última diluição )
3) Pré – relatório :
3.1) Anotar todos os cuidados na hora da recepção da amostra, retirada da unidade analítica, preparo das
diluições
3.2) Anotar todos os cuidados assépticos
3.3) Anotar as dificuldades e erros durante a prática
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ANOTAÇÕES:
MATERIAIS:
EQUIPAMENTOS:
AMOSTRAS:
RESULTADOS:
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AULA PRÁTICA
TEORIA:
RECOMENDAÇÕES GERAIS
1. Sempre utilizar mais de uma placa, seja uma duplicata da mesma diluição, seja duas ou mais diluições
diferentes.
2. As contagens deverão ser realizadas imediatamente após o período de incubação das placas.
3. Na impossibilidade de realizar a contagem imediatamente após o período de incubação, manter as placas
sob refrigeração em temperatura de 4ºC a 7ºC por um período não superior a 24 horas.
4. Esse procedimento não deve tornar-se uma prática rotineira.
5. Para a contagem, selecionar placas que contenham um número de colônias que se encontre dentro do
intervalo de precisão e repetibilidade estabelecido pelo método em uso (por exemplo, 20 a 200 colônias,
25 a 250 colônias, etc).
6. As colônias deverão ser contadas com o auxílio de contador de colônias equipado com placa de vidro ou
acrílico, com diâmetro compatível com o das placas utilizadas, dividido milimetricamente em quadrantes
com 1 cm2 de área e com iluminação artificial uniforme.
7. O contador de colônias deverá ter capacidade para aumento de 1 a 2 vezes, com dispositivo de regulagem
de altura para melhor ajuste do foco, podendo ainda dispor de sistema eletrônico ou manual de registro
das contagens
8. O contador de colônias deverá estar localizado em local onde não haja incidência direta de luz sobre a
plataforma de apoio da placa, para evitar possíveis enganos na identificação das colônias.
9. Utilizar o estereoscópio para observação de características morfológicas das colônias, para diferenciar
microrganismos de partículas da amostra ou do meio e para seleção e isolamento de colônias.
10. Verificar sempre a proporcionalidade dos resultados obtidos nas diluições sucessivas.
Exemplos:
• Diluição 10 -2 (1:100)
– Média das contagens: 25 UFC
– Resultado: 25 x 100 = 2.500 = 2,5 x 103 UFC/g ou mL
• Diluição 10 -3 (1:1.000)
– Média das contagens: 38 UFC
– Resultado: 38 x 1.000 = 38.000 = 3,8 x 104 UFC/g ou mL
O resultado final será expresso considerando-se os dois primeiros algarismos representativos,
separados por vírgula. Os algarismos subseqüentes, quando existirem, deverão ser arredondados e
transformados em potência de 10.
2. Arredondamento de resultados
Quando se fizer necessário, e visando não criar uma falsa idéia de precisão, aplicar a seguinte regra
para a aproximação dos resultados:
2.1 Arredondar para cima o segundo algarismo ou o subseqüente quando o algarismo imediatamente após for
superior a 5.
Exemplo:
– Diluição 10-2
– Média das contagens: 186 UFC
– Arredondando-se o terceiro algarismo para cima tem-se como resultado:
– 190 x 100 = 19.000 = 1,9 x 104 UFC/g ou mL
2.2 Arredondar para baixo o segundo algarismo ou o subseqüente quando o algarismo imediatamente após for
inferior a 5.
Exemplo:
–
Diluição 10–2
– Média das contagens: 184 UFC
– Arredondando o terceiro algarismo para baixo tem-se como resultado:
– 180 x 100 = 18.000 = 1,8 x 104 UFC/g ou mL
2.3 Nos casos em que o terceiro algarismo ou o subseqüente for igual a cinco, arredondar para baixo quando o
segundo ou o subseqüente for menor ou igual a 5 e para cima quando for maior que 5.
Exemplos:
Diluição 10-2
ANOTAÇÕES:
MATERIAIS:
EQUIPAMENTOS:
Aulas Práticas de Microbiologia
Prof. Márcia G. Perdoncini
• No início de cada aula, traçar um plano de trabalho considerando o tempo necessário para a
realização da prática;
• Trabalhar sempre de maneira ordenada, tranqüila, constante e metódica, evitando movimentos
desnecessários, bem como corrente de ar no laboratório;
• Limpar e desinfetar as superfícies das mesas, balcões e etc, no começo e no final de cada aula
prática;
• Efetuar anotações sobre a aula prática, como os materiais, equipamentos e amostras utilizadas; estas
anotações serão necessárias para se fazer os relatórios de cada aula prática;
• Identificar as amostras com o nome da equipe, bem como o material a ser utilizado, antes de iniciar a
prática. As amostras em geral não devem ser descartadas até obter-se os resultados;
• Tocar o material a analisar apenas com materiais estéreis (nunca com as mãos);
• No caso de derramamento de material contaminado, proceder imediatamente a desinfecção e
esterilização;
• Todo o material utilizado na análise, tais como lâminas, pipetas, etc., devem ser colocados em
recipientes contendo solução desinfetante para descarte;
• O material utilizado deve receber a seguinte seqüência de tratamento (*)
– Esterilização
– Lavagem
– Secagem
– Embalagem e esterilização
– Armazenamento
(*) Porém, os alunos deverão deixar lavados apenas os materiais utilizados durante a aula, que não estão
contaminados. Os materiais contaminados serão esterilizados pela equipe de apoio dos laboratórios.
• Os cultivos após leitura devem ser esterilizados;
• Observar a temperatura das estufas e banhos termostatizados, quando forem utilizá-los;
• Ler com atenção o rótulo do produto a ser utilizado;
• Manipular todos os reagentes e solventes com o máximo de cuidado;
• Não cheirar reagentes e meios de cultura;
• Se não for possível trabalhar em fluxo laminar utilzar o bico de Bunsen, entre o material a ser
analisado e o analista;
• Deve-se utilizar luvas cirúrgicas descartáveis quando da manipulação de micorganismos altamente
infecciosos;
• Se não for utilizar pipetador automático, todas as pipetas deverão ter algodão na extremidade de
sucção, para evitar contaminação do analista;
• Seguir as nornas de uso dos aparelhos;
• Flambar alças, agulhas e pinças, antes e após o uso;
• Deixar o laboratório limpo e organizado ao final de cada aula prática.
Aulas Práticas de Microbiologia
Prof. Márcia G. Perdoncini