SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE

CENTRO NACIONAL DE HOTELERÍA, TURISMO Y ALIMENTOS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

DETERMINACIÓN DE Bacillus cereus

1. OBJETIVO

Este procedimiento tiene por objeto explicar los pasos a seguir para realizar el ensayo: Bacillus
cereus en alimentos; empleando la técnica enumeración y aislamiento en superficie.

2. ALCANCE

Este procedimiento es aplicable para el análisis de los siguientes grupos de alimentos:

 Alimento deshidratado para niños lactantes.

 Alimentos preparados (Restaurantes y comidas rápidas).
 Aromáticas.
 Biscochos, repostería y colaciones.
 Galletas.
 Leche y sus derivados.
 Mayonesa.
 Pastas alimenticias.
 Granos y cereales

3. DEFINICIONES.

ALIMENTO: Todo producto natural o artificial, elaborado o no, que ingerido aporta al organismo
humano los nutrientes y la energía necesarios para el desarrollo de los procesos biológicos. Están
incluidas las bebidas no alcohólicas, y aquellas sustancias con que se sazonan algunos comestibles
y que se conocen con el nombre genérico de especia.

ALIMENTO CONTAMINADO: Alimento que contiene agentes y/o sustancias extrañas de cualquier
naturaleza en cantidades superiores a las permitidas en las normas nacionales, o en su defecto en
normas reconocidas internacionalmente.

ALIMENTO DE MAYOR RIESGO: Alimento que, en razón a sus características de composición

especialmente en sus contenidos de nutrientes, Aw actividad acuosa y pH, favorece el crecimiento
microbiano y por consiguiente, cualquier deficiencia en su proceso, manipulación, conservación,
transporte, distribución y comercialización, puede ocasionar trastornos a la salud del consumidor.

ALIMENTO PERECEDERO: Alimento, que en razón de su composición, características

fisicoquímicas y biológicas, pueda experimentar alteración de diversa naturaleza en un tiempo
determinado y que, por lo tanto, exige condiciones especiales de proceso, conservación,
almacenamiento, transporte y expendio.

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FERMENTACIÓN: Proceso catabólico (de obtención de energía) llevado a cabo en ausencia de
oxígeno, dando como producto final compuestos orgánicos.

MATERIA PRIMA: Son sustancias naturales o artificiales, elaboradas o no, empleadas por la
industria de alimentos para su utilización directa, fraccionamiento o conversión en alimentos para
consumo humano.

4. DESARROLLO DE ACTIVIDADES

4.1. INTERFERENCIAS

 Contaminación cruzada en el transporte, recepción y almacenamiento de las muestras.

 Alta concentración del analito.
 Inadecuada homogeneización.
 Temperatura de incubación fuera del rango de especificación para el analito.
 Dilución de nutrientes y pH inestable en los medios de cultivos.

4.2. TOMA Y PRESERVACIÓN DE MUESTRAS

Recolectar las muestras de alimentos con la ayuda de utensilios estériles (Cucharas, tenedores,
cuchillos, pinzas, etc.), e introducir en bolsas estériles. Conservar a temperatura entre 2 y 6 °C y
transportar de inmediato al laboratorio para realizar los respectivos análisis.

4.3. EQUIPOS, MATERIALES, MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS.

4.3.1. Equipos.

 Balanza.
 Baño serológico.
 Cabina de flujo laminar.
 Cuenta colonias.
 Incubadoras 35 °C.
 Nevera 2 – 6 °C.
 Vortex.

4.3.2. Materiales.

 Asa de inoculación en aro.

 Asa de Hokey.
 Bandejas de transporte.
 Cajas Petri grandes.
 Dispensador de pipetas.
 Frascos y recipientes para descarte.
 Gradillas.
 Marcadores.
 Mechero de Bunsen.
 Micropipetas de 100 y 1000 µL.
 Pipetas graduadas estériles de 1, 5 y 10 mL.
 Tips para micropipetas, azules y amarillas.
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  Toallas de papel absorbente.
 Tubos de ensayos tapa rosca 16 cm x 16 mm.

4.3.3. Medios de cultivos y reactivos.

 Agar selectivo para Bacillus cereus según Mossel.

 Agar Almidón.
 Agar Gelatina.
 Agar Leche.
 Caldo Carbohidrato Rojo de Fenol, (Glucosa, Xilosa, Arabinosa).
 Caldo Nitrato.
 Caldo Smith, (Acetil Metil Carbinol).
 Solución de Polimixina.
 Reactivo de Griess.
 Polvo de Zinc.

4.3.3.1. Indicaciones para la preparación del Agar selectivo para Bacillus cereus según Mossel.

 Preparar el agar base según las indicaciones del fabricante.

 Dejar enfriar aproximadamente a 45º C y adicionar por cada 200 mL de agar base; 10 mL de
solución yema de huevo al 50%.
 Agitar suavemente hasta mezclar completamente el agar con los agregados. Servir en cajas
petri grandes estériles.
 Dejar solidificar y almacenar entre 2 y 6 °C.
 Eliminar el exceso de humedad sobre la superficie de la caja, exponiendo la caja abierta en la
cabina de flujo laminar, durante unos minutos.

4.3.4. Soluciones.

 Agua peptonada 0,1 %.

 Cloruro de Sodio 0,85 %.
 Agua peptonada 0.1% estéril.
 Emulsión de Yema de Huevo al 50%.
 Solución acuosa de Hidróxido de Potasio al 40%.
 Solución de Alfa Naftol.
 Cloruro de mercurio sublimado al 15%.

4.3.4.1. Indicaciones para la preparación de la solución de yema de huevo al 50%.

 Lavar los huevos con abundante agua y jabón.

 Sumergir los huevos en una solución de alcohol al 70% durante 15 minutos.
 Perforar la corteza del huevo en la parte superior con ayuda de una pinza estéril.
 Dejar salir la albúmina (clara del huevo) cuidadosamente hasta quedar solo la yema.
 Añadir 25 mL de yema de huevo en una probeta estéril. Completar un volumen de 50 mL,
añadiendo 25 mL de solución salina 0.85% estéril.
 Agregar en un frasco estéril y rotular adecuadamente con la fecha y nombre de la preparación.
 Agitar vigorosamente para homogeneizar completamente.

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Nota: Conservar entre 2 a 6 °C y descartar 8 días después de la preparación o cuando se observe
algún signo de contaminación.

4.4. CONSIDERACIONES DE SALUD, SEGURIDAD Y MANEJO AMBIENTAL.

 Usar bata blanca, guantes, mascarilla, gorro y lentes de protección.

 Lavarse las manos antes y después de manipular.
 Desinfectar el área de trabajo antes y después de realizar una tarea.
 No comer, beber, fumar, aplicarse maquillaje o cremas en el área de trabajo.
 No almacenar alimentos y bebidas en refrigeradores donde se encuentren los medios de cultivos,
reactivos, soluciones y materiales de trabajo.
 Tener en cuenta los avisos de advertencia en lo relacionado con las lámparas UV. No ingresar al
área mientras se encuentre encendida.
 Al salir del laboratorio, verificar que las llaves del gas se encuentren cerradas.

4.5. PROCEDIMIENTO.

 Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados.

 Identificar las cajas con el código de la muestra y la dilución.
 Tomar 0,1 mL a partir de cada una de las diluciones realizadas y agregar sobre la superficie
del agar en cada una de ellas.
 Extender el inóculo sobre la superficie del agar, con la ayuda del asa de Hokey o una pipeta
estéril; hasta distribuir homogéneamente sobre la superficie.
 Invertir las cajas petri y luego incubar a 35 ± 2 °C durante 18 a 24 horas.
 Contar las colonias rosadas (Manitol negativo) que presenten un halo denso (Lecitina positivo)
sobre un fondo rojo violeta.
 Tomar un mínimo de tres colonias típicas y realizar la tinción de Gram, se observan Bacilos
Gram positivos, con extremos cuadrados en cadenas cortas o largas, con esporas
elipsoidales, centrales o subterminales de pared fina que no deformen el bacilo.
 Preparar los controles de calidad.

4.5.1. Confirmación bioquímica de Bacillus cereus

Inocular con asa bacteriológica, los tubos con caldo: glucosa, xilosa, arabinosa, nitrato y glucosa
tamponado.

Sembrar por estría en Agar Leche, Agar Almidón y Agar Gelatina.

Incubar a 35 +/- 2ºC durante 48 horas.
Pasado este tiempo revelar las Pruebas Bioquímicas.

4.5.1.1. Reducción de Nitritos.

Añadir a cada uno de los tubos, unos miligramos del reactivo de Griess y observar el color que
presenta: el color rojo presenta una prueba positiva de reducción de Nitratos. Si no hay cambio de
color debe efectuarse la prueba con polvo de Zinc.

A los tubos negativos de la prueba de Griess; agregar una pequeña cantidad de polvo de Zinc, agitar.

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Color rojo: No reducción de Nitratos.
Color del reactivo: reducción de Nitratos.

4.5.1.2. Fermentación de carbohidratos (Glucosa, Xilosa, Arabinosa):

Observar el cambio de color, según el indicador de PH utilizado.

Rojo de fenol: Vira de amarillo a rosado cuando la reacción es positiva.
Andrade: Vira de rosado a amarillo cuando la reacción es positiva.

4.5.1.3. Producción de Acetil Metil –Carbinol según Smith:

Comprobar la presencia de Acetilmetilcarbinol en el Caldo Glucosa tamponado, añadiendo 0.6 ml de

la solución de alfa naftol al 5 % y 0.2 ml de una solución de hidróxido de potasio al 40%, agitar
suavemente. La producción de un color definido rosa o rojo indica una reacción positiva.

4.5.1.4. Hidrólisis de la Caseína:

La aparición de una zona clara alrededor de la estría realizada en el Agar Leche indica Hidrólisis de
la Caseína.

4.5.1.5. Hidrólisis del Almidón:

Cubrir la superficie del Agar Almidón con solución de lugol. La aparición de una zona clara alrededor
de la estría indica Hidrólisis del Almidón.

4.5.1.6. Hidrólisis de la Gelatina:

Agregar sobre la superficie de la placa de Agar Gelatina, Cloruro de Mercurio al 15% y eliminarlo
después de 5 minutos, lavar con agua corriente; la reacción es positiva cuando una zona clara rodea
la estría.

4.5.1.7. Bioquímica del Bacillus cereus.

Prueba Reacción Prueba Reacción

Fermentación del Fermentación de
Manitol. - Arabinosa. -
Presencia de Hidrólisis de la
Lecitinasa. + Gelatina. +
Fermentación de Hidrólisis de la
Glucosa. +(sin gas) Caseína. +
Reducción de Hidrólisis del
Nitrato. + Almidón. +
Fermentación de Acetil-Metil-
Xilosa. - Carbinol. +

4.5.2. Cálculos.

Realizar el cálculo de la densidad de Bacillus cereus, utilizando la siguiente fórmula:

Bacillus cereus UFC/g - mL: Recuento total X (Colonias positivas/Colonias examinadas).

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Ejemplo:

Recuento total = (Recuento en la caja x Factor de dilución)= 30 X 100 = 3000

Colonias examinadas = 8
Colonias positivas = 5

3000 X (5/8) = 1875 UFC/ g o mL Bacillus cereus UFC/g – mL.

Reportar <100 UFC de Bacillus cereus /g – mL, si no se observa crecimiento característico en las
cajas o si el resultado de las pruebas bioquímicas es negativo.

4.6. BIBLIOGRAFíA.

 Manual de técnicas de análisis para control de calidad microbiológico de alimentos para

consumo humano INVIMA Santa Fe de Bogotá, 1998 trazable a AOAC Oficial Methods 980.31
edición 17.

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