BAB 1

PENDAHULUAN

Pemeriksaan laboratorium pada umumnya melewati tiga tahap yaitu tahap

praanalitik, analitik, dan pascaanalitik. Tahap praanalitik meliputi persiapan

pasien, pengambilan, penampungan, penyimpanan, dan pengiriman bahan. Hasil

pemeriksaan laboratorium khususnya hematologi banyak diminta para dokter

untuk membantu menegakkan diagnosis, menunjang diagnosis, membuat

diagnosis banding, memantau perjalanan penyakit, menilai beratnya sakit, dan

menentukan prognosis. Oleh karena itu pemeriksaan laboratorium yang telah

melalui ketiga tahap pemeriksaan harus dilakukan dengan baik menurut prosedur

yang telah ada, sehingga didapatkan hasil yang teliti, tepat, cepat, dan dapat

dipercaya (Wirawan,2011).

Pemeriksaan hematologi dilakukan dengan menggunakan spesimen darah

dengan antikoagulan. Saat darah segar dicampur dengan antikoagulan, darah dapat

dipisahkan menjadi cairan kekuningan atau disebut plasma dan komponen seluler

seperti eritrosit, leukosit, dan trombosit. Sedangkan darah yang dibiarkan

membeku secara alami akan membentuk cairan kekuningan yang disebut dengan

serum (Turgeon, 2012).

Ada beberapa macam antikoagulan yang digunakan untuk pemeriksaan

hematologi. Setiap antikoagulan memiliki kemampuan mencegah koagulasi

dengan mekanisme tertentu. Perbandingan yang tepat antara antikoagulan yang

dipakai dengan darah yang dipakai sangat penting untuk mencegah terjadinya

1
kesalahan hasil pemeriksaan. Jenis antikoagulan yang dipakai juga perlu

disebutkan pada manual prosedur laboratorium. (Turgeon, 2012)

Saat ini yang umumnya dilakukan untuk pemeriksaan hematologi adalah

darah dikumpulkan dengan punksi vena dan dimasukkan ke dalam tabung yang

telah berisi antikoagulan. Antikoagulan yang sering dipakai untuk pemeriksaan

hematologi adalah ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), natrium sitrat, dan

heparin (Perkins, 2009).

Pada tinjauan pustaka ini akan dibahas tentang antikoagulan yang

digunakan dalam pemeriksaan hematologi yaitu EDTA, natrium sitrat, dan

heparin, serta pengaruh EDTA terhadap sel-sel darah.

2
 BAB 2

ANTIKOAGULAN UNTUK PEMERIKSAAN HEMATOLOGI

2.1 Definisi

Antikoagulan adalah zat yang dapat mencegah penggumpalan darah

(Arkin CF et al, 2003). Literatur lain menyebutkan antikoagulan adalah suatu zat

yang mencegah agar darah tidak membeku. Pembekuan dihambat melalui

beberapa proses seperti pengikatan kalsium atau menghambat pembentukan

trombin (Wirawan, 2011; McCall and Tankersley,2012).

2.2 Jenis Antikoagulan untuk Pemeriksaan Hematologi

Dua puluh sampai tiga puluh tahun yang lalu pengambilan darah dilakukan

dengan menggunkan jarum semprit yang ditampung dalam botol atau tabung

reaksi dengan ditambahkan antikoagulan. Pengambilan darah seperti ini dapat

menyebabkan jumlah antikoagulan yang dipakai dan darah tidak seimbang. Akhir-

akhir ini pengambilan darah dilakukan menggunakan jarum khusus dengan tabung

vakum sebagai penampung darah. Tabung penampung tersebut ada yang berisi

antikoagulan. (Wirawan, 2011)

Setelah darah masuk ke dalam tabung, darah harus dicampur segera untuk

mencegah pembentukan mikroklot. Pencampuran darah dengan antikoagulan

tidak boleh dikocok untuk mencegah terjadinya hemolisis dan busa. Busa akan

mempengaruhi hasil pemeriksaan hematologi (Wirawan, 2011).

Ada tiga macam antikoagulan yang sering dipakai untuk pemeriksaan

hematologi yaitu ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), natrium sitrat, dan

heparin (Mullins, 2007; Perkins SL,2009; Turgeon, 2012;).

3
2.2.1 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)

Ethylenediaminetetraacetic acid adalah antikoagulan yang paling baik

untuk pemeriksaan hitung sel darah karena kemampuan antikoagulasinya yang

baik dan efeknya terhadap morfologi sel darah minimal (Perkin,2009; Arkin et al.,

2003). Ethylenediaminetetraacetic acid dipakai dalam bentuk garamnya dengan

kalium atau natrium, yaitu garam disodium (Na2EDTA), dipotassium (K2EDTA),

atau tripotassium (K3EDTA) (Young et al., 2006). National Committee for Clinical

Laboratory Standards (NCCLS) merekomendasikan antikoagulan pilihan untuk

pemeriksaan hematologi adalah K2EDTA (Arkin et al.,2003).

2.2.1.1 Sruktur Kimia

Asam etilendiaminatetraasetat (ethylenediaminetetraacetic acid/ EDTA)

adalah asam kompleks berupa asam karboksilat poliamino yang basa digunakan

sebagai agensia pengkelat atau ligan beberapa ion atau unsur logam terutama

Fe3+ dan Ca2+.

Gambar 2.1 Struktur Kimia EDTA

2.2.1.2 Cara Kerja

Ethylenediaminetetraacetic acid menghambat proses pembekuan dengan

mengikat ion kalsium dalam darah. Kalsium diperlukan dalam cascade koagulasi

sehingga pengikatan kalsium dapat menghambat dan menghentikan proses

koagulasi baik jalur intrinsik maupun ekstrinsik dan akhirnya tidak terjadi

pembekuan (Gambar 2.1). Zat ini telah dipakai untuk mecegah pembekuan darah

4
sejak awal tahun 1950 dan memiliki banyak keunggulan dibandingkan dengan

antikoagulan lainnya (Gordan and Larson,1995; Arkin et al.,2003; Perkins,2009).

2.2.1.3 Sifat

Ethylenediaminetetraacetic acid memiliki berat molekul 292, merupakan

kompleks asam aminopolikarboksilat yang bekerja sebagai pengikat (chelating

agent). EDTA membentuk kompleks dengan ion kalsium sehingga ion tersebut

tidak berperan lagi pada proses pembekuan (Arkin et al., 2003).

Garam EDTA memiliki pH yang bervariasi. EDTA sendiri memiliki pH

asam yaitu 2.5+1.0, sedangkan dalam bentuk garamnya memiliki pH sebagai

berikut (Arkin et al., 2003) :

Tabel 2.1. pH berbagai garam EDTA

Garam EDTA 1% (w/v) pH
Disodium EDTA (Na2EDTA) 5.0+1.0
Dipotassium EDTA (K2EDTA) 4.8+1.0
Tripotassium EDTA (K3EDTA) 7.5+1.0
(Arkin et al., 2003)

Disodium EDTA memiliki berat molekul 372,2. Garam ini berbentuk

serbuk putih dan tidak berbau. Daya larutnya kurang lebih 100g/L pada suhu

200C. Daya ikat (chelation value) garam ini yaitu 1 g atau 2,6 mmol Na2EDTA

mampu mengikat 2,6 mmol atau 105 mg ion kalsium.

Dipotassium EDTA memiliki berat molekul 404,4. Garam ini berbentuk

serbuk putih dan tidak berbau. Daya larutnya kurang lebih 1650g/L pada suhu

220C. Daya ikat (chelation value) garam ini yaitu 1 g atau 2,4 mmol K2EDTA

mampu mengikat 2,4 mmol atau 100 mg ion kalsium.

Tripotassium EDTA memiliki berat molekul 406. Garam ini berbentuk

cair, bening, dan tidak berbau. Bentuk keringnya berupa serbuk putih tidak

berbau. Daya larutnya kurang lebih 1650g/L pada suhu 220C. Daya ikat (chelation

5
value) garam ini (dalam bentuk kering) yaitu 1 g atau 2,4 mmol K3EDTA mampu

mengikat 2,4 mmol atau 100 mg ion kalsium (Arkin et al, 2003).

2.2.1.4 Jumlah Pemakaian

Jumlah EDTA yang dipakai harus mencukupi untuk mencegah

pembekuan, namun EDTA yang berlebihan juga dapat menyebabkan perubahan

morfologi sel-sel darah. Tabung penampung yang telah berisi darah EDTA harus

dibolak-balik 8 – 10 kali untuk memastikan darah tecampur baik dengan

antikoagulan sehingga memberikan efek antikoagulan yang baik (Arkin et al.,

2003; Wirawan, 2011).

Jumlah garam EDTA yang ditambahkan ke dalam darah adalah 4.55+0.85

µmol/mL darah. Jumlah EDTA yang diperlukan menurut jenis garamnya dapat

dilihat pada tabel di bawah ini sesuai dengan berat molekulnya (Arkin et al.,

2003):

Tabel 2.2. Jumlah EDTA yang diperlukan menurut jenis garamnya

Garam EDTA mg/mL Darah
Disodium EDTA dihydrate (EDTA Na2.2H2O) 1.4 – 2.0
Dipotassium EDTA dihydrate (EDTA K2.2H2O) 1.5 – 2.2
Tripotassium EDTA anhydrous (EDTA K3) 1.5 – 2.2
(Arkin et al., 2003)

Beberapa garam EDTA tersedia secara komersial dalam bentuk cair. Hasil

pemeriksaan hematologi akan dipengaruhi oleh efek dilusi antikoagulan ini

terutama bila darah yang dicampurkan kurang dari yang seharusnya. Hal ini sering

terjadi pada pemeriksaan hematokrit dengan antikoagulan K3EDTA. Penggunaan

antikoagulan ini biasanya menyebabkan dilusi darah 1 – 2%. (Arkin et al., 2003)

6
2.2.1.5 Jenis Pemeriksaan Hematologi dengan Antikoagulan EDTA

Pemeriksaan hematologi yang menggunakan antikoagulan EDTA antara

lain pemeriksaan darah rutin, hitung sel, hematokrit, tes fragilitas osmotik,

golongan darah, dan lain-lain. (Tahono et al., 2012)

2.2.2 Heparin

Heparin dapat digunakan sebagai antikoagulan baik secara in vitro maupun

in vivo. Secara in vitro heparin digunakan untuk melapisi permukaan dalam pipet

mikrokapiler (Turgeon, 2012). Heparin digunakan sebagai antikoagulan untuk

beberapa pemeriksaan karena memiliki sifat pengkelat yang minimal, efek yang

minimal tehadap pengenceran, dan konsentrasi kationnya yang relatif rendah.

Heparin terdapat dalam bentuk garamnya dengan natrium, amonium, dan lithium.

Heparin yang direkomendasikan sebagai antikoagulan adalah lithium heparin

karena paling sedikit pengaruhnya terhadap ion darah. Heparin lebih banyak

digunakan untuk pemeriksaan pH darah, gas darah, elektrolit, dan ion kalsium.

(Arkin et al., 2003)

2.2.2.1 Struktur Kimia

Lithium heparin merupakan kompleks glikosaminoglikan sulfat. Pada

akhir hidrolisis komplit kompleks ini akan menghasilkan D-glukosamin, asam D-

glukoronat, asam L-iduronat, asam asetat, dan asam sulfur (Arkin et al., 2003).

Gambar 2.2 Struktur Kimia Heparin

7
2.2.2.2 Cara Kerja

Mekanisme kerja antikoagulan heparin yaitu :

a. Mencegah pembekuan darah dengan cara menghalangi pembentukan

trombin

b. Mempercepat pembentukan kompleks antitrombin III dengan

menginaktifkan faktor Xa dan mencegah pembentukan trombin dari

protrombin

c. Menginaktifkan XIIa dengan cara mencegah terbentuknya fibrin stabil.

(Tahono et al., 2012)

2.2.2.3 Sifat

Heparin berbentuk serbuk putih atau krem, tidak berbau, dan higroskopik.

Antikoagulan ini memiliki potensi tidak kurang dari 140 USP unit/mg heparin

kering. Heparin ini memiliki pH 6.0 – 8.0 pada konsentrasi 1% (w/v; 1 g/100 mL).

Heparin dengan konsentrasi 5% (w/v; 5g/100mL) berwarna bening. Perbedaan

beratnya dengan bentuk kering tidak lebih dari 8%. Pada pemeriksaan dengan

dengan asam triklorasetat tidak ditemukan protein pada antikoagulan ini. Unsur-

unsur lainnya pada antikoagulan ini antara lain :

 Nitrogen : tidak lebih dari 3% dalam bentuk kering

 Sodium : tidak lebih dari 0.2%

 Potassium : tidak lebih dari 0.2%

 Calcium : tidak lebih dari 0.2%

 Ammoniak : tidak lebih dari 0.01% menggunakan metode sodium

nitroferisianida atau glutamate dehidrogenase.

 Lithium : antara 3.5 – 4.5%

8
  Logam berat : kurang dari 0.003%

 Pada pemeriksaan langsung dengan USP bacterial endotoxin test,

antikoagulan ini mengandung tidak lebih dari 0,03 endotoxin unit per USP

heparin unit. (Arkin et al., 2003)

Antikoagulan heparin dapat menguap pada suhu kamar atau suhu 370C

pada inkubator atau waterbath, dan harga antikoagulan ini cenderung mahal

(Tahono et al., 2012)

2.2.2.4 Jumlah Pemakaian

Untuk tabung penampung darah vena, jumlah yang direkomendasikan

adalah 10 – 30 USP unit/mL darah atau 0.1 – 0.2 mg/mL darah (Arkin et al.,2003;

Kamat,2011). Pipet kapiler yang tersedia biasanya mengandung heparin kurang

dari 15 USP unit/mL (Arkin et al.,2003). Literatur lain menyebutkan jumlah

lithium heparin yang digunakan adalah 10 – 20 IU/mL. Konsentrasi ini tidak

mempengaruhi ukuran eritrosit.(Jury et al., 2012)

Satuan USP unit berbeda dengan international unit dimana international

unit adalah 6.4% (1,064) lebih besar dari USP unit (Arkin et al., 2003).

2.2.2.5 Jenis Pemeriksaan Hematologi dengan Antikoagulan Heparin

Darah dengan antikoagulan heparin dapat digunakan untuk pemeriksaan

hemoglobin, hematokrit, resistensi osmotik, penentuan golongan darah, dan

pemeriksaan immunophenotyping (Jury et al.,2012; Tahono et al., 2012)

Darah dengan antikoagulan heparin tidak bisa digunakan untuk hitung sel

darah karena sering menyebabkan clumping baik terhadap leukosit maupun

trombosit. Sediaan ini juga tidak baik digunakan untuk membuat apusan darah

9
karena menyebabkan dasar yang biru kehitaman dengan pewarnaan Wright

(Turgeon, 2012; Jury et al.,2012; Tahono et al., 2012).

2.2.3 Natrium Sitrat

Garam natrium dari asam sitrat dan/atau buffer garam natriumnya biasanya

digunakan untuk mencegah pembekuan darah. Antikoagulan ini adalah

antikoagulan pilihan untuk pemeriksaan koagulasi, namun dapat juga digunakan

untuk pemeriksaan hematologi (Arkin et al., 2003).

2.2.3.1 Struktur Kimia

Gambar 2.3 Struktur kimia trisodium sitrat

2.2.3.2 Cara Kerja

Natrium sitrat bekerja mengikat kalsium. Kalsium merupakan faktor

penting dalam kaskade koagulasi. Pembuangan kalsium dari kompleks

protrombinase dapat mencegah terhadinya perubahan protrombin menjadi

trombin, sehingga selanjutnya perubahan fibrinogen menjadi fibrin terhambat.

2.2.3.3 Sifat

Asam sitrat merupakan asam trikarboksilat. Asam sitrat memiliki berat

molekul 192. Bentuk yang sering dipakai adalah garam trisodium yang berat

molekul 294 dengan 2 molekul air (pH 8.0). Natrium acid sitrat (disodium sitrat,

disodium hidrogen sitrat) juga dipakai dimana garam ini memiliki pH 4.9 – 5.2.

Kombinasi sodium sitrat dan asam sitrat ini disebut sodium sitrat “buffer” (Arkin

et al., 2003).

10
2.2.3.4 Jumlah Pemakaian

Jumlah antikoagulan natrium sitrat yang dipakai adalah 105 – 109

mmol/L, 3.13% - 3.2% (umumnya dipakai 3.2%) dalam bentuk trisodium sitrat

dihidrat (Na3C6H5O7 . 2H2O), buffer ataupun nonbuffer. Selain itu juga tersedia

tabung sitrat berisi 3.5% (0.129 mol/L) trisodium sitrat dihidrat (Arkin et al.,

2003).

2.2.3.5 Jenis Pemeriksaan Hematologi dengan Antikoagulan Natrium Sitrat

Darah dengan antikoagulan natrium sitrat antara lain dapat digunakan

untuk penentuan kadar hemoglobin, Laju Endap Darah (LED), perhitungan sel

darah merah, agregasi trombosit, penentuan golongan darah, faal hemostasis, dan

transfusi darah. (Tahono et al., 2012)

11
Gambar 2.4 Peran Antikoagulan pada Jalur Koagulasi
(Strasinger and Lorenzo, 2011)

12
 BAB 3

PENGARUH EDTA TERHADAP SEL DARAH

3.1 Pengaruh EDTA terhadap Eritrosit

Sediaan hapus darah tepi yang baik dapat dibuat dari darah EDTA dalam

waktu 2 – 3 jam setelah pengambilan darah (Kennedy et al.,1981). Sediaan hapus

yang dibuat dari darah EDTA setelah 5 jam pengambilan sering menimbulkan

artefak pada sel darah (sel burr, sferosit, dan necrobiotic leukocytes. (Rodak,

1995). Perbandingan jumlah darah dan EDTA juga berpengaruh pada eritrosit.

Jika jumlah darah kurang maka EDTA menyebabkan eritrosit mengkerut akibat

hipertonisitas plasma dan menimbulkan artefak sehingga sulit menginterpretasi

morfologi eritrosit dengan benar (Lampasso, 1965; Arkin et al., 2003). Kelebihan

EDTA berpengaruh pada eritrosit dan leukosit, yaitu menyebabkan kerusakan

membran (Lewis and Stoddart, 1971). Selain itu juga dikatakan bahwa darah

EDTA tidak bisa menggambarkan adanya basophilic stippling pada eritrosit pada

kasus keracunan timbal (Kamat, 2011)

3.2 Pengaruh EDTA terhadap Leukosit

Beberapa penelitian menunjukkan bahwa hitung leukosit masih stabil

sampai tiga hari bila darah EDTA disimpan pada suhu ruangan (Gulati et al.,2002;

Baca et al., 2006). Netrofil dan monosit merupakan sel yang paling sensitif

terhadap penyimpanan darah EDTA, sedangkan limfosit lebih stabil (Reardon et

al., 1991). Setelah 1 jam ada suhu ruangan (20-240C) ditemukan vakuolisasi

ringan pada monosit, dan berlanjut menjadi vakuolisasi sedang setelah 4 jam.

Pada neutrofil terjadi vakuolisasi ringan setelah 3 – 4 jam, berlanjut menjadi

13
vakuolisasi sedang setelah 6 jam (Assendelft and Parvin, 1988). Jika darah EDTA

disimpan pada suhu 40C selama 12 jam hanya ditemukan sedikit perubahan pada

karakteristik morfologi leukosit (Lloyd, 1982). EDTA juga bisa menyebabkan

leukoagglutination yaitu terhadap neutrofil dan limfosit (Kamat, 2011)

3.3 Pengaruh EDTA terhadap Trombosit

EDTA mengurangi aktivasi trombosit dengan melindungi trombosit

selama kontak dengan kaca tube yang dapat mencetuskan aktivasi trombosit.

Aktivasi trombosit menyebabkan agregasi dengan adanya kalsium dan trombosit

beradhesi pada permukaan kaca. Pengikatan kalsium oleh EDTA dapat

mengurangi adhesi trombosit pada kaca. (White et al., 1983)

Pseudotrombositopenia dapat mengurangi keakuratan hitung trombosit.

Agregasi trombosit dapat terjadi pada keadaan kurang pengocokan sampel atau

pengocokan yang terlambat, atau terdapatnya bekuan pada sampel. Selain itu

pengambilan darah yang tidak benar dapat menyebabkan pelepasan trombin dan

terjadinya hitung trombosit rendah palsu akibat adanya agregasi trombosit

(Kjeldsberg and Hershgold, 1974). Bekuan juga dapat terjadi akibat jumlah EDTA

yang kurang dari seharusnya dan EDTA yang sukar larut seperti Na2EDTA.

Ada dua kondisi pasien dimana EDTA dapat menimbulkan agegasi

trombosit, yaitu platelet satellitism dan EDTA induced pseudothrombocytopenia

(Shreiner and Bell, 1973; Evans, 1984). Pada platelet satellitism ditemukan halo

atau cincin trombosit mengelilingi sel leukosit. Jika spesimen diambil

menggunakan antikoagulan lain cincin ini tidak ditemukan. Diduga fenomena in

vitro ini disebabkan oleh antibodi (Ravi et al., 2012).

14
 Gambar 3.1 EDTA induced Pseudothrombocytopenia (Anonymous, 2011)

Gambar 3.2 Platelet Satellitism (Ravi et al., 2012)

EDTA induced pseudothrombocytopenia terjadi pada pasien yang memiliki

antibodi yang dapat berikatan dengan trombosit. Ketika EDTA ditambahkan ke

dalam darah antibodi teraktivasi dan menyebabkan agregasi trombosit. Fenomena

ini kadang-kadang tergantung pada suhu, dengan peningkatan agregasi trombosit

pada suhu rendah. Jika spesimen diambil menggunakan antikoagulan lain agregasi

trombosit tidak terjadi. Sebuah penelitian menunjukkan bahwa jika sampel

diinkubasi pada suhu 370C, tidak ditemukan agregasi trombosit dan hitung

trombosit menjadi akurat (Kjeldsberg and Hershgold, 1974). .

Pemakaian EDTA yang berlebihan juga bisa menyebabkan trombosit

membengkak dan kemudian menjadi pecah. Pecahan trombosit ini kemudian bisa

dihitung oleh alat hematologi otomatis sebagai satu trombosit sehingga

menyebabkan peningkatan palsu hitung trombosit (Eldin, 2010).

15
 BAB 4

RINGKASAN

Pemeriksaan hematologi dilakukan dengan menggunakan spesimen darah

dengan antikoagulan. Antikoagulan memiliki kemampuan mencegah koagulasi

dengan mekanisme tertentu. Perbandingan yang tepat antara antikoagulan yang

dipakai dengan darah yang dipakai sangat penting untuk mencegah terjadinya

kesalahan hasil pemeriksaan. Antikoagulan yang sering dipakai untuk

pemeriksaan hematologi adalah ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), natrium

sitrat, dan heparin.

National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)

merekomendasikan penggunaan K2EDTA untuk pemeriksaan hematologi terutama untuk

hitung sel darah dan menilai morfologi darah tepi. Antikoagulan lain juga dapat

digunakan namun memiliki beberapa kekurangan. Darah dengan antikoagulan heparin

sering menyebabkan clumping baik terhadap leukosit maupun trombosit. Sediaan

ini juga tidak baik digunakan untuk membuat apusan darah karena menyebabkan

dasar yang biru kehitaman dengan pewarnaan Wright. Darah dengan antikoagulan

natrium sitrat kurang baik untuk pemeriksaan hematologi karena efek dilusinya.

16