INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIÓQUÍMICA
LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

Práctica: Separación de grupos usando cromatografía por

exclusión.

Profra. Rosa Martha Cabrera Martínez.

Alumno. Lacunza Guzmán Juan Diego.

Grupo: 4IM2 Sección II

30 de octubre de 2017 Ingeniería bioquímica.

OBJETIVOS.
El alumno:
o Determinará algunos parámetros que caracterizan al lecho cromatográfico.
o Efectuara la desalación de la albúmina, utilizando de cromatografía por
exclusión

FUNDAMENTO.
La cromatografía de exclusión molecular es una de las técnicas más sencillas de
las empleadas en la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Este tipo de
cromatografía se realiza en columnas cilíndricas rellenas con algunos de los geles
que se fabrican con este fin y que pueden ser de varios tipos: dextranos con
enlaces cruzados (sephadex), agarosa (sepharose, Bio-gel A), poliacrilamida (Bio-
gel B), etc. Todos estos geles (fase estacionaria) se hallan constituidos por
gránulos (partículas) de un material esponjoso hidratado, que contiene poros con
un tamaño de diámetro determinado. (1)
Cuando se hace pasar una mezcla de moléculas de distinto tamaño, a través de
una columna de filtración en gel; aquellas moléculas con un tamaño mayor que el
diámetro de los poros de las partículas, sólo podrán moverse en su camino, a
través de la fase estacionaria, en el espacio que queda entre las partículas; y, por
lo tanto, no se verán retrasadas en su descenso. En cambio, aquellas moléculas
capaces de penetrar en las partículas se verán retrasadas por la fase estacionaria;
en mayor medida, cuanto menor sea su tamaño. Por lo tanto, las moléculas eluyen
en este tipo de cromatografía por orden decreciente de tamaño molecular.

Imagen 1. Mecanismo de la cromatografía por exclusión molecular.

DATOS EXPERIMENTALES.
Tabla 1. Determinación del volumen vacío (Vo) de la columna.
Volumen de elución (mL) A615
3 0
6 0.009
9 0
12 0.003
15 0.022
18 0.931
21 0.831
24 0.031
27 0.009
30 0.001
33 0.005
36 0
39 0.001
42 0.001
45 0
48 0

Perfil de elución de la Dextrana azul 2000

1

0.8
Absorbancia

0.6

0.4

0.2

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Volumen de elución (mL)

Gráfica 1. Perfil de elución de la dextrana azul 2000, para determinar el volumen

vacío de la columna.

a) ¿Cuál fue el volumen total de la columna (VT)?

Altura del lecho cromatográfico: 20.5 cm
Diametro: 2cm Radio: 1 cm
VT = (Altura del lecho cromatográfico) (área de la columna)
VT = (20.5 cm) (π (1 cm)2) = 64.4 cm3 = 64.4 mL
 b) ¿Cuál fue el volumen vacío (Vo) de la columna? ¿Qué importancia
tiene determinarlo?
Vo= 18 mL
Es el volumen que se necesita para eluir un soluto que no queda retenido en la
columna, lo que es equivalente al tiempo que permanece, el mismo, en la fase móvil.
c) Determiné el volumen que ocupa en la columna el líquido que se
encuentra en el interior de la estructura del gel (Vi) y el volumen del gel
solo (Vg).
Del SEPHADEX G-25, se sabe:
Intervalo de fraccionamiento para proteínas (daltones): 1000 – 5000
Agua retenida (mL /g gel seco): 2.5 ± 0.2
Volumen del lecho (mL /g gel seco): 4 – 6
Gramos que se tienen con el volumen del lecho cromatográfico
5 mL – 1 g
64.4 mL – X = 12.88 g
Mililitros internos se tienen por gel seco.
1 g gel seco – 2.5 mL
12.88 g – X = 32.2 mL
Vi = 32.2 mL
Vg = VT – (Vi + Vo)
Vg = 64.4 mL – (32.2 mL + 18 mL) = 14.2 mL

Tabla 2. Separación del sulfato de amonio y la albúmina. Solo se tomaron los

pesos de los tubos que presentaron precipitado.
Volumen de A280 Masa del tubo Masa del tubo con (NH4)2SO4
elución (mL) seco (g) precipitado seco (g) (mg)
3 0.001 - - -
6 0.002 - - -
9 0.001 - - -
12 0.003 - - -
15 0.021 - - -
18 0.334 - - -
21 0.294 - - -
24 0.216 - - -
27 0.127 - - -
30 0.04 6.6778 0.000 0.000
33 0.001 7.7930 0.000 0.000
36 0.002 6.1778 0.000 0.000
39 0.000 5.9998 6.0171 17.3
42 0.000 8.4841 8.5179 33.8
45 0.000 6.6176 6.6613 43.7
48 0.000 8.5432 8.5775 34.3
 51 0.000 5.2568 5.2803 23.5
54 0.000 7.5043 0.000 0.000
57 0.000 7.9096 0.000 0.000
60 0.000 7.5090 0.000 0.000
63 0.000 5.1201 0.000 0.000
66 0.000 8.1479 0.000 0.000
69 0.000 - - 0
72 0.000 - - 0
75 0.000 - - 0

Perfil de elución
0.4 50

Masa del sulfato de amonio (mg)

0.35 45
40
Absorbancia (280 nm)

0.3
35
0.25 30
0.2 25

0.15 20
15
0.1
10
0.05 5
0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Volumen de elución (mL)

Albúmina Sulfato de amonio

Gráfica 2. Perfil de elución de la albumina y sulfato de amonio.

a) ¿Qué sustancia eluyó primero y cual después? Explique porqué.
Eluyó primero la albúmina, luego el sulfato de amonio; el gel Sephadex G-25
permite el paso de molecular de tamaño de 1000D a 5000D a su interior, por lo
que la albúmina al ser una proteína de 66380D es excluida, y recorre un camino
más rápido con ayuda de la fase móvil en comparación con el sulfato de amonio
que pasa por el interior del gel, saliendo después de las moléculas que son
excluidas.
b) ¿Qué es un gel? ¿Qué características debe tener el que es
cromatográficamente útil?
“Un gel es un retículo tridimensional cuya estructura se dispone, por lo general al
azar…Constan de polímeros entrecruzados, por lo general, inertes, que no se
unen ni reaccionan con el material analizado y que no presenta carga
eléctrica.”(2).
“El grado de entrecruzamiento se controla de manera cuidadosa para obtener una
serie de geles con diferentes tamaños de poro y rangos de fraccionamiento.” (3)
c) Mencione por lo menos tres aplicaciones, diferentes a la usada en la
práctica, que puede tener esta técnica.
1. “En la titulación de enzimas o en la determinación de requerimientos de
cofactores, la preparación de enzimas contiene a veces inhibidores de
pequeño tamaño molecular o los mismos cofactores. También en los estudios
físicos de algunas moléculas (p. e., en la espectroscopia de fluorescencia)
pueden estar presentes sustancias de interferencia. Estas moléculas
pequeñas pueden eliminarse con facilidad utilizando geles de dextrano o
poliacrilamida.” (2)
2. Para la separación de DNA de otras biomoléculas como proteínas, para la
realización de algunos análisis físicos. (2)
3. También es un instrumento analítico valioso, para la determinación de pesos
moleculares. (2).
d) Escriba las estructuras químicas del Sephadex®, Bio – Gel A® y Bio –
Gel P®, indicando dónde y de qué forma se da el entrecruzamiento en
cada casi y el tipo de enlace que se presenta.
 Sephadex® Bio – Gel A®

Bio – Gel P®

Enlaces alfa, 1-6.

DISCUSION DE RESULTADOS.
Se determinaron primero los parámetros que caracterizan a la columna; el
volumen total, volumen vacío, volumen del gel y volumen interno. Para ello se uso
como fase estacionaria Sephadex G-25, el cual tiene un límite de exclusión entre
1000 D – 5000 D, es decir, para moléculas menores a 1000 D y mayores a 5000 D
de tamaño, el volumen de elución será el mismo para cada situación y como fase
móvil regulador Tris – EDTA.
Para obtener el volumen vacío, se realizó un perfil de elución empleando dextrana
azul 2000, una molécula de tamaño mayor a 5000 daltones, por lo tanto, no cuenta
con las dimensiones necesarias para entrar en los poros del gel y eluye de una
manera rápida. Se obtuvo la mayor absorbancia en el tubo seis, siendo en este
punto el volumen vacío.
Para calcular el volumen total que ocupa nuestro gel, se mide la altura del lecho
cromatográfico, como la columna es un cilindro, se multiplica por el área para
obtener el volumen. El dato calculado es de 64.4 mL de gel, dato que coincide con
el otorgado por el profesor a cargo, ya a cada equipo se le repitió
aproximadamente 60 mL de Sephadex G – 25, se dice aproximadamente porque
se midió en un vaso de precipitados, en el cual puede variar la medida. El obtener
un volumen total similar al otorgado, quiere decir que el empaquetamiento fue
óptimo puesto que no existieron burbujas de aire que aumentaran la altura del
lecho cromatográfico, aunque esto es algo que se determinara adecuadamente
obteniendo nuestro perfil de elución de la separación de mezcla al valorar el
número de picos, la resolución y eficiencia.
El volumen interno se calcula con las propiedades del Sephadex G – 25. Teniendo
el volumen total, el volumen vacío y el volumen interno, se determina el volumen
del gel. Todos estos parámetros son importantes en una cromatografía; se
pudieran ocupar para determinar el PM de la proteína empleada, claro que para
esto necesitaríamos un gel con poros más grandes para tener un intervalo mayor
de tamaño y entren proteínas más grandes, soluciones estándar de proteínas y
volúmenes de elución para cada una.
Se llevo a cabo la separación de una mezcla de albúmina con sulfato de amonio,
empleándose las mismas condiciones que para la dextrana azul 2000. La
albúmina es una proteína de 60,000 daltones de tamaño aproximadamente y el
sulfato de amonio una molécula pequeña, por lo tanto, la proteína eluyó primero
gracias a que el sulfato de amonio se quedó retenido en los poros del gel, algo
muy importante que se debe destacar, es que la albúmina al igual que la dextrana
azul 2000, miden más de 5000 daltones; como ya se mencionó anteriormente las
moléculas con mayor tamaño al del poro, eluyen con de la misma forma y por
ende el mismo volumen de elución, entonces el volumen vacío que equivale al
volumen de elución de la dextrana azul 2000, debe de ser el mismo que el de la
albúmina. Se obtuvo la mayor absorbancia de albumina en el tubo seis, de igual
manera que sucedió con la dextrana.
El sulfato de amonio es una molécula que no absorbe luz, por eso se empleó otro
método para identificar la separación, se precipito con cloruro de bario los tubos
seleccionados (a partir del tubo 13). Para ello anteriormente se pesaron los tubos
vacíos y posteriormente los tubos donde se presentó precipitado, por diferencia de
pesos se obtuvo la masa sulfato de bario formado, lo que equivale al peso del
sulfato de amonio. Entonces para el perfil de elución se empleó en el caso del
sulfato de amonio su peso y no absorbancia.
Al final se graficó el perfil de elución con la absorbancia a 280 nm de la proteína,
con la masa del sulfato de amonio en función del volumen de elución, debemos
recordar que para un perfil de elución no es necesario un valor de absorbancia,
sino que se necesita una señal que indique la presencia del compuesto, por ello se
usa la masa de la sal. Como se observa en la gráfica 2, se aprecia que hubo
separación por la resolución, ya que existen dos tubos en los cuales no hay
medición de absorbancia, ni masa de precipitado, es decir, no hay proteína ni
sulfato de amonio, por lo tanto, se deduce que salió primero completamente la
albúmina y posteriormente la sal. Por la anchura de los picos, se puede decir que
hay una buena eficiencia para una cromatografía tradicional, solo nos basamos en
la campana que se forma por la proteína, ya que lo que nos interesa separar, el
sulfato de amonio se puede considerar una impureza.
En general, se produjo una buena separación producto de un buen trabajo en el
laboratorio, ya que se controló adecuadamente la velocidad de elución, el volumen
del lecho cromatográfico, cuestiones que nos revela el perfil de elución al aparecer
únicamente dos campanas con buena resolución y eficiencia, para poder hablar de
esto más a profundidad, se tendrían que determinar los parámetros
matemáticamente, puesto que ya se tiene el tiempo de retención (volumen de
elución), el volumen vacío, solo falta el ancho de la campana.

CONCLUSIONES.
 Se determinaron correctamente los parámetros que caracterizan un lecho
cromatográfico; volumen vacío, volumen interno, volumen del gel y volumen
total.
 Se separó correctamente la mezcla de la albúmina con sulfato de amonio
(desalación de la proteína), comprobándose con un perfil de elución, el cual
también nos ayudó a saber la eficiencia y resolución del método junto con el
buen trabajo en laboratorio.
BIBLIOGRAFIA.
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octubre de 2017. Instituto de biotecnología-UNAM. Disponible en:
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Cromatografia.pdf
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España: Reverté. Pp. 207, 212,213.
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Argentina: Médica Panamericana. 20ª edición. P. 703.
4. Autor desconocido. (2005).MBM 451ª Section One- Fall 2005. Methods for
working with proteins (Sephadex). Fecha de recuperación: 28 de octubre de
2017. MBMB Department. Disponible en:
http://www.siumed.edu/~bbartholomew/course_material/protein_
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8. Harris D. (2007). Análisis químico cuantitativo. Barcelona, España: Reverté.
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