21 (2): 8489
ISSN 0853-4217 http://journal.ipb.ac.id/index.php/JIPI
EISSN 2443-3462 DOI: 10.18343/jipi.21.2.84
ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian hormon 2,4-D dan benzyl amino purin (BAP)
terhadap pertumbuhan kalus jeruk kasturi (Citrus microcarpa). Penelitian ini menggunakan metode eksperimen
dengan rancangan acak lengkap (RAL) faktorial. Parameter yang diamati adalah persentase tumbuh eksplan, waktu
muncul, lebar, dan tekstur kalus. Hasil penelitian persentase tumbuh eksplan dan lebar kalus dianalisis dengan
ANOVA dan uji lanjut DMRT pada taraf 5%, sedangkan waktu muncul kalus dan tekstur kalus dilakukan secara
deskriptif. Hasil Penelitian menunjukkan bahwa kombinasi hormon D4B1 dan D4B2 menghasilkan waktu muncul
kalus tercepat, yaitu 3,3 HSK. Persentase pembentukan kalus tertinggi, yaitu 100% terdapat pada perlakuan D2B0,
D2B0.5-D4B0. Rerata lebar kalus tertinggi terjadi pada perlakuan D4B2 dengan lebar kalus 0,97 cm. Kalus embriogenik
dihasilkan pada perlakuan D2B1, D2B2, dan D3B0. Perlakuan Kombinasi hormon 2,4-D dan BAP yang terbaik adalah
pada perlakuan D2B2 (2 mg/l 2,4-D, dan 2 mg/l BAP) untuk menghasilkan kalus embriogenik sehingga dapat
digunakan untuk kultur suspense sel.
ABSTRACT
Calamansi fruits (Citrus microcarpa) or musk lime is one horticulture crops has been known as beverage and
food flavorings. This research aimed to determine the effect of 2,4-D and BAP on callus induction of explants
calamansi fruits (Citrus microcarpa). Parameters observed is percentage of explants, time appeared callus, callus
width, and texture of the callus. Research results and a growing percentage of the width callus explants were
analyzed by ANOVA and a further test DMRT at 5% level. The next to appear callus timing parameters and texture of
callus analyzed in description. The result shows that a combination of hormones D4B1 and D4B2 produces a callus
emerged fastest of 3.3 days after culture. The highest percentage of callus formation that is 100% contained in the
treatment of D2B0, D2B0.5-D4B0. The mean width of callus was highest in treatment D4B2 with a width of 0.97 cm.
Embryogenic callus resulting by treatment of D 2B1, D2B2, and D3B0. However, the best a combination of hormones is
treatment D2B2 (2 mg/l, 2,4-D, dan 2 mg/l BAP) producing embryogenic callus edvanced to suspension cultures.
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan varietas kalamansi FR yang berasal dari Bengkulu.
kombinasi hormon 2,4-D dan BAP untuk merangsang Medium Murashige dan Skoog (MS), hormon 2,4-
pembentukan kalus yang bersifat embriogenik, remah, Dikloropenoksi asetik (2,4-D), 6-benzyl amino purin
dan mudah terurai sehingga dapat digunakan untuk (BAP), alkohol 70 dan 96%, NaOH 0,1 N, HCl 0,1 N,
bahan dasar kultur suspensi sel yang sesuai. agar Becto Facto, Tween 20, Makro dan Mikro nutrisi,
Selanjutnya pemilihan kalus untuk diperbanyak dalam EDTA, Myoinositol, dan bahan-bahan pendukung
kultur suspensi sel. Teknik ini dapat menghasilkan lainnya.
bahan metabolit sekunder dalam jaringan tanaman Penelitian ini menggunakan metode eksperimen
yang diperoleh melalui kalus. Metabolit yang di- dengan rancangan acak lengkap (RAL) faktorial yang
hasilkan dari kalus sering kali kadarnya lebih tinggi faktor pertama adalah 2,4-D dengan taraf perlakuan,
daripada metabolit yang diambil langsung dari yaitu 0; 0,5; 1; dan 2 mg/l. Faktor kedua adalah BAP
tanamannya. dengan taraf perlakuan, yaitu 0, 1, 2, 3, dan 4 mg/l.
Salah satu cara yang dapat dilakukan untuk dapat Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 3 kali.
menginduksi dan meningkatkan pertumbuhan kalus Parameter yang diamati adalah persentase tumbuh
adalah dengan penambahan hormon pada media eksplan, saat muncul, lebar, dan tekstur kalus. Hasil
kultur (Rahmi et al. 2010). Menurut Mahadi et al. penelitian persentase tumbuh eksplan, dan lebar
(2014), salah satu hormon yang sering digunakan dan kalus dianalisis dengan ANOVA dan uji lanjut DMRT
sangat efektif adalah 2,4-D, yaitu auksin yang dapat pada taraf 5%, sedangkan saat muncul kalus dan
merangsang pembentukan sel-sel. Konsentrasi yang tekstur kalus dilakukan secara deskriptif.
rendah <5 mg/l hormon 2,4-D pada tanaman dikotil
dapat merangsang induksi kalus. Untuk kelompok
sitokinin biasanya menggunakan benzyl amino purin HASIL DAN PEMBAHASAN
(BAP) yang berfungsi menstimulasi pembelahan sel
dalam jumlah yang sangat kecil <1 mg/l. Penelitian ini Berdasarkan hasil penelitian pengaruh pemberian
untuk mengetahui tentang pengaruh pemberian hormon 2,4-D dan BAP terhadap induksi dan
hormon 2,4-D dan BAP terhadap pertumbuhan kalus pertumbuhan kalus tanaman jeruk kasturi (Citrus
jeruk kasturi (Citrus microcarpa). Dengan demikian, microcarpa) didapatkan data seperti pada Tabel 1.
kajian ini adalah untuk mengetahui apakah peng-
gunaan kombinasi hormon 2,4-D dan BAP pada Waktu Muncul Kalus
media in vitro pada eksplan jeruk kasturi dapat Hasil pengamatan waktu muncul kalus pada Tabel
menginduksi kalus dan menghasilkan kalus yang 1 menunjukkan bahwa pemberian kombinasi hormon
bersifat embriogenik. 2,4-D dan BAP secara deskripsi dari angka yang
diperoleh adalah berpengaruh. Pada perlakuan D4B0,5
dan D4B1 merupakan rerata waktu muncul kalus yang
METODE PENELITIAN paling cepat, yaitu 3,33 HSK. Semakin tinggi
kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh yang
Penelitian ini menggunakan bahan biji jeruk kasturi ditambahkan dalam medium menyebabkan laju per-
Tabel 1 Rerata pengaruh pemberian hormon 2,4-D dan BAP terhadap pertumbuhan kalus tanaman jeruk kasturi (Citrus
microcarpa)
Kombinasi Rerata waktu muncul kalus Rerata presentase jumlah
Rerata lebar kalus (cm)
2,4-D dan BAP (mg/l) (HSK) kalus yang terbentuk (%)
D0B0 12 16,67 d 0,40 e
D0B0,5 12,33 25 c 0,37 d
D0B1 12,33 25 c 0,37 d
D0B2 12,67 33,33 c 0,30 d
D1B0 7,33 58,33 b 0,60 c
D1B0,5 7,67 66,67 b 0,63 c
D1B1 8 75 b 0,67 c
D1B2 8,67 83,33 b 0,63 c
D2B0 6,33 100 a 0,67 c
D2B0,5 6 100 a 0,73 b
D2B1 6 100 a 0,77 b
D2B2 6,67 100 a 0,70 b
D3B0 5,67 100 a 0,73 b
D3B0,5 5,33 100 a 0,80 a
D3B1 5 100 a 0,83 a
D3B2 4,67 100 a 0,87 a
D4B0 4 100 a 0,87 a
D4B0,5 3,67 100 a 0,90 a
D4B1 3,33 100 a 0,93 a
D4B2 3,33 100 a 0,97 a
Keterangan: hari setelah kultur (HSK).
86 JIPI, Vol. 21 (2): 8489
tumbuhan kalus semakin tinggi, hal ini sesuai menurut tumbuhan biasanya merupakan bahan eksplan yang
Robles-Martinez et al. (2016) penggunaan auksin 2,4- paling baik.
D dapat memacu pertumbuhan kalus, auksin berupa Pada induksi kalus ini, mengombinasikan peng-
2,4-D dapat menaikkan tekanan osmotik, meningkat- gunaan hormon auksin dan sitokinin dapat memberi-
kan permeabilitas sel terhadap air, menyebabkan kan pengaruh yang baik terhadap pembentukan dan
pengurangan tekanan pada dinding sel, meningkatkan pertumbuhan kalus serta kandungan bahan metabolit
sintesis protein, meningkatkan plastisitas, dan sekunder. Kalus yang bersifat embriogenik yang
pengembangan dinding sel. dihasilkan dari kombinasi hormon auksin dan sitokinin
Pada induksi kalus jeruk kasturi ini terjadi akan memberikan pengaruh pada produksi bahan
plastisitas dan pengembangan dinding sel didorong metabolit sekunder (Bienaime et al. 2015).
oleh pemberian auksin, karena auksin mengeluarkan Faktor lain yang mendukung keberhasilan per-
H+ ke dalam dinding sel dan H+ ini menyebabkan pH sentase tumbuh eksplan pada penelitian ini adalah
dinding sel menurun sehingga terjadi pelonggaran karena penggunaan media MS yang mengandung
struktur dinding (berarti peningkatan plastisitas) dan komposisi lengkap untuk pertumbuhan eksplan.
terjadi pertumbuhan. Penambahan sitokinin dalam Pemberian hormon dengan beberapa konsentrasi
media sangat dibutuhkan untuk meningkatkan pem- pada media MS memberikan persentase tumbuh
belahan sel, karena sitokinin berperan dalam pem- eksplan yang baik, karena pada media mengandung
bentukan benang gelendong pada tahap metafase. vitamin, unsur hara makro dan mikro, serta besi dan
Perbedaan laju pertumbuhan kalus selain dipengaruhi sukrosa sehingga cukup untuk memacu pertumbuhan
oleh peningkatan kecepatan pembelahan sel karena eksplan dalam pembentukan kalus (Ardiana 2009).
pengaruh pemberian 2,4-D dan BAP juga dipengaruhi Pertumbuhan organ vegetatif dipengaruhi oleh akti-
oleh kondisi genetis, umur jaringan, dan jenis tana- vitas auksin dan nitrogen dalam media, dan sumber
man serta faktor lingkungan yang meliputi cahaya, nitrogen organik paling tinggi terdapat pada media MS
kandungan O2, suhu, dan kelembapan udara serta dibandingkan dengan media lainnya. Hal inilah yang
kemampuan jaringan untuk menyerap zat-zat hara mendukung khususnya pada perlakuan kombinasi
yang tersedia, hal ini banyak dipengaruhi oleh aerasi hormon 2,4-D dan BAP.
pada media dan tekstur kalus yang dihasilkan.
Menurut Samudin (2009), menyatakan bahwa Lebar Kalus
dalam aktivitas kultur jaringan, terutama hormon Hasil analisis varian untuk parameter lebar kalus
auksin sangat dikenal sebagai hormon yang mampu yang terbentuk menunjukkan perbedaan nyata.
berperan menginduksi terjadinya kalus. Pada kon- Kombinasi perlakuan dengan lebar kalus tertinggi
sentrasi rendah akan memacu akar adventif, sedang- terdapat pada perlakuan D4B2 dengan lebar kalus
kan pada konsentrasi tinggi mendorong terbentuknya 0,97 cm (Tabel 1), hal ini disebabkan karena
kalus. Pada perlakuan D4B0,5 dan D4B1 merupakan perbedaan konsentrasi hormon auksin dan sitokinin
kombinasi antara hormon auksin dan sitokinin yang yang diberikan. Menurut Mahadi et al. (2014), salah
terbaik untuk merangsang pembentukan kalus sehing- satu peranan hormon 2,4-D adalah membantu dalam
ga menghasilkan rerata waktu muncul kalus yang proses pembelahan dan pemanjangan sel. Peng-
paling cepat, yaitu 3,33 HSK. gunaan batang muda yang mengandung sel-sel
merismatik mempercepat pembelahan sel baru
Persentase Jumlah Kalus sehingga semakin tinggi kandungan hormon 2,4-D
Persentase tumbuh eksplan dari hasil analisis maka akan semakin cepat terjadi proliferasi sel
varian menunjukkan bahwa pemberian hormon 2,4-D sehingga akan membentuk kalus. Kalus yang ter-
dan BAP berpengaruh nyata terhadap pertumbuhan bentuk adalah kumpulan sel-sel muda yang mudah
eksplan. Hal ini disebabkan karena hormon endogen terurai bersifat remah, hal inilah yang disebut kalus
yang ada di dalam eksplan sudah mencukupi untuk embiogenik.
pertumbuhan eksplan jeruk kasturi dan ditambah lagi Faktor lain yang juga memengaruhi pembelahan
dengan hormon eksogen yang dapat merangsang sel-sel kalus adalah sumber karbon yang terdapat
pertumbuhan eksplan dengan cepat. Dari Tabel 1 pada media MS, yaitu berupa sukrosa. Karbon me-
terlihat bahwa hampir semua perlakuan, yaitu D2B0- rupakan komponen penting bagi senyawa-senyawa
D4B2 menunjukkan persentase tumbuh eksplan penyusun sel seperti karbohidrat, lipid, protein, dan
mencapai 100%, hal ini disebabkan karena eksplan asam nukleat. Jika sumber karbon mencukupi maka
yang digunakan adalah jaringan muda yang memiliki komponen-komponen sel ini akan terbentuk cepat,
sifat maristematik yang memiliki hormon endogen waktu inisiasi kalus pun akan lebih cepat sehingga sel
yang aktif membelah dan kemudian dikombinasikan akan mempunyai kesempatan untuk membelah lebih
dengan hormon eksogen dari kelompok auksin (2,4- optimal (Ardiana 2009). Pembelahan sel yang optimal
D) dan sitokinin (BAP) sehingga sel-sel melakukan akan menyebabkan pertumbuhan kalus yang optimal.
proliferasi membentuk struktur bakal organ berupa Dengan demikian, semakin cepat sel-sel dalam
kumpulan sel-sel yang akan mengalami diferensiasi. memanfaatkan hormon pertumbuhan, maka semakin
Menurut Zulkarnain (2009) bahwa jaringan-jaringan cepat pula terjadi peningkatan jumlah sel-sel tersebut,
yang sedang aktif tumbuh pada awal masa per- hal ini akan menambah lebar kalus terutama pada
JIPI, Vol. 21 (2): 8489 87
Tekstur Kalus
Tekstur kalus merupakan salah satu penanda
yang dipergunakan untuk menilai kualitas suatu kalus.
Tekstur kalus dapat dibedakan menjadi tiga macam,
yaitu: kompak (non friable), intermediet, dan remah a
(friable). Berdasarkan hasil pengamatan, dilihat dari
Tabel 2 tekstur kalus yang terbentuk pada setiap
perlakuan umumnya adalah bertekstur remah dan
dengan warna yang bervariasi seperti terlihat pada
Gambar 2.
Kalus dengan tekstur remah dihasilkan pada
perlakuan D1B0, D1B0,5, D1B1, D1B2, D2B0, D2B1, D2B2,
dan D3B0, dipacu oleh adanya hormon auksin
endogen yang diproduksi secara internal oleh eksplan
yang telah tumbuh membentuk kalus tersebut.
Tekstur kalus yang remah (friable) mengalami
pembelahan sel yang cepat daripada tekstur kalus b
yang kompak. Tekstur kompak disebabkan karena Gambar 1 Lebar kalus yang tumbuh pada perlakuan (a)
kalus mengalami pembentukan lignifikasi sehingga D0B2 diameter 0,3 cm dan (b) D4B2.
kalus tersebut mempunyai tekstur yang keras yang
merupakan efek dari sitokinin yang berperan dalam Tabel 2 Tektur kalus jeruk kasturi
transport zat hara. Pada perlakuan D2B1, D2B2, dan Kombinasi
D3B0 menghasilkan tekstur kalus yang remah 2,4-D dan BAP Tekstur kalus
berwarna putih kekuningan dan bersifat embriogenik. (mg/l)
Hal ini sangat sesuai untuk dijadikan kultur suspense D0B0 Kompak, berwarna hijau
sel untuk memproduksi bahan metabolit sekunder. D0B0,5 Kompak, berwarna hijau
Warna pigmen putih dan kuning pada kalus D0B1 Kompak, berwarna hijau
menunjukkan bahwa pertumbuhan kalus tersebut D0B2 Kompak, berwarna hijau
baik. Warna hijau disebabkan kalus mengandung D1B0 Remah, berwarna putih kehijauan
klorofil, akibat interaksi 2,4-D dan BAP (sitokinin) yang D1B0,5 Remah, berwarna putih kehijauan
D1B1 Remah, berwarna putih kehijauan
berperan dalam pembentukan klorofil pada kalus. D1B2 Remah, berwarna putih kehijauan
Menurut Wardani et al. (2004), perubahan warna D2B0 Remah, berwarna putih kehijauan
kalus menjadi putih kehijauan, pada sel kalus sudah D2B0,5 Remah, berwarna putih kehijauan
mulai terbentuk klorofil sebagai reaksi pencahayaan D2B1 Remah, berwarna putih kekuningan
sehingga kloroplas melakukan fotosintesis. D2B2 Remah, berwarna putih kekuningan
Pertumbuhan kalus semakin menurun pada D3B0 Remah, berwarna putih kekuningan
minggu ke-7 yang diawali dengan gejala perubahan D3B0,5 Kompak, berwarna kuning
warna menjadi cokelat (browning), hal ini diduga D3B1 Kompak, berwarna kuning
karena sel mengalami degradasi fisiologis akibat D3B2 Kompak, berwarna kuning
D4B0 Kompak, berwarna cokelat
kekurangan unsur hara atau hormon tumbuhnya
D4B0,5 Kompak, berwarna cokelat
sehingga kalus menunjukkan ciri ketuaan. Menurut D4B1 Kompak, berwarna cokelat
Yusnita (2003), warna kecokelatan pada kalus ini D4B2 Kompak, berwarna cokelat
akibat adanya metabolisme senyawa fenol bersifat
toksik, yang sering terangsang akibat proses sterilisa- digunakan sebagai bahan awal suspensi adalah sel
si eksplan, yang menghambat pertumbuhan atau kalus yang embriogenik mempunyai ciri-ciri tekstur
bahkan menyebabkan kematian jaringan. Kalus yang kalus remah dan mudah terurai, warna kalus putih
bersifat embriogenik yang dihasilkan dari kombinasi hingga kuning, tidak mudah terjadi oksidasi zat
hormon auksin dan sitokinin akan memberikan fenolik, dan sel-selnya mudah berkembang biak
pengaruh pada produksi bahan metabolit sekunder. (Mahadi 2012). Sedangkan kalus yang non embrio-
genik berwarna kuning kecokelatan, agak pucat, dan
Kalus Embriogenik yang Terbaik lembek berair sehingga sulit dipisahkan (Peterson &
Kalus merupakan bahan awal untuk pembuatan Smith 1991). Dalam hal ini, kalus yang berstruktur
kultur suspensi sel, untuk tujuan produksi metabolit kompak diindikasikan sebagai kalus yang tidak
sekunder, metode kultur suspensi sel merupakan embriogenik (non friable). Untuk mendapatkan kalus
metode pilihan sampai saat ini. Agar kalus dapat yang embriogenik, kita dapat melakukan subkultur
88 JIPI, Vol. 21 (2): 8489
a b c d e
Gambar 2 Tekstur kalus yang terbentuk pada berbagai perlakuan: a) Hijau padat dan tumbuh plantlet; b) Putih kehijauan
remah; c) Putih kekuningan remah (embryogenic); d) Kuning kompak; dan e) Cokelat kompak.