1.1.- Pasos previos a la inclusión: Deshidratación y aclaramiento.

Para conseguir que la parafina insoluble en agua, pueda introducirse en el tejido, será
necesario realizar unos pasos previos.

Deshidratación.

Consiste en la eliminación del agua de la muestra tisular. Se puede realizar mediante diversos
procedimientos, aunque es primordial que durante este proceso se mantengan íntegras las
estructuras tisulares. Entre los procedimientos físico-químicos se encuentra la liofilización,
aunque el método más usual es la utilización de agentes químicos higroscópicos, como el
alcohol etílico, con gran facilidad para absorber el agua.

El uso de alcoholes otorga diversas ventajas. Debido a que su acción deshidratante es rápida,
hace que no endurezca demasiado los tejidos, siendo además una sustancia no demasiado
tóxica ni con elevado riesgo de producir otro tipo de accidentes como explosión o incendio.

Durante el proceso de deshidratación es importante tener en cuenta varios aspectos:

 Evitar la retracción que produciría en el tejido la acción brusca del agente

deshidratante. Para ello debemos utilizar los alcoholes en una graduación ascendente,
por ejemplo comenzar con el de 50%, 70%, 90%, absoluto.
 Intentar que el tiempo en el que la muestra permanece en alcohol sea el mínimo para
disminuir el riesgo de endurecimiento, se alteren menos los tejidos y poder controlar
mejor el grado de deshidratación. Para ello es importante que el volumen de alcohol
sea aproximadamente 10 veces superior al de la muestra y además que los baños
sean dobles.
 Que la deshidratación sea completa, pero no demasiado excesiva que produzca
endurecimiento. Para ello es imprescindible controlar el tiempo de deshidratación que
vendrá dado por el tamaño del fragmento tisular y el tipo de tejido, ya que el contenido
en agua puede diferir.

Pero, ¿siempre se utiliza alcohol?

Podemos utilizar otras sustancias como el alcohol metílico, con el inconveniente de que es
más tóxico e inflamable, la acetona, que como actúa rápidamente puede volver al tejido frágil,
y en ocasiones si queremos acelerar la deshidratación, se puede utilizar una mezcla de ambos.
Después de la deshidratación los tejidos deben introducirse en xilol, tolueno o sustancias
químicas similares, pero, ¿por qué motivo?

Si vamos a utilizar para incluir un medio como la parafina, no soluble en alcohol, será necesario
utilizar alguna sustancia química que permita el intercambio y sustitución del alcohol por el
medio de inclusión.

Para ello, además, tendrá que ser miscible en este último.

A estas sustancias se les llama aclarantes, porque hacen más transparente el tejido o también
líquidos intermediarios. Entre ellos tenemos el xilol, tolueno, cloroformo.

Antiguamente se utilizaba benceno, pero debido a los riesgos para la salud que supone, ha
dejado de utilizarse

Para saber más

Habitualmente como ves, trabajamos en el laboratorio con sustancias como xilol, alcohol, etc. y
ninguna de ellas exenta de riesgos. Aquí tienes dos enlaces donde puedes ver dos
documentos que hacen referencia a diferentes daños para la salud que pueden causar los
disolventes orgánicos, y la ficha de seguridad del xilol.

Peligros solventes orgánicos. (0.86 MB)

Riesgos del xilol. (0.05 MB)

1.2.- Infiltración en parafina. Procedimiento.

Con la infiltración o impregnación lo que queremos conseguir es que todos los espacios intra y
extracelulares de la muestra histopatológica, sean ocupados por la parafina. Para ello será
necesario que se produzca la sustitución del líquido aclarante por esta última. Este proceso se
realiza a una temperatura, generalmente de 60 ºC, que permite que los agentes aclarantes se
evaporen y la parafina líquida ocupe el espacio que antes ellos ocupaban.

La parafina es una sustancia de tipo céreo, formada por mezclas de hidrocarburos saturados,
blanca, inodora, insoluble en agua y alcohol, solubles en la mayoría de solventes orgánicos. Es
sólida a temperatura ambiente y existiendo varios tipos que tienen diferentes puntos de fusión
(de 47 a 70 ºC). La parafina pura tiene el inconveniente de oxidarse con el tiempo dando una
coloración amarillenta y una blanda consistencia, que la hace ineficaz para la obtención de un
corte fino.
Por ello, habitualmente se utiliza una mezcla de parafinas con diferente punto de fusión, lo que
permite poder obtener parafinas más blandas o duras que pueden ser seleccionadas en
dependencia del tipo de tejido o el grosor del corte a efectuar.

La mayoría de ellas suelen tener un grado de fusión de 50 a 58 ºC, llevando incorporado

además una pequeña cantidad de aditivo (plástico, cera microcristalina o polímeros) que
mejora las características del agente de inclusión. ¿Qué condiciones debe cumplir el agente de
inclusión?

 Que permita obtener cortes uniformes.

 Que tenga la suficiente dureza para permitir que se forme un bloque homogéneo con
tejidos de mayor dureza, permitiendo que el corte pueda ser efectuado.
 Que el medio sea viscoso, facilitando la formación de tiras continuas de parafina en el
corte.
 Disminuir la estructura cristalina de la parafina, consiguiendo bloques menos frágiles
que fácilmente podrían romperse.

¿De qué modo se puede realizar esta infiltración?

Podría realizarse de forma manual, pero hoy en día la técnica está limitada al uso de
procesadores automáticos que facilitan el trabajo, controlan mejor tiempo, etc.

También, se dispone de microondas específicos para fijación, procesamiento y tinción, que

proporcionan buenos resultados en menor tiempo, aunque hasta el momento no está muy
extendida su utilización.

Independientemente del método utilizado, el fundamento es el mismo, variando sólo los

tiempos de procesamiento.

Debes conocer

En el siguiente enlace se informa de las características de diferentes procesadores de

infiltración en parafina:

Procesador de parafina.
Los procesadores automáticos utilizados en la infiltración de parafina pueden ser variados. En
la siguiente presentación puedes ver imágenes de algunos de ellos.

1.3.- Otros medios de inclusión.

Aunque es excepcional el uso de otros medios de inclusión, en ciertas ocasiones, puede ser
aconsejable recurrir a otras técnicas. ¿En qué circunstancias podemos utilizarlos?

Generalmente cuando las características del tejido o de la técnica lo requiera, por ejemplo:

 El globo ocular que tiene una consistencia y dureza heterogénea.

 Piezas óseas poco descalcificadas.
 Estudios neurohistológicos.
 Microscopia electrónica.

¿De qué medios de inclusión se dispone?

 Gelatina: Tiene las ventajas de ser soluble en agua y por ello no es preciso deshidratar
y aclarar.

Además, debido a su bajo punto de fusión (40 ºC), la estructura y componentes del
tejido no se alteran.

Es preciso eliminar todo el fijador mediante lavados continuos, antes de la inclusión,

así como incorporar a la gelatina fenol al 1%, que evitará la contaminación bacteriana.
Las secciones que se obtienen son gruesas, y la gelatina no puede eliminarse después
del corte, por lo que puede interferir los procedimientos posteriores de tinción. Por
todos estos inconvenientes, prácticamente su uso se limita a la inclusión de órganos
enteros.

 Agar: Tiene unas características similares a la gelatina. Su uso suele quedar

restringido como medio de agrupamiento de fragmentos muy pequeños de tejido, de
modo que estos pueden introducirse en agar líquido, y cuando enfríe y gelifique, se
puede incluir en parafina.
 Celoidina: Sustancia blanco-amarillenta insoluble en agua que puede utilizarse cuando
se precisa obtener bloques muy duros a bajas temperaturas. Su empleo es muy
limitado porque presenta numerosos inconvenientes, como:
o Riesgos que supone ya que requiere una mezcla de alcohol-éter para su
aclaramiento.
o Excesivo tiempo para el total procesamiento.
 Polietilenglicol: Polímeros líquidos hidrosolubles que pueden polimerizar,
aumentando su viscosidad, transformándose a sólido. Para ello es necesaria la adición
de una sustancia química específica denominada catalizador. Se puede utilizar cuando
se quieren demostrar enzimas, lípidos u otros componentes que pudieran ser
destruidos por calor.
 Resinas: Utilizadas en microscopia electrónica por su gran dureza lo que permite
realizar cortes de adecuados.