Anda di halaman 1dari 75

KARAKTERISASI PLANTARICIN ASAL EMPAT GALUR

Lactobacillus plantarum BERDASARKAN


SENSITIVITASNYA TERHADAP
ENZIM TRIPSIN

SKRIPSI
GILANG AYUNINGTYAS

DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN


FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2012
RINGKASAN

GILANG AYUNINGTYAS. D14070143. 2012. Karakterisasi Plantaricin Asal


Empat Galur Lactobacillus plantarum Berdasarkan Sensitivitasnya terhadap
Enzim Tripsin. Skripsi. Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan,
Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.

Pembimbing Utama : Dr. Irma Isnafia Arief, S.Pt., M.Si.


Pembimbing Anggota : Tuti Suryati, S.Pt., M.Si.

Bakteri asam laktat (BAL) memiliki peran yang sangat penting dalam
pengolahan pangan. Bakteri asam laktat berperan aktif dalam proses fermentasi
pangan. BAL pada perkembangannya saat ini diharapkan dapat diaplikasikan sebagai
agen pengawet pangan alami. Hal tersebut disebabkan oleh kemampuan BAL dalam
memproduksi substansi-substansi antimikrob selama metabolismenya. Bakteriosin
merupakan salah satu substansi antimikrob yang diproduksi BAL. Supernatan bebas
sel netral isolat Lactobacillus plantarum 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 yang diisolasi
dari daging sapi lokal diketahui memiliki aktivitas antimikrob melawan bakteri
indikator. Zat aktif pada senyawa antimikrob ini diduga sebagai bakteriosin yang
dihasilkan oleh Lactobacillus plantarum atau disebut plantaricin, sehingga perlu
dilakukan proses purifikasi untuk mendapatkan plantaricin murni 1A5, 1B1, 2B2,
dan 2C12.
Penelitian ini dilakukan untuk mempelajari karakteristik plantaricin tersebut
terhadap degradasi enzim proteolitik. Sensitivitas plantaricin terhadap enzim
proteolitik merupakan kriteria utama dalam karakterisasi plantaricin, karena
komponen utama dalam plantaricin adalah peptida yang harus sensitif terhadap
enzim proteolitik. Enzim proteolitik yang digunakan dalam penelitian ini adalah
enzim tripsin. Pengujian ini sekaligus untuk membuktikan bahwa plantaricin akan
terdegradasi dalam saluran pencernaan manusia, tempat terjadinya proses proteolitik
oleh enzim tripsin, sehingga plantaricin dapat digunakan sebagai agen pengawet
pangan alami. Proses karakterisasi diawali dengan memproduksi plantaricin 1A5,
1B1, 2B2, dan 2C12, melalui tahapan purifikasi.
Keempat galur Lactobacillus plantarum ditumbuhkan pada media De Man
Rogosa and Sharpe broth (MRSb) yang ditambah yeast extract (YE) 3%, diinkubasi
selama 20 jam, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm untuk
mendapatkan supernatan antimikrob. Supernatan antimikrob disaring menggunakan
membran saring sartorius untuk mendapatkan supernatan bebas sel, yang kemudian
dinetralkan pH-nya menjadi 5,8 – 6,2. Proses purifikasi parsial dilakukan dengan
menjenuhkan larutan menggunakan amonium sulfat hingga penjenuhan mencapai
80%. Presipitat plantaricin didapat dan didialisis menggunakan membran dialisis.
Proses dialisis menghasilkan plantaricin kasar, kemudian plantaricin kasar
dimurnikan dengan teknik kromatografi kolom pertukaran kation.
Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian produksi plantaricin
dan sensitivitas plantaricin 1A5, 1B1, 2B2, 2C12 terhadap enzim tripsin adalah
adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan tiga kali ulangan. Rancangan acak
lengkap (RAL) pola faktorial 2x4 digunakan pada penelitian uji antagonistik
plantaricin 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 terhadap bakteri indikator dengan ulangan

ii
sebanyak tiga kali. Faktor perlakuan pertama adalah penggunaan enzim tripsin, dan
faktor perlakuan kedua adalah plantaricin asal galur L. plantarum yang berbeda.
Hasil karakterisasi plantaricin 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 terhadap enzim
tripsin, memperlihatkan bahwa plantaricin tersebut sensitif terhadap enzim tripsin.
Hal tersebut diindikasikan oleh terjadinya penurunan konsentrasi protein plantaricin,
serta terjadinya penurunan aktivitas penghambatan plantaricin terhadap bakteri
indikator pada uji antagonistik. Persentase penurunan konsentrasi protein terbesar
dimiliki oleh plantaricin 2C12 yaitu sebesar 74,27 %. Perlakuan enzim tripsin
berbeda nyata (p≤0,05) terhadap diameter zona hambat plantaricin pada uji
antagonistik dengan bakteri indikator. Aktivitas antimikrob dari plantaricin tidak
sepenuhnya diinaktivasi oleh enzim tripsin. Hal ini terlihat dari masih terbentuknya
zona hambat dan masih cukup tingginya nilai activity unit pada uji antagonistik
plantaricin 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 terhadap bakteri indikator Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 14028, Bacillus cereus,
Salmonella enteritidis ser. Thypimurium ATCC 14028, dan Escherichia coli ATCC
25922.

Kata - Kata Kunci : Bakteriosin, Lactobacillus plantarum, plantaricin, trispsin,


antagonistik.

iii
ABSTRACT

Plantaricin Characterization from Four Strains of Lactobacillus plantarum


Based on Sensitivity to Tripsin Enzyme
Ayuningtyas, G., I.I. Arief, dan T. Suryati
Lactic acid bacteria (LAB) has been used as biological preservative for
thousands years in food processing. LAB produces many antimicrobial substances,
one of them is bacteriocin. Four strains of Lactobacillus plantarum (1A5, 1B1, 2B2,
and 2C12) were isolated from Indonesia local beef and have identified producing
bacteriocin called plantaricin 1A5, 1B1, 2B2, and 2C12. The pure plantaricins were
obtained from purification steps, consisted of purification partial using ammonium
sulphate precipitation, dialysis, and purification using chromatographi cation
exchange. The objective of this research was to study characteristic plantaricin from
Lactobacillus plantarum 1A5, 1B1, 2B2, and 2C12 to proteolytic enzyme
degradation. The characterization was determined by sensitivity assay to tripsin
enzyme with antagonistic assay againt indicator bacterias (Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus cereus, Salmonella
enteritidis ser. Thypimurium ATCC 14028, and Escherichia coli ATCC 25922). The
result showed that plantaricin 1A5, 1B1, 2B2, and 2C12 could inhibit the indicators
bacterias consisted of Gram positive bacteria and Gram negative bacteria. Tripsin
enzyme treatment caused the declining of plantaricin protein concentration, and
plantaricin 2C12 has the highest declining percentage of protein concentration. The
activities of the plantaricin 1A5, 1B1, 2B2, and 2C12 decreased after treatment with
tripsin enzyme. The declining of plantaricin activities were determined by the
inhibition zone as result from antagonistic assay.

Keywords : Bacteriocin, Lactobacillus plantarum, plantaricin, tripsin, antagonistic


assay

iv
KARAKTERISASI PLANTARICIN ASAL EMPAT GALUR
Lactobacillus plantarum BERDASARKAN
SENSITIVITASNYA TERHADAP
ENZIM TRIPSIN

GILANG AYUNINGTYAS
D14070143

Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk


Memperoleh gelar Sarjana Peternakan pada
Fakultas Peternakan
Institut Pertanian Bogor

DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN


FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2012

v
Judul : Karakterisasi Plantaricin Asal Empat Galur Lactobacillus
plantarum Berdasarkan Sensitivitasnya terhadap Enzim
Tripsin
Nama : Gilang Ayuningtyas
NIM : D14070143

Menyetujui,

PembimbingUtama, PembimbingAnggota,

(Dr. Irma Isnafia Arief, S.Pt., M.Si.) (Tuti Suryati, S.Pt., M.Si.)
NIP: 19750304 199903 2 001 NIP: 19720516 199702 2 001

Mengetahui:
Ketua Departemen
Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan

(Prof. Dr. Ir. Cece Sumantri, M.Agr.Sc.


NIP: 19591212 198603 1 004

Tanggal Ujian : 2 Februari 2012 Tanggal Lulus :

vi
RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan pada tanggal 7 November 1988 di Bogor, Jawa Barat.


Penulis merupakan anak kedua dari tiga bersaudara dari pasangan Drs. Ade Sutisna,
M.MPd. dan Lelih Sondari. Riwayat pendidikan penulis dimulai pada tahun 1995 di
Sekolah Dasar Negeri Panaragan 1 Bogor dan diselesaikan pada tahun 2001.
Pendidikan dilanjutkan di Sekolah Menengah Pertama Negeri 4 Bogor dari tahun
2001 hingga 2004, dan Sekolah Menengah Atas Negeri 5 Bogor dari tahun 2004 dan
selesai pada tahun 2007.
Penulis diterima di Institut Pertanian Bogor pada tahun 2007 melalui jalur
Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) dan ditempatkan di Departemen Ilmu
Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan. Penulis aktif dalam
organisasi Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Peternakan pada dua periode
2008-2009 dan 2009-2010, serta kepanitiaan kegiatan kampus lainnya. Selama
mengikuti pendidikan, penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Teknik
Pengolahan Daging, Teknik Pengolahan Susu, serta Metodelogi Penelitian dan
Rancangan Percobaan. Penulis berkesempatan menjadi penerima beasiswa BBM
(Bantuan Belajar Mahasiswa) dan PPA (Peningkatan Prestasi Akademik) selama tiga
tahun pendidikannya di IPB, serta menerima Beasiswa Unggulan Kementrian
Pendidikan Nasional Republik Indonesia pada tahun 2011.
Penulis pernah mengikuti kegiatan Program Kreativitas Mahasiswa bidang
penelitian tahun 2010-2011 dengan judul “Aplikasi Bakteriosin Sebagai
Preservatif Alami pada Produk Bakso untuk Meningkatkan Keamanan Pangan
Produk Olahan Daging” dan berhasil didanai. Penelitian tersebut juga
mengantarkan penulis untuk mengikuti The 18th Tri-University International Joint
Seminar and Symposium 2011 di Jiangsu University, China. Penulis melakukan
penelitian dan penulisan skripsi yang berjudul “Karakterisasi Plantaricin Asal
Empat Galur Lactobacillus plantarum Berdasarkan Sensitivitasnya terhadap
Enzim Tripsin” guna memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana
pada Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.

vii
KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur bagi Allah SWT pencipta alam raya, yang berkat
rahmat dan karunia-Nya sehingga akhirnya penulisan skripsi ini dapat terselesaikan
dengan baik. Shalawat dan salam semoga selalu tersampaikan pada Nabi Muhammad
SAW. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada seluruh pihak yang telah
memberi dukungan dalam penyelesaian penelitian tugas akhir dan skripsi yang
berjudul “Karakterisasi Plantaricin Asal Empat Galur Lactobacillus plantarum
Berdasarkan Sensitivitasnya terhadap Enzim Tripsin”. Penulisan skripsi ini
dilakukan guna memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Peternakan
pada Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.
Semakin meningkatnya permintaan akan pangan sehat bebas bahan pengawet
sintetis menjadikan peran preservative biologis semakin dibutuhkan. Bakteriosin
merupakan salah satu senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat
(BAL), berupa peptida atau komplek peptida aktif. Banyak negara telah
menggunakan bakteriosin sebagai agen pengawet pangan alami, karena
kemampuannya dalam menghambat bakteri patogen dan pembusuk makanan.
Semenjak diketahui bahwa komponen utama dalam bakteriosin adalah peptida, maka
kriteria utama dalam karakterisasi bakteriosin adalah sensitivitasnya terhadap
protease. Penelitian ini dilakukan untuk mengkaji lebih lanjut mengenai karakterisasi
dari bakteriosin yang dihasilkan oleh Lactobacillus plantarum (plantaricin) terhadap
enzim proteolitik yaitu tripsin. Hasil yang diperoleh pada penelitian ini diharapkan
dapat memberikan informasi mengenai karakteristik plantaricin 1A5, 1B1, 2B2, dan
2C12 terhadap enzim tripsin. Disamping itu, dapat memberikan informasi plantaricin
mana yang memiliki sensitivitas tertinggi terhadap enzim tripsin, sehingga nantinya
akan lebih direkomendasikan untuk digunakan dalam aplikasi pengolahan pangan.
Penulis berharap agar skripsi ini dapat bermanfaat bagi para pembaca dan
seluruh pihak, serta dapat digunakan sebagai penambah ilmu pengetahuan bagi ranah
pangan pada umumnya, dan ranah mikrobiologi pada khususnya.

Bogor, Januari 2012

Penulis
DAFTAR ISI

Halaman
RINGKASAN ...................................................................................... ii
ABSTRACT ......................................................................................... iv
LEMBAR PERNYATAAN ................................................................ v
LEMBAR PENGESAHAN ................................................................. vi
RIWAYAT HIDUP .............................................................................. vii
KATA PENGANTAR ......................................................................... viii
DAFTAR ISI ........................................................................................ ix
DAFTAR TABEL ................................................................................ xi
DAFTAR GAMBAR ........................................................................... xii
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................ xiii
PENDAHULUAN ............................................................................... 1
Latar Belakang ......................................................................... 1
Tujuan ...................................................................................... 2
TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................... 3
Bakteri Asam Laktat ............................................................... 3
Lactobacillus ................................................................ 4
Lactobacillus plantarum ............................................... 5
Antimikrob ............................................................................... 5
Bakteriosin ............................................................................... 6
Purifikasi Bakteriosin .............................................................. 8
Mekanisme Penghambatan Senyawa Antimikrob ................... 10
Bakteri Patogen ......................................................................... 11
Pseudomonas ................................................................ 12
Staphylococcus aureus .................................................. 13
Bacillus cereus .............................................................. 14
Salmonella typhimurium .............................................. 15
Escherichia coli ............................................................ 16
Enzim Protease ......................................................................... 17
MATERI DAN METODE ................................................................... 18
Lokasi dan Waktu .................................................................... 18
Materi ....................................................................................... 18
Prosedur ................................................................................... 18
Pewarnaan Gram .......................................................... 18
Uji Antagonistik Supernatan Bebas Sel Netral ............ 19
Purifikasi Parsial .......................................................... 19
Dialisis ......................................................................... 21

ix
Purifikasi Kromatografi Pertukaran Kation ................. 21
Sensitifitas terhadap Enzim Proteolitik ........................ 22
Uji Antagonistik Plantaricin ....................................... 22
Rancangan dan Analisis Data .................................................... 23
HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................ 26
Karakteristik Galur L.plantarum dan Bakteri Indikator .......... 26
Produksi Plantaricin ................................................................. 30
Uji Antagonistik Supernatan Bebas Sel Netral ............ 31
Purifikasi Plantaricin ................................................... 32
Karakterisasi Plantaricin 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 .............. 35
Sensitivitas Plantaricin Murni terhadap Enzim
Proteolitik ..................................................................... 35
Uji Antagonistik Plantaricin Murni terhadap Bakteri
Indikator ....................................................................... 37
KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................ 47
Kesimpulan .............................................................................. 47
Saran ........................................................................................ 47
UCAPAN TERIMA KASIH ................................................................ 48
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................... 49
LAMPIRAN ......................................................................................... 54

x
DAFTAR TABEL

Nomor Halaman

1. Kategori Aktivitas Antimikrob ............................................................ 11


2. Penggunaan Padatan Amonium Sulfat (Penjenuhan) .......................... 20
3. Karakteristik BAL Lactobacillus plantarum 1A5, 1B1, 2B2, 2C12,
dan Bakteri Indikator ........................................................................... 27
4. Kondisi pH Supernatan Bebas Sel Asal Empat Galur Lactobacillus
plantarum pada Media MRS broth dengan Inducer Yeast Extract
(YE) 3% ............................................................................................... 30
5. Diameter Zona Hambat Supernatan Netral Asal Empat Galur
Lactobacillus plantarum terhadap Bakteri Indikator .......................... 31
6. Diamater Zona Hambat Plantaricin Asal Empat Galur Lactobacillus
plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 .............................................. 37

7. Diamater Zona Hambat Plantaricin Asal Empat Galur Lactobacillus


plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri
Bacillus cereus ..................................................................................... 39
8. Diamater Zona Hambat Plantaricin Asal Empat Galur Lactobacillus
plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri
Staphylococcus aureus ATCC 25923 ................................................... 41
9. Diamater Zona Hambat Plantaricin Asal Empat Galur Lactobacillus
plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri
Escherichia coli ATCC 25922 ............................................................. 43
10. Diamater Zona Hambat Plantaricin Asal Empat Galur Lactobacillus
plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri
Salmonella enteritidis ser. Thpimurium ATCC 14028 ....................... 44

xi
DAFTAR GAMBAR

Nomor Halaman
1. Bakteri Pseudomonas ........................................................................ 13

2. Bakteri Staphylococcus aureus ............................................................ 14


3. Bakteri Bacillus cereus ........................................................................
15
4. Bakteri Salmonella typhimurium ......................................................... 16
5. Bakteri Escherichia coli ...................................................................... 16
6. Metode Pengukuran Zona Hambat ...................................................... 23
7. Morfologi dan Hasil Pewarnaan Gram Bakteri Lactobacillus
plantarum …………………………………………………………… 28
8. Morfologi dan Hasil Pewarnaan Gram Bakteri Indikator ………… 29
9. Histogram Konsentrasi Protein Plantaricin Asal Empat Galur
Lactobacillus plantrum pada Tahap Proses Purifikasi Plantaricin ..... 34
10. Histogram Konsentrasi Protein Plantaricin Asal Empat Galur
Lactobacillus plantarum yang Diberi Perlakuan Enzim Tripsin 35
11. Histogram Persentase (%) Penurunan Konsentrasi Protein
Plantaricin Murni setelah Didegradasi Enzim Tripsin ……………... 37
12. Histogram Activity Unit Plantaricin Asal Empat Galur Lactobacillus
plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ………………..................... 39

13. Histogram Activity Unit Plantaricin Asal Empat Galur Lactobacillus


plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri
Bacillus cereus ……………………………………………………….. 40

14. Histogram Activity Unit Plantaricin Asal Empat Galur Lactobacillus


plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri
Staphylococcus aureus ATCC 25923 ................................................... 42

15. Histogram Activity Unit Plantaricin Asal Empat Galur Lactobacillus


plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri
Escherichia coli ATCC 25922 …………………………………........ 43

16. Histogram Activity Unit Plantaricin Asal Empat Galur Lactobacillus


plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri
Salmonella enteritidis ser. Thypimurium ATCC 14028 ……………. 45

xii
DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Halaman
1. Hasil Sidik Ragam Persentase Penurunan Protein Plantaricin Asal
Empat Galur Lactobacillus plantarum Setelah Didegradasi Enzim
Tripsin................................................................................................... 55
2. Hasil Sidik Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin Asal Empat
Galur Lactobacillus plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin
terhadap Bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 .................. 55
3. Uji Tukey Diameter Zona Hambat Plantaricin Asal Empat Galur
Lactobacillus plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap
Bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ............................... 55
4. Hasil Sidik Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin Asal Empat
Galur Lactobacillus plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin
terhadap Bakteri Bacillus cereus ......................................................... 56
5. Uji Tukey Diameter Zona Hambat Plantaricin Asal Empat Galur
Lactobacillus plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap
Bakteri Bacillus cereus ........................................................................ 56
6. Hasil Sidik Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin Asal Empat
Galur Lactobacillus plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin
terhadap Bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 ...................... 56
7. Uji Tukey Diameter Zona Hambat Plantaricin Asal Empat Galur
Lactobacillus plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap
Bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 ..................................... 57
8. Hasil Sidik Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin Asal Empat
Galur Lactobacillus plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin
terhadap Bakteri Escherichia coli ATCC 25922 .................................. 57
9. Hasil Uji Kruskal-Wallis Zona Hambat Plantaricin yang Diberi
Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri Salmonella enteritidis ser.
Thypimurium ATCC 14028 ................................................................ 57
10. Uji All-Pairwise Comparisons Kruskal-Wallis Zona Hambat
Plantaricin yang Diberi Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri
Salmonella enteritidis ser. Thypimurium ATCC 14028 ..................... 58
11. Hasil Uji Kruskal-Wallis Zona Hambat Plantaricin yang Berasal dari
Galur Lactobacillus plantarum yang berbeda terhadap Bakteri
Salmonella enteritidis ser. Thypimurium ATCC 14028 ..................... 58
12. Tahapan Pembuatan Buffer Potassium Phosphate 0,1 M ................... 58
13. Pembuatan buffer tris hidroklorida (Tris HCl) 0,05 M ....................... 59

xiii
14. Dosis Penggunaan Enzim Tripsin ....................................................... 60
15. Gambar Zona Hambat Plantaricin terhadap Berbagai Bakteri
Indikator .............................................................................................. 60
16. Gambar Zona Hambat Supernatan Antimikrob Netral pada Uji
Aktivitas Antimikrob Awal ................................................................. 61
17. Gambar Proses Purifikasi Plantaricin 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 ...... 61
18. Gambar Presipitat Plantaricin¸ Plantaricin Kasar, dan Plantaricin
Murni ................................................................................................... 61

xiv
PENDAHULUAN

Latar Belakang
Penggunaan bakteri asam laktat (BAL) dalam industri pangan telah
diaplikasikan sejak lama, khususnya sebagai kultur starter untuk produk-produk
pangan fermentasi. Bakteri asam laktat memiliki peran yang penting pada
pengolahan pangan. Hal tersebut dikarenakan BAL dapat memberikan karakteristik
yang diinginkan pada produk pangan fermentasi dan juga dapat meningkatkan
kesehatan masyarakat yang mengkonsumsi produk-produk fermentasi, melalui
perannya sebagai faktor pertahanan alami melawan kolonisasi bakteri-bakteri
patogen didalam usus.
Selama proses fermentasi bakteri asam laktat memproduksi berbagai
substansi antimikrob yaitu, asam organik, hidrogen peroksida, bakteriosin dan
substansi seperti bakteriosin. Bakteriosin merupakan peptida yang dihasilkan dari
metabolisme anaerobik bakteri asam laktat (BAL) baik Gram positif maupun Gram
negatif. Bakteriosin memiliki aktivitas antimikrob terhadap mikroorganisme yang
memiliki kedekatan secara filogenik dengan mikroorganisme penghasil bakteriosin
tersebut.
Penggunaan bakteri asam laktat juga diharapkan dapat diaplikasikan sebagai
agen pengawet pangan alami atau food biopreservation agent untuk mencegah
kerusakan pangan akibat keberadaan bakteri patogen dan bakteri pembusuk
makanan. Hal tersebut karena pada kondisi saat ini permintaan akan produk pangan
alami bebas bahan pengawet kimia semakin meningkat. Bakteriosin merupakan
senyawa antimikrob yang aman untuk dikosumsi karena substansi utama dalam
bakteriosin adalah peptida yang dapat didegradasi oleh enzim proteolitik, dan tidak
membahayakan bagi mikroflora usus. Berdasarkan hal tersebut, bakteriosin
berpotensi sebagai bahan pengawet pangan alami, dan berpotensi untuk mengganti-
kan penggunaan antibiotik.
Keberagaman dan ketersediaan BAL yang cukup tinggi dapat dimanfaatkan
untuk peningkatan produksi bakteriosin. Salah satu spesies BAL yang secara alami
terdapat dalam daging sapi adalah Lactobacillus plantarum. Lactobacillus plantarum
menghasilkan bakteriosin yang dikenal dengan plantaricin. Penelitian sebelumnya
(Arief et al., 2008) menemukan bahwa isolat indigenus Lactobacillus plantarum

1
2C12, 1A5,1B1, dan 2B2 yang diisolasi dari daging sapi lokal Indonesia
menghasilkan suatu senyawa antimikrob sebagai bakteriosin. Bakteriosin yang
berasal dari berbagai galur Lactobacillus plantarum dapat memiliki karakteristik dan
spektrum penghambatan yang berbeda-beda.
Plantaricin diperoleh melalui proses yang disebut purifikasi, yaitu me-
misahkan plantaricin dari sel bakteri Lactobacillus plantarum dan dari komponen
antimikrob lainnya yang dihasilkan sel bakteri pada proses fermentasi. Plantaricin
sebagai substansi proteinaceous harus sensitif paling tidak terhadap satu jenis enzim
proteolitik (Moreno et al., 2000), oleh karena itu sensitivitas plantaricin terhadap
enzim proteolitik merupakan kriteria utama dalam karakterisasi plantaricin. Enzim
proteolitik yang digunakan untuk melakukan karakterisasi plantaricin adalah enzim
tripsin. Pengujian sensitivitas plantaricin terhadap enzim proteolitik pun perlu
dilakukan untuk menunjukkan bahwa plantaricin akan terdegradasi di dalam saluran
pencernaan manusia, tempat terjadi proses proteolisis oleh enzim tripsin. Penelitian
ini dimaksudkan untuk mengkarakterisasi plantaricin dari empat galur Lactobacillus
plantarum terhadap degradasi enzim tripsin. Karakterisasi dilakukan melalui
pengukuran konsentrasi protein yang terkandung di dalam plantaricin sebelum dan
setelah didegradasi oleh enzim tripsin, serta melalui uji antagonistik plantaricin yang
diberi perlakuan enzim tripsin dengan bakteri indikator yaitu bakteri patogen dan
bakteri pembusuk makanan.

Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari karakteristik plantaricin yang
diproduksi oleh bakteri asam laktat Lactobacillus plantarum 1A5, 1B1, 2B2, dan
2C12 terhadap degradasi enzim tripsin. Karakterisasi plantaricin tersebut diuji
melalui sensitivitasnya terhadap enzim tripsin sebagai salah satu kriteria plantaricin
dapat digunakan sebagai bahan pengawet pangan yang aman.

2
TINJAUAN PUSTAKA

Bakteri Asam Laktat


Bakteri asam laktat secara umum termasuk dalam bakteri Gram positif, tidak
berspora, berbentuk bulat maupun batang, dan menghasilkan asam laktat sebagai
mayoritas produk akhir selama memfermentasi karbohidrat (Axelsson, 2004). Grup
bakteri yang termasuk bakteri asam laktat adalah spesies yang berasal dari genus
Lactococcus, Steptococcus (hanya satu spesies), Enterococcus, Pediococcus,
Tetragenococcus, Aerococcus, Alloiococcus, Oenococcus, Vagococcus, Lactospera,
Leuconostoc, Weisella, Lactobacillus, Dolosigranulum, Globicatella, dan Carno-
bacterium (Ray dan Bhunia, 2007). Saat ini hanya beberapa spesies dari Lacto-
coccus, Lactobacillus, Leuconostoc, dan Pediococcus yang digunakan dalam proses
fermentasi pangan, dan beberapa spesies dari Lactobacillus serta Bifidobacterium
memiliki efek yang menguntungkan bagi kesehatan dan bagi saluran pencernaan
(Ray and Miller, 2003).
Sifat yang terpenting dari bakteri asam laktat adalah kemampuannya untuk
memfermentasi gula menjadi asam laktat. Sifat ini penting dalam pembuatan produk-
produk fermentasi seperti fermentasi sayur-sayuran, fermentasi susu, dan fermentasi
ikan (Fardiaz, 1989a). Hal penting lainnya dari karakteristik bakteri asam laktat
adalah kemampuannya untuk memproduksi bermacam-macam metabolit antimikrob,
diantaranya asam organik, hidrogen peroksida, karbon dioksida, dan bakteriosin,
yang dapat mengambat bakteri patogen dan bakteri pembusuk, memperpanjang masa
simpan produk pangan, serta meningkatkan keamanan produk pangan (Jeevaratnam
et al., 2005). Beberapa dari agen antimikrob telah diketahui karakteristiknya, tapi
beberapa masih diidentifikasi (Ray and Miller, 2003).
Bakteri asam laktat dapat dibedakan atas dua kelompok berdasarkan tipe
fermentasinya yaitu organisme yang bersifat homofermentatif, dan heterofermentatif.
Pada kelompok homofermentatif, glukosa difermentasi menghasilkan asam laktat
sebagai satu-satunya produk. Grup bakteri asam laktat heterofermentatif selain
menghasilkan asam laktat juga memproduksi senyawa-senyawa lainnya yaitu etanol,
CO2, asam asetat (Rahman et al., 1992). Strepstococcus, Pediococcus, dan beberapa
spesies Lactobacillus bersifat homofermentatif, sedangkan Leuconostoc dan spesies
Lactobacillus lainnya bersifat heterofermentatif (Fardiaz, 1989a).

3
Bakteri asam laktat juga disebut sebagai biopreservatif karena berkontribusi
dalam menghambat pertumbuhan bakteri lainnya khususnya patogen dan mampu
membawa dampak positif bagi kesehatan manusia (Smid dan Gorris, 2007).
Preservatif yang dilakukan oleh bakeri asam laktat disebabkan oleh asam laktat yang
dihasilkan oleh bakteri tersebut selama fermentasi pangan akan menurunkan nilai pH
dari lingkungan pertumbuhannya dan menimbulkan rasa asam, hal ini juga
menghambat pertumbuhan dari beberapa jenis mikroorganisme lainnya (Buckle et al.
1987). Beberapa strain bakteri asam laktat berkontribusi dalam pengawetan pangan
karena kemampuannya memproduksi bakteriosin (Savadogo et al., 2004). Kemam-
puan bakteriosin dalam melakukan aktivitas sebagai biopresevatif dicapai oleh efek
penghambatannya terhadap mikroorganisme patogen yang berbahaya (Savadogo et
al., 2006).

Lactobacillus
Lactobacillus merupakan bakteri berbentuk batang, Gram positif dan sering
membentuk pasangan dan rantai dari sel-selnya (Buckle et al., 1987). Bakteri ini
tidak menghasilkan spora, anaerob fakultatif, katalase negatif, bakteri ini menyerupai
Streptococcus dalam kebutuhan nutriennya (Fardiaz, 1989b), umunya tidak bergerak,
koloninya dalam media agar berukuran 2-5 mm, konfeks, opak, sedikit transparan,
dan tidak berpigmen (Holt et al., 1994). Lactobacillus umumnya lebih tahan terhadap
keadaan asam daripada jenis-jenis Pediococcus atau Streptococcus, oleh karenanya
menjadi lebih banyak terdapat pada tahapan terakhir dari fermentasi tipe asam laktat
(Buckle et al., 1987). Spesies dalam genus Lactobacillus banyak yang bersifat
termodurik, yaitu tahan suhu pasteurisasi dan sering ditemukan pada makanan,
misalnya pada permukaan sayuran, pada susu serta produk-produk susu (Fardiaz,
1989b), dan ditemukan pada pangan asal hewan (Holt et al., 1994). Ray dan Bhunia
(2007) menyebutkan bahwa, suhu pertumbuhan dari Lactobacillus bervariasi dari
1oC hingga 50 oC, namun kebanyakan spesies yang digunakan sebagai kultur starter
pada fermentasi terkontrol produk pangan, tumbuh dengan baik pada suhu 25oC
hingga 40 oC.

4
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus plantarum termasuk bakteri dalam filum Firmicutes, kelas
Bacilli, ordo Lactobacillales, famili Lactobacillaceae dan genus Lactobacillus.
Lactobacillus plantarum mempunyai kemampuan untuk menghambat
mikroorganisme patogen pada bahan pangan dengan daerah penghambatan tersbesar
dibandingkan dengan bakteri asam laktat lainnya (Jenie dan Rini, 1995).
Lactobacillus plantarum 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 merupakan isolat indigenus yang
diisolasi dari daging sapi lokal Indonesia yang dijual di tiga pasar yang berbeda di
Bogor. Karakteristik morfologi keempat galur Lactobacillus plantarum tersebut
adalah berbentuk batang, susunan tunggal maupun susunan rantai pendek. Hasil
pewarnaan Gram menunjukkan bahwa bakteri tersebut adalah bakteri Gram positif,
serta hasil uji katalasenya menunjukkan negatif (Firmansyah, 2009). Arief et al.
(2011) melaporkan bahwa suatu senyawa antimikrob diproduksi oleh bakteri asam
laktat Lactobacillus plantarum 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12, yang diisolasi dari daging
sapi lokal. Senyawa antimikrob tersebut dapat menghambat pertumbuhan bakteri
patogen Escherichia coli enterotoksigenik (ETEC) ATCC 25922, Escherichia coli
enteropatogenik (EPEC) K11, Salmonella typhimurium ATCC 14028 dan
Staphylococcus aureus ATCC 25923.

Antimikrob
Antimikrob adalah sifat suatu senyawa kimia atau biologi yang dapat
membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Makanan mungkin
mengandung komponen yang dapat menghambat pertumbuhan jasad renik.
Komponen antimikrob tersebut terdapat dalam makanan melalui salah satu dari
beberapa cara yaitu, terdapat secara alamiah di dalam bahan pangan, ditambahkan
dengan sengaja ke dalam makanan, terbentuk selama pengolahan atau jasad renik
yang tumbuh selama fermentasi makanan. Senyawa antimikrob dapat bersifat
bakterisidal (membunuh bakteri), bakteristatik (menghambat pertumbuhan bakteri),
fungisidal (membunuh kapang), fungistatik (menghambat pertumbuhan kapang), dan
germisidal (menghambat germinasi spora bakteri) (Fardiaz, 1989a).
Zat antimikrob asal bakteri asam laktat berfungsi sebagai suatu preservatif
alami. Suatu preservatif pangan yang alami yang memenuhi kriteria-kriteria sebagai
berikut yaitu, tingkat toksisitas yang rendah, stabil terhadap proses pengolahan

5
pangan dan selama penyimpanan pangan, mampu menghambat pada konsentrasi
yang rendah, dan economic viability (Jeevaratnam et al., 2005). Kemampuan suatu
zat antimikrob dalam menghambat pertumbuhan mikroba dipengaruhi oleh beberapa
faktor, antara lain konsentrasi zat pengawet, waktu penyimpanan, suhu lingkungan,
sifat-sifat mikroba (jenis, konsentrasi, umur, dan keadaan mikroba), sifat-sifat fisik
dan kimia makanan, termasuk kadar air, pH, jenis dan jumlah senyawa di dalamnya
(Davidson dan Branen, 1993). Karakteristik bakteri asam laktat adalah
kemampuannya untuk memproduksi bermacam-macam metabolit antimikrob.
Antimikrob ini mampu menghambat dan membunuh mikroorganisme yang menjadi
target seperti khamir, kapang, bakteri vegetatif, spora bakteri, dan bahkan virus.
Spektrum dari aktivitas antimikrob bervariasi berdasarkan metabolit spesifiknya
(Ray and Miller, 2003).

Bakteriosin
Bakteriosin merupakan salah satu senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh
bakteri asam laktat. Bakteriosin didefinisikan sebagai peptida-peptida aktif atau
kompleks peptida yang disintesis di ribosom, serta memiliki aktivitas bakteriostatik
dan bakterisidal (Jeevaratnam et al., 2005). Aktivitas bakterisidal dan bakteriostatik
pada banyak kasus, dilakukan terhadap bakteri yang memiliki kedekatan secara
filogenik dengan bakteri penghasil bakteriosin tersebut. Beberapa bakteriosin yang
berasal dari bakteri Gram positif, memiliki spektrum penghambatan yang cukup luas,
dan dapat digunakan sebagai antibakterial agen untuk berbagai aplikasi pengolahan
pangan (Hata et al., 2010).
Karakter lainnya dari bakteriosin adalah bakteriosin tahan panas atau heat
stable dan agak stabil pada penyimpanan dingin serta beku. Efek bakterisidal
bakteriosin terjadi terhadap sel yang sensitif, dan kematian terjadi secara cepat pada
konsentrasi yang rendah. Karakteristik peptida bakteriosin adalah peptida hidropobik
dan kationik, serta muatan positifnya akan lebih tinggi pada kondisi pH rendah.
Peptida bakteriosin merupakan peptida ribosomal, amfipatik, dan mempunyai
struktur α-helical atau β-sheet, atau keduanya, serta dapat juga mempunyai tioeter,
jembatan disulfida, atau kelompok tiol bebas. Umumnya bakteriosin memiliki kurang
dari 60 jenis asam amino, namun efisiensi aksi bakterisidalnya tidak bergantung pada
banyaknya asam amino yang terkandung dalam bakteriosin tersebut. Enzim

6
proteolitik yang berbeda dapat menghidrolisis peptidanya, menyebabkan hilangnya
keefektifan dari bakteriosin (Ray dan Bhunia, 2007).
Saat ini penggunaan bakteri asam laktat sebagai penghasil bakteriosin di
bidang peternakan semakin bertambah luas, diantaranya sebagai biopreservatif
(Wiryawan dan Tjakradidjaja, 2001). Bakteriosin dari bakteri asam laktat telah
menjadi perhatian penting karena potensinya untuk digunakan sebagai bahan
tambahan makanan yang aman sebagai preservatif alami dan non-toxic, serta
mencegah terjadinya kebusukan pangan oleh bakteri patogen Gram positif (Hata et
al., 2010).
Bakteriosin berakumulasi di dalam media kultur selama fase pertumbuhan
eksponensial hingga fase pertumbuhan stasioner (Vuyst dan Vandamme, 1994).
Menurut Driber et al. (2006), pada awal fase stasioner bakteri asam laktat mengalami
modifikasi enzimatis pada proses pascatranslasi yang akan mengubah prebakteriosin
menjadi bakteriosin yang aktif. Inkubasi yang terlalu lama menyebabkan aktivitas
bakteriosin menurun, hal ini karena pengaruh inaktivator bakteriosin yang spesifik
atau sifat reabsorpsi bakteriosin oleh sel produsen. Jika waktu inkubasi diperpanjang
maka aktivitas bakteriosin menurun karena terbebasnya protease dari sel autolisis,
bakteriosin juga merupakan molekul proteaneus sehingga molekulnya mudah
terdegradasi (Jo et al., 1996). Produksi bakteriosin dipengaruhi oleh tipe dan level
karbon, sumber nitrogen dan fosfat, surfaktan kation dan penghambat (Savadogo et
al., 2006).
Bakteriosin asal bakteri asam laktat dibagi kedalam empat kelas yang berbeda
yaitu kelas I, kelas II, kelas III, dan kelas IV. Kelas I adalah lantibiotik, sedangkan
kelas II adalah peptida berukuran kecil sifatnya relatif stabil terhadap panas dan tidak
mengandung lanthionine pada peptidanya. Bakteriosin kelas III adalah peptida
berukuran besar yang labil terhadap panas (Yamato et al., 2003), dan kelas IV
merupakan bakteriosin kompleks yang membutuhkan karbohidrat dan separuh lipid
untuk mencapai aktivitas antimikrobial (Jeevaratnam et al., 2005). Kelas I dan II
merupakan kelas-kelas utama dari bakteriosin yang mempunyai potensi untuk
digunakan di dalam aplikasi komersial. Bakteriosin yang diproduksi oleh
Lactobacillus plantarum dikenal dengan nama plantaricin (Omar et al., 2006).

7
Contoh bakteriosin yang berasal dari kelas I adalah nisin yang diproduksi
oleh Lactocoocus lactis subsp. Lactis. Kelas I dibagi menjadi Ia dan Ib. Kelas Ia
termasuk nisin didalamnya terdiri dari peptida hidrofobik dan kationik yang dapat
membentuk pori di membran sel targetnya, serta memiliki struktur yang lebih
fleksibel dibandingkan dengan bakteriosin kelas Ib. Bakteriosin kelas Ib merupakan
peptida globular, bermuatan negatif atau sama sekali tidak bermuatan (Altena et al.,
2000). Bakteriosin kelas II dibedakan menjadi kelas IIa dan IIb. Peptida-peptida
bakteriosin kelas IIa aktif dalam menghambat Listeria. Bakteriosin kelas IIb
mengandung dua peptida yang berbeda, dan membutuhkan kedua peptida ini untuk
aktivitas antimikrobial yang optimal (Cleveland et al., 2001).
Penggunaan bakteriosin sebagai biopreservative memiliki beberapa keun-
tungan, yaitu 1) tidak toksik dan mudah mengalami biodegradasi karena merupakan
senyawa protein, 2) tidak membahayakan mikroflora usus karena mudah dicerna oleh
enzim-enzim dalam saluran pencernaan, 3) aman bagi lingkungan dan dapat
mengurangi penggunaan bahan kimia sebagai bahan pengawet, serta 4) dapat
digunakan dalam kultur bakteri unggul yang mampu menghasilkan senyawa
antimikrob terhadap bakteri patogen atau dapat digunakan dalam bentuk senyawa
antimikrob yang telah dimurnikan (Nurliana, 1997).
Bakteriosin diproduksi oleh bakteri asam laktat Gram positif maupun Gram
negatif. Strain bakteri yang berbeda bahkan spesies bakteri yang berbeda dapat
memproduksi bakteriosin yang sama (Ray and Miller, 2003). Beberapa strain pada
spesies yang sama dapat memproduksi bakteriosin yang sama dan dapat pula yang
berbeda, namun diketahui juga bahwa satu strain bakteri dapat memproduksi lebih
dari satu bakteriosin (Ray dan Bhunia, 2007).

Purifikasi Bakteriosin
Metode yang digunakan untuk purifikasi bakteriosin adalah metode purifikasi
protein. Umumnya purifikasi protein membutuhkan prosedur isolasi, yaitu
memisahkan protein dari makromolekul yang lain atau memisahkan protein dengan
sifat tertentu dari protein lain yang tidak diinginkan dalam analisis. Metode yang
biasa digunakan untuk tahap awal isolasi adalah metode yang memiliki daya pemisah
terendah seperti pengendapan dengan ammonium sulfat (Englard dan Seifter, 1990).
Presipitasi adalah suatu metode menggunakan penambahan reagen yang menye-

8
babkan protein meninggalkan larutan dan membentuk partikel tidak larut dalam
endapan (Tokuyasu et al. 1996). Proses pengendapan protein dengan garam
ammonium sulfat dapat dikelompokan menjadi dua bagian yaitu salting in dan
salting out. Englard dan Seifter (1990) menyatakan pada konsentrasi garam
ammonium sulfat yang tinggi, garam dapat lebih mengikat molekul air. Menurunya
jumlah air yang terikat pada protein menyebabkan gaya tarik menarik antara molekul
protein lebih kuat dibandingkan dengan gaya tarik menarik antara molekul protein
dengan air (mempertinggi interaksi hidrofobik), sehingga protein akan mengendap
dari larutan atau berikatan dengan kolom hidrofobik. Proses pengendapan harus
dilakukan dalam kondisi dingin sehingga protein akan mengendap tanpa mengalami
denaturasi. Keuntungan menggunakan garam ammonium sulfat karena mempunyai
kelarutan tinggi, pH moderat, relatif lebih murah, non toksik, dan tidak
mempengaruhi enzim (Tokuyasu et al., 1996). Proses pengendapan ini mempunyai
dua tujuan yaitu sebagai awal proses pemurnian dan meningkatkan konsentrasi
protein (Day dan Underwood, 2002).
Rangkaian metode isolasi protein berikutnya adalah dialisis. Dialisis
merupakan metode pemisahan molekul kecil dan molekul besar dengan gaya difusi
selektif melalui membran semiparmiabel. Sampel yang mengandung protein
umumnya mengandung komponen yang tidak diinginkan seperti garam ammonium
sulfat yang merupakan garam dari proses pengendapan protein (He et al., 1995).
Metode isolasi protein lainnya adalah kromatografi kolo. Kromatografi merupakan
suatu metode pemisahan fisik, dimana komponen-komponen yang dipisahkan
didistribusikan di antara dua fasa, salah satu fasa tersebut adalah suatu lapisan
stasioner dengan permukaan yang luas, yang lainnya sebagai fluida yang mengalir
lembut di sepanjang landasan stasioner. Kromatografi pertukaran ion terdiri atas
landasan stasioner berupa padatan dan fasa bergerak berupa cairan (Day dan
Underwood, 2002). Pemisahan komponen secara kromatografi kolom dilakukan
dalam suatu kolom yang diisi dengan fase stasioner dan cairan (pereaksi) sebagai
fase mobil untuk mengetahui banyaknya komponen contoh yang keluar melalui
kolom (Adnan, 1997).

9
Mekanisme Penghambatan Senyawa Antimikrob
Mekanisme aktivitas penghambatan oleh senyawa antimikrob dipengaruhi
oleh struktur dan komposisi sel mikroorganisme target. Terdapat beberapa
mekanisme, diantaranya kerusakan pada dinding sel, perubahan permeabilitas sel,
perubahan molekul protein dan asam nukleat, penghambatan kerja enzim, serta
penghambatan sintesis asam nukleat dan protein (Dwidjoseputro, 1990). Aksi
penghambatan bakteriosin terhadap bakteri yang sensitif terjadi secara cepat pada
konsentrasi yang rendah, serta efisiensis bakterisidalnya akan meningkat pada
kondisi pH yang asam, dan pada temperatur yang lebih tinggi. Sel penghasil
bakteriosin akan mengalami ketahanan terhadap bakteriosin yang dihasilkannya
sendiri, disebabkan ketahanan protein yang spesifik. Terdapatnya sebuah struktur
amfipatik α-helical dengan sisi polar dan nonpolar yang berlawanan pada
bakteriosin, membuat bakteriosin dapat berinteraksi dengan kedua fase air dan lipid
ketika terikat dengan permukaan membran sel bakteri yang sensitif, sehingga sel
mengalami destabilisasi fungsional dan sel tersebut mati (Ray dan Bhunia, 2007).
Umumnya bakteri Gram positif lebih sensitif terhadap bakteriosin sedangkan
bakteri Gram negatif resisten terhadap bakteriosin. Hal tersebut dikarenakan
permukaan membran sitoplasma bakteri Gram negatif mengandung molekul
lipopolisakarida (LPS), yang secara normal berperan sebagai pembatas untuk
mencegah terjadinya kontak antara molekul bakteriosin dengan fosfolipid anionik di
membran sitoplasma bagian dalam. Molekul LPS ini juga yang menyebabkan bakteri
Gram negatif tahan terhadap garam empedu. Namun bakteri Gram negatif dapat
menjadi sensitif terhadap bakteriosin apabila mendapat perlakuan fisik maupun
kimia, contohnya dengan memberikan perlakuan tekanan tinggi terhadap sel (Ray
dan Bhunia, 2007).
Aksi penghambatan bakteriosin terutama efek bakterisidal terhadap bakteri
sensitif diawali dengan destabilisasi fungsi membran sitoplasma. Destabilisasi ini
berupa pengingkatan permeabilitas membran, sehingga mengganggu keseimbangan
barier dan dapat mengakibatkan kematian sel (Jack et al., 1995). Molekul bakteriosin
akan menempel di permukaan membran sel bakteri dan akan membentuk pori-pori.
Akibat terbentuknya pori-pori di membran sitoplasma sel bakteri, maka membran
sitoplasma menjadi tidak selektif. Banyak molekul-molekul kecil dan ion-ion yang

10
melewati membran, akibatnya proses metabolisme sel akan terganggu, seperti
penghambatan sintesis ATP dan terganggunya sistem transport sel. Hal tersebut akan
menyebabkan kematian sel dan akhirnya sel akan mengalami lisis.
Reseptor bakteriosin di sel sensitif adalah polimer anionik yaitu asam teikoat
yang hanya dihasilkan oleh bakteri Gram positif. Molekul-molekul kationik dari
bakteriosin akan berinteraksi dengan polimer-polimer anionik dipermukaan membran
sel. Sifat hidrofobik dari bakteriosin juga berpengaruh saat aktivitas penghambatan
bakteri sensitif. Hal ini dikarenakan inaktivasi mikroorganisme oleh bakteriosin
tergantung pada interaksi hidrofobik antara sel-sel bakteri dengan molekul
bakteriosin (Ray dan Miller, 2003). Membran terluar bakteri Gram negatif bersifat
hidrofilik, akibatnya bakteriosin asal bakteri asam laktat tidak efisien dalam
menghambat bakteri Gram negatif (Ray dan Bhunia, 2007). Davis dan Stout (1971),
mengkategorikan aktivitas antimikrob berdasarkan diameter zona hambat yang
dihasilkan pada uji antagonistik seperti tercantum pada Tabel 1 berikut.

Tabel 1. Kategori Aktivitas Antimkirob


Daerah Hambat Kategori
> 6 mm Kuat
3 – 6 mm Baik
0 – 3 mm Lemah
Sumber : Pan et al. (2009)

Bakteri Patogen
Bakteri yang tumbuh dalam bahan pangan terbagi menjadi bakteri pembusuk
yang dapat menyebabkan kerusakan makanan dan bakteri patogen penyebab penyakit
pada manusia. Jumlah bakteri pembusuk umumnya lebih dominan dibandingkan
dengan bakteri patogen (Fardiaz, 1992). Penyakit yang ditularkan melalui makanan
hanya berhubungan dengan sejumlah kecil bakteri patogenik tertentu. Makanan atau
bahan pangan tersebut digunakan sebagai substrat pertumbuhan bakteri patogen.
Bakteri patogen menyebabkan penyakit pada manusia melalui dua cara yaitu infeksi,
dalam kasus ini bakteri patogen berkembang biak dalam alat pencernaan manusia
dan menghasilkan racun sedangkan intoksikasi adalah bakteri patogen menghasilkan
racun dalam bahan pangan dan bahan pangan tersebut dikonsumsi oleh konsumen

11
(Buckle et al.,1987). Beberapa bakteri yang merupakan bakteri patogen diantaranya
adalah famili Enterobacteriaceae yaitu Salmonella, Escherichia. Bakteri patogen
lainnya adalah Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, dan Pseudomonas yang
merupakan jenis bakteri penyebab kebusukan pada makanan atau bakteri pembusuk
(Fardiaz, 1989a).
Bakteri dibedakan menjadi bakteri Gram positif dan Gram negatif
berdasarkan susunan dinding selnya yang mengakibatkan perbedaan dalam sifat-sifat
pewarnaannya (Fardiaz, 1989a). Susunan dinding sel bakteri Gram positif terdiri atas
90% lapisan peptidoglikan dan lapisan tipis lainnya yaitu asam teikoat. Susunan
dinding sel Bakteri Gram negatif terdiri atas 5-20% lapisan peptidoglikan, sedangkan
lapisan lainnya terdiri dari protein, lipopolisakarida dan lipoprotein (Fardiaz, 1989b).
Bakteri Gram positif akan memberikan respon berwarna biru keunguan jika
dilakukan uji pewarnaan Gram, sedangkan bakteri Gram negatif memberikan respon
warna merah (Tortora et al., 2006). Staphylococcus aureus dan Bacillus cereus
merupakan bakteri Gram positif sedangkan Salmonella, Escherichia coli merupakan
bakteri Gram negatif (Buckle et al., 1987).

Pseudomonas
Pseudomonas merupakan salah satu jenis bakteri Gram negatif berbentuk
batang kecil dan dapat bergerak, umumya berflagella polar tunggal dan mempunyai
tipe metabolisme yang bersifat oksidatif. Bakteri ini merupakan penyebab berbagai
jenis kerusakan bahan pangan yang sebagian besar berhubungan dengan kemampuan
spesies ini dalam memproduksi enzim yang dapat memecah baik komponen lemak
maupun protein dari bahan pangan (Buckle et al., 1987). Sifat-sfat Pseudomonas
yang penting mempengaruhi pertumbuhannya pada makanan adalah sebagai berikut :
1. umumnya mendapatkan sumber karbon dari senyawa yang bukan karbohidrat
2. dapat menggunakan senyawa-senyawa sumber nitrogen sederhana
3. kebanyakan spesies tumbuh baik pada suhu rendah, kecuali P.aeruginosa dan
P. fluorescens yang dapat tumbuh pada suhu 37oC
4. memproduksi senyawa-senyawa yang menimbulkan bau busuk
5. dapat mensintesa faktor-faktor pertumbuhan dan vitamin
6. beberapa spesies bersifat proteolitik dan lipolitik, atau pektinolitik
7. pertumbuhan pada kondisi aeribik berjalan cepat, biasanya membentuk lendir

12
8. beberapa spesies memproduksi pigmen, misalnya P. fluorescens mempro-
duksi pigmen flouresein yang bersifat fluorosens dan larut air, P. nigrifaciens
memproduksi pigmen hitam, dan P. aeruginosa memproduksi pigmen
piosianin yang berwarna biru
9. kebanyakan Pseudomonas, kecuali P. syringe, bersifat oksidase positif, dan
akan membentuk warna biru jika ditambah senyawa dimetil-p-fenilenediamin
dihidrokhlorida
10. tidak tahan terhadap panas dan keadaan kering, oleh karena itu mudah
dibunuh dengan proses pemanasan dan pengeringan (Fardiaz, 1989a).

Gambar 1. Pseudomonas (Rehm, 2008)

Staphylococcus aureus
Staphylococcus merupakan bakteri berbentuk bulat yang terdapat dalam
bentuk tunggal, berpasangan, tetrad, atau berkelompok seperti buah anggur.
Staphylococcus aureus memproduksi pigmen berwarna kuning sampai oranye.
Bakteri ini membutuhkan nitrogen organik (asam amino) untuk pertumbuhannya dan
bersifat aerobik fakultatif (Fardiaz, 1989a). Hemolisin merupakan salah satu toksin
penting yang dibentuk oleh . Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif
berbentuk kokus dengan diameter 0,7 - 0,9 m, dan termsuk dalam family
Micrococcaceae. Staphylococcus aureus tahan garam dan tumbuh baik pada medium
yang mengandung 7,5% NaCl, serta dapat memfermentasikan manitol (Fardiaz,
1989b). Suhu pertumbuhan minimum dari Staphylococcus aureus adalah 5-13oC
sedangkan untuk Staphylococcus aureus penghasil enterotoksin lebih tinggi yaitu 10-
19 oC (Fardiaz, 1989a).
Kebanyakan Staphylococcus aureus bersifat patogen dan memproduksi
enterotoksin yang tahan panas, dimana ketahanan panasnya melebihi sel

13
vegetatifnya, dan waktu generasi dari bakteri ini adalah 27-30 menit pada medium
broth (Fardiaz, 1989a). Bakteri ini juga tahan terhadap aktivitas pemecahan oleh
enzim-enzim pencernaan, dan relatif resisten terhadap pengeringan. Selain
enterotoksin, dia juga memproduksi hemolisin (toksin yang dapat merusak dan
memecah sel-sel darah merah). Substrat yang baik untuk pertumbuhan dan produksi
enterotoksin ialah substrat atau makanan yang mengandung protein seperti daging,
ikan, susu dan produk olahannya. Sementara itu keberadaan bakteri Staphylococcus
aureus dan toksin yang dihasilkan pada makanan tidak dapat dideteksi secara visual
karena tidak menimbulkan perubahan yang nyata pada makanan (Syamsir, 2010).
Staphylococcus aureus adalah bakteri patogen utama pada manusia yang
menyebabkan berbagai penyakit secara luas yang berhubungan dengan toxic schock
syndrome sebagai akibat dari keracunan pangan. Uji MSA, uji koagulase, dan uji
clumping factor dapat membedakan Staphylococcus aureus dengan spesies
Staphylococcus lainnya jika hasil uji tersebut positif (Salasia et al., 2005).

Gambar 2 . Staphylococcus aureus (Cook dan Cook, 2008)

Bacillus cereus
Bacillus cereus merupakan bakteri pembentuk spora tergolong dalam famili
Bacillaceae. Bacillus cereus memproduksi spora berbentuk silinder yang tidak
membengkak, selain itu Bacillus cereus memproduksi enzim proteolitk yang sifatnya
menyerupai rennin sehingga dapat menggumpalkan susu (Fardiaz, 1989a). Bakteri
ini adalah Gram positif berbentuk batang, bergerak, dan dapat membentuk spora,
bersifat anaerobik fakultatif dan tersebar secara luas dalam tanah dan air.
Kemampuan membentuk spora memungkinkan mikroorganisme ini tetap hidup pada
operasi pengolahan dengan pemanasan (Buckle et al., 1987). Suhu minimum untuk

14
pertumbuhan Bacillus cereus adalah 10 oC. Ray dan Bhunia (2007), menyebutkan sel
bakteri ini sensitif terhadap pasteurisasi, namun sporanya dapat bertahan terhadap
suhu tinggi. Suhu untuk pertumbuhannya berkisar antara 4 oC hingga 50oC, dengan
suhu optimum pertumbuhannya adalah 35-40 oC. Parameter pertumbuhan lainnya
adalah bakteri ini dapat tumbuh pada pH 4,9 hingga 9,3 dengan aw minimum 0,95
serta konsentrasi NaCl adalah 10%. Spora dan sel Bacillus cereus terdapat pada
tanah serta debu, juga dapat diisolasi dari sebagian kecil makanan.

Gambar 3. Bacillus cereus (Cowan dan Talaro, 2009)

Salmonella enteritidis ser. Thypimurium


Salmonella sp.merupakan bakteri patogen yang berbahaya. Salmonella selain
dapat menyebabkan gejala gastroinstestinal (gangguan perut), juga menyebabkan
demam tifus (Salmonella typhimurium), dan paratifus (Salmonella paratyphi).
Salmonella bersifat motil dengan flagella peritrikat (Fardiaz, 1989a). Salmonella
berbentuk batang lurus, berukuran 0,7-1,5 m x 2-5 m (Holt et al., 1994). Bakteri
ini merupakan Gram negatif, tidak berspora, dan tipe metabolisme nya anaerobik
fakultatif, dan bersifat motil. Salmonella sp.merupakan bakteri mesopilik dengan
suhu pertubuhan optimumnya berkisar 5-46oC. Salmonella sp. Dapat dibunuh dengan
perlakuan pasteurisasi dan sensitif pada pH rendah (4,5 atau dibawahnya), dan tidak
akan tumbuh pada Aw 0,94 (Ray dan Bhunia, 2007). Bakteri ini tumbuh pada tingkat
keasaman anatar 4,5-5,4 dengan pH optimumnya sekitar 7. Salmonella sp. akan mati
secara perlahan pada pH kurang dari 4,0 dan lebih dari 9,0 (Adam and Moss, 2007).

15
Bahan pangan rentan terhadap kontaminasi Salmonella, khususnya bahan pangan
asal ternak yang memiliki angka tertinggi terjangkit oleh Salmonella. Bahan pangan
ini diantaranya daging sapi, daging ayam, daging kalkun, daging babi, telur, susu,
dan produk olahan bahan pangan tersebut (Ray dan Bhunia, 2007).

Gambar 4. Salmonella typhimurium (Brands, 2006)

Escherichia coli
Merupakan bakteri Gram negatif yang berbentuk batang, dan metabolismenya
adalah anaerobik fakultatif. Escherichia coli disebut juga koliform fekal karena
ditemukan di dalam saluran usus hewan dan manusia, sehingga sering terdapat di
dalam feses. Bakteri ini sering digunakan sebagai indikator kontaminasi kotoran
Escherichia coli dapat tumbuh pada medium sederhana pada kisaran pH dan suhu
yang luas, yaitu mulai suhu kurang dari 10oC sampai lebih dari 40 oC. Bakteri ini
memiliki waktu generasi 17 menit pada medium Broth dan 12,5 menit pada medium
susu (Fardiaz, 1989b).

Gambar 5. Escherichia coli (Cowan dan Talaro, 2009)

16
Enzim Protease
Enzim terdapat pada semua sel hidup, tergolong protein dan penting dalam sistem
biologis. Suatu senyawa kompleks yang berfungsi sebagai biokatalisator pada reaksi-
reaksi biokimia di dalam sel dan mempunyai cara kerja yang unik dan spesifik
(Soedarmo et al., 1988). Enzim proteolitik adalah enzim yang dapat menguraikan
atau memecah protein. Enzim proteolitik terbagi atas dua kelompok besar yaitu
golongan eksopeptidase (memecah peptida dari arah luar) dan golongan
endopeptidase (memecah peptida dari arah dalam). Enzim-enzim ini meliputi
protease-protease pankreas, khimotripsin, dan tripsin, bromelin, papain, fungal
proteases dan Serratia peptidase (Winarno, 1989). Protease atau enzim proteolitik
adalah enzim yang memiliki daya katalitik yang spesifik dan efisien terhadap ikatan
peptida dari suatu molekul polipeptida atau protein. Protease dapat diisolasi dari
tumbuhan (papain dan bromelin), hewan (tripsin, kimotripsin, pepsin, dan renin),
mikroorganisme seperti bakteri, kapang, virus.
Enzim tripsin mengkatalis proses hidrolisis ikatan peptida. Hidrolisis dengan
enzim tripsin ini adalah salah satu tahap dalam menentukan runtunan deret asam
amino suatu protein. Tripsin adalah protein globular, terdiri dari tiga rantai
polipeptida yang dihubungkan melalui ikatan disulfida (Suhartono, 1988). Tripsin
dihasilkan oleh pankreas dalam bentuk tripsinogen yang tidak aktif. Tripsinogen
tersebut kemudian disekresikan ke usus halus, tempat enzim enterokinase
mengaktifkannya menjadi tripsin (Poedjiadi, 1994). Tripsin tidak mengkatalisis
hidrolisa untuk semua ikatan peptida. Kerjanya spesifik untuk hidrolisis ikatan
peptida pada gugus karbonil residu lisin dan agrinin. Tripsin mengkatalisis hidrolisis
pada peptida dibagian tengah rantai, bukan diujung rantai maka enzim ini juga
dinamakan endopeptidase (Suhartono, 1998).

17
MATERI DAN METODE

Lokasi dan Waktu


Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium
Terpadu, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan,
Institut Pertanian Bogor, pada bulan April hingga Agustus 2011.

Materi
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya adalah, isolat
indigenus bakteri asam laktat dari daging sapi lokal Indonesia, yaitu Lactobacillus
plantarum 2C12, 1A5, 1B1, dan 2B2, bakteri indikator (Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus cereus, Salmonella
enteritidis ser. Thypimurium ATCC 14028, dan Escherichia coli ATCC 25922).
Selain itu digunakan media De Man Rogosa and Sharpe broth (MRSB), Mueller
Hinton agar (MHA), yeast extract (YE) 3%, NaCl 1%, NaOH 1 N, amonium sulfat,
buffer potassium phosphate, resin SP sepharose –Fast flow, enzim protease tripsin
(Sigma Life Science, activity ≥ 10000 BAEE units/ mg protein), tris hydrochloride
0,05 M, kristal violet, lugol, safranin, alkohol, akuades dan larutan Mc. Farlan no.
0,5.
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat gelas antara
lain tabung reaksi, labu erlenmeyer, botol schott, cawan petri, gelas ukur, pipet
pasteur, pipet tetes, gelas objek, dan cover glass. Selain itu digunakan alat-alat
seperti ose, membran saring sartorius, mikro pipet, spoit, sentrifuse, incubator,
refrigerator, magnetic stirrer, hot plate, spektrofotometer UV-Vis, mikroskop,
membran dialisis, alumunium foil, kapas, oven, otoklaf, timbangan analitik, bunsen,
laminar air flow, vortex, cork borer, pH meter, jangka sorong, dan kamera digital.

Prosedur

Pewarnaan Gram (Waluyo, 2008)


Sampel bakteri dari koloni yang homogen diambil menggunakan ose steril.
Sebanyak satu ose sampel bakteri dioleskan secara merata pada kaca objek kemudian
difiksasi panas. Olesan bakteri kemudian ditetesi dengan kristal violet, diratakan
kemudian didiamkan selama satu menit. Setelah satu menit, preparat dibilas

18
menggunakan akuades dan dikeringkan. Tahap selanjutnya, olesan bakteri ditetesi
logul dan diratakan kembali, dikeringkan selama satu menit, kemudian dibilas
kembali dengan akuades lalu dikeringkan. Preparat dicuci dengan pemucat warna
yaitu etanol 95%, tetes demi tetes selama 30 detik, kemudian dicuci segera dengan
akuades dan ditiriskan. Preparat selanjutnya ditetesi safranin dan didiamkan selama
30 detik, kemudian dibilas dengan akuades dan ditiriskan. Preparat bakteri ditetesi
minyak imersi, dan diamati dibawah mikroskop pembesaran 100x untuk mengetahui
hasil dari pewarnaan Gram serta mengamati morfologinya. Bakteri yang termasuk
dalam kelompok Gram positif akan menunjukkan warna ungu atau gelap sedangkan
kelompok bakteri Gram negatif akan menunjukkan warna merah.

Uji Antagonistik Supernatan Bebas Sel Netral Lactobacillus plantarum


Kultur Lactobacillus plantarum 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 masing-masing
diinokulasi ke dalam media de Man Ragosa Sharp Broth (MRSB) dan diinkubasikan
pada suhu 37 °C selama 24 jam. Supernatan bebas sel diperoleh melalui sentrifugasi
o
pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 C selama 20 menit dan disaring
menggunakan membrane saring sartorius. Supernatan bebas sel dinetralkan pH nya
menjadi 5,8 – 6,2 dengan penambahan NaOH 1 N. Supernatan bebas sel netral siap
diuji aktivitas antimikrobnya terhadap bakteri indikator dengan metode difusi sumur.

Purifikasi Plantaricin
Purifikasi plantaricin untuk mendapatkan plantaricin murni meliputi
beberapa tahap, dan dijelaskan sebagai berikut.
Purifikasi Parsial dengan Menggunakan Presipitasi Amonium Sulfat. Sebanyak
500 ml media MRS – broth ditambah Yeast ekstrak 3% dan NaCl 1% diinokulasi
dengan 10% (v/v) kultur Lactobacillus plantarum. Terdapat empat galur
Lactobacillus plantarum yang digunakan untuk diperoleh bakteriosinnya yaitu
Lactobacillus plantarum 2C12, 1A5, 1B1, dan 2B2 yang telah disegarkan,
selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 20 jam dan setelah itu disimpan pada
refrigerator suhu 4oC selama dua jam. Tahap selanjutnya dilakukan sentrifugasi pada
kecepatan 10000 rpm selama 20 menit pada suhu 4oC untuk mendapatkan
supernatan. Sebelum memasuki tahap penyaringan, supernatan diukur pH nya
menggunakan pH meter. Supernatan disaring dengan menggunakan membran saring

19
Tabel 2. Penggunaan Padatan Amonium Sulfat (% Penjenuhan)
Awal
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
%
Konsentrasi Akhir dari Padatan Amonium Sulfat (gram) / 1000 ml
0 106 134 164 194 226 258 291 326 361 398 436 476 516 559 603 650 697
5 79 108 137 166 197 229 262 296 331 368 405 444 484 526 570 615 662
10 53 81 109 139 169 200 233 266 301 337 374 412 452 493 536 581 627
15 26 54 82 112 141 172 204 237 271 306 343 381 420 460 503 547 592
20 0 27 55 83 113 143 175 207 241 276 312 349 387 427 469 512 557
25 0 27 56 86 115 146 179 211 245 280 317 355 395 436 478 522
30 0 28 56 86 117 148 181 214 249 285 323 362 402 445 488
35 0 29 57 87 118 151 184 218 258 296 329 369 410 453
40 0 29 58 89 120 153 187 222 263 296 335 376 418
45 0 30 59 90 123 156 190 226 263 302 342 383
50 0 30 60 92 125 159 190 235 268 308 348
55 0 31 61 93 127 161 201 235 273 312
60 0 31 62 95 129 168 201 239 279
65 0 32 63 97 132 168 205 244
70 0 32 65 99 134 171 209
75 0 33 66 101 137 174
80 0 34 67 103 139
85 0 34 68 105
90 0 34 70
95 0 35
100 0
Sumber: Doonan, 2004.

20
sartorius diameter 0,22 µm dan selanjutnya supernatan bebas sel dari setiap galur
Lactobacillus plantarum dinetralkan pH nya menjadi 5,8 – 6,2 dengan menggunakan
NaOH 1N diikuti dengan pengukuran pH menggunakan pH meter. Seluruh tahap ini
dilakukan pada suhu dingin. Setiap supernatan antimikrob yang telah disaring steril
diberi penambahan serbuk amonium sulfat hingga 80% penjenuhan secara bertahap
(20%, 40%, 60%, dan 80%) untuk menghasilkan endapan protein, kemudian
dihomogenkan secara perlahan pada suhu 4 oC selama 2 jam. Tabel penggunaan
padatan amonium sulfat ditampilkan secara lengkap pada Tabel 1. Supernatan
selanjutnya dipisahkan dan didapatkan presipitat bakteriosin. Presipitat dikoleksi
pada labu erlenmeyer steril. Pengecekan protein bakteriosin hasil purifikasi diamati
menggunakan Spektrofotometer UV-Vis pada λ= 280 nm.

Dialisis. Presipitat bakteriosin yang masih bercampur dengan ammonium sulfat


didialisis dengan menggunakan membran dialisis berdiamater 20 µm dan buffer
yang digunakan adalah potassium phosphate selama 12 jam, selanjutnya dilakukan
penggantian buffer sebanyak dua kali di awal proses (2 jam dan 4 jam) pada suhu
4oC sehingga akan didapat ekstrak kasar bakteriosin yang berasal dari Lactobacillus
plantarum selanjutnya disebut plantaricin. Pengecekan protein plantaricin hasil
dialisis diamati menggunakan Spektrofotometer UV-Vis pada λ= 280 nm.

Purifikasi dengan Menggunakan Kromatografi Pertukaran Kation. Kolom


terlebih dahulu diisi dengan resin SP Sepahrose-fast flow. Kolom dipasang penjepit
bunsen kemudian buffer potassium phosphate pH 6,8 dituangkan ke dalam kolom.
Buffer dibuang secara perlahan. Resin SP Sepahrose dimasukkan ke dalam kolom
secara perlahan-lahan dengan menggunakan pipet pasteur dan dijaga agar tidak ada
udara (gas) yang masuk ke dalam kolom. Resin akan menjadi gel. Diatas resin
diberikan buffer dan kolom disimpan pada suhu dingin sampai siap untuk digunakan.
Plantaricin hasil dialisis dimasukkan ke dalam kolom secara perlahan-lahan,
dan dibawah kolom diberikan tabung penampung eluat yang keluar dari kolom. Eluat
pertama adalah buffer, sedangkan yang berikutnya adalah sampel plantarcin murni.
Kecepatan alir yang diberikan adalah 0,8 ml/menit. Setelah selesai pencucian
dilakukan dengan buffer kembali dan ditampung untuk mengambil eluat yang terikat
pada gel (resin). Semua dilakukan di ruang dingin. Setelah selesai dalam beberapa

21
tabung koleksi didapatkan eluat yang berisikan plantaricin murni. Plantaricin murni
disimpan pada suhu dingin (4oC) dan selanjutnya siap untuk dianalisis sifat dan
karakteristiknya serta dilakukan pengecekan protein plantaricin hasil kromatografi
kolom dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada λ= 280 nm (Hata,
2010).

Karakterisasi Plantaricin

Sensitivitas terhadap Enzim Tripsin. Karakterisasi plantaricin dilakukan melalui


uji sensitivitas plantaricin terhadap enzim tripsin. Enzim dan buffernya yang
digunakan yaitu tripsin dalam 0,05 M Tris Hydrochloride (pH 7,0). Sampel-sampel
plantaricin sebanyak 1 ml dihomogenkan dengan enzim tripsin (0,5 mg/ml).
kemudian diinkubasi pada suhu 25 oC selama 60 menit. (Savadogo et al., 2004).
Keberadaan protein plantaricin setelah mendapat perlakuan enzim proteolitik diukur
absorbansinya pada λ= 280 nm.

Uji Antagonistik Plantaricin terhadap Bakteri Indikator. Bakteri indikator


(patogen dan pembusuk makanan) sebanyak 107 cfu/ml yang berumur 24 jam
diinokulasikan ke dalam cawan, selanjutnya dituangkan media konfrontasi yaitu
Mueller Hinton agar. Setelah agar mengeras dan dingin, dibuat sumur pada cawan
dengan diameter 5 mm. Sebanyak 50 l plantaricin murni (sebagai kontrol)
dituangkan kedalam sumur dengan menggunakan mikro pipet, begitu pula
plantaricin yang telah mendapat perlakuan enzim tripsin, kemudian cawan disimpan
dalam refrigerator selama 2 jam untuk memberikan kesempatan plantaricin berdifusi
ke dalam agar. Setelah itu cawan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam
(Savadogo et al., 2006). Zona bening yang terbentuk di sekitar area sumur
menandakan bahwa plantaricin mampu menghambat bakteri indikator. Selanjutnya
dilakukan pengukuran diameter zona bening (mm) dengan menggunakan jangka
sorong. Diameter dari masing-masing zona hambat diukur sebanyak tiga kali di
daerah yang berbeda yang kemudian hasilnya dirata-ratakan (Gambar 6). Hasil
diameter zona bening diolah secara statistik setelah dikurangi dengan diameter
sumur. Zona bening atau zona hambat dapat diekspresikan sebagai aktivitas unit
bakteriosin. Unit aktivitas bakteriosin didefinisikan sebagai AU (activity unit), 1 AU

22
merupakan luas daerah hambatan per satuan volum contoh bakteriosin yang diuji
(mm2/ml). Aktivitas bakteriosin dapat dihitung menggunakan persamaan berikut :

Keterangan :
Lz = Luas zona bening (mm2)
Ls = Luas sumur (mm2)
V = Volume contoh (ml)

Keterangan :
C
A = Luang sumur (5mm)
B A B = Zona hambat / zona bening yang terbentuk
C = Cawan petri (MHA dan bakteri indikator)
Garis = Pengukuran diameter zona hambat pada 3
posisi yang berbeda

Gambar 6. Metode Pengukuran Zona Hambat

Rancangan dan Analisis Data


Rancangan dan analisis data meliputi rancangan atau metode statistik yang
digunakan pada penelitian ini, perlakuan, model statistik yang digunakan, peubah
yang diamati, dan analisis data yang digunakan. Rancangan dan analisis data pada
penelitian ini meliputi produksi plantaricin, sensitivitas plantaricin murni 1A5, 1B1,
2B2, dan 2C12 terhadap enzim tripsin, dan uji antagonistik plantaricin murni 1A5,
1B1, 2B2, dan 2C12 terhadap bakteri indikator.

Produksi Plantaricin
Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL)
dengan ulangan sebanyak tiga kali. Faktor perlakuan adalah galur Lactobacillus
plantarum, dengan empat taraf perlakuan (galur 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12). Analisis
data dilakukan secara deskriptif. Peubah yang diamati adalah nilai pH supernatan
bebas sel, zona hambat hasil uji antagonistik supernatan bebas sel netral
Lactobacillus plantarum, serta absorbansi dan konsentrasi protein plantaricin. Model
statistik rancangan acak lengkap (RAL) adalah sebagai berikut.

23
Yij = µ + Pi + €ij
Keterangan :
Yij = Variabel respon akibat pengaruh galur Lactobacillus plantraum ke-i pada
ulangan ke-j.
µ = Nilai tengah umum.
Pi = Pengaruh perlakuan galur lactobacillus plantarum ke-i (i = 1A5, 1B1, 2B2,
dan 2C12).
€ij = Pengaruh galat perlakuan ke-i pada ulangan ke-j (j = 1, 2, 3).

Sensitivitas Plantaricin Murni 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 terhadap Enzim
Tripsin
Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL)
dengan ulangan sebanyak tiga kali. Faktor perlakuan adalah galur Lactobacillus
plantarum, dengan empat taraf perlakuan (galur 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12). Peubah
yang diamati adalah persentase penurunan konsentrasi protein plantaricin. Model
statistik rancangan acak lengkap (RAL) adalah sebagai berikut.
Yij = µ + Pi + €ij
Keterangan :
Yij = Variabel respon akibat pengaruh galur Lactobacillus plantraum ke-i pada
ulangan ke-j.
µ = Nilai tengah umum.
Pi = Pengaruh perlakuan galur lactobacillus plantarum ke-i (i = 1A5, 1B1, 2B2,
dan 2C12).
€ij = Pengaruh galat perlakuan ke-i pada ulangan ke-j (j = 1, 2, 3).
Data yang persentase penurunan konsentrasi protein plantaricin diuji asumsi,
apabila hasilnya memenuhi uji asumsi maka data dianalisis dengan analisis ragam
(anova). Bila hasil yang diperoleh nyata maka dilanjutkan dengan uji Tukey (Mattjik
dan Sumertajaya, 2002).

Uji Antagonistik Plantaricin Murni 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 terhadap Bakteri
Indikator
Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial (RAL
faktorial) dengan pola 2 x 4. Faktor perlakuan yang pertama adalah pemberian enzim
tripsin dengan dua taraf perlakuan (tanpa trispin dan tripsin). Faktor perlakuan kedua

24
adalah plantaricin asal galur Lactobacillus plantarum, dengan empat taraf perlakuan
(galur 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12). Ulangan dilakukan sebanyak tiga kali. Peubah
yang diamati adalah diameter zona hambat hasil uji antagonistik plantaricin murni
1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 terhadap bakteri indikator. Model statistik rancangan acak
lengkap faktorial adalah sebagai berikut.
Yijk = µ + Pi + Yj + PYij + €ijk
Keterangan :
Yijk = Variabel respon akibat pengaruh enzim tripsin ke-i dan galur Lactobacillus
plantarum ke- j pada ulangan ke-k.
µ = Nilai tengah umum.
Pi = Pengaruh perlakuan enzim proteolitik ke-i (i = tanpa tripsin, tripsin).
Yj = Pengaruh perlakuan galur Lactobacillus plantarum ke-j (j = 1A5, 1B1,
2B2, dan 2C12).
PYij = Pengaruh interaksi antara enzim proteolitik ke-i dengan galur Lactobacillus
plantarum ke-j.
€ij = Pengaruh galat perlakuan ke-i dan ke-j, terhadap ulangan ke-k, k = 1, 2, 3.
Data yang zona hambat diuji asumsi, apabila hasilnya memenuhi uji asumsi
maka data dianalisis dengan analisis ragam (anova). Bila hasil yang diperoleh nyata
maka dilanjutkan dengan uji Tukey (Mattjik dan Sumertajaya, 2002).

25
HASIL DAN PEMBAHASAN

Karakteristik Galur Lactobacillus plantarum dan Bakteri Patogen


Karakteristik dari keempat bakteri asam laktat Lactobacillus plantarum 1A5,
1B1, 2B2, dan 2C12 serta bakteri patogen dapat dilihat pada Tabel 3. Hasil
karakteristik morfologi dari keempat bakteri asam laktat Lactobacillus plantarum
1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 menunjukkan bahwa sel bakteri berbentuk batang, dengan
susunan tunggal maupun berkoloni berbentuk rantai pendek. Ray dan Bhunia (2007)
menyatakan, Lactobacillus plantarum tergolong dalam bakteri Gram positif,
berbentuk batang tunggal maupun rantai pendek, tidak berspora, katalase negatif, dan
anaerob fakultatif.
Hasil yang diperoleh pada penelitian ini sesuai dengan penelitian sebelumnya
yang menyatakan bahwa kultur Lactobacillus plantarum 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12
memiliki morfologi berbentuk batang dengan susunan tunggal maupun rantai pendek
(Firmansyah, 2009). Karakteristik morfologi yang dihasilkan menunjukkan bahwa
kultur Lactobacillus plantarum 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 yang digunakan murni
atau tidak tercemar. Pengujian karakteristik kultur bakteri menurut Hidayati (2006)
dapat didasarkan pada fenotipnya, seperti berdasarkan dinding selnya melalui
pewarnaan Gram, serta bentuk atau morfologi dari masing-masing kultur tersebut.
Buckle et al. (1987) menjelaskan bahwa bakteri Pseudomonas aeruginosa
dan Bacillus cereus memiliki morfologi berbentuk batang. Hal ini sesuai dengan
hasil pengamatan yang dilakukan, yaitu Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 dan
Bacillus cereus berbentuk batang. Hasil karakteristik morfologi bakteri Salmonella
enteritidis ser. Thypimurium ATCC 14028, dan Escherichia coli ATCC 14028
adalah berbentuk batang soliter maupun berkoloni, sedangkan Staphylococcus aureus
ATCC 25923 memiliki bentuk bulat atau kokus dalam susunan tunggal maupun
berkoloni seperti buah anggur. Hal ini sesuai dengan pernyataan Fardiaz (1992)
yakni Staphylococcus aureus berbentuk bulat anggur sedangkan Escherichia coli
berbentuk batang. Menurut Holt et al. (1994), bakteri Salmonella enteritidis ser.
Thypimurium memiliki morfologi berbentuk batang lurus.

26
Tabel 3. Karakteristik BAL Lactobacillus plantarum 1A5, 1B1, 2B2, 2C12, dan
Bakteri Indikator

Bakteri Pewarnaan Gram Morfologi Bentuk dan Susunan


L. plantarum 1A5 Positif Batang tunggal dan koloni berantai
pendek
L. plantarum 1B1 Positif Batang tunggal dan koloni berantai
pendek
L. plantarum 2B2 Positif Batang tunggal dan koloni berantai
pendek
L. plantarum 2C12 Positif Batang tunggal dan koloni berantai
pendek
P. aeruginosa Negatif Batang tunggal dan koloni berantai
ATCC 27853 pendek
S. aureus Positif Bulat tunggal dan koloni seperti buah
ATCC 25923 anggur
B. cereus Positif Batang tunggal dan berkoloni, terdapat
kantung spora
S. Thypimurium Negatif Batang tunggal dan berkoloni
ATCC 14028
E. coli Negatif Batang tunggal dan bekoloni
ATCC 25922

Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan diferensial yang


paling penting dan sering digunakan untuk pengujian kemurnian suatu bakteri. Pada
pewarnaan Gram, bakteri dibedakan menjadi dua kelompok berdasarkan komponen
dinding selnya yaitu bakteri Gram postif dan Gram negatif (Pelczar dan Chan, 2007).
Hasil pewarnaan Gram terhadap bakteri Lactobacillus plantarum 1A5, 1B1, 2B2,
dan 2C12, serta bakteri indikator Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Bacillus
cereus menunjukan bahwa bakteri-bakteri tersebut tergolong dalam bakteri Gram
positif. Hal ini dikarenakan pada proses pewarnaan Gram keenam bakteri ini
menyerap warna ungu yang berasal dari kompleks antara kristal violet dengan iodin,
dan tetap mempertahankan warna tersebut meskipun telah diberi alkohol 95% dan
ditambahkan zat warna lainnya yaitu safranin.

27
Bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella enteritidis ser.
Thypimurium ATCC 14028, dan Escherichia coli ATCC 25922, berdasarkan hasil
pewarnaan Gram menunjukan bahwa ketiga bakteri ini tergolong dalam bakteri
Gram negatif. Hal ini disebabkan ketiga bakteri tersebut tidak dapat mempertahankan
warna ungu dari zat pewarna kristal violet saat diberi alkohol 95%, dan bakteri ini
menyerap warna merah dari pewarna tandingannya yaitu dari safranin. Hasil
pengamatan morfologi dan pewarnaan Gram secara mikroskopis dari bakteri
Lactobacillus plantarum 1A5, 1B1, 2B2, 1A5, serta bakteri indikator dapat dilihat
pada Gambar 7 dan Gambar 8.

(A) (B)

(C) (D)
Gambar 7. Morfologi dan Hasil Pewarnaan Gram Bakteri Lactobacillus plantarum :
(A) L. plantarum 1A5; (B) L. plantarum 1B1; (C) L. plantarum 2B2; (D)
L. plantarum 2C12.

Dinding sel bakteri Gram positif sebagian besar terdiri dari lapisan
peptidoglikan (90%). Lapisan ini akan menyebabkan kompleks antara kristal violet
dan iodin tetap didalam dinding sel saat pewarnaan Gram walaupun telah dilakukan
pencucian dengan alkohol 95% (Fardiaz, 1989). Teori lain menyatakan bahwa

28
bakteri Gram positif mempertahankan warna ungu disebabkan dinding sel
mengalami dehidrasi saat ditetesi alkohol 95%, sehingga pori-pori menciut, daya
rembes dinding sel dan membran menurun. Keadaan ini membuat kompleks kristal
violet - iodin tidak dapat keluar dari sel, dan saat ditetesi degan safranin zat pewarna
ini tidak dapat masuk ke dalam dinding selnya (Pelczar dan Chan, 2007).

(A) (B) (C)

(D) (E)
Gambar 8. Morfologi dan Hasil Pewarnaan Gram Bakteri – Bakteri Indikator: (A)
Bacillus cereus; (B) Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853; (C)
Staphylococcus aureus ATCC 25923 ; (D) Salmonella enteritidis ser.
Thypimurium ATCC 14028; (E) Escherichia coli ATCC 25922.

Bakteri Gram negatif mempunyai kandungan lipid yang tinggi pada dinding
selnya dalam bentuk lipopolisakarida dan lipoprotein (Fardiaz, 1992). Lipid pada
dinding sel bakteri Gram negatif akan larut oleh alkohol sehingga pori-pori
mengembang dan menyebabkan kompleks kristal violet – iodin keluar dari sel,
sehingga dinding sel bakteri menjadi tidak berwarna. Dinding sel bakteri yang tidak
berwarna tersebut akan menyerap zat pewarna safranin, sehingga sel bakteri akan
tampak berwarna merah ketika dilihat dibawah mikroskop (Pelczar dan Chan, 2007).

29
Produksi Plantaricin
Tabel 4 menunjukkan kondisi pH awal dari supernatan bebas sel dan kondisi
pH setelah supernatan bebas sel dinetralkan menggunakan NaOH 1 N. Berdasarkan
data pH pada Tabel 4, supernatan antimikrob yang dihasilkan berada dalam kondisi
asam pada semua galur Lactobacillus plantarum. Kondisi asam ini disebabkan oleh
adanya asam-asam organik yang merupakan metabolit primer bakteri asam laktat
selama proses metabolismenya.
Asam organik tersebut adalah asam laktat, karena Lactobacillus plantarum
merupakan bakteri asam laktat homofermentatif yang hanya menghasilkan asam
laktat dari proses fermentasi karbohidrat (Ray dan Bhunia, 2007). Fardiaz (1989),
menyatakan terbentuknya asam laktat dan asam organik oleh bakteri asam laktat
dapat menyebabkan penurunan pH. Akibatnya mikroba yang tidak tahan terhadap pH
yang relatif rendah akan terhambat pertumbuhannya. Data pH supernatan pada
keempat galur Lactobacillus plantarum memiliki pH yang hampir sama, dan berkisar
di pH 4. Roller (2003) menyatakan, asam organik dengan nilai pH 4 dapat
menghambat pertumbuhan bakteri, sedangkan jika berada pada kisaran pH 5 dapat
menghambat kapang dan khamir.

Tabel 4. Kondisi pH Supernatan Bebas Sel asal Empat Galur Lactobacillus


plantarum pada Media MRS broth dengan inducer yeast extract (YE) 3%

Galur Lactobacillus pH Supernatan Bebas Sel


plantarum Awal Netral
1A5 4,01 ± 0,04 6,11 ± 0,34
1B1 3,94 ± 0,11 5,87 ± 0,12
2B2 4,00 ± 0,02 6,17 ± 0,31
2C12 3,98 ± 0,01 6,04 ± 0,16

Supernatan antimikrob bebas sel dimurnikan untuk mendapatkan bakteriosin


yang terkandung didalamnya, sehingga pengaruh asam organik di dalam supernatan
antimikrob bebas sel harus dihilangkan untuk memberi kesempatan pada bakteriosin
agar dapat menghambat pertumbuhan bakteri indikator pada uji antagonistik.
Penambahan sejumlah basa kuat NaOH 1N dilakukan untuk memberikan kondisi pH
netral pada supernatan bebas sel, sehingga nilai pH supernatan bebas sel dari

30
keempat galur Lactobacillus plantarum berada pada kisaran pH 5,8 hingga pH 6,2.
Kisaran pH 5,8 – 6,2 digunakan karena pada kondisi tersebut aktivitas bakteriosin
yang terkandung dalam supernatan bebas sel dapat optimal. Plantaricin PASM1 asal
Lactobacillus plantarum A-1 yang diisolasi dari tortilla tanpa proses fermentasi,
menunjukan aktivitas antimikrob yang optimal (90-100%) pada kisaran pH 5,5
hingga pH 7 (Hata et al., 2010).

Uji Antagonistik Supernatan Bebas Sel Netral Lactobacillus plantarum


Hasil uji antagonistik supernatan bebas sel netral asal empat galur
Lactobacillus plantarum terhadap bakteri indikator disajikan secara lengkap pada
Tabel 5. Uji antagonistik terhadap bakteri indikator ditunjukkan dengan adanya zona
hambat yang terbentuk di sekitar sumur.

Tabel 5 . Diameter Zona Hambat Supernatan Netral Asal Empat Galur Lactobacillus
plantarum terhadap Bakteri Indikator
Galur Lactobacillus plantarum
Bakteri Indikator
1A5 1B1 2B2 2C12
-------------------------------------------mm-----------------------------------------
Pseudomonas 16,86± 0,34 13,37± 0,96 13,50 ± 1,12 10,32± 0,92
aeruginosaATCC 27853
Bacillus cereus 16,30± 1,42 15,02± 1,56 11,05± 0,39 7,46± 0,91
Staphylococcus aureusATCC 17,72± 1,27 16,21± 0,49 15,01 ±1,54 10,46± 1,40
25923
Escherichia coli ATCC 25922 15,73± 0,31 15,22± 0,87 9,74± 1,36 10,93± 1,40
Salmonella enteritidis ser. 18,00± 0,64 13,09± 0,30 9,13± 0,64 14,55± 3,45
Thypimurium ATCC 14028
Keterangan : Diameter lubang sumur (5 mm) termasuk ke dalam diameter zona hambat.

Berdasarkan data pada Tabel 5, supernatan bebas sel netral asal empat galur
Lactobacillus plantarum yaitu 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 menunjukkan aktivitas
antimikrob, hal ini dapat dilihat dari terbentuknya zona hambat saat uji antagonistik
terhadap kelima bakteri indikator. Zona hambat yang terbentuk adalah zona hambat
semu, yang berarti aktivitas dari antimikrob tersebut adalah bakteriostatik atau
menghambat pertumbuhan mikroba (Syahniar, 2009). Sapatnekar et al. (2010)
menyatakan, aktivitas antimikrob bakteriosin ditunjukkan dengan tebentuknya zona
hambat bening dan zona yang berbeda dari area sekitar cawan yang ditumbuhi oleh

31
bakteri indikator yang digunakan. Besarnya diameter zona hambat dari keempat
plantaricin terhadap bakteri indikator berkisar antara 7,46 mm hingga 18,00 mm.
Perbedaan ukuran zona hambat yang dihasilkan dapat dipengaruhi oleh
beberapa faktor, diantaranya adalah konsentrasi bakteriosin yang terkandung di
dalam supernatan bebas sel netral dari seriap galur berbeda-beda. Terlalu rendahnya
konsentrasi bakteriosin yang terbentuk, maka akan menyebabkan aktivitas
penghambatan untuk melawan bakteri indikator akan relatif rendah (Syahniar, 2009).
Hal ini juga didukung oleh Todorov et al. (2004) yang menyatakan bahwa rendahnya
aktivitas penghambatan pada media perlakuan dapat disebabkan oleh berkurangnya
aktivitas antimikrob dari bakteriosin akibat sensitifnya peranan asam organik. Faktor
lainnya adalah karakteristik dari bakteri indikator yang berbeda-beda. Bakteri
indikator terdiri atas bakteri Gram negatif dan bakteri Gram positif. Tingkat
sensitivitas kedua bakteri ini terhadap zat antimikrob sangat berbeda. Bakteri Gram
positif lebih sensitif, sedangkan bakteri Gram negatif lebih resisten.
Aktivitas antimikrob supernatan netral ini menunjukkan adanya aktivitas
bakteriosin dalam menghambat bakteri indikator. Aksi penghambatan bakteriosin
terutaman efek bakterisidal terhadap bakteri sensitif diawali dengan destabilisasi
fungsi membran sitoplasma. Destabilisasi ini berupa peningkatan permeabilitas
membran, sehingga mengganggu keseimbangan barier dan dapat mengakibatkan
kematian sel (Jack et al., 1995). Berdasarkan hasil uji antagonistik supernatan
antimikrob netral terhadap bakteri indikator yang menunjukkan adanya aktivitas
penghambatan, maka perlu dilakukan proses lanjutan yaitu purifikasi bakteriosin asal
Lactobacillus plantarum 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 yang selanjutnya disebut
plantaricin. Purifikasi plantaricin meliputi purifikasi parsial dengan menggunakan
presipitasi amonium sulfat, dialisis, dan purifikasi dengan menggunakan
kromatografi pertukaran kation.

Purifikasi Plantaricin
Proses purifikasi plantaricin diawali oleh proses purifikasi parsial dengan
menggunakan presipitasi amonium sulfat. Supernatan bebas sel yang telah
dikondisikan netral (pH 5,8-6,2) dipresipitasi dengan amonium sulfat 80% pada
kondisi dingin 4 oC. Presipitasi adalah suatu metode menggunakan penambahan
reagen yang menyebabkan protein meninggalkan larutan dan membentuk partikel

32
tidak larut dalam endapan. Prinsip penambahan garam amonium sulfat 80% ke dalam
supernatan bebas sel dari setiap galur Lactobacillus plantarum adalah untuk
mengendapkan plantaricin yang merupakan protein, sehingga dapat dipisahkan dari
substansi lainnya yang terkandung di dalam supernatan bebas sel netral. Keuntungan
menggunakan garam ammonium sulfat karena mempunyai kelarutan tinggi, pH
moderat, relatif lebih murah, non toksik, dan tidak mempengaruhi enzim (Tokuyasu
et al., 1996). Hasil yang didapatkan pada purifikasi parsial ini disebut presipitat
plantaricin.
Tahap purifikasi berikutnya adalah dialisis dalam kondisi dingin (4 oC).
Proses ini dilakukan untuk menghilangkan garam amonium sulfat dan molekul
berukuran kecil lainnya yang masih terkandung dalam presipitat plantaricin.
Molekul plantaricin yang berukuran lebih besar akan terperangkap didalam
membran dialisis, sedangkan garam amonium sulfat akan berdifusi keluar melewati
membran dialisis. Hasil yang diperoleh dari tahap purifikasi ini disebut plantaricin
kasar. Tahap purifikasi terakhir untuk mendapatkan plantaricin murni adalah
purifikasi dengan menggunakan kromatografi pertukaran kation.
Pemisahan komponen secara kromatografi kolom dilakukan dalam suatu
kolom yang diisi dengan fase stasioner dan cairan (pereaksi) sebagai fase mobil
untuk mengetahui banyaknya komponen contoh yang keluar melalui kolom (Adnan,
1997). Purifikasi dengan kromatografi kolom menghasilkan sejumlah fraksi
plantaricin murni dengan konsentrasi protein yang berbeda-beda. Pengecekan
protein presipitat plantaricin, plantaricin kasar, dan plantaricin murni 1A5, 1B1,
2B2, serta 2C12 dilakukan menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Hasil
pengecekan protein disajikan secara lengkap pada Gambar 9.
Berdasarkan data pada Gambar 9, diketahui bahwa komponen utama pada
plantaricin adalah peptida-peptida atau kompleks peptida. Nilai konsentrasi protein
plantaricin mengalami peningkatan pada tahap purifikasi yang lebih lanjut.
Konsentrasi protein plantaricin kasar 1A5, 1B1, dan 2B2 meningkat lebih dari dua
kali lipatnya dibandingkan dengan protein presipitat plantaricin, namun konsentrasi
protein plantaricin 2C12 mengalami penurunan setelah tahap dialisis. Peningkatan
konsentrasi protein pada plantaricn kasar disebabkan karena proses dialisis telah
menghilangkan garam-garam ammonium sulfat yang masih terkandung dalam

33
presipitat plantaricin, sehingga konsentrasi plantaricin kasar yang merupakan hasil
tahap dialisis akan lebih tinggi dibandingkan presipitat plantaricin.

80
71,19
70
Konsentrasi Protein Plantaricin

60 56,66

50 44,59
(mg/ml)

40

30 23,70 24,61
24,08
20 15,62

10 3,41
2,93 4,34
1,69 0,97
0
1A5 1B1 2B2 2C12
Galur L. plantarum

Gambar 9. Histogram Konsentrasi Protein Plantaricin Asal Empat Galur


Lactobacillus plantrum pada Tahap Proses Purifikasi Plantaricin.
plantaricin
Presipitat plantaricin, Plantaricin kasar, Plantaricin murni.
Keterangan : Fraksi plantaricin murni yang digunakan berbeda-beda, plantaricin 1A5 = fraksi 9,
plantaricin 1B1 = fraksi 7, plantaricin 2B2 = fraksi 7, plantaricin 2C12= fraksi 54.

Day dan Underwood (2002) menyatakan Proses dialisis atau proses


pencucian bertujuan untuk menghilangkan pengotor pada permukaan partikel-
partikel protein. Konsentrasi protein yang dihasilkan oleh Plantaricin kasar 1B1
memiliki nilai yang lebih tinggi dibandingkan tiga plantaricin lainnya. Faktor-faktor
yang mempengaruhi tinggi rendahnya konsentrasi protein presipitat plantaricin dan
plantaricin kasar adalah konsentrasi plantaricin yang terkandung, konsentrasi media
pertumbuhan BAL yang masih tersisa, serta konsentrasi buffer kalium fosfat pada
plantaricin kasar.
Proses purifikasi plantaricin dengan metode kromatografi pertukaran kation
akan menghasilkan sejumlah fraksi plantaricin murni, yang konsentrasi proteinnya
berbeda-beda. Fraksi dengan konsentrasi protein yang tidak terlalu tinggi dipilih
sebagai sampel untuk melakukan pengujian karakterisasi plantaricin terhadap
degradasi enzim proteolitik. Karakteristik peptida bakteriosin pada umumnya adalah
peptida hidropobik dan kationik, serta muatan positifnya akan lebih tinggi pada

34
kondisi pH rendah (Ray dan Bhunia, 2007). Peptida bakteriosin berukuran kecil dan
resisten terhadap panas (Ray dan Miller, 2003). Ray dan Bhunia (2007) menyatakan,
satu galur bakteri dapat memproduksi lebih dari satu jenis bakteriosin. Dikatakan
pula beberapa galur pada spesies yang sama dapat memproduksi bakteriosin yang
sama atau dapat pula berbeda.

Karakterisasi Plantaricin 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12


Karakterisasi plantaricin 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 dilakukan untuk
mengetahui karakter dari masing-masing plantaricin murni yang dihasilkan keempat
galur Lactobacillus plantarum tersebut. Salah satu karakterisasi plantaricin adalah
pengujian sensitivitas plantaricin terhadap enzim tripsin.

Sensitivitas Plantaricin Murni 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 terhadap Enzim
Tripsin
Uji sensitivitas plantaricin terhadap enzim tripsin ditunjukkan dengan
terjadinya penurunan konsentrasi protein dari masing-masing plantaricin setelah
mendapat perlakuan enzim tripsin bila dibandingkan dengan kontrol. Hasil pengujian
konsentrasi protein plantaricin 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 yang diberi perlakuan
enzim tripsin dapat dilihat secara lengkap pada Gambar 10.

25 23,70
Konsentrasi Protein Plantaricin

20

15
(mg/ml)

10,69
10

4,34
5 2,93
1,69 1,18 1,13 0,57
0
1A5 1B1 2B2 2C12
Galur L. plantarum

Gambar 10. Histogram Konsentrasi Protein Plantaricin Asal Empat Galur


Lactobacillus plantarum yang Diberi Perlakuan Enzim Tripsin.
K Kontrol, .. Tripsin.

35
Berdasarkan data pada Gambar 10, penurunan konsentrasi protein keempat
plantaricin terjadi setelah plantaricin diberi penambahan tripsin dan diinkubasi
selama satu jam pada suhu 25 oC. Hal tersebut menandakan bahwa enzim tripsin
mampu mendegradasi protein atau peptida-peptida yang merupakan komponen aktif
utama didalam plantaricin. Data penurunan konsentrasi protein plantaricin diolah
lebih lanjut dalam bentuk persentase penurunan konsentrasi protein, sehingga dapat
terlihat lebih jelas bagaimana sensitivitas dari masing-masing jenis plantaricin
terhadap degradasi enzim tripsin.
Persentase penurunan konsentrasi protein dari plantaricin 1A5, 1B1, 2B2,
dan 2C12 dapat dilihat secara lengkap pada Gambar 11. Galur Lactobacillus
plantarum yang berbeda tidak berpengaruh terhadap persentase penurunan
konsentrasi protein plantaricin. Hal ini berarti bahwa plantaricin yang dihasilkan
oleh Lactobacillus plantarum 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 mempunyai tingkat sensi-
tivitas yang sama terhadap degradasi enzim tripsin. Berdasarkan data pada Gambar
11 diketahui bahwa, persentase penurunan konsentrasi protein plantaricin 2C12
cenderung lebih tinggi dibandingkan plantaricin lainnya, sedangkan plantaricin 1B1
memiliki peptida-peptida yang kurang mampu didegradasi oleh enzim tripsin, hal ini
dapat dilihat dari persentase penurunan proteinnya yang rendah yaitu 33,50 %.
Enzim tripsin merupakan enzim endopeptidase yaitu mengkatalisis hidrolisa
pada peptida dibagian tengah rantai. Enzim tripsin tidak mengkatalisis hidrolisa
untuk semua ikatan peptida, enzim tripsin hanya akan memecah ikatan peptida pada
gugus yang spesifik, yaitu gugus karbonil residu lisin dan agrinin (Suhartono, 1998).
Urutan asam amino dari masing-masing plantaricin dapat menjadi faktor penentu
degradasi plantaricin tersebut oleh enzim tripsin. Semakin banyak urutan asam
amino gugus karbonil residu lisin dan agrinin, maka semakin banyak protein yang
dapat didegradasi oleh enzim tersebut.
Bakteriosin yang berasal dari bakteri asam laktat yang berbeda, dapat
memiliki urutan asam amino yang sama. Umumnya bakteriosin memiliki kurang dari
60 jenis asam amino, namun efisiensi aksi bakterisidalnya tidak bergantung pada
banyaknya asam amino yang terkandung dalam bakteriosin tersebut (Ray dan
Bhunia, 2007). Plantaricin ASM1 yang telah diteliti sebelumnya, diketahui terdiri
atas 43 residu asam amino, dengan titik isoelektrik pada pH 6,97 (Hata et al., 2010).

36
90 74,27

Persentase Penurunan Protein


80 66,02
70 56,94
60

Plantaricin
50 33,50
40
30
20
10
0
1B1 2B2 1A5 2C12
Galur L. plantarum

Gambar 11. Histogram Persentase (%) Penurunan Konsentrasi Protein Plantaricin


Murni setelah Didegradasi Enzim Tripsin.

Uji Antagonistik Plantaricin murni 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 terhadap Bakteri
Indikator.
Uji antagonistik dilakukan dengan menggunakan metode difusi sumur,
terhadap plantaricin murni sebagai kontrol dan plantaricin murni yang telah
mendapat perlakuan enzim tripsin. Hasil uji antagonistik plantaricin asal empat
Galur Lactobacillus plantarum dengan perlakuan enzim tipsin terhadap bakteri
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ditampilkan pada Tabel 6. Plantaricin murni
yang dihasilkan oleh Lactobacillus plantarum 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 mampu
menghambat bakteri Gram negatif Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

Tabel 6. Diameter Zona Hambat Plantaricin Asal Empat Galur Lactobacillus


plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Galur Perlakuan
Rata-rata
Lactobacillus plantarum Kontrol Tripsin
--------------------------------mm-------------------------------
1A5 9,25 ± 2,42 7,48 ± 0,74 8,36 ± 1,25
1B1 8,39 ± 1,58 6,15 ± 1,99 7,27 ± 1,58
2B2 8,25 ± 1,72 6,02 ± 1,77 7,14 ± 1,58
2C12 8,85 ± 1,56 6,75 ± 1,05 7,80 ± 1,48
Rata-rata 8,96±0,46a 6,60 ± 0,66b
Keterangan : Huruf superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan berbeda nyata
(P≤0,05). Diameter lubang sumur (5 mm) termasuk ke dalam diameter zona hambat.

37
Bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 merupakan bakteri Gram
negatif yang berbentuk batang. Umumnya bakteri Gram negatif resisten terhadap
bakteriosin. Namun berdasarkan hasil penelitian ini, plantaricin 1A5, 1B1, 2B2, dan
2C12 mampu menghambat pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
Hasil ini sesuai dengan penelitian yang pernah dilakukan untuk menguji aktivitas
plantaricin ST13BR. Plantaricin ST13BR dilaporkan menunjukkan aktivitasnya
terhadap bakteri indikator Pseudomonas aeruginosa juga terhadap beberapa bakteri
Gram negatif lainnya seperti Escherichia coli dan Klebsiella pneumoniae (Todorov
et al., 2004).
Zona hambat plantaricin terhadap bakteri indikator Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853 tidak dipengaruhi oleh interaksi (P> 0,05) dari galur Lactobacillus
plantarum dengan perlakuan enzim proteolitik. Zona hambat plantaricin terhadap
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 hanya dipengaruhi oleh perlakuan enzim
proteolitik yang berbeda. Plantaricin dari empat galur Lactobacillus plantarum yang
berbeda terbukti sensitif terhadap perlakuan enzim proteolitik, yaitu tripsin. Zona
hambat plantaricin kontrol untuk keempat galur Lactobacillus plantarum memiliki
nilai yang lebih tinggi dibandingkan dengan zona hambat setelah mendapat
perlakuan enzim tripsin. Hal ini selaras dengan terjadinya penurunan konsentrasi
protein keempat plantaricin akibat degradasi enzim tripsin. Enzim tripsin telah
menghidrolisis substrat aktif di plantaricin yaitu peptida, sehingga menghasilkan
aktivitas penghambatan yang lebih rendah dibandingkan dengan kontrol.
Penurunan konsentrasi protein dan zona hambat plantaricin sejalan dengan
terjadinya penurunan activity unit plantaricin akibat degradasi oleh enzim tripsin
(Gambar 12). Degradasi oleh enzim tripsin telah menurunan lebih dari setengah
activity unit plantaricin. Aktivitas penghambatan keempat plantaricin terhadap
bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 tersebut masih ada walaupun telah
didegradasi oleh enzim tripsin. Hal tersebut dikarenakan masih terdapatnya sejumlah
peptida aktif dalam plantaricin yang tidak terdegradasi oleh enzim tripsin, sehingga
zona hambat hasil uji antagonistik masih terbentuk walaupun zona yang terbentuk
tidak begitu besar serta masih cukup tingginya activity unit plantaricin yang tersisa
setelah degradasi oleh enzim.

38
1440
1264,32
1260

Activity Unit (mm2/ml)


1080
922,01 884,56 862,08
900
720 614,52
540
302,67 335,12
360 261,74
180
0
1A5 1B1 2B2 2C12
Galur L. plantarum

Gambar 12. Histogram Activity Unit Plantaricin Asal Empat Galur Lactobacillus
plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. .. Kontrol, .. Tripsin.

Tabel 7. Diameter Zona Hambat Plantaricin Asal Empat Galur Lactobacillus


plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri Bacillus
cereus

Galur Perlakuan
Rata-rata
Lactobacillus plantarum Kontrol Tripsin

--------------------------------mm-------------------------------
1A5 9,31 ± 1,77 7,64 ± 1,83 8,48 ±1,19
1B1 8,58 ± 1,24 7,15 ± 1,90 7,86 ±1,01
2B2 8,67 ± 1,28 7,72 ± 1,12 8,19 ±0,67
2C12 9,66 ± 1,31 7,23 ± 0,21 8,44 ±1,72
Rata-rata 9,06 ±0,52a 7,44 ±0,30b
Keterangan : Huruf superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan berbeda nyata
(P≤0,05). Diameter lubang sumur (5 mm) termasuk ke dalam diameter zona hambat.

Bacillus cereus merupakan bakteri patogen Gram positif dan menghasilkan


spora (Fardiaz, 1989a). Kontaminasi dalam pangan oleh bakteri ini akan
mengakibatkan sakit pada pencernaan. Hasil uji antagonistik plantaricin 1A5, 1B1,
2B2, dan 2C12 yang diberi perlakuan enzim proteolitik terhadap bakteri Bacillus
cereus dapat dilihat pada Tabel 7. Hasil sidik ragam terhadap zona hambat
menunjukkan bahwa interaksi antara galur Lactobacillus plantarum dengan
perlakuan enzim tripsin tidak berpengaruh terhadap diameter zona hambat (P > 0,05).

39
Perlakuan enzim tripsin berpengaruh nyata terhadap diamater zona hambat pada uji
antagonistik dengan bakteri indikator Bacillus cereus, namun perlakuan galur
Lactobacillus plantarum yang berbeda tidak berpengaruh nyata.
Rataan zona hambat plantaricin terhadap bakteri Bacillus cereus dengan
perlakuan enzim tripsin (7,44 mm) berbeda dengan rataan zona hambat plantaricin
tanpa perlakuan enzim, yang diamaternya lebih tinggi yaitu 9,06 mm. Terjadinya
penurunan diameter zona hambat akibat degradasi enzim tripsin, diikuti dengan
terjadinya penurunan activity unit plantaricin yang telah mendapat perlakuan enzim
tripsin. Berdasarkan data pada Tabel 7 dan Gambar 13, enzim tripsin belum mampu
sepenuhnya menginaktivasi antimikrob keempat plantaricin. Hal ini dapat terlihat
dari masih terbentuknya zona hambat dan masih cukup tingginya activity unit
plantaricin yang diberi perlakuan enzim tripsin terhadap bakteri Bacillus cereus.
Keadaan ini dapat disebabkan oleh masih cukup tingginya peptida aktif
dalam plantaricin yang mampu menghambat pertumbuhan Bacillus cereus, selain itu
dapat disebabkan oleh jenis bakteri indikator yang digunakan. Umumnya bakteri
Gram positif seperti Bacillus cereus ini sangat sensitif terhadap bakteriosin. Karena
bakteri Gram positif mengandung molekul asam teikoat pada membran sitoplasma-
nya, dan molekul ini merupakan reseptor dari bakteriosin (Ray dan Miller, 2003).
Menurut Ray dan Bhunia (2007), efek bakterisidal dari bakteriosin terhadap sel yang
sensitf terjadi secara cepat dan pada konsentrasi yang rendah.

1400
1251,48
1200 1089,61
Activity Unit (mm2/ml)

975,77 1004,57
1000
800 699,35 695,89
560,43
600
428,65
400
200
0
1A5 1B1 2B2 2C12
Galur L. plantarum

Gambar 13. Histogram Activity Unit Plantaricin Asal Empat Galur Lactobacillus
plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri Bacillus
cereus. .. Kontrol, .. Tripsin.

40
Hasil sidik ragam dari diameter zona hambat plantaricin asal empat galur
Lactobacillus plantarum dengan perlakuan enzim tripsin terhadap bakteri
Staphylococcus aureus ATCC 25923 menunjukkan bahwa hanya perlakuan enzim
proteolitik yang berpengaruh sangat nyata (P ≤ 0,01) terhadap diameter zona hambat
plantaricin. Hasil uji antagonistik plantaricin asal empat galur Lactobacillus
plantarum dengan perlakuan enzim tripsin terhadap bakteri Staphylococcus aureus
ATCC 25923 ditampilkan pada Tabel 8.

Tabel 8. Diameter Zona Hambat Plantaricin Asal Empat Galur Lactobacillus


plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri
Staphylococcus aureus ATCC 25923

Galur Perlakuan
Rata-rata
Lactobacillus plantarum Kontrol Tripsin
--------------------------------mm-------------------------------
1A5 8,44 ± 1,66 6,12 ± 1,03 7,28 ± 1,64
1B1 8,13 ± 1,05 6,68 ± 0,80 7,40 ± 1,02
2B2 8,01 ± 1,09 6,00 ± 0,87 7,00 ± 1,42
2C12 8,76 ± 0,74 6,69 ± 0,21 7,72 ± 1,46
a b
Rata-rata 8,34 ±0,34 6,37 ±0,36
Keterangan : Huruf superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan berbeda nyata
(P≤0,05). Lubang sumur (5 mm) termasuk ke dalam diameter zona hambat.

Berdasarkan data yang terdapat pada Tabel 8, rataan diameter zona hambat
plantaricin tanpa perlakuan enzim tripsin adalah 8,34 mm, dan diameter zona hambat
menurun setelah mendapat perlakuan enzim tripsin menjadi 6,37 mm. Penurunan
zona hambat juga diikuti dengan penurunan activity unit plantaricin (Gambar 14).
Activity unit menurun lebih dari setengahnya setelah plantaricin mendapat perlakuan
enzim tripsin. Terjadinya penurunan aktivitas antimikrob plantaricin terhadap bakteri
Staphylococcus aureus ATCC 25923 disebabkan oleh penurunan konsentrasi protein
dalam plantaricin. Peptida-peptida aktifnya sudah didegradasi oleh tripsin, menjadi
asam amino - asam amino yang tidak lagi memiliki kemampuan bakterisidal ataupun
bakteriostatik. Enzim tripsin tidak mendegradasi seluruhnya peptida-peptida aktif
plantaricin, oleh karena itu plantaricin 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 yang telah
mendapat perlakuan enzim tripsin masih memiliki aktivitas penghambatan yang
cukup tinggi. Hal ini terlihat dari masih cukup tingginya baik diameter zona hambat

41
maupun activity unit yang dihasilkan terhadap bakteri Staphylococcus aureus ATCC
25923.

1000 943,89
900 820,97 817,12
783,93
Activity Unit (mm2/ml)

800
700
600
500
392,30
400 310,64
300 258,64
225,56
200
100
0
1A5 1B1 2B2 2C12
Galur L. plantarum

Gambar 14. Histogram Activity Unit Plantaricin Asal Empat Galur Lactobacillus
plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri
Staphylococcus aureus ATCC 25923. .. Kontrol, .. Tripsin.

Rataan diameter zona hambat plantaricin terhadap bakteri Staphylococcus


aureus ATCC 25923 yang dihasilkan oleh galur 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 adalah
sama (P > 0,05). Bakteri Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif,
yang umumnya sangat sensitif terhadap bakteriosin. Hasil penelitian ini sesuai
dengan hasil penelitian mengenai aktivitas plantaricin 1.5.1 terhadap bakteri
indikator Staphylococcus aureus, dimana plantaricin 1.5.1 menghasilkan diameter
zona hambat, namun nilainya lebih tinggi yaitu 9 mm (Omar, 2006).
Interaksi antara galur Lactobacillus plantarum yang berbeda dengan
perlakuan enzim proteolitik, tidak berpengaruh nyata terhadap diamater zona hambat
plantaricin pada uji antagonistik dengan bakteri indikator Escherichia coli ATCC
25922. Enzim tripsin belum mampu menginaktifkan sepenuhnya aktivitas keempat
jenis plantaricin, hal ini terlihat dari data yang terdapat pada Tabel 9. Berdasarkan
data pada Tabel 9, rataan diameter zona hambat plantaricin tanpa perlakuan enzim
tripsin (kontrol) tidak berbeda dengan rataan diameter zona hambat plantaricin
setelah didegradasi enzim tripsin.

42
Tabel 9. Diameter Zona Hambat Plantaricin Asal Empat Galur Lactobacillus
plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri Escherichia
coli ATCC 25922

Galur Perlakuan
Rata-rata
Lactobacillus plantarum Kontrol Tripsin
----------------------------------mm------------------------------
1A5 10,02 ± 3,62 7,81 ± 1,58 8,92±1,56
1B1 8,01 ± 2,71 7,84 ± 3,13 7,93± 0,12
2B2 8,56 ± 1,57 6,93 ± 1,82 7,75±1,15
2C12 9,52 ± 2,31 6,54 ± 0,11 8,03±2,11
Rata-rata 9,03 ± 0,91 7,28± 0,65
Keterangan : Lubang sumur (5 mm) termasuk ke dalam diameter zona hambat.

Enzim tripsin menurunkan activity unit plantaricin sebesar 48,13 %.


Plantaricin yang diberi perlakuan enzim tripsin masih memiliki diameter zona
hambat yang cukup tinggi terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922 terutama
plantaricin 1A5 dan 1B1. Hasil pengukuran activity unit plantaricin dapat dilihat
pada Gambar 15.

1800 1650,47
1600
Activity Unit (mm2/ml)

1400
1200 1087,23
979,25
1000 863,96
800 740,12
843,58
600 496,46
400 278,46
200
0
1A5 1B1 2B2 2C12
Galur L. plantarum

Gambar 15. Histogram Activity Unit Plantaricin Asal Empat Galur Lactobacillus
plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri
Escherichia coli ATCC 25922. .. Kontrol, .. Tripsin.
Plantaricin 1B1 masih memiliki aktivitas penghambatan yang tinggi terhadap
bakteri Escherichia coli ATCC 25922 dengan nilai activity unit 843,58 mm2/ml,

43
walaupun plantaricin tersebut telah mendapat perlakuan enzim tripsin. Selain itu
pesentase penurunan activity unit plantaricin 1B1 akibat perlakuan enzim tripsin
sangat kecil yaitu 2,36%. Hal ini mengindikasikan bahwa enzim tripsin tidak dapat
mendegradasi dengan baik peptida-peptida yang terkandung dalam plantaricin 1B1,
sehingga masih terdapat sejumlah peptida aktif dan mampu menghambat bakteri
Escherichia coli ATCC 25922. Bakteriosin memiliki sebuah struktur amfipatik α-
helical dengan sisi polar dan nonpolar yang berlawanan pada bakteriosin, membuat
bakteriosin dapat berinteraksi dengan kedua fase air dan lipid ketika terikat dengan
permukaan membran sel bakteri yang sensitif, sehingga sel mengalami destabilisasi
fungsional dan sel tersebut mati (Ray dan Bhunia, 2007). Keberadaan struktur
amfipatik α-helical yang tetap baik walaupun plantaricin telah didegradasi enzim
tripsin, akan meyababkan plantaricin tetap memiliki aktivitas penghambatan
terhadap bakteri indikator yang digunakan pada penelitian ini.

Tabel 10. Diameter Zona Hambat Plantaricin Asal Empat Galur Lactobacillus
plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri Salmonella
enteritidis ser. Thypimurium ATCC 14028

Galur Perlakuan
Rata-rata
Lactobacillus plantarum Kontrol Tripsin
---------------------------------mm-------------------------------
1A5 9,56 ± 2,51 6,39 ± 1,55 7,98 ±2,24
1B1 9,23 ± 1,45 6,97 ± 2,09 8,10 ±1,60
2B2 7,92 ± 2,54 6,91 ± 2,21 7,42 ±0,71
2C12 11,59 ± 5,57 6,89 ± 0,03 9,24 ± 3,23
Rata-rata 9,57 ± 1,52a 6,79 ± 0,27b
Keterangan : Huruf superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan berbeda nyata
(P≤0,05). Lubang sumur (5 mm) termasuk ke dalam diameter zona hambat.

Uji non parametrik Kruskal Wallis dilakukan terhadap diamater zona hambat
hasil uji antagonistik empat jenis plantaricin yang diberi perlakuan enzim proteolitik
dengan bakteri Salmonella enteritidis ser. Thypimurium ATCC 14028. Hasil
pengujian yang ditampilkan pada Tabel 10 menunjukkan bahwa perlakuan enzim
proteolitik berpengaruh sangat nyata (P ≤ 0,01) terhadap diameter zona hambat
plantaricin pada uji antagonistik dengan bakteri Salmonella enteritidis ser.
Thypimurium ATCC 14028. Selain itu, activity unit plantaricin hasil uji antagonistik

44
dengan bakteri Salmonella enteritidis ser. Thypimurium ATCC 14028 pun menurun
akibat pemberian enzim tripsin. Enzim tripsin mampu menurunkan lebih dari
setengah activity unit plantaricin 1A5, 1B1, dan 2C12, lain halnya dengan
plantaricin 2B2 yang hanya mengalami penurunan sebanyak 38,01 %.
Penurunan aktivitas antimikrob terbesar dimiliki oleh plantaricin 2C12,
dimana diameter zona hambat plantaricin 2C12 kontrol adalah 9,57 mm dengan
activity unit sebesar 2039,75 mm2/ml, sedangkan setelah diberi perlakuan enzim
tripsin diamater zona hambatnya terhadap bakteri Salmonella enteritidis ser.
Thypimurium ATCC 14028 menurun menjadi 6,79 mm dan menyisakan activity unit
sebesar 353,54 mm2/ml (Gambar 16). Hal ini menunjukkan bahwa enzim tripsin
efektif menghidrolisis ikatan-ikatan peptida yang terdapat dalam plantaricin 2C12.
Hasil penghambatan yang cukup besar oleh plantaricin murni 2C12 juga
mengindikasikan bahwa plantaricin ini efektif menghambat pertumbuhan bakteri
Salmonella enteritidis ser. Thypimurium ATCC 14028 yang merupakan bakteri
Gram negatif.

2500
2039,75
2000
Activity Unit (mm2/ml)

1500 1386,58
1207,85

1000 823,84

520,16
510,72
500 342,47 353,54

0
1A5 1B1 2B2 2C12
Galur L. plantarum

Gambar 16. Histogram Activity Unit Plantaricin Asal Empat Galur Lactobacillus
plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri
Salmonella enteritidis ser. Thypimurium ATCC 14028. Kontrol, ...
Tripsin.

Umumnya bakteri Gram negatif resisten terhadap bakteriosin, namun pada


keadaan tertentu bakteri Gram negatif dapat menjadi sensitif terhadap bakteriosin
apabila mendapat perlakuan fisik maupun kimia, contohnya dengan memberikan

45
perlakuan tekanan tinggi terhadap sel (Ray dan Bhunia, 2007). Hasil yang diperoleh
pada penelitian ini serupa dengan hasil penelitian lain. Aktivitas antimikroba dari
bakteriosin yang dihasilkan oleh strain bakteri asam laktat isolat Lactobacillus
plantarum asal yogurt hasil industri rumah tangga di Mesir (Abo-Amer, 2007)
berhasil menghambat pertumbuhan bakteri Salmonella enteritidis ser. Thypimurium,
dengan zona hambat sebesar 8 mm (strain AA110), 7 mm (strain AA125 dan
AA140), 9 mm (strain AA135).
Berdasarkan hasil uji antagonistik plantaricin murni 1A5, 1B1, 2B2, dan
2C12, terlihat bahwa keempat plantaricin tersebut mampu dan efektif menghambat
bakteri-bakteri indikator yang digunakan, baik bakteri Gram positif maupun bakteri
Gram negatif, sehingga dapat dikatakan bahwa keempat plantaricin ini mempunyai
spektrum antimikrob yang luas. Pan et al. (2009) menyatakan, terdapat tiga kategori
aktivitas antimikrob yaitu lemah dengan diameter zona hambat 0 – 3 mm, baik
dengan diameter zona hambat 3 – 6 mm, dan kuat dengan diameter lebih dari 6 mm.
Keempat galur produsen plantaricin tersebut memberikan pengaruh yang sama
terhadap aktivitas penghambatan yang dilakukan untuk menghambat bakteri
indikator. Ray and Bhunia (2007) menyatakan, beberapa strain pada spesies yang
sama dapat memproduksi bakteriosin yang sama dan dapat pula yang berbeda,
namun diketahui juga bahwa satu strain bakteri dapat memproduksi lebih dari satu
bakteriosin.
Hasil uji sensitivitas plantaricin 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 terhadap enzim
tripsin yang dilakuan pada penelitian ini, secara keseluruhan berbeda dengan hasil
peneliti yang lain. Aktivitas antimikroba dari bakteriosin yang dihasilkan oleh strain
bakteri asam laktat asal susu fermentasi Burkina Faso (Savadogo et al., 2004), isolat
Lactobacillus plantarum ST13BR asal bir Barley (Todorov et al., 2004), isolat
Lactobacillus plantarum ST19BZ asal Boza (Todorov dan Dicks, 2005), isolat
Lactobacillus plantarum asal yogurt hasil industri rumah tangga di Mesir (Abo-
Amer, 2007) dan isolate Lactobacillus plantarum LPC010 asal fermentasi green
olive diinaktifkan secara sempurna oleh semua enzim proteolitik yang digunakan,
antara lain enzim pepsin, tripsin, α-khimotripsin, pronase E, dan proteinase K.

46
KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan
Lactobacillus plantarum 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 mampu menghasilkan
bakteriosin yang disebut plantaricin. Sebagian plantaricin dapat terdegradasi oleh
tripsin yang ditunjukkan dengan penurunan aktivitas plantaricin setelah inkubasi
dengan tripsin. Plantaricin 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 mampu menghambat
pertumbuhan bakteri Gram positif yaitu Bacillus cereus dan Staphylococcus aureus
ATCC 25923, serta bakteri Gram negatif yaitu Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853, Salmonella enteritidis ser. Thypimurium ATCC 14028, dan Escherichia coli
ATCC 25922.

Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menentukan asam amino
penyusun peptida-peptida plantaricin 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12, serta untuk
menentukan sensitivitas plantaricin tersebut terhadap enzim proteolitik lainnya yaitu
pepsin dan α-khimotripsin.

47
UCAPAN TERIMA KASIH

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat
dan karunia-Nya yang telah melimpahkan nikmat dan kemudahan sehingga skripsi
ini dapat terselesaikan. Shalawat serta salam semoga tercurahkan kepada Nabi
Muhammad SAW beserta keluarga, para sahabat, dan para pengikutnya hingga akhir
zaman.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Irma Isnafia Arief, S,Pt., M.Si
dan Tuti Suryati, S.Pt., M.Si. selaku dosen pembimbing skripsi yang telah
mencurahkan waktu, dan memberikan bimbingan dalam penelitian serta penyusunan
skripsi ini, kepada Ir. Hotnida C.H. Siregar, M.Si selaku dosen pembimbing
akademik, serta kepada Ir. B.N. Polii, SU dan Dr. Ir. Yuli Retnani, M.Sc. selaku
dosen penguji sidang atas masukan-masukan yang diberikan. Tidak lupa penulis
mengucapkan terima kasih kepada seluruh dosen yang telah membimbing dan
memberikan bekal ilmu selama penulis menuntut ilmu di Fakultas Peternakan,
Institut Pertanian Bogor.
Rasa terima kasih yang sangat dalam penulis sampaikan kepada kedua orang
tua, Ayahanda Ade Sutisna dan Ibunda Lelih Sondari yang senantiasa memberikan
kasih sayang, mendukung baik secara moril dan materil, serta senantiasa mendoakan
penulis untuk keberhasilan penulis. Kepada kakak Fitra Suri Aditya dan adik
Muhamad Rizki Maulidan, atas doa dan dukungannya.
Tidak lupa penulis mengucapkan terima kasih kepada Devi Murtini, S.Pt.,
Dwi Febriantini, serta keluarga penelitian plantaricin Anis Usfah Prastu Jati, Khairul
Bariyah, Ade Fuziawan, Tri Santi Marselly, Indri Septiani, Handa Habibullah
Siregar, Fariz Am Kurniawan, dan Dede Supriatna yang telah berbagi dalam suka
dan duka selama penelitian. Teman-teman penelitian di Laboratorium Terpadu M.
Sarwar Khan, Kasih Febrina Suheri, dan Ritoh Yahya. Teman-teman seperjuangan
IPTP 44, serta sahabat-sahabat Maya Rachmawaty, Annisa Oktavia Rini, Dini
Widyaningrum, Rina Atrina, dan Talkhishul Abid.
Terakhir, penulis ucapkan terima kasih kepada semua pihak yang tidak dapat
disebutkan satu-persatu di dalam skripsi ini yang telah membantu penulis selama ini
dan seluruh civitas akademika Fakultas Peternakan IPB.

48
DAFTAR PUSTAKA

Abo-Amer, A.E. 2007. Characterization of a bacteriocin-like inhibitory substance


produced by Lactobacillus plantarum isolated from Egyptian home-made
yogurt. Research Article. Science Asia. 33: 313-319.
Adam, M.R. & O. Moss. 2008. Food microbiology. 3rd Edition.
http://books.google.co.id/books?id [28 Juni 2010].
Adnan, M. 1997. Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan Makanan. Andi,
Yogyakarta.
Altena, K., A. Guder, C. Crame, & G. Bierbaum. 2000. Biosynthesis of lantibiotic
mersacidin: Organization og type B lantibiotic gane cluster. J. Apply Environ
Microbiol. 66: 2565 – 2571.
Arief, I. I., R. R. A. Maheswari, & T. Suryati. 2008. Isolasi dan karakterisasi bakteri
asam laktat dari daging sapi lokal di pasar tradisional daerah Bogor. Laporan
Penelitian Hibah Bersaing XIII/3. LPPM-IPB.
Arief, I.I., B.S.L. Jenie, M. Astawan, & A.B. Witarto. 2011. Karakterisasi isolat
indigenus bakteri asam laktat sebagai kandidat probiotik secara in vitro serta
identifikasinya dengan PCR (Polymerase Chain Reaction) dan sekuensing
GEN 165 rRNA. Laporan Penelitian Hibah Bersaing. LPPM-IPB.
Axelson, L. 2004. Lactic Acid Bacteria: Classification and Physiology. In:Salmien,
S, A.V. Wright & A. Ouwehand (Editor). Lactic Acid Bacteria
Microbiological and Functional Aspects. 3rd Edition, Revised and Expanded
Marcel Dekker, Inc., New York.
Brands, D. 2006. Salmonella, Deadly Diseases and Epidemics. Foreword: D.
Heymann. Chelsea House Publisher, USA.
Buckle, K.A., R.A. Edwards, G.H. Fleet, & M. Wooton. 1987. Ilmu Pangan.
Terjemahan: H. Purnomo & Adiono. Universitas Indonesia Press, Jakarta.
Cleveland, J., T.J. Motville, I.F. Nes, & M.L. Chikinda. 2001. Bacteriocin : Safe
natural antimicrobials for food preservation. J. Int J Food Microbiol. 71: 1-20.
Cowan, M.K. & K.P. Talaro. 2009. Microbiology- A System Approach. Mc Graw
Hill, New York.
Cook, L.F. & K.V. Cook. 2008. Staphylococcus Infection, Deadly Diseases and
Epidemic. Foreword: D. Heymann. Chelsea House Publisher, USA.
Davidson, P. M. & A. L. Branen. 1993. Antimicrobials in Foods. 2nd Edition. Marcell
Dekker, Inc., New York.
Day, R. A. Jr. & A. L. Underwood. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Edisi Keenam.
Erlangga, Jakarta.

49
Driber, D., G. Fimland, Y. Hechard, Mc. Mullen, & H. Prevost. 2006. The
continuing story of class II bacteriocins. J. Microbiol. Mol. Biol. Rev : 562-
582.
Doonan, S. 2004. Bulk purification by fractional precipitation. In: Culter,P (Editor).
Protein Purification Protocols. 2nd Edition. Human Press, Totowa, New
Jersey. http://books.google.co.id/books?id. [23 Desember 2011].
Dwidjoseputro. 1990.Dasar-DasarMikrobiologi. Edisi ke-11. PT. Djembatan, Jakarta.
Englard, S. & S. Seifter. 1990. Precipitation techniques. In: Murray, P.D (Editor).
Methods in Enzymology Guide to Protein Purification. Academic Press, San
Diego, California.
Fardiaz, S. 1989a. Mikrobiologi Pangan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan
Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi. Pusat Antar Universitas Pangan dan
Gizi. Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Fardiaz, S. 1989b. Analisis Mikrobiologi Pangan. Departemen Pendidikan dan
Kebudayaan Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi. Pusat Antar Universitas
Pangan dan Gizi. Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan
Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi. Pusat Antar Universitas Pangan dan
Gizi. Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Firmansyah, D. 2009. Profil fenotipik Isolat Bakteri Asam Laktat yang Berasal dari
Daging. Skripsi. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Hata, T., R. Tanaka., & S., Ohmomo. 2010. Isolation and characterization of
plantaricin ASM1: A new bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum
A-1. J. Food Microbiology. 137 : 94-99.
Hidayati, N. 2006. Isolasi, identifikasi dan karakterisasi L. plantarum asal daging
sapi dan aplikasinya pada kondisi pembuatan sosis fermentasi. Skripsi.
Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Holt, J.G., N.R. Krieg, P.H.T Sneath, J.T. Staley & S.T. Williams. 1994. Bergey’s
Manual of Determinative Bacteriology. 9th Edition. Lippincott Williams and
Wilkins, Philadelphia.
Jack, R.W., J.R. Tagg, & B. Ray. 1995. Bacteriocin of Gram positive bacteria.
Microbiol. Rev. 59: 1416-1429.
Jeevaratnam, K., M. Jamuna, & A.S. Bawa. 2005. Biological preservation-
bacetiocin of lactic acid bacteria. J. Indian Journal of Biotechnology. 4: 446-
454.
Jenie, S.L., & S. E. Rini. 1995. Aktivitas antimikroba dari beberapa spesies
Lactobacillus terhadap mikroba patogen dan perusak makanan. Bul. Teknol.
Industri Pangan. 7(2) : 46-51.

50
Joe Young Boe., B. Kwung Ni, K. Sung Koo, & J. Hong Ki. 1996. Evaluation of
optimum production for bacteriocin from Lactobacillus sp. JB 42 isolation
from Kimchi. J. Microbiol. Biotech. 6 : 63-67.
Mattjik A. A. & Sumertajaya M. 2002. Perancangan Percobaan dengan Aplikasi
SAS dan Minitab. Jilid I. Edisi Kedua. IPB Press, Bogor.
Moreno, I., A.L.S. Lerayer, V.L.S. Baldini, & F. Mauro de F. Leitão3. 2000.
Characterization of bacteriocins produced by Lactococcus lactis strains. J.
Brazillian Journal of Microbiology. 31:184-192
Nurliana. 1997. Pengaruh penambahan bakteriosin dan gabungan bakteriosin
produksi bakteri asam laktat terhadap jumlah bakteri dalam susu pasteurisasi.
Tesis. Kesehatan Masyarakat Veteriner, Pascasarjana, Institut Pertanian
Bogor.
Omar, N.B., H. Abriouel, R. Lucas, & M.Martinez- Canamero. 2006. Isolation of
bacteriocinogenic Lactobacillus plantarum strains from ben saalga, a
traditional fermented gruel from Burkina Faso. J. Food Microbiology. 112:
44-50.
Pan, X., F. Chen, T. Wu, H. Tang, & Z. Zhou. 2009. The acid, bile tolerance, and
antimicrobial property of Lactobacillus acidophilus NIT. J. Food Control. 20:
598-602.
Pelczar, M. J. & E. C. S. Chan. 2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Terjemahan R. S.
Hadioetomo, T. Imas, S. D. Tjitrosomo & S. L. Angka. Universitas Indonesia
Press, Jakarta.
Poedjiadi, A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Universitas Indonesia Press, Jakarta.
Rahman, A., S. Fardiaz, W.P. Rahayu, Suliantri & C.C. Nurwitri 1992. Teknologi
Fermentasi Susu. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi. Pusat Antar
Universitas Pangan dan Gizi. Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Ray, B. & A. Bhunia. 2007. Fundamental Food Microbiology. 4th Edition. CRC
Press, Boca Raton, London, New York, Washington, D.C.
Ray, B. & K.W. Miller. 2003. Bacteriocins other than nisin: the pediocin like
cystibiotics of LAB. In : Roller, S. (editor). Natural Antimicrobial for the
Minimal Processing of Food. Woodhead Publishing, Ltd., London.
Roller, S. 2003. Natural antimicrobials for the minimal processing of foods.
Woodhead Publishing, Ltd. Cambridge, England.
Salasia, S.I.O., H.W. Michael, & Khusnan. 2005. Karakteristik fenotipe isolat
Staphylococcus aureus dari sampel susu sapi perah mastitis subklinis. J. Sain
Vet. 23(2): 72-78.
Sapatnekar, N.M., S.N. Patil, & B.A. Aglave. 2010. Extraction of bacteriocin and
study of its antagonistic assay. International J. of Biotechnology and
Biochemistry (6): 865-870.

51
Savadogo, A., A. T. Q. Cheik, H. N. B. Imael & S. A. Traore. 2004. Antimicrobial
activities of lactic acid bacteria strain isolated from Burkina Faso fermented
milk. Pakistan J. Nutr. 3 (3): 174-179.
Savadogo, A.,A.T.Q. Cheik, H.N.B. Imael & S.A. Traore. 2006. Bacteriocins and
lactic acid bacteria- a minireview. Afric. J. Biotechnol. 5(9): 678-683.
Smid, E.J. & L.G.M. Gorris. 2007. Natural antimicrobial for food preservation.
In:Rahman, M.S. (Editor). Handbook of Food Preservation. 2nd Edition. CRC
Press, New York.
Soedarmo, D.M., Girindra,A., Manaf, A., Hawab, M., Kustaman, E., Bintang, M., &
Sulistiyani. 1988. Penuntun Praktikum Biokimia. Pusat Antar Universitas
Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Suhartono, M.T. 1988. Pengantar Biokimia. Pusat Antar Universitas Institut
Pertanian Bogor, Bogor.
Syahniar, T.M. 2009. Produksi dan Karakterisasi Bakteriosin Asal Lactobacillus
plantarum 1A5 serta Aktivitas Antimikrobanya Terhadap Bakteri Patogen.
Skripsi. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Todorov, S.D., C.A. van Reenen, & L.M.T Dicks. 2004. Optimization of bacteriocin
production by Lactobacillus plantarum ST13BR, a strain isolated from barley
beer. J. Gen. Appl. Microbiol. 50: 149–157.
Todorov, S.D. & L.M.T. Dicks. 2005. Effect of growth medium on bacteriocin
production by Lactobacillus plantarum ST194BZ, a strain isolated from boza.
J. Food Technol. Biotechnol. 43(2) : 165-173.
Tokuyasu, K., H. Ono, K. Hayasi, & Y. Mori. 1996. Purification and characterization
of extracellular chitin deacetylase from Colletotricum lindemuthianum. Biosc.
Biotech. Biochem. 10: 1598-1603.
Tortora, G.J., B.R. Funke, & C.L. Case. 2006. Microbiology an Intoduction. 9th
Edition. Pearson Education, Inc. Publishing as Benjamin Cummings, San
Fransisco.
Vuyst, L.D. & E.J. Vandamme. 1994. Lactic acid bacteria and bacteriocins : their
practical importance. In:Vuyst, L.D. and E.J. Vandamme (editors).
Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria. Microbiology, Genetic and Application.
Blakie Academic and Profesional, London.
Waluyo, L. 2008. Teknik Metode Dasar dalam Mikrobiologi. UMM Press, Malang.
Winarno, F.G. 1989. Enzim Pangan. PT. Gramedia, Jakarta.
Wiryawan, K.G. & Tjaktradidjaja, A. S. 2001. Produksi biopreservatif atau feed
supplement (bakteriosin) dari Bakteri Asam Laktat. Laporan Akhir. Fakultas
Peternakan. Institut Pertanian Bogor, Bogor.

52
Yamato, M., K. Ozaki, & F. Ota. 2003. Partial purification and characterization of
the bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus YIT 0154. J. Mirobiol.
Res. 158: 169-172.

53
LAMPIRAN

54
Lampiran 1. Hasil Sidik Ragam Persentase Penurunan Protein Plantaricin
Asal Empat Galur Lactobacillus plantarum setelah
Didegradasi Enzim Tripsin

Derajat Jumlah Kuadrat


Sumber Keragaman F P
Bebas Kuadrat Tengah
Galur Lactobacillus 3 2789,1 929,7 1,80 0,226
plantarum
Galat 8 4139,1 517,4

Total 11 6928,2

Lampiran 2. Hasil Sidik Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin Asal


Empat Galur Lactobacillus plantarum dengan Perlakuan
Enzim Tripsin terhadap Bakteri Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853

Derajat Jumlah Kuadrat


Sumber Keragaman F P
Bebas Kuadrat Tengah
Enzim 1 26,040 26,040 9,28 0,008
Galur Lactobacillus 3 5,645 1,885 0,67 0,582
plantarum
Interaksi Enzim dan
Galur Lactobacillus 3 0,219 0,073 0,994
plantarum
Galat 16 44,887 2,085
Total 23 76,800

Lampiran 3. Diameter Zona Hambat Plantaricin Asal Empat Galur


Lactobacillus plantarum dengan Perlakuan Enzim Tripsin
terhadap Bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Enzim Nilai Tengah Kehomogenan Grup

Kontrol 8,6837 A

Tripsin 6,6004 B

55
Lampiran 4. Hasil Sidik Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin Asal
Empat Galur Lactobacillus plantarum dengan Perlakuan
Enzim Tripsin terhadap Bakteri Bacillus cereus

Derajat Jumlah Kuadrat


Sumber Keragaman F P
Bebas Kuadrat Tengah
Enzim 1 15,701 15,701 7,70 0,014
Galur Lactobacillus 3 1,426 0,475 0,23 0,872
plantarum
Interaksi Enzim dan
Galur Lactobacillus 3 1,717 0,572 0,28 0,838
plantarum
Galat 16 32,607 2,038
Total 23 51,451

Lampiran 5. Uji Tukey Diameter Zona Hambat Plantaricin Asal Empat


Galur Lactobacillus plantarum dengan Perlakuan Enzim
Tripsin terhadap Bakteri Bacillus cereus

Enzim Nilai Tengah Kehomogenan Grup


Kontrol 9,0542 A
Tripsin 7,4365 B

Lampiran 6. Hasil Sidik Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin Asal


Empat Galur Lactobacillus plantarum dengan Perlakuan
Enzim Tripsin terhadap Bakteri Staphylococcus aureus ATCC
25923

Derajat Jumlah Kuadrat


Sumber Keragaman F P
Bebas Kuadrat Tengah
Enzim 1 23,118 23,118 22,86 0,000
Galur Lactobacillus 3 1,597 1,597 0,53 0,670
plantarum
Interaksi Enzim dan
Galur Lactobacillus 3 0,599 0,200 0,20 0,897
plantarum
Galat 16 16,179 1,011
Total 23 41,493

56
Lampiran 7. Uji Tukey Diameter Zona Hambat Plantaricin Asal Empat
Galur Lactobacillus plantarum dengan Perlakuan Enzim
Tripsin terhadap Bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923

Enzim Nilai Tengah Kehomogenan Grup


Kontrol 8,3345 A
Tripsin 6,3716 B

Lampiran 8. Hasil Sidik Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin Asal


Empat Galur Lactobacillus plantarum dengan Perlakuan
Enzim Tripsin terhadap Bakteri Escherichia coli ATCC 25922

Derajat Jumlah Kuadrat


Sumber Keragaman F P
Bebas Kuadrat Tengah
Enzim 1 18,298 12,298 3,34 0,086
Galur Lactobacillus 3 4,889 1,630 0,30 0,827
plantarum
Interaksi Enzim dan
Galur Lactobacillus 3 6,388 2,128 0,39 0,763
plantarum
Galat 16 87,703
Total 23 117,273

Lampiran 9. Hasil Uji Kruskal-Wallis Zona Hambat Plantaricin yang Diberi


Perlakuan Enzim Tripsin terhadap Bakteri Salmonella
enteritidis ser. Thypimurium ATCC 14028

Perlakuan N Nilai Tengah Ranking Z


Enzim Tripsin 12 1,809 8,5 -2,74
Kontrol (Tanpa Tripsin) 12 4,032 16,5 2,74
Total 24 12,5
H = 7,55 DF = 1 P = 0,006

57
Lampiran 10. Uji All-Pairwise Comparisons Kruskal-Wallis Zona Hambat
Plantaricin yang Diberi Perlakuan Enzim Tripsin terhadap
Bakteri Salmonella enteritidis ser. Thypimurium ATCC 14028

Kehomogenan
Enzim Nilai Tengah Ranking
Grup

Kontrol 16,458 A

Tripsin 8,5417 B

Lampiran 11. Hasil Uji Kruskal-Wallis Zona Hambat Plantaricin yang


Berasal dari Galur Lactobacillus plantarum yang berbeda
terhadap Bakteri Salmonella enteritidis ser. Thypimurium
ATCC 14028

Perlakuan N Nilai Tengah Ranking Z


L. plantarum 1A5 6 2,739 11,8 -0,30
L. plantarum 1B1 6 3,382 13,8 0,50
L. plantarum 2B2 6 2,758 11,2 -0,53
L. plantarum 2C12 6 2,530 13,3 0,33
Total 24 12,5
H = 0,55 DF = 3 P = 0,907

Lampiran 12. Tahapan Pembuatan Buffer Potassium Phosphate 0,1 M

1) Pembuatan stok K2HPO4 (1M)

Bobot molekul (BM) = 174,18

Bobot X gram
Molaritas = 1M =
BM x Volume larutan 174,18 x 1 L

X gram = 174, 18 gram, untuk 1 L larutan K2HPO4

174,18
Untuk 500 ml larutan= = 87,09 gram
2
87, 09 gram K2HPO4 dilarutkan dalam 500 ml akuades, kemudian dihomogenkan.

2) Pembuatan stok KH2PO4 (1M)

Bobot molekul (BM) = 136,09

Bobot X gram
Molaritas = 1M =
BM x Volume larutan 136,09x 1 L

58
X gram = 136,09 gram, untuk 1 L larutan KH2PO4

136,09
Untuk 500 ml larutan= = 68,045 gram
2
68,045 gram KH2PO4 dilarutkan dalam 500 ml akuades, kemudian dihomogenkan.

3) Pembuatan buffer Potassium Phosphate1M (100 ml) pH = 6 – 6,8

1 M K2HPO4 1 M KH2PO4
46,7 ml 50,5 ml

Buffer Potassium
Phosphate1M
Ukur pH hingga 6 -6,8

4) Pengenceran Buffer Potassium Phosphate1M menjadi 0,1 M


V1xM1 = V2xM2
100 ml x 1M = V2 x 0,1 M
V2 = 100 / 0,1 = 1000 ml
Sehingga 100 ml buffer Potassium Phosphate1M dilarutkan dalam 900 ml akuades
pH netral, dan dihasilkan buffer Potassium Phosphate0,1 M pH 6 – 6,8

Lampiran 13. Pembuatan buffer tris hidroklorida (Tris HCl) 0,05 M


 Bobot Moleku Tris Base = 121,14 g/mol

X gram = 121,14 gram, untuk 1 L larutan Tris Base 1 M

121,14 gram
1 L Tris Base 0,05 M = =6,057 gram
20

 Untuk membuat 100 ml larutan tris base maka sebanyak 0,6057 gram tris
base dilarutkan dalam 100 ml akuades, lalu dilakukan pengecekan pH.
 Tambahkan HCl pekat (25 %) hingga pH larutan mencapai 6,8 - 7.

59
Lampiran 14. Dosis Penggunaan Enzim Tripsin

 Enzim yang digunakan adalah : Tripsin from bovine pancrease T1426 100 mg
Sigma Life Science. Activity ≥ 10000 BAEE units/ mg protein
13821 units/ mg solid; 13960 unit/ mg protein
 Dosis penggunaan enzim tripsin adalah sebanyak 0,5 mg dalam 1 ml larutan
buffer tris HCl
 Enzim tripsin dilarutkan dalam buffer tris HCl, kemudian dihomogenkan
bersama sample plantaricin dengan dosis 1:1.

Lampiran 15. Gambar Zona Hambat Plantaricin terhadap Berbagai Bakteri


V
Indikator

Zona Hambat Plantaricin 1A5 Zona Hambat Plantaricin 2C12

Zona Hambat Plantaricin 1B1 Zona Hambat Plantaricin 2B2

60