Anda di halaman 1dari 8

B.

Cara Pembuatan Ezim


Enzim adalah produk protein sel hidup yang berperan sebagai biokatalisator dalam
proses biokimia, baik yang terjadi di dalam sel maupun di luar sel (Poedjadi, 1994),
sedangkan menurut Smith (1990) menyatakan bahwa enzim adalah sautu kompleks protein
yang menjalankan dan mengatur perubahan-perubahan kimia dalam sistem biologis.
Enzim pada umumnya selain dapat diperoleh dari mikroorganisme juga dapat diproduksi
dari tanaman dan hewan, tetapi enzim yang diperleh dari mikroorganisme yang paling
banyak digunakan dibandingkan dengan tanaman dan hewan (Akhdiya, 2003). Enzim
diisolasi dari hewan, tumbuhan dan mikroorganisme dengan beberapa cara antara lain;
metode ekstraksi, koagulasi, sentrifugasi, filtrasi dan kromatografi.
1. Produksi Enzim dari Mikroorganisme
Produksi enzim yang berasal dari mikroorganisme yang paling banyak
digunakan, hal dikernakan pertumbuhannya cepat, dapat tumbuh pada substrat yang
murah, lebih mudah ditingkatkan hasilnya melalui pengaturan kondisi pertumbuhan
dan rekayasa genetik serta mampu menghasilkan enzim yang ekstrim.
Mikroorganisme yang unggul merupakan salah satu faktor penting dalam usaha
produksi enzim baik yang berupa bakteri atau kapang (Akhdiya, 2003)
1.1 Produksi Enzim Skala Industri
Produksi enzim secara industri saat ini sangat mengandalkan metode
fermentasi tangki dalam (deep tank). Bahan mentah (raw material) untuk industri
fermentasi enzim biasanya terbatas pada unsur-unsur dimana bahan tersedia
dengan harga yang murah, dan aman secara nutrisi. Dalam produksi enzim,
menggunakan batch untuk proses fermentasi dengan aerasi yang baik (diagram 1),
tetapi proses mungkin ditingkatkan dengan memelihara satu atau beberapa
komponen selama fermentasi.
Beberapa enzim yang digunakan dalam skala industri adalah enzim
ekstraseluler, enzim yang secara normal dihasilkan oleh mikroorganisme sesuai
dengan substratnya dalam lingkungan eksternal dan dapat disamakan dengan
enzim pencernaan pada manusia dan hewan. Kemudian ketika mikroorganisme
memproduksi enzim untuk memisahkan molekul eksternal besar agar bisa dicerna
biasanya digunakan media fermentasi. Dalam fermentasi sari dari kultivasi
mikroorganisme tertentu, seperti contoh, bakteri, yeast atau filamentous jamur,
dijadikan sumber utama protease, amilase dan sedikit selolosa, lipase, dsb
Beberapa enzim intraseluler, sekarang juga banyak diproduksi secara
industri dan diantaranya glukosa oksidase untuk pengawetan makanan,
asparginase untuk terapi kanker, dan penicilin asilase untuk antibiotikTahap
pemulihan standar untuk enzim ekstraseluler seperti berikut: memindah
mikroorganisme, mengkonsentrasikan, penambahan bahan pengawet, standarisasi
dan pengepakan. Untuk ekstraksi enzim intraseluler memerlukan cara mekanis,
fisik atau gangguan kimiapada dinding sel atau membran.
Untuk menghasilkan enzim dalam skala Industri, tetap saja diawali oleh
sebotol kecil mikroorganisme yang dipersiapkan untuk itu. Umumnya
mikroorganisme dalam bentuk kering atau sudah dalam bentuk terbekukan untuk
menjaga dari gangguan lingkungan yang mampu mengubah keadaan
mikroorganisme tersebut atau malah dapat mematikannya. Mikroorganisme
tertentu yang dipersiapkan tersebut dinamakan “production strain”, atau
mikroorganisme jenis tertentu yang merupakan cikal bakal produk enzim.
Hal yang sangat penting diperhatikan dalam proses fermentasi adalah
sterilisasi. Untuk memperoleh enzim sesuai dengan yang diinginkan, strain
produksi dan bahan baku yang digunakan dalam proses pembuatan enzim haruslah
benar-benar terjaga dari kontaminan atau mikroorganisme lain yang tidak
diinginkan. Hal ini untuk menjaga produk dan menghilangkan kegagalan produk,
Jika strain produksi tidak dijaga dari kontaminan, kemungkinan akan terjadi
penggandaan yang tidak terkendali, mikroorganisme “antah barantah” akan muncul
dengan tujuannya masing-masing dan dalam keadaan ini produk yang diinginkan
tidak akan diperoleh.
Strain produksi, disebut juga bibit untuk produksi enzim, pada mulanya
dibiakan dalam labu kecil yang mengandung nutrien. Nutrien adalah persediaan
bahan makanan untuk mikroorganisme tertentu yang akan dikembangbiakkan.
Labu tersebut ditempatkan dalam inkubator, sebuah alat yang mampu menjaga
temperatur optimal bagi pertumbuhan mikroorganisme yang dimaksud.
Tahap selanjutnya, bibit dipindahkan ke dalam peralatan yang akan
memfermentasikan bibit mikroorganisme tersebut. Peralatan yang lebih besar dari
labu kecil tadi, sebelumnya telah mengandung bahan baku dan air sebagai medium
perkembangannya. Fermentasi akan berlangsung dengan membiarkan sel-sel
mengalami penggandaaan dan menyesuaikan dengan lingkungan dan nutriennya.
Selanjutnya dipindahkan ke tanki yang lebih besar yang merupakan alat fermentasi
utama. Dalam proses ini akan dilakukan pengontrolan terhadap waktu fermentasi,
temperatur, pH, dan udara sedemikian rupa untuk mengoptimasi pertumbuhan
sehingga hasil fermentasi yang diinginkan dapat diperoleh.
Proses selanjutnya adalah proses penyaringan (filtrasi) dan pemurnian
(purifikasi). Campuran sel, nutrien, dan enzim disebut dengan air kaldu. Proses
filtrasi dan purifikasi terhadap air kaldu ini adalah proses paling menentukan dalam
proses fermentasi enzim. Enzim akan ditarik (diekstrak) dari air kaldu melalui
proses kimia yang melibatkan beberapa bahan kimia tertentu untuk mendapatkan
ekstraksi yang efisien. Filtrasi dilakukan dengan mekanisme sentrifugasi.
Campuran kaldu dimasukkan dalam alat centrifuse, sehingga terbentuk pemisahan
campuran antara enzim bercampur air dan bahan lain dalam kaldu.
Setelah terpisah, proses selanjutnya yang dilakukan adalah penguapan
(evaporasi) terhadap air yang masih bercampur dengan enzim sehingga enzim yang
diinginkan benar-benar murni. Enzim akan diformulasikan dalam bentuk bubuk,
atau tetap dalam keadaan cair, dapat juga dalam bentuk granul. Harus dipastikan
bahwa produk enzim yang dihasilkan dalam keadaan stabil, penyimpanan sesuai
standar, dan harus aman untuk digunakan.
Industri berbasis biokimia, khususnya fermentasi memiliki bidang
penjaminan mutu yang sangat teliti. Tugasnya adalah untuk mengontrol setiap
waktu proses produksi dan produk akhir enzim sehingga layak dijual sesuai dengan
spesifikasi dan kegunaan enzim yang diproduksi.

1.2 Produksi Enzim Skala Laboratorium


Untuk mengawali proses pembuatan enzim, hal yang dipersiapkan adalah
sebotol kecil mikroorganisme tertentu yang akan dipelihara dan dikembangkan
hingga terjadinya proses penggandaan dalam jumlah banyak. Kemudian produk
yang diinginkan akan diperoleh. Bahan yang paling penting dalam pembuatan
enzim adalah kehadiran mikroorganisme, semisal bakteri.
Bakteri tunggal mampu memproduksi enzim dalam jumlah yang kecil,
semakin banyak mikroorganisme yang terlibat maka akan menghasilkan jumlah
enzim yang lebih banyak. Proses penggandaan mikroorganisme inilah yang disebut
dengan proses fermentasi.
a. Produksi Enzim Kitinase Dari Aspergillus niger
Beberapa penelitian telah mencoba menghidrolisis kitin dengan enzim yang
dihasilkan oleh Aspergillus sp, Bacillus sp, Clostridium sp, Serratia sp, Aeromonas
sp, dan Trichoderma sp. (Maggadani, 2012). Aspergillus niger merupakan jenis
kapang yang dapat mensekresikan enzim selulase, kitinase, α- amilase, α-amilase,
glukoamilase, katalase, pektinase, lipase, laktase, invertase, dan asam protease
(Purkani dkk, 2016).
1. Pembuatan media
Media padat untuk peremajaan isolat Aspergillus niger digunakan media
Potato Dextrose Agar (PDA). Untuk media pertumbuhan terdiri dari (g/L air):
MgSO4 7H2O 1,0; KH2PO4 1,5; CaCl2 2H2O 0,2; yeast ekstrak 0,2, glukosa,
molase, ditambahkan dengan akuades, sedangkan untuk media produksi seperti
media pertumbuhan dengan ditambah induser cangkang rajungan (Purkani dkk,
2016).
2. Kultivasi isolat penghasil enzim kitinase
Isolat Aspergillus niger diremajakan dengan cara memindahkan satu ose
koloni dari stok biakan kedalam media padat yang telah disiapkan kemudian
diinkubasi pada diremajakan dalam media padat diambil dengan kawat ose
kemudian dimasukkan kedalam media pertumbuhan. Selanjutnya dilakukan
inkubasi pada suhu ruang dengan penggojokan pada 170 rpm. Sampling dilakukan
tiap 4 jam kemudian disaring dan dicuci dengan aquadest selanjutnya dikeringkan
dengan oven sampai diperoleh masa sel kering yang konstan (Purkani dkk, 2016).
3. Produksi enzim kitinase
Sebanyak 1 mL inokulum ditambahkan kedalam 100 mL media produksi,
kemudian di inkubasi pada suhu 30 oC dengan penggojokan 170 rpm selama 6
hari, setelah itu disentrifugasi pada 3500 rpm selama 20 menit dengan suhu 4 oC.
Supernatan yang terbentuk setelah disentrifugasi adalah ekstrak kasar enzim
kitinase atau crude enzyme chitinase yang selanjutnya diuji aktivitasnya (Purkani
dkk, 2016)
b. Produksi Enzim Selulase dari Bakteri Bacillus subtilis
Mikroorganisme biasa berasal dari air, tanah dan udara yang memberikan
kontribusi besar bagi manusia terutama dalam hal produk pangan dan obat-obatan.
Produk tersebut dihasilkan oleh bioteknologi industri yang banyak memanfaatkan
enzim sebagai katalis dalam suatu reaksi kimia dalam pembentukan produk tanpa
ikut bereaksi di dalamya. Salah satu enzim yang digunakan adalah enzim selulase
yang dihasilkan dari bakteri Bacillus subtilis. Produksi selulase secara komersial
biasanya menggunakan kapang atau bakteri. Kapang yang bisa menghasilkan
selulase adalah Aspergillus niger dan Trichoderma viride sedangkan bakteri yang
bisa menghasilkan enzim selulase adalah Pseudomonas, Cellulomonas dan Bacillus
(Gunam dkk., 2011).
Selulase merupakan enzim yang dihasilkan oleh mikroorganisme di luar sel.
Produksi enzim dalam mikroorganisme dapat dikontrol untuk meningkatkan
produktivitas enzim oleh mikroorganisme tersebut. Selulase yang dihasilkan
bergantung pada hubungan kompleks yang melibatkan berbagai variasi faktor
antara lain; ukuran inokulum, pH, rasio C:N, suhu, aditif medium, waktu
pertumbuhan dan sebagainya.
Pada produksi enzim selulase bakteri ditumbuhakn pada media selektif
yang pertumbuhannya ditandai dengan adanya kekeruhan pada media. Magnesium
(MgSO4), natrium klorida (NaCl) dan kalsium klorida (CaCl2) sebagai sumber ion
dan mineral yaitu ion Mg2+, Na+ dan Ca2+. Mineral berfungsi sebagai penyusun
sel dan pengatur tekanan osmosis, kadar ion H+ dan potensial oksidasi reduksi
medium. yeast ekstrak sebagai sumber nitrogen dan CMC sebagai substrat yang
berfungsi sebagai sumber karbon untuk bakteri Bacillus subtilis dalam
memproduksi enzim selulase. Air berfungsi sebagai komponen utama sel mikroba
dalam medium yang berfungsi sebagai oksigen untuk bahan organik sel pada
proses respirasi dan sebagai pelarut serta alat pengangkut dalam metabolismenya
dan dengan penambahan bakto agar sebagai pemadat media (Solihat dkk, 2010).
Pada proses isolasi enzim selulase ini dilakukan pembuatan media
inokulum dan media produksi, kemudian stok inokulum dijadikan sebagai starter
dalam media produksi yaitu sebanyak 45 mL selanjutnya dilakukan proses
sentrifugasi dingin dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C,
kemudian dipisahkan filtrat yang menjadi ekstrak kasar enzim selulase dari
residunya (enzim ektrakseluler).
c. Produksi Enzim Amilase dari Bakteri Laut Arthrobacter arilaitensis
Amilase merupakan enzim industri yang paling penting yang menyumbang
sekitar 30% dari produksi enzim dunia sebagai contoh produksi amilase oleh
Bacillus licheniformis dan Aspergillus sp. sekitar 300 ton enzim murni pertahun
(Sivaramkrishnan et al. 2006). Oleh karena itu meskipun enzim amilase telah
banyak diisolasi dan dikristalisasi, eksplorasi sumber amilase yang lebih efisien
masih dibutuhkan (Ahmadi et al. 2010).
Sumber α-amilase dapat diperoleh dari tumbuhan, hewan dan
mikroorganisme. Amilase yang berasal dari mikroba dapat menghasilkan enzim
yang besar, sehingga banyak dimanfaatkan sebagai enzim industri (Tanjildizi et al.
2005). Beberapa laporan menyebutkan α-amilase yang dihasilkan oleh bakteri
berbeda dengan yang dihasilkan oleh jamur, contoh Bacillus dan Aspergillus sp.
diteliti sebagai sumber yang berguna untuk industri (Silva et al. 2011). Saat ini
mikroba yang banyak digunakan untuk produksi amilase berasal dari tanah,
mikroba yang berasal dari laut belum banyak dimanfaatkan padahal karateristik
mikroba laut sangat unik dan spesifik, yaitu tahan pada salinitas/NaCl tinggi, suhu,
cahaya, dan lingkungan ekstrim lainnya. Komunitas mikroba dari jenis bakteri,
arkea, protista dan fungi (Purawan, 2015)
Parameter yang dioptimasi pada media produksi amilase dari bakteri laut
Arthrobacter arilaitensis terdiri dari optimasi konsentrasi substrat, pH, suhu
fermentasi, ko-substrat, dan sumber nitrogen. Pembuatan media produksi yaitu
disiapkan sebanyak 3,8% ASW, 0,1% yeast extract dan 0,5% pepton, dan 0,5% pati
komersial dengan analytical grade sebagai substrat media produksi.

d. Produksi Protease Dari Beberapa Isolat Bakteri


Kebutuhan enzim protease dewasa ini semakin meningkat terutama dalam
bidang pangan seperti industri keju, bir dan roti, sedangkan bidang non pangan
seperti dalam pembuatan deterjen dan penyamakan kulit. Kemajuan dalam bidang
bioteknologi memungkinkan semakin meluasnya penggunaan enzim protease
dalam berbagai produk komersial. Di Indonesia kebutuhan akan enzim protease
juga semakin meningkat namun kebutuhan ini masih tergantung pada produksi
impor. Salah satu cara mengantisipasi ketergantungan terhadap produksi impor
tersebut perlu adanya usaha untuk memproduksi enzim protease (Daniel, 1979).
Enzim protease yang digunakan dalam bidang industri umumnya dihasilkan
oleh mikroorganisme. Penggunaan mikroorganisme untuk produksi enzim,
khususnya protease mempunyai beberapa kelebihan, diantaranya mudah diproduksi
dalam skala besar, waktu produksi relatif pendek serta dapat diproduksi secara
berkesinambungan dengan biaya yang relatif rendah (Thomas, 1984).
Mikroorganisme penghasil protease dapat berupa bakteri, kapang maupun khamir.
Enzim protease dari bakteri mulai diperkenalkan sekitar tahun
1960anolehGebruder Schyder dari Swiss dan Novo Industri A/S dari Denmark,dan
sampai sekarang penggunaan bakteri sebagai penghasil protease mempunyai
peluang yang besar untuk memproduksi protease (Basuki, 1997)
1. Isolasi bakteri
Media yang digunakan untuk isolasi adalah media susu skim yang
mengandung susu skim 20 g, pepton 5 g, agar 15 g dalam satu liter (Cappuccino,
1983). Sampel diinokulasikankedalam media cair atau lansung pada permukaan
media agar. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar diatas alat pengocok pada
kecepatan 100 rpm. Setelah inkubasi selama 24 jam, 1 setetes larutan yang sudah
ditumbuhi bakteri diambil dan diinokulasikan pada permukaan media padat dengan
komposisi yang sama. Isolat yang tumbuh dipelihara pada agar miring NA untuk
diuji lebih lanjut.
2. Seleksi isolat penghasil protease secara kualitatif
Secara kualitatif pengujian dilakukan dengan menumbuhkan satu "loopful"
bakteri terseleksi pada permukaan medium yang sama, setelah ditumbuhkan selama
2-3 hari pada suhu kamar, aktivitas protease ditunjukkan dengan adanya zona
lingkaran jernih disekitar koloni. Hasil bagi diameter lingkaran jernih dengan
diameter koloni dinyatakan sebagai aktivitas protease secara relatif. Isolat-isolat
yang memperlihatkan adanya aktivitas protease dengan nilai nisbi > 2, selanjutnya
diuji secara kuantitatif.
3. Pengujian aktivitas protease secara kuantitatif
Sebagai starter digunakan biakan bakteri yang sudah ditumbuhkan pada
medium mengandung 20% susu kedelai dan 5% laktosa, digoyang di atas shaker
dengan kecepatan 100 rpm, pada suhu kamar selama satu hari. Sebanyak 1% starter
diinokulasikan ke dalam 20 ml medium yang sama, inkubasikan selama 3 hari
diatas alat pengocok dengan kecepatan 130 rpm. Selanjutnya kultur disentrifugasi
pada kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit untuk memisahkan larutan enzim dari
partikel-partikel substrat. Filtrat yang diperoleh diukur aktifitas proteasenya.
Aktivitas protease diukur dengan menggunakan kasein Hammersten sebagai
substrat (2% casein dalam 0,05 M larutan buffer fosfat pH 7,0). Sebanyak 0,5 ml
larutan enzim ditambahkan pada 0,5 ml larutan 0,05 M buffer fosfat pH 7 dan
diinkubasikan terlebih dahulu pada suhu 37°C selama 5 menit. Selanjutnya
ditambahkan 0,5 ml substrat. Campuran reaksi diinkubasikan kembali pada suhu
37°C selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 1 ml 0,4 M
Trichloroacetic acid (TCA). Selanjutnya supernatan dipisahkan dari endapan
dengan menggunakan kertas saring Whatman no. 1. Sebanyak 0,5 ml filtrat
ditambah dengan 2,5 ml 0,5 M Natrium karbonat, dipreinkubasikan selama 10
menit, kemudian ditambahkan 0,5 ml reagen Folin Ciocalteau dan diinkubasikan
kembali selama 30 menit. Pembacaan Optical density (OD) dilakukan pada panjang
gelombang 660 nm. Untuk setiap kali pengujian dikurangi dengan blanko. Sebagai
blanko digunakan larutan enzim dengan perlakuan yang sama, tetapi penambahan
TCA dilakukan sebelum penambahan substrat. Satu unit aktivitas enzim protease
adalah banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 mikrogram tirosin.