BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Biokimia merupakan ilmu yang mempelajari tentang senyawa-senyawa yang
ada di dalam sistem hidup, penyusunan senyawa-senyawa tersebut ke dalam sel-sel
dan interaksi kimia yang terjadi.Karakterisasi dan klasifikasi sebagian besar mikroba
seperti bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat
tumbuh pada beberapa tipe media, memproduksi tipe metabolit tertentu yang di
deteksidengan interaksi mikroba dengan reagen tes yang menghasilkan warna reagen.
Reaksi-reaksi dalam sel akan teridentifikasi dengan melakukan pengujian-pengujian
tertentu. Sel akan memberikan respon sesuai dengan kemampuan yang dimilikinya,
misalnya menghasilkan enzim katalase, enzim gelatinase atau kemamupuan untuk
menghidrolisis lemak.
Secara morfologis, biakan maupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak
serupa. Karena itu ciri fisiologis atau biokimiawi merupakan kriteria yang amat
penting di dalam identifikasi spesimen yang tidak dikenal. Tanpa hasil pengamatan
fisiologis yang memadai mengenai organisme yang diperiksa maka penentuan
spesiesnya tidaklah mungkin dilakukan.
Melalui percobaan uji biokimia ini, praktikan dapat mengetahui beberapa
teknik pengujian secara biokimia yang akan sangat membantu dalam
pengidentifikasian mikroorganisme. Hasil yang diperoleh dalam percobaan
selanjutnya akan dicocokan pada literatur (buku determinan), sehingga akan diketahui
jenis dan nama dari mikroorganisme yang diuji tersebut berdasarkan rekasi-reaksi
kimia yang ditimbulkannya dan apakah reaksi tersebut positif atau negatif.

B. Tujuan : Untuk mengetahui spesies atau jenis bakteri dari suatu isolat
BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Biokimia adalah ilmu yang mengenal dasar molekuler kehidupan. Di seluruh dunia
biokimia dianggap sangat menggairahkan kerena berbagai alasan; pertama, mekanisme kimia
banyak sentral pada kehidupan kini mulai dipahami. Kedua, pola dan prinsif-prnsip
molekular yang umum mendasri penampilan. Ketiga, biokimia sangat mendasari ilmu
kedokteran. Keempat, perkembangan yang cepat (Stryer, 1995).
Pengamatan aktivitas biokimia atau metabolisme mikroorganisme yang diketahui dari
kemampuan mikroorganisme untuk menggunakan dan menguraikan molekul yang kompleks
seperti karbohidrat, lemak, protein dan asam nukleat. Selain itu dilakukan pula pengamatan
pada molekul-molekul sederhana seperti asam amino dan monosakarida. Dan hasil dari
berbagai uji ini digunakan untuk perincian dan identifikasi mikroorganisme. Penggunaan zat
hara tergantung dari aktivitas metabolisme mikroba. Metabolisme seringkali menghasilkan
hasil sampingan yang dapat digunakan untuk identifikasi mikroorganisme. Pengamatan
aktivitas metabolisme diketahui dari kemampuan mikroorganisme untuk menggunakan dan
menguraikan molekul yang kompleks seperti zat pati, lemak, protein dan asam nukleat.
Selain itu pengamatan juga dilakukan pada molekul yang sederhana seperti amino dan
monosakarida (Maisyah, 2009).
Berikut beberapa uji Biokimia yang digunakan untuk identifikasi bakteri antara lain:
A. Indol
Media ini biasanya digunakan dalam indetifikasi yang cepat. Hasil uji indol yang
diperoleh negatif karena tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah muda pada
permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol dari tryptopan sebagai sumber
karbon, yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan kovaks. Asam amino triptofan
merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino
ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein.
B. MR-VP
Uji MR dengan hasil positif, terjadi perubahan warna menjadi merah setelah
ditambahkan methyl red. Artinya, bakteri ini mengahasilkan asam campuran (metilen glikon)
dari proses fermentasi glukosa yang terkandung dalam medium MR-VP. Terbentuknya asam
campuran pada media akan menurunkan pH sampai 5,0 atau kurang, oleh karena itu bila
indikator metil ditambahkan pada biakan tersebut dengan pH serendah itu maka indikator
tersebut menjadi merah. Hal ini menandakan bahwa bakteri ini peragi asam campuran.
 Uji VP dengan hasil negatif, karena tidak terbentuk warna merah pada medium
setelah ditambahkan α-napthol dan KOH, artinya hasil akhir fermentasi bakteri ini bukan
asetil metil karbinol (asetolin) (Anonim2, 2008).
C.Simmon’s Citrate
Perbenihan ini digunakan untuk melihat kemampuan organisme enterik berdasarkan

kemampuan memfermentasi sitrat sebagai sumber karbon. Perbenihan Simmon’s Citrate ini

mengandung indikator biru bromtimol yang akan berubah menjadi biru pada reaksi positif
dan tetap hijau jika reaksi negatif (Volk dan Wheeler, 1993).
D. Uji katalase
Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu untuk mengetahui
apakah bakteri tersebut merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau anaerob obligat dan
digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme untuk menguraikan hidrogen
peroksida dengan menghasilkan enzim katalase. Bakteri yang memerlukan oksigen
manghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) yang sebenarnya beracun bagi bakteri sendiri.
Namun mereka dapat tetap hidup dengan adanya anti metabolit tersebut karena mereka
menghasilkan enzim katalase yang dapat mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan
oksigen. Enzim merupakan katalisator sejati, dimana molekul ini meningkatkan dengan nyata
kecepatan reaksi kimia spesifik yang tanpa enzim akan berlangsung sangat lambat. Enzim
tidak dapat mengubah titik keseimbangan reaksi yang dikatalisnya, enzim juga tidak akan
habis dipakai atau diubah secara permanen oleh reaksi-reaksi ini. Enzim merupakan
biokatalis yang berfungsi untuk membantu proses metabolisme. Enzim memiliki kemampuan
untuk mengkatalisis suatu reaksi. Suatu enzim adalah suatu katalis biologis. Hampir tiap
rekasi biokimia dikatalis oleh enzim. Enzim merupakan katalis yang lebih efisien daripada
kebanyakan katalis laboratorium atau industri. Enzim juga memungkinkan suatu selektivitas
pereaksi-pereaksi dan suatu pengendalian laju reaksi yang tidak dimungkinkan oleh kelas
katalis lain. Kespesifikan enzim disebabkan oleh bentuknya yang unik dan oleh gugus-gugus
polar (atau nonpolar) yang terdapat dalam struktur enzim tersebut. Beberapa enzim bekerja
bersama suatu kofaktor non protein, yang dapat berupa senyawa organik maupun anorganik.
Hidrolisis Gelatin terdapat enzim-enzim yang menguraikan golongan potein disebut
protenase/protease, kedua nama ini dianggap sinonim. Contoh pada hidrolisis gelatin dimana
protein diperoleh dari hidrolisis kalogen, yaitu zat pada jaringan penghubung dan tendon dari
hewan. Gelatin akan terurai oleh mikrobia yang mensintesis enzim proteolisis. Larutan
gelatin bersifat cair pada suhu ruang atau suhu kamar dan padat apabila berada di dalam
refrigerator. Dan apabila gelatin sudah dihidrolisis oleh mikroba, maka akan tetap bersifat
cair (Hadioetomo, 1993).
Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu untuk mengetahui
apakah bakteri tersebut merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau anaerob obligat.
Bakteri yang memerlukan oksigen manghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) yang
sebenarnya beracun bagi bakteri sendiri. Namun mereka dapat tetap hidup dengan adanya
antimetabolit tersebut karena mereka menghasilkan enzim katalase yang dapat mengubah
hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen dengan reaksi sebagai berikut :
2H2O 2H2O + O2 (Volk dan Wheeler, 1993).
E.Reaksi Fermentasi Karbohidrat (Gula-gula)
Fermentasi merupakan salah satu aktivitas biokimia yang dilakukan oleh mikroba.
Fermentasi adalah proses pengunahan senyawa makromolekul organik menjadi senyawa
yang lebih sederhana oleh aktivitas mikroba pada kondisi anaerob. Fermentasi dapat
menghasilkan berbagai senyawa akhir, contohnya fermentasi karbohidrat yang dapat
menghasilkan berbagai senyawa asam seperti asam laktat dan propionet, ester-ester, keton
dan gas.(Pelczar, 2008)
Sebagian besar mikroorganisme memperoleh energi dari substrat berupa karbohidrat
yang selanjutnya di fermentasi menghasilkan asam-asam organik (seperti asam laktat, format,
asetat), dengan disertai atau tidak disertai pembentukan gas. Organisme-organisme yang
berbeda akan menggunakan karbohidrat/gula-gula yang berbeda tergantung dari komponen
enzim yang dimilikinya. Perbenihan gula-gula digunakan untuk melihat adanya pembentukan
asam yaitu dengan adanya perubahan warna indikator (merah fenol atau biru bromtimol)
yang terdapat dalam perbenihan menjadi kuning yang sebelum ditanami berwarna merah
(indikator merah fenol) atau berwarna biru (indikator biru bromtimol) serta untuk
pembentukan gas, yaitu dengan terlihatnyaudara di dalam tabung peragian/fermentasi (tabung
durham). Jenis karbohidrat yang digunakan pada uji fermentasi karbohidrat antara lain:
Sukrosa, Laktosa, Maltosa, Manitol. Glukosa dapat langsung masuk dalam jalur fermentasi
tahap pertama. Sedangkan, sukrosa, laktosa mantol, dan maltosa akan di hidrolisis terlebih
dahulu menjadi monosakarida penyusunnya. Laktosa dihidrolisis menjadi galaktosa dan
glukosa. Monosakarida jenis manosa dan galaktosa terlebih dahulu akan diubah menjadi
glukosa melalui reaksi epimerisasi. Sedangkan fruktosa akan diubah terlebih dahulu menjadi
fruktosa 6-fosfat dan kemudian fruktosa 6-fosfat diubah menjadi glukosa 6-fosfat. Glukosa 6-
fosfat dan glukosa hasil epimerisasi galaktosa dan manosa akan masuk dalam tahap awal
proses fermentasi untuk menghasilkan asam piruvat, asam asetat dan CO2 dan kemudian
pada tahap kedua fermentasi asam piruvat dan asam asetat di reduksi kembali oleh atom
hidrogen yang dilepaskan dalam tahap pertama, membentuk asam laktat dan etanol (Volk dan
Wheeler, 1993).
Enzim merupakan katalisator sejati, dimana molekul ini meningkatkan dengan nyata
kecepatan reaksi kimia spesifik yang tanpa enzim akan berlangsung sangat lambat. Enzim
tidak dapat mengubah titik keseimbangan reaksi yang dikatalisnya, enzim juga tidak akan
habis dipakai atau diubah secara permanen oleh reaksi-reaksi ini. Enzim merupakan
biokatalis yang berfungsi untuk membantu proses metabolisme. Enzim memiliki kemampuan
untuk mengkatalisis suatu reaksi. Suatu enzim adalah suatu katalis biologis. Hampir tiap
rekasi biokimia dikatalis oleh enzim. Enzim merupakan katalis yang lebih efisien daripada
kebanyakan katalis laboratorium atau industri. Enzim juga memungkinkan suatu selektivitas
pereaksi-pereaksi dan suatu pengendalian laju reaksi yang tidak dimungkinkan oleh kelas
katalis lain. Kespesifikan enzim disebabkan oleh bentuknya yang unik dan oleh gugus-gugus
polar (atau nonpolar) yang terdapat dalam struktur enzim tersebut. Beberapa enzim bekerja
bersama suatu kofaktor nonprotein, yang dapat berupa senyawa organik maupun anorganik
(Lehninger, 1995).
Hidrolisis Gelatin terdapat Enzim-enzim yang menguraikan golongan potein disebut
protenase/protease, kedua nama ini dianggap sinonim. Contoh pada hidrolisis gelatin dimana
protein diperoleh dari hidrolisis kalogen, yaitu zat pada jaringan penghubung dan tendon dari
hewan. Gelatin akan terurai oleh mikrobia yang mensintesis enzim proteolisis. Larutan
gelatin bersifat cair pada suhu ruang atau suhu kamar dan padat apabila berada di dalam
refrigerator. Dan apabila gelatin sudah dihidrolisis oleh mikroba, maka akan tetap bersifat
cair (Hadioetomo, 1993).
Bakteri memiliki berbagai aktivitas biokimia (pertumbuhan dan perbanyakan) dengan
menggunakan raw material (nutrisi) yang diperoleh dari lingkungan sekitarnya. Transformasi
biokimia dapat timbul di dalam dan di luar dari bakteri yang diatur oleh katalis biologis yang
dikenal sebagai enzim. Setiap bakteri memiliki kemampuan dalam menggunakan enzim yang
dimilikinya untuk degradasi karbohidrat, lemak, protein, dan asam amino. Metabolisme atau
penggunaan dari molekul organik ini biasanya menghasilkan produk yang dapat digunakan
untuk identifikasi dan karakterisasi bakteri (Maisyah, 2009).
BAB III

PROSEDUR KERJA

A. Alat dan Bahan

 Alat
1. Ose
2. Buncen
3. Rak dan Tabung reaksi
4. Inkubator
5. Pipet tetes
 Bahan
1. Isolat B
2. Media gula-gula pendek ( Glukosa,Sukrosa,Manosa,Manitol,Laktosa)
3. Media gula-gula panjang
 SIM (Sulfur Indol motility: I dan H2S
 MR (Metil red)
 VP ( Voges Proskauer)
 Sc (Simmon’s Citrate)
B. Cara kerja
1. Menyalakan bunsen menggunakan korek api.
2. Membakar Ose sampai merah dan dinginkan terlebih dahulu
3. Membuka tabung dan mengambil isolat B menggunakan Ose
4. Mengambil media glukosa, membuka kapas penutup,memfiksasi mulut
tabung, menusukkan jarum ose,mengocok tabung dan menutup kembali
tabung dengan kapas.
5. Mengambil media laktosa, membuka kapas penutup,memfiksasi mulut tabung,
menusukkan jarum ose,mengocok tabung dan menutup kembali tabung
dengan kapas.
6. Mengambil media sukrosa,membuka kapas penutup,memfiksasi mulut tabung,
menusukkan jarum ose,mengocok tabung dan menutup kembali tabung
dengan kapas.
7. Mengambil media manosa,membuka kapas penutup,memfiksasi mulut tabung,
menusukkan jarum ose,mengocok tabung dan menutup kembali tabung
dengan kapas.
8. Mengambil media manitol,membuka kapas penutup,memfiksasi mulut tabung,
menusukkan jarum ose,mengocok tabung dan menutup kembali tabung
dengan kapas.
9. Mengambil media MR, membuka kapas penutup,memfiksasi mulut tabung,
menusukkan jarum ose,mengocok tabung dan menutup kembali tabung
dengan kapas.
10. Mengambil media VP,membuka kapas penutup,memfiksasi mulut tabung,
menusukkan jarum ose, megocok tabung dan menutup kembali tabung dengan
kapas.
11. Menutup semua tabung reaksi yang sudah berisi campuran media dan isolat
bakteri dengan kertas Aluminium
12. Memberikan label nama disetiap tabung, kemudian memasukkan sampel
medium ke dalam inkubator selama 24 jam.
13. Mengamati koloni bakteri yang terbentuk pada masing-masing medium
setelah di inkubasikan.
BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

ISOLAT HASIL UJI BIOKIMIA Diduga

spesies
G S MN ML L I H2S MR VP SC Salmonella
B +/gas + - + + + - + + + sp

Sebelum

Sesudah
 B. Pembahasan
Salmonella adalah suatu genus bakteri enterobakteria Gram Negatif
batang berbentuk tongkat yang menyebabkan tifoid, paratifoid, dan penyakit
foodborne.Bakteri Salmonella termasuk dalam kingdom Bacteria,filum
proteobacteria, class gamma proteobacteria, ordo enterobactriales,family
enterobacteriaceae, Genus Salmonella, Spesies Salmonella thyposae,Salmonella
parathyposa A, Salmonella Parathyposa B.
Uji Simmons Citrat Agar digunakan untuk melihat kemampuan
mikroorganisme menggunakan citrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi.
Media ini merupakan medium sintetik dengan NA citrat sebagai satu-satunya sumber
karbon, NHA+ sebagai sumber N dan Brom Thymol Blue sebagai indikator pH. Pada
uji ini menunjukkan reaksi positif. Hal ini ditandai dengan adanya perubahan warna
media dari hijau menjadi biru. Ini karena dasar dari medium mampu dihilangkan
sehingga terjadi peningkatan pH yang nantinya akan menambah warna media dari
hijau menjadi biru bila keadaan menjadi alkalin.
Uji MR hasilnya positif, terjadi perubahan warna menjadi merah setelah
ditambahkan methyl red. Artinya, bakteri ini mengahasilkan asam campuran (metilen
glikon) dari proses fermentasi glukosa yang terkandung dalam medium MR-VP.
Terbentuknya asam campuran pada media akan menurunkan pH sampai 5,0 atau
kurang, oleh karena itu bila indikator metil ditambahkan pada biakan tersebut dengan
pH seredndah itu maka indikator tersebut menjkadi merah. Hal ini menandakan
bahwa bakteri ini peragi asam campura

BAB V

KESIMPULAN

DAFTAR PUSTAKA