Karantina Hewan Hari, tanggal : Kamis, 14 Desember 2017

Dosen : Drh. Taryu M.Si.

Drh. Apris Beniawan, M.Si.
Drh. Tetty Barunawati

TEKNIK PEMERIKSAAN POLYMERASE CHAIN REACTION

(PCR)
Kelompok 3/P2 :

Suratman J3P115007
Nanda Finisa J3P115022
Rahmatiaqmara H J3P115024
Ridho Rizki J3P115041
Indah Elsa J3P115046
Syifa Fauziah J3P115073

PROGRAM KEAHLIAN PARAMEDIK VETERINER

PROGRAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2017
PENGERTIAN POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR

(polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan
(replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik
ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat
sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini
dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan memperoleh hadiah Nobel pada
tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di
bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan
hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil. PCR (Polimerase Chain Reaction)
atau reaksi berantai polimerase adalah suatu metode in vitro yang
digunakan untukmensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua
primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan
mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan
amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas
penggunaannya.

FUNGSI POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Fungsi lengkap PCR berkaitan dengan metode yang digunakan,

berdasarkan metode tersebut dapat dibagi sebagai berikut :
1. Metode PCR : COLD PCR
Prinsip : Denaturasi selektif missmatch/heterodu pleks DNA
(campuran DNA tipe mutan dengan tipe wildnya) pada Tc
(suhu critikal).
Fungsi : Pengayaan fragmen DNA yang mengandung mutasi pada
populasi suatu sel sel dan deteksi mutasi gen
Aplikasi : 1. Pengayaan gen KRAS dan gen P53 yang membawa
mutasi yang jumlahnya sedikit pada kanker paru
2. Deteksi mutasi DNA BRAF dan K-ras pada kolon
kanker
3. meningkatkan akurasi deteksi mutasi K-ras dengan
metode analisa kurva leleh (melting curve)

2. Metode PCR : PNAC PCR

Prinsip : Penghambatan secara selektif perbanyakan fragmen DNA
tipe wild menggunakan oligo peptida
Fungsi : Deteksi mutasi gen
Aplikasi : Deteksi mutasi KRAS pada kanker kolon dengan tingkat
sensitivtas dan spesifitas yang cukup tinggi

3. Metode PCR : Supression PCR

Prinsip : Ampflifikasi spesifik pada daerah SS loop dari hairpin
DNA yang terbentuk dari ikatan komplemetari yang kuat
pada ujung-ujung linker menggunakan primer spesifik gen
Fungsi : Deteksi keberagaman gen
 Aplikasi : Deteksi type alele gen thrombin III, interleukin 1α,
insulin like growth factor II, aldolase B, alfa microglobulin,
Low Density Lipoprotein

4. Metode PCR : TETRA ARMS PCR

Prinsip : Amplifikasi fragmen gen spesifik menggunakan sepasang
primer pengamit (flanking primer) dan sepasang primer
internal yang berposisi saling berlawanan arah
Fungsi : Deteksi keragaman gen dan mutasi
Aplikasi : Deteksi mutasi gen PI3KCA exon 9 dan 20 pada kanker
payudara

BAHAN DAN METODE

Pada proses PCR diperlukan beberapa komponen utama adalah :

a. DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan. DNA cetakan
yang digunakan sebaiknya berkisar antara 105 – 106 molekul. Dua hal penting
tentang cetakan adalah kemurnian dan kuantitas.
b. Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (18 – 28
basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA. Dan
mempunyai kandungan G + C sebesar 50 – 60%.
c. Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP), terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP.
dNTP mengikat ion Mg2+ sehingga dapat mengubah konsentrasi efektif ion. Ini
yang diperlukan untuk reaksi polimerasi.
d. Enzim DNA Polimerase, yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis
rantai DNA. Enzim ini diperoleh dari Eubacterium yang disebut Thermus
aquaticus, spesies ini diisolasi dari taman Yellowstone pada tahun 1969. Enzim
polimerase taq tahan terhadap pemanasan berulang-ulang yang akan membantu
melepaskan ikatan primer yang tidak tepat dan meluruskan wilayah yang
mempunyai struktur sekunder.
e. Komponen pendukung lain adalah senyawa buffer. Larutan buffer PCR
umumnya mengandung 10 – 50mM Tris-HCl pH 8,3-8,8 (suhu 20o C); 50 mM
KCl; 0,1% gelatin atau BSA (Bovine Serum Albumin); Tween 20 sebanyak
0,01% atau dapat diganti dengan Triton X-100 sebanyak 0,1%; disamping itu
perlu ditambahkan 1,5 mM MgCl2.

Cara Kerja
Ada tiga tahapan penting dalam proses PCR yang selalu terulang dalam
30- 40 siklus dan berlangsung dengan cepat :

1. Denaturasi
Dalam proses PCR, denaturasi awal dilakukan sebelum enzim taq
polimerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA merupakan
proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. Ini biasanya
berlangsung sekitar 3 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA
terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal. Denaturasi yang tidak lengkap
mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi)
secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR. Adapun waktu
denaturasi yang terlalu lama dapat mengurangi aktifitas enzim Taq polymerase.
Aktifitas enzim tersebut mempunyai waktu paruh lebih dari 2 jam, 40 menit, 5
menit masing-masing pada suhu 92,5; 95 dan 97,5oC.

2. Annealing (penempelan primer)

Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang baik adalah
bahwa primer sebaiknya berukuran 18 – 25 basa, mengandung 50 – 60 % G+C
dan untuk kedua primer tersebut sebaiknya sama. Sekuens DNA dalam masing-
masing primer itu sendiri juga sebaiknya tidak saling berkomplemen, karena hal
ini akan mengakibatkan terbentuknya struktur sekunder pada primer tersebut dan
mengurangi efisiensi PCR.
Waktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30 – 45 detik.
Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya. Kisaran
temperatur penempelan yang digunakan adalah antara 36oC sampai dengan 72oC,
namun suhu yang biasa dilakukan itu adalah antara 50 – 60oC.

3.Pemanjangan Primer (Extention)

Selama tahap ini Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang
DNA primer dari ujung 3’. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut
pada suhu 72oC diperkirakan 35 – 100 nukleotida/detik, bergantung pada buffer,
pH, konsentrasi garam dan molekul DNA target. Dengan demikian untuk produk
PCR dengan panjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup
untuk tahap perpanjangan primer ini. Biasanya di akhir siklus PCR waktu yang
digunakan untuk tahap ini diperpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh produk
PCR diharapkan terbentuk DNA untai ganda. Reaksi-reaksi tersebut di atas
diulangi lagi dari 25 – 30 kali (siklus) sehingga pada akhir siklus akan diperoleh
molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru yang merupakan hasil polimerasi
dalam jumlah yang jauh lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan
yang digunakan. Banyaknya siklus amplifikasi tergantung pada konsentrasi DNA
target dalam campuran reaksi.
Produk PCR dapat diidentifikasi melalui ukurannya dengan menggunakan
elektroforesis gel agarosa. Metode ini terdiri atas menginjeksi DNA ke dalam gel
agarosa dan menyatukan gel tersebut dengan listrik. Hasilnya untai DNA kecil
pindah dengan cepat dan untai yang besar diantara gel menunjukkan hasil positif.
Keunggulan PCR dikatakan sangat tinggi. Hal ini didasarkan atas spesifitas,
efisiensi dan keakuratannya. Spesifitas PCR terletak pada kemampuannya
mengamplifikasi sehingga menghasilkan produk melalui sejumlah siklus.
Keakuratan yang tinggi karena DNA polymerase mampu menghindari kesalahan
pada amplifikasi produk. Masalah yang berkenaan dengan PCR yaitu biaya PCR
yang masih tergolong tinggi.
Selain itu kelebihan lain metode PCR dapat diperoleh pelipatgandaan suatu
fragmen DNA (110 bp, 5x10-9 mol) sebasar 200.00 kali setelah dilakukan 20
siklus reaksi selama 220 menit. Reaksi ini dilakukan dengan menggunakan
komponen dalam jumlah sangat sedikit, DNA cetakan yang diperlukan hanya
sekitar 5 ug oligonukleotida yang diperlukan hanya sekitar 1 mM dari reaski ini
biasa dilakukan dalam volume 50-100 ul. DNA cetakan yang digunakan juga
tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu sehingga metode PCR dapat digunakan
untuk melipatgandakan suatu sekuen DNA dalam genom bakteri hanya dengan
mencampukan kultur bakteri di dalam tabung PCR .

JENIS-JENIS PCR

Teknik PCR dapat dimodifikasi ke dalam beberapa jenis diantaranya

(Yusuf 2010):
1. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP); metode ini
digunakan untuk membedakan organisme berdasarkan analisis model
derifat dari perbedaan DNA.
2. Inverse-PCR, metode ini digunakan ketika hanya satu sekuen internal
yang diketahui. Template didigesti dengan enzim restriksi yang memotong
bagian luar daerah yang akan diamplifikasi, fragmen restriksi yang
dihasilkan ditempelkan dengan ligasi dan diamplifikasi dengan
menggunakan sekuen primer yang memiliki titik ujung yang memiliki
jarak yang jauh satu sama lain dengan segmen eksternal yang telah
tergabung. Metode ini khusus digunakan untuk mengidentifikasi ”sekuen
antara” dari beragam gen.
3. Nested-PCR, proses ini memungkinkan untuk mengurangi kontaminasi
pada produk selama amplifikasi dari penyatuan primer yang tidak
diperlukan. Dua set primer digunakan untuk mendukung metode ini, set
kedua mengamplifikasi target kedua selama proses pertama berlangsung.
Sekuens DNA target dari satu set primer yang disebut primer inner
disimpan di antara sekuens target set kedua dari primer yang disebut
sebagai outer primer. Pada prakteknya, reaksi pertama dari PCR
menggunakan outer primer, lalu reaksi PCR kedua dilakukan dengan inner
primer atau nested primer menggunakan hasil dari produk reaksi yang
pertama sebagai target amplifikasi. Nested primer akan menyatu dengan
produk PCR yang pertama dan menghasilkan produk yang lebih pendek
daripada produk yang pertama.
4. Quantitative-PCR; digunakan untuk pengukuran berulang dari hasil
produk PCR. Metode ini secara tidak langsung digunakan untuk mengukur
kuantitas, dimulai dari jumlah DNA, cDNA, atau RNA. Hasil dari metode
ini juga menampilkan copy dari sampel
5. Reverse Transcriptase (RT-PCR); metode ini digunakan untuk
amplifikasi, isolasi atau identifikasi sekuen dari sel atau jaringan RNA.
Metode ini dibantu oleh reverse transcriptase (mengubah RNA menjadi
cDNA), mencakup pemetaan, menggambarkan kapan dan dimana gen
diekspresikan.
Reverse transcriptase-PCR (RT-PCR) merupakan metode yang digunakan
untuk mengamplifikasi cDNA dari mRNA. RT-PCR digunakan untuk
mendapatkan kembali dan menyalin utas 5’ dan 3’ dari mRNA,
menghasilkan kumpulan cDNA yang banyak dari jumlah mRNA yang
sangat sedikit. RT-PCR dapat dengan mudah digunakan untuk
mengidentifikasi mutasi, polimorphisme dan mengukur kekuatan ekspresi
gen. Konsep utama yang digaris bawahi pada teknik ini yaitu
mengkonversi mRNA ke bentuk rantai tunggal untuk cetakan cDNA.
Primer Oligodeoxynukleotida di hibridisasikan ke sehingga cDNA dapat
 teramplifikasi. Tergantung pada tujuan penelitian, primer untuk sintesi
cDNA rantai pertama dapat disusun secara khusus untuk hibridisasi gen
target atau dapat mengikat secara umum semua mRNA.
6. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) bertujuan untuk
mendeteksi polimorfisme pada tingkat DNA. Metode ini dikembangkan
oleh Welsh and Mc Clelland (1990) dengan cara mengkombinasikan
teknik PCR menggunakan primer – primer dengan sequens acak untuk
keperluan amplifikasi lokus acak dari genom.
7. Masih banyak jenis modifikasi dari PCR ini, seperti :
 Allele-specific PCR
 Assembly PCR
 Assymetric PCR
 Dial-out PCR
 Hot start PCR, dan lainya.

IDENTIFIKASI PENYAKIT DENGAN METODE PCR

1. Rabies
Deteksi virus rabies menggunakan metode RT-PCR dinilai memiliki
sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi untuk pemeriksaan ante-mortem. RT-PCR
merupakan metode yang mudah dilakukan dengan waktu pengerjaan yang lebih
cepat dibandingkan dengan FAT dan MIT. Hal ini merupakan kelebihan metode
RT-PCR dibandingkan metode pemeriksaan lainnya sehingga deteksi virus rabies
pada kasus manusia tersangka tertular rabies melalui gigitan hewan penular rabies
(GHPR) dapat dilakukan lebih cepat (Puspa et al. 2014).
Isolasi RNA dilakukan dengan menggunakan kit komersial dan sesuai
dengan protokol kit (Qiagen, Hilden Jerman). Pemeriksaan spesimen rabies
dilakukan dengan menggunakan metode RT-PCR, yaitu dengan mengamplifikasi
gen N dan gen G sebagai target amplifikasi.

2. Brucella
Polymerase Chain Reaction (PCR) telah digunakan secara luas di banyak
negara untuk deteksi brucellosis pada ternak yaitu uji tapis brucellosis pada satu
populasi ternak, identifikasi species dalam suatu kelompok ternak, dan untuk
identifikasi strain epizootik dengan tujuan membantu pakar epidemiologi
melakukan trace back infeksi dari sumbernya (Brickeret al., 2003 dalam Noor et
al. 2014). Teknik multiplex PCR species-specific assay dapat dipakai untuk
identifikasi species maupun galur Brucella. Bricker dan Halling (1994), pertama
kali mengembangkan uji (AMOS)-PCR untuk identifikasi B.abortus, B.melitensis,
B.ovis, dan B.suis berdasarkan adanya polimorfisme pada lokasi species-specific
dengan menyisipkan sequence kromosom Brucella IS711 menggunakan lima
primer oligonukleotida. Teknik tersebut kemudian dikembangkan lebih lanjut oleh
Ewalt dan Bricker (2003) menjadi uji Brucella abortus strain specific-Polymerase
Chain Reaction (BaSS-PCR) dengan mengubah dan menambah primer sehinga
dapat mengamplifikasi sampai empat lokus yang berbeda dengan menggunakan
tujuh primer oligonukleotida. Teknik BaSS-PCR mampu untuk mengidentifikasi
dan membedakan isolat B.abortus galur vaksin (S19 dan RB51) dan galur lapang
B.abortus biovar 1, 2, dan 4. Uji BaSS-PCR ini merupakan uji yang sangat cepat,
sensitif, dan akurat untuk identifikasi galur Brucella (Bricker et al., 2003 dalam
Noor et al. 2014). Berdasarkan pertimbangan tersebut maka pada penelitian
dilakukan identifikasi isolat lokal B.abortus hasil isolasi sampel dari sapi
terinfeksi brucellosis secara molekuler dengan uji BaSSPCR. Manfaat dari
penelitian ini diharapkan dengan diketahuinya galur B.abortus yang menginfeksi
ternak sapi di Indonesia maka dapat digunakan untuk tindakan pengendalian serta
identifikasi galur epizootik untuk trace back infeksi dari sumbernya.

3. Anthrax
Beberapa penelitian telah membuktikan bahwa determinan molekular yang
berperan dalam virulensi B. anthracis pada inang adalah molekul-molekul DNA
sirkular yang terpisah dari kromosom bakteri tetapi mampu melakukan replikasi
sendiri (dinamakan plasmid) yang mensintesis multitoxin protektif antigen (PA),
faktor lethal, dan edema (plasmid pXO1) dan yang mensintesis enzim biosintetik
kapsul (plasmid pXO2) (Chand et al.,2009; Ebrahimi et al., 2011; Liu, Moayeri,
and Leppla, 2014 dalam Wibawa et al. 2014). Atas dasar ini, deteksi dengan
teknik PCR terhadap penanda-penanda molekular ini dipilih untuk mereduksi
resiko keselamatan dan keamanan dalam diagnosis anthrax.
Teknik multiplex PCR ini telah digunakan oleh Balai Besar Veteriner
Wates dalam diagnosis B. anthracis dan aplikasi teknik PCR ini untuk deteksi,
identifikasi dan/atau differensiasi B. anthracis dari sampel-sampel lapangan.
Multiplex PCR. Teknik multiplex PCR yang digunakan dapat
mendeteksi/mengidentifikasi sekaligus untuk membedakan strain B. anthracis dan
kemungkinan kontaminasi dari spesies Bacillus lainnya. Teknik ini menggunakan
tiga pasang primer (BacR, Cap dan Lef) untuk mendeteksi genus, strain virulen
dan strain avirulen B. anthracis (Ramisse et al., 1996 Wibawa et al. 2014).

4. Masih banyak penyakit yang dapat diidentifikasan dengan metode PCR ini,
seperti :
 Newcastle Disease (ND)
 Classical Swine Fever (CSF)
 Septicaemia Epizootica (SE)
 dan lainnya

DAFTAR PUSTAKA

Budiarto. 2015. PCR Perkembangan dan Perannya dalam Diagnostik Kesehatan.

[jurnal] Vol.6 No.2. Bogor, Jawa Barat. Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI.
Noor SM, Sudarmono PP, Kusumawati A, Karuniawati A. 2014. Identifikasi
Brucella abortus Isolat Lokal dengan Brucella abortus Strain Specific-
Polymerase Chain Reaction (Identification of Local Isolates of Brucella
Abortus Using Brucella Abortus Strain Specific-Polymerase Chain Reaction
Assay). Jurnal Veteriner, 15(3), pp.306-311.
Puspa KD, Nugraha AA, Setiawaty V. 2014. Deteksi Virus Rabies pada Kasus
Ante-Mortem dengan RT-PCR. Jurnal Biotek Medisiana Indonesia, 3(1),
17-23.
Wibawa H, Sudarsono I, Pramastuti I, Handoko A. 2014. Deteksi dan Identifikasi
Agen Penyakit Anthrax dengan Teknik Multiplex Polymerase Chain
Reaction. Buletin Laboratorium Veteriner BBVet Wates. 14(3).
Yusuf ZK. 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). Sainstek, 5(6).