3 Er Parcial Bioquimica 2017 Completo

Temas del 3er Parcial Bioquímica 2017
Seminarios
 Seminario 15 - Reacciones rédox - 2017
 Seminario 16 - Biología Molecular - 2017
 Seminario 17 - Presentación Cadena de transporte de
electrones. Fosforilación oxidativa - 2017
 Seminario 18 - Integración del metabolismo en
condiciones fisiológicas - 2017
 Seminario 18 - presentación Integración del metabolismo
en condiciones fisiológicas - 2017
 Seminario 19 - Cuestionario de integración metabólica en
condiciones fisiológicas y patológicas - 2017
 Seminario 20 - RIA - 2017
Trabajos Prácticos
 TP 15 - Sangre. Orina. ELISA - 2017
 TP 16 - No hay clase con este nombre
 TP 17 - Curvas de consumo de oxígeno. Casos clínicos -
2017
 TP 18 - No hay clase con este nombre
 TP 19 - Metabolismo de la fenilalanina. Cuestionario de
productos especializados de aminoácidos - 2017
 TP 20 - Catabolismo del hemo. Ictericias - 2017
 TP de laboratorio 2 - Glucemia-Orina-ELISA - 2017
Teóricos
 Teórico 13 Dra Rosenstein - Metabolismo de
aminoácidos - 2017
 Teórico 14 Dra González - Síntesis del grupo
Hemo. Patologías asociadas - 2017
 Teórico 15 Dr Coirini - Especies Reactivas del
Oxígeno - 2017
 Teórico 16 Dra Cornejo - Bioquímica Clínica -
2017
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA HUMANA
MATERIA QUÍMICA BIOLÓGICA - CICLO LECTIVO 2017
SEMINARIO 15
Reacciones Rédox
Cuestionario - Problemas
CONCEPTOS BÁSICOS
Las reacciones de óxido-reducción o rédox son reacciones de transferencia de

electrones desde un dador a un aceptor. En el proceso, el dador de electrones se oxida y
el aceptor de electrones se reduce.
El dador de electrones se denomina agente reductor (dicha especie se oxida y
provoca una reducción) y el aceptor de electrones se denomina agente oxidante (dicha
especie se reduce y produce una oxidación).
Para que una reacción rédox pueda llevarse a cabo debe interactuar una especie
reducida, dadora de electrones y una especie oxidada, aceptora de electrones.
Ejemplo:
Fe0+ Cu2+ Fe2+ + Cu0
Las reacciones de óxido-reducción se pueden dividir en dos hemirreacciones:

una hemirreacción de oxidación y una hemirreacción de reducción.
En una reacción de óxido-reducción (proceso rédox) ambas hemirreacciones
ocurren simultáneamente.
En el ejemplo anterior:
Fe0 Fe2+ + 2e- (hemirreacción de oxidación)
2+ -
Cu + 2e Cu0 (hemirreacción de reducción)
Cada hemirreacción está formada por una especie reducida (dador de electrones) y
su especie oxidada (aceptor de electrones conjugado) que en conjunto constituyen un par
rédox conjugado.
Siguiendo con el ejemplo,
Fe2+/Fe0 constituye un par rédox, siendo Fe0 la especie reducida (dador de
electrones) y Fe2+ la especie oxidada (aceptor de electrones).
Los pares rédox conjugados difieren en su tendencia a aceptar electrones. Esta

tendencia se expresa a través del POTENCIAL DE REDUCCIÓN (E). El potencial de
reducción indica la tendencia a reducirse de la especie oxidada del par. En condiciones
estándar (concentraciones 1 M de todas las especies y pH 7), se define el potencial de
reducción estándar (E°’).
El potencial de reducción real de un par rédox conjugado depende de las
concentraciones de la especie reducida y de la especie oxidada, aceptor de electrones
involucrados en la hemirreacción.
donde:
E: potencial de reducción real (en volt)
E0´: potencial de reducción estándar (en volt)
R: constante de los gases (1.987 cal / °K . mol)
T: Temperatura en °K (273+°C)
n: número de electrones intercambiados
F: Constante de Faraday (23062 cal/ v . mol)
(Especie Oxidada): concentración de la especie oxidada
(Especie Reducida): concentración de la especie reducida
1
Se puede calcular la diferencia de potencial real o estándar ('E o 'E°’) de una
reacción rédox según
E = E hemirreacción - E hemirreacción
Reducción Oxidación
E0´ = E0´hemirreacción - E0´hemirreacción

Reducción Oxidación
Los datos de E°' se encuentran tabulados y para las hemirreacciones del ejemplo
son
E°'Cu2+/Cu0 = + 0,337 v
E°'Fe2+/Fe0 = - 0,44 v
Entonces la diferencia de potencial estándar (E0’) de la reacción será:

E°' = E°'Cu2+/Cu0 - E°'Fe2+/Fe0
= + 0,337 v - (- 0,44 v) = + 0,777 v
Conociendo la diferencia de potencial de la reacción se puede calcular su variación

de energía libre tanto real como estándar.
G = -n.F.E
G0´= -n.F. E0´

El G°’ permite calcular la Keq de la reacción considerando
G0´= -R.T.ln(Keq)
En el ejemplo,
G°’ = -n F 'E°’
= - 2 23062 cal/v (+ 0,777v) = - 35838 cal = - 35,838 kcal
La reacción de óxido-reducción en condiciones estándar es espontánea tal como

está planteada e implica la oxidación del Fe0 y la reducción del Cu2+.
Según la segunda ley de la termodinámica, G es criterio de espontaneidad: todo

proceso es espontáneo cuando ocurre con disminución de la energía libre.
Para las reacciones rédox, además, un E positivo, indica que la reacción es
espontánea.
Por lo tanto, al enfrentarse dos pares rédox, se reducirá espontáneamente la
especie que tiene MAYOR potencial de reducción.
En el ejemplo,
El par Cu2+/Cu0 se reduce espontáneamente y su E°' (+ 0,337 v) es mayor que el
del par Fe2+/Fe0 (- 0,44 v).
2
Si el par Fe2+/Fe0 se enfrentara con el par Zn2+/Zn0 cuyo E°' es - 0,76 v, en
condiciones estándar se reduciría el Fe2+ a Fe0 y el Zn0 se oxidaría a Zn2+.
Calcule el E°' y el G°' de la reacción para demostrar esta afirmación.

E°' Fe2+/Fe0 = - 0,44 v
E°' Zn2+/Zn0 = - 0,76 v
Aclaración
¿Cómo me doy cuenta cuál es la especie oxidada y cuál es la especie reducida?
Estos casos son muy simples. Por ejemplo:
NAD+/NADH + H+ E0´NAD+/NADH + H+
FAD /FADH2 E0´FAD /FADH2
Fe3+/Fe2+ E0´Fe3+/Fe2+
Zn2+/Zn0 E0´Zn2+ /Zn0
Hay otros casos en los cuales generalmente necesitamos tener la fórmula escrita.
Observe y analice la estructura de los siguientes pares y determine los grupos funcionales
involucrados en la reacción rédox.
piruvato/lactato E0´piruvato/lactato
piruvato lactato
fumarato/succinato E0´fumarato/succinato
fumarato succinato
3
oxaloacetato/malato E0´oxaloacetato/malato
oxaloacetato malato
Por lo tanto, podemos resumir la información proporcionada por los Potenciales de

reducción estándar (E0´).
Especieoxidada + n e Especiereducida
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CUESTIONARIO - PROBLEMAS
1.- Observe las siguientes hemirreacciones e indique cuál de las dos sustancias está más
oxidada en cada hemirreacción:
Propanal ácido propanoico
CH3-(CH2)14-COOH CH3-(CH2)5-CH=CH-(CH2)7-COOH
Ácido palmítico ácido palmitoleico
Cu+ Cu++ + e-
a) ¿Qué característica consideró Ud. para elegir la sustancia más oxidada?

b) En base a esto, ¿cómo definiría OXIDACIÓN, REDUCCIÓN Y ÓXIDO-
REDUCCIÓN?
2- Para la siguiente reacción:

Agº + Fe+++ Ag+ + Fe++
a) Escriba las hemirreacciones de oxidación y reducción.
b) Indique cuál es el agente oxidante y cuál es el agente reductor.
3-
a) ¿Qué es el potencial de reducción estándar?
b) ¿Cómo se establece la escala de potenciales de reducción?
c) ¿Cuál es el potencial de reducción de referencia?
4- Discuta cómo será el Eº’...

a) de una sustancia fuertemente reductora.
b) de una sustancia muy oxidante.
c) de una sustancia que le cede electrones al H+
d) de una sustancia que se reduce en presencia de H2
5- Calcular la variación de energía libre estándar que se produce al pasar un par de

electrones desde X (E°’ = - 0,106 v) hasta Y (E°’ = + 0,067 v).
a) – 1,8 kcal/mol
b) + 1,8 kcal/mol
c) + 7,98 kcal/mol
d) – 7,98 kcal/mol
6- Calcular la variación de energía libre estándar que se produce al pasar un par de

electrones desde X (E°’ = + 0,067 v) hasta Y (E°’ = - 0,106 v)
a) – 1,8 kcal/mol
b) + 1,8 kcal/mol
c) + 7,98 kcal/mol
5
7- Calcular la Keq de la siguiente reacción a 25°C y pH 7
Xreducido + NAD+ Xoxidado + NADH + H+ E°’ = - 0,115 v
–4
a) 1,29x10
b) 1,29
c) 100
d) 8,9
8- Calcular la Keq de la siguiente reacción a 25°C y pH 7

Xreducido + NAD+ Xoxidado + NADH + H+ E°’ = + 0,028 v
a) 1,29x10–4
b) 1,29
c) 100
d) 8,9
9- Ordene las siguientes sustancias en orden creciente de tendencia a reducirse:

a) Cit boxidado/Cit breducido Eº’ = +0,030 v
b) piruvato/lactato Eº’ = -0,185 v
c) O2/H2O Eº’ = +0,816 v
d) fumarato/succinato Eº’ = -0,031 v
+ +
e) NAD /NADH + H Eº’ = -0,32 v
f) Cit coxidado/Cit creducido Eº’ = +0,254 v
g) oxaloacetato/malato Eº’ = -0,166 v
+
h) H /H2 Eº’ = -0,421 v
10- Según los datos del ejercicio 9 y en condiciones estándar, conteste las siguientes
preguntas:
a) ¿Qué sustancias serán reducidas espontáneamente por el NADH?
b) ¿Qué sustancias podrán utilizarse para reducir espontáneamente al NAD+?
c) Justifique la siguiente afirmación: “En los sistemas biológicos, el oxígeno es el aceptor
final de electrones”
11- Utilizando los datos del ejercicio 9, indique en cuál de los siguientes casos se
producirá una reacción rédox en forma espontánea, en condiciones estándar:
a) piruvato + NAD+
b) lactato + NAD+
c) piruvato + NADH + H+
d) lactato + NADH + H+
12- Según los datos del problema 9, responda las siguientes preguntas, en todos los
casos en condiciones estándar y justifique desarrollando las ecuaciones.
a) Si se pone a reaccionar el par piruvato/lactato con el par NAD +/NADH + H+, ¿quién se
reduce y quién se oxida?
b) Si se pone a reaccionar el par O2/H2O con el par fumarato/succinato ¿quién se reduce
y quién se oxida?
c) Si se pone a reaccionar el par Cit boxidado/Cit breducido con el par O2/H2O ¿quién se reduce
y quién se oxida?
5
13- Según los datos del problema 9, calcule la variación de energía libre estándar (Gº’)
que se produce al pasar un par de electrones desde el malato al citocromo b.
a) + 9,04 kcal/mol
b) – 9,04 kcal/mol
c) + 6,27 kcal/mol
14- Para la reacción

malato + NAD+ OA + NADH + H+ Gº’ = 7,1 kcal/mol
Utilizando los datos del problema 9, ¿cuál es el G’ y el sentido de la reacción a 25°C y
pH 7 cuando las concentraciones son
[NADH] = 10 mM
[NAD+] = 100 mM
[OA] = 10 mM
[malato] = 100 mM
a) + 4,4 kcal/mol, hacia la derecha
b) - 4,4 kcal/mol, hacia la derecha
c) + 4,4 kcal/mol, hacia la izquierda
d) - 4,4 kcal/mol, hacia la izquierda
15- Dados los siguientes pares rédox:

piruvato + 2H+ + 2e- lactato
NAD+ + 2H+ + 2e- NADH + H+
Utilizando los datos del problema 9, indique el G de la reacción espontánea a 37 °C, si
las concentraciones intracelulares son:
[piruvato] = 200 mM
[NAD+] = 0,05 mM
[lactato] = 50 mM
[NADH] = 0,03 mM
a) +6765 cal/mol
b) – 6765 cal/mol
c) + 16418 cal/mol
d) – 16418 cal/mol
16- Dados los siguientes potenciales de reducción:

Eº’ NAD/NADH + H+ = -0,32 v
Eº’ FAD/FADH2 = -0,12 v
Eº’ O2/H2O = +0,82 v
a) ¿Cuál es el agente más oxidante?
b) ¿Cuál es un agente reductor más fuerte: el NADH + H+ o el FADH2?
c) Si el NADH + H+ y el FADH2 se oxidan en presencia de O2 en condiciones estándar.
¿De cuál de las 2 oxidaciones se obtendrá más energía? Justifique.
d) Para el caso anterior, calcule el Gº’ de las reacciones de oxidación de NADH + H+ y de
FADH2 en presencia de O2 en condiciones estándar. Escriba las hemirreacciones de
oxidación y reducción, identifique el agente oxidante y el agente reductor.
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17- Dados los siguientes potenciales de reducción estándar:
Eº’ oxaloacetato/malato = -0,166 v
Eº’ NAD+/NADH + H+ = -0,32 v
Calcule el G de la reacción espontánea a 37º C en los siguientes casos:
a) [OA] = 100 mM
[Mal] = 0,01 mM
[NADH + H+] = 200 mM
[NAD+] = 0,02 mM
b) [OA] = 0,01 mM
[Mal] = 100 mM
[NADH+ H+] = 0,02 mM
[NAD+] = 200 mM
Indique con qué situación metabólica se relaciona cada caso.
18- Dados los potenciales de reducción estándar de las siguientes hemirreacciones:

piruvato + 2 H+ + 2 e- lactato Eº’ = -0,185 v
NAD+ + 2 H+ + 2 e- NADH + H+ Eº’ = -0,320 v
Si la temperatura es 37º C y las concentraciones intracelulares son:
[piruvato] = 200 mM
[NAD+] = 0,05 mM
[lactato] = 50 mM
[NADH] = 0,03 mM
a) Calcule el E de la reacción espontánea.
b) Calcule el G de la reacción espontánea.
19- Utilizando los potenciales de reducción estándar indicados en el ejercicio anterior y las
siguientes concentraciones:
[piruvato] = 100 mM
+
[NAD ] = 0,10 mM
[lactato] = 150 mM
[NADH] = 0,05 mM
a) Calcule el E de la reacción a 37°C:
piruvato + NADH + H+ lactato + NAD+
b) Indique si la reacción es o no espontánea en estas condiciones.
20- La reacción
piruvato + NADH + H+ lactato + NAD+
Tiene un Gº’ = - 6226 cal/mol.
Calcule el Eº’ del par piruvato/lactato sabiendo que el Eº’ del NAD+/NADH es - 0,320 v.
21- La enzima malato deshidrogenada cataliza la formación de la última de las tres

moléculas de NADH producida en el ciclo de Krebs. A continuación, se indican las dos
hemirreacciones involucradas y los potenciales de reducción estándar.
oxalacetato2- + 2 H+ + 2 e- malato2- Eº’ = -0,166 v
+ + - +
NAD + 2 H + 2 e NADH + H Eº’ = -0,320 v
a) Escriba la ecuación neta para esta reacción rédox.
b) Calcule la variación de energía libre estándar (G°’).
c) Indique si esta reacción será favorable o desfavorable en condicione estándar.
d) Calcule la constante de equilibrio para la reacción neta.
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22- Teniendo en cuenta los valores de referencia, indique qué porcentaje de la energía
disponible de la oxidación del acetato se convierte en ATP, a través del ciclo de Krebs,
cadena respiratoria y fosforilación oxidativa.
Acetato + 2 O2 2 CO2 + 2 H2O G°’ = – 243 kcal/mol
+
NADH + H + ½ O2 +
NAD + H2O G°’ = – 53 kcal/mol
FADH2 + ½ O2 FAD + H2O G°’ = – 41 kcal/mol
GTP GDP + Pi G°’ = – 8kcal/mol
ATP ADP + Pi G°’ = – 8kcal/mol
a) 8%
b) 33%
c) 42%
d) 85%
23- Ídem 22 en presencia de rotenona.
24- En condiciones estándar, el potencial de reducción del par NAD +/NADH es igual a -
0,32 v. ¿Cuál debería ser el potencial de reducción de la sustancia X para producir una
diferencia de -1,35 kcal/mol en la variación de energía libre al reducirse en una reacción
rédox espontánea en condiciones estándar? F = 23060 cal/mol; n = 2.
a) + 0,08 v
b) - 0,29 v
c) + 0,12 v
d) - 0,05 v
25- En condiciones estándar, el potencial de reducción del par NAD +/NADH es igual a-
0,32 v. ¿Cuál debería ser el potencial de reducción de la sustancia X para producir una
diferencia de -2,52 kcal/mol en la variación de energía libre al reducirse en una reacción
rédox espontánea en condiciones estándar? F = 23060 cal/mol; n = 2.
a) +0,032 v
b) -0,155 v
c) +0,108 v
d) -0,265 v
26- Todas las reacciones rédox del ciclo de Krebs utilizan NAD + como aceptor de
electrones, excepto la oxidación del succinato a fumarato que utiliza FAD, de acuerdo a la
siguiente reacción:
Considerando las siguientes hemirreacciones
fumarato + 2 H+ + 2 e- succinato E°’ = 0,03 v
+ -
FAD + 2 H + 2 e FADH2 E°’ = 0,05 v
NAD+ H+ + 2 e- NADH E°’ = - 0,032 v
a) Indique cuál de los cofactores producirá un valor de G°’ negativo para la reacción.
b) ¿Cuál será la relación de concentraciones de productos / reactivos utilizando FAD que
dará un valor de G = 0, para la reacción a 37°C? repita los cálculos utilizando NAD+.
c) Suponga que la relación de NADH/NAD+ = 0,01 y de FADH2/FAD = 0,01, ¿cómo será la
relación fumarato/succinato para una reacción que utiliza FAD y para una reacción que
utiliza NAD+? ¿Por qué el FAD es un aceptor de electrones más adecuado para esta
reacción que el NAD+?
8
27- La termogenina es una proteína natural de la membrana mitocondrial de ciertos
tejidos animales como el tejido adiposo pardo. Las células de este tipo de tejido adiposo
tienen una elevada concentración de mitocondrias, y su función específica es oxidar
ácidos grasos para producir preferentemente calor y no la síntesis de ATP. La
termogenina ubicada en la membrana mitocondrial interna provee un canal a través del
cual los protones pueden pasar libremente. Esta adaptación metabólica permite que el
animal regule su temperatura mediante la movilización de sus reservas lipídicas y se
puede explicar a partir del funcionamiento de la cadena respiratoria.
Responder y justificar:
a) ¿El proceso es aeróbico o anaeróbico?
b) ¿A cuántos complejos de la cadena respiratoria involucra?
c) ¿Se genera un gradiente transmembrana de protones acoplado al flujo de electrones?
d) ¿El flujo de electrones está activado o deprimido en este proceso?
e) ¿Se produce flujo de electrones a través de la subunidad Fo de la ATP sintetasa?
f) Por la acción que realiza la termogenina se dice que es un agente desacoplante de la
fosforilación oxidativa. ¿Qué entiende por efecto desacoplante?
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SEMINARIO 16
Biología Molecular:
Ingeniería genética y
sus aplicaciones en la medicina
Objetivos de aprendizaje
• Conocer y familiarizarse con los principios básicos de la biología molecular.
• Aprender fundamentos de las técnicas de rutina de biología molecular.
• Estudiar la secuenciación de ADN y su aplicación en el diagnóstico clínico.
• Comprender la técnica de PCR conceptualmente y aplicaciones de la misma.
• Conocer y comprender algunas aplicaciones médicas de la investigación de
genes, estudio de enfermedades hereditarias, huella genética, proteínas recombinantes,
animales transgénicos, terapia génica.
LOS INSTRUMENTOS BÁSICOS DE LA INVESTIGACIÓN DE GENES
En las últimas décadas la tecnología de recombinación del ADN también conocida
como ingeniería genética, o más acertadamente recombinación genética in vitro, ha
revolucionado la biología. El campo de la salud es uno de los más beneficiados con el
desarrollo de esta tecnología. Las investigaciones que se realizan en esta área están
enfocadas al diagnóstico oportuno de enfermedades, así como su posible tratamiento a
través de la terapia con moléculas recombinantes e introducción de genes. Además, la
manipulación de genes proporcionará en el futuro una herramienta fundamental para la
eliminación de enfermedades mortales para el hombre. Por estas razones resulta útil que
el médico esté familiarizado con conceptos básicos sobre biología molecular, su
aplicación en la investigación biomédica, y en especial con sus posibles aplicaciones
clínicas, conceptos estos que aparecen cada vez con mayor frecuencia en toda la
literatura biomédica, tanto básica como clínica.
El rápido progreso de la biotecnología y, de hecho, su propia existencia, es el
resultado de utilizar unas pocas técnicas que se describen a continuación.
A- Enzimas de restricción
El descubrimiento de las enzimas de restricción ha permitido a los investigadores
manipular segmentos específicos de ADN, facilitando enormemente el estudio de esta
molécula de gran tamaño.
Las enzimas de restricción, o endonucleasas de restricción, reconocen secuencias
de bases específicas en el ADN doble hélice e hidrolizan las uniones fosfodiéster en
lugares concretos de ambas hebras del dúplex que contienen las secuencias reconocidas.
Las enzimas de restricción fueron obtenidas a partir de una gran variedad de procariontes.
Mediante su actividad de endonucleasa, en estos organismos las enzimas de restricción
eliminan ADN foráneo que pudiera ingresar. El ADN del propio microorganismo no se
destruye porque los sitios reconocidos por sus propias enzimas de restricción se
encuentran metilados.
Las enzimas de restricción reconocen secuencias específicas en el ADN de entre 4
a 8 pares de bases e hidrolizan un enlace fosfodiéster en cada hebra de la región
reconocida. Una característica notable de estos sitios de corte es que casi siempre son
palíndromos, o una repetición invertida, y los puntos de corte están dispuestos
simétricamente (figura 1).
Figura 1: Los puntos de corte están indicados por las flechas. El corte con BamHI (izquierda)
produce extremos simple cadena o “adhesivos” y el corte con AluI (derecha) produce extremos
doble cadena o “romos”. En cada hebra, la enzima hidroliza el enlace fosfodiéster en el lado 3’ del
eje de simetría.
1
Se han purificado y caracterizado más de 100 enzimas de restricción. Se nombran
con una abreviatura de tres letras que se refiere al organismo hospedador, por ej. Eco de
Escherichia coli, Hin de Haemophilus influenzae, Hae de Haemophilus aegyptius, seguida
de una indicación de la cepa en cuestión y de un número romano (en el caso que se haya
identificado más de una enzima de restricción de la misma cepa). La reacción catalizada
por estas enzimas puede ocurrir en el centro mismo de la secuencia reconocida dejando
lo que se conoce como extremos “romos” con ADN doble cadena, o extremos “adhesivos”
si el corte ocurre en posiciones diferentes en una hebra y en la otra del ADN, dejando en
este caso una porción de hebra simple cadena. Las enzimas de restricción se utilizan para
hidrolizar las uniones fosfodiéster de moléculas de ADN y proporcionar fragmentos
específicos que se pueden analizar y manipular con más facilidad que la molécula
original. Además, la cantidad y la longitud de los fragmentos de ADN obtenidos luego del
tratamiento con una enzima de restricción dependerán de la frecuencia de la secuencia de
reconocimiento de dicha enzima ya que si su secuencia de reconocimiento se encuentra
muchas veces repetida en el ADN, se generarán muchos fragmentos de restricción de
diferentes tamaños. Es importante destacar que a medida que el sitio de restricción de
una enzima tenga mayor número de pares de bases, la frecuencia de corte será menor y
la longitud de los fragmentos será mayor, ya que es menos probable que se combinen
dichas pares de bases para formar la secuencia de reconocimiento y encontrarla en el
ADN.
B- Técnicas de transferencia o “blotting”

Las técnicas Southern blot y Northern blot se utilizan para separar y caracterizar
ADN y ARN respectivamente. La técnica de Southern blot fue desarrollada por Edwin
Southern para separar e identificar fragmentos de ADN. Por analogía, la separación e
identificación de ARN se denominó Northern blot y la de proteínas, Western blot.
Fundamento de las técnicas: En todas estas técnicas se realiza primero una
electroforesis en gel con el objetivo de separar las moléculas por su tamaño y carga,
posteriormente la transferencia a una membrana, para finalmente identificar un fragmento
específico de ADN, una molécula de ARN particular o una proteína de interés mediante la
unión específica de otra molécula (sonda) de ácido nucleico para ADN o ARN o de un
anticuerpo en el caso de las proteínas.
La electroforesis en gel es una técnica en la que se aplica un campo eléctrico para

separar moléculas en base a su tamaño y a su carga como ya fue explicado en la clase
de separación de proteínas. Debido a que los ácidos nucleicos contienen grupos fosfatos
cargados negativamente, en un campo eléctrico migran hacia el electrodo positivo
(ánodo). El ADN tratado previamente por una o más enzimas de restricción o el ARN es
sembrado en un gel y al aplicarse el campo eléctrico los fragmentos se separan por
tamaño. Los fragmentos de ácidos nucleicos no se visualizan directamente sino que debe
teñirse el gel con un agente que se intercala entre las bases de la doble hélice y que
fluoresce al ser irradiado con luz ultravioleta (como el bromuro de etidio). De esta manera
se detectan hasta pequeñas diferencias de peso molecular, observándose los fragmentos
de ADN de una intensa fluorescencia anaranjada cuando se expone el gel a luz
ultravioleta. (figura 2).
La transferencia consiste en el pasaje de los ácidos nucleicos desde el gel donde
se han separado por electroforesis hacia un papel o membrana de nylon. Esta
transferencia ocurre por capilaridad donde el movimiento del buffer que embebe el gel
transfiere las moléculas de ácido nucleico a la membrana. Es importante destacar que la
posición de los fragmentos de ADN o ARN en el gel se conserva en la membrana. En el
caso de Southern blot, las membranas deben ser luego sometidas a condiciones alcalinas
2
para desnaturalizar las dos hebras y dejar al ADN como simple cadena. En el caso del
Northern blot no es necesario este paso ya que el ARN es simple cadena.
Un paso de gran importancia en estas técnicas, al igual que en la técnica de
Western blot, es el bloqueo de la membrana de manera de evitar hibridaciones
inespecíficas. Con este fin, en general se utiliza ADN de esperma de salmón o arenque.
Figura 2: Electroforesis de ácidos nucleicos en gel de agarosa, y tinción con Bromuro de etidio
de los fragmentos separados.
¿Cómo identificar específicamente un fragmento de interés en la membrana?

Mediante el uso de sondas específicas.
SONDAS: Una sonda es un fragmento de tamaño variable (desde unos pocos
nucleótidos como 50 pb hasta 2 kb) que puede ser ADN o ARN que se une
específicamente por complementariedad de bases a la secuencia de interés que se
encuentra en la membrana de nylon junto con cientos de fragmentos más. Este evento de
unión por bases complementarias se conoce como hibridación. Se dice que la sonda
“hibrida” con el fragmento específico. Una característica fundamental de la sonda es que
lleva alguna “marca” para que pueda detectarse la unión y por ende, identificar la
secuencia de interés a la cual se unió. Una de las técnicas más ampliamente utilizadas
para marcar la sonda es la incorporación de un nucleótido radioactivo. Un concepto
importante es que la sonda no tiene que ser necesariamente del mismo tamaño del
fragmento de interés, es suficiente que la sonda reconozca específicamente una porción
3
del fragmento de interés. Luego que la sonda ha hibridado con el fragmento de interés,
debe lavarse la membrana para eliminar el exceso de sonda que no se hubiera unido
específicamente. La radioactividad puede ser detectada por exposición de la membrana a
una placa autorradiográfica (como la de rayos X). En la placa se observan
específicamente el o los fragmentos donde hibridó la sonda ya que la radiación emitida en
ese sitio vela la placa autorradiográfica (figura 3). Existen otras formas de detección de las
sondas que no son radioactivas, algunas se marcan con grupos químicos que luego se
observan por fluorescencia.
Figura 3: Un fragmento de ADN o una molécula de ARN que contiene una determinada secuencia
puede identificarse si se separan por electroforesis una mezcla de fragmentos, se transfieren a
nylon, y se hibridan con una sonda marcada con 32P (fósforo radioactivo), complementaria a la
secuencia que se busca. El fragmento que contiene la secuencia buscada se visualiza después
por autorradiografía. Figura modificada de Griffiths AJF, Miller JH, Suzuki DT, et al. An Introduction
to Genetic Analysis. 7th edition. New York: W. H. Freeman; 2000. Using cloned DNA. Available
from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22040/.
4
Cuadro comparativo de las técnicas de blotting
Tipo de blot Southern Northern Western
Analiza ADN ARN Proteínas
Procedimiento
1) Preparación de la Tratar con enzimas Nada Nada
muestra de restricción
2) Separación por Tamaño Tamaño Tamaño o carga

electroforesis
3) Tratamiento del Desnaturalizar el Nada Nada

gel ADN con álcali
Por capilaridad Por capilaridad Campo eléctrico

4) Transferencia a una
membrana
Sonda radioactiva de Sonda radioactiva Anticuerpos
5) Identificación de RNA o de RNA o marcados
moléculas de interés ADN simple cadena ADN simple cadena fluorescente o
radioactivamente
C- Secuenciación de ADN
La secuenciación de ADN consiste en determinar el orden de los nucleótidos (A, C,
G y T) en una molécula de ADN. La secuencia de ADN constituye la información genética
heredable del núcleo celular, los plásmidos (bacterias), la mitocondria y cloroplastos (en
plantas) que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. Así pues,
determinar la secuencia de ADN es útil en el estudio de la investigación básica de los
procesos biológicos fundamentales, así como en campos aplicados, como el diagnóstico
de enfermedades hereditarias y la investigación forense. El desarrollo de la secuenciación
del ADN ha acelerado significativamente la investigación y los descubrimientos en
biología.
La mayoría de los métodos de secuenciación que se utilizan actualmente se basan
en el método originalmente desarrollado por Sanger en el año 1977. El principio clave
del método clásico de terminación de la cadena o método de Sanger es el uso de
dideoxinucleótidos trifosfato (ddNTPs) como terminadores de la cadena de ADN. Estos
dideoxinucleótidos terminan la elongación de la cadena al carecer del grupo 3'-OH del
azúcar que se necesita para la formación del enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos
durante la elongación de la cadena de ADN. En estas condiciones de elongación, se
generan moléculas de ADN simple cadena que difieren en longitud en apenas un
nucleótido y que pueden separarse unas de otras por electroforesis en gel de
poliacrilamida.
Este método requiere una hebra molde de ADN simple cadena, un cebador o
primer de ADN, una ADN polimerasa, dNTPs y los ddNTPs que terminan la elongación de
la cadena de ADN. La muestra de ADN se divide en cuatro reacciones de secuenciación
separadas que contienen la ADN polimerasa, los cuatro deoxinucleótidos estándar (dATP,
dGTP, dCTP Y dTTP), uno de ellos marcado radioactivamente (no es relevante cuál de
5
ellos, ya que solo se utiliza para evidenciar en pasos siguientes los fragmentos
generados). En cada mezcla de reacción se añade sólo uno de los cuatro ddNTPs
(ddATP, ddGTP, ddCTP, O ddTTP). La incorporación de un dideoxinucleótido en la
cadena naciente de ADN termina su extensión, lo que produce varios fragmentos de ADN
de longitud variable. Los fragmentos de ADN sintetizados, conteniendo la marca
radioactiva, son desnaturalizados por calor y separados por tamaño (con una resolución
de un solo nucleótido) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Cada una de las
cuatro reacciones de síntesis se corre en carriles individuales (denominados carril A, T, G
y C, de acuerdo al dideoxinucleótido añadido) y se visualizan las bandas de ADN
mediante autorradiografía. La secuencia del ADN se lee directamente a partir de la placa
autorradiográfica (figura 4): una banda oscura en un carril indica un fragmento de ADN
que es el resultado de una terminación de la cadena tras la incorporación de un ddNTP. El
nucleótido terminal puede ser identificado de acuerdo al ddNTP que se añadió en la
mezcla de reacción que dio lugar a esa banda.
Luego se desarrolló una técnica ligeramente modificada en la que no se usa
radioactividad sino fluorescencia: los ddNTPs terminadores de la cadena se marcan
fluorescentemente. Este método es conocido como secuenciación por terminador
fluorescente y utiliza cada uno de los cuatro ddNTPs que terminan la cadena marcado
con un fluoróforo de diferente color. La mayor ventaja de este método es que la
secuenciación se puede llevar a cabo en una sola reacción, en lugar de en cuatro
reacciones como en el método original. Además, a diferencia de la original que se
desarrollaba manualmente, esta técnica se desarrolla en equipos automatizados que
realizan una separación electroforética capilar y detectan la fluorescencia para determinar
la secuencia: una cámara detecta el color emitido por cada banda a medida que la
electroforesis avanza por lectores láser y envía los datos a un programa informático que
ensambla la secuencia (figura 4). Esta automatización de la lectura hace al método
atractivo por su gran capacidad y rapidez.
Figura 4: secuenciación de ADN

Izquierda: esquema del resultado de una secuenciación por el método de Sanger (radioactividad).
Derecha: esquema del resultado de una secuenciación por terminador fluorescente. Cada pico de
color representa un nucléotido en la secuencia de ADN.
Al medio se indica el resultado de la secuenciación como la secuencia de nucleótidos del ADN en
estudio
6
El método de Sanger fue ampliamente usado para adquirir gran cantidad de
conocimientos en ciencias biológicas. Es de remarcar que fue el método utilizado para
obtener la secuencia del genoma humano completo.
Posteriormente, se desarrollaron los denominados métodos de “Next-generation
sequencing” (NGS) o de alto rendimiento. Estos hicieron la secuenciación genómica más
rápida y de menor costo, permitiendo una aplicación más extensiva de la técnica. Para la
secuenciación de genomas completos, estos métodos hacen primero una fragmentación y
amplificación de todo el ADN genómico. Luego la secuenciación de miles de fragmentos
individuales se procesa simultáneamente. Se utilizan herramientas bioinformáticas para
buscar secuencias superpuestas entre fragmentos y reconstruir la secuencia de todo el
genoma. Esta aproximación es apropiada para pequeños genomas que carecen de ADN
repetitivo. Hay más de una docena de plataformas de NGS, los más conocidos y
utilizados son los denominados Illumina (método fluorométrico, basado en el método de
Sanger descripto arriba) y el Ion Torrent (método potenciométrico). Utilizando estas
tecnologías actualmente es posible determinar la secuencia de varios genomas humanos
en solo unas pocas horas.
Actualmente se desarrollan métodos de secuenciación de ADN potencialmente aún
más rápidos. Algunas de estas tecnologías de tercera generación evitan la amplificación
previa y determinan la secuencia de moléculas únicas de ADN
D- ADN producido por transcripción reversa

Es posible analizar qué proteínas se expresan en determinadas células
determinando la presencia de sus ARN mensajeros. Para ello se aisla el ARN y se utiliza
una enzima que sólo se encuentra en ciertos virus: la transcriptasa reversa. Utilizando los
ARN mensajeros como molde, la enzima produce una copia de ADN (ADNc) a partir del
ARN. A diferencia de los fragmentos de ADN clivados a partir del genoma por enzimas de
restricción, el ADN producido por la transcriptasa reversa, debido a que usa ARNm
maduro como templado, no contiene intrones.
E- Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR)

En 1984, Kary Mullis ideó un ingenioso método para amplificar secuencias
específicas de ADN que se denomina Reacción en Cadena de la Polimerasa (polymerase
chain reaction, PCR). Mediante esta técnica se puede amplificar un segmento específico
de ADN hasta millones de veces en pocas horas in vitro, si se conocen las secuencias
colindantes (flanqueantes) a esta secuencia blanco.
La PCR se lleva a cabo mezclando en un tubo
a) muestra conteniendo el ADN de interés,
b) oligonucleótidos (de entre 20 y 30 nucleótidos) que actuarán como cebadores (o
primers) uniéndose específicamente a la secuencias colindantes con la secuencia blanco,
c) los cuatro desoxirribonucleótidos (dNTPs),
d) un buffer de pH 7,4 y
e) ADN polimerasa termoestable al calor.
Se realizan replicaciones sucesivas repiendo tres pasos en cada ciclo, utilizando un
equipo programable denominado termociclador. El termociclador es un aparato con
capacidad para calentar y enfriar rápidamente las mezclas de reacción, de modo que se
aprovechen las cualidades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos y las enzimáticas de la
ADN polimerasa.
Cada ciclo es la repetición de los siguientes 3 pasos:
1) Desnaturalización de la doble hélice de ADN: las dos hebras de la molécula
de ADN original se separan mediante calentamiento de la solución a 95°C durante 15
7
segundos.
2) Hibridación de los cebadores: La solución se enfría rápidamente a una
temperatura entre 50 y 60°C que es generalmente la temperatura a la cual cada cebador
se une con una hebra de ADN desapareada. Un cebador hibrida con el extremo 3’ de la
secuencia blanco en una hebra y el otro cebador hibrida con el extremo 3’ de la secuencia
en la hebra complementaria. No se formará nuevamente el ADN doble hebra inicial
porque los cebadores están presentes en exceso.
3) Síntesis de ADN: la mezcla se calienta a 72°C para que actúe la ADN
polimerasa. Se utiliza una enzima termoestable (Taq polimerasa) proveniente de una
bacteria termófila (Thermus aquaticus) que tiene temperatura óptima de acción alrededor
de 70°C. La Taq polimerasa cataliza la elongación de ambos cebadores copiando la
secuencia blanco. La Taq polimerasa es resistente a temperaturas tan extremas como
95°C que es la temperatura del primer paso del ciclo de PCR lo cual permite que se
puedan realizar hasta 35 ciclos consecutivos de calentamiento y enfriamiento, sin
necesidad de reponer la polimerasa luego de este paso. Todos los componentes de la
PCR se agregan por única vez al inicio de la reacción. ¿Qué pasaría si se usase una ADN
polimerasa humana?
Estos tres pasos constituyen un ciclo de PCR y se pueden llevar a cabo repetidas y
consecutivas veces modificando únicamente la temperatura de la reacción. Cada ciclo de
PCR duplica la cantidad de ADN, por lo que finalmente se produce un aumento de 2 n de
la cantidad de ADN original, siendo n el número de ciclos que se llevan a cabo. La
amplificación es de un millón de veces después de 20 ciclos y de mil millones de veces
después de 30 ciclos, los cuales se pueden llevar a cabo en menos de una hora (figura 5).
Figura 5: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
8
Características importantes de la técnica
No es necesario conocer toda la secuencia a amplificar, únicamente hay que
conocer las secuencias que flanquean el fragmento de ADN interés.
Por PCR se pueden amplificar fragmentos tan grandes como 10 kb.
No es necesario que los cebadores se ajusten perfectamente a las secuencias que
flanquean el fragmento a amplificar. El uso de cebadores derivados de un gen de
secuencia conocida hace posible la búsqueda de variaciones sobre el tema. Esta
característica es muy importante porque así se han descubierto por PCR familias de
genes y relaciones evolutivas entre organismos.
Aplicaciones
La PCR permite amplificar una secuencia que constituye menos de la millonésima
parte del ADN total de un organismo superior. Es una técnica sumamente sensible, se
puede amplificar y detectar una única molécula de ADN, aportando una información muy
valiosa en medicina. A continuación se describen algunos ejemplos.
♦ Detección de bacterias y virus: la PCR puede descubrir la presencia de bacterias
y virus en estadíos tempranos de la infección o en estado latente. En estos casos, los
individuos infectados no han desarrollado todavía respuesta inmune a dichos patógenos,
por lo cual no puede detectarse la infección determinando la presencia de los anticuerpos.
Entonces, se recurre a la detección del agente patógeno. Esta puede hacerse tanto por
métodos inmunológicos (detectando la presencia de proteínas características del agente),
técnica que está siendo reemplazada por la PCR. Como primers o cebadores se usan
secuencias cortas complementarias a una parte del genoma del agente infeccioso. Aún
unas pocas copias originales de una bacteria o virus en la muestra del paciente pueden
detectarse luego de la amplificación.
Se aplica, por ejemplo, en la detección de virus de hepatitis B (HBV) y C (HCV) y el
de inmunodeficiencia humano (HIV). La búsqueda de bacilos en muestras de tejido puede
ser muy lenta y laboriosa pero con la PCR se puede detectar la presencia de solo 10 de
estos microorganismos por cada millón de células humanas.
♦ Colaboración con la medicina forense en variados aspectos por ejemplo la
identificación de personas permitiendo el reconocimiento de cadáveres o parentescos
biológicos en casos de disputa de paternidad. Ver huella dactilar de ADN más adelante.
♦ Establecimiento de grupos tisulares precisos en transplantes, amplificando y
comparando secuencias de los HLA del donante y receptor para determinar
compatibilidades.
♦ Detección de organismos transgénicos, por ejemplo productos de agricultura
como soja o maíz, para su comercialización.
♦ Estudio de relaciones evolutivas entre los organismos ya que bajo ciertas
circunstancias el ADN puede mantenerse intacto durante miles de años o incluso más
tiempo.
F- PCR en tiempo real

La PCR cuantitativa, qPCR, Q-PCR (del inglés quantitative polymerase chain
reaction) o PCR en tiempo real (del inglés real time PCR) es una variante de la PCR que
amplifica y simultáneamente cuantifica de forma absoluta el producto de la amplificación
de ADN.
La PCR cuantitativa es la metodología más moderna para el estudio de la
expresión génica. Podemos clasificar las técnicas de PCR en tiempo real según el empleo
de fluorocromos o bien de sondas moleculares dependientes de la secuencia.
En las técnicas basadas en fluorocromos se detecta la generación exponencial de
ADN de doble cadena empleando un compuesto que se intercala en la molécula doble
9
cadena y al estar unido produce fluorescencia. A medida que se amplifican las moléculas
de ADN aumenta el número de moléculas del fluorocromo unidas y por ende aumenta la
fluorescencia emitida. Un ejemplo de fluorocromo que permite esta detección es el SYBR
Green que, excitado mediante luz azul (λmax = 488 nm) emite luz verde (λmax = 522 nm).
La PCR en tiempo real se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir un
haz de luz de una longitud de onda determinada sobre cada mezcla de reacción y de
detectar la fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado. Esta técnica permite
determinar la cantidad de producto obtenido en cualquier momento de la amplificación
mediante la cuantificación de la intensidad de la señal de fluorescencia.
Esta técnica es de particular utilidad en virología en las que el grado de infección,
cuantificado como las copias de genoma viral por unidad de tejido del paciente, es
relevante en muchos casos. La qPCR posibilita tanto la cuantificación como el genotipado,
información útil para el diagnóstico, tratamiento y pronóstico de la enfermedad.
G- Animales transgénicos
Los individuos que han sido genéticamente modificados ya sea por deleción o
reemplazo de genes se denominan organismos transgénicos y los genes extraños o
modificados que se agregan se denominan transgenes. Estas modificaciones se realizan
en plantas o animales de experimentación.
En los organismos superiores, animales o vegetales, la información genética se
transmite por mecanismos de reproducción sexual, es lo que se conoce como transmisión
genética vertical. Sin embargo, hace ya unos treinta años se lograron obtener los primeros
ratones transgénicos mediante transferencia génica por inyección directa de ADN extraño
en un cigoto obtenido por fecundación in vitro. Es decir, se trataba de una transmisión
genética horizontal, también llamada transgénesis. Dado que el cigoto se hace
transgénico inicialmente, el ADN extra pasa a las células germinales y luego es
transferido a la progenie derivada de estas células comportándose como un gen nuclear
regular.
Actualmente, la biotecnología hace uso de muchos conocimientos y herramientas
para lograr objetivos inicialmente impensados. Así, se logra que el transgen no se inserte
en el genoma de una célula en forma azarosa sino que reemplace el gen normal, técnica
denominada direccionamiento de genes.
Hay varias formas de lograr la alteración de un gen de interés. La más simple es
sacarlo del genoma. Aunque parezca contrario a la lógica, una de las mejores maneras de
verificar la función de un gen es observar los efectos en individuos que no lo tienen. Si
ambas copias del gen de interés son completamente inactivadas o removidas, se
consigue un animal denominado knock-out. Esta estrategia es válida particularmente si el
gen no es esencial, si su ausencia no es letal.
La habilidad de generar de animales transgénicos, especialmente animales knock-
out para un determinado gen, ha sido de gran utilidad para el estudio in vivo de la función
de genes y proteínas. También sirve para generar modelos animales de enfermedades
humanas (por ejemplo, ratones knock-out) para el estudio de la enfermedad propiamente
dicha o de su progresión y para evaluar estrategias terapéuticas, de una manera que no
sería posible en seres humanos.
Al igual que ocurre en plantas, los animales son manipulados genéticamente
también para mejorar la calidad del animal mismo, introduciéndole nuevos rasgos
genéticos y así otorgándole características no existentes naturalmente como la protección
contra enfermedades. Esta aplicación se da especialmente en especies de interés
comercial o agrícola-ganadero (vacas, cerdos, ovejas, caballos). En el área médica, los
animales transgénicos son utilizados en la producción de proteínas recombinantes
(granjas farmacéuticas). En estas granjas farmacéuticas se crían ovejas, cabras, vacas o
10
cerdos transgénicos que producen en su leche proteínas terapéuticas humanas.
Ejemplos: obtención de α-1-antitripsina, proteína C, factor VIII de coagulación,
antitrombina III, etc.
A partir del núcleo de una célula de un animal es posible generar un animal
idéntico, denominado clon. El primer mamífero se clonó en 1996 (oveja Dolly), luego la
técnica se aplicó a cerdos y caballos. En Argentina, en el año 2002, el laboratorio Biosidus
clonó una vaca a la que llamó Pampa. Pampa también se clonó, y en el proceso, al ADN
de este animal se le agregó el gen humano que codifica para la somatotropina u hormona
de crecimiento de modo que el gen se expresa únicamente en la glándula mamaria,
generando una vaca transgénica, llamada Pampa Mansa. La leche de este animal
contiene hormona de crecimiento humana, vital para tratar a las personas que padecen
retrasos del crecimiento por deficiencias en la cantidad o actividad de esta proteína. En
2012, el Grupo de Biotecnología de la Reproducción del INTA Balcarce consiguió la
producción de leche con características de la leche materna humana en una vaca clonada
doblemente transgénica. Esta es la vaca Rosita ISA, productora de leche que contiene
lactoferrina y lisozima de origen humano.
11
USO DE TECNICAS DE INGENIERÍA GENÉTICA EN EL DIAGNOSTICO DE

ENFERMEDADES
Detección de polimorfismos
Los polimorfismos son variaciones en las secuencias de ADN, que ocurren con
significativa frecuencia en la población. En el genoma humano pueden encontrarse
millones de diferentes polimorfismos, que involucran mutaciones puntuales, la sustitución
de una base por otra pero también pueden ser deleciones e inserciones. Las variaciones
tienen diferentes consecuencias fenotípicas: contribuyen a nuestras características
individuales, producen una alteración funcional (enfermedad congénita o genética
heredable) o aumentan la susceptibilidad a ciertas enfermedades. Cuando un
polimorfismo llega a una frecuencia de más del 1% en la población general se considera
estable. El alelo de la anemia falciforme es un ejemplo de mutación puntual que es
estable en la población humana.
Algunos polimorfismos, que ocurren dentro de la región codificante de genes y
otros que se encuentran en regiones no codificantes estrechamente relacionadas a
genes, están involucrados en la etiología (causa) de enfermedades heredables. Estas
variaciones en el genoma sirven como base para el uso de técnicas de ADN
recombinante en el diagnóstico de enfermedades.
El análisis de ADN hace posible examinar variaciones en la secuencia de ADN
entre individuos y entre especies. Se pueden realizar estos estudios a dos niveles:
estudiando la variación en sitios reconocidos por enzimas de restricción (por RFLP,
técnica que está en desuso actualmente) y en un nivel más preciso, secuenciando el ADN
para analizar la variación del ADN base por base. La secuenciación es el método de
elección en la actualidad para analizar regiones del ADN, zonas de genes, regiones no
codificantes, etc.
12
Detección de polimorfismos que contienen regiones altamente variables,
causados por repetición de secuencias de ADN
El ADN humano contiene algunas secuencias que están repetidas en tándem un
número variable de veces en ciertos loci dispersos en el genoma. Esas regiones se
llaman regiones hipervariables porque contienen un número variable de repeticiones en
tándem (variable number of tandem repeats, VNTRs) o bien microsatélites de ADN y
contienen repeticiones en tándem de menor tamaño (short tandem repeats, STRs). Estas
regiones son polimórficas ya que la secuencia varía en el número de copias de la unidad
que se repite. El análisis de los VNTR es aplicable cuando se pueden obtener muestras
de ADN en buenas condiciones y en cantidad abundante.
Los VNTRs en humanos son secuencias de 1-5 kb que consisten en un número
variable de unidades repetitivas de 15 a más de 100 pb de longitud en el genoma de
diferentes individuos. Cuando el ADN completo es tratado con enzimas de restricción que
reconocen sitios que flanquean la región VNTR (no afectando dentro de los VNTRs) se
obtienen fragmentos que contienen esos loci, los cuales difieren en tamaño de un
individuo a otro dependiendo del número de repeticiones que estén presentes. Los
fragmentos de diferentes tamaños pueden ser separados por electroforesis en gel
mediante la técnica de Southern blot. Las sondas usadas para identificar esos fragmentos
de restricción se unen a la secuencia que está repetida o a una secuencia cercana a ésta.
Se comparan los patrones generados por muestras de ADN de origen conocido y
desconocido. La coincidencia entre los patrones indica con alta probabilidad que las
muestras provienen de la misma fuente.
Una de las primeras sondas que detectaron los VNTR humanos fue obtenida en
1985 a partir de una cuádruple repetición de una secuencia de 33 pb encontrada dentro
del primer intrón del gen de la mioglobina (figura 6). Una vez que los VNTRs se clonaron y
secuenciaron se encontró que la razón de la hibridación de la sonda a los VNTRs era una
secuencia central (core) de 13 pb común a todas las repeticiones y a la sonda. Las
secuencias flanqueantes a ese core, no eran necesariamente similares.
13
Figura 6: Obtención de una huella dactilar de ADN, utilizando una sonda para VNTR:
Panel a). La sonda utilizada reconoce una secuencia interna de 13 pb presente en los VNTR (se
marcan en negrita en la secuencia de 33 pb).
Panel b): En este diagrama se observa tres pares de cromosomas somáticos homólogos
conteniendo VNTRs (I, II, III) para cada uno de los tres individuos (A, B, C). El tamaño de los
fragmentos depende del número de repeticiones que ellos contengan.
Se realiza un Southern blot utilizando la sonda indicada en a) y se visualizan los fragmentos de
restricción producidos a partir del material genómico de los individuos.
Existe otra clase de secuencias repetitivas de ADN dispersas, los microsatélites

(short tandem repeats, STRs) que contienen repeticiones más cortas, de 2 a 5 pb.
Literalmente cientos de sistemas de STRs han sido mapeados en todo el genoma
humano, varios fueron investigados para su aplicación en tests de identificación de
humanos. Fueron encontrados en casi todos los cromosomas en el genoma y pueden ser
amplificados usando una variedad de cebadores por el método de PCR. Se analizan
principalmente repeticiones de 4 pb que son amplificadas por PCR con mayor fidelidad
que las repeticiones dinucleotídicas aunque también se usan repeticiones tri y
pentanucleotídicas. Al examinar múltiples STR loci, se puede obtener un alto grado de
discriminación entre individuos dada la enorme variedad de alelos presentes en una
población.
14
Dada la enorme variabilidad en el número de repeticiones en tándem de un

individuo a otro, el grupo de fragmentos que aparece en la autorradiografía del Southern
blot (VNTRs) o como productos de la PCR (STRs) es altamente personalizado. Los
patrones de fragmentos de restricción producidos a partir de esos loci pueden usarse para
identificar individuos de manera tan segura como la tradicional huella digital. En efecto,
esta técnica de fragmentos de restricción suele ser llamada como la huella digital de ADN
(DNA fingerprint). Cuántos más loci se examinan, más confiables son los resultados. Por
ejemplo, cuando se analiza la variabilidad de 5-10 STRs diferentes, la probabilidad que
dos individuos compartan por azar el mismo patrón de fragmentos es aproximadamente 1
en 10.000.000.000 (diez mil millones).
Originalmente desarrollada en base a los VNTRs, la detección de huellas dactilares
de ADN ahora se basa en el estudio de los STRs.
Ventajas de los STRs sobre los VNTRs

El estudio de STRs por PCR presenta varias ventajas sobre las técnicas
convencionales de Southern blot de los VNTRs. Dado el pequeño tamaño de los STRs, se
pueden diferenciar los fragmentos de ADN por una única base. Además puede usarse
menor cantidad de ADN o incluso ADN degradado. Por lo tanto, la integridad y cantidad
de muestra es un problema menor al utilizar los métodos de tipificación basados en PCR
que con los métodos convencionales de obtención de fragmentos de distintos tamaños
como los VNTRs.
Para revisión del uso de VNTRs y STRs en identidad genética, se puede acceder
a: http://worldwide.promega.com/resources/pubhub/short-tandem-repeat-analysis-in-the-
research-laboratory/
http://worldwide.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-
and-applications-guide/dna-based-human-identification/
Aplicaciones de la huella genética

Un uso inicial de la huella dactilar de ADN fue en disputas legales en la resolución
de delitos y para determinar paternidad. Luego de extendió en otras aplicaciones como la
identificación de restos humanos, pruebas de paternidad, compatibilidad en la donación
de órganos, el estudio de las poblaciones de animales silvestres, y el establecimiento del
origen o la composición de alimentos. También se ha utilizado para generar hipótesis
sobre las migraciones de los seres humanos en la prehistoria.
Por este método pueden determinarse relaciones familiares: individuos que están
estrechamente relacionados genéticamente tendrán patrones de fragmentos de restricción
más similares entre sí que con personas más distantemente relacionadas. Sólo gemelos
15
monocigóticos tendrán patrones idénticos. En estos casos, se debe contar con muestras
biológicas obtenidas de los individuos entre los que se busca la relación familiar. Cuando
no es posible obtener la muestra de los individuos directamente involucrados, se analizan
muestras de familiares directos, aportando información indirecta. Cuántos más familiares
se analicen y más próximo sea el lazo sanguíneo, hay menor probabilidad de error al
establecer el vínculo familiar.
La técnica también se aplica para aportar evidencia a favor o en contra de
sospechosos en casos policiales. Igualmente importante, también ha dado lugar a varias
exoneraciones de condenados. La extrema sensibilidad del método permite aislar
pequeñas trazas de ADN humano como evidencia para obtener la huella dactilar de ADN
de la persona que la dejó en el lugar. En estos casos, se debe contar con muestras
biológicas obtenidas como evidencia (sangre, semen, tejidos como células del folículo
piloso en el extremo de un único pelo, aún en pequeñas cantidades) y muestras
provenientes de sospechosos. Se comparan las huellas dactilares de ADN obtenidas a
partir de la evidencia y de la muestra tomada del sospechoso. La coincidencia entre
ambos resultados adjudica al sospechoso la muestra tomada como evidencia.
Las huellas dactilares de ADN resultaron un importante avance en medicina
forense. Igualmente, debe aclararse que esta metodología, particularmente el uso de los
VNTRs, ha sido discutida en algunos ámbitos por cuestiones sobre la contaminación de
las muestras, por procedimientos incorrectos en la preparación de las muestras o por la
interpretación errónea de los resultados.
Los resultados, usando una sonda que reconoce una de las secuencias repetitivas
del ADN humano, se muestran en la figura 7.
1- ¿A qué se debe que en los distintos individuos aparezcan fragmentos distintos
marcados si se utiliza la misma sonda?
2- ¿Cuál de los sospechosos le resultaría culpable?
3- ¿Por qué se analiza también el ADN de la víctima?
Figura 7: Análisis de los VNTRs realizado con distintas muestras.

carril 1 muestra de sangre tomada de la víctima
carriles 2 a 7: muestras de sangre tomadas de sosopechosos
carril central: muestra de tomada como evidencia de una gota de sangre en la escena del crimen.
Las muestras se amplificaron por PCR y se sometieron a Southern blot utilizando una sonda que
reconoce una secuencia de 13 pb común a todos los VNTRs presentes en el genoma humano.
16
Diagnóstico de enfermedades hereditarias aplicando técnicas de
secuenciación
Varias enfermedades hereditarias se pueden diagnosticar por secuenciación.
Se detalla la aplicación de la técnica para la poliposis adenomatosa familiar (PAF).
Esta es una enfermedad autosómica dominante, que se caracteriza clásicamente por el
desarrollo de cientos a miles de adenomas en el colon y el recto durante la segunda
década de la vida. La PAF tiene una incidencia de 1/8300 nacimientos, y se manifiesta por
igual entre ambos sexos. Casi todos los pacientes desarrollan cáncer colorrectal si no se
identifican y son tratados en una etapa temprana. La enfermedad es causada por
mutaciones en el gen APC, un gen supresor tumoral localizado en el cromosoma 5q21.
Este gen produce un ARNm de 8,9 kb dividido en 15 exones y genera una proteína de
2843 aminoácidos. La proteína APC tiene múltiples dominios que median tanto la
oligomerización como la unión a una variedad de proteínas intracelulares, las cuales
tienen importantes roles en la adhesión celular, la transducción de señales, y la activación
de la transcripción.
Otras características de las mutaciones del gen APC son:
1) pueden ocurrir en varias localizaciones dentro del gen APC.
2) dos de las más comunes son en los codones 1061 y 1309, se describe un nuevo
sitio con alta probabilidad de mutaciones en la ubicación 1465.
3) las mutaciones patogénicas resultan en un codón stop prematuro por alguno de
estos mecanismos: sustitución, deleción o inserción de nucleótido.
Hoy en día, una serie de pruebas genéticas están disponibles para analizar las
mutaciones en el gen APC. El método más utilizado actualmente es la secuenciación
directa del gen. Cuando se identifica una mutación específica causante de la enfermedad,
se debe realizar la prueba genética a todos los parientes de primer grado. Miembros de la
familia con un resultado negativo para la mutación detectada en el paciente no necesitan
más investigación y su seguimiento es el mismo de la población en general.
La información genética no es solo relevante para el paciente afectado, sino

también para la familia inmediata y sus futuros descendientes. La prevención del cáncer y
el mantener una buena calidad de vida de estos pacientes son los objetivos principales.
Por eso el diagnóstico precoz a través del análisis de la secuencia del gen logró extender
y mejorar la calidad de vida de estos pacientes.
También es relevante el conocimiento de qué tipo de mutación presentan los
pacientes ya que ayuda a predecir la severidad de la enfermedad, dado que la ubicación
de la mutación puede afectar la función de la proteína de diferente manera.
Farmacogenética
Es la ciencia que estudia las variaciones heredadas en los genes que dictan la
respuesta a fármacos. Explora cómo se pueden utilizar estas variaciones para predecir si
un paciente tendrá una buena, mala o ninguna respuesta a una determinada droga. ¿Hay
una diferencia entre farmacogenética y farmacogenómica? Farmacogenómica se refiere al
estudio general de diversos genes que determinan comportamiento a una droga. La
farmacogenética refiere al estudio de las diferencias heredadas (variaciones) en el
metabolismo y respuesta a una droga. La distinción entre los dos términos se considera
arbitraria y actualmente los dos términos se utilizan alternativamente. Para entender mejor
la importancia de esta nueva rama de la ciencia les describiremos un ejemplo.
Lucía es una niña de siete años que padece leucemia. Su doctor quiere comenzar
la quimioterapia cuanto antes. El purinethol es un quimioterápico común cuya
denominación genérica es 6-mercaptopurina. Su mecanismo de acción involucra su
17
incorporación a las células cancerosas en activa división que conlleva la muerte celular.
Esta droga fue utilizada por primera vez hace 30 años. Mientras que la mayoría de los
pacientes fueron beneficiados por el uso de esta droga, los doctores sabían que el
tratamiento producía un riesgo muy importante y los efectos secundarios eran a veces
fatales en ciertos pacientes. Se estudió entonces el metabolismo de la droga
encontrándose que la enzima tiopurina metiltransferasa (TPMT) es responsable de
metabolizarla e inactivarla. Encontraron que en la población variaban los niveles de la
actividad enzimática de TPMT. Dado que se trata de una sustancia tóxica es importante
que permanezca en el cuerpo solamente por una cantidad de tiempo limitada y que afecte
principalmente a las células cancerosas y no a las células normales. Por lo tanto, antes de
prescribir la droga, es crítico conocer si el paciente tiene actividad de TPMT para hacer
inactivo con eficacia el Purinethol. Aproximadamente el 89% de los niños posee TPMT
normal y se les puede administrar una dosis completa de la droga, sin sufrir efectos
secundarios relevantes. Aproximadamente el 11% de los niños posee TPMT con actividad
disminuída y se beneficiarán de una dosis mucho más baja. El 0,33% de niños tienen la
variante de menor actividad, y la sustancia tóxica puede persistir en el cuerpo de estos
niños durante mucho más tiempo por lo que sufrirán efectos secundarios severos o fatales
si se les administra cualquier dosis de Purinethol. Saber qué variante genética de TPMT
posee el paciente influenciará el tratamiento enormemente.
Para determinar la dosificación de Purinethol que Lucía necesitará se debe realizar
una prueba de diagnóstico basada en el estudio de secuencias del ADN para determinar
qué variante de TPMT tiene Lucia.
La historia de Lucía ilustra apenas una manera en que la farmacogenética puede

ser utilizada en la clínica. La farmacogenética también ayuda a elegir la droga adecuada
para un determinado paciente de una diversidad de distintos tratamientos. Por otro lado
ayuda a determinar el riesgo de un paciente frente a un determinado tratamiento y a
diseñar en función de esta información una estrategia para tratar la enfermedad.
USO DE TECNICAS DE INGENIERÍA GENÉTICA PARA LA PREVENCIÓN Y

TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES
Consejo genético
Una forma de prevenir enfermedades es evitando el pasaje de genes defectuosos
a la progenie. Con la verificación de la presencia de genes defectuosos en un individuo,
particularmente en familias que se conoce que lo portan, los consejeros genéticos pueden
informar sobre los riesgos y opciones.
Se han desarrollado análisis de screening basados en técnicas de recombinación
del ADN para muchas enfermedades hereditarias. Estos análisis pueden realizarse en
individuos adultos miembros de una familia donde una enfermedad es frecuente, en los
padres antes de la concepción, durante la gestación o luego del nacimiento. En ciertas
18
enfermedades, el diagnóstico precoz permite instaurar el tratamiento en etapas tempranas
post-nacimiento o aún en útero.
Producción de Proteínas Terapéuticas
Una contribución muy importante de la ingeniería genética a la medicina es haber
desarrollado la habilidad de producir cualquier proteína en cantidades casi ilimitadas,
siempre que se conozca el gen que codifica dicha proteína. Con el desarrollo de métodos
que permiten la transferencia de genes específicos de una célula a otra, y la inducción de
la expresión de los mismos en el nuevo hospedador, la industria farmacéutica ha
adquirido una gran potencialidad. Algunas compañías farmacéuticas ya producen
polipéptidos humanos por bacterias o levaduras. Un ejemplo de estos polipéptidos
producidos son hormonas como la insulina, hormona del crecimiento, glucagon, interferón,
factores de la coagulación, factor VIII, etc. Estos productos se encuentran comúnmente en
venta en las farmacias y son producidos por técnicas de biotecnología.
Algunas proteínas obtenidas por técnica de ADN recombinante utilizadas en la medicina:

Productos Usos
Activa plasmina, una enzima involucrada en la disolución de los trombos.
Anticoagulantes,
Efectivo en el tratamiento de pacientes con afecciones cardíacas o
TPA
circulatorias en general.
Factores de la
Promueve la coagulación deficiente en pacientes hemofílicos. Su uso
coagulación, Factor
elimina los riesgos de infección generados por múltiples transfusiones.
VIII
Factores Son factores de crecimiento del sistema inmune que estimulan la producción
estimulantes de de leucocitos; usados para tratar deficiencias inmunológicas y contra
colonias (CSF) infecciones.
Estimula la producción de eritrocitos; usada para tratar anemias en

Eritropoyetina
pacientes con enfermedades hepáticas.
Factores de Estimula la diferenciación y crecimiento de varios tipos celulares; usados

crecimiento para promover curación de heridas.
Hormona de
Usada para tratar el enanismo o retardos del crecimiento debidos a
crecimiento
deficiencia de esta hormona
humana (hGH)
Insulina humana Usada para tratar diabetes
Interfieren con la replicación viral; usados para tratamiento de algunos
Interferones
tumores.
Activan y estimulan diferentes clases de leucocitos; posibles usos en
Interleuquinas
infección con VIH, cáncer y deficiencias inmunológicas.
Anticuerpos
Especificidad de unión; usados en tests diagnósticos, transporte dirigido de
monoclonales
drogas, toxinas o compuestos radioactivos como terapia antitumoral.
(mAbs)
Previene daño tisular de las especies reactivas del oxígeno cuando el tejido
Superóxido
brevemente se somete a bajo oxígeno para luego aumentar abruptamente
dismutasa (SOD)
como en cirugías.
Proteínas derivadas de la cápside viral efectivas en alertar al sistema

Vacunas
inmune pero más seguras que las tradicionales a virus inactivado.
Tomado de Lehninger “Principios de Bioquímica” David L. Nelson y Michael M. Cox
19
CUESTIONARIO
1.- ¿Para qué se utilizan las enzimas de restricción?
2.- ¿Para qué se utiliza la técnica de Southern blot? Y Northern blot?
3.- ¿Con qué técnica pueden separarse e identificarse proteínas particulares dentro
de una mezcla?
4.- ¿Qué es el ADNc? ¿Cuál es la enzima que se utiliza para obtenerlo? ¿De
dónde se obtiene esta enzima?
5.- ¿Por qué es importante la secuencia de bases del primer o cebador utilizado en
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)?
6.- ¿Cuáles son los reactivos necesarios para hacer una PCR?
7.- ¿Cómo se analizan los VNTRs del genoma de una persona? ¿Y los STRs? ¿En
qué se asemejan y en qué se diferencian ambas estrategias de análisis de huellas
dactilares de ADN?
8.- ¿Qué es un organismo transgénico?
9.- ¿Cómo diagnosticaría una infección por HIV a través de la utilización de

técnicas de Biología Molecular? ¿Qué controles utilizaría? Tener en cuenta que el virus
HIV es un retrovirus o RNA virus.
10.- ¿Por qué las vacunas obtenidas por técnicas de recombinación de ADN son
más seguras que las que se fabricaban antiguamente?
EJERCITACION
1) La hemofilia A es una enfermedad hereditaria ligada al sexo y causada por la
falta de actividad del factor VIII de la coagulación. El gen que codifica para el factor VIII se
encuentra en el cromosoma X.
Una paciente con historial familiar de hemofilia A concurre a la consulta de un
médico genetista para averiguar si es portadora de la enfermedad. La paciente refiere que
posee un hermano y un tío materno afectados, y una hermana y hermano sanos. El
médico ordena la obtención de sangre venosa de su madre, padre, hermanos y su tío. A
partir del ADN extraído de las muestras se realiza un análisis de dos VNTRs localizados
en intrones 13 y 22 del gen factor VIII por PCR. A continuación, se muestran los geles de
agarosa teñidos con bromuro de etidio obtenidos y el árbol genealógico.
P = paciente
= mujer símbolo vacío = sano
= varón símbolo lleno = enfermo
= no se conoce el sexo
a) ¿Qué VNTR utilizaría para poder dar un diagnóstico?

b) ¿Qué conclusiones saca a partir de los resultados?
c) ¿Era necesario analizar al padre de la paciente para obtener el diagnóstico?
20
VNTR intrón 13
VNTR intrón 22
2) La anemia falciforme es una enfermedad autosómica recesiva causada por una

mutación puntual en el gen que codifica para la β-globina. Un matrimonio concurre a la
consulta de un médico genetista con el objetivo de obtener un diagnóstico prenatal. Dicha
pareja posee una hija con diagnóstico de anemia falciforme y otra niña sana. A partir del
ADN extraído de las muestras de cada integrante de la familia se analizan cuatro VNTRs
que se localizan próximos al gen que codifica para la β-globina. A continuación, se
muestra uno de los geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio obtenido y el árbol
genealógico.
P = paciente
= mujer símbolo vacío = sano
= varón símbolo lleno = enfermo
= no se conoce el sexo
P
P
a) ¿Qué conclusiones saca de los resultados obtenidos?

b) Utilizando esta misma técnica, ¿podría diagnosticar esta enfermedad en otro
grupo familiar?
21
3) Usted está trabajando en el Plan Nacional de Investigación en Diabetes y
necesita clonar el gen de la acetil-CoA Carboxilasa con el objetivo de estudiar la
regulación de dicho gen por insulina en diferentes condiciones metabólicas.
a) ¿A qué vía metabólica corresponde esta enzima?
b) ¿Qué técnica utilizaría para estudiar la expresión de este gen?
c) Explique brevemente el fundamento de la técnica que eligió.
d) En un plan de detección de enfermedades genéticas, descubre que existe un
porcentaje de individuos que posee una mutación del gen de la acetil-CoA Carboxilasa,
que genera un nuevo sitio de restricción para EcoRI. Utilizando una sonda marcada
radioactivamente como se indica en la figura, ¿cuál le parece que sería la calle de la
autorradiografía correspondiente a la muestra de un individuo normal, cuál de un portador
y cuál de un individuo enfermo? Justifique.
I------------------ 2 Kb -------------------------I
1,5 Kb 0,5 Kb
I-----------------------------------I--------------I
Eco RI Eco RI Eco RI
(generado
por la mutación)
Sonda
1 2 3
22
4) Dos bebés del mismo sexo (B1 y B2) nacieron el mismo día en el mismo
hospital. Debido a que se sospechó que los mismos fueron accidentalmente cambiados
en la nursery del hospital, se obtuvieron las huellas genéticas de ADN. A partir de
muestras de sangre de los padres y de los bebés, se extrajo el ADN y se amplificó por
PCR. El ADN luego fue tratado con la enzima de restricción BanI y se separaron los
fragmentos obtenidos por electroforesis en gel de agarosa. Para revelar los fragmentos
se usó una sonda radioactiva que se une a una secuencia dentro de los fragmentos BanI
que exhiben polimorfismos. Los resultados de un Southern blot son los mostrados más
abajo. Basados únicamente en este test, ¿quiénes son, con mayor probabilidad, los
padres del bebé B1 y quiénes los del bebé B2?
(MA es una de las madres y PA es su marido y MB es otra de las madres y PB su
marido).
MA PA B1 B2 MB PB
5) Se ha encontrado una enfermedad relacionada con el gen X que codifica para la

enzima Z. La causa de dicha enfermedad es la ausencia de la actividad de Z. Se
realizaron pruebas a distintos individuos utilizando diferentes técnicas de biología
molecular: Southern y Northern blot utilizando una sonda marcada que es el ADNc
específico para el gen X y Western blot utilizando anticuerpos específicos para la enzima
Z. En el análisis de Southern blot primero se realizó digestión del ADN con la enzima de
restricción EcoRI.
A continuación, se representan las autorradiografías de las distintas técnicas. Los
carriles se indican como A, B, C y D y corresponde a los pacientes analizados.
El individuo A es el control normal que no presenta la enfermedad.
El individuo B no presenta síntomas, pero algunos de sus hijos presentan la
enfermedad.
Los individuos C y D presentan la enfermedad.
a) Explicar por qué el individuo B no presenta síntomas.

b) Sugerir posibles defectos que lleven a la enfermedad en el individuo C y D a
partir de los resultados obtenidos. Justifique su respuesta.
23
A B C D
Peso molecular
Southern blot
5 kb
4 kb
1 kb
A B C D
Northern blot 3 kb
A B C D
Western blot 43 kDa
20 kDa
24
El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017
Bibliografía recomendada
LEHNINGER: PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA
(6ª ED.) (EN PAPEL)
ISBN 9788428216036
DAVID L. NELSON; MICHAEL M. COX , OMEGA, 2014
CADENA DE TRANSPORTE DE BIOQUIMICA
ELECTRONES Y (7ª ED.) (EN PAPEL)
ISBN 9788429176025
FOSFORILACIÓN OXIDATIVA LUBERT STRYER , REVERTE, 2013
BIOQUIMICA ILUSTRADA DE HARPER

(29ª ED.) (EN PAPEL)
ISBN 9786071509147
VV.AA. , MCGRAW-HILL, 2013
El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 1 El Depto. Bioquímica Humana NO edita texto para esta clase 2017 2
Lípidos
Lípidos Polisacáridos
polisacáridos Proteínas
proteínas En los sistemas biológicos podemos hablar de cuatro
modalidades de transferencia de electrones:
Directamente como electrones

ácidos
ácidos
grasos
grasosglucosa
glucosaaminoácidos
aminoácidos Fase 1
Fe2+ + Cu2+ ⇔ Fe3+ + Cu+
Acetil -CoA Como átomos de hidrógeno (H+ + e-) (reacciones en las que
interviene FAD o FMN)
NADH + AH2 ⇔ A + 2 e- + 2 H+
Ciclo
Ciclo
FADH 2 Fase 2
de Krebs Como hidruro ( :H- ) (deshidrogenasas ligadas a NAD+)
Por combinación directa de un reductor orgánico con O2

Fosforilación (hidroxilación, etc)
oxidativa
oxidativa Fase 3
R-CH3 + ½ O2→ R-CH2-OH
EQUIVALENTES DE REDUCCIÓN
1
Características generales de las mitocondrias
2
NADH Nicotinamida adenina dinucleótido Complejo I:
NADH deshidrogenasa ó NADH:ubiquinona óxido reductasa
Sustrato reducido + NAD+ ⇔ Sustrato oxidado + NADH + H+
Deshidrogenasa
Niacina:
vitamina B3
Complejo I:
NADH deshidrogenasa ó NADH:ubiquinona óxido reductasa
Riboflavina: vitamina B2
FAD Flavina adenina dinucleótido

FMN Flavina mononucleótido
3
Complejo I:
Proteínas con Fe-S NADH deshidrogenasa ó NADH:ubiquinona óxido reductasa
COMPLEJO III ó Ubiquinona: cit c óxido-reductasa

Co Q ó Ubiquinona
4
Citocromos COMPLEJO IV ó
citocromo oxidasa
Complejo II: Succinato – Co Q deshidrogenasa
Succinato-CoQ reductasa
Acil CoA
5
Inhibidores de la cadena de transporte de electrones
(-)
malonato
Teoría quimiosmótica de Mitchell

2) Transporte de protones a través de la MMI, potencial
1) Flujo de electrones a través de transportadores (exergónico) electroquímico transmembrana (endergónico)
NADH + H+ + ½ O2 → NAD+ + H2O
NADH + 11 H+N + ½ O2 NAD+ + 10 H+P + H2O

Eº’ NAD+/NADH= -0,320 V
∆Eº’= 1,14V
Eº’ O2/H2O= 0,816 V
Fuerza protón motriz, energía almacenada en el gradiente
∆Gº’= -n F ∆Eº’ = - 220 kJ/mol (real es más negativo)

= - 52.6 kcal/mol 3) Flujo de protones a favor de gradiente: Síntesis de
ATP por la ATP sintasa
6
Potencial Síntesis de Potencial

químico ATP por la eléctrico
ΔpH fuerza Δψ
(alcalino protón- (negativo
adentro) adentro)
motríz 5,2 kcal/mol
ATP sintasa
7
H+N: H+ en la matriz mitocondrial

(negativamente cargada)
H+P: H+ en el espacio intermembrana

(positivamente cargado)
•Por cada par de electrones transportados del NADH se bombean 10 H+

•Para sintetizar 1 ATP se necesitan 4 H+ (1 se usa para el transporte)
¿Cuántos ATP se sintetizan por cada NADH que se reoxida?
10/4= 2,5
•Por cada par de electrones transportados del FADH2 se bombean 6 H+

•Para sintetizar 1 ATP se necesitan 4 H+ (1 se usa para el transporte)
¿Cuántos ATP se sintetizan por cada FADH2 que se reoxida?
6/4= 1,5
8
Regulación de la fosforilación oxidativa:
Disponibilidad de [ADP]
Disponibilidad de NADH
Cadena de transporte de electrones no fosforilantes:

Curvas de consumo de
Oxígeno Sistema de monooxigenasas del citocromo P450 microsomal
9
Sistema de monooxigenasas del citocromo p450 mitocondrial
10
SEMINARIO 18
Integración Metabólica
Nuestro organismo debe satisfacer diversos requerimientos metabólicos
esenciales: sintetizar todos los componentes que las células necesitan, proteger nuestro
medio interno de toxinas y adaptarse a las condiciones cambiantes del medio externo.
Para cumplir con estos requisitos, transformamos los componentes de la dieta mediante el
metabolismo oxidativo, el almacenamiento y movilización de moléculas combustibles, las
vías biosintéticas y la detoxificación o eliminación de los compuestos residuales de las
diferentes vías metabólicas.
El organismo debe mantener un balance entre las necesidades de las células y la
disponibilidad de los combustibles, lo que se denomina homeostasis metabólica. La
disponibilidad constante de combustibles en la sangre se denomina homeostasis
calórica, mediante la cual el nivel sanguíneo de combustibles (en equivalentes de ATP)
no disminuye por debajo de ciertos límites, independientemente de si el individuo se
encuentra en un estado de buena nutrición o ayuno. El mantenimiento de la homeostasis
metabólica se logra mediante la integración de tres factores principales:
1) La concentración de nutrientes en la sangre, que afecta la velocidad con la
cual éstos son utilizados y almacenados en los diferentes tejidos,
2) los niveles de hormonas en sangre (primeros mensajeros), que transmiten
información a tejidos específicos sobre el estado del organismo y el aporte o demanda de
nutrientes,
3) el sistema nervioso central que, por medio de señales neurales, controla el
metabolismo directamente o a través de la liberación de hormonas.
Los nutrientes que utiliza nuestro organismo son los carbohidratos, los lípidos y las
proteínas, aproximadamente en las siguientes cantidades:
Una persona normal que lleva una vida sedentaria consume diariamente alrededor
de 200 g de glúcidos, 70 g de proteína y 60 g de lípidos, lo que le permite afrontar un
requerimiento energético de 1600-2400 kcal. Como se observa en la tabla anterior, desde
el punto de vista energético, el principal combustible metabólico son los ácidos
grasos.
Cuando se estudia la variación en los niveles de nutrientes en las diferentes etapas
que van desde la saciedad hasta el ayuno se observa que mientras que la cetonemia y la
concentración de ácidos grasos en sangre puede variar entre 1 y 2 órdenes de magnitud,
la concentración de glucosa se mantiene dentro de límites muy ajustados.
1
La glucemia debe mantenerse constante ya que, en condiciones normales, es el

principal combustible utilizado por el cerebro. La glucosa es la principal fuente de energía
que cruza la barrera hematoencefálica a una velocidad suficiente como para mantener el
funcionamiento del tejido. Un adulto requiere 190 g de glucosa por día, de los cuales 150
g (80%) son consumidos por el cerebro, mientras que el resto es utilizado por tejidos
como el cristalino, los glóbulos rojos, la médula renal y el músculo esquelético en
ejercicio.
Luego de una comida rica en carbohidratos, la glucemia aumenta desde el nivel de
ayuno de 70-110 mg% (aproximadamente 5 mM) hasta 120-140 mg% (8 mM), en 30
minutos hasta 1 hora. Luego de dos horas, la glucemia comienza a disminuir hasta llegar
a los valores del ayuno. La glucemia aumenta cuando se ingiere y absorbe glucosa y en
una persona saludable, no sobrepasa los 140 mg% porque los tejidos captan la glucosa
plasmática, la almacenan para su uso posterior y/o la oxidan para obtener energía.
Posteriormente, la glucemia disminuye porque las células continúan metabolizando la
glucosa.
Consecuencias de la hiperglucemia y de la hipoglucemia
Glucemia Consecuencias
mmol/l mg %
8,0 144 Supera umbral renal, glucosuria

5,5 100  insulina
4,6 83  insulina
3,8 68  glucagon, adrenalina, HG
3,2 58  cortisol
2,8 50 Confusión
1,7 31 Debilidad, mareos, náuseas
1,1 20 Calambres musculares
0,6 11 Daño cerebral, muerte
¿Qué ocurriría si la glucemia aumentara indefinidamente? Una concentración

elevada de glucosa provocaría la liberación de agua de los tejidos como consecuencia de
su efecto osmótico. Los tejidos se deshidratarían y su funcionamiento se afectaría, por
ejemplo, en el cerebro se podría producir un coma hiperosmolar. Por otro lado, si la
glucemia continuara bajando luego de una ingesta, los tejidos que dependen de glucosa
2
sufrirían por la falta de energía. Si la glucemia cayera abruptamente, el cerebro no podría
producir cantidades adecuadas de ATP. Se producirían mareos, seguidos de
adormecimiento y eventualmente, coma. Los glóbulos rojos no podrían producir suficiente
ATP para mantener la integridad de sus membranas. La hemólisis de estas células
disminuiría el transporte de oxígeno a los tejidos. Eventualmente, todos los tejidos que
dependen de oxígeno para producir energía fallarían. Si el problema fuera suficientemente
severo, podría provocar la muerte del individuo. Estas consecuencias del exceso o
deficiencia de glucosa se evitan porque el organismo es capaz de regular la glucemia.
Cuando la concentración de glucosa en sangre se aproxima al valor normal del ayuno de
70 a 110 mg%, alrededor de 2 horas después de la ingesta, se activa la glucogenolisis en
el hígado. El glucógeno hepático es la fuente principal de glucosa plasmática durante las
primeras horas del ayuno y luego, la gluconeogénesis empieza a ser importante como
fuente de glucosa. Los precursores utilizados en la gluconeogénesis hepática son
aportados por otros tejidos. El músculo en ejercicio y los glóbulos rojos producen lactato
en la glucólisis. La degradación de proteínas en el músculo provee aminoácidos y el tejido
adiposo aporta glicerol cuando se movilizan los depósitos de triacilglicéridos (TAG). Aún
durante el ayuno prolongado, la glucemia no cae dramáticamente. Luego de 5 a 6
semanas de ayuno, la glucemia aún se encuentra en valores de alrededor de 65 mg%.
Reservas energéticas en el humano

A pesar de su rol esencial en el metabolismo energético del cerebro y otros tejidos,
la cantidad de glucosa circulante es limitada. Para asegurar su continua provisión, el
organismo almacena combustibles metabólicos para proveer glucosa o energía en caso
de necesidad.
Reserva en g Provee energía durante

Combustible tisular Ayuno Caminando Maratón
Glucosa sanguínea 20 40 min 5 min 4 min
Glucógeno hepático 80 3,5 h 70 min 18 min
Glucógeno muscular 150 14 h 5h 70 min
Lípidos 9000 – 15000 34 días 11 días 3 días
Proteínas 6000 15 días 5 días 1,3 días
Dentro de los mecanismos homeostáticos que permiten regular la disponibilidad de

moléculas combustibles, el control hormonal es uno de los más importantes. La insulina
y el glucagon son las principales hormonas que regulan el almacenamiento y la utilización
de combustibles. La insulina es una hormona anabólica que promueve el almacenamiento
de combustibles, mientras que el glucagon es la hormona que estimula la movilización de
combustibles. Otras hormonas como la adrenalina, son liberadas como respuesta del
SNC a la hipoglucemia, al ejercicio y a otros tipos de estrés fisiológico. Junto con otras
hormonas del estrés (glucocorticoides), la adrenalina aumenta la disponibilidad de
combustibles.
Los principales mecanismos que modifican la velocidad de una vía metabólica a
través de la regulación de la actividad de las enzimas clave de las mismas son:
1. Disponibilidad de sustrato
2. Compartimentación celular
3. Modificación alostérica
4. Modificación covalente
5. Inducción y represión enzimáticas
3
1.- Disponibilidad de sustrato
La concentración de sustrato puede modificar significativamente la velocidad de
una reacción enzimática. De esa forma, fluctuaciones en la concentración de los sustratos
proveen un mecanismo automático de ajuste de la velocidad de una reacción enzimática a
las circunstancias metabólicas particulares. Un ejemplo de este tipo de regulación es el
que ocurre cuando se ingiere una dieta rica en glúcidos con la actividad de la
glucoquinasa hepática. Los cambios en las velocidades de las reacciones enzimáticas
que ocurren en virtud de cambios en la disponibilidad de sustrato son rápidos ya que la
fluctuación en la concentración de sustratos influye directamente en la actividad catalítica
de las enzimas involucradas, sin que medie ningún otro mecanismo adicional.
2.- Compartimentalización celular

La velocidad del flujo de una vía metabólica también se regula por la accesibilidad
de los sustratos al compartimiento celular en que se encuentran las enzimas de la vía. En
este tipo de regulación es fundamental el mecanismo de transporte de los metabolitos a
través de las membranas celulares y subcelulares. La -oxidación de ácidos grasos
ocurre en las mitocondrias y por lo tanto los ácidos grasos deben atravesar la membrana
mitocondrial interna para ser oxidados. Esta vía metabólica, por lo tanto, está fuertemente
regulada por la velocidad de transporte de los AG a la mitocondria.
3.- Modificación alostérica

Se produce cuando se altera la capacidad catalítica de una enzima (generalmente
con estructura cuaternaria) como consecuencia de un cambio en su conformación,
inducido por un metabolito (modificador alostérico). Es un mecanismo rápido de
modificación de la actividad enzimática.
4.- Modificación covalente

Otro tipo de modificación de la actividad enzimática se produce cuando la enzima
une covalentemente un grupo químico, lo que puede provocar una profunda alteración en
su actividad catalítica. La situación puede revertirse, es decir, la enzima puede perder el
grupo unido y retomar la actividad anterior. La regulación por modificación covalente da
como resultado cambios rápidos de la actividad enzimática, debido fundamentalmente a
que el agregado o eliminación del grupo es también catalizado por enzimas. Este
mecanismo de regulación enzimática ocurre en respuesta a una acción hormonal, por lo
tanto, responde a una regulación metabólica integral del organismo, es decir, responde a
la necesidad de coordinación de los estados metabólicos de los diferentes tejidos y a la
disponibilidad general de metabolitos, reflejada en los niveles sanguíneos de los mismos.
Entre los grupos que pueden unirse covalentemente se encuentran a los grupos
fosfato, adenilo, uridilo, metilo y ribosil-adenil-difosfato. La fosforilación es el tipo más
común de modificación covalente. Un tercio de las todas las proteínas regulables en las
células eucariotas son capaces de sufrir este tipo de regulación. Algunas proteínas tienen
sólo un sitio de fosforilación, mientras que otras proteínas poseen numerosos residuos
que pueden ser fosforilados. Este modo de modificación covalente es central en un gran
número de pasos regulatorios del metabolismo intermedio.
5.- Inducción o represión enzimática

Este mecanismo provoca un cambio en la cantidad de enzima presente debido a
una modificación en la expresión génica de la enzima como consecuencia de una
cascada de señalización intracelular generada por un mensajero químico. Es un
mecanismo lento y se manifiesta en respuesta a diferentes estímulos (hormonas, cambios
en el medio, etc.).
4
Otros mecanismos de regulación
Los zimógenos representan un conjunto de enzimas que se activan luego de sufrir
la hidrólisis de un péptido. Esta modificación covalente es irreversible. Generalmente, este
mecanismo impide que la acción de estas enzimas, mayoritariamente enzimas
proteolíticas, se manifieste en localizaciones “inconvenientes” para la célula o el
organismo (enzimas digestivas), o permite que se desencadene un proceso en el
momento apropiado (coagulación).
Especialización celular
Aun cuando todas las células del organismo están dotadas de la información
completa correspondiente al genoma, la diferenciación que conduce a la formación de los
distintos tejidos y órganos es el resultado de la expresión diferencial de la información
genética. Es decir, cada grupo de células especializadas puede expresar diferentes genes
y por lo tanto presentar diferentes actividades enzimáticas.
Mecanismos múltiples
La superposición de diversos mecanismos de regulación en un paso metabólico no
constituye una redundancia estéril. Cada mecanismo tiene sus particularidades, entre
ellas, la velocidad con que se desencadena y con la que se establece, y la duración de su
efecto. Cuando operan varios mecanismos a la vez, la regulación de la vía es más
sensible a cambios metabólicos de diversa índole. Por otra parte, cuando alguno de los
dispositivos de control no funciona correctamente, por anormalidades del individuo o del
ambiente, las consecuencias se atenúan por la existencia de otros mecanismos de
control. Por ello, en la diversidad se encuentra gran parte de la eficiencia y eficacia de los
mecanismos de regulación metabólica, y por consiguiente, no cabe plantearse cuál de
ellos es más importante o desempeña un papel más relevante en el control del
metabolismo.
Integración del metabolismo

Uno de los requisitos para mantener y perpetuar la vida es la conservación de la
homeostasis, es decir, la constancia del medio interno (niveles sanguíneos de iones,
lípidos e hidratos de carbono), dentro de límites muy estrechos. Estas condiciones deben
mantenerse tanto aún en situaciones variadas como el reposo, el ejercicio, la saciedad o
el ayuno. ¿Cómo se armoniza nuestro organismo para sobrevivir en diferentes situaciones
metabólicas?
En los mamíferos, la coordinación del metabolismo se logra a través del sistema
neuroendócrino. Las principales hormonas que participan en la regulación del
metabolismo intermedio son: la insulina, el glucagon, las catecolaminas y el cortisol. Por lo
tanto, antes de seguir repasemos sus efectos.
Insulina
La insulina es una hormona anabólica porque promueve el almacenamiento de
nutrientes. En particular, la insulina promueve
a) el almacenamiento de glucosa como glucógeno en hígado y músculo
b) la conversión de glucosa en TAG en hígado y su almacenamiento en el
tejido adiposo
c) el transporte de aminoácidos y la síntesis de proteínas en músculo
d) la síntesis de proteínas en el hígado (por ej. la albúmina)
e) el transporte de glucosa al músculo y al tejido adiposo La insulina también
inhibe la movilización de los combustibles.
5
¿Qué efectos tiene el glucagon? Como ya dijimos, el glucagon favorece la
movilización de combustibles:
1) estimula la liberación de glucosa a partir del glucógeno hepático
2) estimula la gluconeogénesis hepática a partir de lactato, glicerol y
aminoácidos
3) moviliza los ácidos grasos de los TAG del tejido adiposo como fuente
alternativa de combustible.
Otras hormonas cuyos efectos son opuestos a los efectos de la insulina son la
adrenalina, la noradrenalina y el cortisol. Sólo la insulina y el glucagon se liberan como
respuesta directa al cambio de combustibles en la sangre. La liberación de las otras
hormonas es mediada por señales neurales.
Mecanismos homeostáticos en saciedad

La saciedad es la percepción de no tener necesidad inmediata de ingesta de
alimentos. Utilizaremos este término para describir la situación que se observa luego de la
ingesta de alimentos. Luego de la ingesta, el incremento de la glucemia es el estímulo
para que las células del páncreas liberen insulina. Luego de una comida típica mixta con
carbohidratos, proteínas y grasas, los niveles de glucagon permanecen relativamente
constantes mientras que los de insulina aumentan.
Ciertos aminoácidos, particularmente arginina y leucina, también estimulan la

liberación de insulina. Los niveles sanguíneos de glucagon, secretado por las células del
páncreas, pueden aumentar o disminuir dependiendo de la composición de la ingesta. Si
la ingesta es rica en glúcidos, la concentración de glucagon disminuye, pero si es rica en
proteínas, los niveles de glucagon sanguíneo aumentan.
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¿Qué ocurre con la glucosa que llega al hígado desde el intestino?

El hígado es el primer tejido que tiene la oportunidad de utilizar la glucosa que
proviene de la dieta que le llega por la circulación porta. En saciedad, el hígado oxida
glucosa para satisfacer sus necesidades inmediatas y su exceso se almacena como
glucógeno. La glucosa puede convertirse en glucógeno; en piruvato y lactato (por
glucólisis) o puede utilizarse en la vía de las pentosas. El piruvato puede oxidarse a acetil-
CoA, que a su vez se convierte en ácidos grasos y luego en triacilglicéridos, u oxidarse a
CO2 y agua en el ciclo de Krebs (TCA).
¿Qué mecanismos regulatorios controlan el almacenamiento de combustibles

producidos a partir de glucosa?
Luego de la digestión y absorción de los glúcidos, la glucosa llega a la vena porta,
donde su concentración puede alcanzar los 180-360 mg% (10-20 mM), y finalmente al
hígado. Dado su elevado S0.5 (Km) para la glucosa, cuando la concentración de glucosa
es normal, la actividad de la glucoquinasa es muy baja. Como consecuencia del
incremento de la concentración de glucosa que llega al hígado por la vena porta, la
velocidad de fosforilación de la glucosa por la glucoquinasa aumenta. Los niveles de la
enzima también se INDUCEN con dietas ricas en carbohidratos en respuesta al
incremento en los niveles de insulina. La insulina promueve el almacenamiento de
glucosa como glucógeno. La insulina activa la fosfodiesterasa, disminuyendo los niveles
7
de AMPc, a las fosfatasas que desfosforilan a la glucógeno sintasa (GS desfosforilada es
activa) y a la enzima clave de la glucogenolisis (glucógeno fosforilasa desfosforilada es
inactiva). La insulina también promueve la síntesis de triacilglicéridos (TAG), que se
liberan del hígado como VLDL.
¿Qué ocurre con la glucosa que no es utilizada por el hígado?

Parte de la glucosa que proviene del intestino llega a la circulación general. El
cerebro utiliza casi únicamente glucosa para generar ATP. Otros grandes consumidores
de glucosa son los glóbulos rojos, que sólo pueden convertir la glucosa en lactato y
piruvato y el tejido adiposo que la convierte en lípidos. El músculo puede utilizar glucosa
para convertirla en glucógeno o degradarla por glucólisis. Algunos tejidos producen lactato
y piruvato por glucólisis a partir de la glucosa sanguínea. Estos metabolitos son captados
por el hígado y convertidos en lípidos. EN EL ESTADO DE SACIEDAD, EL HÍGADO
UTILIZA GLUCOSA Y NO REALIZA GLUCONEOGÉNESIS. Por lo tanto, el ciclo de Cori
(la conversión de glucosa a lactato en los tejidos periféricos y luego la conversión de
lactato en glucosa en el hígado) se interrumpe en estado de saciedad. En este caso, el
lactato que llega al hígado se convierte en piruvato que puede convertirse en acetil-CoA,
que a su vez puede oxidarse (ciclo de Krebs) o convertirse en ácidos grasos y TAG.
Todos los tejidos requieren glucosa para la vía de las pentosas y muchos usan
glucosa para la síntesis de glucoproteínas y otros compuestos que contienen
carbohidratos.
La insulina estimula el transporte de glucosa a las células del músculo en reposo y
adipocitos promoviendo el reclutamiento de los transportadores de glucosa de tipo GLUT
4 en la membrana celular. Otros tejidos, como el hígado, el cerebro y los glóbulos rojos
tienen un tipo diferente de transportador de glucosa que no se afecta significativamente
por insulina. Luego de una ingesta, se sintetiza glucógeno en el músculo por un proceso
similar al del hígado. Existen diferencias metabólicas entre estos tejidos, pero en esencia,
la insulina estimula la síntesis de glucógeno en el músculo en reposo como lo hace en el
hígado. Una diferencia clave entre el metabolismo del glucógeno muscular y hepático, es
que la insulina estimula fuertemente el transporte de glucosa en el músculo mientras que
el transporte de glucosa en las células hepáticas es independiente de insulina.
En el tejido adiposo, la insulina también estimula el transporte de glucosa que se oxida
para producir energía y también provee glicerol para la síntesis de TAG. La glucosa
también puede convertirse en ácidos grasos en el tejido adiposo.
¿Qué ocurre luego de una ingesta con los distintos tipos de nutrientes que la
componen?
Los productos finales de la digestión de los alimentos son los monosacáridos, los
ácidos grasos y los aminoácidos que por diferentes rutas llegan a la circulación
sanguínea.
En esta situación, la hormona predominante es la insulina, que favorece la entrada
de glucosa a las células, particularmente a los miocitos y adipocitos. Sumado a la mayor
utilización de glucosa en los hepatocitos, la consecuencia es una disminución de la
8
glucemia. Dos horas después de la ingesta la glucemia vuelve a los niveles del ayuno, 70
a 110 mg% (aprox. 5 mM).
En un individuo normal, aproximadamente el 50% de la glucosa ingerida se
metaboliza por glucólisis, el 10% se acumula como glucógeno y el 30 - 40% se convierte
en lípidos. En términos generales, en ausencia de insulina, la glucólisis, la glucogénesis y
la lipogénesis disminuyen. Sólo el 5% de la glucosa ingerida se transforma en lípidos en
un diabético deficiente en insulina.
¿Qué ocurre con las proteínas hidrolizadas en la digestión? Algunos de los

aminoácidos de la dieta son utilizados por las células intestinales para obtener energía, el
resto llega al hígado a través de la vena porta. El intestino metaboliza aspartato,
asparagina, glutamato y glutamina y libera alanina a la sangre portal. En el hígado, sólo
se metabolizan aminoácidos cuando su concentración es muy alta dado que las
transaminasas hepáticas tienen un Km alto, lo que permite “priorizar” el uso de
aminoácidos para la síntesis de proteínas. Los esqueletos carbonados de los aminoácidos
degradados en el hígado pueden ser oxidados completamente a CO 2 y H2O o bien
utilizarse como sustrato para la lipogénesis, y el grupo amino se convierte en urea. En los
demás tejidos, los aminoácidos provenientes de la dieta pueden utilizarse para la síntesis
de proteínas o para obtener energía, lo que dependerá del estado metabólico, es decir, de
la disponibilidad de energía. El hígado tiene baja capacidad para transaminar aminoácidos
ramificados que son fácilmente degradados en el músculo esquelético. De esta forma, el
músculo transamina aminoácidos ramificados y libera los cetoácidos a la sangre, de
donde son captados y oxidados en el hígado. En el músculo, los aminoácidos ramificados
se utilizan para sintetizar alanina y glutamina, que se liberan a la sangre.
¿Qué ocurre con los lípidos en la saciedad?

Los lípidos de la dieta llegan a la circulación general contenidos en quilomicrones.
En la circulación también se encuentran las VLDL provenientes del hígado, que contienen
los productos de la lipogénesis a partir de glucosa, lactato, piruvato y aminoácidos. Los
Qm y las VLDL son sustrato de la LIPOPROTEÍN LIPASA, una enzima anclada en las
células endoteliales de los capilares, que es muy abundante en el endotelio del tejido
adiposo. Esta enzima cataliza la liberación de ácidos grasos de los Qm y las VLDL a partir
de los TAG. En saciedad, se frena la lipólisis y se produce lipogénesis en el tejido adiposo
y la concentración plasmática de ácidos grasos libres es baja. Los ácidos grasos captados
por los adipocitos son re-esterificados con glicerol 3-fosfato para formar TAG y se
almacenan en forma de gotas de grasa dentro de estas células. El glicerol-3-P se produce
en los adipocitos a través de la glucólisis que genera dihidroxiacetona fosfato (DHAP). La
enzima glicerol-3-P deshidrogenasa reduce la DHAP a glicerol-3-P.
Mecanismos homeostáticos en el ayuno

Cambios en los niveles de insulina y glucagon
Cuando la glucemia disminuye como consecuencia de los mecanismos ya
descriptos, los niveles de insulina bajan y las células del páncreas comienzan a liberar
glucagon. Estos cambios hormonales provocan la degradación del glucógeno hepático y
la síntesis de glucosa por gluconeogénesis, lo que permite mantener la glucemia.
9
Estimulación de la glucogenolisis
El glucagon se une a receptores 7TMS
ubicados en la membrana plasmática y
asociados a la proteína Gs. La activación de la
adenilato ciclasa produce un incremento en los
niveles de AMPc y la activación de la proteína
quinasa A. Como consecuencia, la glucógeno
sintasa es fosforilada e inactivada y la síntesis
de glucógeno disminuye. Al mismo tiempo, se
estimula la degradación de glucógeno por un
mecanismo en dos pasos: 1) la PKA fosforila y
activa a la fosforilasa quinasa. 2) Esta enzima,
a su vez, fosforila y activa a la glucógeno
fosforilasa. La fosforilasa cataliza la
glucogenolisis, produciendo glucosa-1-fosfato,
que se convierte en glucosa-6-fosfato. La
desfosforilación de la glucosa-6-fosfato por la
glucosa-6-fosfatasa produce glucosa libre, que
se libera a la sangre.
Estimulación de la gluconeogénesis
Alrededor de 4 horas luego de una comida, el hígado produce glucosa que libera a
la sangre no sólo por glucogenolisis, sino también por gluconeogénesis. Los cambios
hormonales activan la liberación de precursores para la gluconeogénesis desde los tejidos
periféricos, específicamente lactato, aminoácidos y glicerol. Por diversos mecanismos se
promueve la conversión de los precursores gluconeogénicos a glucosa y se evita la
producción de ciclos fútiles. En particular, en el hígado, durante el ayuno se inactivan las
enzimas glucolíticas, piruvato quinasa, fosfofructoquinasa 1 (FFQ1) y glucoquinasa
promoviendo el flujo de carbonos por la vía gluconeogénica. Estos mecanismos operan en
los tres pasos en los que difieren la glucólisis y la gluconeogénesis:
1. Conversión de piruvato a fosfoenolpiruvato (PEP). El piruvato (derivado de
lactato y alanina) se convierte por la vía gluconeogenética a PEP. Este no se reconvierte
a piruvato (ciclo fútil) porque el glucagon promueve la fosforilación e inhibición de la
piruvato quinasa. El PEP se transforma en fructosa 1,6 difosfato (reversión de las
reacciones de la glucólisis).
2. Conversión de fructosa 1,6 bifosfato en fructosa 6 fosfato. Dados los bajos
niveles del regulador alostérico fructosa 2,6 bifosfato, la enzima glicolítica FFQ1 es
relativamente inactiva. Por lo tanto, la fructosa-6-fosfato no se convierte en fructosa-1,6-
bifosfato y se evita así un segundo ciclo fútil. La fructosa-6-fosfato se convierte en
glucosa-6-fosfato.
3. Conversión de glucosa-6-fosfato en glucosa por la glucosa-6-fosfatasa. Dado
que la glucoquinasa tiene un alto S0.5 (Km) para la glucosa y las concentraciones de
glucosa son relativamente bajas en el hepatocito durante el ayuno, la glucosa se libera a
la sangre. Por lo tanto, el tercer ciclo fútil potencial no ocurre.
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Las enzimas que participan en la gluconeogénesis, pero no en la glucólisis, están

activas durante el ayuno. La piruvato carboxilasa se activa por el acetil-CoA que proviene
de la oxidación de ácidos grasos. La fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK), la
fructosa-1,6-bifosfatasa y la glucosa-6-fosfatasa se inducen (aumentan los niveles
proteicos de las enzimas) por efectos del glucagon y los glucocorticoides. Cuando los
niveles de fructosa-2, 6-difosfato son bajos, la fructosa-1,6-bifosfatasa es activa. En esta
situación metabólica, el ciclo de Cori contribuye a mantener la glucemia. El hígado
sintetiza glucosa a partir de lactato y luego la glucosa se convierte de nuevo en lactato por
glucólisis en los tejidos periféricos como los glóbulos rojos. El ciclo de la alanina,
mediante el cual vuelven los carbonos al hígado como alanina en vez de lactato también
contribuye a la gluconeogénesis. Luego de varias horas de la ingesta, ya no ingresa
combustible desde el intestino y queda poco glucógeno en el hígado. Los tejidos que usan
glucosa dependen de la gluconeogénesis hepática, principalmente a partir de lactato,
glicerol y alanina.
En los ciclos de Cori y de la alanina NO SE PRODUCE SÍNTESIS NETA DE
GLUCOSA, sólo se reemplaza la utilizada por los tejidos periféricos. Sin embargo, dado
que otros tejidos como el cerebro oxidan completamente glucosa, es obligatoria su
síntesis durante el ayuno.
El glicerol, producto de la lipólisis en el tejido adiposo, es un sustrato para la
síntesis de glucosa en el ayuno. En cambio, los ácidos grasos no pueden utilizarse para la
síntesis de glucosa porque el acetil-CoA no puede convertirse en los intermediarios de
tres carbonos de la gluconeogénesis.
Son las proteínas, especialmente las del tejido muscular, las que aportan la mayor
parte del carbono necesario para la gluconeogénesis. Las proteínas musculares se
hidrolizan en el músculo produciendo aminoácidos que, en su mayoría, se metabolizan en
el músculo. Los principales aminoácidos que se liberan del músculo son alanina y
glutamina. El metabolismo de los demás aminoácidos produce intermediarios (piruvato, -
cetoglutarato) que pueden producir alanina y glutamina. Estos aminoácidos se liberan a la
sangre, de la que pueden ser captados en el hígado o el riñón y convertidos en glucosa.
Cuantitativamente la alanina es el sustrato gluconeogenético más importante.
11
El músculo también puede liberar los cetoácidos de aminoácidos ramificados que
pueden ser transformados en el hígado en glucosa o cuerpos cetónicos (dependiendo de
su condición de aminoácidos cetogénicos o glucogénicos). A partir del cetoácido de la
valina se puede sintetizar glucosa, a partir de cetoácido de la leucina se puede sintetizar
cuerpos cetónicos y ambos tipos de compuestos se pueden sintetizar a partir del
cetoácido de isoleucina. Gran parte de la glutamina liberada por el músculo es convertida
en alanina en el epitelio intestinal. En el intestino, la glutamina puede ser parcialmente
oxidada para producir energía y en parte el esqueleto carbonado y el grupo amino se
liberan a la sangre como alanina y amonio. Esta vía probablemente involucra la formación
de oxaloacetato a partir de glutamina por el TCA y la conversión a PEP y a piruvato que
se transamina a alanina.
La síntesis de glucosa en el hígado durante el ayuno está muy relacionada con la
síntesis de urea. La mayoría de los aminoácidos ceden su grupo amino por
transaminación con α-cetoglutarato formando glutamato y un nuevo cetoácido que puede
utilizarse para la gluconeogénesis (para un aminoácido glucogénico). El glutamato (por
desaminación oxidativa catalizada por la glutamato deshidrogenasa) provee el amonio
para la síntesis de urea. Una fuente adicional de amonio es la mucosa intestinal que
convierte glutamina en alanina y amonio. Es importante considerar que cuanto mayor sea
la actividad gluconeogénica, mayor será la producción de urea.
¿Qué limita la capacidad del hígado de convertir aminoácidos en glucosa?

La conversión de aminoácidos en glucosa involucra diversos procesos metabólicos:
transaminación, desaminación oxidativa, conversión de NH4+ en urea y finalmente
gluconeogénesis a partir del esqueleto carbonado del aminoácido. La limitación fisiológica
para formar glucosa a partir de aminoácidos es la gran cantidad de energía requerida para
este proceso. Se requieren cuatro moléculas de ATP para convertir amoníaco en urea y
seis más para transformar el esqueleto carbonado de los aminoácidos en glucosa.
En todas las células los niveles de ATP se mantienen relativamente constantes.
Por lo tanto, para la gluconeogénesis, el hígado debe realizar metabolismo aeróbico para
producir ATP en reemplazo del ATP consumido.
Glucemia durante el ayuno prolongado

Durante el ayuno prolongado, se produce un cambio en la utilización de los
combustibles. Los tejidos usan menos glucosa que durante un ayuno corto y utilizan
predominantemente combustibles derivados de la metabolización de los TAG del tejido
adiposo (es decir, ácidos grasos y cuerpos cetónicos). En consecuencia, la glucemia no
cae drásticamente. De hecho, aún después de 5 a 6 semanas de ayuno, la glucemia es
de alrededor de 65 mg%.
El principal cambio que ocurre en el ayuno prolongado es un incremento
significativo en los niveles sanguíneos de cuerpos cetónicos luego de 3 a 5 días de ayuno.
En estos niveles, el cerebro y otros tejidos nerviosos comienzan a utilizarlos y
consecuentemente oxidan menos glucosa, requiriendo alrededor de la tercera parte de la
glucosa (40 g/día) que requieren en condiciones de alimentación normal. Como resultado
de esta reducción en la utilización de glucosa, la velocidad de la gluconeogénesis en el
hígado disminuye y también lo hace la producción de urea. Por lo tanto, no se degradan
las proteínas del músculo y otros tejidos, dado que hay una menor necesidad de
aminoácidos para la gluconeogénesis.
La proteína corporal, particularmente la muscular, no es fundamentalmente una
forma de almacenaje de combustible, como lo son el glucógeno o los TAG, sino que las
proteínas tienen funciones muy importantes tanto estructurales como funcionales. Por lo
tanto, si la degradación de proteínas aumenta excesivamente, la función corporal puede
12
comprometerse seriamente. Si continúa el ayuno y no hay otros problemas, como
infecciones, el individuo muere, generalmente porque la pérdida severa de proteínas
produce el mal funcionamiento de los órganos principales, como el corazón. Por lo tanto,
el aumento en los cuerpos cetónicos que disminuye la degradación de proteínas, permite
la supervivencia por largos períodos sin ingerir alimentos.
Estimulación de la lipólisis
Los cambios hormonales (baja relación insulina/glucagon) que ocurren durante el
ayuno estimulan la degradación de TAG del tejido adiposo. Consecuentemente, se liberan
a la circulación ácidos grasos y glicerol. Los ácidos grasos (AG) son utilizados como
combustible preferentemente a la glucosa por muchos tejidos. En el corazón y el músculo,
la oxidación de los AG inhibe la glucólisis. En el cerebro, los AG no se oxidan porque no
atraviesan la barrera hematoencefálica. La -oxidación de ácidos grasos en el hígado,
permite generar el ATP necesario para la gluconeogénesis y la síntesis de acetil-CoA. En
este caso, sin embargo, la mayor parte del acetil-CoA no entra al TAC, sino que se
convierte en cuerpos cetónicos (CC, acetoacetato y -hidroxibutirato), que se transportan
a la sangre y sirven como combustible adicional para los tejidos extrahepáticos. Esto
ocurre porque en esas condiciones los niveles de oxaloacetato hepáticos son muy bajos
dado que el oxaloacetato se utiliza para la síntesis de glucosa. Como en el caso de los
AG, los CC son utilizados preferentemente a la glucosa en muchos tejidos. Pueden
atravesar la barrera hematoencefálica y cuando la cetonemia es suficientemente alta, los
CC son un combustible alternativo para el cerebro (Aclaración: esto ocurre cuando se
está en un estado de inanición: es decir con más de 3 a 5 días de ayuno) aunque son
incapaces de reemplazar completamente la necesidad de glucosa del cerebro. Los CC
también inhiben la proteólisis del músculo esquelético y por lo tanto disminuyen la
destrucción muscular durante el ayuno. Mientras la cetonemia esté elevada se necesitará
menos glucosa, menos aminoácidos gluconeogénicos y menor necesidad de usar
proteínas musculares. La glucemia tiende a disminuir en el ayuno por lo que se reduce la
secreción de insulina y se favorece la de glucagon. Además, el ayuno reduce la formación
de triiodotironina, la forma activa de la hormona tiroidea a partir de tiroxina lo que puede
reducir el requerimiento basal de energía hasta un 25%.
¿Cómo se movilizan los aminoácidos durante el ayuno?

Durante el ayuno nocturno, la síntesis de proteínas en el hígado y otros tejidos
continua, pero a una velocidad menor comparada con la del estado postprandial. Hay una
degradación neta de proteínas tanto en el músculo esquelético (que contiene la masa
proteica más importante del organismo) como en otros tejidos. El músculo esquelético
13
puede oxidar aminoácidos ramificados para producir energía y liberar alanina y glutamina.
La liberación de aminoácidos musculares durante el ayuno nocturno es estimulada por la
disminución de los niveles de insulina y el aumento de los niveles de glucocorticoides, que
provocan un aumento en la proteólisis y liberación de aminoácidos a la sangre. El hígado
es el principal órgano que capta la alanina circulante. Además, el hígado también capta
otros aminoácidos libres, α-cetoácidos y algo de glutamina de la sangre. La alanina y
otros aminoácidos son degradados y el amoníaco formado puede ser convertido en urea,
mientras que el esqueleto carbonado es convertido principalmente en glucosa. El
glucagon y los glucocorticoides estimulan la captación hepática de aminoácidos, la
gluconeogénesis y ureagénesis. La inducción de las enzimas gluconeogénicas por
glucagon y glucocorticoides durante el ayuno nocturno se correlaciona con la inducción de
las enzimas de la degradación de aminoácidos (ej., tirosina aminotransferasa) y la
inducción de las enzimas del ciclo de la urea. El ciclo de la urea también se incrementa
por el mayor aporte de amonio proveniente de la degradación hepática de los
aminoácidos.
¿Qué ocurre con el metabolismo de los aminoácidos en otros tejidos?

La glutamina es generada en el músculo esquelético por la oxidación de los
aminoácidos ramificados, y en los pulmones y cerebro para la eliminación del amonio
formado localmente a partir del metabolismo de aminoácidos El riñón, el intestino y las
células con un alto recambio celular representan los sitios de mayor captación de
glutamina, que actúa como dador de nitrógeno para la síntesis de bases nitrogenadas y
en particular en el riñón, como mecanismo de regulación del equilibrio ácido-base en
situaciones de acidez metabólica.
¿Cuál es la clave de la cooperación metabólica entre los distintos tejidos?

La cooperación metabólica entre células y entre diferentes tejidos es fundamental
para la supervivencia de un individuo. Nuestro organismo está organizado para mantener
estable el medio interno utilizando los mecanismos de regulación enzimática que hemos
detallado previamente. Pero, … ¿cuál es la “llave maestra” de esta integración?
Se ha descripto que la quinasa activada por AMP (AMPK) es el principal
regulador del metabolismo. La AMPK induce una cascada de eventos dentro de las
células en respuesta a cambios en la carga energética de la célula. Su rol como
reguladora de la carga energética ubica a esta enzima en un punto de control central en el
mantenimiento de la homeostasis energética. Por otra parte, recientemente, se ha
descripto que la actividad de AMPK también puede ser regulada por estímulos fisiológico
como hormonas y nutrientes.
Cuando se activa la AMPK las células cambian de un estado de consumo activo de
ATP (como en la síntesis de ácidos grasos) a
una producción activa de ATP (como en la
oxidación de glucosa y ácidos grasos).
La activación de la AMPK también ejerce
efectos a largo plazo a nivel de la expresión
génica y la síntesis de proteínas. Otra actividad
importante atribuida a la AMPK es la regulación
de la síntesis y secreción de insulina a nivel
pancreático y la modulación de la función
hipotalámica involucrada en la regulación de la
saciedad.
El ATP es la fuente principal de energía
bioquímica. Sin embargo, los niveles
endógenos de AMP se modifican más
14
significativamente que los de ADP o ATP. Pequeños cambios en la concentración de ADP
o ATP conducen a importantes modificaciones en los niveles de AMP, de acuerdo a la
siguiente reacción:
2 ADP  ATP + AMP Adenilato Quinasa
Keq = [ATP] x [AMP] y por lo tanto [AMP] = Keq [ADP]2/ [ATP]

[ADP]2
La unión del AMP (regulador alostérico) a la AMPK aumenta su actividad y

favorece su activación haciendo a la enzima un mejor sustrato para las quinasas que la
fosforilan (AMPKK) y peor sustrato para las fosfatasas que la desfosforilan. Debido a que
la AMPK es altamente sensible a las variaciones en los niveles de AMP, esta enzima
modifica su actividad frente a pequeños cambios en la relación [ATP]/ [ADP]. La
regulación alostérica negativa de la AMPK es ejercida por la fosfocreatina. La AMPK
aumenta el metabolismo energético incrementando la captación de glucosa en el músculo
en ejercicio y activando el metabolismo de los ácidos grasos. Simultáneamente, la AMPK
inhibe la síntesis de ácidos grasos, la transferencia del grupo fosfato de alta energía de la
fosfocreatina, la síntesis de colesterol, la transcripción del ADN y la apoptosis.
El balance entre los nucleótidos de adenina está regulado por la actividad de la
adenilato quinasa y a su vez depende fuertemente de la producción mitocondrial de ATP y
del metabolismo anaeróbico de los hidratos de carbono. El ATP consumido se resintetiza
mediante las actividades de la adenilato quinasa, la creatina fosfoquinasa y el
metabolismo anaeróbico. Cuando el consumo de energía es menor y sostenido en el
tiempo, se utiliza la oxidación mitocondrial de ácidos grasos para generar ATP.
La AMPK tiene un dominio que puede unirse al glucógeno. En el músculo, un
contenido alto de glucógeno reprime la actividad de la AMPK. También se ha demostrado
que aumenta la actividad la enzima en respuesta al estímulo de receptores acoplados a
fosfolipasa C y a hormonas secretadas por el tejido adiposo (adipoquinas) tales como
leptina y adiponectina.
¿Qué consecuencias tiene la activación de la AMPK?

La cascada de señalización iniciada por la activación de la AMPK tiene efectos
sobre el metabolismo de glucosa y lípidos, la expresión de genes y la síntesis de
proteínas. Estos efectos son importantes en la regulación del metabolismo del hígado,
músculo esquelético, corazón, tejido adiposo y páncreas.
15
Esquema que representa el rol central de AMPK in la regulación del

metabolismo en respuesta a eventos tales como estrés inducido por ejercicio o
nutrientes. Las flechas indican efectos positivos de la AMPK, mientras que las
líneas T indican efectos inhibitorios
Metabolismo intermedio durante el ejercicio

Regulación de la glucemia durante el ejercicio
Durante el ejercicio operan mecanismos similares a los que ocurren durante el
ayuno, lo que permite mantener la glucemia en valores normales a pesar del aumento en
el consumo de glucosa que ocurre en esta situación. En una etapa inicial, las células
musculares obtienen ATP a partir de la creatina fosfato. Sin embargo, la cantidad de
creatina fosfato en el músculo puede sostener el ejercicio sólo durante períodos muy
breves. Por lo tanto, luego de esta etapa inicial comienzan a degradarse los depósitos de
glucógeno muscular, y la glucosa obtenida es oxidada en el músculo para aportar ATP.
La disponibilidad de ATP en el músculo durante el ejercicio se mantiene por los
siguientes procesos:
a) Adenilato quinasa
Cuando el ATP se convierte en ADP (durante la contracción muscular), la adenilato
quinasa regenera el ATP produciendo AMP en el proceso, en la siguiente reacción:
adenilato quinasa
2 ADP  ATP + AMP
El aumento en los niveles de AMP activa la glucólisis estimulando a la FFQ1 y

también a la fosforilasa b. La fosforilasa b también puede activarse por fosforilación
convirtiéndose en fosforilasa a. La fosforilación de la fosforilasa b también se estimula por
un aumento en los niveles de calcio, que proviene del retículo sarcoplásmico. El Ca 2+ se
une a calmodulina y este complejo activa a la fosforilasa quinasa que fosforila y activa a la
fosforilasa.
16
2 ADP  ATP + AMP

Músculo en reposo: 1,0 mM 5 mM 0,2 mM
Músculo en ejercicio: 1,5mM 4 mM 0,8 mM
Con la actividad muscular, los cambios en las concentraciones de ATP y ADP son
relativamente pequeños. Sin embargo, a través de la adenilato quinasa, los niveles de
AMP aumentan marcadamente durante el ejercicio (como vemos en el ejemplo, hay 4
veces de aumento en los niveles de AMP en el ejercicio respecto del reposo). De esta
forma, los niveles de AMP representan una señal intracelular muy importante en la
regulación del metabolismo muscular (por ej. recordar que es activador de la movilización
de glucógeno).
Fuentes de combustible para la contracción muscular

Fuente Velocidad ~ P total disponible
máxima de (mmol)
producción
(mmol/seg)
ATP muscular 223
Creatina-P 73,3 446
Glucógeno muscular lactato 39,1 6700
Glucógeno muscular CO2 16,7 84000
Glucógeno hepático CO2 6,2 19000
Ácidos grasos (adiposo) CO2 6,7 4000000
b) Creatina fosfoquinasa/ Fosfocreatina

La fosfocreatina es una reserva de enlaces fosfato de alta energía.
Fosfocreatina + ADP  ATP + creatina
Aunque la reacción de la fosfocreatina es la más rápida para producir ATP, la
cantidad de ATP producido en esta reacción es considerablemente pequeña. En un
ejercicio intenso, las reservas de fosfocreatina se agotan aproximadamente a los 30 - 40
segundos. Los corredores olímpicos son capaces de correr 100 m “casi sin respirar” y
aproximadamente la mitad de la energía que usan en la corrida proviene de los enlaces
de alta energía acumulados como creatina fosfato. Mientras que la fosfocreatina es
importante para un máximo rendimiento, otras fuentes de producción de energía deben
ponerse en juego después de los primeros 30 segundos de una corrida rápida y corta.
Después de haber agotado las reservas de fosfocreatina el músculo puede obtener ATP a
partir de la metabolización de glucosa a piruvato o lactato (glucólisis anaeróbica). Por esta
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vía, sólo se obtienen 2 ATP por cada mol de glucosa o bien 3 ATP por cada resto glicosilo
obtenido a partir de la glucogenolisis. La glucólisis anaeróbica es un proceso rápido, pero
produce ácido láctico que puede acumularse en el músculo en ejercicio, y producir
acidosis. Por otra parte, el lactato puede transferirse al hígado donde es transformado en
glucosa por gluconeogénesis (ciclo de Cori), lo que traslada parte de la carga metabólica
del músculo al hígado. Además, en condiciones anaeróbicas, los ácidos grasos NO
pueden usarse como sustratos. Por lo tanto, si sólo se produce metabolismo anaeróbico
en el músculo en ejercicio, las reservas de glucógeno muscular se agotarán rápidamente
y se iniciará la captación de glucosa sanguínea, lo que puede provocar hipoglucemia y un
malfuncionamiento del SNC.
Los depósitos de glucógeno en el músculo son suficientes para realizar ejercicios
como levantar pesas o empujar un objeto, pero sólo por períodos cortos
(aproximadamente 2 min). Durante el ejercicio intenso, se libera a la sangre la hormona
adrenalina que se une a receptores de membrana en las células musculares, y activa a la
adenilato ciclasa. Cuando los niveles de AMPc aumentan, la PKA se activa y cataliza la
fosforilación de la fosforilasa quinasa, que se activa y fosforila a la glucógeno fosforilasa.
La fosforilasa a cataliza la conversión de glucógeno a glucosa 1 fosfato, la que por la
fosfoglucomutasa se convierte en glucosa 6 fosfato que entra a la glucólisis. En los
músculos que contienen muchas fibras glucolíticas (como los pectorales), se produce ATP
principalmente por glucólisis, siendo lactato el producto principal.
A diferencia del ejercicio intenso, el ejercicio moderado puede sostenerse por
períodos largos. Un individuo entrenado, por ejemplo, puede correr durante muchas
horas. Los músculos de la pierna contienen gran cantidad de fibras de contracción lenta
(rojas) que son capaces de oxidar combustibles a CO2 y H2O, dado que contienen más
mitocondrias que los músculos compuestos predominantemente por fibras glicolíticas de
contracción rápida (blancas). Los músculos utilizados en ejercicios violentos y de corta
duración (carera de 100 m) tienen predominio de éstas últimas fibras. Cuando el flujo
sanguíneo del músculo en ejercicio aumenta, un proceso que requiere de 5 a 10 minutos,
aumenta la llegada de combustibles sanguíneos y de oxígeno al músculo. En estas
condiciones, el músculo puede captar combustibles, principalmente glucosa y ácidos
grasos y los oxida para obtener ATP.
Por lo tanto, en estas condiciones el aporte de glucosa de la sangre debe ser

restaurado. El hígado produce glucosa por degradación de sus depósitos de glucógeno y
por gluconeogénesis. La fuente principal de carbonos para la gluconeogénesis durante el
ejercicio es el lactato producido por el músculo en ejercicio, pero también se utilizan
aminoácidos y glicerol. La adrenalina liberada durante el ejercicio estimula la
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glucogenolisis y la gluconeogénesis hepáticas, a través de un aumento en los niveles de
AMPc. En estas condiciones, el músculo puede oxidar ácidos grasos y una pequeña
proporción de cuerpos cetónicos provenientes de la circulación, que se producen como
consecuencia de la lipólisis de los TAG del tejido adiposo. Durante el ejercicio prolongado,
los ácidos grasos son el combustible principal del músculo en ejercicio, lo que permite que
otros tejidos con dependencia absoluta por glucosa no se vean afectados. La utilización
de ácidos grasos en lugar de glucosa como combustible en el músculo esquelético
depende de diversos factores, como la disponibilidad de ácidos grasos en el torrente
sanguíneo, que a su vez depende de su liberación por el tejido adiposo por un proceso
regulado por la lipasa hormona-sensible. Durante un ejercicio prolongado, se observa una
pequeña disminución en los niveles de insulina, y un aumento de los niveles de glucagon,
catecolaminas, cortisol y posiblemente hormona de crecimiento que activan la lipólisis en
el adipocito. Asimismo, productos de la oxidación de los ácidos grasos inhiben la glucólisis
muscular, dado que la actividad de la piruvato deshidrogenada es inhibida por acetil-CoA,
NADH y ATP, que aumentan cuando se produce beta-oxidación. En estas condiciones, la
concentración de AMP baja, la de ATP sube y la actividad de la fosfofructoquinasa 1
(PFK-1) disminuye. El transporte de glucosa hacia el músculo esquelético está mediado
por el transportador GLUT4 que es activado por insulina o el ejercicio. La oxidación de los
cuerpos cetónicos también aumenta durante el ejercicio. Su utilización como combustible
depende de su velocidad de producción hepática. Sin embargo, los cuerpos cetónicos
nunca son el principal combustible para el músculo (el músculo siempre “prefiere” ácidos
grasos libres). Además, para la degradación de ácidos grasos como combustible, la acetil-
CoA carboxilasa debe estar inactivada, es decir deben ser bajos los niveles de malonil-
CoA que inhiben la entrada de los acil-CoA a la mitocondria. Este proceso ocurre porque
se activa la AMP-PK que catalizar (e inactiva) a la acetil-CoA carboxilasa.
El control metabólico es específico de cada órgano

Los mecanismos de integración metabólica pueden diferir en los diferentes tejidos.
Si bien todas las células del organismo están equipadas con la misma información
genética, los diferentes tipos celulares expresan o suprimen diferentes genes, en forma
específica. Por lo tanto, los tejidos difieren en su expresión enzimática, en su respuesta a
hormonas y en el transporte de diversas sustancias.
Hígado
El hígado esta “estratégicamente” ubicado entre la circulación general y el tracto
digestivo. Como ya se mencionó, una de las funciones centrales del hígado es mantener
la glucemia dentro de límites estrictos. Sin embargo, en el hígado se produce también un
sinnúmero de reacciones que permiten monitorear, reciclar, modificar y distribuir todos los
metabolitos absorbidos en el tracto digestivo. El hígado recibe todos los nutrientes que
entran a la sangre proveniente del tracto digestivo por la circulación enterohepática a
través del sistema porta. Esto le permite cumplir con algunas de sus funciones específicas
(como por ejemplo la síntesis de las proteínas de la coagulación) y metabolizar y eliminar
compuestos tóxicos ingeridos (por ej. alcohol) o productos metabólicos tóxicos (como el
amoníaco). Además del aporte sanguíneo de la vena porta, el hígado recibe a través de la
arteria hepática, sangre rica en oxígeno y en metabolitos provenientes de tejidos
periféricos, que fueron secretados a la circulación (por ej. glucosa, aminoácidos, ciertas
proteínas complejo hierro-transferrina, LDL remanentes, quilomicrones remanentes y
también metabolitos de desecho producidos en el metabolismo de distintos tejidos). Por
otro lado, el hígado cumple una importante función secretora de moléculas sintetizadas
localmente (por ej. VLDL y proteínas séricas). La secreción de VLDL no sólo distribuye el
exceso de calorías hacia el tejido adiposo para su almacenamiento, sino también
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fosfolípidos y colesterol hacia otros tejidos. Además, el hígado puede convertir
aminoácidos en glucosa, ácidos grasos y cuerpos cetónicos.
Músculo esquelético
El músculo esquelético representa casi la mitad del peso corporal. A pesar de usar
una gran parte de la glucosa que consumimos diariamente, el músculo no realiza
gluconeogénesis, no puede desfosforilar a la glucosa 6-P y por lo tanto no puede generar
glucosa libre y contribuir al mantenimiento de la glucemia. El músculo carece de
receptores para glucagon y, por lo tanto, no responde a las variaciones en los niveles
sanguíneos de esta hormona. Las grandes reservas de glucógeno muscular no pueden
ser movilizadas para mantener la glucemia, pero son importantes para el metabolismo
energético local, a través de la activación del sistema adrenérgico. Si se realiza
metabolismo anaeróbico, se incrementa la formación de lactato que puede ser
transportado a otros tejidos. El corazón usa grandes cantidades de lactato producido por
otros tejidos. A diferencia del hígado, el músculo esquelético carece de actividad de ácido
grasa sintetasa y por lo tanto no puede sintetizar ácidos grasos ni triglicéridos. Sin
embargo, el paso inicial en la síntesis de ácidos grasos (la síntesis de malonil-CoA) está
activo y sujeto al control de la AMP quinasa. Como ya mencionamos, el malonil-CoA
regula el transporte de ácidos grasos en la membrana mitocondrial interna y por lo tanto la
velocidad de oxidación de ácidos grasos en el músculo esquelético.
Corazón
El metabolismo del músculo cardíaco difiere del metabolismo del músculo
esquelético en diferentes aspectos. El metabolismo cardíaco en condiciones normales es
completamente aeróbico, mientras que el músculo esquelético puede funcionar
anaeróbicamente por períodos cortos. El corazón no contiene reservas apreciables de
combustibles metabólicos, ya sea glucógeno o lípidos, aunque contiene una pequeña
cantidad de fosfocreatina. Por lo tanto, el aporte de oxígeno y nutrientes debe ser
continuo. El corazón puede utilizar ácidos grasos, cuerpos cetónicos, glucosa y lactato.
Luego de una ingesta, predomina la utilización de lactato y glucosa, pero en el ayuno o
durante el ejercicio predomina la de ácidos grasos. Recién en condiciones extremas,
como carreras de 100 m o cuando la irrigación disminuye (como en la ateroesclerosis o
infarto de miocardio) puede realizar glucólisis anaeróbica.
Cerebro
El cerebro debe generar grandes cantidades de ATP para mantener el potencial de
membrana, lo que resulta esencial para la transmisión de los impulsos nerviosos. En
condiciones normales, el cerebro sólo usa glucosa como combustible, oxidándola a través
de la glucólisis aeróbica. No utiliza ácidos grasos, pues éstos no atraviesan la barrera
hematoencefálica. De hecho, el 60% del total de glucosa consumida por el organismo es
utilizado por el cerebro. El metabolismo del cerebro es totalmente aeróbico, consume el
20% del total del oxígeno consumido por el organismo. No posee reservas apreciables de
glucógeno u otros combustibles, por lo que requiere del aporte constante de oxígeno y
glucosa que atraviesan la barrera hematoencefálica con facilidad. Después de 5-10 días
de ayuno, el cerebro comienza a utilizar cuerpos cetónicos además de glucosa,
reduciendo notoriamente el consumo de glucosa.
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¿Por qué los cuerpos cetónicos reemplazan sólo parcialmente los requerimientos
de glucosa del cerebro? Las células gliales se alinean con los vasos sanguíneos que
irrigan el cerebro y forman una barrera que los ácidos grasos no pueden cruzar. Las
células gliales captan glucosa y la metabolizan por glucólisis anaeróbica a lactato, que es
exportado hacia las regiones más internas del cerebro. Allí, el lactato sirve como sustrato
para el metabolismo aeróbico. Por lo tanto, las células de la glía parecen ser parcialmente
dependientes del metabolismo anaeróbico y los cuerpos cetónicos no son sustratos de
esta vía metabólica. Esto bien puede explicar la dependencia del SNC por glucosa,
además de los cuerpos cetónicos, aun en estado de inanición.
Tejido adiposo
La función principal del tejido adiposo es almacenar combustibles lipídicos en forma
de TAG. Como ya se ha descripto, el transporte de glucosa a los adipocitos es un
mecanismo que depende de insulina. Los ácidos grasos se sintetizan a partir del acetil-
CoA que proviene del piruvato y de NADPH (procedente de la vía de las pentosas). El
glicerol 3 fosfato necesario para la síntesis de TAG proviene de la reducción de un
intermediario de la glucólisis, la dihidroxiacetona fosfato, ya que los adipocitos carecen de
la capacidad de fosforilar al glicerol, por no expresar la enzima glicerol quinasa. Por lo
tanto, la síntesis de TAG depende absolutamente de glucosa. La glucosa funciona como
sensor del metabolismo del tejido, cuando sus niveles son adecuados, se produce
glicerol-3-fosfato para la síntesis de TAG y cuando los niveles son bajos, los ácidos
grasos sintetizados se liberan de los adipocitos y son utilizados por otros tejidos.
Eritrocitos
El eritrocito es una célula especializada en el transporte de oxígeno, dióxido de
carbono y protones. La falta de mitocondrias le impide un metabolismo aeróbico,
reduciendo sus posibilidades de obtención de energía a la glucólisis anaeróbica con
formación de lactato, que pasa a sangre y puede utilizarse como combustible por tejidos
como el corazón o como precursor gluconeogenético por el hígado. La reducción del
piruvato a lactato es fundamental para reoxidar el NADH y permitir que la glucólisis siga
ocurriendo. Los requerimientos energéticos del eritrocito se basan en el mantenimiento de
su forma bicóncava (que asegura un transporte adecuado de gases e impide la remoción
por las células del sistema retículo endotelial) y de su ambiente iónico interno. Además de
la glucólisis anaeróbica, el eritrocito utiliza la glucosa para obtener NADPH por la vía de
las pentosas. El NADPH se utiliza para evitar la oxidación del hierro de la hemoglobina,
que en esa forma no podría transportar el oxígeno. Además, el NADPH es necesario para
mantener elevados los niveles de glutatión reducido que se emplea como defensa contra
los radicales libres del oxígeno. Finalmente, la glucosa también es utilizada en el glóbulo
rojo en una derivación de la vía glucolítica para sintetizar 2,3-difosfoglicerato (2,3 DPG) a
partir de 1,3-difosfoglicerato, cuya función es disminuir la afinidad de la hemoglobina por
el oxígeno, permitiendo una mayor liberación de oxígeno en los tejidos.
REGULACIÓN HORMONAL DE LA UTILIZACIÓN DEL COMBUSTIBLE

METABÓLICO
Las principales hormonas que intervienen en la regulación de la glucemia son la
insulina, el glucagon y las catecolaminas. También son importantes los glucocorticoides y
la hormona de crecimiento.
La concentración de glucosa en sangre es el estímulo primario para la secreción de
insulina y glucagon. La hipoglucemia estimula la secreción de glucagon que favorece la
degradación del glucógeno hepático (pero no del muscular). Una hipoglucemia severa
21
induce la secreción de adrenalina de la médula adrenal que estimula la degradación de
glucógeno muscular. El glucagon y la adrenalina promueven además la lipólisis en el
tejido adiposo, aumentando la concentración sanguínea de ácidos grasos y aportando
sustrato para la cetogénesis hepática.
Por el contrario, la hiperglucemia induce un aumento en la secreción de insulina. Al
igual que los hepatocitos, las células  expresan el transportador de glucosa de baja
afinidad GLUT2 y la enzima glucoquinasa de baja afinidad por la glucosa. Por ese motivo,
sólo en presencia de altas concentraciones de glucosa en sangre se produce captación y
fosforilación de glucosa en estas células. La subsecuente metabolización de la glucosa-6-
fosfato parece ser el evento que desencadena la liberación de insulina.
Un balance adecuado de estas dos hormonas antagónicas permite una adecuada
homeostasis de la glucemia, efecto que puede perderse en condiciones de deficiencia de
insulina (como la diabetes), quemaduras graves y shock hemorrágico. Además, la
concentración sanguínea de glucagon se reduce por la somatostatina, hormona que
también inhibe la secreción de somatotrofina (hormona de crecimiento).
Insulina
En términos generales la insulina promueve:
1) la captación de sustratos por determinadas células
2) el almacenamiento de combustibles como glucógeno y lípidos
3) la biosíntesis de macromoléculas como ácidos nucleicos y proteínas.
Más en detalle, la insulina produce:
- Aumento de la permeabilidad a la glucosa en músculo y tejido adiposo,
por exposición del transportador GLUT4 en las membranas plasmáticas.
- Activación de la glucólisis y de la vía de las pentosas en el hígado y
tejido adiposo por inducción de las enzimas clave (fosfofructoquinasa y glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa, respectivamente), lo que permite la generación de energía y de
precursores para la síntesis de AG (NADPH y acetil-CoA) y de TAG (glicerol-3-fosfato,
proveniente de la reducción de la dihidroxiacetona fosfato).
- Activación de la síntesis de ácidos grasos y triacilglicéridos en hígado
y tejido adiposo, al aumentar el aporte de precursores y por inducción de la enzima
acetil-CoA carboxilasa. De esta manera se favorece la formación de la lipoproteína VLDL
en el hígado, que por sangre llega a los tejidos periféricos donde es sustrato de la
lipoproteín-lipasa, enzima cuya síntesis también se induce por insulina.
- Inhibición de la gluconeogénesis en hígado al disminuir las actividades
de fructosa- 1,6difosfatasa y de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa. Este efecto se debe en
parte al aumento de los niveles de fructosa-2,6-difosfato.
- Aumento de la síntesis e inhibición de la degradación de glucógeno en
hígado y músculo. A nivel hepático, se ha descripto recientemente una proteína quinasa
B, que se activa por fosforilación desencadenada por insulina. La proteína quinasa B
fosforila a una enzima denominada glucógeno sintasa quinasa (GSK), inactivándola. De
esta forma, no fosforila a la glucógeno sintasa y ésta se mantiene activa, con la
consecuente síntesis de glucógeno. Tanto en el hígado como en el músculo, la activación
de fosfodiesterasas disminuye los niveles de AMPc inactivándose por lo tanto la proteína
quinasa A. Además, la insulina activa fosfatasas con lo cual disminuye el grado de
fosforilación de la fosforilasa quinasa y de la glucógeno fosforilasa inactivando ambas
enzimas. En consecuencia disminuye la glucogenólisis. La desfosforilación de enzimas
también contribuye a mantener la glucógeno sintasa en estado activo.
- Efecto antilipolítico debido a la disminución en los niveles de AMPc
intracelular por activación de fosfodiesterasas. También contribuye la activación de
fosfatasas. En consecuencia, se inactiva la lipasa hormono sensible y se reduce la
hidrólisis de TAG en tejido adiposo.
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- Aumento de la captación de aminoácidos en músculo, con incremento
de la síntesis de proteína muscular.
Glucagon
El principal órgano blanco del glucagon es el hígado, donde interactúa con
receptores específicos acoplados a la adenilato ciclasa. Su mecanismo de acción
involucra el incremento en los niveles de AMPc. Consecuentemente se activan la
glucogenólisis (glucógeno fosforilasa fosforilada y, por lo tanto, activa) y se inhibe la
glucogenogénesis (glucógeno sintetasa fosforilada y por lo tanto, inactiva). Además, por
fosforilación de la FFQ2 disminuye su actividad de quinasa y aumenta su actividad de
fosfatasa, con lo que se hidroliza la fructosa-2,6-difosfato, se inhibe la glucólisis y se
activa la gluconeogénesis. El glucagon también inhibe a la piruvato quinasa hepática
causando una acumulación de PEP y una disminución en los niveles de piruvato. La
acumulación de PEP promueve la gluconeogénesis, mientras que la inhibición de la
piruvato quinasa disminuye la actividad de la vía glucolítica.
Varias enzimas se inducen cuando los niveles de glucagon son elevados,
fundamentalmente las que catalizan los pasos claves de la gluconeogénesis, la glucosa-6-
fosfatasa, la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa y la fructosa-1,6-difosfatasa.
El glucagon también aumenta los niveles de AMPc en el tejido adiposo, donde
promueve la movilización de los depósitos de TAG por activación de la lipólisis (activa la
lipasa hormono sensible). Asimismo, al aumentar el nivel de ácidos grasos libres y su
captación por el hígado, los acil-CoA inhiben alostéricamente la acetil-CoA carboxilasa,
que también se inhibe por fosforilación inducida por glucagon. Como resultado, la síntesis
de ácidos grasos en el hígado se inhibe.
Catecolaminas
Las catecolaminas, adrenalina y noradrenalina, funcionan como hormonas al
liberarse a la sangre por la médula adrenal. La hipoglucemia es uno de los estímulos para
la liberación de estas hormonas. En el músculo, sus receptores están acoplados a la
adenilato ciclasa y se produce un incremento en los niveles de AMPc activando la
glucogenólisis. En consecuencia, la captación de glucosa por el músculo disminuye y la
glucemia aumenta. La adrenalina también inhibe la secreción de insulina y estimula la de
glucagon. Este efecto aumenta la producción y liberación de glucosa por el hígado con
incremento en la glucemia. Al igual que el glucagon, la adrenalina estimula la lipólisis (a
través de la proteína quinasa A).
Glucocorticoides
Los glucocorticoides tienen acciones diversas que afectan la mayoría de los tejidos
del organismo, algunos de estos efectos parecerían ser contradictorios, pero si se los
analiza en conjunto, se puede ver que promueven la sobrevida en situaciones de estrés.
Son moduladores lentos del metabolismo de los combustibles circulantes. Sus efectos se
relacionan con la regulación de la expresión de enzimas clave de varias vías metabólicas.
Inducen la expresión de las enzimas de la gluconeogénesis: piruvato carboxilasa,
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, fructosa-1,6-difosfatasa y glucosa-6-fosfatasa.
Asimismo, por sus efectos catabólicos sobre las proteínas tisulares en condiciones de
estrés, aportan sustratos para la gluconeogénesis. Además, facilitan la lipólisis inducida
por otros agentes como glucagon y catecolaminas.
Hormona de crecimiento
Ejerce un efecto hiperglucemiante y lipolítico, es decir, opuesto al de la insulina. En
ese sentido, disminuye la utilización periférica de glucosa y estimula su producción
hepática por gluconeogénesis. Se ha demostrado también que la hormona de crecimiento
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acentúa la movilización de grasas de los depósitos, incrementando los niveles de glicerol
y ácidos grasos libres en plasma.
24
CICLO ATP-ADP
INTEGRACIÓN del
METABOLISMO ENERGÉTICO
PANCREAS HÍGADO
Hígado Músculo • CONTROL DE LA GLUCEMIA – reservas de glucógeno,
INSULINA/ gluconeogénesis
GLUCAGON
•Almacena glucógeno
Homeostasis • Recibe todos los nutrientes del tracto digestivo

Metabólica
• Recibe compuestos del resto de los tejidos: uso o
eliminación
• Responde a insulina y glucagon
•Secreta proteínas y lipoproteínas circulantes

Adiposo
Tracto GI SNC
Balance entre necesidades y disponibilidades
MÚSCULO ESQUELÉTICO CORAZÓN
• Representa casi la mitad del peso corporal
• En condiciones normales: metabolismo aeróbico
• No contribuye al control de la glucemia
• No contiene reservas apreciables de glucógeno o lípidos,
• Las reservas de glucógeno se utilizan localmente pero sí pequeñas cantidades de fosfocreatina
• No expresa receptores para glucagon, pero sí para • Puede utilizar ácidos grasos, cuerpos cetónicos, glucosa y
adrenalina (receptores beta-adrenérgicos) lactato
• Puede utilizar ácidos grasos, cuerpos cetónicos y glucosa • En post-ingesta utiliza glucosa y lactato, y en ayuno o
ejercicio utiliza ácidos grasos
• Metabolismo aeróbico o anaeróbico: lactato ( hígado)
• En condiciones extremas puede realizar glucólisis
• No puede sintetizar glucosa ni ácidos grasos (pero anaeróbica
expresa acetil-CoA carboxilasa, regulada por la AMPK)
CEREBRO TEJIDO ADIPOSO
• Alta demanda de ATP • Almacena TAG
• No utiliza ácidos grasos (BHE) • La entrada de glucosa depende de insulina
• En condiciones normales sólo usa glucosa en condiciones • El glicerol-3-P para la síntesis de TAG proviene de la
aeróbicas glucólisis (DHAP)
• Luego de un ayuno prolongado, además de glucosa, puede • En post-ingesta acumula TAG (insulina)
utilizar cuerpos cetónicos
• En ayuno degrada TAG (glucagon, adrenalina)
ERITROCITOS Mecanismos de regulación de la
velocidad de las vías metabólicas
• Utilizan exclusivamente glucosa en anaerobiosis: la 1. Disponibilidad de sustrato
lactato deshidrogenasa permite reoxidar el NADH y 2. Compartimentación celular
produce lactato
3. Regulación alostérica
• La vía de las pentosas permite obtener NADPH (evitar
la oxidación del Fe de la Hemoglobina y mantener el
4. Modificación covalente
glutation en estado reducido) 5. Inducción y represión enzimáticas
• La glucosa se utiliza también para la síntesis de Otros mecanismos de regulación

2,3 difosfoglicerato a partir de 1,3 difosfoglicerato Casos particulares: zimógenos
Especialización celular
Mecanismos múltiples
REGULACIÓN DEL METABOLISMO

Consumo normal carbohidratos 200 g
CICLOS DE INGESTA/AYUNO
promedio diario lípidos 70 g
proteínas 60 g
(otros)
Requerimientos 1600-2400 kcal/día
Reservas
Combustible Tejido gramos kilocalorías / %
Almacenado
Glucógeno Hígado 70 – 200 280 / 0,2
Glucógeno Músculo 120 480 / 0,4
Glucosa Fluidos Corporales 20 80 / 0,05
Lípidos TAG Adiposo 15000 135000 / 85
Proteínas Músculo 6000 24000 / 14-15
CONSECUENCIAS DE LAS VARIACIONES DE LA GLUCEMIA PANCREAS
Hígado Músculo
INSULINA/
GLUCAGON
(Glucagon =
glucose is gone)
Homeostasis
Metabólica
Adiposo
Tracto GI SNC
3 formas de integración entre tejidos
CONTRARREGULACIÓN DE INSULINA REGULACIÓN DEL METABOLISMO

, exercise, stress DIETA RICA EN HIDRATOS DE CARBONO
Glucose
0 1 2 3
REGULACIÓN DEL METABOLISMO POST-INGESTA
CICLOS DE INGESTA/AYUNO SECRECIÓN DE INSULINA
Glucosa
Transportador de glucosa
DIETA RICA EN PROTEÍNAS Umbral GLUT2 Espacio extracelular
80 mg%
Célula β pancreática
Glucosa
hexoquinasa IV
(glucoquinasa)
Glucosa-6-fosfato
Glucólisis Núcleo
Ciclo de Krebs
Glucose (mg%)
Fosforilación
oxidativa
Sulfonilureas
(glibenclamida) -
Canal de K+ Fusión y
Hipoglucemiante oral Gránulos de
dependiente de ATP exocitosis
insulina
Secreción
de insulina
Canal de Ca2+
despolarización dependiente de voltaje
Insulina - procesamiento
RER
proteólisis
proteólisis
Golgi
heterodímero
POST-INGESTA
(150 g/día)
(h/200-300 g)
(sín límite)
METABOLISMO DE LÍPIDOS E HIDRATOS DE CARBONO CAPTACIÓN DE GLUCOSA

EN EL HÍGADO – POST INGESTA MÚSCULO Y TEJIDO ADIPOSO POST-INGESTA
Insulina
Membrana plasmática
Receptor de insulina Transportador

de glucosa
El influjo de glucosa en el
músculo esquelético y en
el tejido adiposo
(transportadores GLUT4)
aumenta hasta 15 veces !!!
¿CÓMO SE METABOLIZAN LOS AMINOÁCIDOS DE LA DIETA?
TRANSPORTADORES DE GLUCOSA
urea
¿CÓMO INCORPORAMOS LOS LÍPIDOS DE LA DIETA? REGULACIÓN DEL METABOLISMO

Hígado
REGULACIÓN DEL METABOLISMO REGULACIÓN DEL METABOLISMO
AYUNO AYUNO
Ingesta
12 hs 5 semanas
Glucosa: -20% Glucosa: -40%
Acetoacetato: constante Acetoacetato: x 30
Ácidos grasos: x 4 Ácidos grasos: x 10
β-hidroxibutirato : x 3 β-hidroxibutirato : x 200
Mecanismo de acción de glucagon

GLUCAGON
glucagon
RECEPTOR

AC
AMPc
AMP PDE
AMPc ATP
R R Inhibición de
fosfatasas P
C C
PKA inactiva PKA activa
C C
R R
glucógeno
P-OH P-O-P fosforilasa ACTIVA
Variación de actividades
enzimáticas sintasa INACTIVA
Transcripción
TRADUCCION Variación del nivel
de expresión de enzimas
ESTADO POST - ABSORTIVO
POST - AYUNO NOCTURNO
(80 g)
post ayuno
12 hs)
Glicerol
ORÍGENES DE LA GLUCOSA EN EL AYUNO GLUCÓLISIS

A) Glucoquinasa
Glucosa ingerida
alto Km
inducible
Glucogenólisis
Gluconeogénesis
Horas Días
I II III IV V
Ingesta Ayuno Ayuno Ayuno Inanición
corto medio prolongado
ggeno gneo çc mm
3/5-10/12 d
Lactato
deshidrogenasa
Lactato Piruvato
Alanina
aminotransferasa
Alanina Piruvato
Glicerol quinasa Glicerol 3-fosfato

deshidrogenasa
Glicerol Glicerol-3-fosfato Dihidroxiacetona fosfato
METABOLISMO EN EL HEPATOCITO EN EL AYUNO

Ciclo de Cori – lactato glóbulo rojo
Metabolismo de los aminoácidos en el ayuno
Ciclo de la alanina – músculo
NO ocurre post-ingesta ni ayuno Ciclo de la urea
Mecanismo de acción de la adrenalina
Adrenalina
Receptor Beta Receptor Alfa
Activación de Activación de
Adenilil Ciclasa Fosfolipasa C
AMPc DAG y Calcio
Activación de PKA Activación de PKC
Hígado, músculo Hígado

Mecanismo de acción del cortisol
Inducción de enzimas
clave de la
gluconeogénesis
Catabolismo de
proteínas musculares
Acción lipolítica en tejido

adiposo
REGULACIÓN DEL METABOLISMO

AYUNO
Ingesta
urea
12 hs 5 semanas
Glucosa: -20% Glucosa: -40%
Acetoacetato: constante Acetoacetato: x 30
Ácidos grasos: x 4 Ácidos grasos: x 10
β-hidroxibutirato : x 3 β-hidroxibutirato : x 200
AYUNO (3-5 días de ayuno)
PANCREAS
Hígado Músculo
INSULINA/
GLUCAGON
(Glucagon =
glucose is gone)
Homeostasis
Metabólica
Adiposo
Tracto GI SNC
Quinasa activada por AMP

AMPK Glucólisis Transporte Oxidación de Síntesis de Síntesis de Síntesis de Síntesis de Síntesis de
Lipólisis
“Coordinación del metabolismo” (corazón) de glucosa ácidos grasos ácidos grasos colesterol Triglicéridos glucógeno proteínas
Dieta Estrés Ejercicio FFK2 GLUT 1

Acetil CoA LHS HMGR TGS eEFR2
carboxilasa GS
GLUT4 mTOR
AMP
AMPKK PPasa
AMPK AMPK
Transporte de glucosa beta-oxidación

PANCREAS HIGADO ADIPOSO CORAZON MUSCULO
Secreción insulina Síntesis de Síntesis de Oxidación de ácidos grasos ESQUELETICO
Síntesis de colesterol Acidos grasos y Ácidos grasos Captación de glucosa Oxidación de ácidos grasos
colesterol Captación de glucosa
Síntesis de ácidos grasos glucólisis
Transcripción
Creatina fosfoquinasa Apoptosis

adenilato quinasa FUENTES DE ENERGÍA EN EL EJERCICIO
2 ADP ATP + AMP La energía para la contracción muscular procede del ATP (ATP → ADP+Pi).
Este nucleótido es regenerado por distintos sistemas dependiendo de la
actividad o intensidad del trabajo muscular
Keq = [AMP]. [ATP]
• Sistema de la creatina fosfato
[ADP]2 • Glucólisis anaeróbica
• Oxidación de sustratos
Keq. [ADP]2
[AMP] =
[ATP]
ADP ATP AMP

Reposo 1,0 mM 5 mM 0,2 mM
Ejercicio 1,5 mM 4 mM 0,8 mM
FUENTES DE ENERGÍA EN EL EJERCICIO

FUENTES DE ENERGÍA EN EL EJERCICIO
Dependen de la intensidad del ejercicio
Combustible como % del consumo de O2

Glucógeno muscular
• Reposo: el músculo consume ATP que proviene
principalmente de ácidos grasos Ácidos grasos de la sangre
• Ejercicio: el músculo consume ATP que proviene de Glucosa de la sangre
o Creatina fosfato agotamiento

o Glucosa procedente del glucógeno muscular
o Glucosa procedente de la sangre Horas
o Ácidos grasos
Adrenalina
Impulso nervioso
AMPc
Retículo
sarcoplásmico
Ca2+ proteína quinasa A
ATP
contracción
muscular ADP Ca2+-calmodulina
AMP/ Fosforilasa
quinasa
P
AMPK
FFQ 1
glucógeno glucógeno
Glucólisis fosforilasa b fosforilasa a
activa
Glucogenolisis
Pi
FUENTES DE ENERGÍA EN EL EJERCICIO FUENTES DE ENERGÍA EN EL EJERCICIO

FUENTES DE ENERGÍA EN EL EJERCICIO Ciclo de la alanina – músculo
NO ocurre post-ingesta ni ayuno – Ciclo de la urea
Ocurre en ejercicio: adrenalina AMPK
SEMINARIO 19
Cuestionario de Integración Metabólica

1.- Responda los siguientes ítems con respecto a los mecanismos de regulación de una
vía metabólica.
a) La -oxidación y la biosíntesis de ácidos grasos ocurren en diferentes compartimentos

subcelulares. Discuta la importancia de este hecho desde el punto de vista regulatorio de
ambas vías.
b) ¿En qué consiste la modificación covalente de enzimas? Plantee tres ejemplos de
enzimas cuya regulación ocurre por este mecanismo.
c) La reacción catalizada por la enzima fosfofructoquinasa I es un punto clave en la
regulación de la glucólisis. Describa los tipos de regulación que experimenta la enzima
mencionada.
d) Explique el significado de la frase: “el glucagon promueve la inducción de la enzima
piruvato carboxilasa”. Describa la secuencia completa de eventos por el cual el glucagon
regula, por una acción genómica, la gluconeogénesis.
e) Explique con sus palabras, qué significa REPRESION ENZIMATICA.
2.- Considerando los siguientes ejemplos de regulación metabólica:
1) La oxidación de ácidos grasos en mitocondrias está disminuida cuando la biosíntesis

de ácidos grasos en el citosol es activa debido a la inhibición de carnitina-acil-transferasa I
por malonil-CoA.
2) La síntesis de HMG-CoA reductasa en varios tipos celulares es inhibida por
lipoproteínas de baja densidad.
3) La glucosa-6-fosfatasa está presente en el hígado y los riñones, pero no en el músculo.
4) La amidofosforibosiltransferasa, enzima limitante de la biosíntesis de purinas, es
inhibida por todos los nucleótidos de purina.
5) La enzima que cataliza la síntesis y degradación de fructosa-2,6-bifosfato es fosforilada
y desfosforilada en respuesta a una señal hormonal.
6) La insulina induce la expresión de la glucoquinasa.
7) La piruvato quinasa hepática se inactiva por fosforilación ante un aumento de glucagon.
8) Altas concentraciones de protones inhiben a la fosfofructoquinasa I.
Indique, colocando el número correspondiente, cuál de los ejemplos anteriores se aplica a

cada una de los siguientes modos de regulación metabólica:
(a) interacción alostérica ---------------------------------
(b) modificación covalente--------------------------------
(c) niveles enzimáticos -------------------------------------
(d) compartimentalización ---------------------------------
(e) especialización metabólica de órganos ----------------
3.- a) ¿Cómo es la regulación de la fosfofructoquinasa II en el hígado y en el músculo?

Describa la regulación de ambas enzimas.
b) Las catecolaminas y el glucagon inician la respuesta a una disminución de la glucemia.
Las catecolaminas estimulan la glucólisis en el músculo, mientras que el glucagon inhibe
la glucólisis en el hígado. Explique este hecho.
4.- ¿En cuál de los siguientes compuestos NO se convierte la glucosa-6-fosfato en el

tejido adiposo?
a) piruvato, b) glucosa, c) ribosa-5-fosfato
1
5.- ¿Qué destinos tiene la glucosa que llega al hígado? Indique todos,
independientemente de la ingesta. Señale las diferencias entre ayuno y saciedad.
6.- ¿Cómo se regula la gluconeogénesis durante el ayuno? ¿Cuáles son sus sustratos y
su fuente de energía? ¿a partir de qué sustrato gluconeogénico se requiere la menor
cantidad de energía para sintetizar glucosa? Compare el efecto regulador del glucagon y
del cortisol.
7.- Durante el ayuno se estimula la lipólisis. Describa el proceso, indicando el o los

estímulos que disparan el proceso y la forma de transporte sanguíneo y el destino final de
los productos.
8.– ¿A qué compuestos se denomina cuerpos cetónicos? ¿En qué condiciones

metabólicas/patológicas se forman? ¿Por qué? ¿En qué tejido se sintetizan? ¿Qué
destino tienen?
9.- a) ¿Cuál es el principal destino metabólico del piruvato en el hígado

i- durante un ayuno
ii- luego del consumo de una dieta abundante y equilibrada?
Escriba la primera reacción en la que el piruvato se transforma en i) y en ii) y mencione la
enzima correspondiente.
b) ¿Cuál es el destino del piruvato en el glóbulo rojo? Escriba la reacción y mencione la
enzima. ¿Qué consecuencia tiene para el glóbulo rojo la presencia de un compuesto que
inhiba irreversiblemente a esta enzima? Explique.
10.- Responda las siguientes preguntas con respecto al metabolismo en el cerebro.

a) ¿El cerebro utiliza ácidos grasos como fuente de energía en el estado de ayuno?
Justifique
b) ¿Qué combustibles metabólicos puede usar durante períodos de inanición?
11.- ¿En qué situaciones la concentración de lactato en sangre aumenta? ¿Qué problema
puede acarrear una concentración elevada de lactato en sangre? ¿Qué tejido(s) sintetizan
y cuáles consumen lactato? ¿Qué destino puede tener el lactato?
12.- La síntesis de triacilglicéridos por los adipocitos no puede proceder sin el aporte
externo de glucosa. Justifique.
¿Qué diferencia existe entre la síntesis de triacilglicéridos en el tejido adiposo y en el
hígado?
13.- ¿Qué sucede con el metabolismo del tejido adiposo en el ayuno prolongado?
14.- Marque con la letra E los siguientes procesos metabólicos que son estimulados por
insulina y con la letra I aquellos procesos que son inhibidos por la hormona.
a) Gluconeogénesis en hígado………
b) Entrada de glucosa al músculo y tejido adiposo……
c) Glucólisis en el hígado…
d) Degradación proteica intracelular…………
e) Síntesis de glucógeno en el hígado y el músculo….
f) Captación de aminoácidos ramificados en el músculo…………
g) Síntesis de triacilglicéridos en el tejido adiposo……………
2
15.- ¿Cuál de las siguientes afirmaciones es incorrecta en relación a la utilización de
combustible metabólico después de 3 días de ayuno?
a) más glucosa es consumida por el cerebro.
b) los triacilglicéridos del tejido adiposo son degradados para proveer ácidos grasos a la
mayoría de los tejidos.
c) es posible detectar consumo de cuerpos cetónicos como combustible en el cerebro.
d) las proteínas son degradadas para proveer precursores de 3 carbonos para la síntesis
de glucosa.
16.- Ordene los siguientes caminos metabólicos o fuentes de energía en orden

decreciente de velocidad de producción de ATP durante un ejercicio vigoroso.
a) glucógeno muscular a CO2
b) glucógeno hepático a CO2
c) glucógeno muscular a lactato
d) ácidos grasos del tejido adiposo a CO2
e) creatina fosfato muscular
17.- Dadas las fuentes de energía de la pregunta anterior, ordénelas en orden decreciente
de la producción total potencialmente disponible de ATP
(a) Una carrera de 100 metros
(b) Una carrera de 1000 metros
(c) Una maratón
18.- Las concentraciones en sangre de diferentes metabolitos varían drásticamente a lo

largo de un período de ayuno.
a) En el caso de los ácidos grasos se observa que:
i) Después de una comida, la concentración es 0,14 mM
ii) A las 12 hs de ayuno: 0,6 mM
iii) A los 3 días de ayuno: 1,2 mM
Explique qué ocurre metabólicamente para que se produzcan cada una de estas
situaciones.
b) ¿Ud. espera que la concentración de piruvato en sangre experimente las mismas
variaciones? Justifique.
19.- Enumere los efectos de la insulina en el tejido adiposo e indique el mecanismo

involucrado en cada caso.
20.- a) En el hígado la insulina promueve la síntesis de ácidos grasos. Indique qué

enzimas o procesos son activados por la insulina para provocar este efecto.
b) ¿La insulina afecta mayormente la captación de glucosa por el hígado? Justifique.
21.- ¿Qué efectos metabólicos produce la adrenalina en a) el músculo y en b) el tejido

adiposo? Indique las enzimas involucradas en esta regulación y el mecanismo regulatorio
correspondiente
22.- El citrato funciona como un importante regulador del metabolismo. Al respecto

indique:
a) ¿qué enzima del metabolismo de hidratos de carbono es regulada por citrato? ¿Qué
efecto produce sobre la actividad de la misma?
b) ¿Que otra vía metabólica es regulada por citrato? ¿Sobre qué enzima actúa y que
efecto produce sobre la actividad de la misma? ¿En qué compartimento subcelular ocurre
esta regulación? ¿En qué condiciones energéticas el citrato alcanza este compartimento?
3
23.- Indique la característica distintiva de la diabetes. Explique la causa bioquímica de

esta característica. ¿Cómo se diagnostica la diabetes? Una vez diagnosticado ¿qué
estudios de laboratorio puede indicarle al paciente para su control?
24.- Un paciente diabético tipo I no tratado puede entrar en coma por descenso del pH
sanguíneo y deshidratación. Explique por qué la falta de insulina promueve estos dos
efectos.
25.- Explique, a nivel bioquímico, cómo se altera la regulación de la gluconeogénesis y la

glucólisis en la diabetes tipo I y las consecuencias de esta alteración sobre el estado del
paciente.
4
SEMINARIO 20
Radioinmunoensayo
TÉCNICAS DE RADIOCOMPETICIÓN PROTEICA
Nociones de Radioactividad
Recordemos que los átomos están formados por un núcleo, que contiene protones,
neutrones y la energía de interacción nuclear y por una zona extranuclear donde se
mueven los electrones por caminos energéticos definidos llamados órbitas. La
radioactividad es un fenómeno nuclear, por el cual un núcleo inestable se desintegra,
perdiendo partículas o energía de excitación para formar una especie nuclear más
estable.
Los átomos poseen en su núcleo protones y neutrones. Se pueden definir el
número atómico Z (es el número de protones) y el número másico A (número de protones
y neutrones) de un elemento. La identidad del átomo viene dada por su número atómico Z
(un elemento de Z = 6 siempre va a ser C, no importa el número de neutrones). Sin
embargo, podemos encontrar en la naturaleza un elemento con más de un número
másico, en este caso se los denomina isótopos (podemos encontrar C con 6, 7 u 8
neutrones, pero siguen siendo C porque su Z = 6. Muchos de los isótopos de los
elementos representados en la tabla periódica de Mendeleiev son inestables en su
núcleo, ya sea por exceso de masa, neutrones, protones o energía. Para ganar
estabilidad deben perder ese exceso emitiendo partículas o fotones (desintegración), en
otras palabras, estos isotopos son radioactivos. En la técnica de Radioinmunoanálisis
(RIA), los se utilizan elementos radioactivos, los más frecuentemente utilizados para
“marcar” los antígenos (Ag) son 125I y 3H (tritio).
El 125I posee un exceso de energía y para ganar estabilidad desintegra emitiendo
fotones  (energía). Como los fotones no poseen masa, su interacción con la materia es
baja, por lo que pueden recorrer grandes distancias antes de colisionar con moléculas del
medio circundante (tienen alta penetrancia). El número de desintegraciones que el 125I
emite en la unidad de tiempo puede medirse en un contador de centelleo sólido. El
funcionamiento de este instrumento se basa en la interacción que se produce entre los
fotones  emitidos y un cristal de NaI (figura).
Figura: Contador de Centelleo Sólido
El 125I se utiliza para marcar moléculas proteicas. La mayoría de las proteínas

posee en su estructura residuos de tirosina, y son precisamente los anillos aromáticos los
que se iodinan (así como ocurre con la tiroglobulina en la glándula tiroidea). Las
hormonas esteroideas no pueden ser marcadas con 125I por lo que se debe recurrir a otro
elemento radioactivo mucho más pequeño, el tritio 3H.
El 3H posee un exceso de neutrones en su núcleo y para ganar estabilidad emite
una partícula cargada llamada β-. Esta partícula posee cierta masa y rápidamente
interacciona con la materia, por lo que su penetrancia es baja. El número de
desintegraciones que el 3H emite en la unidad de tiempo no podría medirse en un
contador de centelleo sólido debido a su baja penetrancia (la partícula β- colisionaría
primero con el tubo o con el aire antes de interaccionar con el cristal), es por eso que se
1
utiliza un contador de centelleo líquido. La muestra que se desea medir debe mezclarse
con líquido centellante (que posee 3H y amplifica la señal). El número de colisiones entre
la partícula β- y las moléculas del líquido centellante se miden en el contador de centelleo
líquido.
Tanto en el contador de centelleo sólido como líquido, la eficiencia de medición no

es del 100% (algunas colisiones no son contadas), por lo que se mide son las cuentas por
minuto (cpm) (colisiones que se producen efectivamente) y no las desintegraciones por
minuto (dpm) (emisiones que ocurren realmente).
Introducción a la radiocompetición proteica

La sangre y otros fluidos biológicos son mezclas químicas complejas. La
determinación en sangre de sustancias tales como glucosa, urea, lípidos, etc., que están
presentes en concentraciones del orden de los mg% se puede llevar a cabo mediante
ensayos de laboratorio convencionales, de baja sensibilidad.
En cambio, existe un gran número de sustancias como hormonas proteicas y
esteroides, vitaminas, etc., que también son de gran importancia clínica y que se hallan en
muy bajas concentraciones, del orden de los nanogramos/ml (ng/ml) o picogramos/ml
(pg/ml).
1 ng = 1 x 10-9 g 1 pg = 1 x 10-12 g
Para poder cuantificar estas sustancias se requiere un método de alta sensibilidad

y especificidad, como las técnicas de radiocompetición proteica. La sensibilidad es la
capacidad de detectar un compuesto que se encuentra en muy bajas concentraciones. La
especificidad es la capacidad de reconocer únicamente a una sustancia dada en una
mezcla compleja.
En el método de radiocompetición proteica, la sustancia que se quiere valorar en el

suero del paciente es enfrentada en un tubo de ensayo con una proteína ligadora. La
proteína ligadora debe cumplir con dos requisitos: que tenga afinidad y saturabilidad
frente a la sustancia que se desea dosar (afinidad es la tendencia que presenta la
sustancia ligadora de unirse al ligando, mientras que saturabilidad es la propiedad de la
sustancia ligadora de unir una cantidad máxima fija de ligando).
Las proteínas ligadoras empleadas en este tipo de ensayo pueden ser:
- Proteínas plasmáticas: algunos ejemplos de este tipo son, la transcortina sérica
que es empleada para determinar glucocorticoides en fluidos biológicos y la proteína
ligadora de esteroides sexuales que se emplea para la determinación de estradiol y
testosterona en suero.
- Receptores celulares: en este caso el método recibe el nombre de
radiorreceptor. Un ejemplo es el receptor estrogénico uterino que se emplea en la
2
determinación de estradiol en suero.
- Anticuerpos (Ac): en este caso el método recibe el nombre de
radioinmunoanálisis (RIA). A continuación, se explican fundamento y técnica de este
método.
RADIOINMUNOANÁLISIS
En el radioinmunoanálisis, la proteína ligadora es un anticuerpo (Ac) y la sustancia
que se quiere valorar en el suero del paciente es considerada el antígeno (Ag)
Al enfrentar en un tubo el Ag con el Ac, ocurre la siguiente reacción y se establece
el equilibrio:
Ac + Ag Ag-Ac
Pero qué pasaría si al tubo de ensayo le agregáramos una cantidad conocida de
la sustancia a dosar, o sea el Ag, pero marcada radioactivamente (Ag*, también llamada
trazador). Las características inmunoquímicas del Ag* deben permanecer idénticas a las
del Ag sin marcar, en otras palabras, la presencia del átomo radiactivo en la molécula no
debe distorsionar ningún epitope.
De esta forma, el Ag y el trazador competirán por su unión al Ac que no podrá
distinguir entre ellos. Por lo tanto, existirán dos equilibrios simultáneos:
Resumiendo: dentro del tubo de ensayo, en un medio de pH y temperatura

adecuados, se establece una competencia entre las moléculas marcadas y las no
marcadas del Ag para unirse al Ac. Dado que el Ac (proteína ligadora) debe agregarse en
cantidades limitantes, luego de un tiempo de incubación adecuado se llegará a un estado
de equilibrio en el que parte del Ag se unió al Ac para formar el complejo Ag-Ac y otra
parte del Ag quedó libre en el medio de reacción. Lo mismo sucede con Ag*.
Cuando se alcance el equilibrio en el tubo de ensayo habrá:
- complejos Ag-Ac
- moléculas de Ag libres
- complejos Ag*-Ac
- moléculas de Ag* libres
La interacción de estas moléculas está regida por la Ley de Acción de Masas: la

unión del Ag o Ag* con el Ac se realiza mediante sitios reactivos específicos y las
reacciones se desplazarán de acuerdo con la concentración de estas especies. Así,
cuanto mayor sea la concentración de Ag, mayor será la cantidad del complejo Ag- Ac
formado y, por lo tanto, mayor será la cantidad de Ag* desplazada.
Nos resta poder separar dichas fracciones (unida y libre) por algún método, luego
podemos medir la radioactividad presente en cada una de estas fracciones, de manera tal
de poder cuantificar la proporción de trazador que se encuentra en cada una de las
3
fracciones. Cuanto mayor haya sido la cantidad de Ag presente en la muestra original,
mayor será la cantidad de complejos Ag-Ac y menor la de complejos Ag*-Ac formados, y
mayor será la cantidad de Ag* libre.
La separación de ambas fracciones puede efectuarse por alguno de los siguientes
métodos:
- precipitación con segundo anticuerpo: los complejos formados se precipitan
con un segundo anticuerpo dirigido contra el anticuerpo utilizado en el ensayo. Este
método se usa principalmente cuando el Ag es una hormona proteica, ya que se forman
complejos proteicos de alto peso molecular que precipitan fácilmente.
- adsorción de la fracción libre: se emplean materiales de alto poder adsorbente
como el carbón activado con o sin agregado de dextrano, talco, florisil, etc., que retienen,
por el fenómeno físico de adsorción, las moléculas de bajo peso molecular. Al centrifugar
el carbón activado con las partículas adsorbidas se encuentran en el precipitado. Se
emplea para hormonas esteroides.
Separadas ambas fracciones, se mide la radioactividad en general en la fracción
donde se encuentran los complejos Ag-Ac, llamada fracción unida. Si se usó el método
del 2do Ac, la fracción unida se encuentra en el precipitado; pero si se usó el método del
carbón activado, la fracción unida se encuentra en el sobrenadante.
¿Cómo relacionamos la radioactividad con la concentración de la sustancia a

dosar presente en la muestra?
Preparando simultáneamente una curva patrón (o de desplazamiento) con
cantidades conocidas y crecientes del Ag (patrón, es decir Ag de concentración conocida).
Evidentemente, todos los tubos, incluyendo los que contienen la muestra, deberán llevar
la misma cantidad de Ac y de Ag* dado que la única variable del ensayo debe ser el Ag de
la muestra, y deberán ser sometidos a las mismas condiciones de incubación y
separación. Entonces, a mayor concentración de Ag más se desplaza el Ag* y menos
complejos Ac-Ag*. Se construye entonces la curva de desplazamiento.
Los valores de radioactividad correspondientes a las muestras pueden entonces

interpolarse en la curva para obtener las concentraciones del Ag. Dado que las
interpolaciones sobre curvas no son precisas se recurre a un tratamiento matemático de
los datos que transforma la curva en recta para trabajar con menor error. El gráfico que se
utiliza para obtener una recta grafica la función logit en el eje y el log (AG) en el eje x.
Estos son los gráficos denominados LOGIT LOG.
4
Cada vez que se realice un ensayo deben considerarse:
• Las uniones inespecíficas que corresponden a la unión del Ag* a otras
sustancias que no sean el Ac. Para ello utilizamos tubos procesados de la misma manera
que los restantes pero que carecen del Ac. Toda unión que se observe en estos tubos se
deberá a la fijación del Ag y Ag* a moléculas distintas al Ac. El valor de esta unión
inespecífica se sustrae a los tubos restantes, ya que se asume que en todos los tubos
ocurre en la misma proporción.
• La unión máxima que corresponde a la unión que puede darse entre el
antígeno marcado y el anticuerpo en ausencia de antígeno frío. Este tubo se procesa de
igual manera que las demás muestras no se le adiciona antígeno frío.
• La unión total que corresponde a la radioactividad total que se incorpora en
el ensayo en todos los tubos. En este tubo se adicionan todos los compuestos, pero no se
realiza la fase de separación y se mide la radioactividad de ambas fracciones (unida y
libre).
Resumiendo, los pasos y el fundamento del RIA:

• Se mezcla una cantidad constante de antígeno marcado radioactivamente y
una cantidad constante de un anticuerpo para ese antígeno y cantidades variables de
antígeno si marcar o frío, en todos los tubos. En el caso del anticuerpo se adiciona en
cantidades limitantes, con el fin de que se establezca la competencia entre Ag y Ag*.
Todos los tubos deben tener igual volumen final.
• Se produce la reacción del anticuerpo (Ac) con el antígeno sin marca
(también denominado antígeno frío o Ag) y o el antígeno marcado (también denominado
antígeno caliente o Ag*).
• Se deja que se establezca el equilibrio En el equilibrio, el antígeno está
presente en dos fracciones: una fracción unida (complejos Ag-Ac y Ag*-Ac) y una fracción
libre (moléculas de Ag y Ag*).
• Se separa la fracción de antígeno que se ha unido de la que permanece
libre. Por ejemplo, se utiliza un 2º anticuerpo dirigido contra el primero.
• Se mide la radioactividad en la fracción unida.
• El antígeno frío competirá con el marcado para unirse al anticuerpo, y se
observará un descenso en la medida de la radioactividad.
• Este descenso es proporcional a la concentración de antígeno frío en la
muestra
5
EJEMPLO - UN ENSAYO RIA
Se realiza un RIA para determinar la concentración de LH en 2 muestras de suero
(A y B). El contenido de cada tubo y los datos obtenidos se muestran en la siguiente tabla:
Nombre del Tubo Componentes y procesamiento de cada tubo Radioactividad
Standard de Método
Muestra concentración Trazador Ac 1° de
a Dosar conocida (LH*) (anti LH) Ac 2° separación cpm
Total No No Si No No No 43399/43687
Unión Inespecífica No No Si No Si Si 396/418
Unión Máxima No No Si Si Si Si 17486/17542
5 UI/ml No Si Si Si Si Si 16208/16301
Resolución
o -Primero hay queNopromediar los valores de radioactividad (cpm) para cada
Muestra A Si Si Si Si Si 14269/13768
par de duplicados. No
Muestra B
o La uniónSi específica de cadaSi tubo seSi obtieneSi restando
Si 9901/9523
el promedio de la
unión inespecífica [(396+418)/2=407].
o Se hacen los cocientes entre el promedio de cada punto y el de la unión

máxima, tanto para la curva como para las muestras a determinar. A este cociente se lo
denomina T = cpm unido / cpm unión máxima.
o Se calcula el valor de Logit T: Logit T = ln T .
1-T
Nombre del Tubo cpm cpm promedio cpm específico T logit log [LH]
Total 43399/43687
Unión Inespecífica 396/418 407
Unión Máxima 17486/17542 17514 17107
5 UI/ml 16208/16301 16254,5 15847,5 0,93 2,53 0,70
15 UI/ml 13502/13804 13698 13291 0,78 1,25 1,18
30 UI/ml 10078/10971 10974,5 10567,5 0,62 0,48 1,48
75 UI/ml 6711/6424 6567,5 6160,5 0,36 - 0,57 1,87
150 UI/ml 4145/4218 4181,5 3774,5 0,22 - 1,26 2,17
300 UI/ml 3011/3077 3044 2637 0,15 - 1,70 2,48
Muestra A 14269/13768 14018,5 1361,5 0,79 1,36
Muestra B 9901/9523 9762 9355 0,55 0,19
o Se grafica la curva de desplazamiento: Logit T en función de los logaritmos

de la concentración de LH (eje x: log [LH]; eje y: Logit T).
6
o Entrando a la curva con el valor de Logit de las muestras a determinar, se

obtiene el valor del logaritmo de la concentración de LH, a partir del que se calcula la
concentración de LH (antilogaritmo).
Resultados exactos:
[LH] A = 13,72 mUI/ml [LH] B = 41,58 mUI/ml
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Cuestionario de RIA
1.- ¿Qué tipo de compuestos pueden ser evaluados por RIA?
2.- ¿Cuál es la sensibilidad de un ensayo de RIA?
3.- ¿Cuáles son los tres reactivos específicos que deben estar presentes en la
determinación de un compuesto por el método RIA? ¿Qué función cumple cada uno de
ellos? Dé ejemplos.
4.- ¿Cuál es el reactivo utilizado para marcar antígenos?
5.- Al realizar un radioinmunoanálisis, ¿por qué es necesario separar la fase libre
de la unida?
6.- ¿Cómo realizaría una curva patrón para la determinación de LH?
7.- Imagine que está evaluando la concentración de una hormona por RIA. Si
consideramos que está detectando únicamente la radiactividad debida a la fase ligada:
¿esperaría obtener más señal en una muestra con más o con menos concentración de
hormona? Justifique su respuesta.
10.- ¿Cómo procedería si quiere determinar la concentración de prolactina en la
muestra de un paciente?
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TRABAJO PRÁCTICO 15
Sangre – Orina
ELISA
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA
La bioquímica clínica es la rama del laboratorio en la que se usan métodos

químicos y bioquímicos para el estudio de las enfermedades. En la práctica, está
usualmente dedicada, aunque no exclusivamente, a los estudios de la sangre, orina,
materia fecal y otros fluidos biológicos debido a la relativa facilidad de obtención de este
tipo de muestras. Las investigaciones bioquímicas están involucradas, en grados
variables, en todas las áreas de la medicina clínica.
Cada ensayo bioquímico debería proveer respuesta a una pregunta generada en el
médico sobre el paciente. Los resultados de los tests bioquímicos pueden ser de uso para
el diagnóstico, screening y prognosis de una enfermedad así como para el seguimiento de
su tratamiento. Además, el laboratorio bioquímico puede estar vinculado con la
investigación de las bases bioquímicas de las enfermedades y con los ensayos clínicos de
nuevas drogas.
Existen una amplia variedad de especialidades dentro de la bioquímica clínica y no
todos los laboratorios están equipados para llevar a cabo todas las posibles solicitudes.
Los resultados de los tests de laboratorio usualmente se comparan con un rango
de referencia que representa el estado saludable normal. Sin embargo, este rango de
referencia sólo debe ser tomado como una guía y es importante tener en cuenta que un
resultado anormal no siempre indica la presencia de una enfermedad, ni que un resultado
normal la ausencia de ella. La discriminación entre resultados normales y anormales está
afectada por varios factores fisiológicos que deben ser considerados al interpretar
cualquier resultado. Por ejemplo sexo, edad, dieta, stress, ansiedad, ejercicio, historia
médica del paciente, hora de extracción de la muestra, etc. son factores que el médico
debe evaluar al interpretar un resultado.
SANGRE
Se puede considerar que la sangre es un tejido conectivo fluido, porque está
compuesto por células y una “sustancia intercelular” líquida: el plasma sanguíneo.
La cantidad total de sangre en un individuo adulto es de aproximadamente 5-6
litros, representando así el 7-8% del peso corporal. El plasma corresponde al 54% del
volumen sanguíneo, mientras que la porción celular, representa el 46% restante.
La sangre circula por el organismo a través de los vasos sanguíneos y tiene la
función de transportar:
 nutrientes orgánicos
 desechos orgánicos resultantes del metabolismo celular y el exceso de iones
minerales hacia los riñones para su excreción
 gases (O2 y CO2) desde los pulmones hacia los tejidos y viceversa
 vitaminas, hormonas, etc.
Otras funciones de la sangre incluyen:
 mantener el equilibrio ácido-básico del cuerpo
 regular el balance hídrico
 participar en la regulación de la temperatura corporal
 mediar en los mecanismos de defensa del organismo (puesto que la sangre
contiene, entre otros, leucocitos y anticuerpos)
La sangre es el líquido más frecuentemente utilizado con finalidades analíticas. Los
tres procedimientos generales para la obtención de sangre de un individuo son:
1) punción arterial
2) punción venosa
3) punción cutánea
1
La técnica de elección para la obtención de muestras de sangre dependerá de los
parámetros que se deseen analizar. La punción venosa es técnicamente más fácil y es la
usualmente utilizada para la mayoría de las determinaciones de rutina, pero proporciona
valores incorrectos de saturación de O2 y pCO2, parámetros que deben medirse a partir
de una punción arterial. Estas determinaciones de los gases en sangre son críticas para
valorar los problemas de oxigenación que se encuentran en enfermedades tales como el
asma, neumonías, embolia pulmonar. Los pacientes con oxígenoterapia prolongada o
ventilación mecánica son monitoreados para lograr el nivel de oxigenación adecuado.
La sangre obtenida por punción de la piel (a veces denominada incorrectamente
sangre capilar) es una mezcla de sangre procedente de arteriolas, vénulas y capilares, y
contiene también líquido intersticial e intracelular. Por lo tanto, está compuesta por una
fracción arterial y una fracción venosa. La mayor presión en las arteriolas hace que la
muestra sea más rica en sangre arterial.
En los tres casos, si inmediatamente de extraída la sangre se mezcla en un tubo
con un anticoagulante, se tiene lo que se llama sangre entera, y se mantiene en ese
estado por un tiempo prolongado.
Si luego el tubo se centrifuga a baja velocidad, se obtienen dos fracciones
claramente definidas:
a) un precipitado de células, compuesto por eritrocitos comprimidos
(aproximadamente 45% del volumen total) por encima de los cuales existe un volumen de
glóbulos blancos y plaquetas (aprox. 1%)
b) un sobrenadante fluido que corresponde al plasma y representa el 54%
restante.
Si no se agrega anticoagulantes a la sangre, y se deja reposar el tubo durante unos

minutos, se produce la coagulación de esa muestra, obteniéndose también dos
fracciones:
a) el coágulo, constituido principalmente por las células y
b) el líquido excluido del coágulo denominado suero.
En resumen, el suero se diferencia del plasma en que carece de factores de la
coagulación consumidos durante dicho proceso (como por ejemplo fibrinógeno, que ha
sido convertido en la fibrina del coágulo, protrombina entre otros), y por contener además,
en baja concentración, sustancias de importancia fisiológica liberadas por las plaquetas
durante la coagulación, por ejemplo, el factor de crecimiento derivado de las plaquetas
(PDGF). El plasma de un individuo en ayuno es límpido y de color amarillo claro, debido a
las pequeñas cantidades del pigmento bilirrubina.
El plasma y el suero tienen aproximadamente la siguiente composición química:

 Agua (90%)
 Sustancias orgánicas (9%)
 Sustancias inorgánicas (1%)
Es decir, son soluciones acuosas de proteínas, electrolitos y pequeñas moléculas
orgánicas. El plasma contiene alrededor de:
2
 7 g% de proteínas,
 900 mg% de electrolitos (especialmente iones sodio (Na +), cloruro (Cl-),
bicarbonato (HCO3-), potasio (K+), calcio (Ca2+), magnesio (Mg2+) y fosfatos.
 Bajas concentraciones de pequeñas moléculas orgánicas que comprenden
aproximadamente: 100 mg% de glucosa, 25 mg% de productos de desechos
nitrogenados no proteicos (el principal es la urea), lípidos (triglicéridos, fosfolípidos,
colesterol).
DETERMINACIONES EN SANGRE
Las determinaciones sanguíneas más importantes pueden clasificarse en los
siguientes grupos:
1) Hematología.
a. Hemograma y exámenes hematológicos.
2) Coagulación y hemostasia.
3) Análisis de gases en sangre y saturación de oxígeno.
4) Determinaciones físico-químicas:
a. Características físicas: osmolaridad plasmática, viscosidad de la
sangre, velocidad de sedimentación globular (eritrosedimentación).
b. Concentración de electrolitos: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, H2PO4-
c. Concentración de compuestos orgánicos: glucosa, urea, ácido úrico,
lípidos, bilirrubina, proteínas, etc.
5) Determinación de actividades enzimas: lactato deshidrogenasa (LDH),
creatinfosfoquinasa (CPK), transaminasa glutámico-oxaloacética (TGO), transaminasa
glutámico-pirúvica (TGP), amilasa, colinesterasa, fosfatasa ácida y alcalina, etc.
6) Serología y diagnóstico inmunobiológico: determinación de antígenos y/o
anticuerpos marcadores de enfermedades (SIDA, carcinomas, hepatitis, etc.),
determinación de complemento, anticuerpos antinucleares, anticitoplasmáticos,
antieritrocitarios, antifosfolípidos, inmunocomplejos, etc.
7) Otros: determinación de marcadores oncológicos, tóxicos y fármacos.
Los rangos de referencia son guías valiosas para el médico pero como se dijo
anteriormente, no deben tomarse como indicadores absolutos de salud o enfermedad.
Además, los valores entre laboratorios pueden variar significativamente por diferencias en
la metodología y la forma de estandarización. Por lo tanto, los valores de referencia en
una determinada institución pueden variar con respecto a los listados en esta guía.
HEMATOLOGÍA
El estudio hematológico más frecuente es el Hemograma.
El Hemograma completo consiste en determinar:
1. Cantidad de cada tipo de célula presente en la sangre:
a. Recuento de glóbulos blancos o leucocitos
b. Recuento de glóbulos rojos llamados también hematíes o eritrocitos
c. Recuento de plaquetas.
2. Hematocrito
3. Concentración de hemoglobina
4. Índices hematimétricos:
a. Volumen corpuscular medio (VCM)
b. Hemoglobina corpuscular media (HCM)
c. Concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM)
5. Fórmula leucocitaria
6. Evaluación morfológica de las células
3
Todas estas determinaciones se realizan con sangre entera venosa.

Los recuentos celulares pueden hacerse manualmente contando los elementos
en una cámara de Neubauer vista bajo el microscopio. Este método consiste en colocar
una pequeña cantidad de sangre entre dos vidrios, uno de los cuáles tiene grabada una
retícula de tamaño conocido sobre la que se cuentan las células. La muestra debe ser
procesada antes de acuerdo con el tipo de célula a contar. Dado que el tamaño de la grilla
y el volumen de la cámara son conocidos, es posible establecer el número de células por
volumen de sangre.
El hematocrito informa el volumen que ocupan los glóbulos rojos como porcentaje
del total de la sangre y se mide centrifugando un pequeño volumen de sangre en un tubo
cilíndrico y midiendo la relación entre la altura de la columna de hematíes con respecto a
altura total de la columna.
El número de eritrocitos y el hematocrito pueden variar fisiológicamente por el

ejercicio, la altura sobre el nivel del mar, el embarazo, sexo (los andrógenos estimulan la
eritropoyetina), etc.
La concentración de hemoglobina se mide según la absorbancia de la muestra a
una determinada longitud de onda, característica de esta proteína. Puede variar
fisiológicamente por las mismas razones que varía en número de eritrocitos. La altitud
sobre el nivel del mar produce cierto grado de hipoxia que, dependiendo de la duración y
la continuidad, puede elevar la concentración de hemoglobina.
Los índices hematimétricos son parámetros calculados que relacionan el número
4
total de eritrocitos, el hematocrito y la concentración de hemoglobina. Son útiles para
clasificar los diferentes tipos de anemias.
 el volumen corpuscular medio (VCM) = hematocrito/nº hematíes. Evalúa el
volumen medio de los glóbulos rojos. Pueden presentarse alteraciones hematológicas con
eritrocitos de menor volumen (microcíticas) o de mayor volumen (macrocíticas).
 la hemoglobina corpuscular media (HCM) = concentración de hemoglobina/nº
hematíes. Evalúa la hemoglobina contenida en cada glóbulo rojo
 la concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM) = concentración de
hemoglobina/hematocrito. Evalúa la hemoglobina contenida en todos los eritrocitos.
Pueden presentarse alteraciones donde los eritrocitos tienen menor concentración
de hemoglobina (hipocrómicas) o mayor concentración (hipercrómicas).
Por ejemplo, las anemias ferropénicas (por deficiencia de hierro) presentan valores
disminuidos de HCM (microcíticas) y de CHCM (hipocrómicas).
Hoy en día es muy frecuente que los laboratorios cuenten con contadores
hematológicos, equipos preparados para contar los distintos tipos de células. En este
caso el mismo contador prepara la muestra y está calibrado para contar las partículas de
cada tipo, según el tamaño de cada tipo de células. También mide la concentración de
hemoglobina y a partir de estos parámetros, el equipo calcula los índices hematimétricos.
La fórmula leucocitaria expresa la cantidad de cada tipo de leucocito. Puede ser
absoluta (expresada por volumen de sangre) o porcentual.
En diversas patologías (infecciones, intoxicaciones, reacciones alérgicas,
leucemias, etc.) puede alterarse el número total de leucocitos y/o las cantidades relativas
de cada tipo leucocitario.
La fórmula leucocitaria y la evaluación morfológica (color, tamaño y forma) de las
células se determinan por observación microscópica de una gota de sangre fresca
extendida sobre un portaobjetos de vidrio, preparado que se denomina frotis. Este frotis
se tiñe con colorantes que permiten diferenciar todos los tipos celulares.
Los glóbulos rojos normales se ven como pequeños discos teñidos con menor
intensidad en el centro. Algunas de las anomalías morfológicas de la serie roja son
eliptocitosis (forma oval, pareja), anisocitosis (diferentes formas). La hipercromía,
hipocromía y anisocromía, que indican cantidades anormales de hemoglobina, se pueden
evidenciar de acuerdo a la intensidad con que se tiñen los eritrocitos.
Valores de referencia Hemograma

Los siguientes son los valores de referencia considerando personas adultas
sanas:
 Recuento de hematíes: Mujeres: 4,6 x 106 ± 0,6 x 106/ mm3
Hombres: 5,3 x 106 ± 0,7 x 106/ mm3
 Hematocrito : Mujeres: 42 ± 5 %
Hombres: 47 ± 5 %
Recién Nacidos: 46 - 62 %
 Concentración de Hemoglobina: Mujeres: 12 - 15 g%
Hombres: 13 - 17 g%
Recién Nacidos: 13 - 20 g%
 Índices hematimétricos: VCM: 82 – 95 fl (femtolitro)
HCM: 27 – 31
CHCM: 320 – 360 g/l
 Recuento de leucocitos: Adultos: 4000 - 11000 / mm3
Recién nacidos: 10000 – 25000 / mm3
 Fórmula Leucocitaria relativa: Cayados: 0 - 1 %
Neutrófilos: 55 - 70 %
5
Eosinófilos: 1 - 4 %
Basófilos: 0 - 1 %
Linfocitos: 20 - 30 %
Monocitos: 4 - 8 %
 Recuento de plaquetas: 150000 - 400000 / mm3
ANÁLISIS DE GASES EN SANGRE Y SATURACIÓN DE OXÍGENO

Se utilizan para evaluar el estado ácido base (EAB) o el estado de oxigenación
respiratoria del individuo.
La muestra de elección en este caso es sangre entera obtenida por punción
arterial, colectada anaeróbicamente.
Los parámetros medidos son pH, pCO2 y pO2, y se pueden incluir los parámetros
calculados de concentración de bicarbonato, de CO2, el exceso de base y la saturación de
O2 de la hemoglobina.
Las determinaciones de pH, pCO2 y pO2 se realizan con un equipo constituido por
tres electrodos, cada uno específico para cada uno de los parámetros a medir y se los
denomina electrodo de pH, electrodo de CO2 y electrodo de O2. En cada electrodo, los H+,
el CO2 o el O2 presentes en la muestra generan una diferencia de potencial proporcional a
su concentración. La corriente producida es medida por un voltímetro y convertida en
unidades de pH o mmHg (unidad en que se expresan la pCO2 y pO2).
Recordar que la concentración de bicarbonato se calcula con los resultados
obtenidos en las mediciones de pH y pCO2, utilizando la ecuación de Henderson-
Hasselbach, que relaciona el pH de la solución con la relación [HCO3-]/[H2CO3]:
pH = pKa + log [HCO3-]/[H2CO3]
Siendo la [H2CO3] muy baja, debido a la presencia de la anhidrasa carbónica, para
calcularla se utiliza la [CO2]:
[CO2] (mM) = 0,03 x pCO2 (mmHg)
[HCO3-] [HCO3-]
pH = pKa + log ------------ = pKa + log --------------------
[CO2] 0,03 x pCO2
Medidos el pH y la pCO2 y conocido el pKa del sistema (6,1), se calcula la [HCO3-].
Valores de referencia Estado Ácido-Base

Parámetro Rango de referencia
pH arterial 7,35 - 7,45
pCO2 arterial 32 - 48 mmHg
pO2 arterial 83 - 108 mmHg
CO2 total arterial 23 - 29 mEq/l
-
HCO3 arterial 20-28 mEq/l
Exceso de base Entre –2 y +3 mEq/l
arterialSaturación de O2 95 - 98 %
arterial
La saturación de oxígeno, otro de los parámetros calculados por el equipo de
gases, indica el porcentaje de la hemoglobina total que ha fijado oxígeno y es calculado a
partir de la pO2 y pH medidos utilizando la ecuación de Hill, que describe la función
sigmoidea que sigue la saturación de oxígeno graficada en función de la pO 2, para un pH
dado.
6
IONOGRAMA
Es la determinación de las concentraciones circulantes de iones en plasma o suero,
en particular de Na+ y K+.
La concentración de Na+ varía entre 135 y 145 mEq/l en los individuos sanos. La
hiponatremia y la hipernatremia son importantes trastornos electrolíticos que requieren
una medición exacta del laboratorio para diagnóstico y para el control de su corrección.
Normalmente, la pérdida urinaria diaria de este ión es equilibrada por la ingestión y el
estado de hidratación, entre otros factores.
El rango fisiológico de concentración sérica de K+ es de 3,5 a 5,5 mEq/l. Una
concentración del ión potasio circulante elevado o deprimido (hipercalemia o hipocalemia,
respectivamente) puede tener profundos efectos adversos sobre el miocardio, lo que hace
de la concentración de potasio uno de los objetos de análisis clínico más importante.
Dado que el potasio es el principal catión intracelular, debe tenerse en cuenta que la
hemólisis de la muestra (post-extracción) eleva espuriamente el resultado.
Valores de referencia Ionograma

Parámetro Rango de referencia
Osmolaridad 275 - 295 mOsm
Na+ Sangre 135 - 155 mEq/l
Orina 30 - 280 mEq/día
K+ Sangre 3,5 – 5,5 mEq/l
Orina 25 - 125 mEq/día
Cl- 98 - 107 mEq/l
Ca2+ 8,1 - 10,4 mg%
Mg2+ 1,7 - 2,4 mEq/l
Fósforo 2,7 - 4,5 mg%
ERITROSEDIMENTACIÓN
Esta determinación consiste en medir la velocidad de sedimentación globular. Para
ello se utiliza sangre entera anticoagulada con la que se llena un fino tubo graduado
(contiene un volumen estandarizado de muestra) y se lo deja reposar. Habitualmente se
realizan lecturas luego de 1 y 2 hs, tiempo durante el cual en la columna se separan dos
fases, las células en la parte inferior y una fase superior de plasma. Cada lectura implica
medir la altura de la columna líquida superior. Normalmente, en la primera hora la
eritrosedimentación es menor que 12 mm para el hombre y menor que 15 mm para la
mujer. Este parámetro aumenta por variadas razones fisiológicas (embarazo) y
patológicas (procesos inflamatorios agudos y crónicos, infecciosos, anemias,
disproteinemias, etc.), resultando en un dato altamente inespecífico para diagnósticos. Un
resultado de eritrosedimentación acelerada es de escaso valor cuando se lo considera
aisladamente; en cambio, en conjunto con otros datos clínicos y de laboratorio, es un
elemento valioso en el diagnóstico y seguimiento.
QUÍMICA CLÍNICA
El término Química Clínica comprende un alto número de determinaciones de
concentraciones circulantes de compuestos orgánicos y enzimas implicados en una
amplia variedad de procesos metabólicos. Esta guía de estudio no pretende incluir a
todas, sólo se tendrán en cuenta las que tienen significancia en el contexto del curso de
Bioquímica Humana. El alumno deberá poder vincular un determinado test con los
7
diferentes temas bioquímicos relacionados, situaciones metabólicas normales y/o
especiales, patologías, etc.
Algunas de las determinaciones listadas en la tabla que sigue suelen agruparse
según el aspecto que evalúan. Así, se denomina hepatograma al conjunto de tests que
evalúan la función hepática: bilirrubina total y directa, transaminasas (TGO y TGP),
fosfatasa alcalina, colesterol, proteínas totales y albúmina. La colestasis se refleja en los
valores de -glutamiltranspeptidasa (-GT) y 5’-nucleotidasa. La función renal se evalúa
determinando las concentraciones de urea y creatinina, junto con el ionograma plasmático
y urinario. Las enzimas CPK, LDH y GPT suelen agruparse para evaluar daño cardíaco.
Además de metabolitos, se pueden determinar concentraciones circulantes de
marcadores tumorales, fármacos y tóxicos.
IMPORTANTE: Observaciones:
- Los valores de referencia indicados son estimativos. Dependen de la
metodología utilizada, por lo que los valores de referencia en una determinada institución
pueden variar con respecto a los listados en esta guía. Además, en algunas
determinaciones los rangos de referencia pueden variar con la edad y sexo, entre otros
factores.
- Prestar atención a las unidades, y evaluar comparativamente las
concentraciones de los distintos elementos.
METABOLITOS
Glucosa 70 - 110 mg% Metabolismo de glúcidos - acción
de insulina y glucagon - curva de
tolerancia oral
Urea 15 - 45 mg% Metabolismo de aminoácidos –
Nutrición - Función hepática -
Función renal
Creatinina 0,6 - 1,4 mg% Metabolismo de fosfocreatina
Ácido úrico < 8 mg% varones Metabolismo de purinas - gota
< 7 mg% mujeres
Triglicéridos 40 - 180 mg% Metabolismo de lípidos y
Colesterol total 140 - 200 mg% lipoproteínas Dislipoproteinemias
Función hepática
Colesterol de HDL Varones > 35 mg% Mujeres >
29 mg%
Colesterol de LDL < 130 mg%
Bilirrubina total 0,8 - 1 mg% Metabolismo del hemo -

(conjugada + Función hepática
no conjugada)
Bilirrubina directa < 0,2 mg%
(conjugada)
Proteínas totales 6,1 - 7,9 g% Osmolaridad plasmática -
Función hepática -
Albúmina 3,5 - 4,8 g% Proteinograma - buffers
biológicos
Hierro 60 - 170 g% Metabolismo del hierro
Transferrina
Ferritina
IgG 710 - 1520 mg% Respuesta inmune
IgA 90 - 310 mg% Infecciones
IgM 40 - 250 mg%
IgD 0 - 9 mg%
IgE 0 - 100 UI/ml Alergias Infecciones parasitarias
8
NH3 19 - 82 g% Función hepática - Errores
congénitos del ciclo de la urea
Ácido láctico 4,5 - 17 mg% Metabolismo en músculo-

Alteraciones del metabolismo del
glucógeno- hipoxia
Hemoglobina 4 - 7% de la hemoglobina total Metabolismo de glúcidos

glicosilada (diferentes métodos pueden Regulación de la glucemia
medir diferentes valores)
Fructosamina 1 - 2% de las proteínas totales
Cuerpos cetónicos Negativo Metabolismo de lípidos y glúcidos

Diabetes
ENZIMAS
Transaminasa 15 - 30 U/l Función cardíaca y hepática

glutámico oxaloacético Hepatitis
o Enfermedad hepática obstructiva
aspartato amino Infarto de miocardio
transferasa
(TGO o ASAT)
Transaminasa 8 - 20 U/l
glutámico pirúvico
o
alanina amino
transferasa
(TGP o ALAT)
Fosfatasa alcalina 80 - 280 U/l Metabolismo óseo - función
(FAL) hepática- Isoenzimas
Fosfatasa ácida total Hombres 3 - 12 UI/l
Mujeres 0,4 - 9 UI/l
Creatina quinasa < 170 U/l Función cardíaca, muscular y
(CPK) cerebro- infarto de miocardio-
trauma-miopatías Isoenzimas
Lactato deshidrogenasa 230 - 460 U/l Función cardíaca y eritrocitaria-
(LDH) infarto de miocardio- anemias -
Isoenzimas
5’nucleotidasa < 15 U/l Función hepática- enfermedad
(5’Nu) hepatobiliar obstructiva intra o
extra hepática
-glutamiltranspeptidasa Hombres 22 ± 12 U/l Función hepática- enfermedad
(GGT) Mujeres 15 ± 6 U/l obstructiva hepática y post-
hepática
Amilasa < 220 U/l Función pancreática y parótidas-
pancreatitis- parotiditis
Lipasa 0 - 200 Función pancreática- pancreatitis
HORMONAS
T3 1,5 - 3,4 mg% Glucagon 30 - 210 pg/ml
T4 total 5 - 12 g% PTH 10 – 45 pg/ml
T4 libre 0,8 – 2,4 ng% Calcitonina 3 - 19 pg/ml
TSH 0,35 – 5,0 mU/l Subunidad -hCG Mujeres no
(5 - 60 ng/ml) embarazadas < 5
mUI/ml
9
ACTH A las 8 hs, 0 - 54 Estradiol
pg/ml
LH Varones 2 - 12 U/l Estriol Variable según
Mujeres variable edad y ciclo
según ciclo menstrual
FSH menstrual
Varones 1 - 7 U/l Progesterona
Mujeres variable
según ciclo
menstrual Mujeres
postmenopáusicas >
30 U/l
GH < 10 mU/l Testosterona Variable según
edad
Prolactina Mujeres 60 - 500 mU/l Cortisol 8 hs: 5 - 25 µg%
Varones 60 - 360 mU/l 16 hs 3 – 15 µg%
20 hs: < 50%
valor de las 8hs
Insulina < 30 U/l Aldosterona 3-10 mg%
MARCADORES TUMORALES TUMOR

-fetoproteína < 10 Células germinales y Hepatoma
CA125 ng/ml
< 35 U/ml Ovario
CA15-3 < 28 U/ml Carcinoma mamario
CA19-9 < 37 U/ml Páncreas y gastrointestinal
CEA (antígeno carcionoembrionario) < 2,5 Colorrectal
PSA (antígeno prostático específico) ng/ml
< 2 ng/ml Próstata
Fosfatasa ácida prostática <2-4 Próstata
hCG g/l Células germinales y coriocarcinoma
Paraproteínas Mieloma
ORINA
La orina es el producto de excreción del riñón y el líquido orgánico por el que se
excretan la mayoría de los metabolitos hidrosolubles del organismo.
El proceso de formación de orina comienza con la ultrafiltración de la sangre a nivel
del glomérulo renal, continúa en el sistema tubular renal donde se realizan procesos de
secreción y reabsorción de agua y solutos y culmina con la excreción. A través de este
proceso, los riñones conservan en equilibrio el volumen, composición y estado ácido-base
de los líquidos corporales, que además están sujetos al ingreso dietético de solutos
(incluyendo fármacos y tóxicos) y agua y a la velocidad y tipo de transformación
metabólica de glúcidos, lípidos, aminoácidos y ácidos nucleicos tanto endógenos como
exógenos.
La obtención de una orina dentro de parámetros normales implica un correcto
funcionamiento del riñón y una relación equilibrada entre este órgano y los distintos
órganos de la economía.
La orina normal está compuesta por:
 agua (90%)
 compuestos inorgánicos:
o cationes inorgánicos: Na+, K+, Ca2+, Mg2+, NH4+, trazas de Fe, Zn, Cu.
o aniones inorgánicos: Cl-, fosfatos, sulfatos, trazas de nitratos, bicarbonato, etc.
 compuestos orgánicos:
o Nitrogenados: los principales son urea, creatinina, ácido úrico, creatina,
aminoácidos y péptidos.
o No nitrogenados: están en mucha menor cantidad e incluyen trazas de ácido
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glucurónico, ácido cítrico, oxalatos, metabolitos de hormonas esteroideas. En muy
pequeña concentración hay también glucosa, colesterol y cuerpos cetónicos.
Es importante remarcar que mediante el análisis de orina pueden obtenerse datos
referentes a la función renal, a lesiones del parénquima y vías urinarias y, además, se
podrá rescatar información sobre el funcionamiento de vías metabólicas variadas y la
capacidad funcional de varios órganos, mediante la determinación de distintos metabolitos
urinarios. El examen urinario de rutina aporta datos que deben asociarse al contexto
clínico del paciente para que brinde una apreciación diagnóstica.
ANÁLISIS DE ORINA COMPLETO

El análisis completo de orina es una técnica simple cuyo objeto es demostrar la
presencia de algunos componentes de importancia diagnóstica. La práctica médica diaria
dispone así de una estrategia diagnóstica de extrema utilidad. Además, fuera de los
procedimientos de rutina, existen determinaciones más complejas para analizar la
presencia y concentración de variados tipos de compuestos.
La recolección de la muestra es muy importante, determina la fidelidad de los
resultados y su correcta interpretación. Se debe realizar en un recipiente limpio (de vidrio
o plástico), que no contenga restos de detergentes, grasas o agua oxigenada. No es
necesario que sea estéril. Es recomendable una exhaustiva higiene y enjuague de las
manos y genitales. Se debe desechar los primeros mililitros de orina y recoger el chorro
medio de la micción. Habitualmente, el análisis de orina completo se efectúa sobre la
primera orina de la mañana (de 3 hs. de retención mínima). Algunos análisis específicos
requieren la recolección durante 24 hs (orina de 24 hs.). En este caso, es importante
recomendar que una vez obtenida la muestra, se la debe conservar en lugar fresco y al
abrigo de la luz solar. Si se debe realizar un cultivo bacteriano de esa muestra
(urocultivo), el frasco debe estar estéril.
El examen de rutina incluye 3 partes
1. examen físico
2. examen químico
3. examen microscópico
1) El examen FISICO: comprende la descripción del color, aspecto y olor, así
como la determinación de volumen, densidad y pH.
 Aspecto, color y olor: se realiza por observación directa de la orina en un
tubo limpio de vidrio transparente. Normalmente, la orina posee:
 Aspecto: límpido
 Color: amarillo ámbar
 Olor: sui generis
 Espuma: blanca, no persistente Pueden presentarse anomalías:
 Aspecto turbio: debido a proteinuria, bacteriuria, precipitación de sales
(fosfatos amónicos en orinas alcalinas o uratos en orinas ácidas.
 Color: rojizo: por hematuria, hemoglobinuria, mioglobinuria, ingesta de
remolacha, presencia de cristales de uratos amorfos (no patológico)
amarillo intenso, verde oscuro hasta amarronado: bilirrubina
caoba: pigmentos biliares o porfirias
pardo oscuro, negruzco: alcaptonuria
anaranjado: estado febril, tratamiento con rifampicina
 Aspecto opalescente y color blanco amarillento: pus, infección urinaria
 Olor: dulce, a frutas o cetónico: cuerpos cetónicos, glucosuria
fecaloide: procesos infecciosos
 Espuma persistente: proteinuria, resto de detergente en el frasco de muestra
o el tubo
 Volumen: se determina midiéndolo en una probeta graduada, e indicando el
11
período de tiempo en que se recolectó la muestra. La diuresis normal es de 1500 ml/24 h.
Debido a que la cantidad de líquido que maneja el riñón es normalmente muy variable,
dicha cifra puede variar en más o en menos.
El volumen urinario está influenciado por la ingesta hídrica, pérdidas por
transpiración, vómitos o diarrea, emoción, frío/calor, hormonas (aldosterona, antidiurética),
iones (sodio principalmente), ingesta de metilxantinas (cafeína, teobromina), alcohol,
diuréticos, estados patológicos como diabetes, etc.
Si el volumen urinario diario es menor de 400 ml/24 h se define el estado de
oliguria, llegando a anuria cuando se anula la diuresis (pensar en situación obstructiva). El
aumento del volumen de 24 h se define como poliuria, estableciéndose el límite en 3 litros,
siendo este un valor arbitrario ya que es más difícil establecer un valor de cota de este
estado.
El aumento de frecuencia de las micciones (polaquiuria) suele asociarse con
trastornos de la vejiga urinaria.
En la nicturia, la mayor cantidad de orina se excreta durante la noche.
 Densidad: en condiciones normales, la densidad urinaria tiene un valor entre
1015 y 1025 g/l. Este parámetro hoy en día forma parte de las determinaciones realizadas
utilizando las tirillas reactivas (ver más abajo).
La densidad urinaria aporta información sobre la función renal de concentración-
dilución de la orina. Como resultado se pueden obtener orinas de tonicidad (concentración
de solutos) variada, con el objetivo de conservar el equilibrio del agua corporal.
Orinas muy concentradas (hipertónicas con respecto al plasma) aparecen cuando
el riñón tiende a conservar agua por disminución del aporte hídrico, estados febriles,
pérdidas gastrointestinales, diabetes sacarina.
El uso de diuréticos, disminución, ausencia o falta de acción de la hormona
antidiurética, mala nutrición proteica y diabetes insípida son factores que resultan en la
formación de orinas diluidas (hipotónicas con respecto al plasma).
pH: el riñón es uno de los órganos que junto con el pulmón interviene en la
regulación de la concentración de H+ en el líquido extracelular y lo hace
fundamentalmente regulando la concentración de HCO -3 plasmático. Esta función se
ejerce a través de la recuperación del bicarbonato filtrado, producción de nuevo
bicarbonato, excreción de NH4+, H2PO4-. En condiciones patológicas adquiere importancia
la excreción de cuerpos cetónicos y otros ácidos orgánicos.
La excreción normal de H+ le da características ácidas, por lo que el rango normal
de pH urinario oscila entre 5 y 6. El pH es una de las determinaciones realizables
utilizando las tirillas reactivas (ver más abajo). Dietas enriquecidas en el consumo de
frutas y verduras dan orinas ligeramente alcalinas.
La ingesta abundante de carnes da lugar a orinas ácidas. En casos patológicos, se
pueden detectar aumentos o disminuciones del pH. La reacción ácida es causada por
fiebre, acidosis metabólica o cetoacidosis diabética. El aumento del pH urinario suele
asociarse con dietas alcalinas, estado post-prandial, vómitos, infección urinaria, alcalosis
metabólica.
2) el Examen QUÍMICO: rutinariamente se analiza la presencia de proteínas,

hemoglobina, glucosa, cuerpos cetónicos, sales biliares y bilirrubina. Todas estas pruebas
están incluidas en las tirillas reactivas y normalmente la reacción debe ser negativa. En
caso de observarse reacción positiva, se informa con una a cuatro cruces (+ a ++++),
según la intensidad del color desarrollado. Cabe destacar que esta técnica aporta
resultados semicuantitativos, debiéndose procesar la muestra por métodos de tipo
cuantitativo si se desea establecer la concentración exacta de tales sustancias.
Tirillas reactivas
12
En el laboratorio de análisis clínicos es corriente el uso de tiras reactivas para
investigar la presencia de varios elementos químicos en la orina.
Las tiras reactivas de orina consisten en unas pequeñas cintas de plástico rígido a
las que van pegados unos cuadraditos impregnados de reactivos, que son diferentes
dependiendo de lo que se quiera analizar. Si el compuesto que se quiere analizar se
encuentra en la muestra, se pone en contacto con los reactivos presentes en el
cuadradito, produciendo una reacción de color fácilmente observable. Además de ser
positivo (cambio de color) o negativo (sin cambio), las diferentes intensidades de color
darán idea de la cantidad de compuesto analizado presente en la muestra, permitiendo
una semicuantificación de dicho compuesto. La semicuantificación se logra por
comparación del color desarrollado por la muestra con una curva de calibración que
provee el fabricante como 5-6 recuadros con tonalidades relacionadas con la
concentración correspondiente a cada metabolito que se quiere analizar. Si el análisis de
un metabolito da positivo con las tirillas reactivas, su cuantificación exacta deberá
realizarse con otro método químico, más específico y sensible.
De esta manera se puede determinar: densidad, pH, leucocitos, nitritos, proteínas,
glucosa, cuerpos cetónicos, urobilinógenos, bilirrubina, hemoglobina y sangre.
La ventaja de este método es que es muy rápido y muy específico ya que cada tira
tiene diversos segmentos en los cuáles está el reactivo apropiado para cada
determinación.
Descripción de las determinaciones incluidas en las tirillas reactivas

 pH: la tirilla contiene una mezcla de indicadores de pH que en contacto con
la orina dan una nítida graduación de colores, desde el naranja (pH 5) al azul (pH 9).
Resultado normal: 5 - 6 en orina fresca.
 Leucocitos: los granulocitos (un tipo de leucocitos) poseen la enzima
esterasa, que reacciona con los reactivos de la tirilla dando un producto de color violeta.
Resultado normal: negativo (no existe límite definido entre la excreción fisiológica y
patológicamente elevada de leucocitos. Mayormente se indica 10 a 20 leucocitos/l como
síntoma sospechoso y más de 20 como hallazgo patológico).
 Nitritos: se utiliza una amina que en medio ácido reacciona con los nitritos
dando una sal de diazonio, que reacciona con un cromógeno para formar color rosado.
Resultado normal: negativo.
 Proteínas: la tirilla contiene un indicador que en presencia de proteínas vira
del amarillo al verde. Resultado normal: negativo (hasta 30 mg% en orina matinal, la tirilla
no detecta esta cantidad).
La excreción de proteínas por orina debe ser menor a 150 mg/día. Este valor da
una reacción negativa con los métodos usuales de determinación cualitativa. Si la
reacción da positiva, se debe determinar la concentración en una muestra de orina de 24
hs con un método químico.
La proteinuria suele deberse a las siguientes causas:
- Aumento de proteínas plasmáticas normales y anormales.
- Aumento de permeabilidad glomerular
- Disminución de la reabsorción de polipéptidos y proteínas de bajo PM que
normalmente filtran por el glomérulo.
- Alteraciones hemodinámicas, entre las que cabe destacar el ejercicio, cambios
de posición de decúbito a erecta, fiebre, etc.
La proteinuria no siempre se acompaña de lesiones en el parénquima renal. Sin
embargo la proteinuria persistente que supera los 750 mg/24 hs es un indicador de lesión
en el parénquima renal.
La llamada proteinuria de Bence-Jones es un ejemplo típico de proteinuria por
rebasamiento. La misma resulta de altas concentraciones plasmáticas de cadenas
13
livianas de IgA, IgG e IgD observadas en mielomas (neoplasia de los plasmocitos) y
linfomas.
- Glucosa: La glucosa, por la glucosa oxidasa presente en la tira, se oxida a
gluconolactona y peróxido de hidrógeno. El agua oxigenada, en presencia de la
peroxidasa también presente en la tirilla, oxida a su vez un indicador. La cantidad de
producto formado da una gama de color entre amarillo al verde.
Resultado normal: negativo (glucosuria fisiológica hasta 15 mg% en orina matinal,
la tirilla no la detecta).
La glucosa filtrada en el glomérulo se reabsorbe casi completamente en el túbulo
contorneado proximal. Este proceso es realizado por un transportador de membrana que
se satura con concentraciones de glucosa superiores a 180 mg%; en estas circunstancias
la glucosa no reabsorbida permanece en líquido luminal y se excreta por orina. La causa
más común de glucosuria es la diabetes mellitus no controlada.
Dado que la glucemia normal está comprendida entre 70 y 110 mg%, la presencia
de glucosuria es indicativa de hiperglucemia en caso de indemnidad tubular. Existen un
número de entidades caracterizadas por anomalías a nivel tubular que presentan intensa
glucosuria sin la coexistencia de hiperglucemia.
- Cuerpos cetónicos: sólo el acetoacetato y la acetona reaccionan con
nitroprusiato de sodio y glicina en medio alcalino dando un complejo de color violeta. El -
hidroxibutirato no reacciona. Resultado normal: negativo (hasta 5 mg% en orina matinal,
la tirilla no los detecta).
Los cuerpos cetónicos se forman cuando el aporte de ácidos grasos al hígado
supera su capacidad de utilización del acetil-CoA. Se vierten entonces a sangre desde
donde son captados por órganos aeróbicos para su oxidación y obtención de energía. La
acetona se elimina por el aliento, mientras que el acetoacetato y el -hidroxibutirato lo
hacen por orina. Su eliminación sólo ocurre en cantidades apreciables cuando su síntesis
es desmedida, como ocurre en la diabetes mellitus descompensada, en el ayuno
prolongado y procesos febriles. En estos casos se detecta cetonemia (presencia en
sangre en cantidades elevadas) y cetonuria (presencia en orina).
- Urobilinógeno: el urobilinógeno reacciona en medio ácido con una sal de
diazonio, dando un compuesto rojo. Resultado normal: hasta 1 mg%.
- Bilirrubina: la bilirrubina reacciona con una sal de diazonio en medio ácido,
dando un compuesto rosa violáceo. Resultado normal: negativo.
La bilirrubina presente en orina es de tipo conjugada, forma hidrosoluble que se
filtra en el glomérulo renal, al que llega luego de pasar por la circulación enterohepática.
Está aumentada en casos de hepatitis, ictericia obstructiva o neoplasias de cabeza de
páncreas. La bilirrubina libre o no conjugada está ausente en la orina dado que es
hidrofóbica, circula unida a la albúmina y no filtra por el glomérulo renal.
- Sangre: la hemoglobina tiene actividad seudo-peroxidásica, por eso es capaz de
liberar O2 a partir del H2O2. En las tirillas reactivas se acopla esta producción de oxígeno a
la oxidación del indicador bencidina (forma oxidada azul verdoso). Resultado normal:
negativo (hasta 5 eritrocitos/l).
En situaciones específicas y obedeciendo a patologías diagnosticadas o

presuntivas puede determinarse la concentración de ciertos componentes urinarios, como
o Electrolitos (Ionograma urinario): Na+, K+, Cl-, Ca2+, NH4+, HCO3- y HPO42-.
o no electrolitos: urea, creatinina, ácido úrico, hormonas y sus metabolitos,
enzimas, fármacos y sus metabolitos, tóxicos y sus metabolitos, etc.
- Urea: es la principal forma de excreción del grupo amino de los aminoácidos. La
misma se filtra libremente por el glomérulo y es parcialmente secretada y reabsorbida a
nivel de los túbulos. Su excreción urinaria depende de las proteínas de la dieta, por tal
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motivo el aclaramiento renal de la misma no es una expresión fidedigna del
funcionamiento renal. Por ello, el clearance de urea no se usa para evaluar el
funcionamiento renal. Cabe acotar que la concentración plasmática de urea se elevará
recién cuando el deterioro renal afecte a más del 50% del parénquima.
- Creatinina: resultado de la transformación espontánea de la fosfocreatina
muscular. Este compuesto filtra libremente en glomérulo y prácticamente no es secretada
o reabsorbida a nivel de los túbulos. A diferencia de la urea, la excreción de creatinina no
depende de la proteína dietaria, encontrándose sujeta únicamente a la masa muscular.
Estas circunstancias hacen que el aclaramiento renal de creatinina (clearance) sea un
recurso clínico para el diagnóstico y control evolutivo de la insuficiencia renal. Sumado a
esta característica se asocia la buena relación entre la disminución del clearance de
creatinina y la elevación de su concentración en plasma.
- Acido úrico: producto final del catabolismo de las bases púricas, excretado por
orina. Debido a que el pKa del N9 del ácido úrico es 5,5 y el del N1 es 10,3, a pH
plasmático fisiológico se encuentra en forma de urato monosódico. En orina, el estado
iónico dependerá del pH: si el pH urinario es menor que 5,75, se encontrará
predominantemente como ácido úrico y si es mayor en forma de urato. El ácido es soluble
hasta concentraciones de 6-7 mg%, precipitando en concentraciones mayores. En esa
situación se puede precipitar en el parénquima renal o en las vías urinarias, llevando a
cambios histológicos que conducen a nefropatías o a urolitiasis, respectivamente.
En ciertas alteraciones metabólicas se incrementa la excreción de productos

intermedios o alternativos de los metabolismos.
Ejemplos: - ácido homogentísico urinario incrementado en la alcaptonuria (la orina
es marrón oscura debido a que este compuesto se oxida en presencia del oxígeno del
aire y se convierte en un pigmento de ese color)
- por disminución de la actividad de las enzimas del ciclo de la urea se incrementa
la excreción de los intermediarios o productos derivados (argininosuccinato, citrulina,
ornitina, ácido orótico, etc.)
La concentración de hormonas, sus metabolitos y determinadas enzimas

pueden ser investigados en orina para evaluar la actividad de los órganos y tejidos de
síntesis. Como ejemplo se pueden citar a la aldosterona, cortisol, adrenalina,
noradrenalina, estrógenos totales, metabolitos como la tetrahidroaldosterona,
tetrahidrocortisol, 17-cetosteroides, 17-OH-esteroides, ácido vainillín mandélico o enzimas
como la amilasa, fosfatasa alcalina y LDH, entre otras. Situaciones patológicas como
algunas enfermedades glandulares, y no patológicas como por ejemplo el embarazo,
provocarán modificaciones con respecto a los valores normales.
3) Examen MICROSCÓPICO (Sedimento urinario)

El examen del sedimento presente en una orina recién emitida o conservada
cuidadosamente puede constituirse en lo más importante del análisis de orina ya que
puede proveer datos precisos sobre la existencia de una enfermedad renal y sobre la
naturaleza y extensión de la lesión.
Para el análisis del sedimento urinario, la orina previamente homogeneizada en
forma suave se pasa a un tubo cónico y se la centrifuga a baja velocidad, para evitar la
deformación exagerada de los elementos a investigar. Luego se elimina el sobrenadante
por inversión del tubo, y se resuspende el precipitado en la pequeña cantidad de orina
que queda en el tubo. Esta muestra se coloca entre porta y cubreobjetos limpios,
observando al microscopio. La observación del sedimento debe ser hecha en lo posible
sobre la orina fresca, con no más de 6 hs de emitida, con preferencia sobre la orina de la
mañana que es más concentrada. Es recomendable guardar la muestra en heladera si el
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examen no se realiza en forma inmediata.
En el sedimento urinario podemos distinguir cualitativamente:
 Componentes inorgánicos: cristales inorgánicos de diferentes tipos.
 Componentes orgánicos: distintos tipos de células y cilindros, cristales
orgánicos y microorganismos.
SEDIMENTO URINARIO NORMAL

 Elementos inorgánicos: el estudio detallado y minucioso de estos
elementos carece de valor. Excepto en circunstancias especiales, el hallazgo de cristales
en la orina tiene un valor clínico relativamente pequeño. Se trata de elementos que se
encuentran normalmente en solución y que han precipitado ya sea por hallarse en gran
cantidad o más frecuentemente por modificaciones de la reacción y/o concentración de la
orina, que pueden ser puramente fisiológicos y dependientes de modificaciones de la
dieta.
Únicamente tendrá cierto valor cuando se observen en orinas recién emitidas de
enfermos calculosos.
Se describen brevemente los más comunes, clasificándolos esquemáticamente de
acuerdo a la reacción de la orina en que con mayor frecuencia se encuentran.
Orinas ácidas:
Cristales de ácido úrico: formas de huso y piedra de afilar, cuando se agrupan
están como rosetas o estrellas. Son amarillos a pardo rojizos.
Se encuentran fisiológicamente y están aumentados en gota, estados febriles,
nefritis crónica, litiasis úrica y procesos de intensa destrucción leucocitaria, por ejemplo
leucemia.
Cristales de oxalato de calcio: también se encuentran en orinas alcalinas. Forma de
sobres de carta. Son incoloros y brillantes.
Se encuentran fisiológicamente y abundan en sujetos con litiasis cálcicas renales y
en los vegetarianos, pues los tomates, espinacas y espárragos son ricos en ácido oxálico.
Uratos amorfos: mezcla de urato de calcio, magnesio y potasio, que forman un
sedimento visible llamado “polvo de ladrillo”.
Son propios de los estados febriles, leucemia y cirrosis hepática.
Orinas alcalinas
Fosfatos amorfos: pueden precipitar formando un sedimento blanco visible.
Se encuentran fisiológicamente y abundan en trastornos del metabolismo
fosfocálcico, como ocurre en osteopatías, hiperparatiroidismo y estado de alcalosis.
Fosfato de calcio: forma de estrellas o prismas largos, finos, agujas.
Fosfato amónico-magnésico (fosfato triple): Son incoloros y con forma de tapa de
ataúd. Se encuentran en grandes cantidades en cistitis crónicas, hipertrofia prostática,
pielitis crónica y retención vesical.
 Elementos orgánicos: en general, en un sedimento normal lo único que

aparece son células epiteliales, leucocitos y eritrocitos. Ocasionalmente, puede aparecer
algún cristal de sustancia orgánica, algún cilindro hialino, cilindroides de mucus o alguna
contaminación (partículas de talco, gotas de grasa, fibras vegetales o levaduras y
bacterias por el estacionamiento de la orina).
Células epiteliales: son planas, grandes, con citoplasma transparente y con
núcleo bien definido. Las que provienen del epitelio de la pelvis renal, uréter, vejiga o
vagina carecen de valor diagnóstico.
Células renales: son algo más grandes que un leucocito, frecuentemente
transformadas, de forma cúbica, redondeada o cónica y con un núcleo vesiculoso y de
tamaño relativamente grande. Abundan en las nefritis agudas o crónicas.
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Leucocitos: su morfología es muy variada. Es normal hallarlos hasta 3-5/campo de
observación al microscopio. Se define como piocito a un conjunto de leucocitos formando
glóbulos de membranas fusionadas. La leucocituria con piuria es indicador de infección
urinaria y es necesario efectuar un estudio bacteriológico anterior al tratamiento con
antibióticos.
Hematíes: es significativo si se encuentran hematíes deformados, incluidos en
cilindros hemáticos o en cantidad mayor de 5-6/campo.
Cilindros: representan un acúmulo de sustancias proteicas, material aglutinado
que se expulsa a la orina y tiene el contorno de la luz de los túbulos renales. Los cilindros
se constituyen en las partes distales del nefrón (túbulo distal y los vasos colectores). Esta
localización se favorece por la reabsorción de agua y la acidificación de la orina en el
túbulo contorneado distal. Luego, son arrastrados hacia la vía urinaria baja.
Hay diferentes tipos de cilindros, que son sólo modificaciones de los hialinos, a los
que se agregan otros elementos. Sólo la presencia de cilindros hialinos (hasta 1 por cada
10 campos) es fisiológica.
Cilindros hialinos: son formaciones incoloras, homogéneas, transparentes,
refringentes de lados paralelos, de extremidad redondeada (como dedo de guante) y de
tamaño variable. Están constituidos por proteínas únicamente.
Pueden aparecer en baja cantidad por causas fisiológicas como ejercicios
violentos. Pueden aparecer por causas patológicas como cuadros febriles prolongados,
glomerulonefritis y nefritis crónica.
Cilindros granulosos: son de significación patológica, apareciendo generalmente en
las nefritis agudas y crónicas. Poseen las mismas características del cilindro hialino pero
están impregnados de granulaciones finas o gruesas de material albuminosos proveniente
de la destrucción de células tubulares.
Cilindros céreos: constituyen una etapa posterior a los cilindros granulosos, tiene el
aspecto característico de la cera y un brillo mate como la parafina. Son siempre un signo
de lesión renal grave, característicos de la amiloidosis renal y glomerulonefritis crónica.
Cilindros celulares: poseen elementos celulares incluidos en el estroma proteico.
Estos son fáciles de identificar puesto que pueden contener células epiteliales, hematíes,
leucocitos, que les confiere su identidad. Abundan en la nefritis y pielonefritis.
Cristales orgánicos: su presencia es siempre patológica.
Cristales de cistina: son incoloros, brillantes, de forma hexagonal, gruesos. La
cistina es un producto intermediario del metabolismo proteico. Aparece en el sedimento
en los casos de cistinuria. Los trastornos del metabolismo proteico pueden dar origen a la
formación de cálculos renales, debido a la poca solubilidad de la cistina.
Cristales de leucina y tirosina: Los cristales de leucina se presentan como masas
esféricas de aspecto oleoso, como rueda de carro. La tirosina cristaliza en agujas finas
agrupadas en manojos. En general indican procesos graves de destrucción celular como
la cirrosis hepática, intoxicación por fósforo, fiebre tifoidea y leucemia.
Microorganismos: frecuentemente aparecen por contaminaciones exteriores. Son
de importancia diagnóstica en procesos infecciosos como cistitis. Para diagnosticar una
infección urinaria se debe hacer un examen bacteriológico de la orina (urocultivo), que
consiste en recoger orina en un frasco estéril y luego se siembra una alícuota en medios
de cultivo apropiados.
En el sedimento urinario se pueden encontrar hongos del género Cándida,
principalmente en mujeres. Son de origen vaginal, es difícil distinguirlos de los hematíes y
para ello se hacen pruebas diferenciales.
También se pueden encontrar parásitos como Trichomonas, de origen uretral o
vaginal, frecuentemente en orina de mujeres. Se distingue por el movimiento de los
flagelos que los caracteriza.
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18
ELISA
El enzimoinmunoanálisis es una de las técnicas inmunoquímicas más importantes

desarrollada en los últimos años. Los inmunoensayos sirven para detectar y cuantificar
antígenos o anticuerpos y para estudiar la estructura de los antígenos. Si el ensayo es
adecuado son rápidos y fáciles rindiendo información que sería difícil obtener utilizando
otras técnicas.
El enzimoinmunoanálisis es un método objetivo y automatizable; a diferencia del
RIA está exento de legislación restrictiva y los reactivos usados se conservan durante un
tiempo relativamente prolongado. Estas consideraciones unidas al hecho de que sólo se
necesita un equipo sencillo y económico, han llevado al desarrollo reciente de numerosos
enzimoinmunoanálisis, muchos de los cuales son especialmente adecuados para su
utilización en laboratorios pequeños y en países en desarrollo.
Nos ocuparemos ahora de un tipo de enzimoinmunoanálisis conocido como
análisis por enzimas fijadas a inmunoadsorbentes (ELISA). Esta técnica presenta
como requisito que los anticuerpos o los antígenos se puedan ligar a una enzima y que
este complejo retenga tanto la actividad inmunológica como la enzimática.
En estos ensayos, el antígeno o el anticuerpo se unen usualmente a un soporte de
fase sólida para facilitar la separación de los reactivos libres y combinados. Se ha hallado
que antígenos y anticuerpos se pueden unir covalentemente al material particulado, como
celulosa, poliacrilamida, y que también se puede obtener una adsorción pasiva
satisfactoria a tubos, perlas, discos o microplacas de nylon, poliestireno, polivinilo o
polipropileno. Como ya se ha mencionado una parte esencial del ELISA es la conjugación
del anticuerpo (o antígeno) con una enzima. Es necesario que la enzima tenga actividad
elevada, sea económica, fácil de obtener en forma pura, y que posea una reacción con el
sustrato fácilmente medible. Las enzimas consideradas hasta ahora más satisfactorias
son la peroxidasa del rábano picante, la glucosa oxidasa, la -galactosidasa y la fosfatasa
alcalina. Estas son fijadas generalmente a anticuerpos o antígenos por medio de
glutaraldehído o periodato. Los conjugados así obtenidos han demostrado ser estables
durante muchos meses, incluso años.
La elección del sustrato es crítica en el ELISA. Los sustratos deben ser estables y
solubles antes y después de la reacción enzimática. Los sustratos cromogénicos deben
ser incoloros inicialmente y fuertemente coloreados después de la degradación. Los
sustratos fluorogénicos, que producen un compuesto fluorescente, pueden ser ventajosos
para análisis de alta sensibilidad.
ELISA INDIRECTO
Si bien existen muchas formas de llevar a cabo un ELISA y se los puede clasificar
según varios criterios diferentes, describiremos el método más comúnmente utilizado,
denominado Elisa Indirecto. Este método es ampliamente utilizado para la determinación
de anticuerpos (Ac). La técnica es la siguiente:
1) El antígeno (Ag) correspondiente se adsorbe a las placas de poliestireno, y luego
se lavan.
2) Las muestras a ensayar se incuban en las concavidades y las placas se lavan
nuevamente; el anticuerpo presente reacciona con el antígeno inmovilizado en la
superficie de las concavidades.
3) El conjugado de antiinmunoglobulinas humana marcado con enzima se incuba
en las concavidades; éste reacciona con cualquier anticuerpo "capturado” en el paso
anterior. El exceso de reactivo se lava.
4) Se agrega el sustrato enzimático y las placas se incuban; la velocidad de la
degradación se indica por el cambio de color, que es proporcional a la concentración de
anticuerpo de las muestras del paso (2).
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5) Se detiene la reacción y la intensidad del color se estima visualmente o se mide
en un espectrofotómetro.
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TP 17
Curvas de consumo de oxígeno –

Casos clínicos
SÍNTESIS DE ATP Y CADENA RESPIRATORIA
En las células eucariontes, la síntesis de ATP acoplada a la cadena de transporte de

electrones, fosforilación oxidativa, ocurre en la membrana interna de las mitocondrias. Dicha
síntesis de ATP depende de un proceso quimiosmótico. Los electrones de alta energía de los
hidrógenos del NADH y el FADH2 (compuestos con una baja tendencia a reducirse) son cedidos a
un compuesto con menor energía (alto potencial de reducción). La energía liberada en su paso de
un transportador a otro (pares rédox), es utilizada para bombear protones a través de la
membrana interna desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana. Esto genera un
gradiente electroquímico de protones a través de la membrana mitocondrial interna y
aprovechando dicho gradiente, éstos vuelven a la matriz a través de la H +ATPsintasa que cataliza
la fosforilación del ADP para dar ATP, en un proceso a favor de gradiente.
La teoría quimiosmótica predice la existencia de un gradiente de pH transmembrana. Esto
se puede comprobar experimentalmente. Cuando se agrega un sustrato oxidable (succinato, por
ejemplo) y O2 a una suspensión de mitocondrias aisladas, se puede detectar la acidificación del
medio. Las determinaciones estequiométricas indican que cuando se transfiere un par de
electrones a partir del NADH a través del complejo I se translocan 4 H+ y los complejos III y IV
translocan 6 H+ entre ambos. Además, se ha detectado que por cada ATP sintetizado se toman 3
ó 4 H+ del espacio intermembrana. Cuando se intenta calcular la relación P/O no da un número
exacto y actualmente se considera que el rendimiento de la cadena respiratoria acoplada a la
fosforilación oxidativa es de 2,5 moles de ATP cuando se oxida un mol de NADH y de 1,5
moles de ATP cuando se oxida un mol de FADH2.
En mitocondrias normales la reacción de oxidación del sustrato respiratorio (NADH o
succinato) depende de la presencia de ADP y Pi. En condiciones fisiológicas, la matriz
mitocondrial contiene alta concentración de Pi, de manera que la concentración de ADP es la
reguladora de la actividad del sistema de transporte de electrones y, por lo tanto, de la
respiración mitocondrial.
La funcionalidad de la cadena de transporte de electrones y fosforilación oxidativa
mitocondriales pueden ser evaluadas midiendo la concentración de oxígeno presente en una
suspensión de mitocondrias intactas y/o la concentración de ATP del medio a lo largo del tiempo
en diferentes condiciones. El gráfico obtenido se denomina trazado polarográfico. Los trazados
polarográficos de mitocondrias intactas permiten comprobar que en ausencia de ADP la actividad
es limitada, mientras que después de añadir ADP la respiración se activa a niveles que pueden
alcanzar hasta 20 veces el valor obtenido en ausencia del mismo. Una vez que el ADP adicionado
ha sido totalmente convertido en ATP, la actividad respiratoria retorna a un nivel muy próximo al
inicial. Al estado metabólico caracterizado por la presencia de sustrato oxidable, en ausencia de
ADP y consumo de oxígeno lento se lo denomina “estado controlado” o estado “4”. La adición de
ADP establece un consumo de oxígeno rápido, y por ello a este estado se lo denomina “estado
activado” o estado “3”, que se mantiene hasta que todo el ADP ha sido fosforilado a ATP,
produciéndose entonces un retorno al estado “4”. El cociente entre las pendientes de consumo de
oxígeno en estado ”3” y en estado “4” se denomina índice de control respiratorio y es la expresión
del control que ejerce el ADP sobre el transporte de electrones mitocondrial. El fenómeno de
control respiratorio es de máxima importancia en la regulación fisiológica de la respiración celular.
El índice de control respiratorio y el índice P:O son utilizados para expresar el grado de
acoplamiento entre los procesos de oxidación y fosforilación. Bajos valores de estos índices
indican mitocondrias desacopladas o dañadas. El acoplamiento de los procesos de transporte de
electrones y de síntesis de ATP pueden ser modificados por agentes químicos y por alteración
física de la membrana mitocondrial.
A continuación, se muestran el esquema correspondiente a la cadena de transporte de
electrones acoplada a la fosforilación oxidativa y polarogramas típicos de [O2]= f (tiempo) y
[ATP] = f (tiempo), cuando se tiene una suspensión mitocondrial en presencia de un sustrato
oxidable y ADP.
1
ADP
[ ATP ]
[ O2 ]
ADP
tiempo tiempo
Teniendo en cuenta conocimientos básicos de reacciones rédox y de la cadena de

transporte de electrones, responder las siguientes preguntas:
a) ¿Cuáles pueden ser los sustratos oxidables para las curvas ejemplificadas?
b) ¿Cómo se modificarían las curvas ejemplificadas cuando a la suspensión
mitocondrial se agregan sucesivamente:
i. Malato, ADP, rotenona?
ii. Malato, ADP, antimicina?
iii. Succinato, ADP, rotenona?
iv. Succinato, ADP, antimicina?
v. Malato, ADP, dinitrofenol?
vi. Malato, ADP, cianuro?
vii. Succinato, ADP, oligomicina?
viii. Succinato, ADP, oligomicina, dinitrofenol?
ix. Succinato, ADP, dinitrofenol, oligomicina?
2
x. Malato, ADP, antimicina, dinitrofenol?
xi. Malato, ADP, dinitrofeno, antimicina?
xii. Succinato, ADP, oligomicina, cianuro?
xiii. Succinato, ADP, cianuro, oligomicina?
xiv. Succinato, ADP, rotenona, 2,4 dinitrofenol y cianuro?
xv. Malato, ADP, cianuro, oligomicina y 2,4 dinitrofenol?
xvi. Malato, ADP, oligomicina, 2,4 dinitrofenol y cianuro?
c) Sabiendo que por cada mol de NADH + H+ que ingresa a la cadena respiratoria, la
fosforilación oxidativa acoplada produce aproximadamente 2,5 moles de ATP y se
consume medio mol de oxígeno, prediga la cantidad de ATP formado y de oxígeno
consumido para los siguientes procesos (considerar GTP = ATP):
i. Transformación de -cetoglutarato en succinato
ii. ídem i en presencia de 2,4 dinitrofenol
iii. transformación de isocitrato en succinato
iv. transformación de succinato en oxaloacetato
v. ídem iv en presencia de rotenona
3
CASOS CLÍNICOS
I - Infarto de miocardio
Un hombre de 55 años se sintió mal después de almorzar, quejándose de dolor de
estómago y pecho. Se retiró a su domicilio a descansar y al fumar un cigarrillo se sintió
peor. Fue al hospital, donde se le indicó una radiografía de tórax, un electrocardiograma
(ECG) y se le determinaron enzimas séricas.
El trazado del ECG fue anormal por lo que se internó al paciente de inmediato.
Las enzimas CPK, LDH, GOT y GPT estaban elevadas.
Había sufrido un infarto de miocardio.
El infarto de miocardio se produce como consecuencia de una obstrucción en
alguna rama de la circulación coronaria. El flujo de sangre disminuye y como
consecuencia se produce isquemia. La falta de oxigenación produce necrosis celular de la
parte del tejido con defecto de irrigación.
Cuestionario
1) ¿Cuáles son los efectos de la anoxia sobre...
a) la respiración celular?
b) la relación NAD+/NADH intramitocondrial?
c) la cadena de transporte de electrones?
d) la síntesis de ATP?
e) la velocidad del ciclo de Krebs?
f) el pH del tejido?
2) ¿Por qué al romperse las células del miocardio la enzima succinato deshidrogenasa es
la única enzima del ciclo de Krebs que no se detecta en plasma?
3) ¿Por qué el cigarrillo empeoró la situación del paciente? (hay que tener en cuenta que
la nicotina es vasoconstrictora).
II - Intoxicación con aspirina

Un niño de 5 años ingresa al hospital presentando fiebre de causa desconocida y
aumento de la frecuencia respiratoria. Del interrogatorio a la madre surge que el niño
había tomado aspirinetas (ácido acetilsalicílico, AAS) en dosis superiores a las toleradas
para su edad.
Los exámenes de laboratorio dieron los siguientes resultados
PACIENTE NORMAL
pH 7,3 7,38-7,42
pCO2 (mm Hg) 55 35
PO2 (mm Hg) 50 88
Cuestionario:
1) Dibuje el trazado polarográfico de las mitocondrias del músculo de este paciente.
2) ¿Cuál es el efecto de las cantidades tóxicas de AAS sobre...
a) la cadena de transporte de electrones?
b) la fosforilación oxidativa?
c) la velocidad del ciclo de Krebs?
3) ¿A qué se debe el aumento de la pCO2 y la disminución de la pO2 del paciente?
4) ¿A qué se debe el aumento de la frecuencia respiratoria?
4
III - Infección bacteriana
Una mujer de 34 años ingresa al servicio de emergencia de un hospital
presentando dolor agudo de abdomen de 20 horas de evolución. Se le diagnostica una
infección con bacterias Gram negativas, productoras de endotoxinas. El análisis de
laboratorio de una muestra de sangre arrojó los siguientes resultados:
PACIENTE NORMAL
Piruvato (mM) 3,5 30-60
Lactato (mM) 26,8 0,5-18
Diferencia arterio-venosa de O2 (vol) 0,5 5
Se realizaron los trazados polarográficos de la función mitocondrial del tejido
muscular (normal: A; de la paciente: B) y se obtuvieron los siguientes resultados:
A
Cuestionario:
1) ¿Qué conclusión se puede sacar de la acción de la endotoxina sobre la cadena de
transporte de electrones? ¿A qué nivel de la misma ejerce su acción? Justifique.
2) ¿Cuál será el efecto de la endotoxina sobre la fosforilación oxidativa? ¿Y sobre la
velocidad del ciclo de Krebs?
3) ¿A qué se debe la disminución de la diferencia arterio-venosa de O2?
4) ¿A qué se deben las concentraciones de piruvato y lactato hallados en la sangre del
paciente?
5
Metabolismo de la fenilalanina –
Productos especializados de aminoácidos
Objetivos de la clase:
•Identificar el origen aminoacídico de ciertas sustancias de importancia biológica
•Reconocer la enzima clave en la conversión de aminoácidos en productos
especializados
•Identificar los cofactores necesarios en la conversión de los aminoácidos en
productos especializados
•Reconocer las enfermedades congénitas relacionadas con las vías metabólicas
involucradas en la conversión de aminoácidos en productos especializados
Los aminoácidos, además de ser componentes esenciales de las proteínas, son
precursores de otros compuestos relevantes tales como porfirinas, fosfolípidos,
catecolaminas, hormonas, ácido nicotínico, melanina, creatina, carnitina, poliaminas y
muchos otros. Enunciamos esta larga lista de compuestos para hacer hincapié en la
importancia de los aminoácidos en el metabolismo intermedio. A continuación,
analizaremos algunos de estos compuestos en particular.
1. Síntesis de catecolaminas (adrenalina-noradrenalina y dopamina) a partir

de FENILALANINA y TIROSINA.
En condiciones normales, casi toda la fenilalanina se convierte tirosina por
hidroxilación en posición 4. Esta hidroxilación es catalizada por una oxigenasa de función
mixta denominada fenilalanina hidroxilasa que utiliza tetrahidrobiopterina como coenzima.
La tirosina es sustrato de la enzima tirosinasa, enzima con dos actividades ya que
actúa como tirosina hidroxilasa y dopa oxidasa.
La actividad de tirosina hidroxilasa es similar a la de la fenilalanina hidroxilasa ya
que también requiere tetrahidrobiopterina. Por esta reacción, la tirosina se hidroxila para
dar L-Dopa.
La L-Dopa puede ser oxidada por la actividad de dopa oxidasa, segunda actividad
de la tirosinasa, para dar dopaquinona. Luego de una serie de reacciones, la dopaquinona
se convierte en varios tipos de pigmentos de melanina, que se encuentra en varios
tejidos, particularmente en los ojos, el pelo y la piel. La melanina es sintetizada en los
melanocitos. Su función es proteger a las células de los efectos dañinos de los rayos
ultravioletas.
La L-Dopa también puede ser descarboxilada por una descarboxilasa que requiere
de fosfato de piridoxal como cofactor, para dar dopamina. La dopamina se hidroxila en la
cadena lateral para dar noradrenalina (norepinefrina) por una β-hidroxilasa de dopamina.
Finalmente, la noradrenalina se metila para dar adrenalina (epinefrina) por acción de una
metiltransferasa que utiliza SAM como dador de grupos metilos.
Tirosinasa: enzima con dos actividades: tirosina hidroxilasa y dopa oxidasa

tirosina hidroxilasa da dopa
dopa oxidasa da dopaquinona
1
La adrenalina y la noradrenalina se metabolizan a ácido vainillín-mandélico en un

proceso que involucra la participación de dos enzimas: la catecol-o-metiltranferasa
(COMT) y la monoaminoxidasa (MAO). Los niveles de urinarios de ácido vainillín-
mandélico son un indicio de la producción de catecolaminas en las células cromafines de
médula adrenal y en el sistema nervioso simpático.
2
Patologías asociadas al metabolismo de la fenilalanina

Cuando hay un defecto en la reacción catalizada por la fenilalanina hidroxilasa, la
fenilalanina se acumula en la sangre y se equilibra con su producto de transaminación,
fenilpiruvato. Este compuesto en parte se excreta y también se convierte en fenilactato y
fenilacetato por reducción y descarboxilación oxidativa respectivamente. Estos productos
son excretados en la orina.
El defecto en la reacción catalizada por la fenilalanina hidroxilasa se denomina
fenilcetonuria. Su nombre deriva de la presencia de niveles aumentados de ácido
fenilpirúvico (una fenil-cetona) en la orina. También se encuentran aumentados los niveles
de fenilactato.
El fenilpiruvato puede detectarse en la orina a través de la formación de un
producto de color verde cuando reacciona con cloruro férrico, aunque otros compuestos
dan color similar. Por lo tanto, para mayor especificidad debe ser detectado en sangre.
En algunos casos, la fenilcetonuria produce síntomas neurológicos severos que se
atribuyen a efectos tóxicos de la fenilalanina que competiría por el transporte y
metabolismo de otros aminoácidos aromáticos en el sistema nervioso.
La tirosina se degrada por una vía principal, pero también sigue otras vías
minoritarias de gran importancia fisiológica. La vía principal ocurre en el hígado donde
comienza con su transaminación a p-hidroxifenilpiruvato. La aminotransferasa es una
enzima inducible, cuyos niveles aumentan considerablemente en animales tratados con
tirosina o con glucocorticoides. La oxidación del p-hidroxifenilpiruvato es compleja. Una
3
única enzima agrega los átomos del O2 al carbono α de cadena lateral y al carbono del
anillo que lleva unida esta cadena lateral. La enzima contiene Fe2+ que se mantiene en
estado reducido por el ácido ascórbico. La oxidación del grupo carbonilo a carboxilo se
acompaña de la descarboxilación del grupo ácido. Para acomodar el nuevo grupo OH, la
cadena lateral, ahora más corta, se transfiere a un carbono adyacente. El producto se
denomina homogentisato. Otra oxigenasa que contiene hierro cataliza la ruptura del anillo
aromático agregando átomos de oxígeno a los C1 y C2. La configuración cis del doble
enlace del compuesto generado le da su denominación como maleil-acetoacetato. Este
doble enlace se isomeriza a fumaril-acetoacetato en una reacción en la que participa una
isomerasa que requiere glutation. La hidrólisis de este compuesto produce fumarato (un
intermediario del Ciclo de Krebs) y acetoacetato (un cuerpo cetónico). Por lo tanto, la
fenilalanina y la tirosina son aminoácidos tanto glucogénicos como cetogénicos.
La alcaptonuria es otra enfermedad congénita que se produce por un déficit de la

enzima que degrada el homogentisato, que en exceso se elimina por orina y se oxida por
el oxígeno del aire, formando un pigmento de color negro llamado alcaptona.
El albinismo es una condición genética en la que hay una ausencia congénita de

pigmentación (melanina) de ojos, piel y pelo en los seres humanos y animales. Hay
diferentes tipos y causas de albinismo. Una de ellas es la deficiencia de la actividad de
dopa hidroxilasa en la enzima tirosinasa que provoca una falta de producción de
melanina.
4
2. Síntesis de óxido nítrico (NO) a partir de L-ARGININA

Además de ser sustrato de la enzima arginasa que cataliza la síntesis de urea, la L-
arginina es precursora del óxido nítrico (NO). Esta molécula biatómica de naturaleza
gaseosa es un radical libre, producido por diferentes tipos celulares y con una gran
variedad de funciones. Entre estas funciones, el NO es un agente relajante del endotelio
vascular, una molécula de señalización en células del sistema nervioso y, en altas
concentraciones, un agente citotóxico liberado por macrófagos activados. La enzima óxido
nítrico sintasa (NOS) cataliza la reacción en la que se produce NO y citrulina a partir de L-
arginina. La coenzima que participa en esta reacción es el NADPH y algunas isoformas de
NOS requieren también de Ca2+/calmodulina.
5
3. Síntesis de γ-aminobutirato (GABA) a partir de GLUTAMATO
El ácido γ-aminobutírico (GABA) es el principal neurotransmisor inhibitorio del
sistema nervioso central. La enzima glutamato descarboxilasa cataliza la remoción del
grupo γ-carboxilo del glutamato y la consecuente síntesis de GABA. Esta reacción ocurre
principalmente en el cerebro. En su metabolización, el GABA se transamina con α-
cetoglutarato por la enzima GABA transaminasa y finalmente forma succinato, que puede
ingresar al ciclo de Krebs.
6
4. Síntesis de S-adenosilmetionina (SAM) a partir de METIONINA
La S-adenosilmetionina (SAM) es un cofactor en reacciones de transferencia de
metilos (metiltransferasas) y en reacciones de descarboxilación. Se sintetiza a partir de
metionina, que se activa con ATP en una reacción catalizada por la metionina
adenosiltransferasa. En esta reacción los grupos fosfato del ATP se eliminan (uno como
fosfato (Pi) y los otros dos como pirofosfato (PPi)), dejando libre el C-5' de la ribosa que
forma parte del ATP. Este C de la ribosa se une con el átomo de azufre de la metionina.
El producto resultante, la S-adenosilmetionina es una molécula muy reactiva debido a la
carga positiva sobre el azufre. Existen reacciones en las que se transfiere el grupo metilo,
fragmentos de tres o cuatro carbonos del resto de la estructura de la metionina o el grupo
adenosilo a aceptores específicos. En cada caso quedan otros dos sustituyentes en el
tioéter.
Las reacciones más importantes en las que interviene la S-adenosilmetionina son
las catalizadas por metiltransferasas. En cada uno de estos casos, luego de ceder el
grupo metilo, la SAM se transforma en S-adenosilhomocisteína, cuya hidrólisis produce
adenosina y homocisteína. Los destinos posibles de la homocisteína son:
a) ser metilada por el N5-metil-H4 folato para producir metionina (ver figura)
b) reaccionar con serina para producir cisteína
c) ser hidrolizada a α-cetobutirato, amoníaco y ácido sulfhídrico
La SAM puede ser descarboxilada por una enzima específica que da como
producto S-adenosil-metiltiopropilamina. Este compuesto es el dador del fragmento de 3C
utilizado para la síntesis de poliaminas. La síntesis de poliaminas requiere una enzima
llamada ornitina descarboxilasa. Las poliaminas son altamente catiónicas y se unen
fuertemente a los ácidos nucleicos y a otros polianiones. Entre otras funciones, son
esenciales para la función de las topoisomerasas. Esto podría explicar el incremento
temprano de la actividad de ornitina descarboxilasa durante la división celular.
7
Reacciones en las cuales interviene la SAM
Precursor Producto metilado
noradrenalina adrenalina
guanidinoacetato creatina
nucleótidos nucleótidos metilados
fosfatidiletanolamina fosfatidilcolina
acetilserotonina melatonina
5. Síntesis de taurina a partir de CISTEÍNA

A partir de cisteína se sintetiza taurina, que es utilizada para formar los conjugados
de ácidos biliares taurocolato y taurodesoxicólico.
Otro producto obtenido a partir del catabolismo de la cisteína es el sulfato. Aunque
la mayor parte del sulfato se excreta, una parte se utiliza como componente de diversos
elementos estructurales como proteínas, polisacáridos y lípidos. Por otra parte, muchos
compuestos se eliminan como ésteres de sulfato. Entre estos, los metabolitos de las
hormonas esteroideas se eliminan en la orina. Estos compuestos sulfatados se forman a
partir de la transferencia de sulfato desde un nucleótido transportador, el PAPS
(3'Fosfoadenosina-5'-fosfosulfato (PAPS) que se sintetiza en dos etapas:
ATP sulfurasa, Mg
2-
Adenosina-5 ´- fosfosulfato (AMPS) + PPi
SO4 + ATP
AMPS tioquinasa, Mg
AMPS + ATP PAPS + ADP
El PAPS se utiliza en reacciones que involucran la transferencia de sulfato a

diversas moléculas, por ejemplo, a los azúcares de los glicoesfingolípidos o
galactocerebrósidos.
6. Síntesis de colina a partir de SERINA.

La colina es un precursor de acetilcolina. Proviene principalmente de la dieta,
aunque una parte puede sintetizarse a partir del aminoácido serina, mediante dos
reacciones: una descarboxilación (que da etanolamina) seguida de una metilación (se
forma trimetil etanolamina o colina)
8
La colina reacciona con acetil-CoA y forma acetil-Colina. Esta reacción es
catalizada por la enzima colina acetil transferasa.
7. Síntesis de carnitina a partir de LISINA y METIONINA

La carnitina es esencial para el ingreso de los ácidos grasos a la mitocondria para
su posterior oxidación, proceso en el que intervienen las enzimas CAT1 y CAT2. La
carnitina se sintetiza en hígado y riñón, a partir de los aminoácidos lisina y metionina. La
síntesis de carnitina requiere ácido ascórbico, niacina, fosfato de piridoxal y hierro. Los
músculos esquelético y cardíaco dependen de la carnitina proveniente de los hepatocitos
o de la dieta. El músculo esquelético contiene cerca del 97% de la carnitina corporal.
9
8. Síntesis de creatina a partir de GLICINA y ARGININA
La síntesis de creatina comienza en el riñón y se completa en el hígado. En el
primer paso, la glicina se combina con arginina para formar guanidinoacetato. En esta
reacción, el grupo guanidino de la arginina (el grupo que también forma urea), se
transfiere a la glicina y lo que queda de la molécula de arginina se libera como ornitina. El
guanidino acetato se metila luego en el hígado, utilizando SAM, para formar creatina. La
creatina se transporta a través del torrente sanguíneo particularmente al músculo y
cerebro, donde reacciona con ATP para formar creatina-fosfato. Las células pueden usar
creatina-fosfato para regenerar ATP a partir de ADP por lo cual esta molécula desempeña
un rol muy importante en el músculo durante el ejercicio. La creatina-fosfato es un
compuesto inestable que se recicla espontáneamente formando creatinina, que no puede
ser metabolizada y es excretada por orina y representa un buen indicador de la función
renal.
9. Síntesis de histamina a partir de HISTIDINA

La histamina es un mensajero químico que media una gran variedad de respuestas
celulares, incluidas reacciones alérgicas e inflamación. Es un potente vasodilatador,
regula la secreción de ácido clorhídrico en el estómago y controla ciertos procesos
neurológicos en zonas particulares del cerebro. La histamina se sintetiza a partir de
histidina en una reacción catalizada por la enzima histidina descarboxilasa que requiere
de fosfato de piridoxal como cofactor.
10
10. Síntesis de serotonina a partir de TRIPTOFANO
La serotonina o 5-hidroxitriptamina se sintetiza y almacena en diversos tejidos, pero
la mayor cantidad de serotonina se encuentra en las células de la mucosa intestinal. Se
sintetiza a partir del triptofano en una reacción catalizada por una hidroxilasa similar a la
fenilalanina hidroxilasa, dando como producto 5-hidroxitriptofano, que se descarboxila
para formar 5-hidroxitriptamina o serotonina. La serotonina está involucrada en diversos
procesos tales como la percepción del dolor, trastornos afectivos y regulación del sueño,
regulación de la temperatura corporal y de la presión sanguínea.
11. Síntesis de melatonina a partir de SEROTONINA

La melatonina o N-acetil-5-
metoxitriptamina se produce principalmente en
la glándula pineal y regula una gran cantidad
de procesos celulares, neuroendócrinos y
neurofisiológicos. Sus niveles varían de
manera significativa, con niveles más altos
durante la fase nocturna que en la diurna. Por
tal motivo, se la considera como una de las
principales hormonas que participa en la
regulación de los ritmos circadianos.
Su síntesis se inicia a partir de
serotonina por acción de la N-acetil-
transferasa, cuyos niveles se regulan por la
luz ambiental, siendo más activa durante la
noche. La síntesis finaliza con la acción de la
enzima hidroxi-indol-O-metiltransferasa que
da como producto melatonina.
11
12. Síntesis de niacina a partir de TRIPTOFANO
La niacina se sintetiza en el hígado a partir del aminoácido triptófano. La síntesis
requiere tiamina, riboflavina y fosfato de piridoxal. La síntesis es sumamente ineficiente ya
que se requieren unos 60 mg de triptofano para sintetizar 1 mg de niacina. La niacina se
activa al combinarse con adenina para formar NAD+ y NADP+, importantes coenzimas en
procesos rédox.
13. Síntesis de glutation a partir de GLUTAMATO, CISTEINA, GLICINA

El γ-glutamil-cisteinil-glicina o glutation es un tripéptido
no proteinogénico que se sintetiza en dos etapas, a partir de
la unión amida no peptídica entre el carboxilo γ del ácido
glutámico y la cisteína, catalizada por la enzima γ-glutamil-
cisteína sintasa y la unión posterior de la glicina por la
enzima glutatión sintasa. La presencia de cisteína le confiere
al glutation un grupo sulfhidrilo de gran importancia para la
participación del glutatión en procesos rédox. El glutation
participa en numerosas reacciones celulares, entre ellas, es
responsable de mantener los sulfhidrilos proteicos reducidos,
participa en la síntesis de desoxinucleótidos, y detoxifica
peróxidos, entre otras funciones.
14. Síntesis de porfirinas y grupo HEMO a partir de GLICINA

Las porfirinas son compuestos cíclicos con gran afinidad por iones metálicos, en
particular Fe2+ y Fe3+. La metaloporfirina más abundante es el grupo hemo. El grupo hemo
se sintetiza principalmente en el hígado y en las células madre de la médula ósea que
darán origen a los eritrocitos. Todos los átomos de la molécula de porfirina provienen de
dos moléculas sencillas: la glicina y el succinil-CoA que se condensan en una reacción
catalizada por la enzima delta aminolevulínico sintasa, que requiere de fosfato de piridoxal
como cofactor. El grupo hemo está presente en una gran cantidad de proteínas, tales
como la hemoglobina, la mioglobina, los citocromos, la catalasa, y la pirrolasa del
triptofano.
15. A partir de glutamina, glicina y aspártico se sintetizan nucleótidos

Los aminoácidos glutamina, glicina y aspártico son precursores en la síntesis de
novo de los nucleótidos de purina, en tanto que la glicina y el aspártico lo son en la
síntesis de nucleótidos de pirimidina. Los aminoácidos aportan carbonos y nitrógenos
para la formación de los anillos de purina y pirimidina.
16. Taurina y glicina participan en la síntesis de ácidos biliares

Estos aminoácidos se combinan con los ácidos biliares para aumentar su
solubilidad en la bilis.
12
CUADRO RESUMEN DE PRODUCTOS ESPECIALIZADOS DE AMINOACIDOS
PRODUCTO
AMINOÁCIDO FUNCIÓN DEL PRODUCTO ESPECIAL
ESPECIAL
CATECOLAMINAS NEUROTRANSMISORES
FENILALANINA
MELANINAS PIGMENTOS
COFACTOR PARA LAS METILACIONES
METIONINA SAM
SÍNTESIS DE POLIAMINAS
LISINA +
CARNITINA TRANSPORTE DE ÁCIDOS GRASOS
METIONINA
SERINA ACETILCOLINA NEUROTRANSMISOR
METABOLISMO ENERGÉTICO MUSCULAR

GLICINA + (CPK)
CREATINA
ARGININA SE DEGRADA A CREATININA (INDICADOR
DE LA FUNCIÓN RENAL)
VÍA Rc H1: INFLAMACIÓN Y

HISTIDINA HISTAMINA NEUROTRANSMISIÓN
VIA Rc H2: SECRECIÓN DE HCl
GLUTAMATO GABA NEUROTRANSMISOR
SEROTONINA NEUROTRANSMISOR
TRIPTOFANO MELATONINA PINEAL -SUEÑO/VIGILIA
NAD COFACTOR REDOX
ARGININA NO VASODILATACION
GLUTAMATO +
CISTEINA + GLUTATION ANTIOXIDANTE
GLICINA
GLICINA HEMO HEMOPROTEÍNAS
GLICINA,
ASPARTATO, NUCLEÓTIDOS ARN - ADN
GLUTAMINA
TAURINA Y TAURO Y CONJUGACIÓN HEPÁTICA DE ÁCIDOS
GLICINA GLICOCONJUGADOS BILIARES
13
CUESTIONARIO DE PRODUCTOS ESPECIALIZADOS DE AMINOÁCIDOS
1) ¿Qué características tiene el óxido nítrico (NO)? ¿En qué procesos
fisiológicos o patológicos participa? ¿Qué funciones tiene? ¿En qué tejidos se produce?
2) Escriba la reacción enzimática que genera NO, nombrando sustratos,
productos, enzimas y cofactores involucrados.
3) Escriba la estructura del GABA. ¿De qué clase de molécula se trata? ¿Cuál
es su función y en qué tejidos se produce?
4) ¿De qué aminoácido deriva el GABA, qué tipo de reacción lo genera y cuál
es la enzima involucrada en su síntesis?
5) ¿Qué función tiene la S-adenosilmetionina? ¿En qué reacciones participa?
¿A partir de qué moléculas se sintetiza?
6) ¿Qué función tiene la taurina y de qué aminoácido deriva?
7) ¿Qué grupo funcional se genera del metabolismo de la cisteína? ¿En qué
reacciones participa? ¿Qué función tiene su agregado a diferentes moléculas?
8) Un paciente con un tumor de médula adrenal presenta palpitaciones,
sudoración excesiva y dolores de cabeza por hipertensión. Su orina contiene cantidades
elevadas de ácido vainillínmandélico. ¿Al aumento de qué metabolito podrían atribuirse
estos síntomas?
9) ¿Qué función tiene la 5-hidroxitriptamina (serotonina)? ¿A partir de qué
aminoácido se sintetiza? ¿En qué tipo de reacción?
10) ¿Qué es la creatinina? ¿Qué función tiene? ¿A partir de qué aminoácidos se
sintetiza?
11) ¿Qué neurotransmisores son catecolaminas? ¿A partir de qué aminoácido
se forman?
12) ¿Qué papel juega la S-adenosilmetionina en la síntesis de catecolaminas?
13) Un pequeño número de niños que padecen fenilcetonuria presentan una
actividad de fenilalanina hidroxilasa normal, pero al consumir dietas normales acumulan
fenilalanina y otros metabolitos, incluyendo fenilpiruvato, fenillactato y fenilacetato.
También tienen altos niveles de tetrahidrobiopterina quinoide (forma oxidada de la
coenzima).
a) Indique cual podría ser la enzima deficiente
b) Escriba brevemente las vías para la formación de los metabolitos de fenilalanina
en estos pacientes.
14) ¿Por qué los pacientes de fenilcetonuria deben evitar el consumo de
aspartame?
Aspartame: L-aspartil-L-fenilalanina metil éster
15) ¿Cuál es el déficit enzimático en la alcaptonuria? ¿Qué metabolitos se
acumulan? ¿Por qué? ¿Qué consecuencias tiene?
16) ¿Qué es la melanina? ¿Qué función tiene? ¿A partir de qué aminoácido se
sintetiza?
17) Para los siguientes compuestos indique: a) los aminoácidos de los que
derivan, b) su función, c) el tipo de reacción en la que se forman.
i) Histamina
ii) Melatonina
iii) Niacina
18) ¿Qué es el glutation? ¿A partir de qué aminoácidos se sintetiza? ¿Qué
función tiene?
14
Catabolismo del hemo -

Ictericias
HEMOPROTEÍNAS
El conocimiento de la bioquímica de las porfirinas y el grupo hemo es fundamental

para la comprensión de las diversas funciones de las hemoproteínas en el organismo, y
patologías asociadas a las mismas.
Las porfirinas son compuestos cíclicos formados por la unión de cuatro anillos
pirrólicos enlazados por puentes metenilo (-HC=). Ejemplo son las ferroporfirinas tales
como el hemo, que se encuentra conjugado a las proteínas formando las hemoproteínas.
Entre ellas están las hemoglobinas, mioglobinas, citocromos y catalasas.
Hemoglobina
Está constituida por una ferroporfirina unida a la proteína globina. Esta proteína
conjugada posee la propiedad de combinarse de manera reversible con el oxígeno. Sirve
como medio de transporte del oxígeno en la sangre. La estructura y función de esta
hemoproteína ya fue descripta en detalle en clases anteriores. (Estructura de proteínas)
Mioglobina
Es un pigmento respiratorio que existe en las células musculares de los
vertebrados e invertebrados. Una molécula de mioglobina es semejante a una subunidad
de hemoglobina. También se combina con el oxígeno. La estructura y función de esta
hemoproteína ya fue descripta en detalle en clases anteriores. (Estructura de proteínas)
Citocromos
Son compuestos que actúan como agentes de transferencia de electrones en las
reacciones de oxidorreducción. Varios ejemplos se citaron en clases anteriores (Cadena
de Transporte de Electrones). Otras funciones: participa en el metabolismo de
xenobióticos en el hígado y en la hidroxilación de hormonas esteroideas en el proceso de
síntesis y degradación.
Catalasa
Enzima con porfirina férrica que degrada al peróxido de hidrógeno. Se detalló su
función en clases anteriores (Toxicidad del Oxígeno).
CATABOLISMO DEL HEMO

En condiciones funcionales, en el adulto humano se destruyen 1 a 2 x108 eritrocitos
cada hora. Cuando la hemoglobina es catabolizada, la porción proteínica globina puede
ser usada nuevamente como tal o bajo la forma de sus aminoácidos constituyentes. El
hierro del grupo hemo entra a la fuente común de hierro para también ser reutilizado. Sin
embargo, la porción porfirínica es degradada y eliminada.
Al envejecer, los sistemas metabólicos de los hematíes se hacen menos activos y
más frágiles; en este momento la célula se rompe al pasar a través de un punto estrecho
de la circulación, lo que ocurre principalmente en el bazo. La hemoglobina liberada es
fagocitada casi de inmediato por los macrófagos en muchas partes del organismo,
especialmente en las células de Kupffer hepáticas, y en macrófagos en el bazo y médula
ósea.
1
La hemo-oxigenasa actúa sobre la hemoglobina formando cantidades equimolares

de monóxido de carbono, hierro y biliverdina. El complejo enzimático, hemo-oxigenasa,
es inducible, por lo cual acelera su velocidad cuando hay exceso de hemo circulante.
Como se detalle en el esquema que figura más arriba, para que ocurra la reacción es
necesaria la presencia de oxígeno y NADPH.
Posteriormente la biliverdina, es convertida en bilirrubina no conjugada por
acción de la enzima biliverdina reductasa. El otro producto resultante de la degradación
del hemo, el hierro, es liberado a la sangre, y es transportado por la transferrina a la
medula ósea para la formación de nueva hemoglobina y producción de nuevos hematíes,
o al hígado y otros tejidos para almacenarlo unido a ferritina.
Se calcula que 1 g de hemoglobina rinde 35 mg de bilirrubina. La formación diaria
de bilirrubina en el ser humano adulto es aproximadamente de 250-350 mg.
METABOLISMO DE LA BILIRRUBINA
La transformación de los anillos pirrólicos del grupo hemo en bilirrubina implica una
serie de transformaciones bioquímicas absolutamente esenciales para su excreción.
2
Aproximadamente el 80% de la bilirrubina proviene de la destrucción diaria de los
glóbulos rojos. El otro 20% proviene de una eritropoyesis inefectiva de la médula ósea y
en el hígado de las enzimas microsómicas P450 y citocromo b5.
Una vez sintetizada, la bilirrubina debe ser excretada, proceso que involucra varios
pasos.
1) Transporte de la bilirrubina
El proceso descripto arriba genera la bilirrubina libre o no conjugada, también
denominada indirecta por el modo en que se determina su concentración en sangre. Esta
forma de bilirrubina es apolar, insoluble en agua y lipofílica, por lo que no circula libre en
sangre sino unida a la albúmina. Normalmente en estas condiciones no atraviesa la
barrera hematoencefálica. Por circulación unida a la albúmina la bilirrubina no conjugada,
libre o indirecta llega a la membrana sinusoidal del hepatocito.
Cuando la cantidad de bilirrubina supera la capacidad de unión de la albúmina
puede circular bilirrubina no conjugada no unida a la albúmina. Esto puede ocurrir porque
la concentración de bilirrubina es muy alta (a partir de los 4-5 mg/dl), porque la
concentración de albúmina es baja (hipoalbuminemia) o por la presencia de sustancias y
3
factores que desplazan o debilitan la unión de la bilirrubina con la albúmina. La presencia
de bilirrubina no conjugada no unida a la albúmina es siempre anormal y lleva al pasaje al
SNC y eventual daño del cerebro.
2) Captación de la bilirrubina por las células del parénquima hepático

La bilirrubina circulante es captada por receptores específicos del polo sinusoidal
del hepatocito. Entra a través de transporte activo, incluso en contra del gradiente de
concentración. Ya en la célula hepática, la bilirrubina se une a proteínas (ligandinas &
proteínas y-z) para ser transportada al retículo endoplasmático.
3) Conjugación de la bilirrubina en el retículo endoplasmático liso

La conjugación es el proceso en el cual aumenta la solubilidad en agua o polaridad
de la bilirrubina. Principalmente (80%) se conjuga con ácido glucurónico formándose
monoglucurónido de bilirrubina por acción de la enzima UDP-glucuroniltransferasa. En
baja proporción se forma sulfato de bilirrubina (20%). Se obtiene así la llamada
bilirrubina conjugada, también denominada directa por el modo en que se determina su
concentración en sangre, que se caracteriza por ser soluble en agua y no difundir a través
de las membranas celulares.
Bajo condiciones fisiológicas toda la bilirrubina secretada en la bilis se encuentra
conjugada. La actividad de la UDP-glucuroniltransferasa es más baja en los primeros días
de vida. El principal estímulo fisiológico para aumentar su actividad son los niveles séricos
de bilirrubina. Puede ser estimulada por tratamiento farmacológico con fenobarbital.
Existen defectos congénitos en la captación y conjugación de la bilirrubina de los
cuales el más frecuente es el síndrome de Gilbert y en los recién nacidos el Síndrome de
Crigler-Najjar I y II.
4) Excreción y re-absorción de la bilirrubina. Circulación entero hepática

La bilirrubina conjugada tomada por los lisosomas y el aparato de Golgi pasa
activamente hacia los canalículos biliares, de los canalículos a la vesícula biliar y luego al
intestino delgado. En el tubo digestivo, el ácido glucurónico es liberado por la enzima -
glucuronidasa de bacterias intestinales y la bilirrubina resultante es convertida a
urobilinógeno por reductasas de bacterias intestinales. El urobilinógeno, incoloro, da lugar
a urobilina y estercobilinógeno, los cuales van a dar color a la orina y materia fecal.
La bilirrubina conjugada que llega al duodeno es en parte reabsorbida en la

mucosa intestinal. La forma conjugada de la bilirrubina circula libre en sangre y por
circulación enterohepática, la mayor parte (90%) vuelve al hígado y reinicia el circuito
hacia al intestino. El 10% se excreta por orina ya que llega al riñón por la circulación
general y filtra a través del glomérulo renal.
En el neonato, debido a la ausencia de una flora bacteriana normal, en los primeros

días de vida la materia fecal no tiene coloración. La bilirrubina es desconjugada por la
enzima -glucuronidasa de la pared intestinal. El producto final de esta desconjugación es
bilirrubina no conjugada, que es re-absorbida en el intestino y unida a la albúmina. Es
llevada a través de la circulación enterohepática hacia el hígado, para su nueva captación
y conjugación. A medida que se desarrolla la flora bacteriana se incrementa la formación
de los urobilinógenos fecales.
4
ALTERACIONES EN EL METABOLISMO DE LOS PIGMENTOS BILIARES
HIPERBILIRRUBINEMIA
La bilirrubinemia normal del adulto y del niño mayor es menor de 1 mg/dl. Cuando
la concentración de bilirrubina en la sangre excede de 1 mg/dl, existe
hiperbilirrubinemia. Cuando la bilirrubinemia alcanza una cierta concentración, la
bilirrubina difunde a los tejidos y se evidencia por la coloración amarilla en piel y mucosas.
Este signo es una manifestación clínica muy común y se denomina ICTERICIA. La
ictericia en los adultos aparece con bilirrubinemia mayor de 2 mg/dl. Para que un recién
nacido esté ictérico, la bilirrubinemia debe ser mayor de 7 mg/dl. Más del 50% de todos
los recién nacidos y un porcentaje más alto de prematuros desarrollan ictericia. Más del
5% de los recién nacidos a término normales presentan bilirrubinemia mayor de 13 mg/dl.
La hiperbilirrubinemia puede deberse a la producción excesiva de bilirrubina que el
hígado normal puede excretar o puede resultar de la insuficiencia del hígado dañado para
excretar la bilirrubina producida en cantidades normales. La obstrucción de conductos
excretorios del hígado, también causará hiperbilirrubinemia. La hiperbilirrubinemia se
observa en numerosas enfermedades, que van desde la hepatitis viral hasta cáncer de
páncreas.
TIPOS DE ICTERICIAS
El aumento de la concentración de bilirrubina sérica puede ocurrir por cuatro
mecanismos:
- sobreproducción,
- disminución de captación hepática,
- disminución en la conjugación y
- disminución en la excreción de la bilis (intra o extrahepática).
Esto ha llevado a clasificar las ictericias en:

- Pre-hepáticas o hemolíticas,
- Hepáticas o hepatocelulares
- Disfunción de la captación de bilirrubina
- Disfunción de la conjugación de bilirrubina
- Disfunción de la excreción de bilirrubina
- Post-hepáticas, obstructivas o colestáticas
- Intrahepática
- Extrahepática
Ictericia pre-hepática
La hemólisis es la causa más común del exceso de bilirrubina libre, no conjugada o
indirecta. En estos casos, existe un aumento de la producción de bilirrubina por una
destrucción excesiva de los eritrocitos.
Si existe dificultad en la captación de la bilirrubina plasmática por el hígado,
también se producirá una hiperbilirrubinemia a expensas de la bilirrubina no conjugada.
En ambos casos, hay un aumento de la concentración de bilirrubina total en
sangre, a expensas de su forma no conjugada. No existe coluria (coloración en orina).
Hay coloración oscura de las heces fecales por acúmulo de estercobilinógeno (hipercolia).
Las pruebas de función hepática son normales.
5
Las causas de la ictericia pre-hepática son:

a) hemolíticas
1) Anomalías en la hemoglobina o en los glóbulos rojos:
a) anemia de células falciformes (más frecuente en la raza negra)
b) talasemia
c) esferocitosis: fragilidad de la pared del glóbulo rojo por deficiencias enzimáticas
2) Trastornos hemolíticos adquiridos:
a) paludismo
b) enfermedad hemolítica del recién nacido por incompatibilidad Rh madre-hijo
3) Hemólisis por reacción transfusional
4) Enfermedades hemolíticas del sistema reticuloendotelial
5) Anemia hemolítica autoinmune
b) no hemolíticas
1) Ictericia por hematomas: se produce por reabsorción de hematomas. 1 litro de sangre
puede producir 5 gramos de hemoglobina
2) Ictericia por desplazamiento de la albúmina: varias sustancias endógenas (ácidos
grasos de cadena larga o ácidos biliares) o exógenas (medicamentos) compiten con la
bilirrubina por la unión a la albúmina pudiendo desplazarla
3) otras
Ictericias pre-hepáticas, hemolíticas, por anomalías en la hemoglobina o en los

glóbulos rojos
- Anemia de células falciformes
6
La anemia falciforme es una enfermedad hereditaria de los glóbulos rojos. Se
caracteriza por la presencia de la hemoglobina S (HbS), de estructura anómala. La HbS
contiene la mutación más común de la hemoglobina que consiste en el cambio de un
único aminoácido en la subunidad  de la HbA. Esta modificación cambia la solubilidad de
la proteína, que precipita y hace al glóbulo rojo más susceptible de ruptura y degradación,
disminuyendo la vida media del eritrocito.
- Deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH)

Esta deficiencia tiene carácter congénito. En la mayor parte de los casos se
requiere la presencia de un agente desencadenante para que la hemólisis se presente. La
deficiencia de G6PDH produce carencia del NADPH necesario para mantener el estado
rédox en el eritrocito.
- Talasemias
Para una función óptima, las subunidades  y  de globina de la hemoglobina no
solo deben tener una estructura adecuada sino que se deben sintetizar en una relación
1:1. Las mutaciones que producen una disminución en la síntesis de una subunidad
generan un grupo de enfermedades denominadas talasemias, de tipo  o  según el tipo
de subunidad sintetizada en menor cantidad. Algunos tipos de talasemias cursan con una
alta tasa de hemólisis y la consecuente hiperbilirrubinemia a expensas de la bilirrubina no
conjugada.
Ictericia fisiológica neonatal

Esta hiperbilirrubinemia resulta de una hemólisis acelerada y de un sistema
hepático inmaduro para la captación, conjugación y secreción de la bilirrubina. Durante la
gestación, el embrión tiene poliglobulia (alta concentración de eritrocitos circulantes),
conteniendo hemoglobina de tipo fetal (HbF). Luego del nacimiento, se produce una
disminución en la concentración de eritrocitos y cambia la HbF por la HbA. En estas
condiciones, hay hemólisis y catabolismo del hemo, con producción elevada de bilirrubina
e hiperbilirrubinemia fisiológica a expensas de la forma no conjugada. La ictericia en el
recién nacido es un cuadro benigno, transitorio y en general autolimitado que desaparece
antes del mes de vida.
Debido a que está elevada la concentración de bilirrubina no conjugada circulante,
esta puede penetrar la barrera hemoencefálica llevando a una condición denominada
querníctero. Esto es una encefalopatía tóxica hiperbilirrubinémica con complicaciones
neurológicas serias causadas por la acumulación de bilirrubina no conjugada en cerebro y
tejido nervioso.
Ictericia Hepática
Este tipo de ictericia puede deberse a fallas en la captación, conjugación o
excreción de bilirrubina por el hígado. A este tipo de ictericias se las denomina también
mixtas ya que pueden cursar con incremento de la bilirrubina no conjugada, de la
conjugada, o de ambas, dependiendo de la alteración primaria.
Las causas de la ictericia hepática son:
1) Disminución de la captación de bilirrubina por el hígado (poco frecuentes, son
desórdenes genéticos)
2) Disminución de la conjugación de bilirrubina (deficiencia de glucuroniltransferasa)
3) Daño hepatocelular (muy frecuentes):
a) Hepatitis
b) Cirrosis
c) Cáncer del hígado
7
d) Necrosis hepática por shock severo
e) Tóxicos
f) Congestión hepática por falla cardiaca
Ictericias hepáticas poco frecuentes, por disminución en la captación y/o

conjugación de la bilirrubina
- Síndrome de Crigler-Najjar
El síndrome de Crigler-Najjar es una condición severa caracterizada por
hiperbilirrubinemia no conjugada. Esta ictericia congénita grave se debe a la deficiencia
total o parcial de actividad de bilirrubina UDP-glucuroniltransferasa en el hígado. Faltando
la conjugación, aumenta en circulación la forma no conjugada de la bilirrubina. La ictericia
es observable al nacimiento o edad temprana, con alto riesgo de desarrollo de
kernicterus, forma de daño cerebral causado por acumulación de bilirrubina no conjugada
en cerebro y tejido nervioso.
- Enfermedad o síndrome de Gilbert

El síndrome de Gilbert es una condición relativamente leve en la que la depuración
hepática de la bilirrubina está disminuída, causando una hiperbilirrubinemia por aumento
en la concentración de bilirrubina no conjugada. En los individuos afectados, los niveles
circulantes de bilirrubina son fluctuantes y raramente llegan a producir ictericia.
Las causas son variadas y poco conocidas. Una causa es un defecto en su
absorción por las células parenquimatosas del hígado. En otros casos, la bilirrubina-UDP-
glucuroniltransferasa tiene actividad reducida.
- Síndrome de Dubin-Johnson (ictericia idiopática crónica)

El síndrome de Dubin-Johnson se caracteriza por hiperbilirrubinemia conjugada. Se
manifiesta como ictericia crónica o intermitente en individuos jóvenes, agravada por
enfermedades intercurrentes. Es una enfermedad de buen pronóstico. En estos pacientes
hay un defecto en la secreción hepática de la bilirrubina conjugada en la bilis, causado por
mutaciones en la proteína que realiza el transporte hepatobiliar (CMOAT, canalicular
multispecific organic anion transporter).
8
Ictericia post-hepática
Se debe al fallo para excretar la bilirrubina desde el hepatocito al duodeno. Se
diagnostica por valores de bilirrubinemia conjugada o directa mayores de 2 mg/dl o por un
bilirrubinemia directa mayor del 15% de la bilirrubina total. Es siempre patológica. Se
caracteriza porque la bilis no llega al duodeno.
A su vez, la ictericia post-hepática se puede clasificar en intrahepática (litos
intrahepáticos, colangitis, colangitis esclerosante primaria, granulomas, tumores, quistes,
degeneración amiloide) y extrahepática por obstrucción de la vía biliar (litos en vía biliar,
tumores, parásitos, estenosis por cicatrices).
En la ictericia post-hepática no hay coloración en materia fecal (acolia) y hay
coloración excesiva en orina (coluria).
Las causas de la ictericia post-hepática son:
1) Alteraciones estructurales del tracto biliar.
2) Colelitiasis (cálculos en la vesícula): el cálculo obstruye el paso de la bilis.
3) Atresia congénita de las vías biliares extrahepáticas.
4) Obstrucción biliar por tumores: principalmente causados tumores en la cabeza de
páncreas y en la ampolla de Vater.
Generalmente los pacientes con ictericia obstructiva (post-hepática) tienen una
coloración amarillo-verdosa. Además hay prurito debido a que la bilirrubina se fija en la
grasa de los tejidos.
- Obstrucción del árbol biliar:

Resulta del bloqueo de los conductos hepáticos o del colédoco. El pigmento biliar
pasa de la sangre al interior de los hepatocitos y se conjuga como lo hace en forma
9
habitual, pero no se excreta. Como consecuencia de esto, la bilirrubina conjugada es
absorbida al interior de las venas hepáticas y de los vasos linfáticos.
INTEGRACIÓN
Bilirrubina predominio No conjugada Bilirrubina predomino Conjugada
Sobreproducción Bilirrubina Disminución de la Excreción de Bilirrubina
Disminución Captación Hepática de Bilirrubina Disfunción de los hepatocitos
Disminución del Almacenamiento de Bilirrubina Obstrucción Biliar
Disfunción de la Conjugación
10
Casos Clínicos
Caso Clínico N° 1
A usted le llega un paciente a su consultorio con ictericia. ¿Qué determinaciones de
laboratorio le pediría?
Caso clínico Nº 2
Mirtha tiene 25 años de edad, es maestra en una escuela rural, con agua de pozo e
instalaciones sanitarias precarias. Hace siete días comienza con dolores musculares,
decaimiento, falta de apetito y malestar general, en los últimos tres días se constataron
registros febriles que ceden con la administración de antitérmicos. La orina es muy oscura
y las heces claras.
Al examinarla se observa coloración amarillenta de piel, mucosa y escleróticas, dolor leve
a la palpación del hígado. Los datos de laboratorio en sangre muestran GO T 200 UI/l, GP
T 250 UI/l, bilirrubina total 10 mg/dl, bilirrubina directa 5 mg/dl, bilirrubina indirecta 5 mg/dl.
Caso clínico Nº 3
Pedro es cocinero en una parrilla, tiene 55 años de edad y desde hace cinco meses
aproximadamente refiere el dolor epigástrico luego de probar sus recetas de cocina. El
dolor tiene periodicidad y curva con exacerbaciones y remisiones. En las últimas 48 horas
presentó varios episodios de náuseas y vómitos, además de intenso prurito, por lo que
consulta.
Al examinarlo presenta coloración amarillenta de la piel, mucosas y escleróticas, dolor
localizado a la palpación del hígado. El examen de laboratorio tiene valores de bilirrubina
directa 5 ml/dl y amilasa 100 mg/dl en sangre.
Caso clínico Nº4

Marcela tiene 30 años de edad, produce una enfermedad autoinmune desde hace 5 años.
Desde hace un mes comenzó con agitación y debilidad al caminar pocas cuadras. Desde
hace cuatro días dejó de ir a su trabajo y se quedó en cama por presentar fiebre con
escalofríos, coloración amarillenta de piel, mucosas, escleróticas, refiere además intenso
dolor dorsal. Los datos de laboratorio en sangre son: hematocrito 20%, hemoglobina 6
g/dl, bilirrubina total 5,3 mg/dl, bilirrubina indirecta 5 mg/dl, LDH 1500 UI/l, GOT 25 UI/l,
GP T 30 UI/l.
CUESTIONARIO
1) ¿Por qué las tres personas descriptas en los casos clínicos 2,3 y 4 tienen coloración
amarillenta de piel, mucosas y escleróticas?
2) ¿Qué tipo de ictericia presenta cada una de las personas de los casos clínicos?
3) ¿Cuáles son las causas más frecuentes de ictericia? ¿Cuál se corresponde con cada
caso clínico?
4) ¿Qué importancia tiene la determinación de la bilirrubina directa e indirecta y de las
enzimas séricas en las personas con ictericia? Correlaciónela con cada caso clínico.
11
TRABAJO PRÁCTICO
DE LABORATORIO 2
GLUCEMIA
ORINA
ELISA CHAGA TEST
TRABAJO PRÁCTICO DE LABORATORIO Nº 2
GLUCEMIA – ORINA - ELISA CHAGATEST
DETERMINACIÓN DE GLUCEMIA
FUNDAMENTO DEL MÉTODO:
Glu-oxidasa
Glucosa + O2 + H2O ácido glucónico + H2O2
peroxidasa
H2O2 + 4-aminofenazona + 4-hidroxibenzoato quinonimina roja
PROTOCOLO
Cada grupo de trabajo determinará la glucemia de un paciente (muestra X o Z).

Para ello se realizará una curva de calibración, midiendo la absorbancia de muestras de
concentraciones conocidas de glucosa. Paralelamente se procesará la muestra del paciente.
Luego, se realizará el correspondiente gráfico de absorbancia en función de la concentración de
glucosa, a partir del cual se podrá calcular la concentración de glucosa de la muestra incógnita.
(REPASAR ANEXO COLORIMETRÍA DEL TP DE LABORATORIO Nº 1)
Cada grupo de trabajo utilizará SEIS TUBOS para realizar el protocolo que se indica a
continuación:
TUBO H2O T MUESTRA REACTIVO

(ul) (ul) (ul) (ul)
B 1000 - - 1000
T1 750 250 - 1000
T2 500 500 - 1000
T3 250 750 - 1000
T4 - 1000 - 1000
Muestra (X o Z) - - 1000 1000
A) Pipetear los reactivos correspondientes en cada tubo

B) Mezclar el contenido de los tubos sin formar espuma
C) Incubar 30 min a temperatura a temperatura ambiente
D) Ajustar con el BLANCO el cero del fotocolorímetro a 500nm
1
E) Leer las Absorbancia (500 nm) de todos los tubos

F) Realizar la curva de calibración (gráfico A vs [glucosa])
G) Interpolar el valor obtenido de la A500nm de las muestras incógnita en dicho gráfico y
determinar el valor de glucemia de las muestras. Analizar el resultado del valor de la
muestra, utilizando la curva.
La concentración del testigo es de 250 mg%. Los alumnos deberán calcular la concentración de
glucosa de cada uno de los tubos testigo.
Valores obtenidos por los docentes:
0.4
0.3
Absorbancia
0.2
0.1
0.0
0 100 200 300
Concentración glucosa mg%
Valores obtenidos por cada grupo de alumnos.
Graficar la curva de Absorbancia en función de la Concentración de Glucosa, en hoja
milimetrada, y luego obtener el valor de Glucemia del paciente X o el paciente Z. Informar este
valor a los docentes.
TUBOS CONCENTRACIÓN Absorbancia

DE GLUCOSA (500nm)
Blanco
Testigo 1
Testigo 2
Testigo 3
Testigo 4
2
CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA DE LA MUESTRA INCÓGNITA =
3
ELISA (Chagatest de Wiener lab)
Fundamento:
1- La muestra se coloca en el soporte (cubeta o pocillo) en el que se encuentra inmovilizado el

antígeno (antígenos citoplasmáticos y de membrana de Trypanosoma cruzi). Si la muestra
contiene el anticuerpo específico se formará un complejo antígeno-anticuerpo que quedará
unido a la cubeta. Luego de la incubación la fracción no unida se elimina por lavado.
2- Se agrega el segundo anticuerpo (conjugado), que es un anticuerpo anti-inmunoglobulina
humana conjugado con la enzima peroxidasa. Si la muestra contenía anticuerpos específicos
que formaron complejo con el antígeno y quedaron adheridos a la cubeta, entonces el
anticuerpo conjugado se unirá a los anticuerpos específicos. Luego de la incubación, el exceso
de conjugado se elimina por lavado.
3- Se agrega el sustrato enzimático. Si se unió el conjugado, entonces la peroxidasa producirá
la reacción enzimática dando un color celeste. El sustrato es el Revelador. La reacción se
detiene con el stopper (ácido sulfúrico) con lo que el color celeste vira a amarillo.
Protocolo:
1. Por grupo se utilizan dos pocillos para procesar:
una Muestra X (paciente X)
una Muestra Z (paciente Z)
Rotular los pocillos con Número de GRUPO y Número de Muestra. Mantener cubiertos con
cinta los pocillos sin usar y solo descubrir los que se vayan a usar en esa determinación. Si el
pocillo está rotulado, significa que ya ha sido usado.
2. Con el frasco gotero agregar 1 gota de MUESTRA X en uno de los pocillos previamente
rotulado como (1).
3. Con el frasco gotero agregar 1 gota de MUESTRA Z en uno de los pocillos previamente
rotulado como (2).
4. Cubrir con cinta los pocillos para evitar la evaporación e incubar durante 30 minutos a 37°C
en baño termostático. Fijarse que los pocillos estén en contacto con el agua, pero que no se
hundan por completo. Se pueden colocar sobre una placa de Petri plástica que flota en el
líquido del baño.
4
5. Descartar el líquido de los pocillos en el recipiente de descarte. Lavar con BUFFER DE

LAVADO. Para ello, colocar un poco de este buffer en cada pocillo y después descartar con
firmeza el líquido en el recipiente. Repetir este lavado 4 veces más (5 lavados en total).
Después del último lavado, eliminar por completo el líquido residual invirtiendo los pocillos y
golpeándolos varias veces sobre papel absorbente.
6. Luego, agregar 1 gota de CONJUGADO en cada pocillo.
7. Mezclar con golpes laterales suaves. Cubrir los pocillos e incubar 30 minutos a 37°C en baño
termostático.
8. Descartar el líquido de los pocillos y lavar 5 veces con BUFFER DE LAVADO, como se
realizó anteriormente.
9. Agregar en cada pocillo 1 gota de REVELADOR . Mezclar con golpes laterales suaves. Puede
llevarse a 37°C y esperar hasta el desarrollo de color celeste en la Muestra X (de 15 a 30 min).
10. Detener la reacción con 1 gota de STOPPER. El color celeste vira a amarillo. Evaluar a
simple vista los resultados. El color es estable durante 30 minutos.
TIRILLAS REACTIVAS DE ORINA
Se colocará una gradilla con dos tubos, uno de orina del paciente X y otro de orina del paciente Z
en las puntas de cada mesada. Cada grupo de alumnos usará la orina correspondiente a la
muestra del paciente que le tocó de la glucemia.
Protocolo:
1- Familiarizarse con la forma y la dirección de cómo debe sumergirse la tirilla reactiva dentro de
la orina (NO DEBEN APOYARSE LOS DEDOS SOBRE LAS ALMOHADILLAS !!).
2- Sumergir la tirilla dentro del tubo con la orina, retirándola a los pocos segundos.
3- Esperar un minuto, apoyando la tirilla sobre un papel absorbente sobre la mesada.
4- Comparar los colores de la tirilla reactiva con los resultados de la fotocopia del kit comercial.
5- Anotar los resultados
6- Descartar las tirillas utilizadas.
5
CASOS CLÍNICOS DE LOS PACIENTES ANALIZADOS EN EL TRABAJO PRÁCTICO
PACIENTE X
El señor O.G. de 35 años nacido en la provincia de Chaco concurre al servicio de Clínica Médica a
fin de realizarse un examen de rutina y serología para Chagas por un estudio catastral que están
realizando en la fábrica donde trabaja.
Antecedentes personales: fumador de 30 cigarrillos diarios desde hace 15 años. Peso: 95 kg, talla:
1, 67 m.
Sin antecedentes familiares de importancia.
Al interrogatorio refiere conocer la vinchuca y provenir de un área rural del norte de la provincia.
En la consulta se le detecta TA: 160/95.
Examen de laboratorio
Sangre Valores de Referencia
Glucemia: ______ 70-110 mg%

Proteinemia total: 7 g% 6-8 g%
Colesterol total: 260 mg% <200 mg%
Col HDL: 30 >40 mg%
Col LDL: 200 <100 mg%
TAG: 180 mg % <150 mg%
Bilirrubina total : 1 mg% 0.8-1 mg%
Bilirrubina Directa 0.15 mg % <0.2 mg%
GOAT: normal
GPT: normal
Creatininemia: 1mg % 0.6-1.4 mg%
Uremia: 25 mg% 15-45 mg%
Uricemia: 6.5 mg % <8 mg%
Chagatest por ELISA: _____
6
Orina:
URO (Urobilinógeno):
GLU (glucosa):
KET (cetonas):
BIL (bilirrubina):
PRO (proteínas):
NIT (nitrito):
pH:
BLO (sangre):
SG (densidad):
LEU (leucocitos):
CUESTIONARIO:
En base a los valores indicados más arriba y los obtenidos en el trabajo práctico, indique posibles
alteraciones metabólicas presentes en este paciente.
1.- Qué características considera presentará la orina de este paciente a nivel de:
a) examen físico, b) químico y c) microscópico.
2.- Si el análisis de Chagatest por ELISA diera positivo, que otra técnica ¿que conoce podría ser
utilizada para confirmar el diagnóstico?
PACIENTE Z
Un paciente de 18 años de edad acude al servicio de urgencias con alteración del estado de
conciencia. Sus padres refieren que el paciente fue diagnosticado de diabetes hace 3 años y está
siendo tratado con insulina, manteniendo un aceptable control glucémico. Cinco días antes del
ingreso había comenzado con diarrea y malestar general, pese a lo cual fue a pasar unos días a la
costa con amigos. Durante los últimos dos días, además de la diarrea, presentó vómitos y en el
último día había dejado de ponerse la dosis de insulina de la noche.
Examen Físico: Impresión de enfermedad aguda grave. Presenta signos de deshidratación con
mucosas secas y signo del pliegue. Aliento cetónico. Responde a estímulos dolorosos.
Temperatura: 38°C; TA: 100/60; pulso: 94/min. Pupilas normales y normorreactivas. Auscultación
cardiopulmonar normal. Abdomen distendido, doloroso a la palpación, sin visceromegalias, ruidos
intestinales aumentados. Peso aproximado: 60 kg
7
Datos Complementarios
Sangre: Valores de Referencia
Glucemia: -------- 70-110 mg %

Proteinemia total: 9,5 g% 6-8 g %
Na: 132 mEq/l 135-155 mEq/l
K: 3.0 mEq/l 3,5- 5,5 mEq/l
Cl: 95 mEq/l 98-107 mEq/l
pH: 7.10 7,38-7,42
pCO2: 30 mmHg 32-48 mmHg
% Sat O2: 95 95-98%
CO3H: 10 mEq/l 20–28 mM
leucocitos: 12500/mm3 5000-10000/mm3
Chagatest por ELISA:
Orina:
URO (Urobilinógeno):
GLU (glucosa):
KET (cetonas):
BIL (bilirrubina):
PRO (proteínas):
NIT (nitrito):
pH:
BLO (sangre):
SG (densidad):
LEU (leucocitos):
CUESTIONARIO:
1- Qué enfermedad tiene este paciente?
2- Analice las alteraciones metabólicas presentes en sangre y orina.
3- Qué tratamiento en líneas generales le daría a este paciente?
8
TEÓRICO 13
Metabolismo de aminoácidos
METABOLISMO DE AMINOACIDOS
Comparativamente con los carbohidratos y los lípidos, el metabolismo de los aminoácidos es
considerablemente más complejo, porque si bien los aminoácidos son también utilizados
como fuente de energía, su función biológica está muy ligada al hecho de que los
aminoácidos son los constituyentes de las proteínas. Las proteínas, además de su función
estructural, son también necesarias para una gran variedad de funciones biológicas, tales
como la secreción de hormonas digestivas y proteínas plasmáticas, el transporte de
sustancias y la respuesta inmune, además de sus funciones como enzimas, entre muchas
otras. Por lo tanto, la incorporación de proteínas es indispensable para mantener la
estructura y función del organismo. El exceso de proteínas de la dieta puede ser utilizado
como fuente de energía, dado que como veremos más adelante, los aminoácidos
glucogénicos se pueden convertir en glucosa y los cetogénicos en ácidos grasos o
cetoácidos, o bien ser excretados como productos metabólicos (ej. urea). Una dieta libre de
proteínas produce una pérdida neta de proteínas corporales de alrededor de 0.34 g/kg de
peso/día.
El destino metabólico de las proteínas dietarias dependerá del ingreso energético. Un
aumento de este último permitirá la conservación de proteínas, en cambio, una disminución
en el aporte calórico resultará en la degradación proteica. Además, un factor importante es la
“calidad” de las proteínas dietarias que está determinada por su valor biológico y su facilidad
de absorción y digestión. El valor biológico de una proteína depende de la proporción en la
que se encuentran los aminoácidos esenciales. Por ejemplo, las proteínas del huevo y la
leche tienen mayor valor biológico que las proteínas de origen vegetal. Se recomienda que
entre el 10 al 15% del ingreso calórico provenga de proteínas.
Cuando la ingesta diaria de proteínas es baja, la mayoría de los aminoácidos se utiliza para
la síntesis proteica, debido a que los aminoacil-tRNA tienen una afinidad muy alta por los
aminoácidos. En cambio, cuando la ingesta proteica es alta, los aminoácidos son
catabolizados en reacciones catalizadas por enzimas de Km elevado.
El plasma contiene los 20 aminoácidos que se encuentran habitualmente en las proteínas,
además de otros como la citrulina, la ornitina, la taurina y la 3-metilhistidina.
Los aminoácidos se clasifican en esenciales (aquellos que no pueden ser sintetizados por el
hombre, y por lo tanto deben ser ingeridos en la dieta) y los no esenciales que en su
mayoría son sintetizados a partir de intermediarios anfibólicos por vías metabólicas cortas o
a partir de aminoácidos esenciales. La tabla siguiente indica a qué categoría pertenecen los
aminoácidos más abundantes.
1
Esenciales No esenciales
Fenilalanina Alanina
Isoleucina Arginina
Leucina Asparragina
Lisina Aspartato
Metionina Cisteína
Treonina Glicina
Triptofano Glutamato
Valina Glutamina
Histidina (es esencial en lactantes y niños)
Prolina
Serina
Tirosina
La mayor parte de los aminoácidos utilizados por el organismo para sintetizar proteínas o
precursores derivados de aminoácidos se obtiene de la dieta o del recambio de proteínas.
Las mezclas de aminoácidos obtenidas de la dieta no están presentes en las proporciones
exactas requeridas por el organismo, pero se interconvierten a través de diversas reacciones
metabólicas. De hecho, la mezcla de aminoácidos liberados a la sangre portal desde el
intestino ya muestra cambios en su composición (por ejemplo: la concentración de alanina
es mayor en la sangre portal que la ingerida). El exceso de aminoácidos respecto a las
necesidades para la síntesis de proteínas no puede ser almacenado ni excretado como
tales, sino que son degradados a productos que pueden ser oxidados para obtener energía
o acumulados como grasas.
El catabolismo de aminoácidos está regulado por la inducción de las enzimas catabolizantes.
La velocidad de este proceso varía considerablemente entre las diversas proteínas y está
regulada por la demanda fisiológica. Todas las vías de degradación de los aminoácidos
involucran una etapa clave que es la separación del grupo amino del esqueleto
carbonado.
Virtualmente todos los tejidos producen amoníaco (NH3) por el catabolismo de los
aminoácidos. El NH3 es altamente tóxico sobre todo para el sistema nervioso, pero existen
mecanismos de detoxificación que lo eliminan o lo convierten en metabolitos no tóxicos. En
condiciones normales, la concentración de amoníaco se mantiene baja en la sangre
periférica, pero aumenta mucho en patologías hepáticas
2
REACCIONES DEL CATABOLISMO DE AMINOACIDOS
A) Pérdida del grupo amino

Transaminación
El grupo amino de los aminoácidos se elimina por reacciones de transaminación, catalizadas
por enzimas denominadas aminotransferasas o transaminasas. En estas reacciones, el
grupo -amino de un aminoácido se transfiere al grupo carbonilo de un -cetoácido. Como
consecuencia, el aminoácido dador del grupo amino se convierte en un -cetoácido, y el -
cetoácido aceptor del grupo amino se transforma en un aminoácido.
aminoácido 1 + -cetoácido 2  aminoácido 2 + -cetoácido 1

(dador del amino) (aceptor del amino)
Sólo tres -cetoácidos pueden actuar como aceptores de grupos amino en este tipo de
reacciones: el -cetoglutarato, el piruvato y el oxalacetato, dando como producto glutamato,
alanina, y aspartato, respectivamente. De estos tres -cetoácidos, el más importante
cuantitativamente es el -cetoglutarato, de manera tal que el grupo amino de la mayoría de
los aminoácidos termina formando glutamato.
Las reacciones de transaminación tienen constantes de equilibrio cercanas a 1, por lo tanto
son fácilmente reversibles. Por este motivo, este tipo de reacciones funciona tanto en el
catabolismo como en la biosíntesis de aminoácidos. Las transaminasas son responsables de
la redistribución de grupos amino de los aminoácidos y proveen al organismo de aquellos
aminoácidos no esenciales que están en déficit. Existen transaminasas específicas para el
aminoácido dador del grupo amino.
Todas las transaminasas requieren fosfato de piridoxal (forma activa de la vitamina B6 o
piridoxina) como grupo prostético. En el curso de la reacción, el aminoácido entrante se une
al sitio activo de la enzima, cediendo el grupo amino al fosfato de piridoxal (que se
transforma en piridoxamina) y saliendo como -cetoácido. Luego, el -cetoácido entrante
recibe al grupo amino del fosfato de piridoxal y sale como aminoácido y el grupo prostético
se recupera en su estado original, es decir como fosfato de piridoxal. La distribución de
algunas transaminasas se utiliza como indicio diagnóstico; la liberación de una enzima
específica como consecuencia de una lesión tisular, por ejemplo la glutamato-oxalacetato
aminotransferasa (GOT) en plasma, es un índice de lesión hepática. Las reacciones de
transaminación ocurren mayoritariamente a nivel citoplasmático.
3
Desaminación oxidativa
Como ya dijimos, el producto más abundante que resulta de las reacciones de
transaminación es el glutamato. Éste, a su vez, es capaz de perder su grupo amino por una
reacción de desaminación oxidativa catalizada por la glutamato deshidrogenasa. Esta
enzima está altamente expresada en el hígado y se localiza en la matriz mitocondrial. Utiliza
NAD+ o NADP+ como cofactor que se reduce durante la reacción. El glutamato pierde el
grupo amino y el carbono  se oxida a carbonilo, dando -cetoglutarato como producto,
como se indica en la reacción:
glutamato-deshidrogenasa
glutamato -cetoglutarato
La glutamato deshidrogenasa es una enzima alostérica sujeta a control inhibitorio por GTP (y
ATP) y estimulatorio por ADP (y GDP). De esta forma, cuando los aminoácidos son
necesarios para la producción de energía, la actividad de la enzima aumenta y, por el
contrario cuando los niveles de nucleótidos trifosfatos son altos, su actividad disminuye. La
reacción de la glutamato deshidrogenasa es reversible y el sentido de la misma depende de
la concentración de reactivos y productos. Por lo tanto, la enzima forma parte tanto de la
degradación de aminoácidos como de su biosíntesis, dado que el glutamato puede participar
en reacciones de transaminación. La acción combinada de transaminasas y la glutamato
deshidrogenasa se conoce como transdesaminación, según se esquematiza en la
siguiente figura:
4
aminoácido1 α-cetoácido1
vías de oxidación, gluconeogénesis
-cetoglutarato glutamato
AMONÍACO
Balance global de la transdesaminación:

aminoácido1 α- cetoácido1 + NH3
Otras reacciones de desaminación

En el hígado y el riñón existen L-aminoácido oxidasas de baja actividad, que requieren
flavina mononucleótido (FMN) como cofactor de óxido-reducción, y catalizan la siguiente
reacción:
L-aminoácido + H2O + Enzima-FMN -cetoácido + NH3 + Enzima-FMNH2
La reoxidación del grupo prostético se produce a partir de O 2 con formación de peróxido de

hidrógeno (H2O2):
Enzima-FMNH2 Enzima-FMN + H2O2
El H2O2 formado se desdobla en agua y oxígeno en una reacción catalizada por la catalasa:
H2O2 H2O + ½ O2
Ciertos aminoácidos hidroxilados como serina y treonina pueden ser desaminados en forma
no oxidativa por deshidratasas, generando piruvato y -cetobutirato.
5
Por otra parte, la cisteína puede perder su grupo amino por la acción de una desulfhidrasa,
originando piruvato.
En estos últimos casos, el fosfato de piridoxal también actúa como coenzima, formándose
amoníaco y el correspondiente -cetoácido sin que haya una oxidación real de la molécula.
Por este motivo, se llama a estas reacciones desaminaciones no oxidativas.
De acuerdo a estas consideraciones, el metabolismo de los L-aminoácidos requiere un
proceso inicial de transaminación, generando mayoritariamente glutamato, y posteriormente
la desaminación oxidativa de éste, a través de reacciones reversibles. Esta vía es de gran
importancia desde el punto de vista de la economía celular. Al estar en equilibrio con sus
cetoácidos y entre sí, muchos aminoácidos pueden sintetizarse fácilmente a partir de otros
aminoácidos, o bien desaminarse, lo que depende del estado metabólico. Si el sistema
estuviera lejos del equilibrio, esta interrelación no existiría. Asimismo, el hecho de que el
glutamato sea el producto común de las reacciones de transaminación, reduce la cantidad
de enzimas necesarias. La reversibilidad de las reacciones de transaminación asegura la
utilización correcta de los aminoácidos-cetoácidos dependiendo de la situación metabólica:
6
Proteínas de la dieta 1 CO2 + H2O

Aminoácido1 α-cetoácido1 4
2 5 CARBOHIDRATOS
Proteínas endógenas 6
LIPIDOS
3 α-cetoglutarato glutamato 7
GLUCOSA
Proteínas
AMONIACO
Cuando la absorción intestinal de aminoácidos se incrementa luego de la dieta (1), el exceso

de aminoácidos que no se emplea en la síntesis de proteínas (3) podrán derivarse a la
obtención de energía (4) o la síntesis de lípidos (6) luego de la pérdida del grupo amino. En
ayuno, la velocidad de degradación de proteínas endógenas (2) supera la velocidad de
síntesis de proteínas (3), los aminoácidos perderán su grupo amino y los cetoácidos se
convertirán en glucosa por gluconeogénesis (5) para ser usada en el cerebro; en estas
condiciones la síntesis de ácidos grasos (6) y la oxidación del piruvato (4) estarán inhibidas.
Por otra parte, cuando la ingesta proteica no es adecuada, la síntesis de proteínas podría
mantenerse a expensas de la degradación de proteínas endógenas, sin embargo esto no
ocurre por la proximidad al equilibrio de las reacciones de transdesaminación. Es decir, es
imposible evitar que parte de los aminoácidos pierdan su grupo amino y se metabolicen.
B) REACCIONES DE FIJACION DEL GRUPO AMINO

Como ya mencionamos, el amoníaco es muy tóxico, pero existen reacciones que permiten
que éste reaccione formando compuestos no tóxicos, que llegan por sangre al hígado y al
riñón. Existen varias vías metabólicas para la fijación del grupo amino:
 Síntesis de glutamato
 Síntesis de glutamina
 Síntesis de alanina
 Síntesis de urea.
Síntesis de glutamato
Como ya dijimos, la reacción de la glutamato deshidrogenasa es reversible y la enzima
forma parte no sólo de la degradación de los aminoácidos, sino también de su biosíntesis.
De esta forma, es posible sintetizar glutamato a partir de -cetoglutarato, incorporando
amonio y oxidando NADPH o NADH.
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Síntesis de glutamina
La síntesis de glutamina a partir de glutamato es catalizada por la enzima glutamina
sintetasa, que se localiza a nivel mitocondrial y cataliza la siguiente reacción:
glutamina sintetasa
glutamato glutamina
La glutamina es una forma temporaria de transporte de amoníaco en condiciones no tóxicas,

y dado que es una molécula neutra, atraviesa con mayor facilidad las membranas que el
glutamato. La glutamina cumple distintas funciones:
- biosíntesis de nucleótidos de purinas y pirimidinas
- biosíntesis de hexosaminas
- biosíntesis de NAD
- ruptura con liberación de glutamato y amoníaco en riñón. Esta reacción es catalizada por la
glutaminasa.
Síntesis de alanina
En el músculo, se forma alanina a partir de piruvato y glutamato en una reacción catalizada
por la enzima alanina amino transferasa (ALAT). La alanina así sintetizada llega por la
sangre al hígado donde se utiliza como precursor en la gluconeogénesis.
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Síntesis de urea
La urea es el producto final no tóxico de eliminación del nitrógeno en el hombre y muchos
otros vertebrados superiores (a los que se denomina ureotélicos), en tanto que las aves y los
reptiles excretan el amoníaco como ácido úrico y por ello se los denomina uricotélicos.
Algunos peces y anfibios, eliminan directamente amoníaco (amonotélicos).
En los animales ureotélicos, el amoníaco proveniente de la pérdida de los grupos amino se
convierte en urea en las mitocondrias hepáticas a través del denominado ciclo de la urea.
El ciclo de la urea es un proceso que abarca dos compartimientos intracelulares. Se inicia en
el interior de las mitocondrias de los hepatocitos, donde se forma amoníaco a partir del
glutamato por desaminación oxidativa. Otro origen posible de amoníaco hepático es la
degradación bacteriana de los aminoácidos intestinales. El amoníaco así liberado, se
absorbe y llega al hígado por la vena porta. Asimismo, el amoníaco puede provenir del
catabolismo de algunos neurotransmisores como catecolaminas, serotonina e histamina, que
son degradadas por enzimas específicas localizadas a nivel cerebral o periférico. Estas
enzimas liberan amoníaco por oxidación de la amina. Finalmente, el amoníaco circulante
puede originarse a partir de la degradación de bases púricas y pirimidínicas.
EL CICLO DE LA UREA
En la primera reacción de este ciclo, el amoníaco se combina con bicarbonato para formar
carbamoil-fosfato, con consumo de 2 uniones fosfato de alta energía.
carbamoil-fosfato sintetasa I
O
2 ATP  HCO3 -  H2O NH2 C OPO32-  2ADP

carbamoil -fosfato  2H  Pi
Esta reacción es catalizada por la enzima carbamoil-fosfato sintetasa I que se encuentra en

la matriz mitocondrial (la carbamoil-fosfato sintetasa II es citosólica y participa en la síntesis
de novo de pirimidinas) y cataliza el paso limitante de esta vía. A continuación el carbamoil-
fosfato cede su grupo carbamilo (NH2—CO) a la ornitina, para formar citrulina y liberar
fosfato. Esta reacción es catalizada por la enzima ornitina carbamoil transferasa. La citrulina,
se transloca al citosol. Allí, se incorpora un segundo grupo amino proveniente del aspartato,
en una reacción catalizada por la arginino-succinato sintetasa, dando origen al arginino-
succinato. El aspartato se forma en la mitocondria por transaminación del oxalacetato en una
reacción catalizada por la aspartato aminotransferasa (ASAT), siendo el glutamato el dador
9
del grupo amino. Ese aspartato sale al citosol. La reacción de la arginino-succinato sintetasa
emplea la energía de hidrólisis de dos uniones de alta energía liberada a partir de una
molécula de ATP para dar AMP y PPi. A continuación, la arginino succinato liasa cataliza la
ruptura de este compuesto dando arginina y fumarato. El fumarato puede incorporarse al
ciclo de Krebs del cual había salido originalmente como oxalacetato. La arginina, por su
parte, es sustrato de la enzima citosólica arginasa, que la escinde dando urea y ornitina. La
ornitina vuelve a entrar a la mitocondria donde se reinicia el ciclo, en tanto que la urea pasa
a la sangre y es excretada a nivel renal. La membrana mitocondrial interna contiene un
transportador que intercambia citrulina/ornitina. En resumen, en el ciclo de la urea, los
intermediarios ornitina, citrulina y arginina no sufren ganancia ni pérdida neta. En cambio, el
amoniaco y el bicarbonato se consumen en la síntesis de urea, en la que además se utilizan
4 uniones fosfato de alta energía provistas por el ATP.
De esta forma, el balance final del ciclo es:
CO2 + NH4+ + 3 ATP + aspartato + 2 H2O  UREA + 2 ADP + 2 Pi + AMP+ PPi + fumarato
Las enzimas citosólicas y las mitocondriales del ciclo de la urea forman complejos
multienzimáticos, de forma tal que el producto de una reacción pasa inmediatamente a ser el
sustrato de la reacción siguiente sin difundir, lo que asegura una gran eficiencia de todo el
proceso. La urea no puede ser metabolizada en el organismo y se elimina por la orina. Si
algo de urea penetra en el tracto intestinal, ésta puede ser degradada por bacterias
intestinales que contienen ureasa y el amoníaco resultante es reabsorbido y utilizado en el
hígado.
10
Regulación del ciclo de la urea

El flujo de nitrógeno a través del ciclo de la urea varía considerablemente con la composición
de la dieta. Con una dieta rica en proteínas, el uso de los esqueletos carbonados de los
aminoácidos como fuente de energía, genera una elevada producción de urea a partir del
exceso de aminoácidos. En estado de ayuno severo, cuando la degradación de proteínas del
músculo constituye una de las fuentes de energía, la producción de urea también aumenta,
así como en la diabetes mellitus no controlada. El aumento de la actividad del ciclo de la
urea está vinculado a un aumento en la actividad de las enzimas involucradas en el ciclo. La
11
expresión de las cinco enzimas que participan en el ciclo aumenta en los casos de dietas
ricas en proteínas o en caso de ayuno severo. Estos mecanismos regulatorios se hacen
evidentes a tiempos relativamente prolongados. En cambio, a tiempos cortos, la actividad del
ciclo está regulada por mecanismos alostéricos. En este sentido, la carbamoil-fosfato
sintetasa I es activada alostéricamente por N-acetilglutamato. Este modulador se sintetiza a
partir de glutamato y acetil-CoA, en una reacción catalizada por la N-acetilglutamato
sintetasa. Esta enzima, a su vez es activada por arginina, que se acumula cuando la
producción de urea es muy baja.
Se han descripto deficiencias de origen genético en las enzimas del ciclo de la urea. Los
pacientes que poseen estas alteraciones no toleran dietas ricas en proteínas, pues un
exceso de aminoácidos generaría una sobreproducción de amoníaco a nivel hepático que no
llegaría a ser metabolizado. Por otra parte, una deficiencia a nivel renal puede provocar la
acumulación de urea en sangre. En esos casos, es crítico frenar la acumulación de urea,
que puede ser tóxica en concentraciones elevadas y puede aumentar la concentración de
amoníaco en forma indirecta. Para ello, es importante un control estricto de la dieta con
cantidades adecuadas de proteínas de alto valor biológico, es decir cuya composición
aminoacídica sea similar a las proteínas del ser humano, evitando excesos y defectos de
determinados aminoácidos.
Relación entre el ciclo de la urea y el ciclo de los ácidos tricarboxílicos

Como ya mencionamos, en el ciclo de la urea, el aspartato se combina en el citoplasma con
la citrulina para dar arginino-succinato. Este aspartato proviene de una reacción de
transaminación mitocondrial catalizada por la ASAT, en la que el oxalacetato recibe el grupo
amino del glutamato, formando aspartato y -cetoglutarato. El aspartato sale al citosol,
donde se incorpora al ciclo de la urea. Sin embargo, el esqueleto carbonado del aspartato se
desprende del ciclo como fumarato. De esta forma, el fumarato puede retornar a la
mitocondria e incorporarse al ciclo de Krebs, para volver a transformarse en oxalacetato,
nuevamente generar aspartato y reiniciar el proceso.
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glutamato
Acetil-CoA
N-acetil
glutamato
sintetasa
N-acetilglutamato
carbamoil-fosfato
sintetasa I
Ciclo de la urea y ciclo del ácido cítrico
α-cetoácido
citrulina
0 aspartato
Carbamoil aminoácido
fosfato
Arginino oxalacetato
ornitina succinato
malato
arginina fumarato
DESTINO DE LOS ESQUELETOS CARBONADOS DE LOS AMINOACIDOS

Luego de la pérdida del grupo amino, los esqueletos carbonados resultantes de los
aminoácidos pueden ser canalizados hacia la síntesis de glucosa o hacia el ciclo de Krebs,
para su degradación a través de 7 compuestos: piruvato, acetil-CoA, acetoacetato, -
cetoglutarato, succinil-CoA, fumarato y oxalacetato. En muchos casos, las reacciones de
transaminación de un determinado aminoácido da directamente un intermediario del ciclo de
Krebs, en otros, en cambio, los procesos de degradación son mucho más complejos.
Además, dado que las reacciones de degradación de los aminoácidos son reversibles, los
intermediarios del ciclo de Krebs pueden ser utilizados para la síntesis de aminoácidos no
esenciales. De acuerdo al destino final del esqueleto carbonado, los aminoácidos se
clasifican en cetogénicos y glucogénicos. Los cetogénicos son aquellos aminoácidos que
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se degradan a acetil-CoA o a acetoacetil-CoA, y pueden dar origen a cuerpos cetónicos. Los
aminoácidos glucogénicos son aquellos que se degradan a piruvato, -cetoglutarato,
succinil-CoA, glutamato u oxalacetato, todos compuestos que pueden ser utilizados para la
síntesis de glucosa (gluconeogénesis). La mayoría de los aminoácidos son glucogénicos; la
leucina y la lisina son cetogénicos y la fenilalanina, tirosina, isoleucina y triptofano son
cetogénicos y glucogénicos. Por lo tanto, los aminoácidos no sólo son importantes para la
síntesis de compuestos nitrogenados sino también para la síntesis de compuestos de
reserva energética.
METABOLISMO DE LOS AMINOÁCIDOS EN LOS DIFERENTES TEJIDOS

No todos los tejidos captan y metabolizan aminoácidos en forma similar. Por el contrario,
cada órgano tiene funciones especializadas, con requerimientos energéticos y de
precursores biosintéticos diferentes. Por lo tanto, es necesario diferenciar el metabolismo de
los aminoácidos en cada tejido en particular.
1) INTESTINO
El intestino es un órgano de alto recambio celular debido a la continua descamación de las
células de su epitelio. Por ese motivo, la síntesis de ADN, ARN y proteínas ocurre a alta
velocidad. El intestino capta preferencialmente aquellos aminoácidos que intervienen en la
síntesis de bases nitrogenadas, glutamina y aspartato, así como sus derivados, glutamato y
asparagina, que provienen de la digestión de las proteínas de la dieta. Durante períodos de
ayuno, la glutamina que se utiliza en el intestino para la síntesis de purinas y pirimidinas,
proviene del músculo. Por otra parte, el nitrógeno liberado en el intestino a partir del
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metabolismo de las bases nitrogenadas es captado por el piruvato, que se transforma en
alanina, o bien se libera a la sangre portal directamente como amoníaco, que es captado y
detoxificado en el hígado. Además, las bacterias entéricas descomponen compuestos
nitrogenados y liberan amoníaco que se absorbe y contribuye a la síntesis de urea. De
acuerdo a estas consideraciones, es evidente que el intestino modifica marcadamente la
proporción de aminoácidos que provienen de las proteínas de la dieta, incrementando la
carga de alanina y disminuyendo la de los aminoácidos diácidos y sus amidas.
La glutamina se transforma en glutamato en una reacción catalizada por la glutaminasa o
bien por las enzimas que participan en la síntesis de bases. Posteriormente, el glutamato se
desamina por la glutamato deshidrogenasa o se transamina a -cetoglutarato. En cuanto al
aspartato, luego de ceder el nitrógeno a la síntesis de bases, se transforma en fumarato.
Ambos compuestos resultantes (fumarato y -cetoglutarato) son intermediarios del ciclo de
Krebs, de manera que terminan transformados en malato, y éste produce CO 2, NADPH y
piruvato por acción de la enzima málica (malato deshidrogenasa descarboxilante). Parte del
piruvato resultante puede transaminarse con glutamato, formando -cetoglutarato (que se
reincorpora al proceso) y alanina, que sale a la sangre portal. El resto del piruvato, se
consume en el ciclo de Krebs y sirve como fuente de energía. De esta manera, el intestino
obtiene hasta el 50% de la energía necesaria para su funcionamiento, el resto proviene de la
utilización de cuerpos cetónicos y glucosa, ya que no utiliza cantidades apreciables de
ácidos grasos como combustible energético.
2) HÍGADO
El hígado es el primer destinatario de los aminoácidos absorbidos en el intestino que llegan
por vía portal. También es el sitio primario de captación de la alanina liberada en el músculo
que se utiliza para gluconeogénesis cuando se agota el glucógeno hepático. En el hígado
hay una activa síntesis de proteínas, no sólo propias, sino también de exportación (proteínas
plasmáticas, enzimas de coagulación, etc.). También en el hígado hay una síntesis
considerable de diversos compuestos nitrogenados. El exceso de aminoácidos es
desaminado en el hígado y los esqueletos carbonados generados pueden ser utilizados para
la síntesis de glúcidos o cuerpos cetónicos (dependiendo de la estructura de su esqueleto
carbonado), o bien utilizados como fuentes de energía. La actividad de las transaminasas y
de otras enzimas que participan en la degradación de aminoácidos disminuye cuando el
aporte proteico de la dieta es bajo. Esto permite priorizar, en estas condiciones, la síntesis
de proteínas.
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El hígado carece de las enzimas necesarias para la metabolización de aminoácidos
ramificados. Estos últimos se metabolizan principalmente en el músculo, que controla la
concentración sanguínea de estos compuestos y los utiliza como fuentes de energía.
Cuando se ingiere un exceso aminoácidos cetogénicos, sus esqueletos carbonados se
transforman en el hígado en acetil-CoA, que dependiendo del estado metabólico puede ser
utilizado para la síntesis de ácidos grasos (por ejemplo en estado de saciedad) o para la
síntesis de cuerpos cetónicos (en estado de ayuno o en una diabetes no controlada) que
pueden utilizarse en tejidos periféricos como fuente de energía. Indudablemente, una función
clave del hígado en el metabolismo de los aminoácidos es la eliminación del amoníaco a
través del ciclo de la urea. El amoníaco, no sólo proviene de los aminoácidos, sino también
de la descomposición bacteriana intestinal de compuestos nitrogenados. La urea es una
sustancia no tóxica y altamente soluble, que se elimina en la orina. En un individuo normal,
los niveles plasmáticos de urea no superan los 40 mg/100 ml, valores mayores indican
alteraciones a nivel renal. Cuando la función hepática está deteriorada, como en la cirrosis,
la detoxificacion del amoníaco es insuficiente y su concentración aumenta marcadamente.
Del total de aminoácidos que llegan al hígado por sangre portal, aproximadamente el 75% es
metabolizada en el hígado y el resto en los demás tejidos. Por lo tanto, el destino de los
aminoácidos hepáticos involucra las siguientes opciones:
1) síntesis de proteínas hepáticas
2) síntesis de proteínas plasmáticas
3) detoxificación del amoníaco como urea
4) síntesis de ácidos grasos
5) síntesis de glucosa
6) síntesis de cuerpos cetónicos
3) MÚSCULO
El músculo capta los aminoácidos ramificados (leucina, isoleucina y valina) provenientes de
la dieta y no captados por el hígado. Estos aminoácidos son transformados, parte se utiliza
como fuente de energía y otra parte se libera a la circulación como alanina, glutamina y
glicina. En el músculo las reacciones de transaminación son muy activas. En general, las
transaminasas para aminoácidos ramificados del músculo esquelético son más afines por el
-cetoglutarato que por el piruvato, por lo que se forma mayoritariamente glutamato. El
glutamato se transamina con piruvato regenerando -cetoglutarato y formando alanina que
sale a la circulación. El esqueleto carbonado de los aminoácidos ramificados es degradado
por diversas enzimas, dando intermediarios del ciclo de Krebs, fundamentalmente
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oxalacetato. El oxalacetato se transforma en fosfoenolpiruvato en una reacción catalizada
por la enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinasa) y posteriormente en piruvato por la piruvato
quinasa. El piruvato derivado de aminoácidos ramificados, contiene los átomos de carbono
que originarán alanina por transaminación, de manera que el nitrógeno de la alanina también
provendrá del mismo aminoácido, en forma indirecta. Parte del piruvato puede utilizarse en
la obtención de energía. En una dieta normal, es posible que la mayor parte del piruvato
formado por esta vía se oxide en el músculo y sirva como fuente de energía, dada la alta
capacidad del músculo de degradar aminoácidos ramificados. En cambio, en una dieta pobre
en glúcidos o en estado de ayuno, la oxidación del piruvato es poco probable, dado que la
piruvato deshidrogenasa estará en estado inactivo, por el aumento en los niveles de acetil-
CoA provenientes de la -oxidación e incluso de la cetólisis. En estas condiciones, el
piruvato preferentemente se transaminará para formar alanina. La alanina resultante llega al
hígado donde se transamina para dar piruvato que se utiliza como sustrato de
gluconeogénesis. La glucosa resultante puede derivarse a otros tejidos incluso al propio
músculo. Se ha postulado que en el músculo, la glucosa se oxida y forma piruvato, que
nuevamente genera alanina a partir de aminoácidos ramificados, lo que se denomina ciclo
glucosa-alanina, que se esquematiza a continuación:
HÍGADO MÚSCULO
glucosa glucosa
urea glucólisis
gluconeogénesis piruvato
aminoácido
NH3 + piruvato cetoácido
alanina alanina
Sin embargo, es poco probable que el ciclo glucosa-alanina ocurra en ayunas, dado que la
velocidad de entrada de la glucosa al músculo es baja por falta de insulina. Tampoco es muy
probable que este ciclo funcione luego de una buena alimentación, porque las enzimas de la
gluconeogénesis no se encontrarán en estado activo en el hígado. En ayuno, es más
probable que la alanina generada en el músculo llegue al hígado y allí se utilice para la
gluconeogénesis, pero la glucosa así formada podría ser captada por otros órganos insulino-
independientes y glucosa-dependientes, como el cerebro o los eritrocitos. Otra posibilidad es
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que este mecanismo opere en el músculo en actividad, porque en este estado, la entrada de
glucosa al músculo no depende de insulina. En estas condiciones, se genera lactato por
glucólisis anaeróbica y a partir del amoníaco de los aminoácidos aromáticos se forma
alanina. En el hígado, se genera piruvato (precursor de glucosa) a partir de la alanina y los
grupos amino se eliminan como urea.
En el músculo también se puede producir glutamina a partir de aminoácidos ramificados a
través de un mecanismo complejo que se represente en el siguiente esquema. En el
músculo, se puede sintetizar glutamina a partir de los aminoácidos ramificados leucina y
valina. La leucina se desprende de su grupo amino por transaminación con -cetoglutarato,
generando glutamato y el -cetoácido correspondiente. La degradación de su esqueleto
carbonado genera acetil-CoA, que se combina con oxalacetato para dar citrato, que a través
de las reacciones del ciclo de Krebs puede generar -cetoglutarato. Por su parte, la valina se
puede transaminar con ese -cetoglutarato para dar glutamato y su cetoácido
correspondiente, el -ceto-3-metil butirato. Los pasos metabólicos que siguen son complejos
y dan como producto succinil-CoA, otro intermediario del ciclo de Krebs. Es decir que la
leucina y la valina pueden aportar los carbonos y el nitrógeno necesario para la síntesis de
glutamato, que a su vez se transforma en glutamina por acción de la glutamina sintetasa.
El nitrógeno también puede provenir en forma indirecta de la leucina. Existe otro mecanismo
alternativo para la síntesis de glutamina en el músculo. Por ejemplo, la glucosa puede
aportar los carbonos necesarios para sintetizar -cetoglutarato, que necesita de un nitrógeno
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amínico y amoníaco para sintetizar glutamina. El nitrógeno amínico puede provenir de
cualquier aminoácido que se transamine con -cetoglutarato para dar glutamato y el
amoníaco tiene varias fuentes posibles:
1) fuentes exógenas
2) desaminación oxidativa del glutamato (que es poco importante en el músculo)
3) desaminación de la adenosina a inosina por acción de la adenosina deaminasa. Esta
enzima que interviene en la degradación de nucleótidos de adenina es muy importante
en el músculo en actividad que consume grandes cantidades de ATP.
Sintetizada a través de cualquiera de las vías mencionadas, la glutamina generada en el

músculo puede ser captada en el intestino o en el riñón. En conclusión, en el músculo se
generan sobre todo aceptores de nitrógeno (piruvato y -cetoglutarato) que se combinan con
amoníaco para formar compuestos no tóxicos (alanina y glutamina, respectivamente) que
son transportados a la sangre, sin riesgo. El uso de alanina como transportador de grupos
amino desde el músculo en trabajo activo al hígado resulta muy beneficioso en términos de
economía de energía. De esta forma, el músculo en contracción opera anaeróbicamente
generando lactato y amoníaco. Ambos compuestos llegan al hígado como alanina y permiten
generar glucosa y urea. De esta forma, el gasto energético para realizar la gluconeogénesis
lo realiza el hígado, mientras que el ATP muscular se utiliza para la contracción.
4) RIÑÓN
El riñón capta glutamina, prolina y glicina de la circulación. La glutamina es metabolizada
en el riñón como parte del mecanismo de regulación del equilibrio ácido-base. Esto ocurre a
nivel de los túbulos renales, dado que el amoníaco que aparece en la orina no proviene del
filtrado glomerular. La glutamina es captada desde la sangre e incluso del filtrado glomerular
y es convertida en glutamato y amoníaco por la glutaminasa que es de localización
mitocondrial en el riñón. Existe un sistema de transporte de glutamina a través de la
membrana mitocondrial interna. El glutamato se metaboliza a -cetoglutarato (reacción
catalizada por la glutamato deshidrogenasa), liberando una nueva molécula de amoníaco. El
19
-cetoglutarato se convierte en malato a través del ciclo de Krebs y éste último sale de la
mitocondria y se transforma en oxalacetato (malato deshidrogenasa citoplasmática). A
continuación, el oxalacetato se convierte en fosfoenolpiruvato y luego en piruvato,
generando finalmente ATP. También puede ocurrir que el malato se convierta directamente
en piruvato por la enzima málica (malato deshidrogenasa descarboxilante). Por cualquiera
de estas vías, se genera piruvato que permite la obtención de energía. En ayuno, la piruvato
deshidrogenasa está inactiva y entonces el fosfoenolpiruvato entra a la vía de
gluconeogénesis. De acuerdo a estos mecanismos la glutamina en el riñón genera dos
moléculas de amoníaco que captan protones para formar el ión amonio y de esta manera se
excretan usando cloruro como contraión. De esta forma se elimina el exceso de ácido. Este
es uno de los mecanismos compensatorios en la acidosis metabólica, según se representa
en el siguiente esquema:
El transporte de glutamina a través de la membrana mitocondrial interna y plasmática, y las

reacciones catalizadas por la glutaminasa, la -cetoglutarato deshidrogenasa y la
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, no están en equilibrio, en tanto que las otras reacciones
involucradas si lo están. En acidosis, aumenta la actividad de la -cetoglutarato
deshidrogenasa, favoreciendo el consumo de glutamato por la glutamato deshidrogenasa.
Dado que no se acumula glutamato, deja de inactivarse la glutaminasa porque bajan los
niveles de un modulador alostérica negativo. La conversión de -cetoglutarato en otros
intermediarios del ciclo de Krebs permitirá que disminuya su efecto inhibitorio sobre el
20
transporte de glutamina a través de la membrana mitocondrial interna, acelerando de esta
forma la generación de amoníaco. De esta forma, un descenso agudo de pH que no puede
ser compensado por mecanismos rápidos de regulación (proteínas plasmáticas, sistemas
buffer plasmáticos) desencadenará la degradación de glutamina por el riñón.
Además de este mecanismo de regulación aguda, la capacidad del riñón de excretar amonio
se incrementa si la acidosis continúa por varios días, probablemente a través de la inducción
de enzimas y transportadores de glutamina.
Es muy importante remarcar que el metabolismo de la glutamina está fuertemente integrado
entre el músculo, el riñón y el intestino. El origen de la glutamina para su metabolización
renal durante la acidosis es preponderantemente muscular. El músculo incrementa en estas
condiciones la producción del aminoácido por un mecanismo concertado con el riñón que
todavía se desconoce. En estas condiciones, el intestino, que es el principal consumidor de
la glutamina producida por el músculo en condiciones de no acidosis, reduce su consumo
por la falta de disponibilidad del sustrato que es consumido en mayor medida por el riñón. En
la siguiente se representa la interrelación de distintos tejidos respecto a la producción y
consumo de glutamina y alanina.
5) SISTEMA NERVIOSO
El cerebro está relativamente aislado de la circulación general por un sistema de filtración
selectivo, la barrera hematoencefálica. La mayoría de las moléculas que llegan al cerebro, lo
hacen a través de sistemas de transporte específico. Existen 3 sistemas de transporte de
aminoácidos al cerebro, según sean ácidos, básicos o neutros. Entre estos últimos, los
aminoácidos ramificados se captan con gran afinidad. La concentración de aminoácidos en
el cerebro es mayor que en el plasma y las proporciones son también diferentes. Además, el
21
cerebro es capaz de sintetizar muchos aminoácidos no esenciales a partir de los
correspondientes cetoácidos, que a su vez derivan de la glucosa.
El amoníaco del cerebro proviene de la sangre o es de origen endógeno, principalmente a
partir de glutamina, glutamato o aspartato. También se produce a partir de AMP por la
adenosina deaminasa, como en el músculo.
La intoxicación por amoníaco responde a distintas causas en niños y en adultos. En el
primer caso, la causa más frecuente es la deficiencia de alguna de las enzimas del ciclo de
la urea, en cambio, en adultos suele estar causada por el daño hepático provocado por el
alcohol, venenos o procesos infecciosos. La intoxicación por amoníaco se caracteriza por un
estado comatoso debido a la alcalinización del medio intracelular y a la disminución de los
intermediarios del ciclo de Krebs. Para la detoxificación del amonio, éste se combina con -
cetoglutarato para formar glutamato (a través de la reversión de la reacción catalizada por la
glutamato deshidrogenasa). El glutamato se convierte en glutamina por acción de la
glutamina sintetasa. Ambas enzimas tienen alta actividad en el cerebro. La formación de
glutamato a partir de -cetoglutarato consume equivalentes de reducción que, por otra parte,
son necesarios para la síntesis de ATP:
-cetoglutarato + NH4+ + NADH + H+ glutamato + NAD+
Además, para la síntesis de glutamina se requiere ATP. Cuando la capacidad de la enzima

se satura, se acumula amoníaco en el cerebro. Es importante señalar que en el cerebro, los
aminoácidos cumplen funciones particulares, como precursores de algunos
neurotransmisores.
En el cerebro, existe además una compartimentalización del metabolismo del amoníaco. Las
neuronas generan amoníaco, mientras que las células de la glia lo remueven. De esta forma,
los astrocitos sintetizan glutamina a partir de glutamato por acción de la glutamina sintetasa
(1) y la glutamina vuelve a las neuronas, donde da origen a neurotransmisores
aminoacídicos: glutamato, GABA y aspartato. El excedente pasa a la sangre o al líquido
cefalorraquídeo.
22
Líquido cefalorraquídeo
sangre astrocito neurona otros

neurotransmisores
NH3 NH3
+ +
Glutamato glutamato glutamato

(1) (2)
glutamina glutamina
(1) Glutamina sintetasa

(2) glutaminasa
La glutaminasa (2) está sujeta a un complejo control alostérico inhibitorio por los productos
glutamato y amoníaco, de manera tal que si se acumula amoníaco puede frenarse la síntesis
de neurotransmisores.
glutaminasa
Glutamina glutamato + NH3 neurotransmisores
6) SANGRE
La concentración plasmática de aminoácidos está sujeta a control hormonal. Las hormonas
anabólicas como la insulina, promueven la incorporación de aminoácidos del plasma a
proteínas tisulares, particularmente en el músculo e inhibe la proteólisis muscular. Las
hormonas catabólicas como el cortisol, en cambio, estimulan la degradación de proteínas
musculares, aumentando la oxidación de aminoácidos en el músculo y su liberación a la
sangre.
23
INTEGRACION DEL METABOLISMO DE AMINOACIDOS EN ESTADOS DE AYUNO Y
SACIEDAD
Dieta rica en proteínas
Luego de la digestión, los aminoácidos absorbidos en el intestino pasan directamente al
hígado a través de la vena porta, aunque el intestino retiene gran proporción de glutamina.
En una dieta rica en proteínas, habrá sustrato disponible para las enzimas catabolizantes de
aminoácidos. Dado que no existen reservas de proteínas en el organismo, los aminoácidos
en exceso perderán sus grupos amino por transdesaminación, y a partir de ellos se
sintetizará urea, que se eliminará a la sangre y de allí a la orina. Los esqueletos carbonados
podrán ser oxidados para obtener energía, o bien usados en la síntesis de ácidos grasos
(dependiendo de la estructura de su esqueleto carbonado). En los tejidos periféricos, la
insulina aumentará la captación de aminoácidos, que se utilizarán para la síntesis de
proteínas. Dado que el hígado no metaboliza aminoácidos ramificados, estos serán captados
preferencialmente en los músculos
Ayuno
Luego de varias horas post-ingesta, el metabolismo de aminoácidos en el músculo genera
alanina y glutamina. La alanina puede pasar al hígado donde podrá convertirse en glucosa
por gluconeogénesis. La glutamina puede ser captada por el intestino, y se utilizará para la
síntesis de bases nitrogenadas y obtención de energía.
En la medida en que el ayuno persista, el metabolismo de aminoácidos se acelerará, lo que
incluye la proteólisis muscular. Como consecuencia de ello, se libera glicina, alanina y
glutamina que se emplean en la gluconeogénesis hepática y renal. La glicina puede
transformarse en serina y luego en glucosa en el riñón. En el intestino se incrementa el
consumo de glutamina como fuente de energía, y su transformación parcial en alanina
puede servir como fuente de carbonos para la gluconeogénesis hepática. En estas
condiciones, se inducen las enzimas del ciclo de la urea, cuyos niveles aumentan como
resultado de la utilización de aminoácidos como fuente de energía. Finalmente, en un ayuno
muy prolongado, dejarán de sintetizarse proteínas plasmáticas y de regenerarse el epitelio
intestinal. La proteólisis muscular es el último aporte de esqueletos carbonados para la
gluconeogénesis.
24
Metabolismo del HEMO
Porfirinas y Pigmentos Biliares
Prof. Dra. Susana González

Departamento de Bioquímica Humana
Facultad de Medicina
2017
¿Por qué estudiar la bioquímica del HEMO?
Importancia biomédica:
• Forma parte de las Hemoproteínas (Hemoglobina: transporte de

oxígeno en la sangre; Mioglobina: almacenamiento de oxígeno en el
músculo; citocromo c: participación en la cadena de electrones;
citocromo P450: metabolismo de fármacos, etc)
• Para comprender un grupo de enfermedades conocidas como

PORFIRIAS, que son producidas por anomalías en la biosíntesis de
Porfirinas.
• Para comprender los trastornos asociados a alteraciones en la

producción o excreción de pigmentos biliares (como la bilirrubina). La
ictericia, debida al aumento en la bilirrubina plasmática es la
manifestación clínica más prevalente y se presenta en numerosas
enfermedades (anemias hemolíticas, hepatitis viral, cáncer de
páncreas)
1
Porfirinas y Hierro
Síntesis
Degradación
Pigmentos
Biliares y Hierro
HEMO
15% sintetizado por el hígado (para el citocromo P450 y otras hemoproteínas)
85% sintetizado por células eritroides de la médula ósea (para la Hemoglobina)
HEMO: es el ejemplo de una porfirina con

hierro, grupo prostético de la hemoglobina
• Compuesto cíclico, formado por el

enlace de 4 anillos pirrol a través de
puentes metenilo (-HC=)
• Forma complejo con un ión metálico

(Fe2+) enlazado a los átomos de N de
los anillos pirrol
• Presenta cadenas laterales

sustituyentes en el núcleo de porfirina
(Metilo, Propionato, Vinilo; sustitución
asimétrica, serie III)
2
Síntesis del HEMO
ALA sintasa
Matriz mitocondrial
Fosfato ALA sintasa

de
piridoxal
(Punto de fuga de Krebs)
Α-amino-β-
cetoadípico
Paso más lento, limitante de la velocidad
de síntesis de porfirinas en hígado
Acido δ aminolevulínico
(ALA)
ALA sintetasa: paso limitante en la velocidad de síntesis de HEMO
Requerimiento absoluto de Fosfato de piridoxal (vitamina B6) y Mg+2.

También necesita otra vitamina, ácido pantoténico que se encuentra en la
Coenzima A
Se reprime la expresión de la enzima por Hemo (en hígado) y se

activa su síntesis por Hierro (via proteínas regulatorias IRP)
ALA-S 1 ubicua (hepática, otras células)
ALA-S 2 células eritroides (médula ósea)
Importación mitocondrial, participan chaperonas, en la mitocondria se

escinde el péptido señal y se pliega utilizando ATP
3
ALA sintasa
Se sintetiza en
Importación el citoplasma
mitocondrial con la
participación de
chaperonas, en la
mitocondria se escinde
el péptido señal y se
pliega utilizando ATP
Actúa en la
mitocondria
Devlin
Síntesis del HEMO
ALA dehidratasa
(o PBG sintasa)
2 Anillo pirrólico
Citoplasma
+ 2 H2O
ALA Porfobilinógeno (PBG)
Enzima sulfhidrílica, requiere de Zn+2 y se inhibe por Pb
Enzima muy sensible
4
Síntesis del HEMO
Ac : acético
Pr : propiónico Hidroximetilbilano
Tetrapirrol lineal
Porfobilinógeno (PBG)
Ac Pr
A B
espontánea
Pr
D C
Uroporfirinógeno III
PBG deaminasa (PBG-D)
cosintasa
PBG deaminasa (PBG-D)

(o Uroporfirinógeno I sintasa
o hidroximetilbilano sintasa)
(citoplasma)
La PBG-D se asocia a la proteína

Uroporfirinógeno III cosintasa (URO-CoS) la Uroporfirinógeno III
cual dirige la síntesis hacia el isómero III Incoloro
(no tiene anillos conjugados)
Unidos por puentes CH2 (metilenos)

Hidroximetilbilano
Porfirinógenos espontánea
Uroporfirinógeno I
Co- sintasa
oxidación Oxidación
Uroporfirina III Luz
Excretada Uroporfirina I
CO2 Excretada
Coproporfirinógeno I
Uroporfirinógeno
descarboxilasa (Uro-D) Oxidación
Luz
citosólica
Coproporfirina I
Coproporfirinógeno III
5
Síntesis del HEMO
Grupo vinilo
Decarboxilación oxidativa
2 CO2 + 2H2O
Coproporfirinógeno
oxidasa
(Mitocondria; espacio
intermembrana)
Coproporfirinógeno III
Ingresa a mitocondria Protoporfirinógeno III o IX
(Producto no coloreado)
Descarboxilación oxidativa
Requerimiento absoluto de O2 y específica para isómeros tipo III
Síntesis del HEMO
Grupo vinilo Protoporfirinógeno

oxidasa
(Membrana
mitocondrial interna)
Grupo metileno
Protoporfirina IX o III
Protoporfirinógeno IX o III
Los pirroles se unen por puentes metenilo

En el hígado de mamíferos requiere de O2
Forman estructuras de resonancia que las hacen más estables
Tienen la capacidad de absorber luz visible y UV estado electrónico excitado

Radicales libres daños a lípidos, RNA, DNA y proteínas
6
Síntesis del HEMO: paso final
Ferroquelatasa
(Membrana mitocondrial
interna)
Fe2+
Protoporfirina IX o III
El O2 inhibe la enzima y sólo puede usar Fe+2

Enzima sulfhidrílica que se inhibe por metales pesados, especialmente Pb
(intoxicación por plomo: los eritroblastos presentan siderosomas. El Zn2+ puede
incorporarse de forma no-enzimática a la Protoporfirina IX, y forma compuesto
fluorescente bajo luz apropiada; herramienta de detección de la contaminación)
7
Regulación de la síntesis del HEMO
Hígado
a) ALA sintasa, enzima reguladora clave en biosíntesis del Hemo
Inducción – represión: reprimida por el grupo hemo
La regulación de la ALA-S en el hígado es muy sensible a los niveles de
Hemo (para mantener los citocromos P450 involucrados en la síntesis de
sales biliares, colesterol, detoxificación de fármacos, etc)
Ciertas drogas liposolubles como barbitúricos, insecticidas, esteroides, se

metabolizan por un sistema hepático que utiliza la hemoproteína citocromo
P450: usar Hemo en este citocromo, disminuyen el pool de Hemo libre, por lo
tanto resultan inductoras de la ALA-S
Pool de
Apoproteína + Hemo
Hemo libre
celular
Represión de la expresión génica de ALA-S
8
Hígado
a) Inhibición de la expresión de ALA-S
El hemo unido a una proteína (apo-rrepresor) actuaría reprimiendo la
expresión del gen de ALA-S
b) Transferencia de la enzima desde el citosol a la mitocondria

El hemo (hemina) en altas concentraciones impediría la transferencia de la
ALA-S que se sintetiza en los poliribosomas hacia la mitocondria
d) Disminuye la estabilidad y la vida media del ARNm de la ALA-S

(hemina inhibe la traducción)
e) Control alostérico por hemina: inhibición por retroalimentación
f) Otras: Control por glucosa

Inhibe la síntesis por un mecanismo no definido. Algunos pacientes
desencadenan la porfiria luego de dietas hipocalóricas
Inducen citocromo
P450 que usa Hemo:
al disminuir cantidad
de Hemo, se
estimula ALA-S
9
Células eritroides (precursoras de los eritrocitos en médula ósea)
El control es diferente al hepático
Poseen la isoforma ALA-S2
No es regulado por la fluctuación de los niveles de Hemo
El hemo controla la síntesis de la globinas para formar Hb en GR inmaduros

(si Hemo está disminuído, se fosforila el factor elF2 que restringe la producción de
globina)
Las enzimas limitantes son la ferroquelatasa y la PBG-D (hidroximetilbilano

sintetasa)
Porfirias
Grupo de enfermedades metabólicas provocadas por alteraciones
en el camino de la biosíntesis del Hemo
Enfermedades autosómicas dominantes, salvo la porfiria eritropoyética

congénita (recesiva)
Porfiria aguda intermitente
Coproporfiria hereditaria
Hepática
Porfiria jaspeada o variegata
Porfirias Porfiria cutánea tardía
Porfiria eritropoyética congénita

Eritropoyética
Protoporfiria eritropoyética
Verdes: más frecuentes Porfiria adquirida: Plumbismo intoxicación por plomo
10
Porfiria aguda intermitente (PAI)
Autosómica dominante, mutación en PBG-D

Se acumula ALA y PBG en la orina por falla de la PBG-D, y desrepresión
de la ALA-S al no sintetizarse Hemo
Síntomas neuroviscerales: Severos dolores abdominales,

náuseas, vómitos, neuropatías periféricas y disturbios
psiquiátricos
Desbalance en el hepatocito
Excreción de grandes cantidades de PBG y ALA en orina
Se polimeriza para formar porfobilina y neurotóxico

porfirina que dan color a la orina
Consumo de medicamentos la exacerba, ya que el cit P450 consume hemo

y se des-reprime la ALA-S
Tratamiento: infusiones de hematina o hemina (derivados del hemo)

inhiben ALA-S y disminuyen los intermediarios que causan ataque agudo. Y
administrar glucosa (inhibe ALA-S)
11
Coproporfiria hereditaria
Defecto en la copropofirinógeno oxidasa (se acumula el

coproporfirinógeno III)
Diagnóstico: excreción de coproporfirinas en heces

Síntomas: igual que la PAI (sintomas neurovisceales) junto con
fotosensibilidad debido a la presencia de coproporfirinógeno en exceso
Porfiria jaspeada o variegata
Déficit parcial de protoporfirinógeno oxidasa
Deficiencia de hemo, la des-represión de la ALA-S contribuye a acumular

coproporfirinas u uroporfirinas en heces y orina
El coproporfirinógeno y el protoporfirinógeno inhiben la PBG-D por lo que
se acumula ALA y PBG
Síntomas: igual que la anterior: neuroviscerales y fotosensibilidad
Porfiria cutanea tardía (PCT)
Falla la uroporfirinógeno decarboxilasa ( se acumula uroporfirinógeno)
PCT tipo I: defectos en la actividad de URO-D en hígado (baja 50%, causas

multifactoriales; agente desencadenantes como alcohol o insecticidas)
PCT tipo II: mutaciones en URO-D (hereditaria, autosómica dominante)
Acumulación de plasma y orina de uroporfirina
Fotosensibilidad cutánea, ampollas, fragilidad de la piel
Manifestaciones clínicas se asocian a factores desencadenantes como
hidrocarburos polihalogenados, abuso de alcohol, ingestión de estrógenos,
infecciones virales hepáticas
12
Porfirias
Porfiria eritropoyética congénita
Defecto en la URO-CoS (no se sintetiza uroporfirinógeno III), expresado
predominantemente en tejido eritropoyético
Aumenta la uroporfirina I en GR
Las porfirinas tipo I en exceso producen fotosensibilidad
Síntomas: fotosensibilidad cutánea en áreas expuestas al sol, fragilidad de

la piel, coloración en los dientes (eritrodontia), puede ser fatal
Protoporfiria eritropoyética
Déficit hereditario en la ferroquelatasa, por lo que se acumula

protoporfirina IX en eritrocitos y hepatocitos
Aguda fotosensibilidad, pruritro, edema, lesiones severas en la piel
La protoporfirina de los GR difunde al plasma y en el hígado se forman
cálculos y hepatotoxicidad
Plumboporfiria (intoxicación por Pb o saturnismo) Goya
Se inhiben las enzimas ALA-D, PBG-D y

Ferroquelatasa por intoxicación con metales pesados
como el Pb (la más sensible es ferroquelatasa)
No hay Hemo, aumenta excreción urinaria de ALA; síntomas: anorexia,
dolor abdominal, vómitos, somnolencia, etc. Se acumula Fe en eritroblastos
(sideroblastos), se puede incorporar no enzimáticamente Zn2+ a la protoporfirina IX
(diagnóstico para intoxicación por plomo)
Terapéutica: tratamiento con quelantes como el EDTA, apartar de la fuente
de contaminación
13
Catabolismo del hemo
Hemo de los GR Hemo de las hemoproteínas
(120 días) Catalasa, peroxidasa, citocromos
Macrófago Hígado
El Hemo Sistema multienzimático
se oxida Microsomal
Se abre anillo
tetrapirrólico
Biliverdina: tetrapirrol lineal

Pigmento verde
14
II III IV I
Citoplasma
Se forma un puente metileno entre anillo III y IV
Naranja - amarillenta
No conjugada o indirecta (BI)
Estos cambios catabólicos en la estructura de los
tetrapirroles son responsables por el cambio progresivo
en el color de un hematoma: rojizo—azul—verde
amarillento, finaliza en amarillento, cuando abandona el
tejido afectado (se transporta con albúmina hasta el
hígado)

Bilirrubina no conjugada o indirecta
Viaja unida a la albúmina, si se incrementa libre en plasma puede pasar al
SNC y daña el cerebro
Bilirrubina conjugada o directa

El hígado capta la bilirrubina indirecta mediante receptores, se transporta al
Ret Endoplásmico y allí se conjuga con ácido glucurónico
UDP-
glucuronil-
transferasa
REL
Diglucurónido de bilirrubina
Soluble
Marrón
15
Excreción y absorción de Bilirrubina- circulación entero hepática
En el hígado la BD formada se secreta hacia la

vesícula biliar. En el intestino las bacterias la
desconjugan y la transforman en compuestos
reducidos: estercobilinógenos/urobilinógenos
que se eliminan por las heces
Parte del estercobilinógeno se re-absorbe y

se dirige al hígado donde se regenera
glucurónido de bilirrubina (ciclo
enterohepático), otra parte va a circulación
general y se elimina por orina
urobilinógeno estercobilinógeno
Oxidación Oxidación
por aire Incoloro por aire
urobilina estercobilina
Amarilla Marrón Coloración de
las heces
Ictericias
Ictericia : acumulación de bilirrubina en sangre que difunde a los
tejidos, que adquieren coloración amarilla (piel y mucosas)
El aumento de la bilirrubina sérica puede Clasificación

ocurrir por: aumento en la producción,
disminución de captación hepática, - Pre-hepáticas o Hemolíticas,
disminución en la conjugación, - Hepáticas o Hepotocelulares
disminución en la excreción de la bilis - Post-hepáticas u
(intra o extrahepática).
Obstructivas o colestáticas
16
Fisiológica del recién nacido
Esta hiperbilirrubinemia resulta de un sistema hepático inmaduro para la
captación, conjugación y secreción de la bilirrubina
Está elevada la bilirrubina no conjugada y ésta puede penetrar la barrera

hematoencefálica si la concentración en plasma se incrementa (encefalopatía
tóxica: kernícterus).
Fototerapia: tratamiento con luz para que la bilirrubina se transforme en

producto soluble sin la necesidad de conjugación hepática y se elimina por la
orina (bilirrubina es fotolábil en presencia de oxígeno)
VN en el
recién nacido:
7 mg/dl.
Pre-hepática
Causada por la hemólisis aumentada
El aumento en la destrucción de GR
produce mayor cantidad de bilirrubina
transportada por albúmina (bilirrubina
indirecta) en sangre, que no filtra en riñon
(No hay coluria)
Aumenta la oferta de bilirrubina al

hígado, que la conjuga (BD), la vierte en la
bilis en cantidades mayores a la habitual
(llega más BD al intestino)
Este aumento de BD en el intestino

determina el aumento en la producción de
estercobilinógenos que se reabsorben y
puede pasar a circulación general y se
excreta por orina: aumentan
urobilinógenos/urobilina
Hipercolia
No existe coluria (coloración en orina)

Hay coloración oscura de las heces fecales por acúmulo de estercobilinógeno
(hipercolia).
17
Hepática o mixta
Fallas en la captación, conjugación o excreción de bilirrubina por el hígado.
Producción de BI en SRE es normal
El hígado no es capaz de conjugar

toda la bilirrubina
Parte de la bilirrubina sin conjugar

vuelve a sangre: aumenta BI en plasma
Si hay alteraciones del parénquima

hepático puede aumentar la BD en
plasma, que puede eliminarse por riñón y
dar color oscuro a orina (coluria)
Hay menor eliminación de BD a la bilis,

coluria
lo que determina menor cantidad de
estercobilinógeno/estercobilina en heces
(acolia) y menos urobilinógeno/urobilina
Existe coluria por acumulación de bilirrubina directa

No hay coloración de las heces (acolia)
Post-Hepática
Se debe al fallo para excretar la bilirrubina desde el hepatocito al duodeno
(obstrucción)
Producción de bilirrubina en SER normal,
BI es normal
El hígado es capaz de formar la

bilirrubina conjugada, pero la obtrucción de
las vías biliares no permite su excreción
hacia el intestino
Por el estancamiento de los conductos

biliares auemta pasaje de BD (soluble)
hacia la sangre, que puede filtrar en riñón:
orina caoba, COLURIA
Al no llegar bilis al intestino no hay

estercobilinógeno (acolia, heces con
aspecto masilla, gris claro)
No hay ciclo enterohepático y no se

excreta urobilinógeno/urobilina en orina.
Existe coluria por acumulación de bilirrubina conjugada

No hay coloración de las heces (acolia)
18
Especies Reactivas del Oxígeno
(EROS)
Prof. Dr. Héctor Coirini
Radicales libres definición

Principales radicales asociados a la toxicidad del oxígeno
Fuentes celulares de radicales libres
Acción de los radicales libres sobre los tejidos
Sistemas de defensa celulares
Estrés oxidativo
El óxido nítrico como radical libre
Especies reactivas de oxígeno y su relación con patologías
Definición
Los radicales libres son:

especies químicas de existencia
independiente que poseen un
electrón no apareado,
es decir poseen un solo electrón
en el orbital mas externo
Estas especies químicas pueden formarse
de tres maneras diferentes
1.- Por ruptura homolítica de un enlace covalente de una molécula

normal, siendo este el mecanismo mas común.
X : Y !X . + Y .
2.- Por la pérdida de un electrón de una molécula normal
A ! A+. + e-
3.- Por la adición de un electrón a una molécula normal
A + e- ! A-.
Reducción del oxígeno molecular en

la cadena de transporte de electrones
O2 + 4 H+ + 4 e- ! 2 H2O
Como fue explicado en clases anteriores, la reacción se hace en cuatro
pasos univalentes:
O2 + e- ! O2.-
O2.-+ 2 H+ + e- ! H2O2
H2O2 + H+ + e- ! .OH + H2O
.OH + H+ + e- ! H O
2
e- = electrón
H+ = hidrogeniones
O2.- = radical anión superóxido
H2O2 = peróxido de hidrógeno
.OH = radical hidroxilo
H2O = agua
Primera reducción del oxígeno molecular
O2 + e- ! O2.-
** ** ** ** -
* O O*
**
*
*
**
+e * * O O **
**
*
*
**
OXÍGENO Molecular electrón Anión SUPEROXIDO
Ganancia de un segundo electrón
2 O2.- + 2 H+ ! H2O2 + O2
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO
** **
** ** -
* O O *
*
*
*
H ** O ** O ** H
** **
**
**
**
** -
+ 2H+ +
* O ** O ** ** **
** ** * O ** O *
** **
2 Anión SUPEROXIDO
OXÍGENO Molecular
Un tercer electrón entra en juego
El peróxido de hidrógeno reacciona fácilmente en presencia de

metales de transición, para producir un radical libre de oxígeno muy
reactivo y dañino: el radical HIDROXILO (.OH)
H2O2 + Fe 2+ ! .OH + -OH + Fe 3+
(Reacción de Fenton)
O2.- + H2O2 ! .OH + -OH + O2
(Reacción de Haber- Weiss)
Fe3+
Anión Oxidrilo
** ** ** - **
H ** O ** O ** H * O ** H
**
+ ** O
**
*H
*
** **
Fe2+ Radical
HIDROXILO
Anión Oxidrilo
** ** - **
+ O
**
H ** O ** O ** H * O H *
* *H
**
*
+
** ** ** **
Radical HIDROXILO
** **
** ** -
* O O *
*
* * O ** O *
* ** **
** **
Anión SUPEROXIDO OXÍGENO Molecular
O hv
1O
(ozono) O3 O2 2 (oxígeno singulete)
e-
.- (radical
O2 superóxido)
4H+ + 4e- 2H+ + e-
FSII COX H2O2 (peróxido de

hidrógeno)
e- e-
HO. + HO- (radical + ión

H+ + e- hidroxilo)
H+
2 H2O
NOS
Arg NO. (óxido nítrico) NO. + O2-. ONOO-
+ citrulina (peroxinitrito)
Fuentes celulares de radicales libres
Cadena de transporte de electrones a nivel mitocondrial

(respiración celular).
Otros sistemas de transporte de electrones,

citocromos P450 y b5
Oxidasas presentes en peroxisomas
Células involucradas en la actividad fagocítica
La enzima xantino oxidasa representa otra fuente de

radicales libres
Cadena de transporte de electrones
Citocromos P450 y b5
Oxidasas presentes en peroxisomas
Estas organelas contienen enzimas

(OXIDASAS) involucradas en el acorta-
miento de los ácidos grasos de cadena muy
larga, la oxidación de la cadena lateral del
colesterol, y la oxidación de aminoácidos,
ácido úrico y otros sustratos utilizando
oxígeno molecular con formación de agua
oxigenada.
RH2 + O2 ! R + H2O2
Células involucradas en la actividad fagocítica
N ADP H + H +
NADPH O2
NADPH
NA DPH o xid asa
oxidasa
ADP +
NADP
N O 2-
SOD
Bacter ia
H 2O 2 Fe2+
Reacción de Fenton
HOCl
Cl-
Fe3+
MIEL OPEROXID A SA
OH
Invaginación
Inva
vaa ginación de la memb
membrana
brana Bacter ia
de un NEUTROFILO
La enzima xantino oxidasa
O xantina
N
HN
+ S-Fe2+ O2
N N MoVI
O H H H2O
O
.-
N O2
HN MoIV S-Fe3+
O -
N
O N
H H +
2 H+
urato
Acción de los radicales libres

sobre los tejidos
Lípidos
Proteínas
Hidratos de carbono
Ácidos nucléicos
Formación de Radicales Libres de Lípidos
y Lipoperóxidos
Iniciación LH + .OH ! L. + H2O
L. + O2 ! LOO.
LOO. = radical peroxilo,
Propagación LOOH = hidroxiperóxido lipídico
LOO. + LH ! LOOH + L.
Terminación
LOO. + L. ! LOOH + LH con una nueva insaturación
L. + vitamina E ! LH + vitamina E.
L. + vitamina E. ! LH + vitamina E oxidada
Radicales Libres de Lípidos y Lipoperóxidos

Lipoperoxidación del ácido araquidónico
Productos de degradación de lipoperóxidos
X
o O
o OH
Ma
Ma lo
lo n dia
d ia ldehido
l d e h id o L iip
pope ró x
eró id o
xido
d e g rradado
deg ada do
O
CH3
H
OH
4-hidroxi-2-nonenal
Lipoperoxidación en fosfolípidos
Daño oxidativo a proteínas
O
e++
Me
M e++
Fe
F e++
Fe
F H2O2
=
Inactivación de glutamino sintetasa

glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa,
actividad de proteasas
D
a
ñ
o
s
o
b
r
e
l
a
m
e
m
b
r
a
n
a
Acción de radicales libres sobre la membrana

Daño oxidativo a ácidos nucleicos
3' 3'
R R
O O
-O -O P O
P O
O O
CH 2 - COO - H BASE
H 2C
O
BASE
C
Radicales
Libr es H C
C H
O O
O-
-O P O -O P O
O O
R' R'
5' 5'
Daño oxidativo a ácidos nucleicos
O NH 2 O
CH 3 N N
HN N HN
O N N H 2N N N
N H H
H
Timina A d enina Guanina
Especies
Es
species R
React
Re
e
eact ivas de Oxígeno
O O
NH 2 H
H O N
CH 3 N C HN
HN HN
OH H O
OH
O NH H 2N N N
N H N H
Timina glicol f ormamido pirimidina 8 - o xo g uanina

Daño oxidativo a hidratos de carbono
La glucosa puede servir como un atrapador de radicales .OH,

siendo así oxidada.
El manitol y deoxiazúcares reaccionan fácilmente con

radicales libres.
El ácido hialurónico, (principal proteoglicano que mantiene la

viscosidad del fluido sinovial en las articulaciones) es un
glicosaminoglicano que contiene unidades repetidas de
glucurónico y N-acetil-glucosamina el cual puede fragmentarse
por acción de radicales libres
Sistemas de defensa contra el daño oxidativo
Sistemas primarios de defensa
Antioxidantes
Sistemas enzimáticos que intervienen en

el metabolismo de las EROs
Sistemas secundarios de defensa
Enzimas de degradación y/o enzimas reparadoras
Sustancias exógenas atrapadores de radicales libres

Antioxidantes
Vitamina E
Vitamina C
LOO. + vitamina E ! LOOH + vitamina E.
vit E. + ascorbato ! ! semi-dehidro-ascorbato + vitamina E
vitamina E. + CoQH2 ! vitamina E + CoQH.
Antioxidantes
Vitamina A
retinol
vitamina E. + GSH ! vitamina E + GS. 2GS. ! GSSG
Glutation GSSG + NADPH + H+ ! 2 GSH + NADP+
Antioxidantes
hemo + O2 + NADPH + H+ ! Fe3+ + CO + NADP+ + biliverdina

(hemo-oxigenasa)
Bilirrubina
biliverdina + NADPH + H+ ! bilirrubina + NADP+
(biliverdina reductasa)
bilirrubina + agente oxidante ! biliverdina + agente oxidante inactivado
biliverdina + NADPH + H+ ! bilirrubina + NADP+

Biliverdina reductasa
Melatonina
Sistemas enzimáticos
Superóxido dismutasa (SOD)
2 O2-. + 2 H+ ! H2O2 + O2
mitocondria (Mn SOD, tetrámero)
citoplasma (Cu/Zn SOD, dímero)
Catalasa
2 H2O2 ! 2 H2O + O2
Glutation Peroxidasa (soluble dependiente de selenio)
2 GSH + H2O2 ! GSSG + 2 H2O

2 GSH + LOOH ! GSSH + H2O + LOH
Sistemas enzimáticos
Antioxidantes
Su
Supperó xid
e ró xido Fe2+
Fe3+
D is m u ttasa
Dis a sa
2 O2-. H2O2 .OH
2 H+ O2 2 GSH NADP+
G llu
u tta
a ttio
io n
Glu
G lu tta
a ttio
io n
Pe
eroro x id a s a
xidasa
2 H2O + O2 R e d u c ta s a
Reductasa
GSSG
+ NADPH
C a tta
a la
la sa
sa
2 H2O
Sistemas secundarios de defensa
1- Enzimas Lipolíticas:
2- Enzimas Proteolíticas:
3- Enzimas reparadoras del ADN:
4- Sustancias exógenas atrapadores de radicales libres
flavonoides
flavo
antocianos
Estrés Oxidativo
Especies Reactivas
del Oxígeno Defensa Celular
El estrés oxidativo ocurre cuando las

especies reactivas del oxígeno son
producidas mas rápido de lo que son
removidas por las defensas celular
El Óxido Nítrico NO
* **
*
* N ** ** O **
** **
Nº de electrones en la ultima capa
Electrones N = 7
Electrones O = 8
Total = 15
Síntesis del Óxido Nítrico
L-Arg + NADPH + H+ + O2 ! NHO-L-Arg + NADP+ + H2O

NHO-L-Arg + ½ NADPH + ½ H+ + O2 ! L-citrulina + ½ NADP+ + NO + H2O
2 ARGININA + 3 O2
NADPH + H+
NADP+
2 CITRULINA +
2 NO + 3 H2O
Síntesis del Óxido Nítrico
Las óxido nítrico sintasas (NOS)

2 arginina + 3 O2 se clasifican en tres grandes grupos
NADPH + H+
NOS 1.- endotelial (eNOS)
NADP+
2.- macrofágica (mNOS o iNOS)
2 citrulina + 2 NO 3.- neuronal (nNOS)

+ 3 H2O
Reacciones del Óxido Nítrico
Reacciones con diferentes compuestos,

en general las metaloproteínas
Guanilato ciclasa (que es una hemoproteína)
citocromo oxidasa mitocondrial,

citocromo P-450 microsomal y a
proteínas que contienen hierro como la aconitasa del ciclo de Krebs.
Oxihemoglobina
hemoglobina Fe2+_O2 + NO ! NO3- + hemoglobina Fe3+
Reacciones del Óxido Nítrico
Con sulfhidrilos de proteínas,

formando nitrosotioles (RSNO)
Con el anión superóxido,

formando peroxinitrito (ONOO-)
Con otros radicales orgánicos

como el radical peroxilo.
Especies reactivas del NO
nitrito
nitrato
Funciones biológicas del Óxido Nítrico
El NO es una molécula no polar y por lo tanto es soluble en medio

hidrófobo. Esta propiedad le permite difundir fácilmente a través
de las membranas biológicas y así cumplir un rol de mensajero
intercelular
En el endotelio vascular, el NO participa como factor de relajación
NO también puede participar como molécula efectora citotóxica

sobre bacterias, virus y células tumorales a nivel los de macrófagos y
neutrófilos del sistema inmune.
Tiene una participación tanto fisiológica como patológica en el

sistema nervioso
Acción del Óxido Nítrico en el Endotelio
músculo liso
endotelio subendotelial
NO
Guanilato
NO Ciclasa
soluble
NO
Acciones del Óxido Nítrico

Especies reactivas de oxígeno y
su relación con patologías
La radiación ionizante genera .OH por ruptura de moléculas de agua

daño causado por los radicales libres sobre el ADN, lípidos y proteínas
La deficiencia dietaria crónica en selenio (ej. la enfermedad de Keshan -

Glutation Peroxidasa) o de tocoferoles
En el infante prematuro, la exposición de la retina incompletamente

vascularizada a altas concentraciones de oxígeno, pueden llevar a la
retinopatía del prematuro,

En la mayoría de las patologías el estrés oxidativo
es un efecto secundario
Pacientes con artritis reumatoidea, en el cual en el fluido sinovial de la

rodilla se observan grandes cantidades de neutrófilos activados.
Deficiencia en la enzima glucosa-6- fosfato deshidrogenasa afecta a los

eritrocitos. Esta enzima que forma parte de la vía de las pentosas-fosfato,
genera NADPH, el cual es utilizado por la glutation reductasa para generar
glutation reducido.
Fenómeno de reperfusion: La enzima responsable de dicho proceso

parecería ser la xantino deshidrogenasa que se transforma en anoxia en
una xantino oxidasa
Ateroesclerosis basada en la hipótesis de la
modificación oxidativa de las lipoproteínas.
Aumento en los niveles plasmáticos de LDL y de colesterol provocan
depósitos grasos en la pared arterial, formando la lesión primaria
aterogénica.
La injuria tisular produce hemorragias con liberación de hemoglobina por lisis

de los eritrocitos,
LDL oxidadas son captadas por monocitos y macrófagos, las cuales son
transformados en células espumosas.
Por otro lado, las LDL oxidadas dañan la íntima de la arteria, contribuyendo al
proceso aterogénico por disrupción del endotelio.
Ateroesclerosis basada en la hipótesis de la

modificación oxidativa de las lipoproteínas.
Otros ejemplos de estados patológicos asociados
con injuria por radicales libres
Efisema / Bronquitis
Enfermedades neurodegenerativas
Parkinson
Huntington
Alzheimer
Preclamsia
Cáncer
Diabetes
Alteraciones Cardiovasculares
Envejecimiento
BIOQUÍMICA CLÍNICA
Dra. Fabiana Cornejo Maciel
Depto. Bioquímica Humana

Facultad de Medicina – UBA
2017
1
PACIENTE MÉDICO
SIGNOS Y SÍNTOMAS CONOCIMIENTO = DIAGNÓSTICO
ACCIÓN = TRATAMIENTO
SEMIOLOGÍA = OBSERVACIONAL + INSTRUMENTAL

biomarcador
CLÍNICA INVESTIGACIÓN
BEDSIDE BENCH
1
BIOMARCADOR …
parámetro biológico medible y cuantificable
(analito o función: concentración o actividad de una enzima
específica, concentración de una hormona específica, la
distribución del fenotipo de un gen especifico en una población, o la
presencia de sustancias biológicas)
que se puede utilizar como indicador de un estado

fisiopatológico o de salud
(riesgo de enfermedad, trastornos psiquiátricos, exposición
a agentes ambientales y sus efectos, diagnóstico de la enfermedad,
estudios de los procesos metabólicos, abuso de sustancias,
embarazo, estudios epidemiológicos, etc.).
USOS DE LOS ANÁLISIS DE LABORATORIO -

BIOMARCADORES
PARTE INTEGRAL DEL PROCESO DE
TOMA DE DECISIONES
Diagnóstico in vitro
- influencia 60-80% de las decisiones clínicas
- consume sólo aproximadamente el 2% del gasto en salud
4
2
USOS DE LOS ANÁLISIS DE LABORATORIO -
BIOMARCADORES
TOMA DE DECISIONES
- Diagnóstico
- Screening de enfermedades
- Monitoreo de tratamiento
- Detección de complicaciones
- Medicina legal
- Investigación
Antes de solicitar una determinación o práctica,
los médicos deberían considerar si el resultado lo
influenciará en el manejo clínico del paciente.
5
USOS DE LOS ANÁLISIS DE LABORATORIO

TOMA DE DECISIONES
RIESGO
PESQUISA CPK-MB
Fenilalanina Troponina T hEGF receptor
17-OH-P4
Saber si un Saber si un
recién nacido paciente
sufre sufrió/está
fenilcetonuria sufriendo
o hiperplasia un infarto
suprarrenal agudo de
congénita miocardio
3
¿Qué es un
análisis bioquímico?
Es el estudio de las
biomoléculas y células
característicos de procesos
vitales (metabolismo, inmunidad,
etc.) utilizando diferentes
métodos fisicoquímicos
Esto se realiza con diversas
muestras del paciente como:
sangre, orina, LCR y otros
materiales/fluidos.
A partir de estos análisis se obtienen datos que servirán para

conocer el estado de salud del paciente.
7
Procesos en un
Laboratorio de Análisis Clínicos
Pre-Analítico Analítico Post-Analítico
• Indicaciones • Puesta a punto • Validación de
• Preparación del de resultados
paciente instrumentos • Informe de
• Identificación • Calibración resultados
• Toma de • Control de • Informe de
muestra Calidad valores críticos
• Acondiciona- • Análisis de • Asesoramiento
miento de muestras en
muestra interpretación
de resultados
4
Pre-Pre Instancias de interacción
Analítico
●Elección
Médico-Bioquímico
de análisis
Pre-Analítico
●Requisitos Analítico Post-Analítico
● Momento
de Post-Post
• Indicaciones • Puesta a punto • Validación de
Analítico
realización
• Preparación del de resultados
Interpretación
paciente instrumentos de Resultados
• Reporte de
• Identificación • Calibración resultados
Evaluación de
• Toma de • Control de • Reporte de
interferencias
Muestra Calidad valores críticos
• Acondiciona • Análisis de • Asesoramiento
miento de muestras en
muestra interpretación
de resultados
Métodos y Tecnología en el Laboratorio

Métodos Manuales
Autoanalizadores
Espectrofotometría
Electroforesis
Turbidimetría
Citometría de Flujo
RIA/EIA
Microscopía
Inmunofluorescencia
Quimioluminiscencia
Reacción en cadena de
polimerasa PCR
Secuenciación
10
5
VOCABULARIO
XXemia: concentración de XX en sangre
XXuria: concentración de XX en orina
hiperXXemia: concentración de XX aumentada en sangre

normoXXemia o euXXemia: concentración normal de XX
en sangre
hipoXXemia: concentración de XX disminuída en sangre
hiperXXuria: concentración de XX aumentada en orina
normoXXuria: concentracíòn normal de XX en orina
hipoXXuria: concentración de XX disminuída en orina
natremia : Na - natrium
calemia : K
calcemia : Ca
11
VOCABULARIO
- hepatograma: conjunto de análisis bioquímicos que

permiten evaluar la funcionalidad hepática
- hemograma: recuento y descripción de los componentes
formes de la sangre (leucocitos, hematíes y plaquetas)
- ionograma: concentración de diferentes iones
(sodio (Na), potasio (K), calcio (Ca), magnesio (Mg), cloro (Cl)
y bicarbonatos (HCO3-) en una muestra
ionograma plasmático y urinario
- coagulograma
- proteinograma
- lipidograma
12
6
AUTOANALIZADORES – CONTADORES DE CÉLULAS
BIOINGENIERÍA
13
AUTOANALIZADORES
BIOINGENIERÍA
14
7
AUTOANALIZADORES
CARACTERÍSTICAS
•GESTIÓN SIMPLE
•FLEXIBILIDAD
•LECTURA DE CÓDIGO DE BARRAS EN
MUESTRAS Y REACTIVOS
•CONSUMIBLES Y REACTIVOS COMERCIALES LISTOS
PARA EL USO
•REGISTRO DE CALIBRACIONES
•REGISTRO DE CONTROLES
•REGISTRO DE MUESTRAS
•REGISTRO DE ERRORES
•SIMULTANEIDAD DE PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
•SIMULTANEIDAD DE PROCESAMIENTO DE ENSAYOS
•COMUNICACIÓN INFORMATIZADA
•PROGRAMACIÓN
•REPETICIONES AUTOMÁTICAS
OPTIMIZACIÓN Y EFICIENCIA DE PROCESOS

15
TODO NUEVO MÉTODO ANALÍTICO DEBE VALIDARSE PARA

DEMOSTRAR SU IDONEIDAD PARA EL FIN DESEADO
VALIDACIÓN TÉCNICA DE RESULTADOS NUMÉRICOS

EN INFORMES DE LABORATORIO
CARACTERÍSTICAS DE MÉTODOS ANALÍTICOS
ESPECIFICIDAD ANALÍTICA
DETECTABILIDAD - LÍMITE DE DETECCIÓN/CUANTIFICACIÓN
LINEALIDAD
SENSIBILIDAD/RESOLUCIÓN ANALÍTICA
EXACTITUD
PRECISIÓN
CONFIABILIDAD: conjunto de todas las características anteriores

en el contexto del uso que se le va a dar a un método analítico
16
8
ESPECIFICIDAD Y DETECTABILIDAD
ESPECIFICIDAD ANALÍTICA: habilidad del método en cuestión para

detectar exclusivamente a la sustancia que se desea analizar
DETECTABILIDAD - LÍMITE DE DETECCIÓN/CUANTIFICACIÓN: mínima

cantidad de la sustancia que se desea analizar detectable/cuantificable por el
método en cuestión
17

ESPECIFICIDAD ANALÍTICA
habilidad del método en cuestión para detectar exclusivamente a la
sustancia que se desea analizar,
presente en una mezcla compleja de sustancias - interferencias
CAPTURA basada en el uso de
• ENZIMAS ENZIMOENSAYOS
• ANTICUERPOS INMUNOENSAYOS
18
9
DETECTABILIDAD
LÍMITE DE DETECCIÓN/CUANTIFICACIÓN
resultado: no detectable
DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN basada en la medida de de
• AGLUTINACIÓN
• TURBIDEZ
• ABSORCIÓN DE LUZ MÉTODO
COLORIMÉTRICO/ESPECTROFOTOMÉTRICO
• RADIOACTIVO MÉTODO RADIOMÉTRICO
• FLUORESCENCIA MÉTODO FLUOROMÉTRICO
• LUMINISCENCIA, ETC
• REACCIÓN ENZIMÁTICA MÉTODO ENZIMOMÉTRICO
19

ENZIMOENSAYOS
ENSAYOS ENZIMO-COLORIMÉTRICOS/
ENZIMO-ESPECTROFOTOMÉTRICOS
QUÍMICA CLÍNICA glucosa, urea, creatinina, colesterol, bilirrubina,
enzimas, etc.
ETANOL/alcohol deshidrogenasa – produce NADH
GLUCOSA/glucosa oxidasa – produce H2O2
COLESTEROL/colesterol oxidasa – produce H2O2
UREA/ureasa – produce NH3
20
10
INMUNOENSAYOS
INMUNOAGLUTINACIÓN (semicuantitativo)
grupo sanguíneo, VDRL
INMUNOTURBIDIMETRÍA (precipitación)
crioglobulinas
RADIOINMUNOENSAYOS - RIA (Ag marcado): competitivo, equilibrio

- IRMA (Ab marcado): no competitivo
ENZIMOINMUNOENSAYOS - EIA: ELISA, MEIA, FEIA

competitivos no competitivos sandwich
de antígeno marcado de anticuerpo marcado
detección de color (Px - FAL) – a-T.cruzi, β-hCG
detección de fluorescencia: FEIA
OTROS INMUNOENSAYOS
detección UV
detección de quimioluminiscencia (catalasa, Px - luminol)
detección de luminiscencia de origen eléctrico (Rutenio)
21
ECLIA competitivo sandwich

LINEALIDAD Y SENSIBILIDAD ANALÍTICA
LINEALIDAD: proporcionalidad entre la concentración de la sustancia que

se desea analizar y la respuesta del método en cuestión
SENSIBILIDAD/RESOLUCIÓN ANALÍTICA: capacidad del método en

cuestión para discriminar entre concentraciones semejantes de la sustancia
que se desea analizar
22
11
DETECTABILIDAD – LINEALIDAD – SENSIBILIDAD

CURVA DE CALIBRACIÓN - REALIZACIÓN
Representación gráfica: respuesta del método vs
concentración de sustancia
Establece la correspondencia entre las indicaciones de un instrumento

de medida y los valores de la magnitud (concentración) que se mide.
PROCESAR REPETIDAMENTE
PATRONES DE CONCENTRACIÓN CONOCIDA –
ESTADÍSTICA – INTERPRETACIÓN
Blanco: concentración 0
Estándares/patrones de concentración conocida
Aplicar el método
Medir señal
23


CURVA DE CALIBRACIÓN - RESULTADO
24
12

CURVA DE CALIBRACIÓN - INTERPRETACIÓN
25


LINEALIDAD
- Relación lineal entre señal y concentración
- Proporcionalidad directa O inversa
26
13

SENSIBILIDAD/RESOLUCIÓN:
capacidad del método en cuestión para
discriminar entre concentraciones
semejantes de la sustancia que se
desea analizar
Señal
- incremento mínimo de la concentración

que produce un cambio medible en la
señal.
- mínima diferencia de concentración
detectable por el método en cuestión
- PENDIENTE DE LA CURVA DE
concentración CALIBRACIÓN
27

EXACTITUD Y PRECISIÓN
EXACTITUD: grado de concordancia entre la determinación y el valor real
PRECISIÓN: reproducibilidad del análisis – dispersión de resultados

repetitibilidad: mismo método, resto de condiciones iguales en
corto tiempo - variación intraensayo
reproducibilidad: mismo método, resto de condiciones distintas en
mayor tiempo - variación entre laboratorios –
variación interensayos
PROCESAR REPETIDAMENTE UN
CONTROL DE CONCENTRACIÓN CONOCIDA
– ESTADÍSTICA – INTERPRETACIÓN
28
14
EXACTITUD (medida)
PRECISIÓN (desviación estándar)
¿Qué tan cercano está

el valor medido/calculado
del valor verdadero? - SESGO
¿Qué tan cercanos se ubican

entre sí los distintos valores 29
medidos/calculados? - VARIABILIDAD

EXACTITUD (medida)
INEXACTO INEXACTO EXACTO EXACTO

IMPRECISO PRECISO IMPRECISO PRECISO
Error aleatorio Error sistemático
(descalibraciones,
error de cero, 30
de paralaje…)
15
EXACTITUD (medida)
La exactitud y precisión de un proceso de medición son establecidas por la

medición repetida de alguna referencia trazable técnicamente
estandarizada.
PROCESAR REPETIDAMENTE UN
CONTROL DE CONCENTRACIÓN CONOCIDA –
ESTADÍSTICA – INTERPRETACIÓN
Curva/Gráfico
Levey Jenning
Reglas Westgard
31
fecha

FUNDAMENTO
W---– glucosa oxidasa-peroxidasa – produce H2O2 - colorimétrico
A--– hexoquinasa-G6PDH – produce NADH – espectrofotométrico
Linealidad:
W---: hasta 500 mg% A---: entre 5 y 800 mg%
Límite de detección:
W---: 0,54 mg% A---: 2,5 mg%
Límite de cuantificación:
W---: 4,2 mg% A---: 5 mg%
32
16
Precisión
A--- W---
media (mg%) 79,6 281,3 90,7 278
Intraensayo
SD 1,58 1,83 1,26 3,08
%CV 1,98 0,65 1,39 1,11
Entreensayo
SD 0,67 2,62 1,73 4,86
%CV 0,84 0,93 1,92 1,62
33

Glucosa informada: 85 mg%
A--- W---
0,84% = 0,7 1,92% = 1,6
85 ± (2x0,7) = 85 ± 1,4 85 ± (2x1,6) = 85 ± 3,2
83,6 - 86,4 81,8 - 88,2
cualquier valor entre esos límites puede obtenerse en

determinaciones repetidas de la misma muestra
34
17
DETERMINACIÓN DE COLESTEROLEMIA
Colesterol 5,7 mM (220 mg%)

Dieta
Colesterol 6,1 mM (235 mg%)
35

DETERMINACIÓN DE COLESTEROLEMIA
Colesterol 5,7 mM (5,0 – 6,4)

Dieta
Colesterol 6,1 mM (5,4 – 6,8)
Por la variabilidad analítica y biológica, cualquier valor

entre esos límites puede obtenerse en
determinaciones repetidas de la misma muestra
Los cambios reflejan la variabilidad esperada más que

un aumento en la colesterolemia
5,7 mM = 220 mg%

5,0 mM = 193 mg%
6,4 mM = 247 mg%
6,1 mM = 235 mg%

5,4 mM = 209 mg% 36
6,8 mM = 263 mg%
18
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS NUMÉRICOS EN
INFORMES DE LABORATORIO
VALORES NORMALES O RANGO DE REFERENCIA
- Intervalo de valores que usualmente
incluye el 95% de los resultados obtenidos en una
población sana;
2,5% de la población normal fuera del
rango de referencia en cada extremo
- Distribución normal o gausiana

(estadísticamente, Gauss):
95% = media ± 2SD
- UN RESULTADO FUERA DEL RANGO DE REFERENCIA

PUEDE SER NORMAL PARA ESE INDIVIDUO
- UN RESULTADO DENTRO DEL RANGO DE REFERENCIA

PUEDE SER ANORMAL PARA ESE INDIVIDUO – 37
NO EXCLUYE LA ENFERMEDAD

DETERMINACIÓN DE NATREMIA
Na+
- VN 133 – 146 meq / l
- PACIENTE 131 meq / l

¿?
2,5 % = 1/40
1 de cada 40 individuos sanos/normales

puede tener natremia < 133 meq / l
1 de cada 40 individuos sanos/normales

puede tener natremia > 146 meq / l
38
19
Factores que influencian el “valor normal”:

- edad, raza, sexo, entorno, postura, variaciones diarias, estado
ayuno-saciedad, etc.
- método, laboratorio, condiciones de la muestra (hemólisis,
anticoagulante, orina 24 hs).
ESTANDARIZACIÓN
39

IDEAL REAL
Sujetos Sujetos Sujetos Sujetos
“normales” “enfermos” “normales” “enfermos”
“Ill”
40
20
EVALUACIÓN DE PREDICCIÓN
VALIDEZ CLÍNICA DE UNA PRUEBA
UNA PRUEBA DIAGNÓSTICA SERÁ VÁLIDA SI ES CAPAZ DE MEDIR
CORRECTAMENTE EL FENÓMENO QUE PRETENDE ESTUDIARSE
Sujetos Sujetos
“normales” “enfermos”
41

UNA PRUEBA DIAGNÓSTICA SERÁ VÁLIDA SI ES CAPAZ DE MEDIR
CORRECTAMENTE EL FENÓMENO QUE PRETENDE ESTUDIARSE
42
21
TEST A “GOLDSTANDARD”
VALIDAR prueba o criterio usado para identificar
definitivamente a los que tienen la enfermedad
RESULTADO ENFERMO SANO
DEL TEST
POSITIVO VERDADERO FALSO POSITIVO
POSITIVO FP
VP
NEGATIVO FALSO VERDADERO
NEGATIVO NEGATIVO
FN VN
PREVALENCIA:
proporción de enfermos en una población determinada,
en un momento o período dado. 43

44
22
SENSIBILIDAD CLÍNICA: proporción de verdaderos positivos
mide enfermos identificados correctamente por la prueba.
% POSITIVOS PARA INDIVIDUOS ENFERMOS
ESPECIFICIDAD CLÍNICA: proporción de verdaderos negativos

lo que se detecta son los individuos sanos.
% NEGATIVOS PARA INDIVIDUOS SANOS
UNA BUENA PRUEBA DIAGNÓSTICA ES LA QUE OFRECE

ALTA SENSIBILIDAD CLÍNICA Y ALTA ESPECIFICIDAD CLÍNICA
45

VALIDAR
DEL TEST
POSITIVO VERDADERO FALSO
POSITIVO POSITIVO
VP FP
NEGATIVO NEGATIVO
FN VN
SENSIBILIDAD CLÍNICA
PROBABILIDAD QUE ENFERMO DE RESULTADO POSITIVO
S = VP/(VP+FN) 46
23
VALIDAR
DEL TEST
POSITIVO POSITIVO
VP FP
NEGATIVO NEGATIVO
FN VN
ESPECIFICIDAD CLÍNICA
PROBABILIDAD QUE SANO DE RESULTADO NEGATIVO
E = VN/(FP+VN) 47

VALIDAR
DEL TEST
POSITIVO 400 50
NEGATIVO 100 450
TOTAL 500 500

GOLDSTANDARD
PREVALENCIA = 500/1000 = 50%
TEST A VALIDAR
SENSIBILIDAD = 400/500 = 80%
ESPECIFICIDAD = 450/500 = 90% 48
24
SENSIBILIDAD: capacidad de detectar enfermos

FENILCETONURIA: alta sensibilidad (100%)
CEA: baja sensibilidad (72% en avanzados, 12% en tempranos)
ECG: sensibilidad 85% para IAM
ESPECIFICIDAD: capacidad de detectar sanos

FENILCETONURIA: alta especificidad (99,9%)
CEA: especificidad variable (fumadores – no fumadores)
ECG: especificidad 75% para IAM
49
50
25
SEGURIDAD DE UNA PRUEBA
VALOR PREDICTIVO - depende de la prevalencia de la enfermedad en la

población en estudio.
Los valores predictivos (positivo y negativo)

evalúan eficacia real de una prueba diagnóstica.
Indican probabilidades del resultado: probabilidad de padecer o no una
enfermedad una vez conocido el resultado de la prueba
diagnóstica
son valores post-test
dependen de la prevalencia de una enfermedad
51

Valor predictivo positivo:
- probabilidad de que el paciente SI padezca la enfermedad tras obtener un
resultado POSITIVO en el test.
- probabilidad cuando la prueba es positiva, que corresponda a un verdadero
positivo.
- proporción de verdaderos positivos respecto del total de resultados positivos
obtenidos en el test.
Valor predictivo negativo:

-probabilidad de que el paciente NO padezca la enfermedad cuando el
resultado es NEGATIVO en el test.
- probabilidad cuando la prueba es negativa, que corresponda a un verdadero
negativo.
- proporción de verdaderos negativos respecto del total de resultados
negativos obtenidos en el test.
52
26
VALIDAR
DEL TEST
POSITIVO POSITIVO
VP FP
NEGATIVO NEGATIVO
FN VN
Valor predictivo positivo:
número real de enfermos respecto de todos los resultados que
indican presencia de enfermedad.
VPP=(VP)/(VP+FP)
53

VALIDAR
DEL TEST
POSITIVO POSITIVO
VP FP
NEGATIVO NEGATIVO
FN VN
Valor predictivo negativo:
número real de sanos respecto de todos los resultados que
indican ausencia de enfermedad.
VPN=(VN)/(VN+FN)
54
27
VALOR PREDICTIVO - depende de la prevalencia de la enfermedad
en la población en estudio.
A MENOR PREVALENCIA de la enfermedad

VPP DISMINUYE
VPN AUMENTA
BAJA PREVALENCIA, RESULTADO POSITIVO NO ES

CONCLUYENTE – CONFIRMAR
Una prueba con una sensibilidad y una especificidad dada,

puede tener diferentes valores predictivos en diferentes
poblaciones de pacientes con diferente prevalencia de la
enfermedad.
Creatinina tiene mayor valor predictivo de enfermedad renal en 55

población de pacientes de servicio urológico que en población general

INFLUENCIA DE LA PREVALENCIA
Población 20000 habitantes Población 166 habitantes

20 enfermos 66 enfermos
Técnica de diagnóstico ELISA Técnica de diagnóstico ELISA
sensibilidad 95% sensibilidad 95%
especificidad 99% especificidad 99%
Prevalencia?? Prevalencia??
VPP? VPP?
VPN? VPN?
56
28
VALIDAR
Población 20000 habitantes DEL TEST
20 enfermos
Técnica de diagnóstico
POSITIVO 19 200 219
ELISA NEGATIVO 1 19780 19781
sensibilidad 95%
especificidad 99% 20 19980 20000
Prevalencia = 20/20000 = 0,001 -> 0,1%

VPP = 19/219 = 0,087 -> 8,7%
VPN = 19780/19781 = 0,999 -> 99,9%
57

VALIDAR
Población 166 habitantes DEL TEST
66 enfermos
Técnica de diagnóstico
POSITIVO 63 1 64
ELISA NEGATIVO 3 99 102
sensibilidad 95%
especificidad 99% 66 100 166
Prevalencia = 66/166 = 0,39 -> 39%

VPP = 63/64 = 0,98 -> 98%
VPN = 99/102 = 0,97 -> 97%
UN RESULTADO POSITIVO CONFIRMA!!

58
29
INFLUENCIA DE LA PREVALENCIA
PACIENTE
“El test para enfermedad celíaca me dio negativo, significa que no me
tengo que preocupar?”
MÉDICO CLÍNICO
Enfermedad celíaca baja prevalencia
bajo VPP
alto VPN
derivar a especialista si hay síntomas u otros indicios clínicos
59
MUCHOS OTROS FACTORES A TENER

EN CUENTA !!!!
FRECUENCIA DE LOS
ANÁLISIS DE LABORATORIO
- ¿Cuán rápido ocurren cambios biológicos significativos?

Proteinemia no cambia en menos de una semana
- ¿El resultado, si cambia con el tiempo, modifica la actitud en el

tratamiento?
Transaminasas: uso diagnóstico
Potasio: se modifica por tratamiento con diuréticos y puede indicar
necesidad de instaurar otro tratamiento.
60
30
ENFERMEDAD METABÓLICA
HIPÓTESIS DE GARROD: estudió alcaptonuria -
publicó en 1923 “Errores congénitos del metabolismo”
ENZIMA
A B C
C
D
d
61
ENFERMEDADES METABÓLICAS –
ERRORES CONGÉNITOS DEL METABOLISMO
-ENFERMEDADES DEL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO

- DEFICIENCIA ENZIMA RAMIFICANTE
- DEFICIENCIA ENZIMA DESRAMIFICANTE
- DEFICIENCIA FOSFORILASA MUSCULAR O HEPÁTICA
- OTRAS
-DEFICIENCIAS EN EL METABOLISMO DE ÁCIDOS GRASOS

- DEFICIENCIA CARNITINA-ACIL-TRANSFERASA I
- DEFICIENCIA EN ACIL-CoA DESHIDROGENASAS
-DEFICIENCIAS EN EL METABOLISMO DE LIPOPROTEÍNAS

- DEFICIENCIA RECEPTOR LDL
- MODIFICACIÓNES DE APO B100
- DEFICIENCIA LPL
- DEFICIENCIA APO CII
- DEFICIENCIA LCAT
- OTRAS
62
31
-FENILCETONURIA
-ALCAPTONURIA
-GALACTOSEMIA
-HIPERPLASIA SUPRARRENAL CONGÉNITA:

-DEFICIENCIA 21 HIDROXILASA
-DEFICIENCIA 17 HIDROXILASA
-OTRAS
-INSENSIBILIDAD A LOS ANDRÓGENOS (receptor)
-RESISTENCIA A GLUCOCORTICOIDES (receptor)
-MUCHOS OTROS!!!!!
63
ENZIMA
A B C
C
D
d
64
32
Phe-hidroxilasa
Phe Tyr
Tyr
Phe-Pyr
Phe-Pyr
Phe-Lact
Phe-Lact
65
Ley 26.279 de Pesquisa neonatal

Régimen para la detección y posterior tratamiento de
determinadas patologías en el recién nacido. Alcances.
Prestaciones obligatorias. Constitución de una Comisión
Interdisciplinaria de Especialistas en Pesquisa Neonatal. Propósito.
Funciones del Ministerio de Salud.
66
33
ARTICULO 1º - A todo niño/a al nacer en la República
Argentina se le practicarán las determinaciones para la
DETECCIÓN y posterior TRATAMIENTO de
FENILCETONURIA, HIPOTIROIDISMO NEONATAL,
FIBROSIS QUÍSTICA, GALACTOSEMIA,
HIPERPLASIA SUPRARENAL CONGÉNITA,
DEFICIENCIA DE BIOTINIDASA, RETINOPATÍA DEL
PREMATURO, CHAGAS Y SÍFILIS; siendo obligatoria su
realización y seguimiento en todos los
ESTABLECIMIENTOS PÚBLICOS de gestión
estatal o de la seguridad social Y PRIVADOS de la
República en los que se atiendan partos y/o a recién
nacidos/as. Toda persona diagnosticada con anterioridad a
la vigencia de la presente ley queda incluida
automáticamente dentro de la población sujeta de
67
tratamiento y seguimiento.
68
34

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Temas del 3er Parcial Bioquímica 2017

Las reacciones de óxido-reducción o rédox son reacciones de transferencia de

Las reacciones de óxido-reducción se pueden dividir en dos hemirreacciones:

Los pares rédox conjugados difieren en su tendencia a aceptar electrones. Esta

E0´ = E0´hemirreacción - E0´hemirreacción

Entonces la diferencia de potencial estándar (E0’) de la reacción será:

Conociendo la diferencia de potencial de la reacción se puede calcular su variación

G0´= -n.F. E0´

La reacción de óxido-reducción en condiciones estándar es espontánea tal como

Según la segunda ley de la termodinámica, G es criterio de espontaneidad: todo

Calcule el E°' y el G°' de la reacción para demostrar esta afirmación.

Zn2+/Zn0 E0´Zn2+ /Zn0

Por lo tanto, podemos resumir la información proporcionada por los Potenciales de

Propanal ácido propanoico

a) ¿Qué característica consideró Ud. para elegir la sustancia más oxidada?

2- Para la siguiente reacción:

4- Discuta cómo será el Eº’...

5- Calcular la variación de energía libre estándar que se produce al pasar un par de

6- Calcular la variación de energía libre estándar que se produce al pasar un par de

8- Calcular la Keq de la siguiente reacción a 25°C y pH 7

9- Ordene las siguientes sustancias en orden creciente de tendencia a reducirse:

14- Para la reacción

15- Dados los siguientes pares rédox:

16- Dados los siguientes potenciales de reducción:

18- Dados los potenciales de reducción estándar de las siguientes hemirreacciones:

21- La enzima malato deshidrogenada cataliza la formación de la última de las tres

23- Ídem 22 en presencia de rotenona.

B- Técnicas de transferencia o “blotting”

La electroforesis en gel es una técnica en la que se aplica un campo eléctrico para

¿Cómo identificar específicamente un fragmento de interés en la membrana?

2) Separación por Tamaño Tamaño Tamaño o carga

3) Tratamiento del Desnaturalizar el Nada Nada

Por capilaridad Por capilaridad Campo eléctrico

Figura 4: secuenciación de ADN

D- ADN producido por transcripción reversa

E- Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR)

Figura 5: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

F- PCR en tiempo real

USO DE TECNICAS DE INGENIERÍA GENÉTICA EN EL DIAGNOSTICO DE

Existe otra clase de secuencias repetitivas de ADN dispersas, los microsatélites

Dada la enorme variabilidad en el número de repeticiones en tándem de un

Ventajas de los STRs sobre los VNTRs

Aplicaciones de la huella genética

Figura 7: Análisis de los VNTRs realizado con distintas muestras.

La información genética no es solo relevante para el paciente afectado, sino

La historia de Lucía ilustra apenas una manera en que la farmacogenética puede

USO DE TECNICAS DE INGENIERÍA GENÉTICA PARA LA PREVENCIÓN Y

Algunas proteínas obtenidas por técnica de ADN recombinante utilizadas en la medicina:

Estimula la producción de eritrocitos; usada para tratar anemias en

Factores de Estimula la diferenciación y crecimiento de varios tipos celulares; usados

Proteínas derivadas de la cápside viral efectivas en alertar al sistema

2.- ¿Para qué se utiliza la técnica de Southern blot? Y Northern blot?

8.- ¿Qué es un organismo transgénico?

9.- ¿Cómo diagnosticaría una infección por HIV a través de la utilización de

a) ¿Qué VNTR utilizaría para poder dar un diagnóstico?

2) La anemia falciforme es una enfermedad autosómica recesiva causada por una

a) ¿Qué conclusiones saca de los resultados obtenidos?

5) Se ha encontrado una enfermedad relacionada con el gen X que codifica para la

a) Explicar por qué el individuo B no presenta síntomas.

Western blot 43 kDa

BIOQUIMICA ILUSTRADA DE HARPER

Directamente como electrones

Por combinación directa de un reductor orgánico con O2