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Universidad de Guayaquil

Facultad de Ciencias Naturales


Carrera de BIOLOGÍA
Cuarto Ciclo
Asignatura: Bioquímica /laboratorio
PRACTICA N° 5
PRUEBAS QUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS

Introducción
Los carbohidratos constituyen sustancias con grupos funcionales aldehídicos o
cetónicos, además de radicales alcohólicos primarios y secundarios. Se definen como
polihiroxialdehídos, polihidroxicetonas o aquellos compuestos que por hidrólisis los
producen.

Ellos son componentes fundamentales de muchos alimentos y su degradación


durante el proceso de digestión genera la energía necesaria para las funciones vitales
del organismo. Cuando se encuentran combinados con otras biomoléculas, dan origen
a moléculas más complejas cuyas funciones pueden ser estructurales o de soporte
celular y tisular, de comunicación entre células, de reconocimiento o de señalización.

En sesión práctica se realizarán una serie de reacciones químicas que desarrollan


color, con el fin de identificar, reconocer o separar los diferentes carbohidratos, tales
como monosacáridos, disacáridos o polisacáridos.

La mayoría de las reacciones utilizadas se basan en el poder reductor de los


azúcares. Los carbohidratos reductores, son los más comunes y actúan como agentes de
este tipo, debido a que en su molécula están presentes radicales aldehídicos o cetónicos.
Las propiedades reductoras se ponen de manifiesto mediante su capacidad para reducir
iones metálicos, de preferencia cobre y plata, en solución salina.

Existen diferentes tipos de reacciones químicas que sirven para determinar


cualitativamente la presencia de carbohidratos (monosacáridos, disacáridos y
polisacáridos) como son las siguientes:

Reacciones basadas en la formación de derivados del furfural:

(a). La Prueba de Molish: Se basa en la acción deshidratante e hidrolizante del ácido


sulfúrico concentrado sobre los carbohidratos (Fig. 1). En esta prueba, el ácido fuerte
cataliza la hidrólisis de cualquier enlace glicosídico presente en la muestra, y la
deshidratación del mismo a furfural (pentosas) e hidroximetilfurfural (hexosas) de los
monosacáridos resultantes. Estos furfurales se condensan con naftol y dan un producto
coloreado (Fig. 2). Esta prueba es cualitativa y es utilizada para identificar a todos los
azúcares en general.

Figura 1. Prueba de Molish: reacción entre carbohidratos , H2SO4 y el α-naftol.

Figura 2. Mecanismo de la Reacción de Molish

(b). Prueba de Selliwanoff: En esta reacción las cetosas, en HCl concentrado,


experimentan una deshidratación para producir derivados del furfural con más rapidez
respecto a las aldosas. Posteriormente los derivados del furfural forman complejos con
el resorcinol para producir color. Consecuentemente los grados relativos del color
desarrollado en una solución que contiene azúcar, HCl y resorcinol, proporciona
evidencia sobre si el azúcar es una aldohexosa o cetosa.

Las cetosas generalmente producen un color rojo. En las condiciones que se efectúa la
prueba, todas las cetosas que pueden estar unidas en enlace glicosídico quedarán en
libertad y originarán reacción positiva.
Otras reacciones están basadas en la formación de derivados del furfural, en la cual
todos los azúcares dan positiva la reacción. Los monosacáridos pueden deshidratarse
con ácidos minerales fuertes y concentrados para dar lugar a derivados del furfural. Esta
propiedad se utiliza con fines analíticos; ya que los furfurales reaccionan con
compuestos fenólicos, como el α-naftol o la resorcina, para dar derivados quinónicos
coloreados. En esta propiedad se basan los métodos de identificación de Molisch,
Seliwanoff, Bencidina y Tollens.

Figura 3. Reacción de Selliwanoff: deshidratación de cetosas y formación de un


complejo coloreado con el resorcinol.

Reacciones basadas en reconocimiento del poder reductor en carbohidratos:


a.-Prueba de Benedict se aplica para la detección de los azúcares reductores. Cuando el
Cu2+ en solución alcalina, se reduce, este se precipita como Cu2O como un sólido
amarillo-rojo. El azúcar reductor por su parte, se oxida, se fragmenta y se polimeriza en
la solución de Benedict (Fig. 4), que es fuertemente alcalina. Es decir, los azúcares
reductores son capaces de reducir en caliente y en medio alcalino, el Cu (II), azul a Cu
(I), rojo (Fig. 5).

Este es el fundamento de las clásicas reacciones de Fehling y Benedict. En cuanto la


variabilidad de la coloración para las muestras que reflejan presencia de azúcares
reductores. Estos colores varían según el contenido o concentración de estos azucares
en las muestras (Fig. 6).
Figura 4. Complejo coloreado azul del reactivo de Benedict.

Figura 5. Prueba de Benedict. Reacción entre el citrato de sodio cúprico (Cu2+) y un azúcar
reductor para formar CuO de color amarillo-verdoso-rojo.

Figura 6. Observación de colores obtenidos en la prueba de Benedict: color azul-celeste


(ausencia de azúcares reductores), coloración verdosa (bajo contenido), amarillo-rojizo
(moderado), rojiza (alto).

b.-Prueba de Barfoed: Permite distinguir monosacáridos de disacáridos. Aquí el Cu2+ del


reactivo (acetato cúprico en ácido acético diluido), es reducido a Cu2+ (Cu++) en solución
de ácido débil, en un tiempo de 5 a 8 minutos con los monosacáridos. Los disacáridos
reducen el ion Cu2+ en un tiempo de 9 a 30 minutos. El Cu2O es un precipitado de color
rojo. Es necesario realizar esta prueba en condiciones de pH y de calentamiento fijas y
estrictas.

Figura 7. Reacción de Barfoed. Formación del precipitado reducido de Cu2O.

Reconocimiento de polisacáridos (glucógeno y almidón):


Prueba de Lugol: Se basa en la formación de un complejo entre el ion I2 del lugol
(solución de I2 y de IK) y la molécula de amilosa de almidón (Fig. 8); la cual tiene una
conformación helicoidal. Al introducirse el ion I2 dentro de la hélice (Fig. 9) se forma una
solución color azul o negra dependiendo de la concentración. La amilopectina produce
un color púrpura rojizo, y el glucógeno un color pardo rojizo.
Esta prueba se utiliza como indicador del grado de madurez de los frutos. En los verdes
o inmaduros, con elevadas concentraciones de almidón, la tinción es mas significativa
del color violeta; mientras que en los frutos maduros, ya el almidón se ha hidrolizado
en glucosa o transformado en sacarosa, por lo que la prueba del Lugol, da negativa o
con poca tinción violeta.

Figura 8. Prueba de Lugol


Figura 9. Complejo Iodo-almidón: Introducción de los átomos de Iodo en las hélices de la
almilosa.

OBJETIVO GENERAL
Reconocer carbohidratos mediantes pruebas químicas
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Aplicar pruebas químicas específicas basadas en la formación de derivados del
furfural, poder reductor y otras propiedades en carbohidratos.

2. Reconocer azúcares reductores mediante pruebas de óxido-reducción a partir de


muestras vegetales.

3. Reconocer disacáridos y polisacáridos a partir de muestras vegetales

RECURSOS UTILIZADOS
1.-Materiales y equipos: capsula de porcelana, gradilla, tubos de ensayo, plancha de
calentamiento, pipeta graduada de 10ml, pipetas de plástico graduadas, goteros,
probetas de 5, 10, 25ml, varillas de vidrio, vasos de precipitación, estufa, termómetros,
pinzas

2.-Reactivos: lugol, naftol, Na2CO3, 175 g de citrato de sodio, CuSO4.5H2O, etanol,


Na2CO3, acetato cúprico, ácido acético concentrado, resorcinol, H2S04 concentrado.
3.-Azucares grado técnico: glucosa, fructosa, arabinosa, xilosa, maltosa, lactosa,
almidón, celulosa, sacarosa. Todas a una concentración del 1% (p/v),

4.-Muestras biológicas: Concentrados de frutas maduras (mora, papaya, mango,


guineo, sandia), azúcar, trozos de papa, yuca, almidón, fructosa, pastillas de condroitin
sulfato y glucosamina, edulcorante, leche líquida, yogurt, miel de abeja, stevia, trozo de
hígado, cascara de naranja o de maracuyá.

PROCEDIMIENTO:
I.-Preparación de reactivos
a.-Reactivo de Molish: Disolver 10 g de naftol en 100 ml de etanol al 95%
b.-Reactivo de Lugol: Moler y mezclar finamente en un mortero 50 g de yodo y 100 g de
yoduro de potasio. Disolver con agua destilada y aforar hasta un volumen de 1 litro.
c.-Reactivo de Barfoed: Disolver 13.3 g de acetato cúprico con 200 ml de agua y filtrar
si es necesario, añadir 1.9 ml de ácido acético concentrado.

d.-Reactivo de Silliwanoff: Disolver 0.5 g de resorcinol en 100 ml de HCl diluido 1:2.


e.-Reactivo de Benedict: Disolver 100 g de Na2CO3, 175 g de citrato de sodio, 17.3 g de
CuSO4.5H2O en un litro de agua destilada.
Nota:
*Todas las muestras de azúcares serán preparadas al 1% (p/v) a un volumen de 100ml.
*Las muestras a analizar contienen un solo carbohidrato, a excepción de las muestras
vegetales.
*Todas las reacciones deben ser aplicadas sobre las diferentes muestras de
carbohidratos proporcionadas: un blanco o testigo (agua destilada) y una muestra
desconocida (problema), que al final de la realización de todas las pruebas, debe ser
identificada.

I.-Reacciones basadas en la formación de derivados del furfural


1). Reacción de Molisch (alfa-naftol):
a).-Añada 4 gotas del reactivo a 2 mL de una solución de carbohidrato al 1%.
b).-Mezclar bien, inclinar el tubo y añadir por las paredes 1 mL de H2S04 concentrado,
con sumo cuidado.
c).-La formación de un anillo violeta en la interfase es prueba positiva para
carbohidratos.
d).-Observe y anote el resultado.
2).-Reacción de Selliwanoff

a.-A 2 mL del reactivo se le agregan 5 gotas de una solución de carbohidrato al 1%. Se


agita y se calienta la mezcla hasta ebullición.
b).-La reacción es positiva cuando se produce un color rojo, que puede separarse de
un precipitado rojo parduzco y el cual puede ser disuelto en alcohol.

II.- Reacciones basadas en el Poder Reductor


1.-Reacción de Benedict
a).-A 2 mL de solución de carbohidrato en un tubo de ensayo se le añade 8 gotas del
reactivo de Benedict.
b).-Se hierve la mezcla durante 3 minutos en baño de maría.
c).-Si el azúcar es un compuesto reductor se observa la aparición de un precipitado que
puede ser rojo, amarillo o verde dependiendo de la concentración de la muestra. Sin
embargo, trazas de impurezas dejan el reactivo de un color verde azulado.
d).-Para el caso de la sacarosa, se debe de añadir unas gotas de HCl y luego, el reactivo
de Benedict, posteriormente calentar y ver posibilidad de formación de un complejo
amarillo-rojizo, de acuerdo a la concentración del disacárido.
2).-Prueba de Barfoed
a).-A cada tubo con muestras desconocidas o identificadas se les añade 1 ml de agua
(ensayo blanco); y así como también, a los tubos con glucosa, sacarosa, almidón y a los
tubos con muestras solución desconocida.
b).-Posteriormente, a cada tubo se le adiciona 2 ml de reactivo de Barfoed y se colocan
en un baño hirviendo.
c).-Anotar el tiempo que tarda en aparecer un precipitado amarillo-rojizo o rojo.
d).-Los monosacáridos dan la reacción con mayor rapidez (5-8 min), respecto a los
disacáridos con poder reductor (9-30min).

III.-Reacciones basadas en otras propiedades


1).-Reacción de Yodo (Lugol)
a).-Colocar 1 mL de la muestra de carbohidrato en un tubo de ensayo y añadir 3 mL de
agua destilada y 2-4 gotas de Lugol. Agitar bien
b).-La reacción es positiva cuando aparece una coloración variable desde azul intenso
(almidón) hasta el pardo rojo (glucógeno, dextrinas).
c).-Tome los tubos que resulten positivos y caliéntelos (aprox. a 70 ºC) por 10 minutos y
anote cualquier posible cambio en la coloración.
d).-Déjelos enfriar y observe que ocurre.

Tabla de resultados:
Indicadores: coloración de cada precipitado en caso de ser positivo, observaciones en
pruebas negativas, intensidad de color, rapidez de formación de precipitados.

Muestra Molish Selliwanoff Benedict Barfoed* Lugol


Glucosa

Fructosa

Arabinosa

Maltosa

Lactosa
Sacarosa

Celulosa

Pectina

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

Muestra 4

Muestra 5

Muestra 6

Muestra 7

Muestra 8

Observaciones:
1.-Incluir el nombre de las muestras que han traído para su análisis correspondiente.
2.-Indicar en las muestras que den positiva la reacción de Barfoed, el tiempo de
aparición del precipitado pigmentado.
3.-Para cada uno de estas pruebas discuta los resultados e indique las conclusiones.
4.-Identifique los carbohidratos que puedan estar presentes en las muestras biológicas
analizadas.
5.-Elaborar una tabla integradora con todos los resultados obtenidos con las muestras
biológicas de todos los grupos
Autoevaluación:
1. De acuerdo a los siguientes resultados obtenidos según las pruebas realizadas,
identificar cada muestra. Discuta los resultados para la identificación de cada
carbohidrato.
Muestra Molish Selliwanoff Benedict Barfoed Lugol Carbohidrato
Muestra 01 + - + + -
(10min)
Muestra 02 + - + + -
(5min)
Muestra 03 + + - + -

Muestra 04 + - - - +

2. Explicar por qué los azúcares empleados dan positivo o negativo en las pruebas
ensayadas.

3. ¿Cuándo se considera que un hidrato de carbono es reductor?. De dos ejemplos de


monosacáridos y de disacáridos reductores.

4. ¿Qué reacción de las realizadas se podría utilizar para identificar glucosa en orina?

Bibliografía
 Barboza, J., Ortiz., G., Salcedo, R. 2009. Manual de Prácticas de Bioquímica.
Universidad de Guanajuato. México.
 Boyer, R. Modern Experimental Biochemistry. 1993. Second Edition, pp 102-108.
 Cooper, t. The Tools of Biochemistry. New York: John Wiley and sons, 1997.
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 Hicks, J.J. Bioquímica. Segunda Edición. McGraw-Hill Interamericana. México
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Industrial de Santander.
 Mathews, K., Van Holde, K. 1998. Bioquímica. Segunda Edición. McGraw-Hill
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 Nelson, D., Cox, M. 2007. Lehninger: Principles of Biochemistry. Third Edition.
Worth Publishers. N.Y.
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 Introducción a la Bioquímica Práctica. Bogotá. McGraw-Hill Latinoamérica.
 Robit, J. and White, B. Biochemical Techniques. Theory and Practice. Illinois:
Waveland Press. 1987.
Figura 10. Marcha analítica de reconocimiento de carbohidratos.

Elaborado por:
Ever Morales
Leonardo García

Guayaquil, enero de 2018