ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang

terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen
dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis,
patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah
antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik
dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini
terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah
oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan
panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan
berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya
fluoresensi.
Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen
tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu
permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang non-spesifik
(melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain
yang spesifik untuk antigen yang sama, disebut ‘sandwich’ ELISA). Setelah antigen
diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen.
Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi secara langsung
oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap
tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein
atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan
substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan kuantitas
antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun
metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif .
2.2 Jenis-Jenis Metode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik ELISA
kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim, dan
teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi (primer dan sekunder). Pada
teknik ELISA nonkompetitif, antibody kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim
yang berfungsi sebagai signal. Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai
teknik ELISA sandwich.
 Dewasa ini, teknik ELISA telah berkembang menjadi berbagia macam jenis teknik.
Perkembangan ini didasari pada tujuan dari dilakukannya uji dengan teknik ELISA tersebut
sehingga dapat diperoleh hasil yang optimal. Berikut ini adalah beberapa macam teknik ELISA
yang relatif sering digunakan, antara lain : ELISA Direct, ELISA Indirect, ELISA Sandwich,
dll.
1. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRECT
Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik ini seringkali
digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel ELISA direct
menggunakan suatu antibody spesifik (monoklonal) untuk mendetaksi keberadaan antigen
yang diinginkan pada sampel yang diuji. Pada ELISA direct, pertama microtiter diisi dengan
sampel yang mengandung antigen yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat menempel
pada bagian dinding-dinding lubang microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk membuang
antigen yang tidak menempel pda dinding lubang microtiter. Lalu antibodi yang telah ditautkan
dengan enzim signal dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter sehingga dapat
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan, yang dilanjutkan dengan membilas microtiter
untuk membuang antibody tertaut enzim signl yang tidak berinteraksi dengan antigen. Lalu, ke
dalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan
enzim signal, sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan
antigen yang diinginkan akan berinteraksi dengan substrat dan menimbulkan signal dapat
dideteksi. Pendeteksian interaksi antara antibodi dengan antigen tersebut selanjutnya dapat
dihitung dengan menggunakan kolorimetri, chemiluminescent, atau fluorescent end-point.
ELISA direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain :
a. Immunoreaktifitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan enzim.
b. Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan mahal.
c. Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari antibodi pada percobaan
yang berbeda.
d. Amplifikasi signal hanya sedikit.
e. Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum digunakan untuk
uji ELISA direct.
Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain :
a. Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibody.
b. Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silang dengan antibody lain
(antibody sekunder) dapat diminimalisasi.
2. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) INDIRECT
 ELISA Indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang paling sederhana,
hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur konsentrasinya merupakan
antibody. ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik (monoklonal) serta antibody
sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibody yang diinginkan
pada sampel yang diuji.
Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi
antibodi dalam serum adalah:
1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan
lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara
adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva
standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan
diuji.
2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau
kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini dikenal sebagai blocking,
karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.
3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari
antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk
antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-
spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.
4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam
lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang,
bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.
5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam
lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik.
Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.
6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.
7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/
fluorogenik/ elektrokimia.
8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia
lainnya.
Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim
yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama
dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga
setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi
 analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan
pada permukaan lubang.
ELISA indirect memiliki beberapa kelemahan, antara lain :
a. Membutuhkan waktu pengujian yang relative lebih lama daripada ELISA direct karena ELISA
indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen
spesifik dengan antibody yang dinginkan dan antara antibody yang diinginkan dengan
antibody sekunder tertaut enzim signal, sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1
kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan
antibody spesifik tertaut enzim signal.
Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain :
a. Terdapat berbagai macam variasi antibody sekunder yang terjual secar komersial di pasar.
b. Immunoreaktifitas dari antibody yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh penautan
enzim signal ke antibody sekunder karena penautan dilakuka pada wadah berbeda.
c. Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibody yag diinginkan memiliki beberapa epitop
yang bisa berinteraksi dengan antibody sekunder.
3. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) SANDWICH
Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibody primer spesifik untuk menangkap antigen
yang diinginkan dan antibody sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan
antigen yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan
ELISA direct, hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu
dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat berinteraksi dengan
antibody primer spesifik dan antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal, maka
teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada antigen memiliki minimal 2 sisi
antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent seperti
polisakarida atau protein. Pada ELISA sandwich, antibody primer seringkali disebut sebagai
antibody penangkap, sedangkan antibody sekunder seringkali disebut sebagai antibody
penangkap, sedagkan antibody sekunder seringkali disebut sebagai antibody deteksi.
Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk
mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan
dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki tingkat
sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut
untuk berinteraksi dengan kedua antibody.
Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:
1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’
2. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat
5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen
6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan
antibodi primer
7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang.
8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/
elektrokimia
9. Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen
Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yng mempengaruhi tingkat sensitivitas
dari hasil pengujian, antara lain :
· Banyak molekul antibody penangkap yang berhasil menempel pada dinding-dinding microtiter.
· Avinitas dari antibody penangkap dan antibody detector terhadap antigen sebenarnya, teknik
ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA terdahulu, yaitu ELISA
direct.
Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat sensitivitasnya
yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan dua
jenis antibody, yaitu antibody penangkap dan antibody detector, kemampuannya menguji
sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki.
Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein
serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas
antigen yang terimobilisasi.
Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu teknik ini
hanya dapat diaplikasikan untuk medeteksi antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya
mencari dua jenis antibody yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang
berbeda (epitopnya harus berbeda).
4. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Biotin Sterptavidin (Jenis ELISA Modern)
Pada perkembangan selanjutnya, teknik ELISA sandwich ini juga dikembangkan untuk
mendeteksi antibody dengan tingkat sensitivitas relatif lebih tinggi. Teknik ini dikenal sebagai
teknik ELISA penangkap antibody, dimana prinsip kerjanya sama dengan ELISA sandwich,
hanya saja yang digunakan dalam teknik ini adalah antigen penangkap dan antigen detector
(antigen bertaut enzim signal, bersifat opsional apabila antibody yang diinginkan tidak bertaut
dengan enzim signal).
 Contoh dari aplikasi teknik ini adalah teknik ELISA untuk mendeteksi vitamin biotin
yang bertaut dengan suatu antibody avidin dengan mengubah antibody avidin menjadi antibody
streptavidin, dimana satu molekul streptavidin dapat mengikat empat molekul biotin
(pengembangan dari ELISA indirect), sehingga signal yang teramplifikasi menjadi semakin
kuat akibat interaksi antara biotin dengan enzim yang menjadi semakin banyak.
5. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Multiplex
Teknik ELISA merupakan pengembangan teknik ELISA yang ditujukan untuk pengujian
secara simultan,sedangkan prinsip dasarnya mirip dengan teknik ELISA terdahulu.
6. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) COMPETITIVE
Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA terdahulu.Prinsip
dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke dalam lubang
mikrotiter.Teknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi keberadaan
antigen atau antibody.
Pada pendeteksian antigen, pertama mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim signal,
sehingga antibody spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
lubangmikrotiter. Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan dengan
enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke
dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi antara antigen spesifik bertaut
enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan antibody
spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antigen spesifik tertaut
enzim signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik.
Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat
bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik, sehingga enzim yang tertaut
dengan antigen yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat
dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses pendeteksian ini, pendeteksian
positif ditandai oleh tidak adanya signak yang ditimbulkan, yang berarti bahwa antigen yang
diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan
berinteraksi dengan antibody spesifik.
Sedangkan pada pendeteksian antibody, pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang
dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik tertaut enzim
signal, sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
mikrotiter, kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak
menempel pada dinding-dinding mikrotiter.
 Lalu larutan yang mengandung antibody spesifik yang telah ditautkan dengan enzim
signal dan larutan sampel yang mengandung antibody yang diinginkan dimasukkan ke dalam
lubang-lubang mikrotiter, sehingga terjadi kompetisi antara antibody spesifik tertaut enzim
signal dengan antibody yang diinginkan untuk dapatberinteraksi dengan antigen spesifik, yang
dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim
signal atau antibody yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik.
Lalu, kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat
bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik, sehingga enzim yang tertaut
dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat
dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses pendeteksian ini, pendeteksian
positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang ditimbulkan, yang berarti antibody yang
diinginkan telah menang berkompetisi dengan antibody spesifik tertaut enzim signal dan
berinteraksi dengan antigen spesifik.
Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah
sinyal yang dihasilkan.
Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi
terhadap larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan, tapi hasil
yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody
dan antigen.

Prinsip Kerja ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simple dapat dijabarkan sebagai berikut :
Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu permukaan yang
berupa microtiter. Penempelan tersebut dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu penempelan
secara non spesifik dengan adsorbs ke permukaan microtiter, dan penempelan secara spesifik
dengan menggunakan antibody atau antigen lain yang bersifat spesifik dengan antigen atau
antibodi yang diuji (cara ini digunakan pada teknik ELISA sandwich). Selanjutnya antibodi
atau antigen spesifik yang telah ditautkan dengan suatu enzim signal (disesuaikan dengan
sampel => bila sampel berupa antigen, maka digunakan antibodi spesifik , sedangkan bila
sampel berupa antibodi, maka digunakan antigen spesifik) dicampurkan ke atas permukaan
tersebut, sehingga dapat terjadi interaksi antara antibodi dengan antigen yang bersesuaian.
Kemudian ke atas permukaan tersebut dicampurkan suatau substrat yang dapat bereaksi dengan
enzim signal. Pada saat substrat tersebut dicampurkan ke permukaan, enzim yang bertaut
dengan antibodi atau antigen spesifik yang berinteraksi dengan antibodi atau antigen sampel
 akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan suatu signal yang dapat dideteksi. Pada
ELISA flourescense misalnya, enzim yang tertaut dengan antibodi atau antigen spesifik akan
bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang berupa pendaran flourescense.

Contoh Cara Kerja ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Berikut ini adalah contoh langkah kerja beberapa macam teknik ELISA, yaitu:
a. Pendeteksian antibody dengan ELISA indirect:
1. Melapisi mikrotiter plate dengan antigen yang sudah dimurnikan dengan membiarkan larutan
berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit.
2. Membilas antigen yang tidak terikat dengan buffer.
3. Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan protein yang
tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk).
4. Membilas protein yang tidak melekat.
5. Menambahkan sampel serum yang akan dideteksi antibodinya dan membiarkan antibody
spesifik untuk berikatan dengan antigen.
6. Membilas antibody yang tidak terikat.
7. Menambahkan anti-Ig yang akan berikatan pada daerah Fc pada antibody yang spesifik (sebagai
contoh, anti-rantai gamma manusia yang berikatan dengan IgG manusia). Daerah Fc pada anti-
Ig akan berikatan secara kovalen dengan enzim.
8. Membilas kompleks antibody-enzim yang tidak terikat.
9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke enzim akan
dikonversi menjadi produk.
10. Inkubasi sampai muncul warna, dan
11. Ukur dengan spectrometer. Jka semakin pekat warna yang dideteksi, maka makin besar kadar
antibody spesifik dalam sampel.

b. Pendeteksian antigen dengan ELISA sandwich:

1. Melapisi mikrotiter plate dengan antibodi yang sudah dimurnikandimurnikan dengan
membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit.
2. Membilas antibodi yang tidak terikat dengan buffer.
3. Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan protein yang
tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk).
4. Membilas protein yang tidak melekat.
5. Menambahkan sampel yang akan dideteksi antigennya dan membiarkan antibodi untuk
berikatan dengan antigen spesifik dari sampel.
6. Membilas antigen yang tidak terikat.
7. Menambahkan antibody yang telah terlabeli dengan enzim dan bersifat spesifik untuk epitope
yang berbeda pada antigen sampel, sehingga terbentuk sandwich.
8. Membilas antibody-enzim yang tidak terikat.
9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke enzim akan
dikonversi menjadi produk.
10. Inkubasi sampai muncul warna.
11. Ukur dengan spektrofotometer. Jika semakin pekat warna yang terdeteki, maka makin besar
kadarantigen spesifi dalam sampel.

Sebagai Contoh Aplikasi ELISA: Tes Kehamilan Menggunakan Hormon hCG :

Pada hari kesepuluh setelah sel telur dibuahi oleh sperma pada saluran Tuba fallopi, sel
telur akan bergerak menuju Rahim dan melekat pada dinding Rahim tersebut. Sejak saat itulah
plasenta akan mengalami perkembangan dan hCG mulai diproduksi. Human Chorionic
gonadotropin (hCG) pada dasarnya merupakan hormone glikoprotein yang diproduksi oleh sel
normal trofoblat pada plasenta selama kehamilan yang dapat ditemukan dalam darah dan air
seni.
hCG terdiri dari 2 subunit polipeptida yang terikat secara nonkovalen dengan berat
molekul total 39 kD. Subunit rantai identic dengan subunit rantai dari hLH (human
Luteinizing Hormone), hFSH (human Follicle Stimulating Hormone) dan hTSH (human
Thyreoidea Stimulating Hormone). Subunit bertanggung jawab pada efek hormonal molekul
hCG. Pengukuran hCG yang sempurna dan keberadaan subunit memberi hasil yang sama pada
darah dan urin, tapi tidak pada subunit . Produksi hormone hCG akan bertambah banyak selama
trimester pertama, dimana level hCG yang sempurna mempunyai rentang dari 20000 mIU/ml
sampai 50000 mIU/ml (1 ng = 15 mIU).
Keberadaan hCG sudah dapat dideteksi dalam darah sejak hari pertama keterlambatan
haid, yaitu kira-kira hari keenam sejak pelekatan janin pada dinding Rahim. Kadar hormone
tersebut akan terus-menerus bertambah hingga minggu ke 14-16 kehamilan, terhitung sejak
hari terakhir menstruasi. Sebagian besar ibu hamil akan mengalami penambahan kadar
hormone hCG sebanyak dua kali lipat setiap 3 hari.
 Peningkatan kadar hormone ini biasanya ditandai dengan mual dan pusing yang sering
dialami oleh para ibu hamil. Selanjutnya kadar hCG akan menurun terus secara perlahan, dan
hamper mencapai kadar normal beberapa saat setelah persalinan. Pengetesan dapat dilakukan
pada saat wanita mengalami keterlambatan siklus haid atau kira-kira 7 hari setalah
berhubungan.Sampel yang sigunakan pada umumnya adalah urin. Biasanya dianjurkan
menggunkan air seni yang keluar pertama kali setelah bangun pagi, karena pada saat tersebut
konsentrasi hormone hCG relatif tinggi. Sebenarnya uji darah pada tes kehamilan yang
dilakukan di laboratorium juga memiliki prinsip kerja yang relatif sama, yait mendekati kadar
hCG. Namun, tes darah mempunyai kelebihan berupa kemampuan untuk mendeteksi usia janin
bertumbuh di dalam Rahim seorang ibu.
Perkiraan Kadar hCG dalam Darah Kehamilan Trimester kedua

Kurang dari 5 IU/L

Perempuan yang tidak hamil dan laki-laki (international units
per liter)
24-28 hari setelah haid terakhir 5-100 IU/L
4-5 minggu (1 bulan) setelah haid
terakhir 50-500 IU/L
IIbu
5-6 minggu setelah haid terakhir 100-10.000 IU/L
hamil:
14-16 minggu (4 bulan) setelah haid 12.000-270.000
terakhir IU/L
kehamilan trimester ketiga 1.000-50.000 IU/L
Perempuan pasca menopause Kurang dari 10 IU/L

Keuntungan test kehamilan dengan menggunakan uji kadar hormone hCG antara lain:
1. Analisa yang hemat dan efektif dengan kualitas tinggi dan harganya memadai.
2. Efisien dan fleksibel: sampel yang berbeda dapat dianalisa secara stimulant dengan jumlah
cekungan uji yang fleksibel.
3. Spesifik: sepasang antibody mempunyai selektivitas tinggi secara spesifik berikatan dengan -
hCG.
4. Prosedur yang sederhana.
 Dalam pengaplikasian teknik ELISA, serum hCG selain dapat digunakan sebagai test
kehamilan untuk mengetahui keberadaan janin dalam Rahim, juga dapat digunakan untuk
berbagai uji kehamilan lainnya, antara lain:
1. Prediksi kehamilan yang multiple/ lebih dari 1.
2. Diagnosis kehamilan yang abnormal.
3. Penentuan fase kehamilan/ masa kehamilan.
4. Diagnosis diferensial pada infertilitas/ ketidaksuburan pada wanita atau pria.
5. Invertigasi lanjut setelah terapi untuk tumor trofoblastik.
Alat tes hCG yang menggunakan teknik ELISA tersedia dalam 2 bentuk di pasaran, yaitu:
1. Berupa alat yang digunakan dengan cara memaparkannya pada aliran urin saat pertama
berkemih di pagi hari selama beberapa saat. Jenis alat ini sangat umum digunakan, karena
dijual bebas di apotek, dan penggunaannya mudah. Berikut ini adalah cara kerjanya:
a. Pada saat alat tes mulai bekerja, akan muncul garis pada jedela berbentuk lingkaran (Jendela
control).Dimana garis tersebut merupakan garis konttrol yang menunjukkan bahwa tes bekerja
secara benar.
b. Jendela berbentuk persegi akan menunjukkan hasil tes. Apabila garis muncul pada jendela
berbentuk persegi (jendela hasil) maka alat tes telah mendeteksi adanya hormone hCG dan
mununjukkan adanya kehamilan.
c. Hasil negatif: Munculnya satu garis pada jendela konttrol (berbentuk lingkaran) menandakan
bahwa anda tidak hamil dan tes telah dilakukan dengan benar.
d. Hasil positif: Muncul 2 garis pada jendela control (berbentuk lingkaran) dan jendela hasil
(berbentuk persegi) menandakan anda hamil
e. Hasil Tidak Valid: Apabila garis pada jendela control tidak muncul berarti tes tidak dilakukan
dengan benar.
Berupa alat digunakan dengan cara membubuhi beberapa tetes serum pada mikrotiter.
Berikut ini adalah cara kerjanya:
a. Mengandalkan antibody -hCG yang terimbolisasi pada media padat yang berikatan dengan -
hCG yang bebas dari sampel (urin)
b. Antibodi kelinci anti- -hCG berkonjungsi dengan horseladish peroxidase (HRP) sebagai larutan
konjugasi antibody-enzim.
c. Sampel tes dibiarkan untuk bereaksi simultan dengan antibody, menghasilkan -hCG antara fase
padat denga antibody-enzim.
d. Setelah inkubasi, cekungan dibilas untuk membilas antibody-enzim yang tidak terikat.
Kemudian substrat HRP, TMB, ditambahkan untuk menghasilkan warna biru.
 e. Perkembangan warna dihentikan dengan penambahan stop solution yang akan mengubah warna
kuning.
f. Konsentrasi -hCG secara langsung proporsional terhadap intensitas warna yang dihasilkan dan
diukur absorbansinya dengan spektrofotometer.
2.5 Kelebihan dan Kekurangan ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Teknik ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain :
Ø Teknik pengerjaan relatif sederhana
Ø Relatif ekonomis (karena jenis a antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga menghemat
biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)
Ø Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.
Ø Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen tersebut sangat
rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau antigen yang bersifat sangat
spesifik)
Ø Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.
Sedangkan kekurangan dari teknik ELISA antara lain :
Ø Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya jenis antibodi
monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen).
Ø Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal, sehingga pengujian
teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif mahal.
Ø Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol negatif
yang menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas dari larutan blocking
sehingga antibodi sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim
signal dan menimbulkan signal.
Ø Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga pembacaan harus
dilakukan dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan memberikan
larutan untuk menghentikan reaksi).
 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

ELISA is an antigen antibody reaction. In 1971, ELISA was introduced by Peter Perlmann and
Eva Engvall at Stockholm University in Sweden. It is a common laboratory technique which
is usually used to measure the concentration of antibodies or antigens in blood.

ELISA is a plate based assay technique which is used for detecting and quantifying substances
such as peptides, proteins, antibodies and hormones. An enzyme conjugated with an antibody
reacts with colorless substrate to generate a colored product. Such substrate is called
chromogenic substrate. A number of enzymes have been used for ELISA such as alkaline
phosphatase, horse radish peroxidase and beta galactosidase. Specific substrate such as ortho-
phenyldiamine dihydrochloride (for peroxidase), paranitrophenyl phosphate (for alkaline
phosphatase) are used which are hydrolysed by above enzymes to give colored end product.

Principle
ELISAs are typically performed in 96-well polystyrene plates. The serum is incubated in a
well, and each well contains a different serum. A positive control serum and a negative control
serum would be included among the 96 samples being tested. Antibodies or antigens present
in serum are captured by corresponding antigen or antibody coated on to the solid surface. After
some time, the plate is washed to remove serum and unbound antibodies or antigens with a
series of wash buffer. To detect the bound antibodies or antigens, a secondary antibodies that
are attached to an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase are added to each well.
After an incubation period, the unbound secondary antibodies are washed off. When a suitable
substrate is added, the enzyme reacts with it to produce a color. This color produced is
measurable as a function or quantity of antigens or antibodies present in the given sample. The
intensity of color/ optical density is measured at 450nm. The intensity of the color gives an
indication of the amount of antigen or antibody.

Types of ELISA
Frequently there are 3 types of ELISA on the basis of binding structure between the Antibody
and Antigen.

1. Indirect ELISA
2. Sandwich ELISA
3. Competitive ELISA

1. Indirect ELISA
Antibody can be detected or quantitatively determined by indirect ELISA. In this technique,
antigen is coated on the microtiter well. Serum or some other sample containing primary
antibody is added to the microtiter well and allowed to react with the coated antigen. Any free
primary antibody is washed away and the bound antibody to the antigen is detected by adding
an enzyme conjugated secondary antibody that binds to the primary antibody. Unbound
secondary antibody is then washed away and a specific substrate for the enzyme is added.
Enzyme hydrolyzes the substrate to form colored products. The amount of colored end product
is measured by spectrophotometric plate readers that can measure the absorbance of all the
wells of 96-well plate.

Procedure of Indirect ELISA

1. Coat the micro titer plate wells with antigen.
2. Block all unbound sites to prevent false positive results.
3. Add sample containing antibody (e.g. rabbit monoclonal antibody) to the wells and
incubate the plate at 37°c.
4. Wash the plate, so that unbound antibody is removed.
5. Add secondary antibody conjugated to an enzyme (e.g. anti- mouse IgG).
6. Wash the plate, so that unbound enzyme-linked antibodies are removed.
7. Add substrate which is converted by the enzyme to produce a colored product.
8. Reaction of a substrate with the enzyme to produce a colored product.

Advantages

 Increased sensitivity, since more than one labeled antibody is bound per primary
antibody.
 A wide variety of labeled secondary antibodies are available commercially.
 Maximum immunoreactivity of the primary antibody is retained because it is not
labeled.
  Versatile because many primary antibodies can be made in one species and the same
labeled secondary antibody can be used for detection.
 Flexibility, since different primary detection antibodies can be used with a single
labeled secondary antibody.
 Cost savings, since fewer labeled antibodies are required.
 Different visualization markers can be used with the same primary antibody.

Disadvantages

 Cross-reactivity might occur with the secondary antibody, resulting in nonspecific

signal.
 An extra incubation step is required in the procedure.

2. Sandwich ELISA
Antigen can be detected by sandwich ELISA. In this technique, antibody is coated on the
microtiter well. A sample containing antigen is added to the well and allowed to react with the
antibody attached to the well, forming antigen-antibody complex. After the well is washed, a
second enzyme-linked antibody specific for a different epitope on the antigen is added and
allowed to react with the bound antigen. Then after unbound secondary antibody is removed
by washing. Finally substrate is added to the plate which is hydrolyzed by enzyme to form
colored products.

Procedure of sandwich ELISA

1. Prepare a surface to which a known quantity of antibody is bound.
2. Add the antigen-containing sample to the plate and incubate the plate at 37°c.
3. Wash the plate, so that unbound antigen is removed.
4. Add the enzyme-linked antibodies which are also specific to the antigen and then
incubate at 37°c.
5. Wash the plate, so that unbound enzyme-linked antibodies are removed.
6. Add substrate which is converted by the enzyme to produce a colored product.
7. Reaction of a substrate with the enzyme to produce a colored product.
Advantages

 High specificity, since two antibodies are used the antigen is specifically captured and
detected.
 Suitable for complex samples, since the antigen does not require purification prior to
measurement.
 Flexibility and sensitivity, since both direct and indirect detection methods can be used.

3. Competitive ELISA
This test is used to measure the concentration of an antigen in a sample.

In this test, antibody is first incubated in solution with a sample containing antigen. The
antigen-antibody mixture is then added to the microtitre well which is coated with antigen. The
more the antigen present in the sample, the less free antibody will be available to bind to the
antigen-coated well. After the well is washed, enzyme conjugated secondary antibody specific
for isotype of the primary antibody is added to determine the amount of primary antibody
bound to the well. The higher the concentration of antigen in the sample, the lower the
absorbance.

Procedure
1. Antibody is incubated with sample containing antigen.
2. Antigen-antibody complex are added to the microtitre well which are pre-coated with
the antigen.
3. Wash the plate to remove unbound antibody.
4. Enzyme linked secondary antibody which is specific to the primary antibody is added.
5. Wash the plate, so that unbound enzyme-linked antibodies are removed.
6. Add substrate which is converted by the enzyme into a fluorescent signal.

Advantages

 High specificity, since two antibodies are used.

  High sensitivity, since both direct and indirect detection methods can be used.
 Suitable for complex samples, since the antigen does not require purification prior to
measurement.

Application of ELISA
1. Presence of antigen or the presence of antibody in a sample can be evaluated.
2. Determination of serum antibody concentrations in a virus test.
3. Used in food industry when detecting potential food allergens.
4. Applied in disease outbreaks- tracking the spread of disease e.g. HIV, bird flu, common,
colds, cholera, STD etc.