Anda di halaman 1dari 13

LAPORAN PRAKTIKUM KULTUR JARINGAN TUMBUHAN

Disusun Untuk Memenuhi Sebagian Tugas Mata Kuliah Kultur Jaringan


Tumbuhan
Dosen Pengampu : Sisunandar, P. hD.

Disusun oleh:
LAELATUL KHOERIYYAH
1401070032

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI


FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO
2016
DAFTAR ISI

HALAMAN COVER .............................................................................................


DAFTAR ISI ..........................................................................................................
BAB I. PENDAHULUAN .....................................................................................
BAB II. DASAR TEORI .......................................................................................
BAB III. ALAT DAN BAHAN .............................................................................
BAB IV. CARA KERJA ........................................................................................
V.1. Organogenesis Tembakau
A. Pendahuluan
B. Dasar Teori
C. Alat dan Bahan
D. Cara Kerja
E. Hasil Praktikum dan Foto
F. Pembahasan
G. Kesimpulan
V.2. Embryogenesis Somatik Kopi
A. Pendahuluan
B. Dasar Teori
C. Alat dan Bahan
D. Cara Kerja
E. Hasil Praktikum dan Foto
F. Pembahasan
G. Kesimpulan
V.3. Kultur Tunas Pisang
A. Pendahuluan
B. Dasar Teori
C. Alat dan Bahan
D. Cara Kerja
E. Hasil Praktikum dan Foto
F. Pembahasan
G. Kesimpulan
V.4. Kultur Tunas Melinjo
A. Pendahuluan
B. Dasar Teori
C. Alat dan Bahan
D. Cara Kerja
E. Hasil Praktikum dan Foto
F. Pembahasan
G. Kesimpulan
BAB V. KESIMPULAN ........................................................................................
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................
BAB I
PENDAHULUAN
BAB II
DASAR TEORI
BAB III
ALAT DAN BAHAN
I. Tujuan
1. Mahasiswa mengenal alat-alat dan bahan yang biasa digunakan dalam
kultur jaringan tumbuhan.
2. Mahasiswa mampu mengoperasikan alat-alat yang dikenalkan.
II. Bahan
Peralatan utama dan penggunaannya perlu dipahami meliputi peralatan:
1. Timbangan analitik: Untuk menimbang zat kimia dan kultur kalus.
2. pH meter: Untuk mengatur PH medium. Perhatikan cara kalibrasi,
pengukuran PH dan membersihkan elektrodanya.
3. Autoclave: Untuk mensterilkan medium, instrument dan alat gelas.
4. Oven: Untuk mengeringkan instrument dan alat steril.
5. Lemari es: Untuk menyimpan stok medium dan dan eksplan medium.
6. Hot plate: Untuk memanaskan medium atau membuat larutan stok.
Perhatikan cara mengatur tinggi suhu.
7. Shaker: Untuk mengocok kultur cair ataupun aerasi stok larutan tertentu.
8. Laminar Air Flow: Kotak beraliran udara steril untuk penanaman kultur.
9. Enkes: Kotak steril sebagai ganti Laminar Air Flow.
10. Mikroskop: Untuk melihat dan mengamati bagian tanaman (organ,
jaringan atau sel) yang berukuran kecil yang tidak dapat diamati dengan
mata telanjang.
A. Alat-alat utama pada laboratorium kultur jaringan tumbuhan
1. Otoklaf
Media nutrisi dan air destilasi biasanya disterilkan dalam otoklaf.
Alat-alat gelas seperti tabung reaksi, botol kosong atau cawan petri, kertas
saring, pinset, scalpel dan spatula biasanya disterilkan dengan oven
bersuhu 160oC selama 2-3 jam. Akan tetapi bila oven untuk sterilisasi
tidak tersedia maka sterilisasi alat-alat di atas dapat dilakukan dengan
otoklaf.
Otoklaf adalah suatu alat untuk mensterilisasi dengan
menggunakan uap panas. Dengan sistem pemberian uap panas dan tekanan
tinggi, semua mikroorganisme dapat terbunuh. Otoklaf dapat
disterilisasikan antara suhu 115-135oC. Sterilisasi akan efektif jika waktu,
tekanan dan suhu sesuai untuk objek yang disterilisasikan. Misalnya media
nutrisi dengan volume sampai 50 ml cukup disterilisasi dengan otoklaf
dengan suhu 121oC selama 15 menit pada tekanan 1,5 kg/cm2.
Tahapan pengoperasian otoklaf
a. Buka tutup otoklaf dan letakkan disampingnya.
b. Setelah tempat menyimpan barang atau alat yang akan disterilkan
dikeluarkan, tuangkan air destilasi pada otoklaf sampai batas tertentu
(dilarang menggunakan air kran, karena air keran banyak mengandung
kalsium sehingga lama kelamaan menyebabkan pengendapan putih).
c. Masukkan kembali panic yang berisi barang yang akan disterilkan ke
dalam otoklaf.
d. Sambungkan kabel power dengan aliran listrik. Jika tipe otoklaf adalah
otoklaf bakar maka taruh otoklaf diatas kompor.
e. Tutup otoklaf dan kencangkan semua skrupnya dengan memuatnya
searah jarum jam.
f. Biarkan katup yang berada di tutup otoklaf berada pada posisi terbuka.
g. Tekan tombol “on” atau nyalakan kompor.
h. Jika dari katup sudah ada tetesan air yang keluar, maka tutuplah
katupnya.
i. Biarkan suhu dan tekanan meningkat sampai 121oC dan tekanan 1,5
kg/cm2.
j. Pertahankan suhu dan tekanan tersebut dengan mengatur tombol
pengatur suhu atau dengan mengecilkan api kompor selama 15 menit.
k. Matikan listrik atau kompor.
l. Untuk mengeluarkan barang atau alat yang disterilkan, biarkan tekanan
dalam otoklaf turun sampai 0 lalu tutup dibuka dengan memutar semua
sekrup berlawanan arah dengan jarum jam.
2. pH Meter
Tingkat keasaman (pH) media nutrisi yang cocok untuk
pertumbuhan invitro berkisar antara 5,5-6,0 pH lebih kecil atau lebih besar
biasanya menghambat perkembangan kultur invitro. Tingkat keasaman
media nutrisi biasanya diukur dengan pH meter. Berbagai bentuk pH meter
tersedia secara komersial. Tahapan pengoperasian pH meter adalah: (pH
meter lutron tipe PH 206).
a. Kalibrasi
Sebelum alat ini digunakan untuk mengukur pH larutan, harus dikalibrasi
dengan larutan buffer (pH 4,01 dan 7, 01). Kalibrasi cukup dilakukan 1
kali sehari asalkan kabel power tidak dimatikan. Langkah kalibrasi adalah
sebagai berikut:
 Angkat elektroda dari larutan perendamnya, pasangkan pada elektroda
pada pH meter. Keringkan elektroda dengan kertas tisu.
 Nyalakan tombol power pada posisi “on” dan aturlah tombolnya pada
posisi pH.
 Masukkan elektroda ke dalam larutan buffer pH 4,01. Jika angka pada
pH meter tidak menunjukkan 4,01 maka putarlah tombol “SLOPE”
sampai menunjukkan angka 4,01.
 Angkat elektroda dari larutan buffer dan bilas dengan akuades lalu
dilap dengan menggunakan kertas tisu.
 Celupkan elektroda pada larutan buffer 7,01 sampai terrendam. Bila
angka PH tidak menunjukkan 7,01, maka aturlah tombol “CAL” untuk
PH 7 sampai angka di pH meter menunjukkan 7,01.
 Angka elektroda dan cuci.
b. Pengukuran pH larutan
 Elektroda dibasuh dengan akuades dan dilap dengan kertas tissue.
 Celupkan elektroda pada larutan yang akan diukur sampai terrendam.
 Bila pH terlalu rendah tambahkan beberapa tetes larutan NaOH (1 N)
sambil diaduk dengan batang pengaduk.
 Bila pH terlalu tinggi tambahkan beberapa tetes larutan HCL (1 N)
sambil diaduk.
 Setelah pH mencapai nilai yang diharapkan, angkatlah elektroda dan
basuhlah dengan akuades kemudian bersihkan dengan kertas tissue.
 Apabila tidak digunakan, rendam elektroda dalam larutan akuades.
c. Laminar Air Flow (LAF)
Pada laboratorium kultur yang besar, ruang kultur terpisah dari
ruang transfer tanaman, namun apabila ruangan laboratorium tidak
mencukupi, maka pada ruang kultur biasanya ditempatkan alat transfer.
Alat transfer yang umum digunakan untuk memindahkan tanaman dari
lingkungan luar ke lingkungan in vitro atau untuk mensubkultur tanaman
berupa enkes, laminar air flow cabinet atau dalam skala besar dapat
berupa ruangan transfer steril.
Pada laboratorium kultur jaringan yang sederhana, tempat transfer
dapat berupa enkes atau kotak transfer. Alat ini berupa kotak dengan dua
lobang tangan tempat tangan pekerja masuk untuk memindahkan tanaman.
Pada alat ini dilengkapi lampu spirtus dan lampu ultraviolet. Sebelum
digunakan, ruangan dalam kotak dibersihkan dengan menggunakan
alkohol 70%. Seluruh peralatan yang akan digunakan dalam kultur,
termasuk medium kultur juga dibersihkan dengan menggunakan alkohol
70%, kemudian dimasukkan ke dalam kotak. Selanjutnya kotak ditutup
rapat dan lampu UV dinyalakan selama lebih dari 2 jam untuk
mensterilkan ruangan di dalam kotak.
Langkah selanjutnya lampu UV harus dimatikan dan kotak siap
digunakan untuk menanam. Hal yang tidak boleh dilupakan adalah lampu
ultraviolet harus dimatikan. Hal ini karena cahaya ultraviolet mampu
menyebabkan mutasi pada sel kulit manusia sehingga berbahaya bagi
pekerja. Penggunaan alat ini dalam kultur jaringan sangat terbatas, yaitu
hanya sebagai tempat untuk memindahkan material steril yang ditanam.
Untuk keperluan lain seperti isolasi meristem tidak dapat dilakukan
menggunakan alat tersebut. Disamping itu, penggunaan alat tersebut dalam
waktu yang lama dapat mengakibatkan ruangan menjadi lebih panas
sehingga material yang ditanam menjadi layu.
Alat transfer yang paling banyak digunakan untuk kultur jaringan
adalah Laminar Air Flow (LAF) cabinet. Peralatan ini tersedia di pasaran
dalam berbagai ukuran ukuran, seperti untuk satu orang atau dua orang,
arah aliran udara vertikal ataupun horizontal. Pada umumnya LAF berupa
sebuah kotak yang dilengkapi dengan sebuah motor kecil untuk
mengalirkan udara dari luar. Selanjutnya udara dialirkan melewati filter
yang dikenal dengan nama hight efficiency particulate air (HEPA) filter.
HEPA dengan ukuran 0,3 µ m mampu menyaring udara menjadi sangat
bersih sehingga bebas jamur dan bakteri dengan tingkat efisiensi antara
99,97 – 99, 99%. Kecepatan aliran udara dari alat ini mencapai 27 ± 3 m/
min sehingga dapat menjaga ruangan alat tersebut tetap steril apabila
dipakai.
Apabila alat tersebut akan digunakan, maka terlebih dahulu seluruh
permukaan dalam dari kotak tersebut dibersihkan dengan menggunakan
alkohol 70%, termasuk semua peralatan dan medium kultur jaringan yang
digunakan, sebelum dimasukkan ke dalam kotak. Selanjutnya alat
dinyalakan selama 15 menit sebelum digunakan.
Ruang steril umum digunakan pada laboratorium kultur jaringan
yang besar. Perawatan ruangan ini cukup mahal sehingga diperlukan
penggunaan dalam skala besar. Biasanya ruangan ini dilengkapi dengan
pintu pembersih debu untuk pekerja yang akan bekerja di dalam ruangan
tersebut. Pada ruangan kultur dilengkapi dengan lampu ultraviolet, dan
ventilasi tempatmengalirnya udara bersih ke dalam ruang kultur. Udara
bersih yang mengalir ke dalam ruangan, sebelumnya dialirkan terlebih
dahulu melalui HEPA filter.
Alat lain yang harus tersedia di ruang kultur adalah shakers. Alat
ini diperlukan apabila kultur yang dilakukan adalah kultur suspense atau
kultur sel. Biasanya kedua kultur tersebut menggunakan medium cair,
sehingga agar oksigen di dalam medium selalu tersedia bagi sel yang
dikultur maka harus dilakukan penggojokan medium dengan
menggunakan shaker. Dengan digojoknya medium maka diharapkan
terjadi difusi oksigen dari udara ke dalam medium.
3. Ruang Kultur
Pada ruangan ini pekerjaan aseptic dimuali. Pada ruangan ini
diusahakan terbebas dari debu dan hewan kecil, serta terpisah dari ruangan
yang lain. Pintu penghubung biasanya diusahakan selalu tertutup. Ruangan
ini diusahakan dapat diatur kondisi lingkungannya. Tempetarur ruangan
yang umum digunakan untuk ruangan kultur berkisar antara 25 ± 2oC.
Apabila diperlukan perlakuan temperature lingkungan yang lebih tinggi
dan lebih rendah, sebaiknya digunakan incubator di dalam ruangan ini.
Pada umumnya, kultur ditumbuhkan pada kondisi cahaya cukup.
Biasanya cahaya yang digunakan menggunakan lampu tabung (bukan
bolam) karena cahayanya berwarna putih. Apabila diperlukan kultur dalam
kondisi gelap, biasanya digunakan ruangan yang gelap, namun apabila
tidak memiliki ruangan gelap dapat dilakukan dengan cara botol kultur
ditutup rapat dengan kain hitam, sehingga tidak ada cahaya yang masuk.
Kelembaban yang umum digunakan dalam ruangan kultur biasanya
berkisar antara 50-70%. Apabila kelembaban turun di bawah 50%, maka
medium kultur dapat mongering lebih cepat, sedangkan apabila
kelembaban ruangan kultur sangat tinggi maka kemungkinan munculnya
kontaminasi menjadi lebih tinggi. Ruang kultur diusahakan tidak dimasuki
oleh debu ataupun binatang kecil seperti semut. Hal ini dapat dicegah
dengan mendesinfeksi ruangan secara rutin.
BAB IV
CARA KERJA
ORGANOGENESIS DAUN TEMBAKAU

I. Tujuan
1. Mahasiswa mampu menginduksi organogenesis dari daun tembakau.
2. Mahasiswa mampu mengamati hasil kegiatan
3. Mahasiswa mampu menganalisis hasil kegiatan
II. Bahan dan Alat
 Cawan petri 2 buah (1 memakai kertas saring)
 Botol kultur 2 buah (1 isi akuades, 1 kosong untuk tempat alkohol
perendam pinset).
 Pinset, scalpel, blade.
 Lampu spirtus.
 Botol semprot isi alkohol.
 Korek api.
 Kapas.
 Medium tembakau.
 Laminar air flow.
 Kultur tembakau.
Catatan:
 Semua alat dan bahan disiapkan untuk setiap orang.
 No. 1-5 disterilkan dengan autoklaf.
III. Cara Kerja
1. Mengambil daun tembakau, dan memotong daun tersebut berukuran
sekitar 3 x 3 cm kemudian mensterilkan dengan menggunakan larutan
kalsium hipoklorida selama 15 menit.
2. Daun tembakau steril kemudian memotong-motong berukuran sekitar 1
cm3.
3. Meletakkan eksplan tersebut ke medium organogenesis dengan setiap
botol ditanami 2 daun. Cara meletakkan eksplan dilakukan pada posisi
terbalik.
4. Kultur dipelihara diruang kultur dengan suhu ruang 23-26oC dan
pencahayaan terus-menerus.
5. Pengamatan dilakukan selama 3 minggu. Mengamati pertumbuhan kalus,
pucuk dan akar setiap minggu dan mencatat hasilnya dalam tabel.
EMBRYOGENESIS SOMATIK KOPI

I. Tujuan
1. Mahasiswa mampu melakukan perbanyakan tanaman melalui teknik
embryogenesis somatik.
2. Mahasiswa mampu mengamati dan menganalisis hasil embryogenesis
somatik kopi.
II. Bahan dan Alat
 Cawan petri 2 buah (1 memakai kertas saring).
 Botol kultur 2 buah (1 isi akuades, 1 kosong untuk tempat alkohol
perendam pinset).
 Pinset, scalpel, blade.
 Lampu spirtus.
 Botol semprot isi alkohol 70%.
 Korek api.
 Kapas.
 Laminar air flow/ enkes.
 Medium induksi kalus kopi.
Catatan:
 Semua alat dan bahan disiapkan untuk setiap orang.
 No. 1-5 disterilkan dengan autoklaf.
III. Cara Kerja
1. Melakukan sterilisasi daun kopi dengan cara sebagai berikut: mengambil
daun kopi kedua atau ketiga, mencuci bersih dengan air mengalir,
kemudian rendam dalam alkohol selama 3 menit.
2. Mensterilisasi daun kopi dengan cara merendam dalam larutan kalsium
hipoklorida selama 6 jam.
3. Memotong daun kopi berukuran sekitar 1 cm3 dan tanam pada medium
induksi kalus.
4. Menempatkan kultur di tempat yang gelap.
5. Melakukan pengamatan setelah 30 hari kultur setiap hari sampai terbentuk
kalus.
6. Kalus disubkultur ke dalam medium induksi embryo somatik (cair) dan
disubkulturkan setiap 4 minggu sekali sampai terbentuk embryo somatik.
KULTUR TUNAS PISANG

I. Tujuan
1. Mahasiswa mampu melakukan multipikasi tunas pisang.
2. Mahasiswa mampu mengamati dan menganalisis hasil pekerjaannya.
II. Bahan dan Alat
 Cawan petri 2 buah (1 pakai kertas saring).
 Botol kultur 2 buah (1 akuades, 1 kosong untuk tempat alkohol perendam
pinset).
 Pinset, scalpel, blade.
 Lampu spirtus.
 Botol semprot isi alkohol 70%.
 Korek api.
 Kapas.
 Medium induksi tunas pisang.
 Laminar air flow/ enkes.
Catatan:
 Semua alat dan bahan disiapkan untuk setiap orang.
 No. 1-5 disterilkan dengan autoklaf.
III. Cara Kerja
1. Melakukan sterilisasi tunas pisang dengan cara sebagai berikut:
mengambil mata tunas pisang, mengambil bagian tunas yang masih hidup
sampai berukuran sekitar 1 cm, kemudian cuci bersih dengan air mengalir,
dilanjutkan dengan direndam dalam alkohol selama 5 menit.
2. Mensterilkan mata tunas tersebut dengan cara merendam dalam larutan
kalsium hipoklorida selama 20 menit.
3. Mengisolasi mata tunas sampai berukuran sekitar 0,5 cm.
4. Menanam pada media induksi tunas dan pelihara di tempat yang terang.
5. Melakukan pengamatan setiap minggu selama 4 minggu untuk mengetahui
pertumbuhan tunas pisang.
KULTUR MERISTEM MELINJO

I. Tujuan
1. Mahasiswa mampu mengisolasi meristem melinjo.
2. Mahasiswa mampu melakukan kultur meristem melinjo
II. Bahan dan Alat
 Cawan petri 2 buah (1 pakai kertas saring).
 Erlenmeyer 250 ml berisi medium suspense, yaitu medium cair MS
dengan penambahan 5. 10-6 M 2,4 D.
 Erlenmeyer 250 ml berisi embryogenesis, yaitu medium dasar MS cair
tanpa penambahan agar dan ZPT.
 Pinset, scalpel, blade.
 Lampu spirtus.
 Botol semprot isi alkohol 70%.
 Korek api.
 Kapas.
 Medium induksi meristem melinjo.
 Laminar air flow/ enkes.
III. Cara Kerja
1. Melakukan sterilisasi tunas melinjo dengan cara sebagai berikut:
mengambil tunas dan buang daun melinjo, kemudian cuci bersih dengan
air mengalir, dilanjutkan dengan direndam dalam alkohol selama 5 menit.
2. Mensterilisasi tunas tersebut dengan cara merendam dalam larutan kalsium
hipoklorida selama 15 menit.
3. Mengisolasi meristem sampai berukuran 1 mm.
4. Menanam pada media induksi tunas dan pelihara di tempat yang terang.
5. Melakukan pengamatan setiap minggu selama 4 minggu untuk mengetahui
pertumbuhan tunas pisang.