Anda di halaman 1dari 50

ANALISIS CAMPURAN PARASETAMOL DAN KAFEIN DALAM

TABLET BODREX DENGAN METODE HIGH PERFORMANCE


LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

Laporan Akhir Praktikum Analisis Farmasi

Disusun oleh :

Herlina 148114001

Venerabela Arin C.P. 148114014

Adian Rambu Baba 148114019

Roy Gunawan 148114022

Dosen Pembimbing :

Johnsen Harta, M.Res., M.Pd

Dika Octa, M.Sc

LABORATORIUM ANALISIS FARMASI


FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2017

BAB I
PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG
Obat merupakan sediaan atau paduan bahan-bahan yang siap untuk
digunakan untuk mempengaruhi atau menyelidiki sistem fisiologi atau keadaan
patologi dalam penetapan diagnosis, pencegahan, penyembuhan, pemulihan,
peningkatan, kesehatan dan kontrasepsi (Depkes RI, 2014). Obat yang digunakan
untuk penyembuhan penyakit pada manusia digolongkan pada jenis analgetik,
antipiretik, antibiotik, antihistamin, dan lain-lain. Jenis obat antipiretik termasuk
obat-obatan yang paling banyak digunakan pada kalangan masyarakat Indonesia,
salah satu kandungan obatnya yakni parasetamol.
Bahkan tidak menunjukkan efek anti-inflamasi, parasetamol telah banyak
digunakan sebagai analgesik dan antipiretik. Meskipun tampaknya aman jika
digunakan dalam dosis terapi normal, dosis yang lebih tinggi dari parasetamol
dapat menghasilkan hati dan / atau cedera ginjal pada manusia dan hewan
percobaan (Borges et al., 2014). Sediaan obat analgesik yang banyak digunakan
saat ini merupakan bentuk sediaan obat dengan kombinasi beberapa zat aktif. Hal
ini ditujukan untuk memperoleh efek terapi yang lebih baik. Salah satunya yakni
kombinasi antara parasetamol dan kafein. Contoh merk obat-obatan yang
mengandung parasetamol dan kafein yakni bodrex dan Panadol extra, oskadon.
Kadar dari suatu obat yang dalam hal ini campuran parasetamol dan
kafein perlu dilakukan uji terhadap kadarnya agar kita mengetahui bahwa obat
yang diproduksi oleh suatu pabrik obat memenuhi persyaratan yang ditetapkan.
Obat yang dikonsumsi akan memberikan efek terapi yang menyembuhkan di
dalam tubuh jika kadarnya berada di rentang persyaratan yang ditetapkan.
Apabila kadar obat berada diatas rentang persyaratan maka obat tersebut akan
memberikan efek toksik terhadap konsumen . sedangkan bila berada direntang di
bawah rentang persyaratan, maka obat tersebut tidak memberikan efek terapi.
Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dapat digunakan
dalam analisis penetapan kadar paracetamol dan ibuprofen. Oleh karena itu perlu
dilakukan pengujian dalam menentukan metode Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi (KCKT) yang merupakan metode penting dalam analisa berbagai
cuplikan baik dalam komponen tunggal maupun campuran (Mahdiyar et al.,
2011).
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan metode analisis campuran
parasetamol dan kafein dalam satu sampel secara optimal dengan Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Berdasarkan sifat kimia, kelarutan, serta penentuan
fase diam dan fase gerak yang sesuai maka parasetamol dan kafein dapat
dianalisis dari satu sampel secara simultan.

B. TUJUAN PENELITIAN
Berdasarkan latar belakang yang ada, maka penelitian ini bertujuan ini
bertujuan untuk:
1. Mengetahui apakah prinsip kerja instrument HPLC dapat digunakan untuk
menetapkan kadar parasetamol dan kafein dalam tablet.
2. Mengetahui apakah kadar parasetamol dan kafein dalam tablet sesuai dengan
yang tertera dalam etiket.

C. RUMUSAN MASALAH
Berdasarkan latar belakang yang ada, dapat dirumuskan permasalahan
sebagai berikut:
1. Apakah prinsip kerja instrument HPLC dapat digunakan untuk menetapkan
kadar parasetamol dan kafein dalam tablet?
2. Apakah kadar parasetamol dan kafein dalam tablet sesuai dengan yang tertera
pada etiket?

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. PARASETAMOL
Gambar 1.0. Struktur Parasetamol (R. S. Borges et al.,
2014)

Tabel 1.1. Sifat Fisika dan Kimia Parasetamol

Keadaan fisik dan Serbuk hablur


penampilan
Nama lain 4-Hidroksiasetanilida
Rasa Sedikit pahit
Berat Molekul 151, 17 g/mol
Warna Putih
pH (1% soln / air) Tidak tersedia
Titik didih Tidak tersedia
Melting Point 170oC (338oF)
Suhu kritis Tidak tersedia
Berat Jenis 1.293 (water = 1)
Tekanan Uap Tidak tersedia
Densitas Uap Tidak tersedia
Volatilitas Tidak tersedia
Bau Tidak berbau
Ionicity (dalam Air) Tidak tersedia
Properti Dispersi Lihat kelarutan dalam air, dietil eter.
Kelarutan Larut dalam air mendidih, dan dalam NaOH
1N, mudah larut dalam etanol
(DepKesRI, 2014)

Parasetamol atau asetaminofen adalah obat yang paling terkenal dalam


pengobatan nyeri dan demam. Hal ini digunakan sebagai antipiretik, analgesik
dan antiinflamasi obat, karena menghambat sintesis prostaglandin
cyclooxygenase-1 (COX-1) dan cyclooxygenase-2 (COX-2)(El-Zinati dan Abdel-
Latif 2015).
Penentuan Parasetamol telah dilakukan dengan menggunakan berbagai
metode seperti kromatografi kinerja tinggi fase cair (RP-HPLC) dengan kafein.
Di Farmasi Menggunakan Campuran HPLC dan GC-MS, dengan orde pertama
spectrophotometery derivatif dalam kombinasi dengan ambroxol hidroklorida,
levosetirizine dihidroklorida, dan fenilefrin hidroklorida. Dengan RP-HPLC di
kombinasi dengan klorzoxazone, dan Nimesulide. Oleh RP-HPLC dalam
kombinasi dengan metoklopramid hidroklorida dalam bentuk tabletdengan
kolorimetri analisis. Analisis, dengan kodein fosfat, menggunakan RP-HPLC
sebuah sistem dengan injektor pengguna juga telah dilaporkan. ekstraksi fase
padat, menggunakan deuterated internal yang spektrometri standar(El-Zinati dan
Abdel-Latif 2015).
Parasetamol memiliki serapan maksimum pada daerah atau spektrum
ultraviolet. Parasetamol memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang
243nm dalam pelarut methanol ( Beheraet al., 2012). Tablet parasetamol
mengandung parasetamol, tidak kurang dari 90% dan tidak lebih dari 110% dari
jumlah yang tertera pada etiket (DepKesRI, 2014).

B. KAFEIN

Gambar 1.1. Struktur Kafein (Nawrot et al., 2013)

Tabel 1.2.Sifat Fisika dan Kimia Kafein

Keadaan fisik dan Solid (Kristal padat)


penampilan
Bau Tidak berbau
Rasa Sedikit Pahit
Berat Molekul 194,2 g / mol
Warna Putih
pH (1% soln / air) 6.9 (netral)
Titik didih Tidak tersedia
Melting Point 238 ° C (460,4 ° F)
Suhu kritis Tidak tersedia
Berat Jenis 1,23 (Air = 1)
Tekanan Uap Tidak tersedia
Densitas Uap Tidak tersedia
Volatilitas Tidak tersedia
Bau Threshold Tidak tersedia
KoefisienDistribusi Produk ini sama-sama larut dalam minyak
Air/Minyak dan air; log (minyak / air) = -0.1
Ionicity (dalam Air) Tidak tersedia
Properti Dispersi Lihat kelarutan dalam air, dietil eter.
Kelarutan Larut dalam air panas. Sebagian larut dalam
air dingin, aseton. Sangat sedikit larut dalam
dietil eter. Bebas larut dalam pirol; di
tetrahidrofuran mengandung sekitar 4% air.
Larut dalam piridin, etil asetat. Sebagian
larut dalam alkohol terlarut di petroleum
eter. Kelarutan dalam air meningkat dengan
alkali benzoat, cinnamates, sitrat atau
salisilat.

(Science lab, 2013)

Kafein (1,3,7-trimethylxanthine, C8H10N4O2) adalah alkaloid atau


xanthine alami alkaloid yang dapat ditemukan dalam biji kopi, daun teh, biji
kakao, kacang cola dan tanaman lainnya Ini adalah salah satu zat farmakologis
yang paling banyak digunakan di dunia. Kafein dapat masuk ke dalam tubuh
melalui minum kopi, teh, kakao dan juga digunakan dalam berbagai komponen
(Nawrot et al., 2013).
Kafein adalah alkaloid alami dan dapat ditemukan di setidaknya 63
spesies tanaman dan terdapat dalam daun biji, dan buah-buahan. Kandungan
kafein dalam suatu tanaman berbeda-beda tergantung pada spesies dan asal
tanaman.Kafein digunakan dalam pengobatan pernapasan ringan, depresi yang
disebabkan oleh narkotika dan untuk pengobatan kegagalan sirkulasi. Dalam
beberapa pengobatan, kafein digunakan bersama dengan aspirin misalnya untuk
pengobatan sakit kepala dan dengan ergotamine dalam pengobatan antimigren.
Spektrofotometri, HPLC dan GC dapat digunakan dalam analisis kafein.
(Nawrot, et al, 2013)
Kafein mempunyai serapan maksimum pada spektrum ultraviolet.Kafein
memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang 273 nm dalam pelarut
methanol (Mujahid et al., 2012).

C. HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

Gambar 1.2 Skema kerja HPLC (Kumar et al., 2015)

1. Cara Kerja HPLC


Kumar V et al, 2015menjabarkan cara kerja HPLC sebagai berikut,
Sampel yang akan dianalisis diinjeksikan dalam volume kecil ke dalam aliran
fase gerak. Gerakan analit.melalui kolom diperlambat oleh bahan kimia tertentu
atau interaksi fisik dengan fase stasioner seperti melintas disepanjang kolom.
Jumlah analit diperlambat tergantung pada sifat dari analit dan pada komposisi
dari fase stasioner dan mobile.Waktu yang diperlukan oleh analit tertentu untuk
mengelusi disebut waktu retensi; waktu retensi di bawah kondisi tertentu
dianggap sebagai karakteristik identifikasi cukup unik dari yang diberikan analit.
ukuran partikel yang lebih kecil pada kolom kemasan (yang menciptakan
tekanan baliklebih tinggi) meningkatkan kecepatan liniermemberikan komponen
lebih sedikit waktu untuk menyebar dalam kolom, yang mengarah ke resolusi
lebih baik dalam menghasilkan yang kromatogram. pelarut yang umum
digunakan termasuk kombinasi larut air atau beberapa cairan organik (sebagian
besar umum adalah metanol dan asetonitril). Air mungkin mengandung buffer
atau garam untuk membantu dalam pemisahan analit komponen atau senyawa
seperti asam trifluoroasetat yang bertindak sebagai agen ion pasangan.Sebuah
perbaikan lebih lanjut untuk HPLC telah mengubah komposisi fase mobile
selama analisis.Ini yang diketahui sebagai elusi gradien.
Sebuah gradien umum untuk kromatografi fase terbalik mungkin mulai
5% metanol dan berlangsung secara bertahap sampai 50% methanol dan lebih
dari 25 menit; gradien dipilih tergantung pada hidrofobisitas dari analit.
Campuran analit dipisahkan sebagai fungsi dari afinitas analit untuk fase gerak
saat komposisi relatif terhadap fase diam. Proses partioning mirip dengan yang
terjadi selama ekstraksi cair-cair tapi ini terjadi terus menerus.
Misalnya, bila menggunakan air rendah / tinggi gradien metanol,
komponen lebih hidrofobik akan terelusi dari kolom karena fase gerakrelatif
hidrofobik. Senyawa-senyawa hidrofilik akan mengelusi dalam kondisi relatif
rendah metanol / air yang tinggi. Pilihan pelarut, aditif dan gradien tergantung
pada sifat dari analit dan fase diam. Umumnya serangkaian tes yang dilakukan
pada analit dan sejumlah berjalan percobaan dapat diproses untuk menemukan
metode HPLC optimal memberikan pemisahan terbaik dari puncak.

1.1 HPLC Fase Terbalik


HPLC fase terbalik, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi dan
dibuat nonpolar dengan menambahkan rantai panjang hidrokarbon pada
permukaannya, khususnya dengan atom karbon nomor 8 atau 18.Pelarut polar,
sebagai contoh digunakannya campuran alkohol dan air. Ini akan menjadi gaya
yang kuat antara pelarut polar dan molekul yang polar pada campuran yang akan
melewati Kolom.Gaya antara rantai hidrokarbon yang ditambahkan pada silika
(fase stasioneri) dan molekul polar pada larutan tidak terlalu banyak (Kumar V et
al., 2015).
Karena itu, molekul polar pada campuran akan menghabiskan sebagian
besar waktunya untuk berpindah dengan pelarut. Komponen non polar pada
campuran akancenderung untuk membentuk gaya dengan kelompok hidrokarbon
karena gaya van der waals. Serta kurang terlarut pada pelarut karena perlu untuk
merusak ikatan hidrogen bersamaan antara molekul air dan metanol. Memakan
waktu yang singkat dalam larutan pada pelarut dan ini akan memperlambat jalan
yang akan melewati kolom. Ini berarti molekul-molekul polar yang akan
berjalan melewati Kolom lebih cepat. HPLC Kolom terbalik paling banyak
digunakan pada HPLC (Kumar V et al., 2015).

1.2 HPLC Fase Normal


Kolom pada HPLC diisi dengan partikel silika kecil, dan pelarutnya
nonpolar (heksana), sebagai contoh, Kolom secara khas memiliki diameter dalam
sekitar 4.6 mm, dan panjang sekitar 150-250 mm . Komponen polar dalam
campuran yang melewati Kolom akan menempel lebih lama pada silika polar
dibandingkan dengan komponen non polar. Karena itu, yang non polar akan
melewati Kolom lebih cepat (Kumar et al., 2015).

1.3 Komponen pokok HPLC


Gandjar dan Rohman, 2007 menerangkan bahwa instrumentasi KCKT pada
dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok yaitu:
1. Wadah fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert).Wadah pelarut
kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase
gerak.Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2
liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing
(penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan
berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga
akan mengacaukan analisis.
Pada saat membuat pelarut untuk fase gerak, maka sangat dianjurkan
menggunakan pelarut, buffer, dan reagen dengan kemurnian yang sangat
tinggi, dan lebih terpilih lagi jika pelaarut-pelarut yang digunakan untuk
KCKT berderajat KCKT (HHPLC grade).
Adanya pengotor dalam reagen dapat menyebabkan gangguan
gangguan pada sistem Kromatografi.Adanya partikel yang kecil dapat
terkumpul dalam Kolom atau dalam tabung yang sempit, sehingga dapat
menyebabkan suatu kekosongan pada Kolom atau tabung
tersebut.Karenanya, fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih
dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini.
2. Sistem penghantaran fase gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang
dapat bercampur secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan
resolusi.Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan
pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan
fase terbalik adalah campuran larutan buffer dengan methanol atau
campuran air dengan asetonitril.Untuk pemisahan dengan fase normal, fase
gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut
hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-
pelarut jenis alcohol.Pemisahan dengan fase normal ini kurang.
3. Alat untuk memasukkan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung
kedalam fase gerak yang mengalir dibawah tekanan menuju Kolom
menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan
katup Teflon yang dilengkapi dengan keluk (sample loop) sampel internal
atau eksternal.Pada saat pengisian sampel, sampel digelontor melewati
keluk sampel dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuangan.Pada saat
penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk
sampel dan menggelontor sampel ke Kolom.
4. Kolom
Ada 2 jenis Kolom pada KCKT yaitu Kolom konvensional dan
Kolom mikrobor.Kolom mikrobor memiliki 3 keuntungan dibandingkan
dengan Kolom konvensional, yaitu konsumsi fase gerak kolom mikrobor
hanya 80% atau lebih kecil dibandingkan dengan Kolom konvensional
karena pada Kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-
100µl/menit), adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom
mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa, sensitivitas
Kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih pekat, karenanya jenis
kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel
klinis.
5. Detektor
Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu
detektor universal ( yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat
spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor
spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan
mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis,
detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
6. Wadah penampung buangan fase gerak
7. Tabung penghubung
8. Komputer atau integrator atau perekam
Alat ini akan mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan oleh
detektor lalu mem-plotkannya sebagai suatu kromatogram yang selanjutnya
dapat dievaluasi oleh seorang analis (pengguna).
D. Validasi Metode
Beberapa validasi metode yang digunakan:
1. Presisi
Presisi atau precision adalah ukuran yang menunjukkan derajat
kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil
individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada
sampel yang diambil dari campuran yang homogen. Presisi diukur sebagai
simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi). Precision
dapat dinyatakan sebagai repeatability (keterulangan) atau reproducibility
(ketertiruan).Metode dinyatakan teliti jika CV ≤ 2% (Riyanto, 2014).
Rumusnya adalah sebagai berikut :

(Riyanto, 2014)
2. Linieritas
Linearitas adalah kemampuan metode analisis memberikan respon
proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode
adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah
ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan
linearitas yang dapat diterima.Parameter hubungan kelinieran yang
digunakan yaitu koefisien korelasi (r) dan koefisien determinasi (R) pada
analisis regresi linier y = bx + a (b adalah slope, a adalah intersep, x
adalah konsentrasi analit dan y adalah respon instrumen) (Riyanto, 2014).
Koefisien determinasi adalah rasio dari variasi yang dijelaskan
terhadap variasi keseluruhan. Nilai rasio ini selalu tidak negatif sehingga
ditandai dengan R2. Koefisien korelasi adalah suatu ukuran hubungan
linier antara dua set data dan ditandai dengan r. Hubungan linier yang
ideal dicapai jika nilai a = 0 dan r = +1 atau -1 merupakan hubungan yang
sempurna, tanda + dan - bergantung pada arah garis(Riyanto, 2014).
3. Accuracy
Accuracyadalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan
hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya. Accuracy dinyatakan
sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan.
Accuracy dapat ditentukan melalui dua cara, yaitu metode simulasi
(spiked-placebo recovery) atau metode penambahan baku (standard
addition method) (Riyanto, 2014).
Menurut Riyanto, 2014 rumus penentuan akurasi adalah sebagai berikut:
% Perolehan kembali (recovery) = (C1-C2) / C3 x 100
C1 = konsentrasi dari analit dalam campuran contoh + sejumlah tertentu
analit
C2 = konsentrasi dari analit dalam contoh
C3= konsentrasi dari analit yang ditambahkan kedalam contoh

Tabel I. Kriteria rentang recovery yang dapat diterima (Harmita, 2004)


Analit pada matriks sampel Recovery yang diterima
(%)
10<A≤100 (%) 98-102
1<A≤10 (%) 97-103
0,1<A≤1 (%) 95-105
0,0001<A≤0,1 (%) 90-107
100ppb <A≤ 1 ppm 80-110
10 ppb <A≤100 ppb (%) 60-115
1 ppb<A≤10 ppb (%) 40-120

4. Selektivitas (spesifisitas)
Selektivitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya
dapat mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan
adanya kompinen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel.
Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan
metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang
ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing
lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak
mengandung bahan lain yang ditambahkan
( Harmita, 2004).
5. Batas deteksi
Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang
dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan
dengan blangko.Batas deteksi merupakan parameter uji batas.Batas
kuantitasi merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai
kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi
kriteria cermat dan seksama (Riyanto, 2014).
BAB III

METODE KERJA

A. ALAT DAN BAHAN

ALAT
1. Spektrofotometer UV/Vis merk Perkin- elmer Lamda 20
2. Seperangkat KCKT yang meliputi:
- Pompa merk Shimadzu model SPD-10 AD No.C20293309457JP
- Detektor UV/Vis merk Shimadzu model SPD- 10 AV No.C20343502697 KG
- CBM- 101 merk Shimadzu No. C50363502311 SA
- Kolom waters BondapacTM C 18 (Dengan panjang 30 cm; P61271BO2 P/N
27324; diameter partikel 5-10 µm)
- Injektor jenis katub suntik model 77215i
- Seperangkat komputer merek acer
3. Syringe merk Hamilton Pat No. 2933087
4. Degassing ultrasonic merk Retsch tipe T460 No. V935922012 EY
5. Vacum merk gast model DOA-P104-BN
6. Organic solvent membrane filter merk Whatman dengan ukuran pori 0,5µm dan
diameter 47 mm.
7. Inorganic solvent membrane filter merk whatman dengan ukuran pori 0,45 µm
dan diameter 47 mm.
8. Membran filter holder merk whatman dengan kapasitas 300 ml.
9. Penyaring millipore
10. Microtube 1 mL
11. Micropipette merk socorex ukuran 200-1000 µl
12. Neraca analitik merk scaltec SBC 22 max 60/210 g, d= 0,01/0,1 mg, e= 1 mg
13. Seperangkat alat gelas yang lazim digunakan untuk analisis

BAHAN
1. Parasetamol
2. Kafein
3. Metanol
4. Aquabidest.
5. Amilum

B. CARA KERJA
1. Pembuatan larutan fase gerak

Diukur 200 mL methanol PA



Dimasukkan kedalam labu ukur 500 mL

Ditambahkan dengan akuabides hingga batas

Digojog dan disaring dengan kertas saring lalu didegasing selama 10 menit.

2. Pembuatan Larutan Baku Parasetamol

a. Pembuatan Larutan stok

Sebanyak 60 mg baku Parasetamol ditimbang dengan seksama



Dimasukkan kedalam labu takar 10 mL

Ditambahkan dengan pelarut fase gerak hingga batas, lalu digojog

b. Pembuatan larutan Intermediet parasetamol

0,2 mL larutan stok parasetamol diambil menggunakan pipet volume.



Dimasukkan kedalam labu 10mL

Ditambahkan pelarut fase gerak hingga batas lalu digojog

Diperoleh larutan dengan konsentrasi 120 µg/mL (1µg/mL= 1 ppm)

c. Pembuatan Larutan Baku Seri Parasetamol ( konsentrasi 6; 12; 24; 48;


dan 96µg/mL)

Diambil 0,05; 0,1; 0,2; 0,4 ; 0,8 mL dari larutan intermediet



Masing- masing dimasukkan kedalam microtube 1 mL

Ditambahkan pelarut fase gerak hingga batas

Diperoleh larutan dengan konsentrasi 6; 12; 24; 48; dan 96µg/mL (1µg/mL=
1 ppm)

Disaring menggunakan milipore 0,45 µm

Didegasing selama 5 menit

3. Pembuatan Larutan Baku Kafein

a. Pembuatan Larutan Stok

Sebanyak 5 mg baku kafein ditimbang dengan seksama



Dimasukkan kedalam labu takar 10 mL

Ditambahkan dengan pelarut fase gerak hingga batas

Digojog

b. Pembuatan larutan intermediet kafein

Diambil 0,2 mL larutan stok kafein menggunakan pipet volume



Dimasukkan kedalam labu 10 mL

Ditambahkan pelarut fase gerak hingga batas lalu digojog

Diperoleh larutan dengan konsentrasi 10µg/mL (1µg/mL= 1 ppm)

c. Pembuatan larutan baku seri kafein ( konsentrasi 0,5; 1; 2; 4; 8µg/mL)

Diambil 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; dan 0,8 dari larutan intermediet

Masing- masing dimasukkan kedalam microtube 1 mL

Ditambahkan pelarut fase gerak hingga bata

Diperoleh larutan dengan konsentrasi 0,5; 1; 2; 4; dan 8µg/mL (1µg/mL= 1
ppm)

Disaring menggunakan milipore 0,45 µm lalu didegasing selama 5 menit.

Volume seri larutan Kadar paracetamol Kadar kafein(µg/mL) =


baku (mL) (µg/mL) = ppm ppm

0,05 6,0 0,5

0,1 12,0 1,0

0,2 24,0 2,0

0,4 48,0 4,0

0,8 96,0 8,0

4. Pembuatan Kurva Baku Parasetamol dan Kafein.


6 seri konsentrasi larutan baku parasetamol dan kafein masing-masing
disuntikkan sebanyak 20µL dalam injector port dengan menggunakan HPLC
syringe dengan fase diam kolom C 18 fase gerak methanol : aquadest (40:60)
dan flow rate 1 mL/menit

Kromatogram yang dihasilkan kemudian diamati

Dengan metode regresi linier, diplotkan kadar (μg/mL) terhadap harga AUC dari
masing-masing seri larutan kadar sehingga didapat persamaan y = bx + a (y =
harga AUC, x= konsentrasi, b= slope, a= intersept)

Linearitas yang baik jika memiliki nilai r lebih besar sama dengan 0,999.
5. Pengukuran akurasi dan presisi dengan menggunakan larutan PCT:
Kafein: placebo (amilum)

a. Pembuatan Larutan stok

Ditimbang masing-masing parasetamol, kafein, dan placebo (amilum) 12mg;


1mg; 3mg (total berat 1 tablet bodrex, belum ditimbang beratnya)

Dilarutkan kedalam 10 mL pelarut.

b. Pembuatan Larutan intermediet

Diambil 0,2 mL larutan stok menggunakan pipet volume



Dimasukkan kedalam labu 10 mL

Ditambahkan pelarut fase gerak hingga batas lalu digojog

c. Pembuatan Seri Larutan

Diambil 0,2; 0,3; 0,4 mL dari larutan intermediet



Masing- masing dimasukkan kedalam microtube 1mL

Ditambahkan pelarut fase gerak hingga batas

Disaring menggunakan milipore 0,45 µm

Didegasing selama 5 menit

Masing-masing konsentrasi di replikasi sebanyak 3 kali.

Volume seri Kadar Kadar kafein Kadar amilum


larutan parasetamol (µg/mL) = ppm (µg/mL) = ppm
(mL) (µg/mL) = ppm
0,2 24 2 6

0,3 36 3 9

0,4 48 4 12

Presisi ditentukan berdasarkan nilai CV = (SD/ ) * 100, memiliki nilai


presisi yang baik jika nilai CV< 2%
.
6. Validasi Metode
3 seri konsentrasi larutan pada 5c, masing-masing disuntikkan sebanyak 20µL
dalam injector port dengan menggunakan HPLC syringe dengan fase diam
kolom C 18 , fase gerak methanol : aquadest (40:60) dan flow rate 1 mL/menit.

7. Pembuatan Larutan Sampel


a. Pembuatan Larutan Stok
Tablet bodrex yang telah digerus ditimbang sebanyak 80 mg

dilarutkan dalam fase gerak sebanyak 10 mL

b. Pembuatan Larutan seri


Diambil 6µl, 8µl dari larutan stok

dimasukkan kedalam microtube 1mL

Ditambahkan pelarut fase gerak hingga batas

Disaring menggunakan milipore 0,45 µm

Didegasing selama 5 menit

Masing-masing konsentrasi di replikasi sebanyak 3 kali

Sehingga diperoleh masing-masing konsentrasi sebesar 36ppm parasetamol
dan 3 ppm kafein, 48ppm parasetamol dan 4 ppm kafein

8. Penghitungan Kadar Sampel


Dengan memasukkan harga AUC sampel dalam masing-masing persamaan
kurva baku parasetamol dan kafein y= bx + a sehingga didapatkan kadar
parasetamol dan kafein dalam sampel (mg%). Kemudian data disajikan
dalam bentuk 𝑋̅±SD dengan satuan mg/tablet.

9. Penggunaan HPLC
Dilakukan purge pada kompartemen bawah untuk menghilangkan
gelembung

Setelah kompartemen bawah stabil nyalakan kompartemen atas

Disiapkan methanol dan fase gerak, dicuci syring menggunakan methanol 3-
4x dan sampel 2x

Dipilih lamda 272 nm (karena kadar parasetamol lebihbesar dari kafein)
pada kompartemen atas

Dinyalakan CBM sampai lampu tidak berkedip

Nyalakan CPU computer, muncul layar biru kemudian klik enter

Muncul program class CR 10, dipilih real time analysis

Sebelum diijenkan pastikan garis pada layar sudah lurus dan dilakukan
baseline

Diisi data sampel login, pilih login dan overwrite

9.1 cara injeksi sampel


syringe di paskan pada lubang

buka lubang

masukan syringe dan tekan

tarik syringe dan tutup keran

klik zero pada kompartemen atas

9.2 cara mencuci kolom


dtunggu 20 menit dialiri fase gerak

preasure di catat dan di pump off

selang diganti ke tabung methanol

drain dibukan dan dipil kecepatan alir 5 mL/menit

ditunggu hingga stabil
BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

a. Data

A. PENIMBANGAN

1. Validasi 1
Data Penimbangan

Penimbangan Parasetamol Kafein Amilum


(gram)
Wadah 0,2737 0,2598 0,2850 0,2776 0,2806
Wadah + isi 0,3343 0,3199 0,2902 0,2830 0,2986
Isi 0,0606 0,0601 0,0052 0,0054 0,0180

Data Penimbangan Sampel (Bodrex®)

Tablet Berat (g) Tablet Berat (g)


1 0,8272 11 0,8078
2 0,8348 12 0,8511
3 0,8371 13 0,8279
4 0,8462 14 0,8497
5 0,8261 15 0,8395
6 0,8382 16 0,8489
7 0,8417 17 0,8207
8 0,8316 18 0,8606
9 0,8096 19 0,8414
10 0,8329 20 0,8255
0,8349

2. Validasi 2
Penimbangan Bahan
Parasetamol Baku Kafein Baku
kertas 0.2476 g Kertas 0.2472 g
kertas + isi 0.3076 g kertas + isi 0.3072 g
kertas
kosong 0.2476 g kertas kosong 0.2472 g
Isi 0.0600 g Isi 0.0600 g
Data Penimbangan standar internal

Plasebo Replikasi 1
Parasetamol Kafein Amilum
kertas 0.2726 g Kertas 0.2754 g kertas 0.2749 g
kertas + isi 0.3326 g kertas + isi 0.2804 g kertas + isi 0.2899 g
kertas
kosong 0.2726 g kertas kosong 0.2754 g kertas kosong 0.2749 g
Isi 0.0600 g Isi 0.0050 g isi 0.0150 g

Plasebo Replikasi 2
Parasetamol Kafein Amilum
kertas 0.2550 g Kertas 0.2550 g kertas 0.2545 g
kertas +
isi 0.3150 g kertas + isi 0.2600 g kertas + isi 0.2695 g
Kertas kertas kertas
kosong 0.2550 g kosong 0.2550 g kosong 0.2545 g
Isi 0.0600 g Isi 0.0050 g isi 0.150

3. Penetapan Kadar 1
Data penimbangan
Penimbangan Parasetamol Kafein
(gram)
Wadah 0,2519 0,2726
Wadah + isi 0,3121 0,2776
Wadah + sisa 0,2519 0,2726
Isi 0,0602 0,0050

Data Penimbangan Sampel (Bodrex®)

Penimbangan Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3


Wadah 0,4080 0,4036 0,4036
Wadah + isi 0,4950 0,4908 0,4912
Wadah + sisa 0,4081 0,4037 0,4038
Isi 0,0869 0,0871 0,0874

4. Penetapan Kadar 2
Data Penimbangan
Penimbangan Parasetamol Kafein
(gram)
Wadah 0,4354 0,4317
Wadah + isi 0,4956 0,4367
Wadah + sisa 0,4355 0,4317
Isi 0,0601 0,0050

Data Penimbangan Sampel (Bodrex®)

Penimbangan Replikasi Replikasi Replikasi Replikasi Replikasi Replikasi


(gram) 1 2 3 4 5 6
Wadah 0,2565 0,2572 0,2594 0,2602 0,2421 0,2502
Wadah + isi 0,3365 0,3373 0,3395 0,3403 0,3221 0,3303
Wadah + sisa 0,2565 0,2572 0,2594 0,2603 0,2421 0,2503
Isi 0,0800 0,0801 0,0801 0,0800 0,0800 0,0800

5. Penetapan Kadar 3
Data Penimbangan

Penimbangan Parasetamol Kafein


(gram)
Wadah 0,2498 0,2624
Wadah + isi 0,3098 0,2675
Isi 0,0600 0,0051

Data Penimbangan Sampel (Bodrex®)

Penimbangan Replikasi Replikasi Replikasi Replikasi Replikasi


bodrex 1 (g) 2 (g) 3 (g) 4 (g) 5 (g)
Wadah 0,2551 0,2521 0,2474 0,2571 0,2440
Wadah + isi 0,3353 0,3328 0,3274 0,3372 0,3240
Isi 0,0802 0,0807 0,0800 0,0801 0,0800

B. Preparasi Validasi Metode


1. Validasi 1
a. Parasetamol
Larutan induk : 60,1 mg @10 mL = 6,01 mg/mL

Larutan intermediet :MxV=MxV

: 6,01 mg/mL x 0,2 mL = M x 10 mL

: 0,1202 mg/Ml

Larutan seri :

Volume seri larutan (mL) Kadar parasetamol (µg/mL) = ppm


0,05 6,0
0,1 12,0
0,2 24,0
0,4 48,0
0,8 96,0

b. Kafein
Larutan induk : 5,4 mg @10 mL = 0,54 mg/mL

Larutan intermediet :MxV=MxV

: 0,54 mg/mL x 0,2 mL = M x 10 mL

: 0,0108 mg/mL

Larutan seri :

Volume seri larutan (mL) Kadar kafein (µg/mL) = ppm


0,05 0,5
0,1 1,0
0,2 2,0
0,4 4,0
0,8 8,0
c. Larutan Campuran
Larutan induk :60,6 mg parastamol + 5,2 mg kafein + 0,018 mg amilum
@10 mL
Larutan intermediet : diambil 0,2 mL dari larutan induk @10 mL
Larutan seri :
Volume seri Kadar paresetamol Kadar kafein Kadar amilum
larutan baku (µg/mL) = ppm (µg/mL) = ppm (µg/mL) = ppm
(mL)
0,05 6,0 0,5
0,4 48 4,0
1,0 120 10

2. Validasi 2
a. Parasetamol
Larutan induk : 60.0 mg @10.0 mL = 6.0 mg/mL
Larutan intermediet :MxV=MxV
: 6.0 mg/mL x 0.2 mL = M x 10.0 mL
: 0.1200 mg/mL
Larutan seri :
Volume seri larutan (mL) Kadar parasetamol (µg/mL) = ppm
0.05 6.0
0.1 12.0
0.2 24.0
0.4 48.0
0.8 96.0

b. Kafein
Larutan induk : 5.0 mg @10.0 mL = 0.50 mg/mL
Larutan intermediet :MxV=MxV
: 0.50 mg/mL x 0.2 mL = M x 10 mL
: 0.0100 mg/mL
Larutan seri :
Volume seri larutan (mL) Kadar kafein (µg/mL) = ppm
0.05 0.5
0.1 1.0
0.2 2.0
0.4 4.0
0.8 8.0

c. Larutan Campuran
Larutan induk : 60.0 mg PCT + 5.0 mg kafein + 0.015 mg amilum @10
mL
Larutan seri :
Volume seri Kadar paresetamol Kadar kafein Kadar amilum
larutan baku (µg/mL) = ppm (µg/mL) = ppm (µg/mL) = ppm
(µL)
4.0 24 2 0.006
19.0 114 95 0.026
79.0 474 395 0.119

C. Pengukuran Kurva Baku

1. Validasi 1
a. Absorbansi Parasetamol
1000000
Konsentrasi AUC 900000
(µg/L) 800000
6,01 76824 700000
12,02 118983 600000
24,04 194627 500000
48,08 395267 400000
300000 y = 7710.4x + 23125
96,16 766456
200000 R² = 0.9992
100000
0
0 50 100 150

b. Absorbansi Kafein
250000
Konsentrasi AUC
(µg/L)
200000 y = 22462x + 7894.9
0,52 21768 R² = 0.9983
1,04 33252
2,08 49680 150000
4,16 101138
8,32 195729 100000

50000

0
0 2 4 6 8 10
c. Absorbansi Campuran
Paracetamol Kafein
Kosentrasi
(µg/L) Absorbansi Kosentrasi(µg/L) absorbansi
6 49321,6667 0,5 19718,3333
48 125928 4 28408
120 52011,3333 10 13805,3333

Absorbansi Larutan Campuran


140000

120000

100000

80000

60000

40000

20000

0
6 48 120

parasetamol kafein
2. Validasi 2
a. Absorbansi Parasetamol
a: 10182.125
Konsentrasi
AUC b: 9662.292
(ppm)
r: 0.9996
6.0 68158 r2: 0.9991
12.0 132753 Persamaan linear:
y = 10182.125 + 9662.292x
24.0 226366
48.0 485944
96.0 934876

Kurva Baku Parasetamol


1000000
y = 9662.3x + 10182
800000
R² = 0.9991
600000
AUC

400000 AUC
Linear (AUC)
200000

0
0 50 100 150
Konsentrasi (ppm)

b. Kurva Baku Kafein


Konsentrasi a: 27410.25
AUC
(ppm) b: 141918.8225
0.5 70867 r: 0.8930
r2: 0.7975
1.0 20321
Persamaan linear:
2.0 42989 y = 27410.25 + 14918.82x
4.0 79493
8.0 154623
Kurva baku

Kurva Baku Kafein


200000

150000 y = 14919x + 27410


R² = 0.7975
Axis Title

100000
AUC
50000 Linear (AUC)

0
0 2 4 6 8 10
Axis Title

a. Kurva baku parasetamol


Konsentrasi
AUC
(ppm) a = 1621,2
6 20377 b = 2380,1
12 28380 r = 0,9628
18 34855 y = bx + a = 2380,1x + 1621,2
24 65466
30 73237

Kurva Baku Parasetamol


Konsentrasi VS AUC
80000
y = 2380.1x + 1621.2
60000 R² = 0.9269
AUC

40000 Parasetamol

20000 Linear
(Parasetamol)
0
0 10 20 30 40
Konsentrasi
b. Kurva baku kafein
Konsentrasi
AUC
(ppm)
0,5 7827
1,0 8643
1,5 11103
2,0 19168
2,5 22754

Kurva Baku Kafein


Konsentrasi VS AUC
25000

20000 y = 8075.8x + 1785.3


R² = 0.9135
15000
AUC

10000 Kafein
Linear (Kafein)
5000

0
0 1 2 3
Konsentrasi

3. PRAKTIKUM 4
Kurva Baku Parasetamol

Seri Konsentrasi AUC a = 167412


(ppm)
6 193748 b = 11576
12 305455 r = 0,9016
18 456143
24 459643
30 463946
Konsentrasi Parasetamol vs AUC
456143 463946
500000

400000 459643

300000
305455 AUC
200000
193748
100000

0
0 10 20 30 40

Kurva Baku Kafein

Seri AUC
0.5 49399 a = 32981
1 55928
1.5 65005 b = 25793
2 92357 r = 0,9634
2.5 95668

Konsentrasi Kafein vs AUC


120000
92357 y = 25793x + 32981
100000 R² = 0.9281
80000 95668
55928
60000 AUC
65005
40000 Linear (AUC)
49399
20000

0
0 1 2 3
4. PRAKTIKUM 5
Paracetamol
Konsentrasi AUC
(µg/mL)
6 66911
12 198604
18 256234
24 313013
30 481875
a = -19973,7
b = 15738,95
r = 0,979
y = bx + a = 15738,95x-19973,

Konsentrasi vs AUC Paracetamol


600000
y = 15739x - 19974

R² = 0,9584

AUC

Linear (AUC)

10 20 30 40
Kafein
Konsentrasi AUC
(µg/mL)
0,5 99259
1,0 114456
1,5 97099
2,0 104785
2,5 140770
a = 89268,5
b = 14670,2
r = 0,65
y = bx + a = 14670,2x-

Konsentrasi vs AUC Kafein


y = 14670x + 89269
R² = 0,4245
AUC

Linear (AUC)
C. Validasi Metode
PRAKTIKUM 2
Replikasi I
1. Parasetamol
Konsentras
Konsentrasi
i Rata-Rata
Parasetamol
Parasetamo %Recovery %
yg terukur
l Teoritis Recovery
(µg/mL)
No AUC (µg/mL)
T 231291 22.8837 24 95.3486%
S 971968 99.5401 114 87.3159% 90.5961%
R 4091985 422.4466 474 89.3159%

2. Kafein
Konsentrasi Konsentras
Rata-
Kafein yg i Kafein
%Recovery Rata %
Terukur Teoritis
Recovery
No AUC (µg/mL) (µg/mL)
T 51259 1.5986 2 79.9300%
121.8433
S 210872 12.2973 9.5 129.4453%
%
R 947569 61.6811 39.5 156.1547%

Replikasi II
1. Parasetamol
Konsentrasi Konsentrasi
Parasetamol Parasetamol Rata-Rata
%Recovery
yg terukur Teoritis % Recovery
No AUC (µg/mL) (µg/mL)
T 283324 28.2688 24 117.7867%
S 1001870 102.6348 114 90.0305% 99.0063%
R 4095558 422.8162 474 89.2017%
2. Kafein
Konsentrasi Konsentrasi
Rata-
Kafein yg Kafein
%Recovery Rata %
Terukur Teoritis
Recovery
No AUC (µg/mL) (µg/mL)
T 57472 2.0150 2 100.7500%
122.0518
S 201901 11.6960 9.5 123.1158%
%
R 865914 56.2044 39.5 142.2896%

Presisi (Koefisien Variasi)

1. Parasetamol
Konsentrasi Konsentrasi
Parasetamol Parasetamol
yg terukur yg terukur ̅
𝑿 SD CV ̅̅̅̅
𝑪𝑽
(µg/mL) (µg/mL)
No Rep 1 Rep 2
T 22.8837 28.2688 25.5763 3.8078 14.9%
S 99.5401 102.6348 101.0875 2.1883 2.2% 5.7%
R 422.4466 422.8162 422.6314 0.2613 0.1%

2. Kafein
Konsentrasi Konsentrasi
Kafein yg Kafein yg
Terukur Terukur ̅
𝑿 SD CV ̅̅̅̅
𝑪𝑽
(µg/mL) (µg/mL)
No Rep 1 Rep 2
T 1.5986 2.0150 1.8068 0.2944 16.3%
S 12.2973 11.6960 11.9967 0.4252 3.5% 8.8%
R 61.6811 56.2044 58.9428 3.8726 6.6%

D. PENETAPAN KADAR
1. PRAKTIKUM 3
a. Penetapan kadar sampel
Tablet bodrex yang telah digerus diambil 80 mg dilarutkan ke dalam 10
mL  larutan baku.
Kemudian diambil 4 µL dari larutan baku dan di add hingga 1 mL, maka
diperoleh kadar sebenarnya sebagai berikut:
Volume seri larutan Kadar paresetamol Kadar kafein
baku (µL) (µg/mL) = ppm (µg/mL) = ppm
4.0 24 2

Hasil pengukuran sampel menggunakan HPLC


AUC
Parasetamol Kafein
14803 4160
41328 11672
154177 36632

a. Parasetamol
Konsentrasi parasetamol dalam sampel
Replikasi 1
y = bx + a
14803 = 2380,1x + 1621,2
x = 5,5383 ppm

Replikasi 2
y = bx + a
41328 = 2380,1x + 1621,2
x = 16,6828 ppm

Replikasi 3
y = bx + a
154177 = 2380,1x + 1621,2
x = 64,0964 ppm

Rata-rata konsentrasi
5,5383+16,6838+64,0964
𝑃𝑎𝑟𝑎𝑠𝑒𝑡𝑎𝑚𝑜𝑙 = = 28,7725 ppm
3
% Recovery
28,7725
𝑃𝑎𝑟𝑎𝑠𝑒𝑡𝑎𝑚𝑜𝑙 = × 100% = 119,885%
24

b. Kafein
Konsentrasi kafein dalam sampel
Replikasi 1
y = bx + a
4160 = 8075,4x + 1786,3
x = 0,2939 ppm

Replikasi 2
y = bx + a
11672 = 8075,4x + 1786,3
x = 1,2242 ppm

Replikasi 3
y = bx + a
36632 = 8075,4x + 1786,3
x = 4,3150 ppm

Rata-rata konsentrasi
0,2939+1,2242+4,3150
𝐾𝑎𝑓𝑒𝑖𝑛 = = 1,9444 ppm
3

% Recovery
1,9444
𝐾𝑎𝑓𝑒𝑖𝑛 = × 100% = 97,22%
2

2. PRAKTIKUM 4
Perhitungan Kadar Sampel

 Tablet bodrex 80 mg  60,0 mg PCT + 5,0 mg kafein + 5,0 mg


bahan lain (eksipien).

 Tablet bodrex yang telah digerus diambil 80 mg dilarutkan ke


dalam 10 mL  larutan baku.

 Kemudian diambil 4 µL dari larutan baku dan di add hingga 1 mL,


maka diperoleh kadar sebenarnya sebagai berikut:

Volume seri larutan Kadar paresetamol Kadar kafein


baku (µL) (µg/mL) = ppm (µg/mL) = ppm
4.0 24 2

a. Penetapan Kadar Parasetamol


Nilai kadar didapatkan dengan memasukkan nilai AUC ke dalam
persamaan regresi linear (y = 11576x + 167412) sebagai 𝑦.

Replikasi Parasetamol
1 167350
2 201011
3 174004
4 183487
5 170311

167350−167412
 𝑥1 = = -0,00536 ppm
11576

201011−167412
 𝑥2 = = 2,9025 ppm
11576

174004−167412
 𝑥3 = = 0,5694 ppm
11576

183487−167412
 𝑥4 = = 1,3886 ppm
11576

170311−167412
 𝑥5 = = 0,2504 ppm
11576

−0,00536+2,9025+0,5694+1,3886+0,2504
 𝑅𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 = 5

= 1,021108 𝑝𝑝𝑚
1,021108
 % Recovery 𝑃𝑎𝑟𝑎𝑠𝑒𝑡𝑎𝑚𝑜𝑙 = × 100% = 4,2546%
24

b. Penetapan Kadar Kafein

Nilai kadar didapatkan dengan memasukkan nilai AUC ke dalam


persamaan regresi linear ( y = 25793x + 32981) sebagai 𝑦.

Replikasi Kafein
1 35906
2 42081
3 43824
4 38229
5 36880

35906−32981
 𝑥1 = 25793
= 0,1134 ppm
42081−32981
 𝑥2 = = 0,3528 ppm
25793

43824−32981
 𝑥3 = = 0,4204 ppm
25793

38229−32981
 𝑥4 = = 0,2035 ppm
25793

36880−32981
 𝑥5 = = 0,1512 ppm
25793

0,1134+0,3528+0,4204+0,2035+0,1512
 𝑅𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 = 5

= 0,24826 𝑝𝑝𝑚
0,24826
 % Recovery 𝐾𝑎𝑓𝑒𝑖𝑛 = × 100% = 12,413%
2

3. PRAKTIKUM 5
Sampel Parasetamol
Replikasi Konsentrasi AUC
1 6 ppm 35906
2 6 ppm 335211
3 6 ppm 403416
4 8 ppm 458306
5 8 ppm 490913

1. Replikasi 1
y = 15738,95x-
19973,7 35906 =
15738,95x-19973,7
x = 3,55 µg/mL
2. Replikasi 2
y = 15738,95x-19973,7
335211 = 15738,95x-
19973,7
x = 22,57 µg/mL
3. Replikasi 3
y = 15738,95x-19973,7
403416 = 15738,95x-
19973,7
x = 26,90 µg/mL
̅ 17,67 µg/mL
4. Replikasi 4
y = 15738,95x-19973,7
458306 = 15738,95x-
19973,7
x = 30,39 µg/mL
5. Replikasi 5
y = 15738,95x-19973,7
490913 = 15738,95x-
19973,7
x = 32,46 µg/mL
̅ 31,43 µg/mL
Kafein
Replikasi Konsentrasi AUC
1 6 ppm 10355
2 6 ppm 89182
3 6 ppm 87948
4 8 ppm 97584
5 8 ppm 103299

6. Replikasi 1
y = 14670,2x-89268,5 10355 =
14670,2x-89268,5
x = - 5,38 µg/mL

7. Replikasi 2
y = 14670,2x-89268,5 89182 =
14670,2x-89268,5
x = - 0,006 µg/mL

8. Replikasi 3
y = 14670,2x-89268,5 87948 =
14670,2x-89268,5
x = - 0,090 µg/mL
̅ 1,83 µg/mL

9. Replikasi 4
y = 14670,2x-89268,5 97584 =
14670,2x-89268,5
x = 0,57 µg/mL

10. Replikasi 5
y = 14670,2x-89268,5 103299 =
14670,2x-89268,5
x = 0,96 µg/mL
̅ 0,77 µg/mL
Perhitungan % recovery
Kadar sebenarnya:

Konsentrasi 6 ppm
Paracetamol : 36 ppm

𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟
%𝑟𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑦 = × 100%
𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑛𝑎𝑟𝑛𝑦𝑎

17,67
%𝑟𝑒𝑐𝑜𝑒𝑟𝑦 = × 100% = 49,08%
36

 Kafein : 3 ppm
𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟
%𝑟𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑦 = × 100%
𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑛𝑎𝑟𝑛𝑦𝑎

1,83
%𝑟𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑦 = × 100% = 61%
3

Konsentrasi 8 ppm
Paracetamol 48 ppm
𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟
%𝑟𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑦 = × 100%
𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑛𝑎𝑟𝑛𝑦𝑎

31,43
%𝑟𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑦 = × 100% = 65,48%
448

Kafein 4 ppm

𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟
%𝑟𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑦 = × 100%
𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑛𝑎𝑟𝑛𝑦𝑎
0,77
%𝑟𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑦 = × 100% = 19,25%
4

b. Pembahasan

Tujuan utama dalam praktikum ini yaitu, menetapkan paracetamol dan kafein yang
terkandung dalam tablet Bodrex® serta melihat kesesuaian kadar yang tertera dalam kemasan
Bodrex® tablet dengan hasil analisis menggunakan metode HPLC. Sebelum dilakukan
penetapan kadar dilakukan validasi metode yang digunakan, tujuan dari validasi metode yaitu
untuk mengetahui metode yang digunakan dalam pengukuran paracetamol dan kafein dalam
obat sakit kepala bersifat valid (linieritas, akurasi dan presisi) atau tidak.

Validasi yang dilakukan yakni dengan menggunakan standar internal menggunakan


placebo yang berisi parasetamol, kafein, dan amilum perbandingan 12 : 1: 3 dengan
menggunakan 3 konsentrasi yang dibuat pada kurva baku yang mewakili konsetrasi rendah,
sedang dan tinggi. Didalam analisis dengan HPLC ini pada umumnya banyak menggunakan
metode standar internal dimana sampel yang dianalisis ditambahkan dengan sejumlah larutan
standar yang berbeda dengan sampel namun mempunyai kemiripan sifat. Alasan
menggunakan metode standar internal didalam HPLC yaitu untuk meminimalisir kesalahan
pengukuran akibat variasi volume yang diinjeksikan kedalam alat HPLC (Amelia dan Karlida,
2015). Tujuan validasi adalah untuk mengetahui sejauh mana ketepatan dan kecermatan suatu
instrument pengukuran dalam melakukan fungsi ukurnya, agar data yang diperoleh dapat
relevan/sesuai dengan tujuan diadakannya pengukuran tersebut.

Dalam validasi dilakukan pengukuran presisi, selektivitas (spesifisitas), akurasi,


linieritas. Presisi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji
individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan
secara berulang pada sampel yang diambil dari campuran yang homogen. Metode dinyatakan
teliti jika CV ≤ 2% (Riyanto, 2014). Linearitas adalah kemampuan metode analisis
memberikan respon proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Parameter
hubungan kelinieran yang digunakan yaitu koefisien korelasi (r) dan koefisien determinasi
(R) pada analisis regresi linier y = bx + a (b adalah slope, a adalah intersep, x adalah
konsentrasi analit dan y adalah respon instrumen). Hubungan linier yang ideal dicapai jika
nilai a = 0 dan r = +1 atau -1 merupakan hubungan yang sempurna (Riyanto, 2014).
Accuracy adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan
kadar analit yang sebenarnya. Accuracy dinyatakan sebagai persen perolehan kembali
(recovery) analit yang ditambahkan (Riyanto, 2014). Untuk persen recovery dengan kadar
0,0001<A≤0,1 (%) yang dapat diterima yakni 90-107% (Harmita, 2004). Selektivitas suatu
metode adalah kemampuannya yang hanya dapat mengukur zat tertentu saja secara cermat
dan seksama dengan adanya kompinen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel
(Harmita, 2004).
Parasetamol dan kafein adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor
yang dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa
ini memungkinkan dilakukan analisis dengan teknik HPLC menggunakan fase gerak polar
yaitu methanol dan air. Prinsip dasar dari HPLC adalah proses pemisahan senyawa
berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi, karena adanya perbedaan koefisien distribusi
masing-masing senyawa diantara 2 fase yang saling bersinggungan atau tidak saling campur
(Noegrohati, 1994). Kecepatan migrasi senyawa-senyawa dalam sampel dipengaruhi oleh
polaritasnya. Jika sifat senyawa target serupa dengan fase diam, maka lebih banyak tertinggal
pada fase diam, sehingga pergerakannya lebih lambat. Sebaliknya, jika sifat senyawa target
serupa dengan fase gerak, maka lebih banyak terbawa oleh fase gerak, sehingga terdistribusi
lebih cepat. Dalam percobaan ini, praktikan menggunakan fase terbalik, yaitu fase diam
(kolom C18) lebih non polar dibandingkan dengan fase gerak (campuran metanol-air dengan
perbandingan 40:60)
Penggunakan fasa terbalik karena teknik ini menggunakan pelarut polar sebagai fase
gerak dan fasa diamnya menggunakan pelarut non polar. Penggunaan fasa gerak dan fasa
diam yang berbeda kepolaranya ini bertujuan agar sampel uji tidak bereaksi dengan fasa
diamnya saat melewati kolom HPLC. Sampel dalam melewati kolom memiliki waktu, waktu
yang dibutuhkan ini yang disebut retention time.
Dari keseluruhan waktu retensi yang telah diatur selama 5 menit, parasetamol terelusi
lebih awal dengan waktu retensi lebih singkat pada menit ke-2,5 dibandingkan kafein pada
menit ke-3,5. Kondisi tersebut telah sesuai dengan polaritas kedua senyawa tersebut apabila
dilihat dari strukturnya. Parasetamol hanya memilki 1 gugus CH3, sedangkan kafein memiliki
3 gugus CH3. Semakin banyak gugus CH3, maka sifat senyawa tersebut akan semakin non
polar.

Parasetamol Kafein
Oleh karena itu, kafein akan lebih lama berada dalam kolom dengan fase diam yang
non polar dan mempunyai waktu retensi yang besar. Sementara parasetamol akan cenderung
terbawa bersama dengan fase gerak, sehingga muncul terlebih dahulu dalam kromatogram
dan mempunyai waktu retensi yang kecil.
Tujuan utama yang harus dicapai dari suatu kegiatan analisis kimia adalah
dihasilkannya data hasil uji yang abash (valid), maka perlu dilakukan validasi metode.
Validasi metode analisis adalah suatu proses penilaian terhadap metode analisis tertentu
berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa metode tersebut memenuhi
persyaratan untuk digunakan (Harmita,2004). Disamping itu dengan memvalidasi metode
dapat diperkirakan dengan pasti tingkat kepecayaan yang dihasilkan oleh suatu metode
pengujian maupun dari metode instrumen yang digunakan. Sehingga setelah adanya validasi
terlebih dahulu maka data penetapan kadar yang didapat memiliki hasil yang abash dan
mendekati bahkan sama dengan nilai sebenarnya.
Perlunya penetapan linieritas dalam pengujian, dikarenakan linieritas dapat
menunjukan kemampuan suatu metode analisis untuk memperoleh hasil pengujian yang
sesuai dengan kosentrasi analit dalam contoh kisaran kosentrasi tertentu. Hal ini dapat
dilakukan dengan membuat kurva kaliberasi dari beberapa set larutan standar yang telah
diketahui kosentrasinya dan didapat persamaan garis y=a+bx. Persamaan ini menghasilkan
koefisien korelasi ( r ). Penetapan linieritas minimum menggunakan lima kosentrasi yang
berbeda, nilai korelasi yang memenuhi persyaratan adalah lebih besar dari 0,997 (ICH 1995
diacu dalam Chan 2004). Dalam penetapan kadar hasil yang didapat harus masuk di dalam
kurva baku yang telah ditetapkan dan tidak boleh adanya data yang keluar atau ektrapolasi.
Karena data yang ekstrapolasi akan sulit untuk di prediksi.
Sebelum praktikum, dilakukan kondisioning HPLC dengan cara mengalirkan fase
gerak selama 30 menit untuk memastikan aliran yang digunakan pada saat deteksi tidak terisi/
terdapat gelembung yang dapat mengganggu hasil pembacaan HPLC. Optimasi bertujuan
untuk efesiensi waktu, mendapatkan pemisahan yang bagus dan resolusi yang baik.
Kemudian dilakukan deteksi kromatogram fase gerak dengan cara zero test. Hasil deteksi
ini harus memiliki hasil berupa garis lurus karena apabila terdapat peak akan mempengaruhi
hasil pengujian selanjutnya. Senyawa yang dianalisis memiliki sifat polar, maka fase gerak
yang digunakan adalah metanol : aquabidest (40:60) dan fase diam yang digunakan adalah
C18.

Oleh karena itu sistem HPLC yang digunakan adalah system HPLC terbalik. Fase
gerak sebelum digunakan harus didegassing terlebih dahulu agar tidak ada gelembung yang
akan mengganggu pembacaan dalam HPLC. Setelah itu disaring menggunakan kertas saring
dengan bantuan pompa vakum untuk menghilangkan kotoran atau partikel kecil karena
adanya partikel yang kecil dapat terkumpul dalam kolom atau dalam tabung yang sempit.
Larutan baku dibuat untuk mengencerkan larutan seri yang konsentrasinya sangat kecil
larutan seri dibuat dengan tujuan untuk menentukan kurva baku dan panjang gelombang
maksimal. Kurva baku ditentukan dengan HPLC dan panjang gelombang maksimal
ditentukan dengan spektrofotometri UV. Larutan baku yang akan diukur sebelumnya disaring
menggunakan milipore 0.45µm, penyaringan ini bertujuan agar partikel penganggu yang
terlarut dalam larutan sampel tidak ikut terlarut sehingga ketika diukur menggunakan HPLC
serta puncak yang muncul juga hanya puncak yang diinginkan.
Setelah dilakukan penyaringan kemudian tidak langsung dilakukan deteksi
dengan HPLC namun dilakukan degassing terlebih dahulu untuk menghilangkan buih,
degassing dilakukan 5 menit. Pada saat melakukan validasi menggunakan validasi internal
yakni baku parasetamol, baku kafein dan amilum dengan menggunakan konsentrasi rendah,
sedang dan tinggi untuk mewakili kadar dalam kurva baku. Hingga validasi kedua belum
dapat ditetapkan konsentrasi yang benar-benar masuk dalam range, dan untuk penetapan
kadar sampel menggunakan konsentrasi parasetamol 36 ppm dan 48 ppm, sedangkan untuk
kafein menggunakan konsentrasi 3ppm dan 4ppm. Sebelumnya menggunakan konsentrasi
parasetamol 24ppm dan kafein 2ppm, kadar parasetamol dan kafein yang terukur sangat kecil
dan tidak memasuki range kurva baku. Semua larutan yang dibuat dan akan diukur diharuskan
untuk disaring dan didegassing.
Validasi pada percobaan pertama didapat nilai r parasetamol dan kafein adalah nilai r
parasetamol 0,9992, kafein didapat 0,9983 dan untuk percobaan kedua parasetamol 0.9996
dan kafein 0.8930. nilai r pada validasi pertama sudah sangat baik. Pada penetapan kadar
sampel didapat nilai r parasetamol dan kafein pada tiga percobaan sebagai berikut, percobaan
pertama yakni r 0,9628 dan 0,9558. Percobaan kedua didapat nilai r parasetamol dan kafein
adalah 0,9016 dan 0,9634. Percobaan ketiga didapat nilai r parasetamol dan kafein 0,979 dan
0,65. Dalam penetapan kadar nilai r yang baik adalah diatas 0,997.
Nilai r yang kurang baik dapat disebabkan saat dilakukan pengenceran tidak tepat atau
dilakukan oleh orang yang berbeda karena dapat bersifat subjektif dalam pengenceran, selain
itu juga larutan yang akan dianalisis dimasukkan kedalam microtube, microtube sendiri
terbuat dari bahan plastik yang dapat berubah ukurannya. Untuk mengatasi nilai r yang jelek
dapat dilakukan pengenceran dengan teliti dan dilakukan oleh satu orang saja. Selain itu juga
menggunakan pipet yang akurat pengukurannya yakni dengan mikropipet, sehingga dalam
setiap pengenceran diharapkan selalu sama.
Validasi internal menggunakan placebo yang berisi parasetamol, kafein, dan amilum
perbandingan 12 : 1: 3 dengan menggunakan 3 konsentrasi yang dibuat pada kurva baku yang
mewakili konsetrasi rendah, sedang dan tinggi. Tujuan validasi adalah untuk mengetahui
sejauh mana ketepatan dan kecermatan suatu instrument pengukuran dalam melakukan fungsi
ukurnya, agar data yang diperoleh dapat relevan/sesuai dengan tujuan diadakannya
pengukuran tersebut. Rata-rata nilai AUC yang didapat pada validasi 1 untuk konsentrasi
rendah parasetamol ̅𝑋= 49.321,6667 CV=63,1% , kafein ̅𝑋=19.718,3333 CV=39,4%;
konsentrasi sedang parasetamol ̅𝑋=12.5928 CV= 130,0%, kafein ̅𝑋= 28.408 CV= 115,1%;
konsentrasi tinggi parasetamol ̅𝑋 = 52.011,3333 CV= 29,8%, kafein ̅𝑋= 13.805,3333 CV=
18,7%, untuk hasil AUC parasetamol dan kafein pada validasi 1 tidak didapatkan hasil AUC
yang memasuki range pada kurva baku.
Rata-rata nilai AUC yang didapat pada validasi 2 untuk konsentrasi rendah
parasetamol ̅𝑋= 25,5763 CV=14,9%, kafein ̅𝑋=1.8068 CV=16,3%; konsentrasi sedang
parasetamol ̅𝑋=99,5401 CV= 2,2%, kafein ̅𝑋= 11,9967 CV= 3,5%; konsentrasi tinggi
parasetamol ̅𝑋 = 422,4466 CV= 0,1%, kafein ̅𝑋= 56,2044 CV= 6,6%. Berdasarkan nilai CV
untuk replikasi setiap konsentrasi nilainya diatas 2% yang berarti keterulangan yang sangat
buruk ( Riyanto, 2014). Dapat disebabkan karena kurangnya ketelitian pada saat pengerjaan
maupun alat yang digunakan . Dapat juga dikarenakan adanya kesalahan pengenceran,
didapatkan konsetrasi yang kurang seragam antara replikasi 1, 2 dan 3. Faktor- faktor
kesalahan sistematis juga dapat terjadi pada saat penimbangan atau pengamatan praktikan
yang sangat subjektif.
Kadar parasetamol dan kafein pada percobaan 1 didapat 28,7725 ppm dan 1,9444
ppm. Percobaan 2 didapat 1,021108 ppm untuk parasetamol dan 0,24826 untuk kafein.
Percobaan 3 sampel uji dengan kosentrasi 36 ppm parasetamol dan kafein 3 ppm didapat
kadar parasetamol 17,67 ppm dan kafein 1,83 ppm. Percobaan 3 dengan sampel uji kadar
parasetamol kosentrasi 48 ppm dan kafein 4 ppm didapat kadar terukur parasetamol 31,43
ppm dan kafein 0,77 ppm. Pada percobaan nilai kadar terlalu rendah dari kadar sebernarnya
ini menunjukan sampel yang diuji terlalu encer. Pada percobaan 1 didapat nilai kadar yang
yang mendekati nilai sebenarnya. Akan tetapi pada percobaan 2 dan 3 didapat nilai kadar
parasetamol dan kafein yang sangat jauh dari nilai kadar sebenarnya. kadar terhitung yang
dapat sangat jauh berbeda dengan kadar sebenarnya dapat disebabkan oleh pengenceran yang
tidak tepat, menyebabkan sampel yang diukur dapat terbaca terlalu kecil bahkan terlalu besar
pada alat. Untuk menghidari hal tersebut dapat dilakukan pengeceran oleh satu orang saja,
sehingga pada setiap pengenceran akan selalu sama. Jika pengenceran dilakukan oleh
beberapa orang dikawaatirkan penilaian subjektif dapat mempengaruhi hasil dalam
pembacaan.
Pada penetapan kadar percobaan 1 recovery yang didapat sudah cukup baik yakni
parasetamol 119,885% dan kafein 97,22% (Recovery yang baik 90-107%). Persen recovery
pada percobaan 2 didapat parasetamol 4,2546% dan kafein 12,413%. Nilai persen recovery
yang sangat kecil ini menunjukan bahwa sampel yang diuji terlalu encer. Pada percobaan 3
dilakukan dengan mengukur 2 konsentrasi sampel yakni sampel 1 (pct 36 ppm dan kafein 3
ppm) %recovery parasetamol: 49,08%; kafein: 61%, sampel 2 (pct 48ppm dan kafein 4 ppm)
%recovery parasetamol: 65,48%; kafein: 19,25%.
BAB V
KESIMPULAN
Dalam praktikum dapat mevalidasi suatu metode analasis menggunakan alat HPLC
dan dapat mengukur kadar kafein dan parasetamol dalam bodrex® menggunakan alat HPLC .
Pada validasi menggunakan alat HPLC didapat nilai r parasetamol dan kafein adalah nilai r
parasetamol 0,9992, kafein didapat 0,9983. Kadar parasetamol dan kafein pada bodrex®
didapat kadar parasetamol dan kafein pada percobaan 1 didapat 28,7725 ppm dan 1,9444
ppm. Dari kadar yang terukur didapat persen recovery parasetamol 119,885% dan kafein
97,22% (Recovery yang baik 90-107%). Dari hasil yang didapat dapat disimpulkan praktikan
sudah dapat mevalidasi suatu metode analisis dengan nilai linieritas diatas 0,997 sehingga
metode yang digunakan valid dan dapat menetukan kadar kafein dan parasetamol pada suatu
sampel obat yaitu bodrex® dengan persen recovery parasetamol 119,885% dan kafein
97,22%. Nilai recovery untuk kafein sudah memasuki range yang ditetapkan yaitu Recovery
yang baik 90-107% sehingg kadar yang dirukur dengan metode tersebut sama denan kadar
sebenarnya. Namun untuk nilai recovery parasetamol lebih besar dan belum masuk dalam
range yang ditetapkan, sehingga kkadar terukur pada parasetamol tidak sesuai dean kadar
sebenarnya.
DAFTAR PUSTAKA

Behera et al., (2012). Role Of Ocimum Canum In Prevention Of ReperfusionInduced Renal


Ischemia In Wistar Albino Rats. International Journal of Biomedical and Advance
Research.

Borges Rosivaldo S, Barros Tainá G., Pereir Glaécia A. N., Jr João Batista., Filho Raimundo
F. G. P. Beleza, Veiga Andrex A. S., Hamoy Moisés, Mello Vanessa J., da Silva
Albérico B. F., Barros Carlos A. L, 2014, A Structure and Antioxidant Activity Study
of Paracetamol and Salicylic Acid, Scientific Research, Brazilia, pp 1185-1191.

Chan, C. C,. Lam, Herman. Lee, Y. C. and Zhang, Xue-Ming. (2004). Analytical Method
Validation and Instrument Performance Verification. Canada: John Wiley & Sons.
DepKes RI, 2014, Farmakope Indonesia Edisi V, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, hal. 728,
1000.

El-Zinati M. and Abdel-Latif Monzir S., 2015. Simultaneous Determination of Paracetamol


and Tramadol in Pharmaceutical Tablets by Derivative UV-Vis Absorption
Spectrophotometry. Department of Chemistry, Islamic University of Gaza, P.O. Box
108, Gaza, Palestine.

Gandjar, G., Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, 378-
393.

Harmita, 2004,Review Artikel.Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan


CaraPerhitungannya, Jurnal Majalah Ilmu Kefarmasian, Departemen
Farmasi:FMIPA UI, Vol. 1, No. 3.

[ICH] International Conference on Harmonization. (2005). Validation of Analytical


Procedures: Text and Methodology Q2(R1) [terhubung berkala]. www.ich.org. [02
Maret 2011].
Kumar, V., Bharadwaj, R., Gupta, R., Kumar, S., 2015. An Overview on HPLC Method
Development, Optimization and Validation process for drug analysis. The
Pharmaceutical and Chemical Journal, 2(2):30-40.
Mahdiya Dewangga r, Taufiq Agus, Nuraeni Farida, 2011, Analisis Secara Simultan
Paracetamol Dan Ibuprofen Dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi,
Universitas Pakuan, Bogor, hlm: 1-2.

Mujahid M, Sharma M, Aqil M, Iqbal D, Prem Kapur., Drug Utilization And Adverse Drug
Reaction Monitoring In NSAID Users In A South Delhi Hospital, Int J Res Pharma
Chem, 2(1), 2012,103-108.

Nawrot, P., Jprdan, S., Eastwood, J., Rotstein, J., Hugenholtz, A. and Feeley, M. 2013.
Effects Of Caffeine On Human Health. Food Additives And Contaminants. Taylor&
Francis Group, 20 (1): 1-30.

Riyanto, 2014, Validasi dan Verifikasi Metode Uji, Deeppublish, Yogyakarta, 9,23,53,dan 65.

Science Lab, 2013, Material Safety Data Sheet (Caffeine MSDS),


http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927475.