Anda di halaman 1dari 6

Uji Antibakteri

Pada uji ini diukur respon pertumbuhan populasi mikroorganisme terhadap


agen antimikroba. Kegunaan uji antimikroba adalah diperolehnya suatu sistem
pengobatan yang efektif dan efisien. Terdapat bermacam-macam metode uji
antimikroba seperti metode Diffusi seperti Disc diffusion, E-test, Ditch-plate
technique, Cup-plate technique, dan Gradient-plate technique (Pratiwi, 2008).
Uji Difusi
Metode ini merupakan metode yang paling sering digunakan. Metode ini
dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu secara sumuran dan cakram disc.
Metode sumuran yaitu dengan membuat lubang/sumur pada media agar yang telah
ditanami dengan bakteri uji dan pada lubang/sumur tersebut diberi larutan
antibakteri yang akan diuji (Pratiwi, 2008), lalu pertumbuhan bakteri diamati untuk
melihat ada tidaknya daerah hambatan disekeliling lubang/sumur. Sedangkan,
metode cakram disc merupakan salah satu cara yang paling sering digunakan yaitu
dengan menggunakan Cakram disc berisi antibakteri ditempatkan pada permukaan
medium padat yang sebelumnya telah diinokulasikan bakteri uji pada
permukaannya (Geo F et al, 2005). Setelah diinkubasi, area jernih mengindikasikan
adanya hambatan pertumbuhan bakteri uji oleh agen antibakteri pada permukaan
agar (Pratiwi, 2008). Misalnya, hasil positif (+) apabila terbentuk zona bening pada
media MHA (Muller Hinton Agar), ini menunjukkan bahwa zat uji memiliki daya
antibakteri. Sedangkan hasil negatif (-) apabila tidak membentuk zona bening pada
media MHA (Muller Hinton Agar).

Cakram

Batas zona
Zona pertumbuhan
bakteri

6
7

Gamber 2.6 : Interpretasi Hasil Metode Difusi


Sumber : (Geo F et al, 2005)
Tabel 2.6 Kelebihan dan Kekurangan Metode Difusi

Kelebihan Kekurangan

Dapat menggunakan beberapa jenis


antibakteri pada 1 lempeng agar secara Dipengaruhi banyak faktor
bersamaan

Dapat menentukan Sensitif atau Biasanya bakteri uji menggunakan


Resisten biakan murni

Memerlukan volume media yang


Hasil kuantitatif
relatif banyak

Dapat menentukan KHM

Sumber : Geo F et al, (2005), Vandepitte et al (2010).

Ekstrak Biji ketumbar dengan konsentrasi 25%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% dan
75% (contoh). dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang sudah diberi label. Blank
disc direndam selama 60 menit atau sampai menjadi jenuh pada masing-masing
konsentrasi ekstrak Biji ketumbar. Lalu pindahkan disc dalam cawan petri steril
sesuai masing-masing variabel konsentrasi.

Suspensi bakteri yang sudah dibuat di inokulasikan pada media Mueller Hinton
Agar (MHA) secara merata menggunakan kapas lidi steril, diamkan selama 10
menit. Selanjutnya letakkan disc ekstrak bunga cengkeh dengan konsentrasi yang
sudah ditentukan pada media MHA yang sudah ditanami bakteri uji. Inkubasi dalam
ikubator selama 24 jam pada suhu 37 .

Kontrol positif untuk bakteri Escherichia coli adalah disc antibiotic kloramfenikol.
Kontrol negatif untuk masing-masing bakteri uji adalah VCO (Virgin Coconut Oil)
(Uun, 2016).
8

Metode E-test
Metode E-test digunakan untuk mengestimasi KHM (Kadar hambat
minimum), yaitu konsentrasi minimal suatu agen antimikroba untuk dapat
menghambat pertumbuhan mikroorganisme.
Pada metode ini digunakan strip plastic yang mengandung agen
antimikroba dari kadar terendah hingga tertinggi dan diletakkan pada permukaan
media Agar yang telah ditanami mikroorganisme. Pengamatan dilakukan pada area
jernih yang ditimbulkannya yang menunjukkan kadar agen antimikroba yang
menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada media Agar (Pratiwi, 2008).
Metode Ditch-plate technique
Pada metode ini sampel uji berupa agen antimikroba yang diletakkan pada
parit yang dibuat dengan cara memotong media Agar dalam cawan petri pada
bagian tengah secara membujur dan mikroba uji (maksimum 6 macam) digoreskan
kea rah parit yang berisi agen antimikroba (Pratiwi, 2008).
Metode Cup-plate technique
Metode ini serupa dengan metode disc diffusion, dimana dibuat sumur pada
media agar yang telah ditanami dengan mikroorganisme dan pada sumur tersebut
diberi agen antimikroba yang akan diuji (Pratiwi, 2008).
Metode Gradient-plate technique
Pada metode ini konsentrasi agen antimikroba pada media Agar secara
teoritis bervariasi dari 0-maksimal. Media Agar dicairkan dan larutan sampel
ditambahkan. Campuran kemudian dituang ke dalam cawan petri dan diletakkan
dalam posisi miring. Nutrisi kedua selanjutnya dituang keatasnya.
Plate diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan agen antimikroba
bedifusi dan ermukaan media mongering. Mikroba uji (maksimal 6 macam) di
goreskan pada arah mulai dari konsentrasi tinggi ke rendah. Hasil diperhitungkan
sebagai panjang total pertumbuhan mikroorganisme maksimum yang mungkin di
bandingkan dengan panjang pertumbuhan hasil goresan (Pratiwi, 2008).
Uji Dilusi
Sejumlah zat antimikroba dimasukan ke dalam medium bakteriologi padat
atau cair. Biasanya digunakan pengenceran dua kali lipat zat antimikroba. Medium
akhirnya diinokulasi dengan bakteri yang diuji dan diinkubasi.
9

Tujuan akhir dari metode dilusi adalah untuk mengetahui seberapa banyak
jumlah zat antimikroba yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan atau
membunuh bakteri yang diuji. Uji keretanan dilusi agak membutuhkan waktu yang
banyak, dan kegunaanya terbatas pada keadaan-keadaan tertentu. Uji dilusi kaldu
tidak praktis dan kegunaannya sedikit apabila dilusi harus dibuat dalam tabung
pengujian, namun adanya serangkaian preparat dilusi kaldu untuk berbagai obat
yang berbeda dalam lempeng mikrodilusi telah meningkatkan dan mempermudah
metode (Jawet, et al., 2007).
Keuntungan uji dilusi adalah bahwa uji tersebut memungkinkan adanya
hasil kuantitatif, yang menunjukan jumlah obat tertentu yang diperlukan untuk
menghambat (atau membunuh) mikroorganisme yang diuji (Jawet et al.,2007).
1. Metode dilusi cair
Metode ini mengukur MIC (Minimum Inhibitory Concentration) atau KHM
(Kadar Hambat Minimum) dan MBC (Minimum Bactericidal Concentration) atau
KBM (Kadar Bunuh Minimum). Cara yang dilakukan adalah dengan membuat seri
pengenceran agen antimikroba pada medium cair yang ditambahkan mikroba uji.
Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya
pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM. Selanjutnya, cairan kultur hasil
inkubasi digoreskan pada media agar MHA menggunakan ose lalu diinkubasi pada
suhu 37℃ selama 18-24 jam. Pertumbuhan koloni bakteri pada media agar MHA
diamati dan dibandingkan dengan kontrol untuk menentukan Kadar Bunuh
Minimum (KBM) (Kumalasari, 2011).
Prosedur kerja metode dilusi diawali dengan pembuatan standar McFarland
0,5 yang setara dengan jumlah bakteri sebanyak 1,5× 108 CFU/ml. Bakteri uji yang
telah di remajakan pada media Nutrient Agar Slant (NAS) diambil dengan kawat
ose steril lalu disuspensikan kedalam tabung yang berisi larutan NaCl 0,9% steril
hingga diperoleh kekeruhan yang sama dengan standar kekeruhan standar
McFarland 0,5. Kemudian suspensi bakteri di encerkan dengan perbandingan 1:100
yaitu dengan mencampur 1 bagian suspensi bakteri dengan 99 bagian media
Mueller Hinton Broth (MHB).
10

Bahan yang digunakan adalah ekstrak Biji ketumbar (Coriandrum Sativum


L.), media MHA (Muller Hinton Agar) dan MHB (Muller Hinton Broth), DMSO
10%, suspensi bakteri Escherichia coli, dan antibiotik Kloramphenikol (contoh).
Menyiapkan kontrol positif dan negatif serta melakukan pengenceran pada
ekstrak Biji ketumbar dengan menyiapkan tabung reaksi steril. Semua konsentrasi
pengenceran dibuat dalam volume 1 ml, sehingga volume ekstrak yang digunakan
untuk konsentrasi 25%, 10%, 15%, 10%, 5%, 0% (contoh) berturut-turut yaitu 0,25
ml; 0,20 ml; 0,15 ml; 0,10 ml; 0,5 ml; 2 ml (contoh), kemudian di add-kan hingga
volume total 1 ml (contoh) dengan DMSO (Dimetil sulfoksida). Menggunakan
pengencer DMSO (Dimetil sulfoksida) 10% karena hasil ekstraksi biji ketumbar
bersifat non polar dengan menggunakan pelarut etanol 96%, sedangkan DMSO
dapat larut pada pelarut polar dan non polar, yang artinya larutan DMSO dapat
digunakan sebagai pengencer ekstraksi biji ketumbar. Untuk kontrol negatif (-)
memipet 1 ml antibiotik Kloramphenikol yang dilarutkan dalam aquadest steril,
sedangkan untuk kontrol positif (+) memipet 1 ml DMSO (Dimetil sulfoksida).
Membuat suspensi Bakteri dengan cara mengambil 1 ose suspensi bakteri
Escherichia coli dan mencampurkannya dengan PZ steril yang kekeruhannya
disetarakan dengan Mac Farland 0,5. Setelah itu membuat media Muller Hinton
Broth yang digunakan untuk tes dilusi. Suspensi bakteri yang setara dengan 0,5 Mac
Farland diencerkan dengan Muller Hinton Broth (0,1 mL larutan kuman
ditambahkan 9,9 mL Muller Hinton Broth). Memipet 0,5 mL ekstraksi biji
ketumbar dengan berbagai konsentrasi lalu ditambahkan campuran suspensi dengan
media MHB 0,5 mL ke dalam masing-masing tabung, lakukan secara aseptis,
kemudian menginbukasi selama 24 jam dalam suhu 37 oC. Pada hari berikutnya,
menyiapkan media MHA (Muller Hinton Agar) ambil 1 ose dari masing-masing
tabung dan streak pada media tanam, lakukan secara aseptis, kemudian
menginbukasi selama 24 jam dalam suhu 37 oC. Pada hari selanjutnya, amati
pertumbuhan koloni bakteri pada media tanam.
Kontrol positif metode dilusi menggunakan campuran suspensi bakteri
dengan larutan antibiotic kloramfenikol 2%. Kontrol negatif menggunakan
campuran suspensi bakteri dan larutan DMSO 10%. Data KHM dan KBM pada
masing-masing pengenceran hanya menyajikan hasil positif dan negatif.
11

2. Metode Dilusi Padat


Metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan media
padat. Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi agen antimikroba yang diuji
dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji.