Anda di halaman 1dari 23

Penentuan Kadar Protein metode Kjeldahl

dan Lowry
A. Tujuan Praktikum

1. Mengetahui dan memahami prinsip dasar penentuan kadar nitrogen dengan metoda
Kjeldahl dan metode Lowry.
2. Mampu menetapkan kadar protein dari sampel berdasarkan metoda Kjeldahl dan
metode Lowry .

B. Dasar Teori

Protein (asal kata protos dari bahasa Yunani yang berarti “yang paling utama”) adalah
senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-
monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Protein
berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel makhluk hidup dan virus.

Kebanyakan protein merupakan enzim atau subunit enzim. Jenis protein lain berperan dalam
fungsi struktural atau mekanis, seperti misalnya protein yang membentuk batang dan sendi
sitoskeleton. Protein terlibat dalam sistem kekebalan (imun) sebagai antibodi, sistem kendali
dalam bentuk hormon, sebagai komponen penyimpanan (dalam biji) dan juga dalam
transportasi hara. Sebagai salah satu sumber gizi, protein berperan sebagai sumber asam
amino bagi organisme yang tidak mampu membentuk asam amino tersebut (heterotrof).

Protein merupakan salah satu dari biomolekul raksasa, selain polisakarida, lipid, dan
polinukleotida, yang merupakan penyusun utama makhluk hidup. Selain itu, protein
merupakan salah satu molekul yang paling banyak diteliti dalam biokimia. Protein ditemukan
oleh Jöns Jakob Berzelius pada tahun 1838.

Biosintesis protein alami sama dengan ekspresi genetik. Kode genetik yang dibawa DNA
ditranskripsi menjadi RNA, yang berperan sebagai cetakan bagi translasi yang dilakukan
ribosom. Sampai tahap ini, protein masih “mentah”, hanya tersusun dari asam amino
proteinogenik. Melalui mekanisme pascatranslasi, terbentuklah protein yang memiliki fungsi
penuh secara biologi.

Protein merupakan suatu zat makanan yang sangat penting bagi tubuh karena zat ini
berfungsi sebagai sumber energi dalam tubuh serta sebagai zat pembangun dn pengatur.
Protein adalah polimer dari asam amino yang dihubungkan dengan ikatan peptida. Molekul
protein mengandung unsur-umsur C, H, O, N, P, S, dan terkadang mengandung unsur logam
seperti besi dan tembaga (Winarno, 1992).

Protein merupakan salah satu unsure makro yang terdapat pada bahan pangan selain lemak
dan karbohidrat. Fungsi utama protein dalam tubuh adalah sebagai zat pembentuk jaringan
baru dan mempertahankan jaringan yang sudah ada agar tidak mudah rusak.
Protein sendiri mempunyai banyak sekali fungsi di tubuh kita. Pada dasarnya protein
menunjang keberadaan setiap sel tubuh, proses kekebalan tubuh. Setiap orang dewasa harus
sedikitnya mengonsumsi 1 g protein per kg berat tubuhnya. Kebutuhan akan protein
bertambah pada perempuan yang mengandung dan atlet-atlet.

Kekurangan Protein bisa berakibat fatal:

 ·Kerontokan rambut (Rambut terdiri dari 97-100% dari Protein -Keratin)


 ·Yang paling buruk ada yang disebut dengan Kwasiorkor, penyakit kekurangan
protein. Biasanya pada anak-anak kecil yang menderitanya, dapat dilihat dari yang
namanya busung lapar, yang disebabkan oleh filtrasi air di dalam pembuluh darah
sehingga menimbulkan odem.Simptom yang lain dapat dikenali adalah:
o hipotonus
o gangguan pertumbuhan
o hati lemak
o ·Kekurangan yang terus menerus menyebabkan marasmus dan berkibat
kematian.

Kadar protein yang ditentukan berdasarkan cara Kjeldahl disebut sebagai kadar protein kasar
(crude protein) karena terikut senyawaan N bukan protein, misalnya urea, asam nukleat,
ammonia, nitrat, nitrit, asam amino, amida, purin, dan pirimidin.

Protein akan mengalami kekeruhan terbesar pada saat mencapai pH isoelektris yaitu pH
dimana protein memiliki muatan positif dan negatif yang sama, pada saat inilah protein
berubah wujud menjadi padatan dan kehilangan daya kelarutannya.

Metode Kjeldahl

Analisis protein dalam bahan pangan dapat dilakukan dengan dua metode yaitu metode
kuantitatif dan kualitatif. Kadar protein yang ditentukan berdasarkan cara Kjeldahl disebut
sebagai kadar protein kasar (crude protein) karena terikut senyawaan N bukan protein.

Prinsip kerja dari metode Kjeldahl adalah protein dan komponen organic dalam sampel
didestruksi dengan menggunakan asam sulfat dan katalis. Hasil destruksi dinetralkan dengan
menggunakan larutan alkali dan melalui destilasi. Destilat ditampung dalam larutan asam
borat. Selanjutnya ion- ion borat yang terbentuk dititrasi dengan menggunakan larutan HCl.

Metode Kjeldahl merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada
asam amino, protein dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan
asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan
amonium sulfat. Setelah pembebasan dengan alkali kuat, amonia yang terbentuk disuling uap
secara kuantitatif ke dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi. Metode ini telah
banyak mengalami modifikasi. Metode ini cocok digunakan secara semimikro, sebab hanya
memerlukan jumlah sampel dan pereaksi yang sedikit dan waktu analisa yang pendek.

Cara Kjeldahl digunakan untuk menganalisis kadar protein kasar dalam bahan makanan
secara tidak langsung, karena yang dianalisis dengan cara ini adalah kadar nitrogennya.
Dengan mengalikan hasil analisis tersebut dengan angka konversi 6,25, diperoleh nilai
protein dalam bahan makanan itu. Untuk beras, kedelai, dan gandum angka konversi berturut-
turut sebagai berikut: 5,95, 5,71, dan 5,83. Angka 6,25 berasal dari angka konversi serum
albumin yang biasanya mengandung 16% nitrogen. Prinsip cara analisis Kjeldahl adalah
sebagai berikut: mula-mula bahan didestruksi dengan asam sulfat pekat menggunakan katalis
selenium oksiklorida atau butiran Zn. Amonia yang terjadi ditampung dan dititrasi dengan
bantuan indikator. Cara Kjeldahl pada umumnya dapat dibedakan atas dua cara, yaitu cara
makro dan semimakro. Cara makro Kjeldahl digunakan untuk contoh yang sukar
dihomogenisasi dan besar contoh 1-3 g, sedang semimikro Kjeldahl dirancang untuk contoh
ukuran kecil yaitu kurang dari 300 mg dari bahan yang homogen. Cara analisis tersebut akan
berhasil baik dengan asumsi nitrogen dalam bentuk ikatan N-N dan N-O dalam sampel tidak
terdapat dalam jumlah yang besar. Kekurangan cara analisis ini ialah bahwa purina,
pirimidina, vitamin-vitamin, asam amino besar, kreatina, dan kreatinina ikut teranalisis dan
terukur sebagai nitrogen protein. Walaupun demikian, cara ini kini masih digunakan dan
dianggap cukup teliti untuk pengukuran kadar protein dalam bahan makanan.

Analisa protein cara Kjeldahl pada dasarnya dapat dibagi menjadi tiga tahapan yaitu proses
destruksi, proses destilasi dan tahap titrasi.

1. Tahap destruksi

Pada tahapan ini sampel dipanaskan dalam asam sulfat pekat sehingga terjadi destruksi
menjadi unsur-unsurnya. Elemen karbon, hidrogen teroksidasi menjadi CO, CO2 dan H2O.
Sedangkan nitrogennya (N) akan berubah menjadi (NH4)2SO4. Untuk mempercepat proses
destruksi sering ditambahkan katalisator berupa campuran Na2SO4 dan HgO (20:1). Gunning
menganjurkan menggunakan K2SO4 atau CuSO4. Dengan penambahan katalisator tersebut
titk didih asam sulfat akan dipertinggi sehingga destruksi berjalan lebih cepat. Selain
katalisator yang telah disebutkan tadi, kadang-kadang juga diberikan Selenium. Selenium
dapat mempercepat proses oksidasi karena zat tersebut selain menaikkan titik didih juga
mudah mengadakan perubahan dari valensi tinggi ke valensi rendah atau sebaliknya.

2. Tahap destilasi

Pada tahap destilasi, ammonium sulfat dipecah menjadi ammonia (NH3) dengan penambahan
NaOH sampai alkalis dan dipanaskan. Agar supaya selama destilasi tidak terjadi superheating
ataupun pemercikan cairan atau timbulnya gelembung gas yang besar maka dapat
ditambahkan logam zink (Zn). Ammonia yang dibebaskan selanjutnya akan ditangkap oleh
asam khlorida atau asam borat 4 % dalam jumlah yang berlebihan. Agar supaya kontak antara
asam dan ammonia lebih baik maka diusahakan ujung tabung destilasi tercelup sedalam
mungkin dalam asam. Untuk mengetahui asam dalam keadaan berlebihan maka diberi
indikator misalnya BCG + MR atau PP.

3. Tahap titrasi

Apabila penampung destilat digunakan asam khlorida maka sisa asam khorida yang bereaksi
dengan ammonia dititrasi dengan NaOH standar (0,1 N). Akhir titrasi ditandai dengan tepat
perubahan warna larutan menjadi merah muda dan tidak hilang selama 30 detik bila
menggunakan indikator PP.

%N = × N. NaOH × 14,008 × 100%

Apabila penampung destilasi digunakan asam borat maka banyaknya asam borat yang
bereaksi dengan ammonia dapat diketahui dengan titrasi menggunakan asam khlorida 0,1 N
dengan indikator (BCG + MR). Akhir titrasi ditandai dengan perubahan warna larutan dari
biru menjadi merah muda.

%N = × N.HCl × 14,008 × 100 %

Setelah diperoleh %N, selanjutnya dihitung kadar proteinnya dengan mengalikan suatu
faktor. Besarnya faktor perkalian N menjadi protein ini tergantung pada persentase N yang
menyusun protein dalam suatu bahan.

Metode Lowry

Ada beberapa metode yang biasa digunakan dalam rangka penentuan konsentrasi preotein,
yaitu metode Biuret, Lowry, dan lain sebagainya. Masing-masing metode mempunyai
kekurangan dan kelebihan. Pemilihan metode yang terbaik dan tepat untuk suatu pengukuran
bergantung pada beberapa faktor seperti misalnya, banyaknya material atau sampel yang
tersedia, waktu yang tersedia untuk melakukan pengukuran, alat spektrofotometri yang
tersedia (VIS atau UV).

Reagen pendeteksi gugus-gugus fenolik seperti reagen folin dan ciocalteu telah digunakan
dalam penentuan konsentrasi protein oleh Lowry (1951) yang kemudian dikenal dengan
metode Lowry. Dalam bentuk yang paling sederhana reagen folin ciocalteu apat mendeteksi
residu tirosin (dalam protein) karena kandungan fenolik dalam residu tersebut mampu
mereduksi fosfotungsat dan fosfomolibdat, yang merupakan konstituen utama reagen folin
ciocalteu, menjadi tungsten dan molibdenum yang berwarna biru. Hasil reduksi ini
menunjukkan puncak absorbsi yang lebar pada daerah merah. Sensitifitas dari metode folin
ciocalteu ini mengalami perbaikan yang cukup signifikan apabila digabung dengan ion-ion
Cu.

Larutan Lowry ada dua macam yaitu larutan A yang terdiri dari fosfotungstat-fosfomolibdad
(1:1) dan larutan Lowry B yang terdiri dari Na-carbonat 2% dalam NaOH 0,1 N, kupri sulfat
dan Na-K-tartat 2%. Cara penentuannya seperti berikut: 1 ml larutan protein ditambah 5 ml
Lowry B, digojong dan dibiarkan selama 10 menit. Kemudian ditambah 0,5 ml Lowry A
digojong dan dibiarkan 20 menit. Selanjutnya diamati OD-nya.

Dalam metode ini terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk
sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I).
Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat
phosphotungstat (phosphomolybdotungstate), menghasilkan heteropoly molybdenum blue
akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang
memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri.

Metode Lowry mengkombinasikan pereaksi biuret dengan pereaksi lain (Folin-


Ciocalteauphenol) yang bereaksi dengan residu tyrosine dan tryptophan dalam protein.
Reaksi ini menghasilkan warna kebiruan yang bisa dibaca di antara 500 – 750 nm, tergantung
sensitivitas yang dibutuhkan. Akan muncul puncak kecil di sekitar 500 nm yang dapat
digunakan untuk menentukan protein dengan konsentrasi tinggi dan sebuah puncak besar
disekitar 750 nm yang dapat digunakan untuk menentukan kadar protein dengan konsentrasi
rendah.
Berawal dari pemanfaatan alat spektrofotometer yaitu untuk mengukur jumlah penyerapan
zat suatu senyawa. Penyerapan cahaya pada senyawa larutan tersebut, dalam
spektrofotometri dapat digunakan sebagai dasar atau pedoman dalam penentuan konsentrasi
larutan atau senyawa secara kuantitatif. Dalam pratikum ini penggunaan KMnO4 bertujuan
untuk memudahkan dalam pengenalan dan latihan awal spektrofotometri. Kekuatan warna
biru terutama bergantung pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya. Keuntungan
metode Lowry adalah lebih sensitif (100 kali) daripada metode Biuret

Beberapa zat yang bisa mengganggu penetapan kadar protein dengan metode Lowry ini,
diantaranya buffer, asam nuklet, gula atau karbohidrat, deterjen, gliserol, Tricine, EDTA,
Tris, senyawa-senyawa kalium, sulfhidril, disulfida, fenolat, asam urat, guanin, xanthine,
magnesium, dan kalsium. Interferensi agen-agen ini dapat diminimalkan dengan
menghilangkan interferens tersebut. Sangat dianjurkan untuk menggunakan blanko untuk
mengkoreksi absorbansi. Interferensi yang disebabkan oleh deterjen, sukrosa dan EDTA
dapat dieliminasi dengan penambahan SDS atau melakukan preparasi sampel dengan
pengendapan protein.

C. Alat dan Bahan

Alat jumlah Bahan


Spektrofotometer Visible 1 unit Lar. H2SO4 pekat
(Labo)
Tabung reaksi 8 buah Garam Kjeldahl
Tabung Kjeldahl 4 buah Lar. Asam Borat
Pemanas Kjeldahl 1 unit Dedak (pakan ternak)
Alat distilasi 1 unit Bakso
Buret 50 ml 1 buah Lar. Protein standar
Erlenmeyer 250 ml 5 buah Aquades
Spatula 2 buah Lar.HCl 0,02 N
Kertas timbang
Batu didih 15 buah
Gelas ukur 25 ml 1 buah
Pipet tetes 2 buah
Corong gelas 1 buah

D. Langkah Kerja

Metode Kjehdahl
Metode Lowry

Pembuatan larutan standar protein


Pelarutan sampel
Pengukuran larutan standar protein dan sampel
E. Pengolahan Data

Metode Kjeldahl

Kadar Air Sampel Bakso

Berat Cawan Konstan = 33,1540 gram

Berat Cawan + Sampel = 38,1597 gram

Berat Sampel (w1) = 38,1597 – 33,1540 = 5,0057 gram

Setelah cawan di oven pada suhu 110oC selama 90 menit

Penimbangan 1 : 34,6795 gram

Penimbangan 2 : 34,4198 gram

Penimbangan 3 : 34,3935 gram

Berat sampel setelah dikeringkan (w2): 34,3935 – 33,1540 = 1,2395 g


Kehilangan berat (w3) : 5,0057 – 1,2395 = 3,7662 g

Persen kadar air (wet basis): = 75,24 %

Pembakuan HCl

Berat Boraks = 1,9037 gram

Mr Boraks = 381,37 gram/mol

BE Boraks = 381,37/2 = 190,685

Volume larutan = 50 ml

Volume analit = 10 ml

Volume titran = 21,8 ml


Kadar Protein Bakso 1 (1,0776 g bakso)

Metode Lowry
Penentuan absorbansi larutan standar

Konsentrasi larutan = 20 ppm

Volume larutan = 10 mL

Larutan standar merupakan 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mL larutan 20ppm protein yang
diencerkan dengan air, NaCO3, CuSO4, dan pereaksi fenol sampai volume 10mL

Pengukuran Absorbansi larutan standar pada panjang gelombang 670nm


Standar
V (mL) A
No
1 0,00 0,000
2 0,10 0,013
3 0,20 0,031
4 0,40 0,073
5 0,60 0,120
6 0,80 0,162
7 1,00 0,190

Perhitungan ppm protein dalam larutan standar

1. a. Blanko : 0 ppm 1. b. 0,10 ml lar. Standar protein 20


ppm

V1.C1 = V2.C2

0,10 mL x 20 ppm = 10 mL x C2

C2 = 0,20 ppm
1. c. 0,20 ml lar. Standar protein 20 1. d. 0,40 ml lar. Standar protein 20
ppm ppm

V1.C1 = V2.C2 V1.C1 = V2.C2

0,20 mL x 20 ppm = 10 mL x C2 0,40 mL x 20 ppm = 10 mL x C2

C2 = 0,4 ppm C2 = 0,8 ppm


1. e. 0,60 ml lar. Standar protein 20 1. f. 0,80 ml lar. Standar protein 20
ppm ppm

V1.C1 = V2.C2 V1.C1 = V2.C2

0,60 mL x 20 ppm = 10 mL x C2 0,80 mL x 20 ppm = 10 mL x C2

C2 = 1,2 ppm C2 = 1,6 ppm


1. g. 1,00 ml lar. Standar protein 20
ppm

V1.C1 = V2.C2

1,00 mL x 20 ppm = 10 mL x C2

C2 = 2 ppm
Dengan perhitungan, diperoleh data seperti pada tabel dibawah

Kons. protein (ppm) A


0,0 0,000
0,2 0,013
0,4 0,031
0,8 0,073
1,2 0,120
1,6 0,162
2,0 0,190

Dari data larutan standar tersebut dibuat grafik linear seperti berikut
Perhitungan Konsentrasi Analit/sampel

F. Pembahasan

Pada praktikum penentuan kadar protein dan senyawa bernitrogen dari suatu bahan pangan
dilakukan dengan dua metode yaitu metode Kjeldahl dan Lowry. Sampel yang digunakan
pada praktikum ini adalah sampel bakso.

Metode Kjeldahl

Metode kjeldahl merupakan metode yang sering digunakan untuk menentukan kadar nitrogen
total, tidak hanya bahan pangan namun bahan non pangan pun dapat menggunakan metode
ini. Prinsip dari penentuan kadar protein dengan metode kjedahl adalah penentuan jumlah
Nitrogen (N) yang dikandung oleh suatu bahan dengan cara mendegradasi protein bahan
organik dengan menggunakan asam sulfat pekat untuk menghasilkan nitrogen sebagai
amonia, kemudian menghitung jumlah nitrogen yang terlepas sebagai amonia lalu
mengkonversikan ke dalam kadar protein dengan mengalikannya dengan konstanta tertentu.
Analisa protein dengan metode kjeldahl pada dasarnya dapat dibagi menjadi tiga tahapan,
yaitu proses destruksi, proses destilasi, dan tahap titrasi.
Pada percobaan ini, akan dianalisis kadar protein pada bakso. Sampel terlebih dahulu di
tumbuk atau di gerus untuk memperluas permukaan sehingga reaksi destruksi dapat berjalan
maksimal.

– Destruksi

Sampel di destruksi dengan memanaskan sampel dalam asam sulfat pekat sehingga terjadi
penguraian sampel menjadi unsur-unsurnya yaitu unsur-unsur C, H, O, N, S, dan P. Unsur N
dalam protein ini dipakai untuk menentukan kandungan protein dalam suatu bahan. Hasil
destruksi adalah ion NH4+ yang menunjukkan keberadaan protein. Ion ammonium bereaksi
dengan ion sufat dari asam sulfat membentuk ammonium sulfat. Reaksi di katalisis dengan
adanya garam kjeldahl.

Garam kjeldahl berfungsi untuk mempercepat proses destruksi dengan menaikkan titik didih
asam sulfat saat dilakukan penambahan H2SO4 pekat, serta mempercepat kenaikan suhu asam
sulfat, sehingga destruksi berjalan lebih cepat dan lebih sempurna. Garam kjeldahl tersebut
terdiri dari campuran Na2SO4 anhidrad dan CuSO4. Ion logam Cu akan menaikkan titik didih
H2SO4 sedangkan Na2SO4 anhidrad akan menarik air yang terdapat pada sampel. Karena titik
didih menjadi lebih tinggi, maka asam sulfat akan membutuhkan waktu yang lama untuk
menguap. Karena hal ini, kontak asam sulfat dengan sampel akan lebih lama sehingga proses
destruksi akan berjalan lebih efektif. Asam sulfat yang bersifat oksidator kuat akan
mendestruksi sampel menjadi unsur-unsurnya.

Selama proses destruksi, terjadi reaksi berikut:

Cu2SO4 + 2H2SO4 à 2CuSO4 + 2 H2O + SO2


protein / (CHON) + On + H2SO4 à CO2 + H2O + (NH4)2SO4

Proses destruksi di tandai dengan perubahan warna larutan menjadi warna biru dan bening.
Setelah itu larutan di dalam labu kjeldahl didinginkan terlebih dahulu dan kemudian
diencerkan dengan penambahan 100 ml aquades.

– Destilasi

Pada dasarnya tujuan destilasi adalah memisahkan zat yang diinginkan, yaitu dengan
memecah amonium sulfat menjadi amonia (NH3) dengan menambah beberapa mL NaOH
hingga tepat basa, kemudian larutan sampel ini dipanaskan. Prinsip destilasi adalah
memisahkan cairan atau larutan berdasarkan perbedaan titik didih. Fungsi penambahan
NaOH adalah untuk memberikan suasana basa karena reaksi tidak dapat berlangsung dalam
keadaan asam.
Pada tahap destilasi, ammonium sulfat dipecah menjadi ammonia (NH3) dengan penambahan
NaOH sampai alkalis dan dipanaskan oleh pemanas dalam alat destilasi melalui steam. Selain
itu sifat NaOH yang apabila ditambah dengan aquadest menghasilkan panas, meski energinya
tidak terlalu besar jika dibandingkan pemanasan dari alat destilasi, ikut memberikan masukan
energi pada proses destilasi. Panas tinggi yang dihasilkan alat destilasi juga berasal dari
reaksi antara NaOH dengan (NH4)2SO4 yang merupakan reaksi yang sangat eksoterm
sehingga energinya sangat tinggi. Ammonia yang dibebaskan selanjutnya akan ditangkap
oleh larutan asam standar. Asam standar yang dipakai dalam percobaan ini adalah asam
borat..

Erlenmeyer yang berisi 100 ml asam borat 2 % + BCG-MR (campuran brom cresol green dan
methyl red) ditempatkan di bagian kanan bawah alat destilasi. Erlenmeyer ini digunakan
untuk menangkap amoniak hasil reaksi NaOH dengan (NH4)2SO4. BCG-MR merupakan
indikator yang bersifat amfoter, yaitu bisa bereaksi dengan asam maupun basa. Indikator ini
digunakan untuk mengetahui asam dalam keadaan berlebih. Selain itu alasan pemilihan
indikator ini adalah karena memiliki trayek pH 6-8 (melalui suasana asam dan basa / dapat
bekerja pada suasana asam dan basa), yang berarti memiliki rentang trayek kerjanya yang
luas (meliputi asam-netral-basa). Pada suasana asam, indikator akan berwarna merah muda,
sedang pada suasana basa akan berwarna hijau-biru. Setelah ditambah BCG-MR, larutan
akan berwarna merah muda karena berada dalam kondisi asam.

Asam borat (H3BO3) berfungsi sebagai penangkap NH3 sebagai destilat berupa gas yang
bersifat basa. Supaya ammonia dapat ditangkap secara maksimal, maka sebaiknya ujung alat
destilasi ini tercelup semua ke dalam larutan asam standar sehingga dapat ditentukan jumlah
protein sesuai dengan kadar protein bahan.

Selama proses destilasi lama-kelamaan larutan asam borat akan berubah warna menjadi hijau
kebiruan, hal ini karena larutan menangkap adanya ammonia dalam bahan yang bersifat basa
sehingga mengubah warna merah muda menjadi biru.
Reaksi yang terjadi :

(NH4)2SO4 + NaOH à Na2SO4 + 2 NH4OH


2NH4OH à 2NH3 + 2H2O
4NH3 + 2H3BO3 à 2(NH4)2BO3 +H2

Reaksi destilasi akan berakhir bila terjadi perubahan warna larutan dalam erlenmeyer menjadi
hijau muda akibat reaksi indicator pada suasana basa akibat menangkap ammonia. Ini
menunjukkan larutan telah bersifat basa dan distilasi dihentikan. Selain perubahan visual
yang terlihat, seharusnya dilakukan pengujian keberadaan ammonia di ujung pipa aliran
distilat. Pengujian dilakukan dengan menempelkan lakmus merah ke ujung pipa, bila lakmus
merah tidak berubah menjadi biru menunjukkan tidak ada lagi amoniak yang dihasilkan dari
destilasi, dengan demikian, destilasi dihentikan.

Setelah destilasi selesai larutan sampel berwarna keruh dan larutan asam dalam erlenmeyer
berwarna hijau kebiruan karena dalam suasana basa akibat menangkap ammonia. Ammonia
yang terbentuk selama destilasi dapat ditangkap sebagai destilat setelah diembunkan
(kondensasi) oleh pendingin balik di bagian belakang alat destilasi dan dialirkan ke dalam
erlenmeyer.

– Titrasi

Langkah terakhir dalam proses analisis protein adalah titrasi. Titrasi asam-basa digunakan
untuk menentukan kadar protein dalam sampel. Karena NH3 yang terbentuk adalah asam
lemah, digunakan HCl baku 0,1N untuk menitrasi asam borat yang sudah menangkap
ammonia hasil destilasi, titik akhir di tandai dengan perubahan warna menjadi merah muda
karena adanya indicator Phenolptalein pada kondisi sedikit basa (mendekati netral).

Reaksi yang terjadi

4NH3 + 2H3BO3 à 2(NH4)2BO3 +H2 ……………………….(1)

(NH4)2BO3 + 2 HCl à 2 NH4Cl + H2BO3 ……..…………………(2)

Reaksi 1 adalah reaksi penangkapan ammonia distilat oleh asam borat, dan reaksi (2) adalah
reaksi penetralan pada titrasi asam-basa. Dari reaksi di (2) diatas, bahwa 1 mol HCl akan
bereaksi dengan 1 mol ammonia (dalam bentuk NH4Cl). Sehingga banyaknya protein dalam
sampel dapat dihitung dari konversi HCl yang digunakan dikali dengan factor konversi
nitrogen protein.

Dari metoda yang dilakukan untuk menentukan kadar protein dari suatu bahan pangan yaitu
bakso, maka didapatkan kadar protein bakso sebesar 2,66% pada keadaan bakso kering
(bebas air).

Metode Lowry

Selain metode Kjeldahl, protein dalam bahan pangan dapat ditentukan kadarnya dengan
menggunakan spektrofotometer sinar tampak. Protein merupakan kumpulan dari beberapa
asam amino yang dihubungkan dengan ikatan peptida antara satu asam amino dengan asam
amino lainnya. Adanya ikatan peptida ini akan menyebabkan sampel yang mengandung
protein akan berwarna biru bila ditambahkan Cu2+ kedalamnya. Warna biru juga dihasilkan
akibat terjadinya redukti asam fosfomolibdat dan asam fosfotungstat oleh tirosin dan triptofan
yang merupakan residu protein. Asam fosfotungstat, fospomolibdat dan Cu2+ terdapat pada
reagen folin-ciocalteu yang ditambahkan pada sejumlah tertentu sampel.

Pada metode lowry ini, Cu2+ pada suasana basa akan tereduksi menjadi Cu+. Cu+ kemudian
akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat – phosphotungstat,
menghasilkan heteropoly-molybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai
samping asam amino) terkatalis Cu, yang menghasilkan warna biru.

Warna biru yang di hasilkan bergantung pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya.
Sehingga pengukuran kadar sampel dapat dilakukan dengan pengukuran absorbansi sampel
pada panjang gelombang maksimal pada panjang gelombang 670nm. Metode ini sangat
sensitif pada kadar protein yang kecil, limit deteksinya kurang lebih 2 ppm.

Sampel bakso dilarutkan dalam sejumlah tertentu aquades, dan disaring. Filtratnya
merupakan larutan yang mengandung protein. Sampel ini diperlakukan sama dengan sampel
dan dilakukan pengukuran absorbansi sampel pada panjang gelombang 670nm menggunakan
spektrofotometer visible.

Dari pengukuran deret standar protein yang diperoleh dari standar albumin terhadap 7 standar
yang dibuat, didapat kurva kalibrasi dengan persamaan y = 0,1x – 0,0044. Sedangkan serapan
sampel bakso pada panjang gelombang 670nm sebesar 0,058. Sehingga didapatkan kadar
protein sampel sebesar 1248 ppm. Kadar tersebut dikalikan dengan pengenceran (2000x)
sehingga diperoleh kadar protein sampel bakso mengunakan metode lowry pada kadar kering
bakso sebesar 0,51%.

Jika dibandingkan dengan metode Kjeldahl, kadar protein yang diukur melalui dua metode
tersebut memberikan hasil yang berbeda. Metode lowry memberikan hasil 5 kali lebih kecil
dibandingkan metode kjeldahl. Ini disebabkan karena kelarutan bakso yang sangat kecil
dalam air. Seharusnya bakso dilarutkan terlebih dahulu sampai benar benar larut dalam air
kemudian di reaksikan dengan metode lowry.

1. G. Kesimpulan
2. Kadar protein bakso kering yang diperoleh dengan pengukuran kadar protein
menggunakan metode kjeldahl sebesar 2,66 %
3. Kadar protein bakso kering yang diperoleh dengan pengukuran kadar protein
menggunakan metode Lowry sebesar 0,51%

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2012. Isi Kandungan Gizi Bakso-Komposisi Bahan Makanan.


http://www.organisasi.org/1970/01/isi-kandungan-gizi-bakso-komposisi-nutrisi-bahan-
makanan.html (online). Diakses pada tanggal 30 Oktober 2013

Kurniawan, Gigih. 2013. Protein Analysis Kjeldahl Metodh.


http://chemistryinorganic.blogspot.com/2013/03/Protein-Kjeldahl.html (online). Diakses pada
tanggal 31 Oktober 2013

Wahyudi, Imam. 2013. Laporan Praktikum Analisa Kadar Protein.


http://wahyudi93.blogspot.com/2013/05/laporan-praktikum-analisa-kadar-protein.html
(online). Diakses pada tanggal 31 Oktober 2013

Anonym. 2013. Protein. http://id.wikipedia.org/wiki/Protein (diunduh pada tanggal 2


November 2013 pkl 08.28 WIB)

Sari, Indah. 2013. Penentuan Kadar Protein secara Lowry.


http://indhpsari.blogspot.com/2013/06/penentuan-kadar-protein-secara-lowry.html (diunduh
pada tanggal 2 November 2013 pkl 09.07 WIB)

Riani. 2013. Penentuan Kadar Protein dengan Metode


Kjeldahl. http://rianitusaya.blogspot.com/2012/10/protein-metode-kjeldahl.html (diunduh
pada tanggal 2 November pkl 09.33 WIB)

https://himka1polban.wordpress.com/laporan/kimia-pangan/penentuan-kadar-protein-metode-
kjeldahl-dan-lowry/
PENETAPAN KADAR PROTEIN

Metode : Kjedahl

Bahan : Susu, Kecap

Prinsip :
- Gugus amino dari asam amino pembentuk protein diuraikan oleh H2SO4 pekat dengan
katalisator CuSO4. Karbon dan hydrogen dioksidasi menjadi CO2 dan H2O. Sebagian H2SO4
tereduksi menjadi SO2, dan senyawa terakhir inilah yang mereduksi gugus amino menjadi
amoniak, yang dengan H2SO4 berlebihan membentuk NH4HSO4.
- Dengan penambahan NaOH pekat berlebihan terbentuk amoniak dan ditangkap dalam HCl
0,1 N berlebihan.
- Kelebihan HCl 0,1 N dititrasi kembali dengan NaOH 0,1 N.Miligram protein dihitung sebagai
banyaknya mg Nitrogen dikalikan faktor protein.
Reaksi :
- Pada saat Destruksi
H
| H2SO4
R -C- COOH → CO2 + H2O + NH2 + SO2
| Cu++
NH2
NH2 → NH3
NH4 + H2SO4 → NH4HSO4
- Pada saat Desilasi
NH4HSO4 + 2 NaOH →Na2SO4 + NH3 + 2 H2O
- Pada saat Titrasi
NaOH + HCl →NaCl + H2O

Reagensia :
- H2SO4 pekat
- Campuran Na2SO4, CuSO4, dan selen
- NaOH 50%
- HCl 0,1 N
- Indikator campuran MB : MR ( 1 : 1 )
- Indikator PP 0,1 %
- H3BO3 4 %

Prosedur :
- Ditimbang seksama 1,0 gr sampel dimasukkan dalam labu kjedahl jangan sampai
menempel leher labu.
- Ditambah 5,0 gram campuran katalisator + batu didih + 15 ml H2SO4 pekat.
- Labu kjedahl diletakkan dalam kedudukan miring 45° diatas pemanas, ditutup dengan
corong panaskan hati-hati dalam almari asam hingga buih habis, kemudian panaskan kuat-
kuat
- Hasil destruksi ditambah dengan 50 ml aquadest, kemudian pindahkan kedalam labu
destilasi + 150 ml aquadest dingin + 3 tetes indicator PP 0,1%
- Ditambah 50 ml NaOH 50% melalui dinding labu destilasi sampai merubah lakmus merah
menjadi biru
- Hasil destilasi ditampung dalam erlenmayer yang sudah dimasukkan H3BO3 4% 50,0ml + 2
tetes indicator campuran
- Destilasi sampai hasil destilasi ± 2 kali dari volume H3BO3 4% (pH netral)
- Destilasi dihentikan dan hasil destilasi yang semula berwarna hijau dititrasi dengan HCl 0,1N
sampai warna biru kembali.

Perhitungan : ml titrasi x N HCl x 0,014 x faktor protein x 100 %


gram sampel
=………..%

PENETAPAN KADAR LEMAK

Metode : Gravimetri dengan Soxhlet

Bahan : Susu

Prinsip : Lemak dalam makanan dipecah oleh HCl untuk membebaskan lemak
dari selulose kemudian diekstraksi dengan dietyl eter.Kadar lemak ditetapkan secara
gravimetri

Reaksi :-

Reagensia :

- HCl 4 N
- Dietyl eter

Prosedur :
- Ditimbang 1,0 gr sampel masukkan kedalam erlenmayer
- Ditambah 25 ml HCl 4 N, ditutup kondensor, dipanaskan selama 15 menit sampai
mendidih sambil diaduk
- Disaring dengan kertas saring bebas lemak /whatman (refluksi)
- Dicuci dengan air panas sampai hasil saringan menjadi netral ± pH 7
- Kertas saring + lemak dikeringkan, lalu dilipat dan dibungkus dengan kertas saring bebas
lemak yang baru dan diikat dengan benang kasur.
- Dimasukkan dalam soxhlet + eter sampai volume 1½ kali
- Diekstraksi selama 2-3 jam (6x putaran)
- Lemak + eter sedikit mungkin lalu tuang dalam erlenmayer konstan
- Diamkan sampai bau eter hilang
- Dipanaskan dalam oven suhu 105°C selama 1 jam.
- Dinginkan dalam eksikator selama 15 menit,lalu ditimbang
- Ulangi pemanasan sampai diperoleh bobot konstan

Perhitungan : Berat sari lemak x 100%


Berat sampel
= ………%

http://kloworzberly.blogspot.co.id/2013/04/pemeriksaan-kimia-air-makanan-dan.html